JPH07502533A - 抗ウィルス活性を有するクレアチン類似体 - Google Patents

抗ウィルス活性を有するクレアチン類似体

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JPH07502533A
JPH07502533A JP5511856A JP51185692A JPH07502533A JP H07502533 A JPH07502533 A JP H07502533A JP 5511856 A JP5511856 A JP 5511856A JP 51185692 A JP51185692 A JP 51185692A JP H07502533 A JPH07502533 A JP H07502533A
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cyclocreatine
creatine
cells
group
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JP5511856A
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カデユラー−ダオウク，　リマ
リリー，　ジエイムズ・ダブリユー
ウイドランスキ，　セオドア・エス
バーボーム，　ジヨナサン・ジエイ
フオーサイス，　クレイグ・ジエイ
Original Assignee
アミラ・インコーポレーテツド
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗ウィルス活性を有するクレアチン類似体発明の背景 自然の感染の場合、通常ヒトウィルスは非周期性の末端分化した上皮細胞に出会 う（Ｊ、Ｔｏｏｚｅ、１９８１．ＤＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ。
ｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ、）ｏウィルスゲノムを 複製することができる細胞の数及びウィルス複製の期間を最大にするために、い （つかのＲＮＡ及びＤＮＡ１！！瘍ウイルスは細胞周期調節を変えると思われる （Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅ、　Δ、Ｗ、ｅｔａｌ。
、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、４５：１９２−１９９　（１９８３））、種々の血清型の ヒトアデノウィルスは、例えば細胞周期の６１相における限定点調節に打ち勝つ ことにより細胞ＤＮＡ合成を誘導する（Ｓ　ｈ　ｉ−ｍｏ　ｊ　ｏ。
Ｈ，ａｎｄ　Ｙａｍａｓｈｉｔａ、Ｔ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３旦、４２２−４ ３３　（１９６８）；５ｔｒｏｈ１．Ｗ、Ａ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１旦：６５ ３−６６５　（１９６９）；Ｙｏｕｎｇｈｕｓｂａｎｄ。
１−１．Ｂ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、、４５．４５５−４６８ 　（１９７９））　。この現象はシミアンウィルス４０（Ｇｅｒｓｈｅｙ、　Ｅ 、Ｌ、　、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　、　３０ニア６−８３　（１９７９））及び ラウス肉腫ウィルス（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、Ｎ、ａｎｄ　Ａ、Ｋａｊｉ、Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、７５：５５０１−５５０５　 （１９７８））を含む他の腫瘍ウィルスの場合にも観察された。
アデノウィルスは増殖細胞における細胞周期の進行においても変化を引き起こす 。い（つかの細胞の場合Ｇ１相が短縮され、ＤＮＡ合成がｒＲＮΔ及びポリアミ ンの合成から脱共役する。アデノウィルス−感染侵食性（ｒｏｄｅｎｔ）細胞は 早期に細胞ＤＮＡ複製の連続循環を開始し、倍数体となる（Ｂｒａ　ｉ　ｔｈｗ ａ　ｉ　ｔｅ、　Δ、Ｗ、ｅｔａ１．．去工Ｖｉｒｏ１．．４５：１９２−１９ ９　（１９８３））。
定常細胞がシミアンウィルス４０などのＤＮＡ腫瘍ウィルスに感染してもデオキ シリボ核酸合成経路における酵素を数倍に活性化する（Ｈａｒｔｗｅｌｌ、Ｌ、 Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２ユニ２６２−２７２　（１９６５）　 ）。Ｇ１一体止細胞におけるこれらのいくつかの細胞酵素の活性化も休止細胞に おけるウィルス増殖に重要な役割を果すことができる。ＤＮＡウィルスの形質転 換タンパク質及び他のウィルスタンパク質による正常細胞の生理学のそのような 変化は、ウィルス複製及びウィルス粒子の生産をより有効にする。
発明の概略 本発明はクレアチン及びクレアチンの適した類似体、例えばシクロクレアチンの 抗ウィルス剤としての利用に関する。これらの化合物は多様なウィルス、特定の ＤＮＡウィルスに対する抗ウィルス剤として用いることができる。特にシクロク レアチンはＨ３Ｖ−１、ＨＳ　Ｖ　−２、ヒトサイトメカロウィルス、モルモッ トサイトメガロウィルス及び水痘ウィルスなどのヘルペスウィルスに対して抗ウ ィルス活性を示す。さらにシクロクレアチンはアデノウィルスに対する有効な抗 ウィルス剤である。
本明細書に記載の通り、シクロクレアチンは試験管内及び生体内におけ特表千７ −５０２５３３　（４） る抗ウィルス活性のアッセイにおいて有効であることが示された。さらに本明細 書に記載の通り、クレアチン、ホモシクロクレアチン、β−グアニジノプロピオ ネート、カルボキシクレアチニンも生体内で抗ウィルス活性を有することが示さ れた。
抗ウィルス剤としてクレアチン、シクロクレアチン又はクレアチンの他の適した 類似体は細胞へのウィルスの細胞変性効果を減少させ、ウィルスの産生を阻害す る。例えばクレアチン、シクロクレアチン又はクレアチンの他の適した類似体を 投与し、細胞においてそれが投与されなければ起こるであろう感染の程度を低下 させることができ、あるいは直接又は間接的に細胞の感染を予防することができ る。さらにシクロクレアチンはヌクレオシド類似体であるアシクロビルと共に投 与すると相乗効果を有する。かくして本明細書に記載の化合物は他のヌクレオシ ド類似体（例えばアシクロビル、ガンシクロビル、ヨードキシウリジン（ｉｏｄ ｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、トリフルウリジン（ｔｒｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ビダ ラビン、ジデオキシイノシン（ビデックス）、アジドチミジン（シトプシン）） 又はヌクレオチド類似体、例えばフォスカルネット（ｆｏｓｃａｒｎｅｔ　：ホ スホノ蟻酸）及びフォスフォネット（Ｆｏｓｆｏｎｅｔ　：ホスホノ酢酸）と組 み合わせて投与すると特に有効である。
クレアチン又はシクロクレアチンなどの適したクレアチン類似体は単独で、ある いは他の薬物と組み合わせてウィルス感染の処置又は予防のために患者（例えば 哺乳類）に投与することができる。これらの化合物は感染の重度の軽減又は感染 の症状の軽減（例えば−次感染）のために、あるいはＨＳ　Ｖ感染の場合のよう な再発活性感染の予防、又は起こった再発活性感染の重度の軽減のために用いる ことができる。
図面のｌ！ＩＩ中な説明 図１はベロ細胞（Ｖｅｒｏ　ｃｅｌｌｓ）におけるＨ　Ｓ　Ｖ−１感染の細胞変 性効果に対するシクロクレアチンの保護効果を示す１対の棒グラフである。図Ｉ Ａは、種々のｉｎ（プラーク形成単位、ＰＦＵｓ）のＨ３Ｖ−１ウイルスを接種 したベロ細胞の単層細胞死のノく−セントに対する７種の濃度のシクロクレアチ ンの効果を示す（各接種材料に関して上の棒から下の棒に　４．０ｍｇ／ｍｌ、 ３．０ｍｇ／ｍｌ、２．２５ｍｇ／ｍ１．１．６９ｍｇ／ｍｌ、０．９５ｍｇ／ ｍ　ｌ、領７１ｍｇ／ｍｌＱｍｇ／ｍｌ）。図ＩＢは薬物の不在下におけるパー セント単層化への種々の量の１−（Ｓ　Ｖ　−１ウイルスの影響を示す（８ウ工 ル／接種材料）。
各棒の長さは１個のウェルにおけるパーセント単層化を示す。
図２はベロ細胞におけるＨ　Ｓ　Ｖ−２感染の細胞変性効果に対するシクロクレ アチンの保護効果を示す１対の棒グラフである。図２Δは、種々の量のＨＳ　Ｖ −２ウイルスを接種したベロ細胞の単層細胞死のノく−セントに対する８種の濃 度のシクロクレアチンの効果を示す（各接種材料に関して上の棒から下の棒に　 ４．０ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、２２５ｍｇ／ｍｌ　１．６ｍｇ／ｍ！、 １．２７ｍｇ／ｍｌ、０．９５ｍｇ／ｍｌ、０．７１ｍｇ／ｍｌ、Ｑｍｇ／ｍり 、図２Ｂは薬物の不在下におけるパーセント単層化への種々の量のＨＳ　Ｖ　− ２ウイルスの影響を示す（８ウ工ル／接種材料）。各捧の長さは１個のウェルに おけるノく一セント単層死を示す。
図３はＢａ１ｂ／３Ｔ３、クローンＡ３］細胞における）（Ｓ　Ｖ　−１感染の 細胞変性効果に対するシクロクレアチンの保護効果を示す１対の棒グラフである 。図３Ａは、種々の量のＩ−Ｉ　Ｓ　Ｖ−１ウィルスを接種しｔこＢａ１ｂ／３ Ｔ３、クローンＡ３１細胞の単層細胞死のパーセントに対する８種の濃度のシク ロクレアチンの効果を示す（各接種材料に関して上の棒から下の棒に・４゜Ｏｍ ｇ／ｍ＋、３．０ｍｇ／ｍｌ、２．２５ｍｇ／ｍｌ、１．６９ｍｇ／ｍｌ、１． ２５ｍｇ／ｍｌ、０．９５ｍｇ／ｍ１．０．７１ｍｇ／ｍｌ、Ｏｍｇ／ｍｌ）、 図３Ｂは薬物の不在下におけるパーセント単層化への種々の量のＩ−Ｉ　Ｓ　Ｖ −１ウイルスの影響を示す（８ウ工ル／接種材料）。各欅の長さは１個のウェル におけるパーセント単層化を示す。
図４はＢａ１ｂ／３Ｔ３、クローンＡ３１細胞におけるＨ　Ｓ　Ｖ　−２感染の 細胞変性効果に対するシクロクレアチンの保護効果を示す１対の棒グラフである 。図４Ａは、種々の量のＨ８Ｖ−２ウイルスを接種したＢａ１ｂ／３Ｔ３、クロ ーンＡ３１細胞の単層細胞死のパーセントに対する８種の濃度のシクロクレアチ ンの効果を示す（各接種材料に関して上の棒から下の棒に−４，０ｍｇ／ｍＬ　 ３．０ｍｇ／ｍｌ、２．２５ｍｇ／ｍｌ、１．６９ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ ｍｌ、０．９３ｍｇ／ｍｌ、Ｑ、７１ｍｇ／ｍｌ、Ｑｍｇ／ｍｌ）。図４Ｂは薬 物の不在下におけるパーセント単層化への種々の量のＨＳ　Ｖ　−２ウイルスの 影響を示す（８ウ工ル／接種材料）。各棒の長さは１個のウェルにおけるパーセ ント単層化を示す。
図５はＤＵＩ／１５細胞におけるＨ３Ｖ−１感染の細胞変性効果に対するシクロ クレアチンの保護効果を示す１．対の棒グラフである。図５Ａは、種々の量のＩ −（Ｓ　Ｖ　−１ウイルスを接種したＤＵ１４５細胞の単層細胞死のパーセント に対する８種の濃度の７クロクレアチンの効果を示す（各接種材料に関して上の 棒から下の棒に　４．０ｍｇ／ｍｌ、３．　０ｍｇ／ｍｌ、２．２５ｍｇ／ｍｌ 、１．６９ｍｇ／ｍｌ、１．２７ｍｇ／ｍ１．０．９５ｍｇ／ｍｌ、０．７１ｍ ｇ／ｍｌ、Ｑｍｇ／ｍ１）ｏ図５Ｂは薬物の不在下におけるパーセント単層光へ の種々の量のＨＳＶ−１ウイルスの影響を示す（８ウ工ル／接種材料）。６棒の 長さは１個のウェルにおけるパーセント単層光を示す。
図６はＩ）Ｕ１４５細胞におけるｔｌ　Ｓ　Ｖ　−２感染の細胞変性効果に対す るシクロクレアチンの保護効果を示す１対の欅グラフである。図６Ａは、種々の 量のＨＳＶ−２ウイルスを接種したＤＵ１４５細胞の単層細胞死のパーセントに 対する８種の１度のシクロクレアチンの効果を示す（各接種材料に関して上の棒 から下の欅に：４．０ｍｇ／ｍｌ、３．　０ｍｇ／ｍｌ、２．２５ｍｇ／ｍｌ　 １．６９ｍｇ／ｍｌ、１．２７ｍｇ／ｍｌ、０．９５ｍｇ／ｍｌ、０．７１ｍｇ ／ｍｌ、Ｏｍｇ／ｍｌ）。図６Ｂは薬物の不在下におけるパーセント単層光への 種々の量のＨＳ　Ｖ　−２ウイルスの影響を示す（８ウ工ル／接種材料）。６捧 の長さは１個のウェルにおけるパーセント単層光を示す。
図７はＡ３４９細胞におけるＨＳＶ−］感染の細胞変性効果に対するシクロクレ アチンの保護効果を示す１対の棒グラフである。図７Ａは、種々の量のＨＳ　Ｖ 　−１ウイルスを接種したＡ３４９細胞の単層細胞死のパーセントに対する８種 の濃度のシクロクレアチンの効果を示す（各接種材料に関して上の棒から下の欅 に：４．０ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍ１．２．２５ｍｇ／ｍｌ、１．６９ｍｇ ／ｍｌ、１．２７ｍｇ／ｍｌ、０．９５ｍｇ／ｍｌ、０．７１ｍｇ／ｍｌ、Ｏｍ ｇ／ｍｌ）。図７Ｂは薬物の不在下におけるパーセント単層光への種々の景のＩ −Ｉ　Ｓ　Ｖ　−１ウイルスの影響を示す（８ウ工ル／接種材料）。６棒の長さ は１個のウェルにおけるパーセント単層光を示す。
図８はＡ３４９細胞におけるＨＳＶ−２感染の細胞変性効果に対するシクロクレ アチンの保護効果を示す１対の棒グラフである。図８Δは、種々の量のＨＳ　Ｖ 　−２ウイルスを接種したＡ３４９細胞の単層細胞死のパーセントに対する８種 の濃度のシクロクレアチンの効果を示す（各接種材料に関して上の棒から下の棒 に：　４．Ｏｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍ＋、２．２５ｍｇ／ｍ＋、１．６９ｍ ｇ／ｍｌ、１．２７ｍｇ／ｍｌ、０．９５ｍｇ／ｍｌ、０．７１ｍｇ／ｍｌ　Ｏ ｍｇ／ｍｌ）　。図８Ｂは薬物の不在下におけるパーセント単層光への種々の量 のＨＳＶ−２ウイルスの影響を示す（８ウ工ル／接種材料）。６棒の長さは１個 のウェルにおけるパーセント単層光を示す。
図９は血清−欠乏ベロ細胞におけるＨＳＶ−１のプラーク形成効率（ｐＩａｑｕ ｉｎｇ　ｅｆ　ｒ　１ｃｉｅｎｃｙ）へのＡＭ２８５　（シクロクレアチン）の 阻害効果を示す棒グラフである。欅の高さは調べたシクロクレアチンの各濃度（ ｍＭ）の場合に観察されたプラークの数を示す。
図１０はマウスにおけるＨＳＶ−２陰部庖疹へのＡＭ２８５　（シクロクレアチ ン）クリームの効果を示すグラフである。１０％シクロクレアチンクリーム（黒 四角）、５％シクロクレアチンクリーム（黒三角）、２．５％シクロクレアチン クリーム（黒丸）、５％アシクロビルクリーム（白四角）及びブラセポクリーム （白丸）に関し、接種後の日数に対して平均疾患得点をプロットする。
図１１はヘルペス膣炎モデルにおける食餌的（ｄ　ｉ　ｅ　ｔ　ａ　ｒ　ｙ）　 （１％）シクロクレアチン（ＡＭ２８５）及び１００ｍｇ／ｋｇのアシクロビル （ＡＣＶ、強制飼養により投与）の付加的効果を示すグラフである。
グラフにおいて、ブラセボ（黒菱形）、１％シクロクレアチン（ＡＭ２８５：白 菱形）　、１００ｍｇ／ｋｇのアンクロビル（ΔＣＶ、白丸）又は１％のシクロ クレアチン（ＡＭ２８５）と１００ｍｇ／ｋｇのアシクロビル（ＡＣＶ）（黒丸 ）で処置した動物に関し、ＩＩ　Ｓ　Ｖ−２を接種した後の日数に対して平均疾 患得点をプロットする。
図１２は血清−欠乏べ口細胞中で増殖したＨ　Ｓ　Ｖ−１の細胞変性効果へのシ クロクレアチン（ＡＭ２８５）及びアシクロビルの相乗効果を示すグラフである 。ウィルス−誘導細胞変性効果を６５％阻害するのに必要なシクロクレアチン又 はアシクロビルの濃度を決定し、１．０の部分阻害濃度（ｆｒａｃＬｉｏｎａｌ 　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）とした。各薬物の部分 阻害濃度を合わせ、Ｉ−Ｉ　Ｓ　Ｖ　−１の細胞変性性を６５％阻害する組み合 わせをプロットした。
図１３は血清−欠乏べ口細胞中て増殖したＨ　Ｓ　Ｖ　−２の細胞変性効果への シクロクレアチン（ＡＭ２８５）及びアシクロビルの相乗効果を示すグラフであ る。ウィルス−誘導細胞変性効果を６５％阻害するのに必要なシクロクレアチン 又はアシクロビルの濃度を決定し、１．　０の部分阻害濃度とした。各薬物の部 分阻害濃度を合わせ、Ｉ（Ｓ　Ｖ　−２の細胞変性性を６５％阻害する組み合わ せをプロットした。
図１４は血清−欠乏ベロ細胞中で増殖したＩ（ＳＶ−２の細胞変性効果へのシク ロクレアチン（ＡＭ２８５）及びアシクロビルの相乗効果を示すグラフである。
ウィルス−誘導細胞変性効果を７０％阻害するのに必要なシクロクレアチン又は アシクロビルの濃度を決定し、１．０の部分阻害濃度とした。各薬物の部分阻害 濃度を合わせ、ＨＳ　Ｖ　−２の細胞変性性を７０％阻害する組み合わせをプロ ットした。
図１５はＤＵ１４５細胞におけるアデノウィルス感染の細胞変性効果に対するシ クロクレアチンの保護効果を示す１対の棒グラフである。図１５Ａは、種々の量 のアデノウィルスを接種したＤＵ１４５細胞の単層細胞死のパーセントに対する ７種の濃度のシクロクレアチンの効果を示す（各接種材料に関して上の棒がら下 の棒に＋　１０．０ｍｇ／ｍｌ、７゜５ｍｇ／ｍｌ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１．２ ５ｍｇ／ｍｌ、０．６２５ｍｇ／ｍｌ、０．３１２５ｍｇ／ｍｌ、Ｏｍｇ／ｍＩ ）　。図１５Ｂは薬物の不在下におけるパーセント単層光への種々の量のアデノ ウィルスの影響を示す（８ウ工ル／接種材料）。６棒の長さは１個のウェルにお けるパーセント単層光を示す。
図１６はベロ細胞におけるＨ　Ｓ　Ｖ　−１感染の細胞変性効果の阻害において シクロクレアチン及び１−カルボキシメチル−２−アミノイミダゾールの効果を 対照する１対のグラフである。図１６Δは種々の景（ＰＦＵ）のＨＳＶ−１ウイ ルスを接種したベロ細胞の単層細胞死のパーセントへの６種の濃度のシクロクレ アチンの効果を示す（各接種材料に関して上の棒から下の棒に・５．０ｍｇ／ｍ ｌ、２．５ｍｇ／’ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌ、０．６２ｍｇ／ｍＬ　０．３１ ｍｇ／ｍｌ、Ｏｍｇ／ｍ１）。図１６Ｂは種々の１１Ｉｌ（ＰＦＵ）のＨＳＶ− １ウイルスを接種したベロ細胞の単層細胞死のパーセントへの同一濃度の１−カ ルボキシメチル−２−アミノイミダゾールの効果を示す（各接種材料に関して上 の棒から下の棒に：　５．０ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍ １．０．６２ｍｇ／ｍｌ、０．３１ｍｇ／ｍｌ、Ｏｍｇ／ｍｌ）。６捧の長さは １個のウェルにおけるパーセント単層光を示す。
図１７はベロ細胞におけるＨＳＶ−１感染の細胞変性効果に対するＡＭ３６１（ 化合物５／６）の保護効果を示す１対の棒グラフである。図１７Ａは、種々の量 （ＰＦＵ）のＨ３Ｖ−１ウイルスを接種したベロ細胞の単層細胞死のパーセント に対する５種の濃度のシクロクレアチンの効果を示す（各接種材料に関して上の 棒から下の棒にニア２．７ｍＭ、５４．５ｍＭ、３６．３ｍＭ、１８．２ｍＭ、 Ｏ，ＯｍＭ及び０．０ｍＭ）。図１７Ｂは薬物の不在下におけるパーセント単層 化への種々の量のＨ３Ｖ−１ウイルスの影響を示す（６ウ工ル／接種材料）。６ 棒の長さは１個のウェルにおけるパーセント単層化を示す。
図１８はクレアチンキナーゼのいくつかの競争的阻害剤の構造の図である。
図１９はリン酸化可能なりレアチン類似体となるように設計された１０の構造の 図である。
図２０は化合物１−３の合成法を示す１組の合成スキームである（それぞれ図１ ９の構造１−３）。図２０Ａは図１９の化合物１の製造方法を具体的に示す合成 スキームである。図２０Ｂは図１９の化合物２の製造のための具体的に示す合成 スキームを示す。図２０Ｃは図１９の化合物３の合成を示す。
図２１は図１９の化合物４の合成法を具体的に示す合成スキームである。
図２２は図１９の構造５及び６により特定される化合物の合成のための一般的方 法を具体的に示す１対の合成スキームである。
図２３は図１９の構造９及び１０により特定される化合物の製造法を具体的に示 す１対の合成スキームである。図２３（上）は構造９により特定される化合物の 製造のための合成スキームを示す。図２３（下）は構造１０により特定される化 合物の製造のための合成スキームを示す。
図２４は１．８ｋｇのウサギにおいてシクロクレアチンの継続的静脈内輸液によ って時間の経過後に得られる血清中のシクロクレアチン（ＡＭ２８５）の濃度（ ｍＭ）を具体的に示すヒストグラムである。
図２５はＭＲＣ−５細胞においてＨＣＭＶ　（ｍ、ｏ、ｔ、　＝１）の１循環の 複製の後のウィルス収量へのシクロクレアチン−リン酸塩（ＣＣ「−Ｐ）のニリ チウム塩の効果をＣＣｒ−Ｐ濃度の関数として示すグラフである。ＣＣｒ−Ｐは 感染ｉ＆９６時間で検定されるＨＣＭＶ収量（ＰＦＵ）を減少させる。
図２６は感染後の種々の時間に加えられた場合のヒトサイトメガロウィルスプラ ーク形成へのシクロクレアチン（ＡＭ２８５）の効果を具体的に示すグラフであ る。
図２７は種々の濃度のシクロクレアチンで処理したＩ（ＣＭＶ−感染（ｍ、ｏ、 ｉ、＝１）ＭＲＣ−５細胞において合成される、感染後９６時間で検定されるウ ィルスＤＮＡの量（ｃｐｍ、分当たりのカウジト数）へのシクロクレアチン（Ａ Ｍ２８５）の効果を具体的に示すグラフである。
酵素ＡＴＰ　：クレアチン　Ｎ−ホスホトランスフェラーゼ（Ｅ　Ｃ２゜７．３ ．２：クレアチンキナーゼ）はＡＴＰとクレアチンの間のリン酸基の可逆的転移 を触媒する。前進反応の生成物であるクレアチンリン酸（Ｎ−ホスホロ−クレア チン）は脳、筋肉、網膜（Ｗａ　ｌ　Ｉ　ｉｍａｎｎｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ。
、８３　：　３８１６−３８１９　（１９８６））及び精子（Ｔｏｍｂ　ｅ　ｓ 。
Ｒ，Ｍ、ａｎｄ　Ｂ、Ｍ、５ｈａｐｉｒｏ、Ｃｅｌ　１．４１：３２５−３３４ 、（１９８５））−一高エネルギー要求性のすべての細胞におけるエネルギーの 輸送及び貯蔵のためのビヒクルである。
種々の細胞質ＣＫイソ酵素がミトコンドリア内膜の細胞質側に局在するミトコン ドリアクレアチンキナーゼイソ酵素（ＭｉＭｉ）と共にフレ９８９）の参照文献 を参照）。ＣＫＭｉＭｉはΔＤＰ／ΔＴＰ）ランスロカーゼと共に機能性多酵素 複合体に属する。酸化的リン酸化により生産されたＡＴＰはミトコンドリアクレ アチンキナーゼに用いられ、クレアチンリン酸が生成され、それが細胞作業（ｃ ｅｌｌｕｌａｒ　ｗ。
ｒｋ）の細胞質部位に往復される。反応の間に生成されたＡＤＰはＡＴＰ／ＡＤ Ｐトランスロカーゼを介してミトコンドリアマトリックスに逆輸送され、かくし て呼吸を刺激する。
クレアチンリン酸はミトコンドリアからリン酸基を運び、細胞作業の特定の部位 でＡＤＰからＡＴＰを再生する。筋肉及び心臓ではクレアチンキナーゼのＭＭイ ソ酵素がミオシンのアクチン−活性化Ｍ　ｇ　”−Ａ　ＴＰアーゼ、筋形質Ｃａ ”−ＡＴＰアーゼ及び筋繊維膜Ｎａ”／Ｋ”−へＴＰアーゼにおいてＡＴＰを再 生する。ＭＭイソ酵素の可溶性部分も解糖のＡＴＰ−生産系に機能的に結合して いると思われる。かくしてホスホクレアチンシャトルは高エネルギーを必要とす る組織の代謝の一般的特色であると思われる。
形質転換におけるクレアチンキナーゼ及びウィルスの相互作用クレアチンキナー ゼＢＢはアデノウィルス、ヒトサイトメガロウィルス及びエプスタイン−バール ウィルス（ＥＢＶ）を含むＤＮＡ腫瘍ウィルスによって誘導される細胞酵素の１ つである。ＣＫ　−Ｂ遺伝子の誘導に必要なアデノウィルス産物はＥｌａタンパ ク質である。ＣＫの活性化に必要なこのタンパク質の領域は、非許容細胞の形質 転換にも必要であり、ＣＫの活性化がウィルス形質転換に導く細胞周期変化にお いて役割を果し得ることを示唆している。ＣＫ−Ｂ転写はヒトサイトメガロウィ ルスにより誘導される。アデノウィルス感染と同様に、ＣＭＶ感染は細胞巨大分 子合成の賦活及び有糸分裂活性の向上を伴う。
アデノウィルスＥｌａ発癌性（ｏｎｃｏｇｅｎ　ｉ　ｃ）産物によるＣＫ遺伝子 の発現の誘導の発見は、ＣＫ　−Ｂサブユニットをコードする遺伝子のクローニ ング及び配列決定から発した。ＣＫ−Ｂ遺伝子は、アデノウィルスＥｌａタンパ ク質により活性化され、複製に含まれる７２ｋＤのＤＮＡ結合結合タンパクコー ドする遺伝子であるアデノウィルスのＥ２遺伝子に、顕著なりＮＡ配列類似性を 含むことが見いだされた。ＣＫ−Ｈの転写の開始部位の上流の領域とアデノウィ ルスのＥ２遺伝子の転写の開始部位の上流の配列の間のＤＮＡ配列類似性は、こ れらの類似配列が２つの遺伝子の重要な転写調節要素であり、Ｅｌａタンパク質 による誘導を媒介できることを示唆した。１つの産物によりウィルス及び細胞遺 伝子を共調節できる可能性は経済的であり、ＣＫがウィルス形質転換又は複製に おいて重要であり得ることを示唆している。続いてＥｌａ遺伝子産物がＣＫ−Ｂ 遺伝子の発現を誘導することが示され、形質転換及び遺伝子発現の誘導を結び付 けた。発癌性におけるＣ　Ｋ　−Ｈに可能な役割と一致して、多くのクレアチン 類似体が抗腫瘍活性を有することが示された。
ウィルス機能におけるクレアチンキナーゼの役割ＤＮＡＩＩ！瘍ウィルスの形質 転換する、又は細胞を活性化する力は、ウィルスが非周期性の正常な宿主細胞に おいて複製する能力の現れであると考えられる。腫瘍ウィルスによるＣＫ−Ｂの 誘導はある種の非分裂宿主細胞におけるウィルス複製の効率を向上させると仮定 した。他のウィルスも同様にウィルス過程に関してクレアチンキナーゼに依存し 得る。有効なウィルス生産はエネルギー要求性の過程であり、細胞代謝産物の再 方向づけが必要である。細胞代謝産物が細胞の特定の仕事に正常に方向づけられ る機構はあまり理解されていないが、細胞は要求に応じてエネルギー生産の速度 を調節し、クレアチンキナーゼは高エネルギーリン酸を生合成、細胞移動及び有 糸分裂などの多くの多様な過程に配分するのに重要な役割を果していると思われ る。子孫ピリオンの生合成はがなりのエネルギーを必要とし、クレアチンキナー ゼが細胞の内部のエネルギーの流れの調節に重要な役割を果すのて、ウィルスに よるクレアチンキナーゼの誘導、特にＢＢイソ酵素の誘導は、ピリオン複製及び 生産の段階に必要な細胞エネルギー備蓄の生成及び放出を容易にする。
クレアチンキナーゼの誘導がウィルスの有効な複製又は他のウィルス機能に重要 ならば、ＣＫの阻害又はＣＫの正常な活性の妨害は子孫ウィルスの生産を阻害し 得る。他の可能性は、クレアチンキナーゼ活性がウィルス機能又はウィルスタン パク質に必要な細胞タンパク質に影響を与える産物を生成することである。例え ばクレアチンブールがタンパク質にリン酸基を与え、その機能（例えば活性、位 置）を変更する。ホスホクレアチンがそのようなリン酸基ドナーであったら、ク レアチンの適した構造類似体及びこれらの構造類似体のリン酸化形態は、例えば ホスホクレアチンと標的タンパク質の相互作用を競争的に阻害し、それによりウ ィルス機能を直接又は間接的に妨害することができる。
クレアチン類似体を摂取すると組織のＰ−クレアチンブールが動力学的及び熱力 学的性質の異なる合成ボスファゲンで置換されることが示された。これにより細 胞内エネルギー代謝の微妙な変化が生じ、その変化には高エネルギーリン酸基の 備蓄合計量の増加が含まれる（Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｊ、Ｊ、ａｎｄ　Ｊ、Ｂ、Ｗａ ｌｋｅｒ、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈ且里工旦工旦旦丸ヱ立見、２２０　（２）：５ ６３−５７１　（１９８３）を参照）。Ｐ−クレアチンブールをクレアチン類似 体などの緩−作用性合成ホスファゲンで置換すると、子孫ピリオンの生産が阻害 される。そのような類似体の１つであるシクロクレアチン（１−カルボキシメチ ル−２−アミノ−イミダゾリジン）は細胞のエネルギーの流れを抑制して混乱さ せ、細胞作業の部位におけるへＴＰ使用を妨害し得る。従ってクレアチン類似体 であるシクロクレアチンを抗ウイルス剤候補として選択シクロクレアチンは基本 的にクレアチンの平面状環状類似体である。
シクロクレアチンは構造的にクレアチンに類似しているが、２つの化合物は動力 学的及び熱力学的の両方により区別することができる。シクロクレアチンは試験 管内及び生体内の両方で前進反応においてクレアチンキナーゼにより有効にリン 酸化される。しかし逆反応において、シクロクレアチンリン酸（Ｎ−ホスホロシ クロクレアチン、Ｐ−シクロクレアチン）は脱リン酸化が比較的遅い。試験管内 におけるクレアチンキナーゼによるシクロクレアチンのリン酸化の初期速度はク レアチンの３１％である（Ｒｏｗｌｅｙ、Ｇ、Ｌ、、Ｊ、Δｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏ ｃ、、９旦：５５４２−５５５１−　（１９７１，））。シクロクレアチンに関 して１℃で測定したＶや、アはクレアチンの■□、の９０％であり、Ｋｍｌ；！ ２５ｍＭであると決定され、これはクレアチンの場合より５倍高い。従って試験 管内のこれらの条件下で前進反応におけるシクロクレアチンの場合のＶ＝、、／ Ｋｍ比はクレアチンの約５分の１である（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ、Ａ、Ｃ，ｅｔ 　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、λ±ユ、４３８２−４３８８　（１９ ７２））。
リン酸化化合物であるＰ−シクロクレアチンは構造的にホスホクレアチンに類似 している。しかしシクロクレアチンリン酸のリン−窒素（Ｐ−Ｎ）結合はホスホ クレアチンの結合より安定である。Ｐ−シクロクレアチン（１−カルボキンメチ ル−２−イミノ−３−ホスホノイミダゾリジン）の加水分解のＧｉｂｂｓの自由 エネルギーは、Ｐ−クレアチンの場合より２ｋｃａ　１１モル低く、ＡＴＰの場 合より２１ｋｃａ１１モル高い。その結果、平衡においてシクロクレアチンに対 するシクロクレアチンリン酸の比率はクレアチンに対するホスホクレアチンの比 率の約３０倍である（ＬｏＰｒｅｓｔｉ、Ｐ、ａｎｄ　Ｍ、Ｃｏｈｎ、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃ±ａ、９９８：３１７−３２０　（１９８９）） 。ｐ＋−（７（３７℃）の場合、クレアチンキナーゼにより触媒される逆反応に おいてＰ−シクロクレアチンに関するｖ８□／　Ｋ　ｍ比はＰ−クレアチンの場 合より約１６０倍低い（Ａｎｎｅｓ　ｌｅｙ、Ｔ、Ｍ、ａｎｄ　Ｊ、Ｂ、Ｗａｌ ｋｅｒ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５３：８１２０−８１２５．　（１９７ ８）＋Ａｎｎｅｓ　Ｉｅｙ、Ｔ、Ｍ、ａｎｄＪ、Ｂ、Ｗａｌｋｅｒ、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。
Ｃｏｍｍｕｎ、、７４：１８５−１９０　（１９７７））。
シクロクレアチンは１°Ｃにおいて逆反応に関するＰ−クレアチンの競争的阻害 剤であることが見いだされた（Ｋｌ＝４４ｍＭ）（Ａ、Ｃ，Ｍユ　４３８２−４ ３８８　（１９７２））　。８０ｍＭのシクロクレアチンの存在下でＰ−クレア チンのＫｍは１．８ｍＭから５．１ｍＭに増加する。
クレアチン及びクレアチン類似体の抗ウィルス活性本発明はクレアチン及びシ知 クレアチンなどの適したクレアチン類似体の抗ウィルス剤としての利用に関する 。これらの化合物は多様なウィルス、特にＤＮＡウィルスに対する抗ウィルス剤 として用いることができる。特にシクロクレアチンはＨＳＶ−１、ｌｌ５Ｖ−２ 、ヒトサイトメガロウィルス、モルモットサイトメガロウィルス及び水痘ウィル スなどのヘルペスウィルスに対する有効な抗ウィルス剤であることが示された。
さらにシクロクレアチンはアデノウィルスに対する有効な抗ウィルス剤である。
実施例１に示す通りシクロクレアチンは、培養中のベロ細胞における単純ヘルペ スウィルス１型及び２型の細胞変性効果を減少させる（図１及び２）。図３−８ に示される結果はＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に対するシ知クレアチンの保護効果 がベロ細胞に特異的ではないことを示す。
ＨＳＶ−１のプラーク形成効率のアッセイの結果は、他のアッセイ様式における これらの観察を確証した（実施例２、図９）。がくしでシクロクレアチン及び他 のクレアチン類似体は、細胞をシクロクレアチンと接触させると、細胞へのウィ ルスの細胞変性効果を阻害（すなわち減少又は除去）するために用いることがで きる。
シクロクレアチンは、試験管内でヒト及びモルモットサイトメガロウィルス、水 痘ウィルス及びアデノウィルス（実施例３）の株に対しても有効であった。薬物 に起因する細胞毒性効果はこれらの実験で用いられた条件下でわずかであった。
用いられた条件下でネズミサイトメガロウイルス、インフルエンザＢ及びパライ ンフルエンザ３型ウイルスに対する弱い抗ウィルス活性も観察され、他のＤＮＡ 及びＲＮΔウィルスに対する抗ウィルス活性の可能性が示唆された。抗ウィルス 活性のアッセイに用いられた条件下でシクロクレアチンは水痘性口内炎ウィルス 、疑似狂犬病ウィルス（Ｐｓｅｕｄｏｅａｂｉｅｓ　ｖｉｒｕｓ）又はインフル エンザＡウィルスに対する有意な抗ウィルス活性を示さなかった。
シクロクレアチンの抗ウィルス活性を生体内でも調べた。１つの実験でシクロク レアチンはｌｌ５Ｖ−１−誘導の皮膚疾、申に活性を示さなかったが、化合物は Ｈ３Ｖ−２膣炎の処置に生体内で有効であった（実施例５）。そのような研究の １つの結果を図１０及び表８に示し、図及び表は１０％のシクロクレアチンを含 むクリーム調剤がブラセボと比較して平均疾患得点（陰部疾患の重度）を減少さ せたことを示している。毒性標準は、薬物がこの投薬量で十分許容され、適用領 域に悪影響を及ぼさないことを示した。マウス膣炎モデルを用いた実施例５で議 論されている他の実験はぐ表９Ａ及び９Ｂ、ならびに図１１）、生体内における シクロクレアチンの抗ウイルス効果及びシクロクレアチンとアシクロビルの付加 的効果と一致している。
シクロクレアチンを用いた処置は、抗ヘルペス剤であるガンシクロビル（Ｄ　Ｈ Ｐ　Ｇ、ジヒドロキシプロピル−メチルグアニン）及びアンクロビルなどの他の 抗ウィルス剤に対して耐性であることが証明された感染の処置のための有用な代 替え抗ウイルス治療を与えることができる。ある特定のガンシクロビル（ＤＨＰ Ｇ）耐性ヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）株（ＨＣＭＶ、株Ｃ８７０４） はシクロクレアチンに対して類似の耐性を示さず、シクロクレアチンがＤＨＰＧ の機構と異なる機構を介して作用することを示した（実施例３を参照）。さらに アシクロビル耐性、チミジンキナーゼ陰性（ＴＫ−）Ｈ８Ｖ−１株に対するシク ロクレアチンの活性はＴＫ’株に対する活性と同等であった（実施例３を参照） 。ウィルスＴＫはヌクレオシド類似体であるアシクロビルをヌクレオチド類似体 であるアシクロビル−リン酸に変換し、アシクロビルの抗ウィルス活性に力を与 える。シクロクレアチン抗ウィルス活性はこのＴＫ−媒介段階に依存していない と思われる。
実際に予備実験はクレアチンキナーゼ活性（例えばＣＫ−Ｂ）は、シクロクレア チンと類似の選択された性質を有する種類の抗ウィルス化合物の抗ウィルス活性 に力を与えることができることを示している。シクロクレアチンは１−カルボキ ンメチル−２−アミノイミダゾールのジヒドロ類似体である。このように構造的 に類似しているにもかかわらず、１−カルボキシメチル−２−アミノイミダゾー ルはクレアチンキナーゼに関する基質として劣っている。この類似体はクレアチ ン及びシクロクレアチンと類似のクレアチンキナーゼに関する結合定数を有する が、リン酸化の初期速度が５桁遅い。逆反応においても、リン酸化類似体は不十 分な基質である（Ｌｏｗｅ、Ｇ、ａｎｄ　Ｂ、Ｓ、５ｐｒｏａｔ、Ｊ。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５５：３９４４−３９５１．　（１９８０））。
実施例１３に示す通り、１−カルボキシメチル−２−アミノイミダゾールは細胞 変性効果アッセイの条件下で同等の抗ウイルス効果を示さなかった（図１６）。
従ってシクロクレアチン及び／又は他のクレアチン類似体へのリン酸基の転移が これらの化合物の抗ウィルス活性に重要であり得る。クレアチン及び他のリン酸 化可能クレアチン類似体の抗ウィルス活性も実施例１３において議論する。
クレアチン及びシクロクレアチン以外のクレアチン類似体が、試験管内及び生体 内で抗ウィルス活性を有することが示された。例えばクレアチン、ホモシクロク レアチン、β−グアニジノプロピオネート及びカルボキンクレアチニンはＨ３Ｖ −２膣炎に対して抗ウィルス活性を有することが本明細書で示される（実施例６ 及び７を参照）。
本発明はさらに抗ウィルス活性を有するクレアチン及びクレアチンの適した類似 体に関する。抗ウィルス剤としてクレアチン又はクレアチンの他の適した類似体 はウィルスの生産を阻害し、細胞へのウィルスの細胞変性効果を減少させること ができる。適したクレアチン類似体の性質は下記にさらに詳細に記載する。本明 細書で用い、下記にさらに記載するクレアチンの適した類似体（クレアチン類似 体）はクレアチンの構造的類似体及びこれらの構造的類似体のべ一リン酸化形態 を含む。これらの抗ウイルス剤候補の性質を有する化合物を、細胞変性効果アッ セイ法、プラーク減少アッセイ（ｐｌａｑｕｅ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ａｓｓａ ｙ）又は実施例に記載の生体内アッセイなどの既知のアッセイ法を用い、ヘルペ スウィルス、アデノウィルス又は他のウィルスなどのウィルスに対する抗ウィル ス活性に関しで調べることができる。
クレアチンキナーゼによりリン酸化可能なりレアチン類似体クレアチン及びクレ アチンキナーゼの多くの競争的阻害剤を試験管内で抗ウィルス活性に関して分析 した。図１８はクレアチン、シクロクレアチン（１−カルボキンメチル−２−イ ミノイミダゾリジン）、Ｎ−ホスホロクレアチン（Ｎ−ホスホリルクレアチン） 、シクロクレアチンリン酸（３−ホスホリル−１−カルボキシメチル−２−イミ ノイミダゾリジン）、及び抗ウィルス活性に関してしらべた７種の他の化合物（ 化合物１−Ｖｌ及びＡＭ３６１、図１８）の構造を示す。特に１−カルボキンメ チル−２−アミノイミダゾール（Ｉ、実施例１３）、１−カルボキシメチル−２ −イミノヘキサヒドロピリミジン（Ｉ　Ｉ、実施例４）、３−アミジノ酪酸（Ｉ ＩＩ、カルボクレアチン、実施例４）、１−カルボキシメチル−２−イミノメチ ルイミダゾリジン（ＡＭ３６１、実施例１５）、１−カルボキンエチル−２−イ ミノイミダゾリジン（ＩＶ、ホモシクロクレアチン、実施例４）、Ｎ−エチル− Ｎ−アミジノグリシン（Ｖ、ＥＧＡ、実施例４）、及びβ−グアニンノブロピオ ン酸（Ｖｌ、実施例４）を調べた。各化合物はアッセイ条件下でいくらかの抗ウ ィルス活性を示したが、７種の化合物のいずれもクレアチンキナーゼ阻害剤であ るシクロクレアチンと同等の活性を示さながった。これらの観察は、クレアチン キナーゼに関する基質としての動力学的生存性（ｋｉｎｅｔｉｃ　ｖｉａｂｉｌ ｉｔｙ）、及びシクロクレアチンのリン酸化形態が有するＮ−ホスホロクレアチ ンとアデノシン三リン酸の間のリン酸基転移力の有利な組み合わせによりシクロ クレアチンの抗ウィルス活性を説明できることを示唆した。
従って基質類似体としてクレアチンキナーゼによりリン酸化されることができる シクロクレアチン（ＡＭ２８５．１−カルボキシメチル−２−イミノイミダゾリ ジン）をクレアチンキナーゼ（例えばＣＫＢＢ、ＣＫＭＭ、ＣＫＭＢ）の競争的 阻害剤の種類のプロトタイプとして選んだ。
クレアチンキナーゼに関して動力学的生存性の基質と予測される他の適したクレ アチン類似体を設計した。選ばれた１０種の抗ウイルス性クレアチン類似体候補 を図１９に示す。これらのリン酸化可能基質類似体のそれぞれは、クレアチンキ ナーゼへの有効な結合及びそれによるリン酸化に必須であると思われる構造的要 素を保持するように設計された。
“動力学的生存性基質”は最低でもクレアチンキナーゼにより触媒される前進反 応（リン酸化反応）において、いくらかの抗ウィルス活性を有し、シクロクレア チンと類似の熱力学的性質を有するが前進反応においてクレアチンの約ｌＸｌ０ −’の活性を有する基質であるホモシクロクレアチン（１−カルボキシエチル− ２−イミノイミダゾリジン）と等しいか又はそれより大の基質活性を有してなけ ればならない（Ｒｏｂｅｒ。かくして追加のリン酸化可能クレアチン類似体は試 験管内において、選択された１組の条件下でホモシクロクレアチンと等しいかそ れより大の速度でクレアチンキナーゼによりリン酸化された場合に“動力学的生 存性”であるとする。
クレアチンキナーゼによるリン酸化に関する有効な基質としてのその性質の他に 、シクロクレアチンリン酸（３−ホスホリル−１−カルボキンメチル−２−イミ ノイミダゾリジン）のべ−リン酸基の加水分解のΔＧ”　はＮ−ボスホロクレア チンの場合より約２ｋｃａ　１１モル低く、アデノシン三リン酸の場合より約１ ｋｃａ１１モル上である。図１９に示す追加のクレアチン類似体は、生体内のリ ン酸化形態がＮ−ホスホロクレアチンの自由エネルギーとＡＴＰの自由エネルギ ーの間の範囲に含まれるリン酸基の加水分解の自由エネルギー（リン酸基転移ポ テンシャル）を有すると予測されるようにも選択又は設計する。
化合物１及び２ 例えば図１９に示す環状化合物１及び２は、第３８ｐ２窒素をそれぞれｓ　ｐ　 ３又はｓ　ｐ　２混成炭素で置換することによりシクロクレアチンと関連してい る。化合物１の場合、この置換により環が平面性の少ないコンホーメーションを とることができ、末端窒素のｐＫ、が下がり、分子のリン酸基転移ポテンシャル が下がることが予測される。
シクロクレアチンのｓ　ｐ　２窒素をｓ　ｐ　２混成炭素で置換すると化合物２ が与えられ（図１９）、完全に平面状の共役分子が得られ、末端窒素のｐＫａが 化合物１よりさらに下がる。カルボン酸側鎖の配向の基質結合への依存性は、化 合物１及び２の結合活性の比較により説明することができる。
図２０Ａ及びＢに示す通り、化合物１及び２はそれぞれＮ−ｔｅｒｔブチルジメ チル−シリル−２−ピロリジノン又はＮ−）リフチルシリル−２−ピロリジノン から４段階で合成することができる。さらに化合物２の製造において得られる中 間体（図２０Ｂ）の水添、及び図２０Ｂに示すその後の段階（（１）（Ｍｅ：＋ ０）ＢＦｅ４；　（２）ＮＨ３）により化合物１を得ることができる。
化合物３ 化合物３（図１９）と称される非環状類似体は化合物２と類似の物理化学的性質 を有すると予測されるがアミジノ窒素のｐＫ、は高いであろう。図２０Ｃに示す 通り化合物３は、Ｃｏｌ　１ｅｃｔ、Ｃｚｅｃｈ、Ｃｈｅｍ、Ｃｏｍｍｕｎ、４ １　：２０３４　（１９７６）に記載のような既知のニトリル又は誘導アミドの アミド化により製造することができる。
化合物４ 化合物４と称されるコンホーメーション的に制限された２環状類似体（図１９） は以前にクレアチンキナーゼの競争的阻害剤の可能性のある化合物として提案さ れた（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ、Ｒ，Ｆ、ａｎｄ　Ｇ、Ｌ。
Ｋｅｎｙｏｎ、　Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１針２２１−２ ２８　（１９８４））。この化合物はクレアチンキナーゼの強結合性（すなわち クレアチンの■り、より小又は等しい相対的に１を有する）リン酸化可能基質類 似体となることが予測される。コンホーメーション的自由度の制限により好まし くない活性部位接触が減少し、基質結合及び／又は反シム性に必要なコンホーメ ーション変化が最小になる。
８７９−４８８８　（１９８６）　）に記載の通りα、α°　−ンブロモグルタ ル酸無水物から誘導される既知のアゼチジンアルデヒドが化合物４の製造におけ る中間体となることができる。ペンンルアミンを用いたアゼ物１５）の還元的ア ミノ化により保護ジアミノが得られる。保護ジアミンの水添分解、続くノアノゲ ンブロミド又はノアナミドを用いた環化、及び付随するエステル加水分解により 化合物４が得られる。
構造５及び６ならびに関連類似体 構造５及び６（図１９）は５−員環に置換基（Ｒ）が付加されていることにより シクロクレアチンと異なる。この置換はリン酸基の転移が起こるのを許しながら 追加の接触部位を確立し、利用することにより基質結合のエネルギーをシクロク レアチンより増すように設計されている。
構造５及び６により特定される化合物の場合、Ｒはα−アミノ酸の側鎖から誘導 されるアルキル基又は置換アルキル基であることができ、α−アミノ酸には２０ の標準的アミノ酸の１つが含まれるがそれに必ずしも限られる必要はない。本明 細書で用いる”アルキル”という用語は１つ又はそれ以上の炭素原子を含む分枝 鎖状もしくは直鎖状炭化水素基を言う。さらに本明細書で用いる”置換アルキル 基”は、さらに１つか又はそれ以上の官能基を有する上記で定義した゛アルキル 基”を言い、官能基には不飽和、複素原子−置換基、カルボン酸及び無機酸誘導 体ならびに電子性部分が含まれるがこれらに限られるわけではない。
いずれかの絶対立体配置で多様なＲ−基を有し、疎水性又は親水性置換基を導入 したシクロクレアチンの環置換誘導体、例えば構造５及び６により特定される化 合物の合成の統一された方法は、図２２に記載のような方法による種々に保護さ れた１、２−ジアミンの挿入に頼っている。
そのような１．２−ジアミンは、例えばアラニンから光学活性１．２−ジアミノ プロパンへの変換に関して略示される方法により（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｄ、Ｄ、ｅｔ 　ａｌ、、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、１９：１３８２−１３８４　（１９７６）） 、α−アミノ酸から誘導することができる。この方法は種々のα−アミノ酸に適 合させることができる。別の場合グリシンアルジミンのアルキル化（Ｓｙｎｔｈ ｅｓｉｓ、ｐり、３１３−３１５　（１９８４）；Ｔｅｔ、Ｌｅｔｔ、２３　（ ４１）：４２５６−４２５８　（１９８２））が他のアルキル又は置換アルキル 側鎖を有する別の１．２−′）アミン中間体を与えることができる。選ばれた合 成法がＲ基ドナーとしてα−アミノ酸に頼っていない場合、アルキル及び置換ア ルキル基の性質は変化しないと理解され、その場合“アルキル“という用語は１ つ又はそれ以上の炭素原子を含む分枝鎖状もしくは直鎖状炭化水素基を言い、“ 置換アルキル基”は、１つか又はそれ以上の官能基を有する上記で定義した“ア ルキル基”を言い、官能基には不飽和、複素原子−置換基、カルボン酸及び無機 酸誘導体ならびに電子性部分が含まれるがこれらに限られるわけではない。
ＡＭ３６１はＲ＝メチルである構造５及び６により示される化合物の混合物から 成る組成物である。この組成物は細胞変性効果アッセイ様式においてＨ３Ｖ−１ に対して抗ウィルス活性を示した（図１７、実施例図１９の化合物７は実施例１ ６に記載の通りグリシルグリシンとンアナミドの１段階綿合により製造すること ができる。化合物７をＨ３Ｖ−１に対する細胞変性効果アッセイにおいてＡＭ３ ６１（化合物５／６）と平行して調べた。調べた最高の濃度において（４１，７ ｍＭ）化合物７は、調べたすべてのウィルス接種材料において一貫して抗ウィル ス活性を示し、単層死を減少させた。この濃度でわずかな細胞毒性が観察された 。抗ウイルス効果の有意性の確立のためにさらに実験が必要である。
化合物８ 図１９に示す化合物８はクレアチンのスルホンアミド誘導体であり、クレアチン キナーゼのタレアチンカルボキシレート結合領域の近辺に可能な結合的接触を増 すように設計されている。メチルチオウロニウムヨーダイドを用いたＮ−メチル グリシンのアリールスルホンアミド誘導体のアミド化により化合物８を製造する ことができる。
構造９及び１０ならびに関連類似体 ２つの別の種類の環状クレアチン類似体は、それぞれ構造９及び１０により示さ れるアミジン及び３置換グアニジンである。化合物９−及び１〇−型構造におけ Ｒはアルキル又は置換アルキルである。“アルキル”は１つ又はそれ以上の炭素 原子を含む分枝鎖状もしくは直鎖状炭化水素基を言い、“置換アルキル基”は、 １つか又はそれ以上の官能基を有する上記で定義した“アルキル基”を言い、官 能基には不飽和、複素原子−置換基、カルボン酸及び無機酸誘導体ならびに電子 性部分が含まれるがこれらに限られるわけてはない。
図２３（上）に示す通り、化合物９の構造への種々に置換された（アルキル及び 置換アルキル）環状アミジン前駆体（図２３、上の中間体槽２３５　（１９８０ ）ならびにその参照文献に記載のエチレンジアミンの製造を模範とした。図２３ に示すヨード酢酸又はＲ’　０ＣＯＣＨ２Ｉを用いた５員環状アミジン前駆体の カルボキンメチル化は構造９により特定される化合物に導くことができる。この 方法の前にトラゾリンとヨード酢酸の縮合によるトラゾリン酢酸（構造９、ここ でＲ＝フェニル）を製造した（Ｎｇｕｙｅｎ、Ａｎｎ　Ｃａｅ　Ｋｈｕｅ、Ｐｈ 、Ｄ、ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ、１９８３．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆ。
ｒｎｉａ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｉ）Ｉ）、３７−３８）。
構造１０により特定される化合物の合成の方法は、エチレンジアミン酢酸とＮ− 置換チオウロニウム塩の綜合を含む（Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ。
２３　：１２３２−１２３５　（１９８０）に従い）。チオウロニウム塩は確立 された方法に従って製造することができる（Ｒｏｗｌｅｙ　ｅｔ−１±、、Ｊ、 Δｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、９ト５５４２−５５５１　（１９７１）：Ｃｕｒｄ　 ｅｔ　ａｔ、、Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、１７４２（１９４９））。例えば実施例 １７に記載の化合物１０ａ及び１０ｂ（構造１０、ここでそれぞれＲ＝メチル又 はＲ＝アリル）はこの方法により製造することができる。これらの化合物の抗ウ ィルス活性を検定する最初の実験の説明を実施例１７に提示する。
二股式 上記の図１８及び１９の化合物などの適した化合物を含むクレアチン及び適した クレアチン類似体の構造を含む一役式を下記に示す及び製薬学的に許容し得るそ れらの塩。
（ａ）Ｙは−ＣＯ２１−１及び−Ｃ（＝　Ｏ）　Ｎ　ＨＳ　Ｏ２Ｊから成る群よ り選ばれ、ここでＪは水素及びアリール（例えばフェニル）から成る群より選ば れる。
（ｂ）ＡはＣ，−Ｃ，アルキル又はＣｌアルケニルである。場合によりＡは置換 基−Ｎ　ｌ−１２を有することができる。
（ｃ）ＸはＮＲ，、ＣＨＲ＋及びＲ１置換基を有するＣ、アルケニルから成る群 より選ばれ、ここてＲ３は ■）水素及び ２）Ｋから成る群より選ばれ、ここでＫはＣ，−Ｃ，直鎖状アルキル、Ｃ３−Ｃ ，分枝鎖状アルキル及びＣ，−Ｃ，直鎖状アルコイルから成る群より選ばれる。
（ｄ）ＡがＣ１アルケニル基として選ばれる場合Ｘもアルケニル基として選ばれ ねばならず、ＸがＣ！アルケニル基として選ばれる場合Ａはアルケニル基てなけ ればならず、ここでＡとＸは二重結合により結合する。
（ｅ）ＺＩ及びＺ２は−Ｎ　Ｉ−（Ｒ２及び−ＣＨ，Ｒ，から成る群より独立し て選ばれ、−ＮＨＲ２が選ばれた場合Ｒ２は１）水素、 ２）Ｋ、ここでＫはＣｌ−Ｃ５直鎖状アルキル、Ｃ３Ｃ６分枝鎮状アルキル及び Ｃ，−Ｃ２直鎖状アルコイルから選ばれる、及び３）−Ｐ　（＝Ｏ）（０）０　 （ＯＨ）（例えば−ｐｏ、ｚ’）から成る群より選ばれ、−ＣＨ２Ｒ２が選ばれ た場合Ｒ２は１）水素及び ２）Ｋから成る群より選ばれ、ここでＫはＣ，−Ｃ３直鎖状アルキル、Ｃ３Ｃ６ 分枝鎮状アルキル及びＣ，−Ｃ２直鎖状アルコイルから成る群より選ばれる。
（ｆ）Ｒ＋及び少なくとも１つのＲ２基が存在する場合、Ｒ１は単結合によりＲ ２に結合して５−７員環を形成することができる。
（ｇ）Ｒ＋が存在する場合、Ｒ６はＺＩ又はＺ２の炭素又は窒素（すなわち−Ｎ ＨＲ２又は−ＣＨ２Ｒ２、Ｒ２の一部でない炭素又は窒素）に単結合あるいは二 重結合により結合して５−７員環を形成することができる。
用途 クレアチン及びシクロクレアチンなどの適したクレアチン類似体は、ウィルス感 染の処置のために（すなわち治療における抗ウィルス剤として）単独で、又は他 の薬物と組み合わせて患者に投与することができる。
ウィルス感染の処置のための抗ウィルス剤としてクレアチン及びクレアチン類似 体はウィルス機能を妨害し、それにより患者における疾患及びその症状、例えば 細胞変性性に寄与するウィルス感染の直接／及び又は間接的影響、ウィルスＤＮ Ａ復製の程度及び／又は細胞から細胞への感染又はウィルスのひろがりを予防、 軽減又は除去することができる。例えば感染細胞へのウィルスの細胞変性効果は 、ウィルスに感染した細胞をクレアチン類似体と接触させることにより軽減する ことができる。結果は、ＤＮＡウィルス（例えばアデノウィルス、ヘルペスウィ ルス、例えば単純ヘルペスウィルス、サイトメガロウィルス、水痘ウィルス、エ プスタイン−パールウィルス、ヒト向すンパ球つィルスＶｌ型）ならびにインフ ルエンザウィルス（２木鎖ＲＮＡウイルス）などのＲＮＡウィルスによる感染を 含む多様なウィルス感染をシクロクレアチン又は他のクレアチン類似体を用いて 処置することができることを示す。
クレアチン、シクロクレアチン又はクレアチンの他の類似体を用い、感染の重度 を軽減することができ、−次感染の症状を軽減することができ、あるいはＨ３Ｖ 感染の場合のような再発性活性感染を予防又はその重度を軽減することができる 。シクロクレアチンなどのクレアチン類似体は、単純ヘルペスウィルス感染の処 置に用いることができる。例えばクリーム調剤におけるクレアチン類似体の開始 的適用により、哺乳類の粘膜皮膚表面のＩ−（Ｓ　Ｖ感染による疾患の重度を軽 減することができる。
処置によりウィルス放散（ｓｈｅｄｄ　ｉｎｇ）　、新しい疾、中の形成及び他 の臨床的症状が軽減される。陰部感染の初期処置のための経口的投与、及び重症 の患者（例えばＨＳ　Ｖ感染の新生児）のための非経口的投与も可能である。シ クロクレアチンは脳の組織に堆積するので、シクロクレアチン又は他のクレアチ ン類似体は中枢神経系の感染、例えばＨＳ　Ｖ脳炎又はＨ３Ｖウィルス性髄膜炎 の処置に用途を有することができる。興味深いことに、動物の死亡がＨ３Ｖ脳炎 に起因する実施例３に記載のマウス膣炎モデルにおいて、１％の食餌的シクロク レアチン及び１００ｍｇ／ｋｇのアシクロビル（強制飼養により与える）の共投 与により生存率が向上し、死亡までの平均Ｂ数が増加すると思われた。さらに実 施例８及び表１８に記載する通り、シクロクレアチンを投与するとマウスにおけ るＨＳＶ−２脳炎の死亡率が低下した。
クレアチン及び適したクレアチン類似体は帯状ヘルペス（再活性化水痘ウィルス 感染）及びサイトメガロウィルス感染（例えばヒトサイトメガロウィルス（ＩＩ ＣＭＶ）網脈絡膜炎、脳炎、腸炎、間質性肺炎、肝炎）の処置にも用いることが できる。特にシクロクレアチン、シクロクレアチンリン酸（実施例１３）、クレ アチン、Ｎ−アセトアミドイルサルフノン及びβ−グアニジノアセテート、グア ニジノアセテート（実施例３）は試験管内でヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭ Ｖ）に対する抗ウィルス活性を有することが示された。いくつかの抗ウィルス剤 がＨＳＶ、水痘ウィルス及びＨＣＭＶ感染に対して有効であり、クレアチン及び 適したクレアチン類似体はこれらの感染に対する任意又は補助の治療で作用する ことができ、これらの感染はＡＩＤＳ患者などの免疫損傷（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍ ｐｒｏｍｉｓｅｄ）患者又は移植受容患者などの免疫抑制患者において重症であ り得る。
特にヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）は免疫損傷宿主において生命にかか わる感染を引き起こす（Ｇｌｅｎ、Ｊ、、Ｒｅｖ、Ｉｎ、ｆｅＣｔ、Ｄｉｓ、、 ３：１１５１−１１７８　（１９８１））、ウィルスは向神経性（ｎｅｕｒｏｔ ｒｏｐｉｃ）であり、神経組織及び網膜に感染する傾向がある。ｌ−Ｉ　ＣＭ　 ＶはＡＩＤＳにおいて頻繁な全身的及び眼性日和見感染である（Ｊａｂｓ、Ｄ、 ｅｔ　ａｌ、、Δｒｃｈ、０ｐｈｔｈａ　１ｍｏ　１．．１０７　：１０６８　 （１９８９））、実際に１−Ｉ　ＣＭ　Ｖ網膜炎は多くの場合初期ＡＩＤＳ−限 定日和見感染である。ＨＣＭＶ網膜炎は進行性の壊死性疾患であり、攻撃的な処 置を行わないと網膜炎は重大な視力損失につながる（Ｐｅｐｏｓｅ、Ｊ、、於： Ｒｅｔｉｎａ、Ｒｙａｎ、　Ｓ、　Ｊ、　、　ｅｄ、　、　Ｖｏｌ、　Ｉｌ、　 ｃｈａｐｔｅｒ　９３）ｏ現在の治療にはガンシクロビル及びフォスカルネット が含まれ、これらは無限の維持治療を必要とする。制限的な毒性により多（の場 合処置の中断が必要であり、網膜炎が再発する。
いくつかの観察により、ＨＣＭＶがクレアチン又は適したクレアチン類似体、例 えばシクロクレアチンを用いた処置に関する魅力的な標的となる。ＨＣＭＶは試 験管内でシクロクレアチンに最も感受性のウィルスの１っである（実施例３を参 照）。一般に神経組織及び特に網膜はクレアチンキナーゼＢＢを発現し、クレア チン及び適したリン酸化可能クレアチン類似体が活性に必要なリン酸化を受ける ことを保証している。さらにシクロクレアチンは試験管内で試験した最高の濃度 （４０００μｇ／ｍｌ）においてほとんど、又は全く細胞毒性を示さなかったの で、この系における治療指数は６５より太である。適した類似体はウサギ網脈絡 膜炎モデルの試験管内又は生体内における活性により同定することができる（実 施例１１）。
本明細書で示す通り、シクロクレアチンはヌクレオシド類似体であるアシクロビ ルと共に投与すると相乗効果を有する（実施例１２）。生体内で、シクロクレア チンを食餌的に投与しく１％のシクロクレアチンを有する飼料）、強制飼養によ りアシクロビル（１００ｍｇ／ｋｇ）を投与した場合、結果は用いられた条件下 における付加的効果と一致する。
さらに上記の通りＨＳ　Ｖ−誘導死亡に対する保護効果が同一実験で観察され、 汎発性感染の処置における用途を示した。かくしてシクロクレアチン又は他のク レアチン類似体は、抗ウイルス性ヌクレオシド類似体（例えばアシクロビル、ガ ンシクロビル、ヨードキシウリジン、トリフルウリジン、ビダラビン、ジデオキ シイノシン、シトプシン（アジドチミジン））又はヌクレオド類似体、例えばフ ォスカルネット（ホスホノ蟻酸）及びフォスフォネット（ホスホノ酢酸）などの 他の抗ウィルス剤と組み合わせて投与すると特に有用であることができる。
例えばシクロクレアチンなどの適したクレアチン類似体を新生児Ｈ３■又は水痘 感染の処置に有用なビダラビンと共に投与することができる。
同様に、適したクレアチン類似体をＩ−Ｉ　Ｓ　Ｖ−１眼感染の処置に有用なト リフルウリジン、ヨードキンウリジン又はビダラビンと共に投与することができ る。上記の議論の通り、シクロクレアチンは類似のウィルス過程を標的とするこ とができるが、アシクロビル及びガンシクロビルと異なる機構を介して作用する と思われる。異なる機構により作用する抗ウィルス剤の組み合わせを少量用いる ことにより、耐性株の発生を避けることができる。さらにシクロクレアチン及び 他の適したクレアチン類似体は、そのような耐性株（例えばＤＨＰＧ耐性ＣＭＶ 株、アノクロビル耐性１（ＳＶ株、アジドチミジン耐性ＨＩ　Ｖ株）がすでに起 きた場合の代替え治療を与えることができる。
さらにシクロクレアチンなどの適したクレアチン類似体が抗ウィルス活性を有す るという発見は、さらに別の抗ウイルス剤候補の同定法を示唆している。例えば リン酸化可能クレアチン類似体候補を、クレアチンキナーゼのイソ酵素を用いた アッセイにおいて基質活性に関して初期スクリーニングすることができる。２つ の見本としてのクレアチンキナーゼ酵素アッセイ様式を実施例１３及び１５に記 載する。続いてクレアチンキナーゼを用いたアッセイにおいて所望の基質挙動又 は阻害挙動を示す類似体を、試験管内及び／又は生体内抗ウィルス活性のアッセ イにおいてさらに分析するために選択する。
投与様式 生体内適用の場合、シクロクレアチン又は他のクレアチン類似体は単独で、ある いは他のクレアチン類似体又は他の薬物と組み合わせて投与することができる。
例えばシクロクレアチンを池の抗ウィルス剤、例えば上記のヌクレオシド類似体 と共に投与することができる。クレアチン及び適したクレアチン類似体（例えば シクロクレアチン、ＡＭ３６１）は多様な経路で投与することができ、それには 例えば経口的（例えば食餌）、開始的、経皮的、又は非経口的（例えば皮下、筋 肉内、静脈内注入）な投与経路が含まれるがこれらに必ずしも限られるわけでは ない。
治療的有効ｆｆ１（すなわち哺乳類などの患者において所望の効果を生むのに十 分な：ｌ）の、クレアチン類似体を含む組成物を患者に投与する。投与するべき 薬剤の実際の量は、症状の重度、他の医学的条件及び処置の所望の目的の他に患 者の大きさ及び年令などの因子に依存するであろう。
筋肉の虚血の間にクレアチンキナーゼ阻害剤がＡＴＰｆｉを維持する、又は硬直 を遅らせる能力に関して調べた以前の研究において、シクロクレアチンをマウス 、ラット及びヒヨコに与えた。シクロクレアチンはこれらの動物において十分に 許容されると思われる。新しく岬化したヒヨコに１％のシクロクレアチンを含む 食餌を与え、ヒヨコは抗生物質の存在下で有意な死亡なしに１％のシクロクレア チンを許容したが標準のヒヨコより成長がおそかった。（Ｇｒｉｆ　ｆ　１ｔｈ ｓ、Ｇ、Ｒ，ａｎｄＪ、Ｂ、Ｗａｌｋｅｒ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５１ 　（７）：２０４９−２０５４　（１９７６））。マウスに１％のシクロクレア チンを含む食餌を１０日間与えた（Ａｎｎｅｓｌｅｙ、Ｔ、Ｍ、ａｎｄ　Ｊ。
Ｂ、Ｗａｌｋｅｒ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５３　（２２）＋８１２０− ８１２５　（１９７８））。シクロクレアチンをマウスに、その食餌の最高１％ で２週間（実施例５を参照）又は４週間以上（データは示さない）与え、ひどい （ｇｒｏｓｓ）悪影響はなかった。動物にシクロクレアチンを与えると（例えば １％食餌的）、ｍＭの濃度で種々の臓器にシクロクレアチンが堆積することが示 された。例えばシクロクレアチンは食餌的１％シクロクレアチンを与えられたラ ットの筋肉、心臓及び脳により吸収されることが報告された（Ｇｒ　ｉ　ｆ　ｆ 　ｉ　ｔｈｓ、　Ｇ、　Ｒ。
ａｎｄ　Ｊ、Ｂ、Ｗａｌｋｅｒ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５１　（７）： ２０４９−２０５４　（１９７６））。本明細書に示す通リンクロクレアチンの 抗ウィルス活性は１％の食餌的シクロクレアチンの投与により観察される。（シ クロクレアチンが精製されなかった１つの報告において、マウスに与えられた場 合１％のシクロクレアチンが死亡及び体重減少を引き起こしたと報告された（２ １／３４のマウスが５０日の飼育の間、標準の８０％の平均体重で生存した；Ａ ｒｔｒｕ、Ａ、Ａ、ａｎｄ　Ｊ、Ｄ、Ｍｉｃｈｅｎｆｅｌｄｅｒ、Ｊ、Ｎｅｕｒ ｏｃｈｅｍ、。
Ｊ旦　１１９８−１２００））。
選ばれたクレアチン類似体は選ばれた投与経路に従って調製される（例えば粉末 、錠剤、カプセル、クリーム又は軟膏、溶液、乳液）。クレアチン類似体を含む 適した組成物は、生理学的に許容し得るビヒクル又は担体中で調製することがで きる。例えば錠剤の形態の組成物は、充填剤（例えばラクトース）、結合剤（例 えばゼラチン、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム）、風味料、着色料 、又は所望の被覆材料などの１種か又はそれ以上の添加物を含むことができる。
クリーム又は軟膏調剤の場合、結晶性粉末を適したベース、例えばポリエチレン グリコール（ＰＥＧ）クリームベースと混合することができる。溶液又は乳液の 場合一般に、担体には食塩水又は緩衝媒体を含む水性又はアルコール性／水性溶 液、乳液あるいはｖ濁液が含まれる。非経口的ビヒクルは塩化ナトリウム、溶液 、リンゲルデキストロース（Ｒｉｎｇｅｒ’　５ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、デキス１ −ロースと塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、又は固定油（ｆ　１ｘｅｄ　ｏｉ 　Ｉ）を含むことができる。さらに静脈用ビヒクルは液体及び栄養補給物、なら びに電解質補給物、例えばリンゲルデキストロースに基づくものなどを含むこと ができる。防腐剤及び他の添加剤も存在することができる。例えば抗微生物剤、 酸化防止剤、キレート形成剤、及び不活性カスを加えることができる。（一般に Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ 、１６ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍａｃｋ、Ｅｄ、、１９８０を弁解）。
ここで本発明を以下の実施例により例示するが、これはいかようにも制限を目的 するものではない。
衷奥廻 下記に記載の材料を実施例で用いた。
焦含狗 シ知クレアチン（１−カルボキンメチル−２−イミノイミダゾリジン）及び１− カルボキンメチル−２−イミノヘキサヒドロピリミジンの合成はＧｒｉｆｆｉｔ ｈｓ　ａｎｄ　Ｗａｌｋｅｒ　（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、Ｇ、Ｒ，ａｎｄ　Ｊ、Ｂ 、Ｗａｌｋｅｒ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。
λ且↓・２０４９−２０５４　（１９７６）　）に記載の通りに行った。シクロ クレアチン−リン酸はＡｎｎｅｓｌｅｙ、Ｔ、Ｍ、ａｎｄ　Ｊ、８゜７４　（１ ）−・１８５−１９０　（１９７７）及び５ｔｒｕｖｅ　Ｇ、Ｅ。
ｅｔ　ａ　１．　、　Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｃｍ、、　４２　（２５）　二　４０３ ５−４０４０　（１９７７）に従ってニリチウム塩（三水和物）として製造した 。
１−カルボキンメチル−２−アミノ−イミダゾールはＬｏｗｅ、　Ｇ、ａ３９４ ４−３９５１　（１９８０））に従って製造した。ホモシクロクレアチン（１− カルボキンエチル−２−イミノイミダシリン功の合成は記載の通りに（Ｒｏｂｅ ｒｔｓ、Ｊ、Ｊ、ａｎｄ　Ｊ、Ｂ、Ｗａｌｋｅｒ、Δ二旦九一旦エユ旦九且二二 旦工旦１丸ヱ亙、・λ立見：５６３−５７１　（１９８３））行った。カルボク レアチン及び１−カルボキンメチル−２−イミノイミダゾリジン−４−オンの合 成は記載の通りに（Ｎｇｕｙｅｎ、Ａｎｎ　Ｃａｅ　Ｋｈｕｅ、Ｐｈ、Ｄ、Ｔｈ ｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ、ｒｙ、（Ｕ ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃ ｏ、１９８３）行った。１−カルボキシメチル−２−イミノイミダゾリジン−５ −オン（化合物７、図１９）の合成は実施例１６に記載する。
エチルグアニジノ酢酸（ＥＧＡ）の合成は記載の通りに（Ｒｉｃｈｍ。
ｎｄ、Ｊ、Ｊ、ａｎｄ　Ｊ、Ｗａｌｋｅｒ、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、、２５２：５６４−５７０　（１９８２））　、Ｄａｌ　ｔｏ ｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、により行われた。Ｎ−アセトイミドイル−サル コシンの合成はＷａｎｇ、Ｔ、、Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、。
３９　：　３５９１−３５９４　（１９７４）に従った。
他に指示がなければクレアチン、β−グアニジノプロピオネート（＃Ｇ６８７８ ）、グアニンノ酢酸及びアシクロビルはＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、 （Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、クレアチンリン酸はＩＣＮ　Ｐｈａｒ ｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから得た。ガンシクロビル（ＤＨＰＧ）は５ｙｎｔｅｘ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１ｎｃ、、Ｐａ１ｏ　Δｌｔｏ、ｃＡから得た、 さらに別の化合物の合成に関する供給源及び方法は下記の実施例に記載する。
実施例１ シクロクレアチンのＩ（Ｓ　Ｖ　−１及びＨＳ　Ｖ　−２に対する凍結ウィルス 、ロット上１をΔｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎ　（ＡＴＣＣＶＲ−７３３）から、感染液及び細胞を含む１．Ｏｍｌの凍 結アンプルとして得た。最初の供給源はヒト顔面小水痘てあった。宿主領域はほ とんどの哺乳類細胞を含む。
Ｅｊｅｒｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、、２°３５７−３６ ４．１９６８：Ｒｏｉｚｍａｎ、Ｂ、、ｅｔ　ａｌ、、（１９７２）、於：Ｐｅ ｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ　ｉｎ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　Ｖよ上±、Ｐｏｌ　１ａｒｄ 、Ｍ、、ｅｄｉ　ｔｏｒ、（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、）Ｉ）Ｉ） 、１２９−１６９゜単純ヘルペス２型（ＨＳＶ−２）株ＭＳＨ３Ｖ−２株ＭＳの 凍結ウィルス、ロット基をＡＴＣＣから、感染液及び細胞を含む１．Ｏｍｌの凍 結アンプルとして得た。ＡＴＣＣ番号はＡＴＣＣＶＲ−５４０である。ウィルス の最初の供給源は多発性硬化症の５０才の女性の脳であった。宿主領域はほとん どの哺乳類細胞を含む。Ｇｕｄｎａｄｏｔｔｉｒ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｅｘｐ、 Ｎｅｕｒ。
±、、９：８５．（１９６４）；Ｐａｕｌｓ、Ｆ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、９旦：９４１．　（１９６７）；Ｄｏｗｄｌｅ。
Ｗ、Ｒ，、Ｊ、［ｍｍｕｎｏｌｏｇＬ　９９：９７４．　（１９７５）。
ＨＳ　Ｖウィルス原液の調製及び力価 単純ヘルペスウィルス原液を一８０°Ｃで保存した。試験管内実験の場合に用い る実験室用原液は、以下の方法により調製した：ＨＳＶ−１原液（４，６７ｘｌ Ｏ’ＰＦＵ／ｍｌ）又はＨＳＶ−２原液（７，９３ｘ］、０’ＰＦＵ／ｍりのア リコートを細胞の上に載せた２０ｍ１の培地に直接加えることにより、密集ＤＵ １４５細胞の７５ｃｍ２のフラスコに以前の実験室用原液の１ｍｌのアリコート を接種した。細胞単層の全破壊が培養におけるウィルス複製の３−４日後に観察 された。ウィルス及び残りの細胞を含む培地を３角フラスコ（ｃｏｎｉｃａｌ　 ｔｕｂｅ）に集め、ドライアイス浴（−８０℃）中で凍結し、続いて３７℃で３ ０分間解凍した。凍結−解凍サイクルをさらに１回行った後、細胞破片をＢｃｃ ｋｍａｎｎ　ＧＰＲ遠心機の２００Ｏｒｐｍにおいて３分間遠心することにより 除去した。ウィルス原液（上澄み液）をアリコートに分け、２ｍｌの低温バイア ル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）中で一８０℃において保存した。
ＨＳＶ−１及びＨＳ　Ｖ　−２ウイルス原液の力価をベロ細胞上のプラークアン セイにより決定した。６−ウェル平板中の７５−９０％密集ベロ細胞に、順次希 釈した滴定するべき保存ウィルスを接種した。各ウェルは１０倍希釈を示し、そ の範囲は１０゛１から１０゛８であまた。ウィルスは２ｍｌの無血清培地中に希 釈し、細胞と共に３７℃で１時間インキュベートした。１時間インキュベートし た後、接種材料を吸引により除去し、４２°Ｃに保った３ｍｌのアカロース−培 地で置換した。続いて平板を３７℃で２−３日間インキュベートし、プラークを 発達させた。アガロース−培地は（ａ）１００℃で３０分間溶融した組織培養等 級の水（ＪＲ１４Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ　ＫＳ）中の１％５ｅ ａｐｌａｑｕｅアガロース（ＦＭＣＣｏｒｐ、、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）、及 び（ｂ）２ｘＭＥＭ／２０％　ＦＢＳ／４ｍＭ　Ｌ−グルタミン／２００単位／ ｍｌ　ペニシリン及び２００μｇ　／　ｍ　ｌ　ストレプトマイノン活性（ＪＲ ＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の新しい１１混合物である。
プラークを視覚化するために、５％のホルムアルデヒドをアガロース−培地上層 に加え、４５分から２時間放置し、残りの細胞を平板に固定した。続いて固定さ れた単層をエタノール中の０．２５％のクリスタルバイオレットで２時間染色し た。プラークを顕微鏡下で４０ｘの倍率で計数した。決定された力価はＨＳＶ− １の場合２．５ｘｌＯ’ＰＦＴＪ／ｍ１．及びＨＳＶ−２の場合６．０ｘｌＯ５ ＰＦＵ／ｍｌであった。決定された原液当たりのプラーク数は、アッセイに関し て選ばれた終点及び細胞系に依存して２−３倍変化し得る。
細胞系及び増殖培地 ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の試験管内実験に用いたすべての細胞系は、Ａ２０５ ８細胞の場合を除いてＡＴＣＣから得た。正常な成年のアフリカグリーンモンキ ーの腎臓から開始された細胞系であるベロ細胞をＩＸＥＭＥＭ、５％ウシ胎児血 清、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１００ｔＪ／ｍｌ　ペニシリン、１００μｇ／ｍ ｌ　ストレプトマイシン及び０．１１ｍｇ／ｍｌ　ピルビン酸ナトリウム中で増 殖させた。ベロ細胞はウィルス複製研究において広く用いられてきた。マウスの 胚細胞から確立された接触阻害、非腫瘍原性系であるＢａ１ｂ／３Ｔ３、クロー ンＡ３１細胞は１ｘＤＭＥＭ、ｉＱ％コウシ血消、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１ ００ＬＩ／ｍｌ　ペニシリン、１００μｇ／ｍ＋　ストレプトマイシン及び０． １１ｍｇ／ｍｌ　ピルビン酸ナトリウム中に保持した。５８才の白人男性からの 肺癌組織の外植片培養を介して開始されたＡ３４９細胞はｌｘｋａｉｇｈｎ’　 ｓ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ１２（ａｋａ　Ｈａｎｓ　Ｆ−１２ Ｋ）　、１０％　ＦＢＳ、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍ＋　ペニシリ ン及び１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイサン中に保持した。前立腺の広範囲転 移癌を有する患者の脳における疾患から単離したＤｔＪ１４５細胞は、１ｘＥＭ ＥＭ、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ　ペニシ リン、１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン及びＯ，ｌ１ｍｇ／ｍｌ　ピルビ ン酸ナトリウム中で増殖させた。Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　１ｎ５ｔｉ ｔｕｔｅのＭａｒｉｅ　Ｅ、Ｂｅｃｋｎｅｒがら得たヒト黒色腫系であるＡ２０ ５８細胞は、１ｘＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、４ｍＭＬ−グルタミン、１０ｏＵ／ ｍ１　ペニシリン、１ｏｏμｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン及びＯ，１１ｍｇ／ ｍｌ　ピルビン酸ナトリウム中で増殖させた。
細胞変性効果（ＣＰ　Ｅ）アッセイ法 薬物原液を選ばれた細胞系に適したＩＸ培地中の４−１０ｍｇ／ｍｌの濃度で調 製し、それを同培地でさらに希釈した（希釈因子０．７５）。
適した１ｘ無血清培地中における順次希釈のウィルス接種材料を電動式ＦＤＰマ ルチチャンネルピペットを用いて調製してから細胞に加えた。
血清−欠乏（ベロ、ＤＵ１４５）又は接触阻害（Ａ５４９、Ｂａ１ｂ／３Ｔ３ク ローンＡ３１）単層を以下の方法で確立した。細胞を各細胞系に適した増殖培地 を用いて９６−ウェル組織培養平板（Ｆａｌｃｏｎ。
＃３０７５）中に分けた。細胞が密集したらそれらを３−５日間血清−欠乏とす るか、又は２日間接触休止（ｃｏｎｔａｃｔ　ａｒｒｅｓｔ）とした。
確立された細胞の血清−欠乏又は接触一体止単層から増殖培地を吸引した。１０ ０μｌの体積のウィルス接種材料を、非感染細胞標準として用いるウェル（８ウ エル／平板）を除く各ウェル中におき、非感染細胞標準として用いるウェルには １００ｍ１の培地を入れた。平板を３７°Ｃで１−２時間インキュベートし、ウ ィルスを細胞中に吸収させた。ウィルス接種材料を吸引により除去し、単層を新 しい無血清培地で１回洗浄した。４２°Ｃに保ち、種々の濃度の薬物を含むアガ ロース−培地（０゜２ｍ１）を各ウェルに加えた。アガロース−培地は、（１） １００’Ｃで３０分間溶融した組織培養等級水（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、 Ｌｅｎｅｘａ　ＫＳ）中の１％　５ｅａｐｌａｑｕｅアガロース（ＦＭＣＣｏｒ ｐ、、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）　、及び（２）２ｘＭＥＭ／２０％ＦＢＳ／４ ｍＭ　Ｌ−グルタミン／２００単位／ｍｌペニシリン及び２００　ｕ　ｇ／ｍ　 Ｉ　ストレプトマイシン活性（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の新しい１：１ 混合物である。
続いて薬物の順次希釈液を電動式ＦＤＰマルチチャンネルピペットを用いてウェ ルに加えた。各ウィルス接種材料に関して薬物を含まない培地を１つのウェルに 加え、無薬物標準（“ウィルス標準”）を確立した。
平板を５％　Ｃｏ２及び９５％空気の湿潤雰囲気中の３７℃で、大きなパーセン テージの単層死がウィルス標準ウェルで観察されるまでインキュベートした。
非固定、又はある場合には固定細胞の単層死のパーセンテージの評価により細胞 変性効果を決定した。細胞単層の固定のために、培地を各ウェルから吸引により 除去し、細胞を５％のホルムアルデヒドで処理し、各ウェルに９５％エタノール 中のｏ、２５％のクリスタルバイオレットを０．１ｍｌ加えることにより染色し た。別の場合、細胞を５０μｌの５０％　ＴＣＡを用いて固定し、１１ｍ１ｓの ０．４％　スルホロータミンＢ（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、 Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）を用いて染色した。２時間後、染色液を吸引により 除去した。平板を水道流水で水が透明になるまで濯ぎ、平板を裏がえし、室温で 乾燥した。別の場合、単層死のパーセンテージを生存非固定細胞を調べることに より評価した。固定及び生存細胞の両方の場合に単層死のパーセンテージは位相 差顕微鏡下の１００ｘの倍率で評価した。
治療指数 調べた各薬物に関する治療指数（ＴＩ）は、式：ＴＴ＝ＣＤ５０＋ＥＤ５０によ り算出した。ＣＤ５０は細胞に目に見える影響を与えない濃度と完全な細胞毒性 を与える濃度の中点と算出される抗ウイルス物質の濃度である。ＥＤ５０はＣＰ Ｅをウィルス標準のＣＰＥの半分に減少させると算出される抗ウイルス物質の濃 度である。
ｔ（Ｓ　Ｖ　−１及びＴ（Ｓ　Ｖ　−２の細胞変性性の研究試験管内てＨＳ　Ｖ −１及びＩＩ　Ｓ　Ｖ　−２に対するシクロクレアチンの抗ウイルス効果を決定 するために、上記の通りに濃度を変化させたウィルスを用いて多くの細胞系に挑 戦した。感染単層を数種の濃度のシクロクレアチンの存在下で、平板上の無薬物 標準ウェルで強い細胞変性性が観察されるまでインキュベートした。各細胞系及 びウィルスに関して無薬物標準平板を調製し、シクロクレアチンを含まない低血 清培地を感染単層に加える以外は第１の平板と同様に処理した。
図１はベロ細胞におけるそのようなＩＩ　Ｓ　Ｖ−１の細胞変性性研究の結果を 示す。種々の濃度（陰影の異なる欅で示す）のシクロクレアチンにおいて各ウェ ルて観察された単層死のパーセンテージ（Ｘ軸）をウィルス接種材料の範囲（ｙ 軸、接種材料当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ））に関してプロットしである 。図ＩＡは血清−欠乏べ口細胞の場合、調べた４種のウィルス接種材料のすべて においてシクロクレアチンがＨ３Ｖ−１の細胞変性効果を阻害したことを示す。
シクロクレアチンの存在下で、薬物４度が高い稈抗ウィルス効果が大きいという 投薬量応答が一貫して観察される。
図Ｉ八において、ウィルス感染の不在下におけるパーセント単層死は感染細胞と 同一の平板からの薬物細胞毒性に関する標準となる。さらに無薬物標準平板がら の結果は、シクロクレアチンの不在下でＨ３Ｖ−１のある接種材料を与えられた ベロ細胞のウェルのほとんどが同等の程度の細胞死を示すことを示している（図 ＩＢ）。この平板は図ＩＡにまとめられている実験に関する負の標準となり、投 薬量応答がシクロクレアチンの添加に起因することを証明している。かくしてシ クロクレアチンは明確な抗−Ｈ５Ｖ−１効果を有する。
図Ｉ八に示された実験から算出されたＨ　Ｓ　Ｖ−１に対するシクロクレアチン の５０％有効投薬量（ＥＤ５０）は１．２７ｍｇ／ｍｌ、又１；！約９ｍＭであ る。細胞毒性は観察されず、従ってこの実験によりＣＤ５Ｑは４ｍｇ／ｍｌ又は ２８ｍＭより大であると決牢される。他の細胞毒性実験により、７０ｍＭのシク ロクレアチンが血清−欠乏べ口細胞により十分に許容されることが示された。従 って治療指数は〉７．６であると算出される。
図２Ａ及び２ＢはＨＳ　Ｖ　−２に関する同様の実験の結果をまとめている。結 果は、シクロクレアチンが血清−欠乏ベロ細胞において種々の量のＨ３Ｖ−２の 細胞変性効果を阻害することを示している。Ｈ３Ｖ−１の場合と同様に明確な投 薬量応答がある。ＥＤ５０は１．６９ｍｇ／ｍ１又は１１ｍＭと算出される。Ｃ Ｄ５０は４ｍｇ／ｍ＋又は２８ｍＭより大である。他の細胞毒性実験は、７０ｍ Ｍのシクロクレアチンが血清−欠乏ベロ細胞により十分許容されることを示した 。算出されたＴＩは〉５．５である。
ベロ細胞において観察されたシクロクレアチンの抗ウイルス効果を確証するため に、他の細胞系を用いて同様の実験を行った。実験（図３Ａ及び４Ａ）及び標準 （図３１３及び４Ｂ）平板からの結果は、シクロクレアチンが、接触−阻害Ｂａ １ｂＣ／３Ｔ３細胞への種々の希釈のＩＩ　Ｓ　Ｖ−１（図３Δ）及びｌｌ５Ｖ −２（図４Ａ）の細胞変性効果を阻害することを示している。図３　Ｂ及び４Ｂ はシクロクレアチンの不在下で１−（Ｓ　Ｖ−１又はＨＳ　Ｖ　−２ウイルスの ある接種材料を与えられたＢａ１ｂＣ／３Ｔ３細胞のウェルのほとんどが同程度 の細胞死を示すことを示している。
図５及び６はシクロクレアチンが血清−欠乏ＤＵ１４５細胞においてｐ１々）ｌ ｌノＬ（Ｓ　Ｖ　−１，（図５Ａ）又はＨ３Ｖ−２Ｃ図６Ａ）ノ４Ｂ］胞変性効 果を阻害することを示している。図５Ｂ及び６Ｂに報告されている標準実験の結 果は、シクロクレアチンの不在下でＨ３Ｖ−１（図５Ｂ）又はＨ３Ｖ−２（図６ Ｂ）ウィルスのある接種材料をＪｉえられたＤＵ１４５細胞のウェルのほとんど が同程度の細胞死を有することを証明している。
図７及び８は、シクロクレアチンが接触−■害Ａ４５９細胞において種々ｃｌｔ のＨ３Ｖ−１（図７Δ）及び１（ＳＶ−２（図７　Ｉ３）　ノＩ１１胞変性効果 を阻害することを示している。標準実験の結果は、シクロクレアチンノ不在下て ｊ−（ＳＶ−１（図７Ｂ）　又は１（ＳＶ−２（図８Ｂ）　のあ６接種材料を与 えられた接触−阻害Δ４５９細胞のウェルのほとんどが同程度の細胞死を有する ことを示している。
図３−８にまとめられている実験の結果は、血清−欠乏べ口細胞において１（Ｓ Ｖ−１（図１）及びＨＳ　Ｖ−２（図２）　ｌ：ｉ’４　シ”’Ｃ観察すｈタン クロクレアチンの抗ウイルス効果がベロ細胞に限られていないことを示唆してい る。異なる細胞系におけるＨ３Ｖ−１及びＩ−Ｉ　Ｓ　Ｖ　−２に幻するシクロ クレアチンの効率におけるわずかな変動はこのアッセイで検出することができな かった。
実施例２ ベロ細胞におけるＩ−Ｉ　Ｓ　Ｖ　−１のプラーク形成効率プラークアッセイ １００ｍｍ皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中のベロ細胞の密集血清−欠乏単層につきプラ ークアッセイを行った。増殖培地を吸引により除去し、１０ｍ１の低血清培地を 加えた。単層をこの培地中で５日間増殖させた。この低血清培地の吸引後、ウィ ルスを】Ｏｍｌの無血清培地中で細胞と共に３７℃で１時間インキュベートした 。インキュベーション後、接種材料を吸引により除去し、４２℃に保った２ｍｌ のアガロース−培地で置換した。アガロース−培地は、（ａ）１００’Ｃで２０ 分間溶融した組織培養等級水（ＪＲＩＩ　Ｈｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｅｎｃｘ３ 　ＫＳ）中の１％　Ｓｅａｋｅｍアカロース（ＦＭＣＣｏｒｐ、、Ｒｏｃｋｌａ ｎｄ、ＭＥ）、及び（ｂ）２ｘＭＥＭ／２０％ＦＢＳ／４ｍＭ　Ｌ−グルタミン ／２００単位／ｍＬペニソリン及び２００μｇ／ｍ！　ストレブトマイソン活性 （ＪＲＩ−（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の新しイエ１混合物である。ウィルスプ ラークは２−３日以内で発達した。
プラークを視覚化するために、単層を５％のホルムアルデヒドで４５分間固定し 、続いてエタノール中の０．２５％のクリスタルバイオレットで２時間染色した 。プラークを４０Ｘの倍率の顕微鏡下で計数した。
血清−欠乏べ口細胞におけるＨ　Ｓ　Ｖ　−１に対するシクロクレアンの抗ウイ ルス効果 プラークアッセイを用い、上記の細胞変性性研究で検出されたシクロクレアチン の抗ウィルス活性を確認した。ベロ細胞を１００ｍｍ皿中で増殖させ、血清−欠 乏とした。非感染標準を除く容器にｌｌ５Ｖｉウイルスを接種し、種々の濃度の シクロクレアチンと共に、ウィルスのみに暴露した平板においてプラークが現れ るまでインキュベートした。
図９において、形成されたプラークの数（ｙ軸）を７クロクレアチンの投薬ｊｌ 　（ＡＭ２８５　；　ｘ軸）に対してプロットする。ヒストグラムはシクロクレ アチンが血清−欠乏べ口細胞においてｌｌ５Ｖ−１のプラーク形成効率を低下さ せることを示している。投薬量の増加と共に形成されるプラークの数が減少する 。プラークの大きさもシクロクレアチンの存在下で実質的に減少した（データは 示さない）。第２の実験において、プラークの数が７５５　（Ｏｍｇ／ｍ　Ｉの シクロクレアチンにおいて）から１２０　（４ｍｇ／ｍｌのシクロクレアチンに おいて）に減少するのが観察さねた。シクロク１ノアチンー処置の皿におけるプ ラークの数及び大きさの減少の組み合わせは、ＣＰ　Ｅアッセイの結果を確証し ている。
他のウィルスに対するシクロクレアチンの抗ウイルス効果の普遍性を決定するた めに、水痘性口内炎ウィルス、インフルエンザＡ及びＢ、疑似狂人病ウィルス、 水痘ウィルス、ザイトメガロウィルス及びアデノウィルスによって起こる細胞変 性性の阻害を調べた。用いられた条件下でヒト及びモルモノトヅイｉ・メカロウ ィルス、水痘ウィルス及びアデノウィルスがシクロクし・アデノにより顕著な影 響を受けた。
アデノウィルスに対するシクロクレアチンの抗ウイルス活性アデノウィルス５型 はＡＴＣＣから入手した。Ｉ）Ｕ］４５細胞は八ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎがら得た。細胞をウィルスに感染させ、／ クロクレアチンを基本的に実施例１に記載した細胞変性効果（ＣＰ　Ｅ）アッセ イを用いて抗ウィルス活性に関して検定した。
図１５はＤＵｌ、４５細胞においてアデノウィルスを用いた細胞変性性研究の結 果を示す。種々の濃度のシクロクレアチン（陰影の異なる棒により示す、各接種 材料に関して上から下に：１０ｍｇ／ｍｌ、７．５ｍｇ／ｍｌ、５．０ｍｇ／ｍ ｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌ、０．６２５ｍｇ／ｍｌ、０．３１２５ｍｇ／ｍｌ、Ｏ ，Ｏｍｇ／ｍｌ）において各ウェルて観察された単層死のパーセンテージ（Ｘ軸 ）をウィルス接種材料の範囲（ｙ軸、接種材１当たりのプラーク形成単位（ＰＦ Ｕ）　）に対してプロットしである。図１５Ａは異なる濃度のウィルス接種材料 においてシクロクレアチンがＤＵ１４５細胞におけるアデノウィルスの細胞変性 効果を阻害したことを示す。シクロクレアチンに関する投薬量応答が明らかであ るが、薬物の最高の濃度（１０ｍｇ／ｍｌ＋図１５Ａ１ウィルス感染の不在下（ ＯＰＦＵ）におけるパーセント単層死）においていくらかの細胞毒性が観察され た。図１５Ｂに示されている無薬物標準平板がらの結果は、シクロクレアチンの 不在下でアデノウィルスのある接種材料を与えられたＤＵ１４５細胞のほとんど が同程度の細胞死を示すことを示している。
インフルエンザＡ及びＢ、バラインフルエンザウィルス、疑似狂犬病ライインフ ルエンザＡ／Ｐｏｒｔ　Ｃｈａ１ｍｅｒｓ／１／７３（Ｈ２Ｓｘ）及ヒ水痘性ロ 内炎ウィルス（ＶＳＶ）、Ｉｎｄｉａｎａ株はＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖ　ｉ　ｌ　 ｌ　ｅ、ＭＤ）からｉｌた。インフルエンザｒ３／Ｉｌｏｎｇ　ＫＯｎｇ１５／ ７２は、Ｗｌｌｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　１ｎｆｌｕｅｎｚａ　Ｃｅｎ ｔｅｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ＡｍｅｒｉｃａｓのＤｒ。
Ｍａｒｉｏｎ　Ｔ、Ｃｏｌｅｍａｎにより提供された。／（ラインフルエンザ３ 型（ＰＩＶ−３）、株Ｃ２４３は５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ ｔｉｔｕｔｅ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬから入手した。疑似狂犬病ウィルス 、Ａｕｊｅｓｚｋｙ株は、Ｄｒ、ＡｌｂｅｒｔＫａｐｌａｎ、Ａｌｂｅｒｔ　Ｅ ｉｎｓｔｅｉｎ　Ｃｅｎｔｅｒ、Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ　ＰＡから得た。細 胞変性効果研究に用いたウィルスの、細胞培養感染投薬量、５０％終点（ＣＣＩ Ｄｓｏ）で表した力価は、インフルエンザウィルスＡ及びＢの場合１　ｘ　１０ ’５ＣＣＩ　Ｄ５゜／ウェル、バラインフルエンザウィルスの場合Ｉ　Ｘ　１０ ”５ＣＣＩ　Ｉ）Ｓ。／ウェル、疑似狂犬病ウィルスの場合Ｉ　Ｘ　１０２ＣＣ Ｉ　Ｄ５０／ウェル、及びＶＳＶの場合１　ｘ　１０”ＣＣＩ　Ｄｓ。／ウェル であると決定された。
細胞及び増殖培地 Ｂ）利く一２１細胞（ノリアハムスター腎臓細胞の連続系（ｃｏｎＬｉｎｕｏｕ ｓ　１ｉｎｅ））、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓細胞の連続系）、Ｍ　Ｄ　Ｂ　Ｋ細 胞（ウノ腎臓細胞の連続系）、ＨＥｐ−２細胞（ヒト咽頭の頚表皮癌から誘導し た細胞の連続系）及びベロ細胞（アフリカグリーンモンキー腎臓細胞の連続系） はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏｌ　Ｉｅｃｔ　ｉｏｎ　 （ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉ　ｌ　Ｉｅ、ＭＤ）から得た。
細胞の増殖培地は以下の通りである。培地のいずれも抗生物質を含まなかった。
ＢＨＫ−２１細胞　９％　ＦＢＳ及び０．　１％　ＮａＣＯ３を含む非必須アミ ノ酸（ＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ，ＢＲＬ）を用いたイーグル最少必須培地。
ＭＤＣＫ細胞　５％　ＦＢＳ及び０．　１％　Ｎ　ａ　ＨＣＯ、を含むＭＥＭ０ ＭＤＢＫ細胞・非必須アミノ酸（ＧＴ　ＢＣＯ，ＢＲＬ）　、５％ウシ胎児血清 （ＦＢＳ）　、０．１％　Ｎ　ａ　ＨＣＯｓを含むＥＭＥＭｏＨＥｐ−２細胞　 非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ，ＢＲＬ）　、１０％　ＦＢＳ、０，１％　ＮａＨ ＣＯｓを含むＥＭＥＭ０ベロ細胞：５％　ＦＢＳ、０．１％　ＮａＣ０，を含む ＭＥＭ。
ＶＳＶのための試験培地はＭＥＭ、２％　ＦＢＳ、領　１８％　ＮａＨＣＯ３， ５Ｑｍｇ／ｍｌ　ゲンタマイシンを含み、インフルエンザＡ及びＢのための試験 培地はＭＥＭ　（ＦＢＳを含まず、０．１８％　ＮａＨＣＯ３）、２０μｇ／ｍ ｌ　トリプシン、２ｍｇ／ｍｌ　ＥＤＴＡ。
５０μｇ／ｍｌ　ゲンタマイシンを含んだ、、ＰＩＶ−３希釈のための試験培地 はＭＥＭ、２％　ＦＢＳ、０．１８％　ＮａＨＣＯ３及び５０μｇ／ｍｌ　ゲン タマイシンであった。
ＣＰＥ−減少アッセイ シクロクレアチンを血清を含まないＭＥＭ、０．１８％　Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ、５ ０μｇ／ｍｌ　ゲンタマイシン中の１００ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。血清を 含まないＭ　Ｅ　Ｌｉ中でさらに希釈を行った（２倍希釈案）。
細胞（０，２ｍ　Ｉ　／ウェル）を９６−ウェル平底組織培養平板（Ｃ。
ｒｎｉｎｇ　Ｇｌａｓｓ　Ｗｏｒｋｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）Ｉ：播種した。
細胞を終夜インキュベートし、細胞単層を確立した。増殖培地を９６−ウェル平 板からデカンテーノヨンし、種々の希釈の化合物を平板のウェルに加えた（４ウ ェル／希釈；Ｏ，１ｍｌ／ウェル）。培地のみを非感染細胞標準ウェル及びウィ ルス（無薬物）標準ウェルに加えた（０．１ｍｌ／ウェル）。試験培地で希釈し たウィルス（最終体積０゜１ｍ１）を、平板のすべての化合物試験ウェル（３ウ ヱル／希釈）ならびに９つのウィルス標準ウェルに加えた。ウィルスを含まない 試験培地（０，１ｍｌ／ウェル）をすべての毒性標準ウェル（１ウ工ル／各試験 化合物の希釈）、ならびに３つの非感染細胞標準ウェルに加えた。
平板を３７°Ｃにおいて、ウィルス標準ウェル（無薬物）のＣＰＥの読みが１０ ０％ＣＰＥ近辺となるまでインキュベートした。続いて細胞を顕微鏡によりウィ ルスＣＰＥに関して調べ、０−４の尺度て等級化し、この場合ＯはＣＰＥなして あり、４は１００％ＣＰ　Ｅである。毒性標準ウェルの細胞を顕微鏡により観察 し、細胞毒性による形謔学的変化に関して等級化した。有効投薬量、５０％終点 （ＥＤ５０）及び細胞毒性投薬量、５０％終点（ＣＤ５０）を、それぞれＣＰＥ データならびに細胞毒性標準データから回帰分析により算出した。ＥＤ５０は、 ＣＰＥを読んだ場合に細胞標準のＣＰＥ等級（０）とウィルス標準のＣＰＥ等級 の中屯のＣＩ）　Ｅ等級を与えると算出される抗ウイルス物質の濃度である。
ＣＤ５０は細胞に目に見える影響を与えない濃度と完全な細胞毒性を与える濃度 の中点であると算出される物質の４度である。
７・クロクレアチン（４ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍＩ、１ｍｇ／ｍｌ、５００μｇ ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ、６２．　５μｇ／ｍｌ及びＯ／ ｚｇ／ｍ＋）によるＶＳＶの細胞変性効果の減少をベロ細胞及びＢＨＫ−２１細 胞において検定した。用いられた条件下でシクロクレアチン処置によりＣＰＥは 減少せず、無薬物標準と同等級（４，０）を与えた。同一の培地で希釈し、平行 して調べたりバビリン（ＩＣＮＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃｏ５ｔａ　 Ｍｅｓａ、ＣＡ）はウィルスに対して中捏度の影響しか与えなかった。
シクロクレアチン（４ｍｇ／ｍＬ　２ｍｇ／ｍｌ、Ｉｍｇ／ｍｌ、５００μｇ／ ｍｌ、２５０１１ｇ／ｍｌ、１２５１１ｇ／ｍｌ、６２．　５μｇ／ｍ！及びＯ ＩＩ　ｇ　／　ｍ　ｌ　）による疑似狂犬病ウィルスの細胞変性効果の減少を上 記のＣＰＥアッセイを用いてＭＤＢＫ細胞において検定した。
用いられた条件下でシクロクレアチン処置は無薬物標準の等級（３，９）と大体 同じ等級（３，８−４，０）を与えた。同一の培地で希釈し、疑似狂犬病ウィル スに対して平行して調べたりバビリン（ＩＣＮ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓ、Ｃｏ５ｔａ　Ｍｅｓａ、ＣＡ）は１．０μｇ／ｍｌから１０００　μｇ／ｍ Ｉの濃度範囲で０．　０−３．　８の等級の範囲の阻害効果を有した。Ｄ　ＨＰ 　Ｇはリバビリンより効率が低く、アノクロビル及びアデニンアラヒノンドは同 様のアッセイにおいてこのウィルスに対して無効であった。
シクロクレアチン（４ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、５００Ｌ１ｇ ／ｍｌ、２５０　ｔｔ　ｇ／ｍ　］、１２５ｔｔｇ／ｍｌ及び６２．　５μｇ／ ｍ　］　）によるインフルエンザＡ又はインフルエンザＢの細胞変性効果の減少 を、ＭＤＣＫ細抱において検定した。用いられた条件下でシクロクレアチンはイ ンフルエンザウィルスのみに対してわずかな阻害効果を有したが、阻害は用いた 最高の濃度で観察されたのみであった。対照的にリバビリン（１０μｇ／ｍ１以 下）は各ウィルスに対して有効であった。
シクロクレアチン（１，０ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｉ、５ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍ １．１．２５ｍｇ／ｍｌ、６２５１１ｇ／ｍｌ、２１３μｇ／ｍｌ、１５６μｇ ／ｍＩ及びＯｔｔ　ｇ／ｍ　Ｉ　）によるバラインフルエンザ３型の細胞変性効 果の減少をＨＥ　ｐ　−２細胞において検定した。用いられた条件下でシクロク レアチンはＰＩＶ−３へのわずかな阻害効果を有した。１５６ｍｇ／ｍ＋−２． ５ｍｇ／ｍｌの濃度において平均ＣＰＥは、３．８という平均標準ＣＰＥと比較 して３．　５−３．　７の範囲であった。より高い濃度て抗ウイルス効果が観察 されたが（１０ｍｇ／ｍｌ、平均ＣＰＥ　０．５：５ｍｇ／ｍｌ、平均ＣＰＥ　 ２．８）、いくらかの細胞毒性が観察された（目に見える細胞毒性はそれぞれ４ ０及び２０の等級であった）。
ＧＰＣＭＶに対するシクロクレアチンの抗ウィルス活性ＧＰＣＭＶ株２２１２２ はＩ）ｒ、Ｂｒ１ｇｇ１ｔｔｅ　Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、Ｖｅｔｅｒａｎ’　ｓ　Ａ ｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｃａｔ　Ｃｅｎｔｅｒ、Ｎｅｗ　Ｈａｖ ｅｎ、ＣＴにより提供された。
モルモット胚細胞の連続細胞系であり、モルモット−次胚細胞（ｐｒｉｍａｒｙ 　ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇ　ｅｍｂｒｙｏ　ｃｅｌｌｓ）から確立されたＧＰＥ細 胞は、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｍ、Ａ、Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗａｌｋｅｒｓ ｖｉ　Ｉ　ｌｅ、ＭＤ　から入手し、非必須アミノ酸、１０％ＦＢＳ及び０．０ ５％　ＮａＨＣＯ３を含む（抗生物質を含まない）イーグル最少必須培地中で増 殖した。
モルモソトサイロメガロウィルス（ＧＰＣＶＭ）株２２１２２に対するシクロク レアチンの抗ウイルス効果を、本実施例に記載のＣＰＥ減少アッセイを用い、Ｇ ＰＥ細胞において決定した。細胞培養感染投薬量、５０％終点（ＣＣＩＤｓ。） で表したウィルスの力価はＧＰＣＭＶの場合１ｘ１０２ＣＣＩＤ５゜／ウェルで あった。シクロクレアチンによる阻害効果は０．６２５−５．０ｍｇ／ｍｌの濃 度で観察された。この実験の結果を表１に記録する。
ヒトサイトメガロウィルスに対するシクロクレアチンの試験管内抗つィヒトサイ トメガロウィルス（ＨＣＭＶ）　、株ＡＤ−１６９はＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖ　ｉ 　Ｉ　Ｉ　ｅ、ＭＤ）から入手した。ＨＣＭＶ株Ｃ８７０４（ＤＨＰ　Ｇ耐性） 及びＨＣＭＶ株Ｃ８８０５−３７（ＤＨＰＧ耐性）はＤｒ。
Ｋａｒｅｎ　Ｂｉｒｏｎ（Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ　Ｃｏ、　、 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｔｒｉａｎｇｌｅ　Ｐａｒｋ、　Ｎ、　Ｃ，）かＭＲＣ− ５細胞は男性のヒトの倍数体胚肺細胞の連続系である。ＭＲＣ−５細胞のための 増殖培地は、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）（ＧＩＢＣｏ　ＢＲＬ）　、１０％ウ シ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃ　１ｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏｇａ ｎ、ＵＴ）、０．０３５％　Ｎ　ａ　ＨＣ０３から成る（抗生物質は含まない） 。Ｈｓ６８細胞はＡＴＣＣ（Ｒ。
ｃｋｖｉ　］　ｌｅ、Ｍｄ、）から入手し、４．５ｍｇ／ｍｌ　グルコース、１ ０％　ＦＢＳ及び０．１％　Ｎ　ａ　ＨＣＯｓを含むＤＭＥＭ　（ＧＩＢＣＯＢ ＲＬ）中で増殖した。
ブラークー減少実験 シクロクレアチンはＤｕｌｂｅｃｃｏのＭＥＭ　（ＤＭＥＭ）ＣＧＩ　ＢＣｏ　 ＢＲＬ）　、２％　ＦＢＳ、０１％　Ｎ　ａ　ＨＣＯ３，５０μｇ／ｍ１　ゲン タマイシン中で４ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、ＤＨＰＣは１ｍｇ／ｍｌの濃度で 調製し、同培地て希釈した。２４−ウェル組織培養平板（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で 確立されたＭＲＣ−５細胞の単層から増殖培地をデカンテーションした。平均２ ６．４プラ一ク形成単位を含む１ｍｌのウィルスを化合物の場合に用いたものと 同一の培地中で希釈し、非感染細胞標準として用いるウェル（２ウエル／平板） を除く各つｘ）しに入れ、非感染細胞標準として用いるウェルには１．Ｑｍｌの 無菌ウィルス希釈剤を入れた。平板を２２０Ｏｒｐｍにおいて室温で３０分間遠 心し、ウィルスを吸収させた。
培地を各ウェルから吸引により除去し、試験ウェルに０．８ｍｌの適した薬物希 釈液を入れた（２ウエル／希釈）。化合物を含まない組織培養培地を４つの非感 染ＩＩｌ胞標準標準ウェル板当たり２）、及び８つの感染無薬物標準（“ウィル ス標準”）ウェルに入れた（０．８ｍｌ／ウェル）。平板を５％　ＣＯ２，９５ ％空気の湿潤雰囲気下の３７℃で、ウィルス標準ウェルにおいてウィルスプラー クが区別できるようになるまでインキュベートした。
培地をすべてのウェルから吸引により除去し、１０％緩衝ホルマリン中の領　２ ％のクリスタルバイオレット０．３ｍｌを各ウェルに加えることにより細胞を染 色した。１５分後に染色液を吸引し、平板を水道流水で水が透明になるまで濯ぎ 、平板を裏かえして室温で乾燥した。プラークを解剖用顕微鏡を用いてｇ１数し た。
ＥＤ５０は、ウィルスプラークの平均数をウィルス標準のウィルスプラークの平 均数の半分に減少させると算出される抗ウイルス物質の濃度である。ＣＤ５０は 細胞に目に見える影響を与えない濃度と完全な細胞毒性を与える濃度の中点であ ると算出される抗ウイルス物質の濃度である。細胞毒性は薬物で処理した感染ウ ェルの細胞（プラークから離れて位置する）を調べることにより決定した。調べ た各物質に関する治療指数（ＴＩ）は式：Ｔ１＝ＣＤ５０＋ＥＤ５０により算出 した。
ＨＣＭＶに対するシクロクレアチンの抗ウィルス活性表２はシクロクレアチンが ヒトサイトメガロウィルス、株ＡＤ−１６９によるプラーク形成を阻害すること を示している。表２において、化合物のある濃度におけるプラークの数は、その 濃度の薬物を与えられた２つのウェルのプラークの数の平均である。処置ウェル のプラークの数の平均をウィルス標準ウェル（感染、無薬物標準）のプラーク数 と比較し、プラークのパーセント減少を決定した。ウィルス標準ウェルの平均プ ラーク数は２６．４±５．２であった。処置ウェルの平均プラーク数が標準の変 動の範囲内に含まれる場合、それはゼロパーセント阻害と考えられる（すなわち プラーク数が２１より大のウェルは０％阻害を示すとされる）。
表３に報告する結果は、接触一体止Ｈｓ６８細胞におけるヒトサイトメガロウィ ルス、株ＡＤ−１６９によるプラーク形成へのシクロクレアチンの阻害効果を証 明している。本実験において同一のプラーク減少アッセイを用いた。ウィルス標 準ウェルの平均プラーク数は７４．２±８゜６ブラークであった。６５プラーク より低いプラーク数を与える薬物の濃度が阻害性であると考えられる。
シクロクレアチンはＨＣＭＶに対して明確な抗ウイルス効果を有し、細胞に８日 間！ｌ露した後も目に見える細胞毒性の兆候を示さなかった。
治療指数はＭＲＣ−５細胞において６．５より大、Ｈｓ６８細胞において６．２ より大であると算出された。低い毒性及び優れた抗ウィルス活性の組み合わせに よりシクロクレアチンは優れた抗−〇〇ＭＶ材料となる。
ＨＣＭＶに対する他のクレアチン類似体の活性い（つかの他のクレアチン化合物 がＭＲＣ−５細胞上のブラークア、。
セイにおいてＨＣＭ　Ｖに対する弱い活性を有することが示された：化合物　Ｅ Ｄ５０　（ｍｇ／ｍｌ） グアニジノアセテート　２．０ ベーターグアニジノアセテート　２４ Ｎ−アセトイミドイルサルコソン　１４ネスミサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ ）　、株Ｓｍ１ｔｈはＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖ　ｉ　Ｉ　ｌ　ｅ、ＭＤ）から入手 した。ＲＴＩＩマウスの乳腫病から誘導された非−形質転換クローン細胞系であ るＣ１２７１細胞はＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖ　ｉ　］　ｌ　ｅ、Ｍｄ、）から入手 し、非必須アミノ酸（ＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯＢＲＬ、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏ ｄｕｃｔｓＤｉｖｉｓｉｏｎ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ、、Ｇ ｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、ＮＹ）を、１０％　ＦＢＳ　（Ｉｌｙｃ　Ｉ　ｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）及び０．　１％　ＮａＨＣＯ３ と共に含むイーグル最少必須培地（抗生物質を含まない）中で増殖した。
ＭＣＭＶの希釈のための試験培地は４．５ｍｇ／ｍｌ　グルコース、２％　ＦＢ Ｓ、鉤　１％　ＮａＨＣＯ３及び５０μｇ／ｍｌ　ゲンタマイシンを含むＤｕｌ ｂｅｃｃｏの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）であった。
ＭＣＭＶへのシクロクレアチンの効果 ネズミＣＭｖ実験は以下を除いてモルモットＣＭＶ実験と同様の方法で行った・ 　（１）Ｃ１２７１細胞及びＭＣＭＶを用い、（２）化合物及びウィルスの希釈 のための試験培地が異なり、（３）薬物の効果が強くないので細胞変性効果の十 分な発達を待つ代わりにプラークを計数した。
本実験の条件下でシクロクレアチンはＭＣＭＶに対する活性が低かった（例えば １０ｍｇ／ｍｌのシクロクレアチンの存在下で５３％プラーク減少）。モルモッ ト、ヒト及びネズミサイトメガロウイルスに対するシクロクレアチンの効果の差 がウィルスの差に起因するのか又は実験で用いた宿主細胞系の差によるのか明確 でない。
ＨＣＭＶのＤＨＰＣ−耐性（ガノンクロビル耐性）株を用い、プラーク減少アッ セイを上記の通りに行った。ＨＣＭＶ、株Ｃ８７０４又は株Ｃ８８０５−３７を 用いてＭＲＣ−５細胞に感染させた。アッセイの結果はそれぞれ表４及び５に記 録する。ＨＣＭＶのＣ８７０４株は試験管内て株ＡＤ−１６９より約１０−２０ 倍、Ｄ　ＨＰ　Ｃに対して耐性である。
表４に示す通り、シクロクレアチン（ＡＭ２８５）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で用 いると１００％プラーク減少がまだ観察され、Ｃ８７０４株が株ＡＤ−１６９よ り２ｘ以下の強さでシクロクレアチン（ＡＭ２８５）に対して耐性であることを 示している。
従ってシクロフレアンは薬物耐性株のための代替え治療を与えることができる。
さらに結果は、シクロクレアチンがＤＨＰＣ（ガノンクロビル）の機構と異なる 抗ウイルス機構により作用することを示唆している。
しかしＤ　ＨＰ　Ｇ及びシクロクレアチンに対して株Ｃ８８０５−３７が示した 耐性の量は、株ＡＤ−１６９に対する各化合物の活性と比較すると全く類似であ った（表５）。この結果はウィルス標準ウェルのプラーク数が４４．０±５３で あった第２の実験て確かめられた。株Ｃ８８０５−３７におけるＤ　ＨＰ　Ｇに 対する耐性は株Ａ’Ｄ−１６９よりわずか３−４倍大きいことに注意されたい。
さらにＤＨＰＣに対するウィルス耐性に関する分子的基礎は確立されておらず、 菌株の場合に異なり得る。
ＴＫ−Ｈ８Ｖ−１へのシクロクレアチンの効果Ｈ３Ｖ−１のチミンンキナーゼ陰 性株（ＴＫつに対するシクロクレアチンの抗ウィルス活性を、本実施例の上記の ＣＰＥ−減少アッセイだが細胞が血清欠乏でないアッセイを用い、へ口細胞にお いて検定した。
細胞培養感染投薬量、５０％終点（ＣＣＩ　Ｄｓｏ）て表した、本研究て用いた Ｉ］５ｖ−１の力価はｌＸ１０２５ＣＣＩＤ６．／ウェルてあった。本実験で用 いたＨ３Ｖ−１株ＢＷＩ　Ｏ１６８（ＴＫつは、Ｈ３Ｖ−１の他のＴＫ’株と比 較するとアンクロヒルに対する耐性を示す。典型的にアンクロビルに関するＥＤ ５０は、類似のＴＫ”株よりこのＴＫ−株の場合に８−１２２倍大ある。
／クロクレアチンはアッセイにおいて約９００μｇ／ｍ＋（約６．３ｍ　Ｍ　） のＥＤ５０を示した（表５）　。Ｈ３Ｖ−１のＴＫ’株に対する相対的活性（図 １）は約７ｍＭである。Ｈ３Ｖ　ＴＫ活性はシクロクレアチンの抗ウィルス活性 に必要でないので、シクロクレアチンはアシクロビルと異なる機構を介して作用 していなければならない。
ｖＺ■に対するシクロクレアチンの抗ウィルス活性ＭＲＣ−５細胞（表７Ａ）及 びＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ，Ｒｏ　ｃ　ｋ　ｖｉ＋１ｅ、ＭＤから入手したアフ リカグリーンモンキー腎臓細胞の連続系、表７Ｂ）におけるプラーク減少アッセ イを用い、水痘ウィルス、株Ｏｋａ（Ｄｉａｇ’ｎｏｓｔｉｃ　Ｈｙｂｒｉｄｓ 　Ｉｎｃ、、Ａｔｈｅｎｓ、ＯＨ）に対するシクロクレアチンの抗ウィルス活性 を決定した。
表７Ａ及び７Ｂに示す通り、このアッセイにおいてシクロクレアチンはＨＣＭＶ に対して示した活性と同様か、又はそれより高い抗ウィルス活性を示した。興味 深いことにＤＨＰＧは■Ｚ■に対し、ＨＣＭＶ、株ＡＤ−１６９に対するより効 果が低かった。
クレアチン及びクレアチンキナーゼ活性を阻害することができる多くの池のクレ アチン類似体を、培養中のベロ細胞においてＨ３Ｖ−１に対する抗ウィルス活性 に関して調べた。調べた化合物はクレアチン、ホモシクロクレアチン（１−カル ボキシエチル−２−イミノイミダゾリジン）、カルボクレアチン、エチルグアニ ジノ酢酸（ＥＧＡ）　、β−グアニンノブロピオネート及び１−カルボキシメチ ル−２−イミノヘキサヒドロピリミジンであった。さらにシクロクレアチン及び アンクロビルを正の標準として平行して調べた。
１つの実験において、ウィルスの１回の接種（１２５１”ＦＵ）におけるパーセ ント単層死を、寒天は上に載せないが基本的に実施例１に記載の範囲の薬物濃度 に関して決定した。各濃度を６回試験した（各濃度において６ウエル）。多様な 細胞系を用いて観察された細胞毒性の故に、カルボクレアチン濃度はこの実験に おいてＱｍＭ−３，５ｍＭの範囲で変化させた。
アッセイで用いた条件下で、調べた化合物のそれぞれが、調べた薬物の最高濃度 におけるいくつかのウェルで弱い保護効果を示した（７０ｍＭ　ホモシクロクレ アチン、３．５ｍＭ　カルボクレアチン、８４ｍＭ（ＥＧＡ）　、３８ｍＭ又は ７５．８ｍＭ　β−グアニジノプロピオネート及び９１ｍＭ　１−カルボキシメ チル−２−イミノヘキサヒドロピリミジン）。接種前にホモシクロクレアチンを 予備供給した細胞は、再現性のある抗ウイルス効果を与えなかった。
このアッセイにおいて、おそらく培地の容量オスモル濃度の変化のために、クレ アチンが７０ｍＭの濃度でいくらかの活性を示した。さらにこのアッセイにけお る阻害に必要なシクロクレアチン及びアンクロビルの濃度は通常より高かった（ それぞれ約２０％阻害のために３５ｍＭ及び約５０％阻害のために２．５ｍＭ） 。要約すると、クレアチン、ホモシクロクレアチン１．カルボクレアチン、ＥＧ Ａ、β−グアニジノプロピオネート及び１−カルボキンメチル−２−イミノヘキ サヒドロピリミジンはこの特定の実験において強い、及び／又は再現性のある抗 ウィルス活性を示さなかった。
第２組の実験において、１系列の異なる接種材料（０，１２，２５゜５０．１０ ０及び２００ＰＦＵ）において多様な濃度の各薬物を用いた。
この実験ではシクロクレアチンヵｌｌｌ５Ｖ−１感染ベロ細胞におけるパーセン ト単層細胞死に対する一貫した投薬量依存的阻害を示した。この組の実験で調べ たシクロクレアチン濃度はＯｍＭ、２．１５ｍＭ１４．３ｍＭ、８．６８ｍＭ、 １７．３５ｍＭ及び３４．７ｍＭシクロクレアチンを含んだ。カルボクレアチン （ＯｍＭＳｏ、１１ｍＭ、０．２１ｍＭ。
０．４３ｍＭ５０．８５ｍＭ及び１．７１ｍＭ）、β−グアニジノプロピオネー ト（ＯｍＭ、２．３５ｍＭ、４．７ｍＭ、９．４８ｍＭ、１８゜９５ｍＭ、３７ ．９ｍＭ）　、ＥＧＡ　（ＯｍＭ、２．６ｍＭ、５．２１ｍＭ、１０．５０ｍＭ 、２１．０ｍＭ及び４２．０ｍＭ）ならびに１−カルボキシメチル−２−イミノ ヘキサヒドロピリミジン（ＯｍＭ、２．８３ｍＭ、５．６７ｍＭ、１１．４２ｍ Ｍ、２２．８ｍＭ及び４５．　７ｍＭ）はこの実験において投薬量応答又は−貫 した保護効果を示さなかった。ホモシクロクレアチン（２，１５ｍＭ、４．３ｍ Ｍ、８．６８ｍＭ。
１７．３５ｍＭ及び３４．７ｍＭ）は、特にウィルスの高い力価においていくら かの弱い活性を示した。
他のウィルスへのホモシクロクレアチンの効果ホモシクロクレアチンをシクロク レアチンと平行して（１）ＭＲＣ−５細胞又はＨｓ　６８細胞におけるＨＣＭＶ 、株ＡＤ−１６９、（２）ＭＲＣ−５細胞におけるＨＣＭＶ、Ｄ）−ＩＰＧ−耐 性株Ｃ８７０４、（３）ＭＲＣ−５細胞ｉ：お＋：するＨＣＭＶ、ＤＨＰＧ−ｉ ｉｔ性株ｃ８８０５−３７及び（４）ＭＲＣ−５細胞におけろ水痘ウィルス、株 Ｏｋａに対し、実施例３に記載のプラーク減少アッセイを用いて調べた。２又は ４ｍｇ／ｍ１においてＨＣＭＶ、株ＡＤ−１６９に対して、及び１５．８ｍｇ／ ｍｌにおいて■ＩＣＭ■株Ｃ８７０４及びＣ８８０５−３７に対して弱い抗ウィ ルス活性が観察された。１．２及び４ｍｇ／ｍｌのホモシクロクレアチンの濃度 において■Ｚ■に対する弱い活性も観察された（それぞれ３６％、３９％及び５ ０％プラーク減少）。ホモシクロクレアチンに関する治療指数はシクロクレアチ ンの場合より典型的に低く、細胞毒性の増加を反映している。
さらに実施例３に記載のＣＰＥ減少アッセイを用い、ホモシクロクレアチンをシ クロクレアチンと平行してＭＤＢＫ細胞における疑似狂犬病ウィルス、ＧＰＥ細 胞におけるＧＰＣＭＶ、株２２１２２、及びベロ細胞におけ６Ｈ３Ｖ−１（７） ＴＫ−株ＢＷＩ　Ｏ１６８＋＝対しテ調へた。１２゜５ｍｇ／ｍｌのホモシクロ クレアチンの濃度においてＧＰＣＭＶに対する弱い抗ウィルス活性（平均ＣＰＥ 　３．７）が観察された。
２５％、５％及び１０％シクロクレアチンクリームを、乾燥シクロクレアチン（ ロフトＡＭ２８５）及び地方の薬局から購入したポリエチレングリコール（ＰＥ Ｇ）ベースクリーム（Ｓｑｕｉｂｂクリームベース＃８）から製造した。正の櫻 準、アンクロヒルは地方の薬局から５％アノクロビルクリームとして、又は経口 用調剤の形聾て購入した。
双股 実験の開始時にそれぞれ体重が約２０−２２ｇの雌のスイスＷｅｂｓｔｅｒマウ ス（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ　Ｌａｂ、Ｇｉ　Ｉｒｏｙ、ＣＡ）に単純ヘルペスウィル ス２型（Ｈ３Ｖ−２）　、株Ｅ１９４を膣内感染させた。
各マウスの膣を０．１Ｎ　ＮａＯＨに浸した線先端アプリケーターで５秒間ふき 、膣領域を刺激し、それにより感染を促進した。約１時間後、各膣を５秒間から ぶきした。続いて１０１１−１０＠ウィルス粒子／ｍｌを含むウィルス培地に浸 したアプリケーターを用いて各マウスに２０秒間塗り付けた。ふき綿が適所にあ る間、それを穏やかに、及びゆっくり前後にねじって動がした。
健 ウィルス感染の６時間後、開始クリームを膣領域の内部及び外回りに適用した。
マウスのグループを１０％、５％又は２．５％シクロクレアチンクリーム、５％ アシクロビルクリーム又はブラセボクリームで処置した。各グループの１０マウ スをシクロクレアチン又はアシクロビルで処置し、グループの２５マウスをブラ セボで処置した。処置は開始的に、１日３回、ウィルスの攻撃１産１日目から７ 白目まで行った。
毒性樟準 最終段階でウィルスが含まれないことを除いてウィルス感染に関する上記の方法 を用い、５マウスのグループを偽感染させた。これらのマウスを上記と同一の方 法で同一の時期に処置した。膣領域は潮紅及び刺激に関して毎日調べた。
感染の評価に用いるパラメーター 感染マウスにおける疾患得点を感染の３−１４日に毎日決定した。ｌ十の得点は 膣の直接の回りの潮紅を示す。２＋は疾患の肛門への広がりを示す。３＋は膣か ら肛門への疾患（通常腫脹を伴う）を示す。４＋は疾患が肛門の回りに進行した ことを示す。マウスの多くはその後感染のために死亡したので、死亡時近辺の疾 慝得点を１４日間の最後まで通した。これを行わないと、ブラセボグループの疾 患得点はほとんどの感染マウスが死亡した時に下がるように見えるであろう。い くつかの動物は後肢麻痺を現した（後に死亡した）。この状態は疾患得点に加え なかった。
Ｈ３Ｖ−２誘導膣炎に対するシクロクレアチンの生体内活性抗ウィルス活性の試 験管内における発見を拡張するために、上記のマウス膣炎モデルにおいてシクロ クレアチンを生体内で調べた。シクロクレアチン及びアンクロビルによる疾患阻 害の程度をブラセボ標準と比較した。図１０は、シクロクレアチンをＨ３Ｖ−２ 感染マウスの膣領域に開始的に適用すると、それはブラセボと比較して平均疾患 得点をわずかに下げることを示している。データ点の標準偏差及び統計的有意性 を同実験に関して表８に示す。シクロクレアチンは１０％クリームを用いていく らかの活性を示したが、５％及び２．５％の投薬量はこのアッセイでは不活性で あった。認められている通りアシクロビルは非常に有効であった。
疾患得点以外の基準により、これらの条件下でシクロクレアチンの効果はほとん ど、又は全くなかづた。１０％シクロクレアチンは生存率の向上においてわずか な活性を示したが（ブラセボグループの１６％に対して４０％）、試料サイズが 小さいので結果は満足できるほど有意でなかった。毒性標準における結果はシク ロクレチンが十分に許容され、膣領域に悪影響を起こさなかまたことを示した。
これらの結果は、ＰＥＧクリームベース中の１０％濃度のシクロクレアチンがこ のモデルにおいて中程度の抗ウィルス活性を有することを示している。アンクロ ビルは５％濃度において優れた活性を示した。開始的に適用されたアシクロビル クリームの濃度はシクロクレアチンの濃度の２倍低かったのみであるが、アシク ロビルに関する試験管内ＥＤ５０（７ｍＭ）はシクロクレアチンのＥＤ５０　（ ７ｍＭ）より１０００倍低い。
第２の実験でシクロクレアチンはマウス膣炎モデルにおいて弱い、しかし統計的 に有意でない活性を示した。しかしブラセボグループに２０マウスが含まれたこ の実験において、ブラセポグループの平均疾患得点は比較的低く、シクロクレア チンの効果を不明確にしたかも知れない。
薬物の開始的適用を必要とするこのモデルの場合、卓越した抗−ヘルペス剤であ るアシクロビルの活性に必要な濃度が比較的高いことに注意されたい。
食餌的、又は非経口的投与などの別の投与様式がより有効であり得る。
もう１つの実験を基本的に上記の通り、しかし以下を変えて行った＝（１）接種 アプリケーターは１ｍｌ当たり４ｘｌＯ’プラ一ク形成単位のウィルスを含むウ ィルス培地に浸し、（２）プラセボで処理するグループに２０マウスを含み、（ ３）アシクロビルはウィルス攻撃の２４時間後に開始して５日間、１日の投薬量 の半分づつ１日に２回、強制飼養により経口的に投与し、（４）シクロクレアチ ン調剤（ＡＭ２８５）は粉砕したマウスの餌に１％の最終濃度まで混合し、混合 物の供給をウィルス接種の３日前から開始してウィルス攻撃の１４日後まで続け た。平均疾患得点として記録されたこの実験の結果を表９Ａに報告する。比較の ためにアンクロビルを強制飼養により単独で投与した。アシクロヒルのみで処置 した動物の疾患得点を表９Ｂに報告する。
ＡＭ２８５はそれのみで２００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋ ｇにおいてアシクロビルによって得られる効果と同等の抗ウイルス効果を示した 。２５ｍｇ／ｋｇで投与されるアシクロビルのみは、比較的活性が低かった。１ ％食餌的ＡＭ２８５及びアシクロビル（２５ｍｇ／ｋｇ又は５Ｑｍｇ／ｋｇ）の 組み合わせはΔＭ２８５のみと同等の結果を与えた。しかし１％食餌的ＡＭ２８ ５と１００ｍｇ／ｋｇのアンクロビルの組み合わせはアシクロビルのみより優れ た応答を与え、これは動物に対する全体的利益という点で重要であった（１％Ａ Ｍ２８５のみ（表９Ａ）　、１００ｍｇ／ｋｇアシクロビル（表９Ｂ）及び１％ ＡＭ２８５プラス１００ｍｇ／ｋｇアシクロビル（表９Δ）の結果を比較された い）。これらの結果はグラフとしても示されている（図１１）。
データはシクロクレアチン及びアンクロビルの付加的効果と一致する。
この場合も１つ又は両方の薬物に関する異なる投薬量及び／又は投与様式により 試験管内で観察される効果のような相乗効果が明らかになる。
ＡＭ２８５は食餌において十分許容された。５マウスのグループを、ウィルス− 感染マウスと同様の管理方式下で１つ又は両方の薬物で処置した。表９０は感染 及び毒性標準マウスの全体的生存率を示す。アシクロビルのみて処置したグルー プと比較すると両化合物で処置したグループの生存者が数個多かった。１％ＡＭ ２８５及び１．００ｍｇ／ｋｇのアノクロビルて処置した動物のすべてが生存し た。毒性標準動物を実験の０日及び１５日に秤量した。１５日間を経た体重変化 の結果は、正常な餌のみを与えられたマウスと比較してシクロクレアチンがマウ スにおける体重増加を実際に促進することを示唆している。しかし動物は個別に 秤量していないのでデータの統計的有意性は得られず、観察を確かめるためにさ らに実験が必要である。
やはり上記の４つの修正を伴って行った第２の実験において、シクロクレアチン （ＡＭ２８５）の別の投薬量（０，７５％、０．５％薬物）が有効であることが 見いだされた。さらにウィルスの攻撃の１日後に開始してマウスの餌中で１％薬 物を与えられたマウスの１つのグループにおいて、中程度の抗ウイルス効果を得 ることができた。これらの実験の結果を表９Ｄに示し、それには標準偏差及び統 計的分析と共に平均疾患得点が示しである。各処置グループは１０マウスを含み 、ブラセボグループは２０マウスであった（ウィルス感染マウス７０）。
実施例６ クレアチン類似体を用いたマウスにおけるＨ３Ｖ−２膣炎の処置化合物 クレアチン（ＡＭ３８６）、β−グアニジノブビロオン酸（ΔＭ３８９）、シク ロクレアチン（ＡＭ２８５）、ホモシクロクレアチン（ＡＭ２８８）及び１−カ ルボキシメチル−２−イミノヘキサヒドロピリミジン（ＡＭ２８６）は購入又は 上記の通りに合成した。食餌的投与の場合、粉末形態の化合物を粉砕したマウス の餌に混合した。シクロクレアチン及びアシクロヒル（地方の薬局から経口用調 剤の形態で購入）は水中で経口的強制飼養用に調整した。水をブラセボとした。
感染 膣内感染は、感染のためのウィルス培地が約７ｘｌＯ’ＰＦＵ／ｍｌを含む以外 上記実施例５に記載の通りに行った。
ウィルス接種の３日前、数グループのマウスに、粉砕したマウスの餌に種々のパ ーセンテージの化合物を混合して含む食餌を開始した。供給はウィルス攻撃の８ 日後まで続けた。さらにシクロクレアチン（３２００又は１６００ｍｇ／ｋ　ｇ ／日）あるいはブラセポを、経口的強制飼養（１日当たり２処員）によりウィル ス攻撃的３日に開始してマウスの別のグループに投与した。アシクロビル（２０ ０ｍｇ／ｋｇ／日）を経口的強制飼養により、ウィルス感染の１時間前に開始し て１日２回、７日間投与した。
感染の評価に用いるパラメーター 疾患得点は上記実施例５に記載の通りに決定した。さらに膣ウィルス力価をウィ ルス接種の２日後に採取したふき綿から決定した。細胞培養培地中で湿らせたふ き綿を用いてマウスの膣内をふいた（処置グループ当たり５マウス）。各ふき綿 を１ｍｌの培地中に入れ、−８０℃で凍結した。滴定はＩＯｇ＋ｏウィルス希釈 を用いてベロ細胞を播種した９６−ウェル平板て行った。平板を３７℃で６日間 インキュベートし、ウィルスを顕微鏡により測定した。１ｍｌ当たりのウィルス の力価の算出はＲｅｅｄ、Ｌ、Ｊ、ａｎｄ　Ｍ、Ｍｕｅｎｃｈ、Ａｍ、Ｊ、Ｈｙ ｇ、、２７：４９３−４９８　（１９３８）の方法を用いて行った。
２１日間毎日、死亡を記録した。平均死亡日数算出には死亡したマウスのみを考 虜した。生存（Ｙａｔｅの修正を行ったχ２）、平均死亡日数（Ｓｔｕｄｅｎｔ のｔテスト）及びウィルス力価減少（ＳｔｕｄｅｎｔのＴテスト）を２端分析に より統計的に説明した。
結果 シクロクレアチン（ＡＭ２８５）　、ホモシクロクレアチン（ＡＭ２８８）、ク レアチン（ＡＭ３８６）及びβ−グアニンノブロピオン酸（ＡＭ３８９）は生体 内で抗ウィルス活性を示すことが疾患得点、膣ウィルス力価及び死亡率の減少に より決定された（表１０−１２を参照）。５％における１−カルボキシメチル− ２−イミノヘキサヒドロピリミジン（ＡＭ２８６）は活性ではなく、いくらかの 毒性を示しく下痢及び体重減少）、比較的低い投薬量がもっと有効であり得るこ とを示唆した。興味深いことに、シクロクレアチン（ＡＭ２８５）、ホモシクロ クレアチン（ＡＭ２８８）、クレアチン（ＡＭ３８６）及びβ−グアニジノブロ ビオン酸（ＡＭ３８９）は生体内でリン酸化されるがＡＭ２８６はリン酸化され ないと報告されている。
強制飼養によるシクロクレアチンの投与（１６００又は３２００ｍｇ／ｋｇ／日 ）は本実験条件下で無効であった。
実施例７ Ｈ８Ｖ−２マウス膣炎のさらに別の研究マウス膣炎モデルにおけるさらに別の研 究を行った。プラセポ標準における遅い感染速度及び起こり得る供給の問題が１ つの実験の結果を混乱させた。さらにカルボキノクレアチニン（１−カルボキシ メチル−２−イミノイミダゾリジン−４−オン）を含む化合物をその後の実験に おいて再試験し、それを本明細書に報告する。
生含惣 クレアチン、クレアチンリン酸（Ｎ−ホスホリルクレアチン）、シクロクレアチ ン（ＡＭ２８５）、グアニジノアセテート、１−カルボキシメチル−２−イミノ ヘキサヒドロ−ピリミジン（ＡＭ２８６）　、Ｎ−アセトイミドイルサルコソン 及びカルボキンクレアチニン（１−カルボキシメチル−２−イミノイミダゾリジ ン−４−オン）は購入するか、又は上記の通りに合成した。
感染、処置及び毒性標準 それぞれ体重が約２０ｇのマウスの感染は、ウィルス培地が約ｌＸ１０’ＰＦＵ のウィルス／ｍｌを含む以外は基本的に上記実施例５に記載の通りであった。化 合物は粉砕したマウスの餌と選ばれたパーセンテージで混合した。供給は接種の ３日前に開始し、攻撃ｉ＆８日まで続けた。
粉砕したマウスの餌をプラセボとした。アンクロビル（２００ｍｇ／ｋｇＺ日） はウィルス攻撃後６時間に、及びさらに７日間１日２回、経口的強制飼養により 投与した。
毒性は各薬物管理方式に従って処置した非感染マウスにおける死亡、体重減少又 は体重増加の欠乏により監視した（１管理方式当たり５マウス）。動物は感染の ３日前及び８日後に秤量した。
結果 痰中得点（表１３Ａ及び１３Ｂ）は実施例５に記載の通りに決定し、膣ウィルス 力価（表１５）は２日目に１グループ当たり５マウスで、及び３日目に１グルー プ当たり他の５マウスで上記実施例６に記載の通りに決定した。膣ウィルス力価 はｍ！当たりのｌｏｇ、。細胞培養感染投薬看として表した（ＩＯｇ＋ｏＣＣＩ Ｄｓｏ／ｍｌ）。生存（表１５、Ｆｉｓｈｅｒ厳正試験（ｅｘａｃｔ　ｔｅｓｔ ））、平均死亡日数（表１５、Ｍａｎｎ　Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ　試験）及びウィ ルス力価減少（Ｍａｎｎ　Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ　試験）を二端分析により統計的 に説明した。
本実験の条件下でカルボキノクレアチニン及びアシクロビルのみが統計的に有！ な抗ウィルス活性を示した。食餌的グアニジノアセテート（１％）及び１−カル ボキシメチル−２−イミノヘキサヒドロピリミジン（ＡＭ２８６　；　１％）は 感染を悪化させた。いくつかの動物は感染に対して不治であった（表１４を参照 、回収可能なウィルスを有するマウスの数）。
さらにシクロクレアチンが活性を示した他の実験と対照的に、餌は供給の間で完 全に消費された。従って化合物の捲取が最適でなかったかも知れない。
１％カルボキシクレアチニンを用いた処置は疾患の発達を阻害し、死亡を完全に 予防し、ウィルス感染を阻害したように見えた（表１３Ａ１１４及び１５）。ウ ィルス力価及び回収可能なウィルスの減少の故に、この特定のグループの感染が 無効であった可能性があるが、感染は実証され、５日目の視覚による観察はカル ボキンクレアチニン−処置動物の６０％における感染と一致した（膣領域の潮紅 ）。
上記の実験を、シクロクレアチン（ＡＭ２８５）、シクロクレアチンリン酸（Ａ Ｍ６９６．１−カルボキシメチル−２−イミノ−３−ホスホノイミダゾリジン） 、クレアチン、カルボキシクレアチニン（ＡＭ６９０）及び１−カルボキンメチ ル−２−イミノイミダゾリジン−５−オン（ＡＭ６８９）を用いて繰り返した。
シクロクレアチンリン酸はリチウム塩として製造したので、標準としてＬｉＣ０ ，が含まれた。毒性標準動物のいずれも死亡せず、薬物−処置マウスにおける体 重増加はブラセボと同様であり、化合物が毒性でないことを示した。
本実験の結果を表１６及び１７に示す。全体的（合計）疾患得点は１％シクロク レアチン、２％シクロクレアチン（ＡＭ２８５）及び１％クレアチンにより有意 に減少した（表１６）。食餌的シクロクレアチン（ＡＭ２８５．１％及び２％） 、クレアチン（１％）、及びカルボキシクレアチニン（ＡＭ６９０．１−カルボ キンメチル−２−イミノイミダゾリジン−４−オン、１％）も膣ウイルス力価を 減少させたことが、感染後２白目に決定された（表１７においてｍ１当たりのＩ Ｏｇ＋ｏ細胞培養感染投薬量又はｌｏｇ＋ｏｃｃＩＤｓ。／ｍｌとして表す）。
シクロクレアチンリン酸（ＡＭ６９６．１％）　、ＬｉＣＯ５（０，３％）、カ ルボキシクレアチニン（ＡＭ６９０．１−カルボキシメチル−２−イミノイミダ ゾリジン−４−オン、１％）及び１−カルボキシメチル−２−イミノイミダゾリ ジン−５−オン（ＡＭ６８９．１％）は、本実験条件下でブラセボと比較して疾 患得点の統計的に有意な減少を示さなかった。
シクロクレアチン粉末は経口的強制飼養による投与のために水中で調製するか、 あるいは１％食餌的薬物の随意供給のために粉砕したマウスの餌と混合した。水 （経口的強制飼養により投与）をブラセポ標準とした。
感染及び処置 それぞれ体重が約１８−２０ｇの雌のスイスＷｅｂｓｔｅｒマウス（Ｓｉｍｏｎ ｓｅｎ　Ｌａｂｓ）を、マウス当たり１ｘ１０５ＰＦＵにおいてＨ３Ｖ−２（Ｍ Ｓ株）に腹腔内感染させた。ウィルス接種の１４日前に（−１４日）、シクロク レアチン又はブラセボを用いた経口的強制飼養を開始した。処置は毎日２回、２ ２日間であった。食餌的シクロクレアチン（食餌の１％）は随意に投与した。ア シクロビルは経口的強制飼養により、ウィルス攻撃の１時間前に開始して１日２ 回、８日間投与した。最初は各薬物処置グループに１０マウス、及びブラセボ標 準に２０マウスがいたが、処置の長さ及び付随する損傷のためにいくつかのマウ スが感染の開始の前に死亡した。
毒性標準 ５の非感染マウスのグループを感染動物のグループと同様の管理方式下で処置し た。マウスを毎日生存に関して調べた。標準マウスは一１４日及び８日に相当す る日に秤量した。
杭！ 薬物の効果は死亡及び平均死亡日数の決定により監視した（表１８）。
死亡は毎日２１日間記録した。平均死亡日数算出には死亡したマウスのみを含ん だ。生存（Ｙａｔｅ修正を行ったχ２分析）及び平均死亡日数（Ｓｔｕｄｅｎｔ のｔテスト）を二端分析により統計的に説明した。
表１８に示す通り、食餌の形態又は経口的強制飼養によるシクロクレアチンの投 与により、ＨＳ　Ｖ　−２脳炎による死亡率がブラセポに対して統計的に有意に 減少した。感染により死亡したマウスの中で、３２００ｍｇ／ｋｇ／日における シクロクレアチンは平均生存時間も延長させた。
薬物は十分に許容され、２２日の処置期間を経て毒性であると思われないことが 体重増加及び健康的外観から決定された。
実施例９ シクロクレアチンを用いたＨ３Ｖ−１皮膚疾患の処置供倉惣 シクロクレアチン（ロンｌ−ＡＭ２８５）は上記の通りに合成し、粉砕したマウ スの餌に混合することにより経口的使用用に調製した。アシクロビルは地方の薬 局から経口用調剤として購入した。
臀倚 実験の開始時の体重がそれぞれ約１５ｇの雌のヘアレスマウス（免疫受容性）（ ｉｍｍｕｎｅ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）（ＳｉｍｏｎｓｅｎＬａｂｓ、Ｇｉ　ｌ　 ｒｏｙ、ＣＡ）の皮膚に単純ヘルペスウィルス１型（Ｈ３Ｖ−１）　、Ｋ２Ｓ株 を感染させた。腹腔内に１００ｍｇ／ｋｇのケタミンを用いて動物を麻酔した。
続いて各マウスの右側の皮膚を、２５ゲージの注射針を用いて２つの領域（肩の 近辺及びももの近辺）において引っ掻いた。引っ掻いた各領域は直径が約５−８ ｍｍであった。５０μｍのウィルスの滴を各傷上に置き、動物が麻酔により休ん でいる間、放置した。
処！ ウィルス接種の３日前に１０のマウスのグループに、粉砕したマウスの餌に混合 した１％のシクロクレアチンを含む食餌を開始した。供給はウィルスの攻撃後１ ４日まで続けた。アシクロビルは１０のマウス；こ、ウィルス感染の２４時間後 に開始して１日２回、５日間強制飼養（こよりそれぞれ５マウスのグループをウ ィルス感染マウスと同様の管理方式下テ装置した（ａ、２００ｍｇ／ｋｇのアシ クロビル：ｂ１１％食餌的ノクロクレアチン；Ｃ１粉砕した餌プラセボ）。さら に２つの別のプラセボマウスにブロックの餌を供給した。これらの１７のマウス を感染の一３日及び１５日に相当する日に秤量した。死亡、体重減少又は体重増 加の欠乏を毒性の指榎とした。マウスは生存に関して毎日調べた。
感染の評価に用いるパラメーター 感染マウスの疾患得点は感染の３−１４日に毎日決定した。このモデルの場合、 体に垂直に横切る疾患が発達し、その幅は５−８ｍｍであり、長さが最高２ｃｍ であった（腹の回りを取り巻いた）。１．２．３又は４の疾患得点はそれぞれ約 ０．５．１．０．１．５又は２．０ｃｍの疾患の長さに対応させた。もち及び肩 の疾患に別々の得点を指定した。かくして特定のマウスに関して最高８の疾患得 点が与えられる。感染による死亡により疾患得点は増加しないが、死亡前の疾患 得点を実験の最後まで延長し、動物の死亡時に合計の得点が下がるのを防いだ。
死亡は毎日、２１日間記録した。平均死亡日数の算出には死亡した動物のみを含 んだ。生存（Ｆｉｓｈｅｒ厳正テスト）及び平均死亡日数（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ テスト）を二端分析により統計的に説明した。
結果 表１９は櫻準偏差及び本実験の統計的分析と共に平均疾患得点を示す。
本実験の条件下でＨ３Ｖ−１感染のこのモデルの場合、シクロクレアチンは全体 的疾壱の重度の軽減により決定される統計的に有意な抗ウイルス効果を示さなか った。シクロクレアチン−処置グループにおける生存数は標準グループより少な かったが、この結果は統計的に有意ではない。
実験の経過後の体重増加は、シクロクレアチンがこの投薬量で毒性でないことを 示す。対照的にアシクロビル（２００ｍｇ／ｋｇ）はブラセボグループに対して 疾患の重度の軽減に有効であった。アノクロビルはｌ４ＳＶ−１感染マウスの死 亡率も低下させた。
化合物 シクロクレアチンは上記の通りに合成した。クレアチンリン酸はＩＣＮ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入し、ガンシクロビルは地方の薬局から購入した。他 の化合物はすべてＳｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、から購入した。
ガンシクロビルは経口的強制飼養処置用に水中で調製した。食餌的投与の場合、 随意の供給用に他の化合物を粉砕したマウスの餌と共に調製した。化合物のパー センテージを調節し、ナトリウム、ＨＣＩ及びリン酸基を調節した。かくして遊 離の状態の各化合物のパーセンテージは以下の通りである：クレアチン（１％） 、クレアチンリン酸（１％）、β−グアニジノプロビオン酸（１％）、クレアチ ニン（１％）、アルギニン（１％）、及びグリシン。粉砕したマウスの餌をブラ セボとした。
感染及び処置 雌のスイスＷｅｂｓｔｅｒマウス（それぞれ約１１−１２ｇ）に、マウス当たり １ｘｌＯ’プラ一ク形成単位でネズミサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶＳＳｍｉ 　ｔｈ株）を腹腔内感染させた。ウィルス接種の３日前に、ＡＭ２８５及び他の 化合物（ガンシクロビルを除く）を用いた供給を開始し、攻撃後７日間続けた。
ガンシクロビルの投与は、攻撃の１時間前に開始して１日２回、８日間、経口的 強制飼養により行った。
毒性標準 ５非感染マウスのグループをウィルス−感染動物と同様の管理方式下で処置した 。それらは感染の一３日及び８日に秤量した。死亡、有意な体重減少又は体重増 加の欠乏を毒性の指標とした。マウスは生存に関して毎日調べた。
杭愚 各化合物の効果は死亡及び平均死亡日数測定により監視した（表２０）。
死亡は２１日間、毎日記録した。平均死亡日数には死亡したマウスのみを含んだ 。生存（Ｙａｔｅ修正を行ったχ２分析）、及び平均死亡日数（Ｓｔｕｄｅｎｔ のｔテスト）を二端分析により統計的に説明した。
表２０に示す通り、実験の条件下でガンシ知ビルを除くいずれの化合物も、離乳 したでのマウスにおいてブラセポに対する死亡率の有意な低下を引き起こさなか った。クレアチンリン酸−１β−グアニジノフロピオン酸−及びクレアチニン− 処置グループにおける死亡率はブラセボより大であった。クレアチンリン酸又は クレアチニンで処置したグループのそれぞれ１の動物が死亡し、これらの化合物 が毒性をいくらか伴うことを示唆した。
実施例１１ シクロクレアチンを用いたヒトＣＭＶ感染の処置サイトメガロウィルスは主に種 −特異的ウィルスなので（ヒトウィルスはヒトのみに有効に感染する）　、ＣＭ Ｖ感染の動物モデルは、モルモット又はマウスなどの動物のそれらの同族サイト メガロウィルスによる感染を含む。シクロクレアチンがこれらのモデルにおいて 有効であるかどうかを調べるために、プラークアッセイにおいて各ウィルスに対 してシクロクレアチンを調べた。下記にまとめる通り、これらのウィルスに対す る試験管内のＣｃｒのＥＤ５ＱはヒトＡＤ−１６９株に対するＥＤ５０の５−１ ０倍であった。これらの結果と一致して、又実施例１ｏに示された通り、用いら れた条件下でシクロクレアチン及び数種の他のクレアチン類似体はマウスにおけ るネズミサイトメガロウイルス感染に対して生体内で有意な抗ウィルス活性を示 さなかった。
種々の株のサイトメガロウィルスへのＡＭ２８５の効果（ヒト、マウス及びモル モット） ＨＣＭ　Ｖ　ΔＤ１６９　３００−６１０８７０４　ＤＩＩＰＧ　（ｒ）　９０ ０８８０５−３７　ＤＨＰＧ　（ｒ）　２０００−２７８０ＭＣＭＶ　（３Ｔ３ 細胞）　２２７０ （Ｃ１２７＋細胞）　９６１５ ＧＰＣＭＶ　（ＧＰＥ細胞）　３２７１ウサギにおけるＨ　ＣＭ　Ｖ−誘導網脈 絡膜炎ウサギの目の硝子体にヒトサイトメガロウィルスを接種すると、ＣＭ■感 染のネズミモデルの代替えとなる（Ｄｕｎｋｅ　ｌ、Ｅ、Ｃ，、Ｔｒａｎｓｐｌ ａｎｔａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃ、、２３（３）＋２５　２８（Ｓｕｐｐ　１．３． １９９１））　。）−１ｃＭＶ−誘導網脈絡膜疾磨はヒトにおいて観察される進 行性ＨＣＭＶ網膜炎と類似している。ウサギにおけるウィルス投与及び感染の重 度の決定に用いる方法を以下に記載する。
シクロクレアチンは０．６−１．０ｍＭの範囲の量で血清中に存在すると組織中 に約３ＱｍＭの量まで堆積する。従ってウサギにおＬＸて１ｍＭの血清量を保持 する場合のシクロクレアチンの継続的静脈内投与の効率を調べた。予備実験によ り８３３ｍｇ／ｋｇ／日（１，８ｋｇのウサギにおいて１５ｍｇ／ｍｌで１００ ｍ１／時）の投薬量力（ウサギ蕃こお１するこの目的量を達成することが示され た（図２４を参照）。この投薬範囲及び投与の様式をウサギウィルス網膜炎の処 置に用いるために選んだ０ＩＴｃＭＶ網脈絡膜炎のウサギモデルにおける投薬量 効率評価の向上選ばれた投薬量における静脈内治療（例えば継続的輸液）の間の クレアチン又は他のクレアチン類似体（例えばシクロクレアチン）の効率あるい は適性を、臨床的疾患進行（スリットランプ生物顕微鏡法（ｓｌｉｔ　ｌａｍｐ 　ｂｉｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）及び間接的検眼鏡法により決定）、ウィルス回 収、及びＨＣＭＶ−誘導組織病理学的疾患重度（例えばＤｕｎｋｅｌ、Ｅ、Ｃ， 、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃ、、２３　（３）：２５−２８　 （ｓｕｐｐｌ、３．１９９１）を参照）の比較により評価した。例えば２つの濃 度の選ばれた薬物を静脈内投与することができる（高濃度のものと低濃度のもの ）。平行して食物及び水中の食餌的薬物の随意の投与の効果を監視することがで きる。シクロクレアチン及び他のクレアチン類似体の静脈内及び食物（食餌的） 投与の生体内の効率を（ａ）正の治療標準としての静脈内Ｄ　ＨＰ　Ｇ治療（１ ０ｍｇ／ｋｇ／日を２回に分けた投薬で）、及び（ｂ）負の未処置標準としての ブラセポ治療と比較する。
ＨＣＭＶ網膜炎に対する抗ウィルス活性のアッセイ無細胞ヒトサイトメガロウィ ルス（ＨＣＭＶ）接種材料を、ＨＣＭＶ。
株ＡＤ１６９に感染したヒト包皮線維芽細胞（ＡＴＣＣから得たＨｓ６８細胞） から、培養フラスコから細胞をこすり取り、２１ゲージの針を通過させることに より細胞を粉砕し、遠心により細胞破片を除去することにより調製する。接種材 料の力価をＨｓ６８細胞単層上の標準的プラークアッセイにより決定する（最低 １０’ＰＦＵ／ｍｌ）。非感染標準としてＨｓ　−６８無細胞上澄み液を調製す るために非感染細胞を用いることができる。
別の標準としてＨＣＭＶの熱不活化無細胞接種材料を調製することができる。無 細胞ＨＣＭＶ原液の２ｍｌのアリコートをガラス遠心管に移し、７分間煮沸する か、又は１５分間オートクレーブにかける。熱不活化の後、Ｈｓ６８単層上のプ ラークアッセイにより接種材料から感染性）ＩＣＭＶは回収できない。
合計２４のウサギを本研究で用い、それらを処置のために１２の２グループに分 ける。硝子体内注入の前に、虹彩拡張してからスリツトランブ生物顕微鏡法（Ｓ ＬＥ）及び手動保持９０ジオプトリーレンズを用Ｌｚた間接的検眼鏡法（■０） により動物を評価し、正常な眼の形態及び既往症（例えば既往の前部セグメント （ａｎｔｅｒｉｏｒ　ｓｅｇｍｅｎｔ）又は網脈絡膜疾患）のないことを決定す る。
（１）二よ旦：動物を個別に収容する。シクロクレアチン−処置動物の頚静脈中 に留置カテーテル埋植を与える。場合によりカテーテルを介して静脈内抗生物質 を１−２日間投与し、適した回復を保証すること力くできる。
コポラミン臭化水素酸塩（０，２５％）点眼剤で処置し、接種前に虹彩を拡張す る。点眼剤は研究の間を通じて毎日投与する。場合により１％のアトロピンを拡 張に用いることができる。動物を別に、例えばケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）及び アクプロマシン（５ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内注入して投与することにより麻酔する 。１０５ＰＦＵのＨＣＭ　Ｖ、株ＡＤ１６９を１００μｍで硝子体中央に注入す ることにより動物の両眼；こ接種する。各接種材料は、２７ゲージ針をつけた無 菌の１ｍｌ・ンベルり１ノンノリンジ中に入れた。虹彩の拡張後、眼をブロノく トー＞、Ｌ（ｐｒｏｐａｔｏｓｅｄ）、固定し、角膜輪部より４−５ｍｍ横の強 膜鞘（ｓｃｌｅｒａｌ　５ｈｅａｔｈ）を３−６時の位置で針を用いてつつく。
接種材料を硝子体内注入に１５−３０分かけて直接注入する。針をゆっくり取り 出し、眼を１０によりすぐに調べ、注入による眼の損傷の可能性を評価する。
（３）感染ｉ＆（ＰＩ）１日から６日ＰＩ：動物を輸液のためのポンプにつなげ る。シクロクレアチン（１５ｍｇ／ｍｌｘ１２０−１５０ｍｌ／日）又は１０ｍ ｇ／ｋｇ　ＤＨＰＧ治療を継続的輸液により行う。プラセボ動物は輸液を行わな いか、あるいは例えば食塩水の輸液を受けることができる。１２のＨＣＭＶ−接 種動物の各グループを以下の通りに処置する。６のシクロクレアチン−処置動物 （１５ｍｇ／ｍｌｘ１２０−１５ｍｌ／日シクロクレアチン）：３動物　ＤＨＰ Ｇ　（１０ｍｇ／ｋｇ／日）、及び３動物　ブラセポ治療。これらの投薬量を感 染後１日から６日まで投与する。
（４）評価：動物はＳＬＥ、及び９０ジオプトリーレンズを用いた間接的検眼鏡 試験により毎日調べ、角膜、網脈絡膜、虹彩、前房及び硝子体変化を含む臨床的 ＨＣＭＶ疾患進行（１日から６日ＰＩ）を評価し、播種性ＨＣＭＶ感染（肺炎） の兆候に関して全身的に評価する。間接的検眼鏡試験は、ウサギが受けている治 療に関して隠された２人の読み取り人により独立して行う。
ＳＬＥの場合は覚醒して、１０の場合は全身麻酔下で動物を観察する。
ＳＬＥの場合、］滴の２％フルオレセインを試験の前に６眼に点眼する。
白色及びコバルトブルー光を用いて動物を調べ、結膜、角膜及び前房のＨＣＭＶ −誘導疾患を評価する。）ＴＣＭＶ−誘導疾患は０−４＋に重度が増加する尺度 上で等級化し、図及び写真で示す。網脈絡膜炎得点、０＋、異常なし、１＋、孤 立性白網膜浸潤（ｆｏｃａｌ　ｗｈｉｔｅ　ｒｅｔｉｎａｌ　１ｎｆｉｌｔｒａ ｔｅｓ）；２＋、孤立性−地形性白網膜浸潤及び血管充血：３＋、白網膜浸潤、 血管充血及び出血：４＋、前記の疾患の顕症のすべて、及び網膜剥離。ビリチス （ｖ　ｉ　ｒ　ｉ　ｔ　ｉ　ｓ）得点二〇＋、異常なし；１＋、ストランド、綿 毛ボール（ｆｌｕｆｆｂａｌｌ）又は細胞の単離：２＋、微から中程度のかすみ 及び浸潤、網膜のほとんどは可視；３＋、中から高程度のかすみ及び浸潤、網膜 のほとんどは不明確：４＋、高程度のかすみ、浸潤及び／又は出血、網膜は不明 確（例えばＤｕｎｋｅｌ、Ｅ、Ｃ，、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　Ｐｒｏ ｃ、、２３　（３）：２５−２８　（Ｓｕｐｐｌ、３．１９９１）を参照）。
１０の場合、動物をケタミンＨＣＩ　（５０ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注入により麻 酔し、１滴の１％アトロピンを拡張のために眼に点眼する。場合によりフェニレ ブチンＨＣＩ　（０，５％）及びスコポラミン臭化水素塩（０２５％）点眼剤を 拡張に用いることができる。深い麻酔下で両眼の眼球後部セグメントを両側から 調べ、ｌ−Ｉ　ＣＭ　Ｖ−誘導疾患を実証する。
（５）ウサギにおける化合物の血液量を監視するために各治療グループの１動物 から血液を得る。例えば以下の時間間隔て血清を得る。薬物輸液開始後６時間、 輸液後２４及び４８時間。
（６）７日ＰＩ　感染の７日後に動物を犠牲にする。網脈絡膜試料を取り出し、 Ｈｓ　６８細胞単層上の細胞音波処理アッセイによるＨＣ〜ＩＶ回収用に加工す る（プラークアッセイ）。選ばれた眼及び肺組織試料を組織化学用に加工し、処 置及び非処置グループにおけるＨ　ＣＭ　Ｖ−誘導肌性病理学を評価する。片目 （ｃｏｍｐａｎｉｏｎ　ｏｃｕｌａｒ）及び全身組織を液体窒素中で急速凍結し 、組織試料中の化合物の濃度を決定する。
細胞−音波処理培養によるＨＣＭＶ回収のために、ツベルクリンシリンジ中に吸 引することにより硝子体を眼から吸引し、すぐに１５ｍ１の遠心管に移す。網脈 絡膜組織試料を強膜からこすり取り、１５ｍ１の遠心管に入れ、１．５ｍｌのＨ ＢＳＳ　Ｃハンクス平衡塩溶液）を網脈絡膜組織に加える。試料を氷水浴に入れ 、ＶＷＲＢｒａｎｓｏｎ　５ｉｎｆｉｅｒ２５０（各回１０秒の３パルス）を用 い、１３５ワツト及び６０％のデユーティ−サイクル（ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ） で音波処理することにより粉砕する。音波処理後、試料を低速卓上遠心機におい て４５０ｘｇで１０分間遠心する。５０μｇの上澄み液を容管から取り出し、５ ００μｌのＭＥＭを含む密集Ｈｓ６８　Ｃｏ５ｔｅｒ細胞単層に３重に移す。細 胞−音波処理物の単層接種後２４時間で培地をウェルから吸引し、培養に５００ μｍの新しいＭＥＭを加える。培地は２日毎に変える。ＨＣＭＶ細胞−音波処理 物回収培養は３７℃でインキュベートし、毎日観察する。ＨＣＭＶ細胞−音波処 理物は７日間隔で移す、単層を培地中にこすり取り、集め、上記の通りに音波処 理し、集め、音波処理した上澄み液を新しいＨｓ６８細胞単層に３重に移す（５ ０μｌ／Ｃｏ５ｔｅｒウエル）。ＨＣＭＶ細胞変性効果が検出されない場合、細 胞−音波処理物を接種した培養を感染後７日、１４日及び２１日に合計３回移す 。ＨＣＭＶ細胞変性効果が逆光顕微鏡により細胞培養中で検出された場合、感染 を３＋感染状態まで進行させてから培養を収穫する。硝子体及び網脈絡膜培養か ら回収されたＨ　ＣＭ　Ｖを凍結し、標準的方法による免疫蛍光法を用いて）− （ＣＭＶであることを確認する。
すべての薬物−処置静脈内治療グループに関する臨床的、ＨＣＭＶ回収、及び組 織学的効率の結果は互いに、及びプラセポ治療グループと関連シティる。（ａ） ＨＣＭＶ−誘導疾患の臨床的顕症、（ｂ）ＨＣＭＶ回収、又は（Ｃ）組織病理学 の減少又は予防は抗ウイルス効果の指標である。
実施例１２ ）ＩＳＶ−１及びＩＳＶ−２細胞変性性に対するシクロクレアチンとアシクロビ ルの相乗性シクロクレアチンの抗ウイルス効果は新しい種類の抗ウィルス剤の発 見を与えるので、シクロクレアチンと代表的な他の普通の種類の抗ウィルス剤で あるヌク１ノオンド類似体との相乗性を調べるのは興味深かった。
シクロクレアチン（ＡＭ２８５）及びアンクロビルを単独で、及び組み合わせて 用い、それらが相乗的に作用してＩ−Ｉ　Ｓ　Ｖ−誘導細胞変性性を阻害するこ とができるか否かを決定した。各薬物のみ、又はそれらを組み合わせて用いた細 胞変性効果の研究を、寒天を上乗せしないこと以外は実施例１に記載の通りにし て血清−欠乏べ口細胞において行った。
図１２−１４はシクロクレアチン、及び東越した抗ヘルペスヌクレオシド類似体 であるアンクロビルが血清−欠乏べ口細胞においてＩ−Ｉ　Ｓ　Ｖ　−１及びＨ Ｓ　Ｖ　−２の細胞変性効果を相乗的に阻害できることを示す。データは、あら かじめ決められた抗ウイルス性の終点を達成するために単独て、又は組み合わせ た場合に必要な各薬物の部分阻害濃度としてイソホログラムの形態で示しである 。単独で与えた場合、選ばれた終点を達成するために必要な部分阻害濃度は１． 　Ｑである。池の薬物と組み合わせて投与した場合、同一の効果を得るために必 要な薬物の量は少ない。
薬物の付加的効果は、（Ｘ−〇、ｙ＝１）及び（Ｘ＝１、ｙ＝０）で限定される 点の間の直線を与える。データがこの線より下にくぼんだ線を与える場合、相乗 効果が示される。
図１２の場合、ＩＳＶ−１誘導細胞変性性を６５％阻害するために必要なシクロ クレアチン（ＡＭ２８５）及びアシクロビルの投薬量はそれぞれ３５ｍＭ及び０ ９７μＭであると決定された。各薬物の部分阻害濃度を組合わせ、細胞変性性を ６５％阻害するこれらの組み合わせを図１２にプロットした。
ＩＳＶ−２誘導細胞変性性を６０％又は７０％阻害するのに必要なシクロクレア チン（ＡＭ２８５）又はアシクロビルの濃度はそれぞれ３５ｍＭ及び１．９５ｍ Ｍであると決定された。部分阻害濃度を組み合わせて用い、６０％又は７０％阻 害を与える組み合わせを図１３（６０％阻害終点）及び図１４（７０％阻害終点 ）にプロットした。図１２−１４に記録する各実験の場合、得られたイソホログ ラムは相乗性を示唆している。
これらの実験の結果は、シクロクレアチンがヌクレオチド類似体と異なる種類の 抗ウィルス剤を与えるという仮定を支持している。さらにシクロクレアチンはそ の効力を向上させる、及び／又はその毒性を低下させるようなヌクレオチド類似 体と組み合わせて臨床的に用いることができる。
上記で議論したマウス膣炎モデルの条件下で、１０％のシクロクレアチン及び２ ％、１％又は０．　５％のアシクロビルを含む開始遇用クリームを用いた１組の 実験においてシクロクレアチン及びアシクロビルの相乗効果は観察されなかった 。動物に１％のシクロクレアチンを含むマウスの餌を供給し、アノクロビルを強 制飼養により投与した別の実験の場合（上記参照）、アノクロビルとシクロクレ アチンの付加的効果が観察された。生体内の相乗効果を観察するために、例えば 異なる調剤又は投与経路（例えば非経口的）を用いた別の実験が必要である。
実施例１３ 抗ウィルス活性はＣＫのリン酸化が必要であり得る１−カルボキンメチル−２− アミノイミダゾールの効果シクロクレアチンの抗ウイルス効果の機構の研究のた めに、構造的に７クロクレアチンと緊密な関連性のある化合物を、基本的に実施 例１に記載した細胞変性効果アッセイにおいてｌｌ５Ｖ−１及びｌｌ５Ｖ−２に 対する抗ウィルス活性に関して調べた。図１６に示す通り、シクロクレアチンは ベロ細胞においてＩＳＶ−１誘導細胞変性性に対する投薬量応答を示すが（図１ ６Ａ）、１−カルボキンメチル−２−アミノイミダゾール（図１６Ｂ）は用いら れた条件下てそのような効果を示さない。
／クロクレアチンはタレアチンキナーゼ濃度が高い脳、筋肉及び心臓などの組織 でリン酸化される（Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｊ、Ｊ、ａｎｄ　ＪＢ　Ｗａ　Ｉｋｅｒ、 Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、２２０　：５６３−５７１　（ １９８３））。対照的に７クロクレアチンと等しい親和力でクレアチンキナーゼ と結合する１−カルボキンメチル−２−アミノイミダゾールはシクロクレアチン より５桁も遅い速度でリン酸化される（Ｌｏｗｅ、Ｇ、ａｎｄ　Ｂ、Ｓ、５ｐｒ ｏａｔ、Ｊ、Ｂｉ。
１、Ｃｈｅｍ、、２５５：３９４４−３９５１　（１９８０））。おそらく１− カルボキシメチル−２−アミノイミダゾールはクレアチンキナーゼによるリン酸 化があまり遅いために抗ウィルス活性を示さないのである・う。
抗ウィルス活性に有効なリン酸化が必要である可能性と一致して、シクロクレア チンは抗ウイルスアッセイで用いられるのと同一の条件下で組織培養においてリ ン酸化される。下表２１に示す通り、細胞が含むクレアチンキナーゼの量が多い 程、シクロクレアチンのリン酸化のパーセンテージが高い。この傾向は、ＣＫ活 性が低い細胞の場合に薬物と共に８日間インキュベートした後も観察される。さ らに実施例６に示す通り、生体内でリン酸化されることが報告されているシクロ クレアチン（ＡＭ２８５）、ホモシクロクレアチン（ＡＭ２８８）、クレアチン （、Ａ、　Ｍ　３８６）及びβ−グアニノノプロピオン酸（ＡＭ３８９）はマウ スにおいてＩＳＶ−２に対する抗ウィルス活性を示すが、生体内でリン酸化され ないと報告されている１−カルボキンメチル−２−イミノヘキサヒドロピリミジ ン（ＡＭ２８６）は類似の活性を示さない。しかしいくらかの抗ウィルス活性を 示す（実施例７を参照）カルボキシクレアチニン（１−カルボキノメチル−２− イミノイミダゾリジン−４−オン）はクレアチンキナーゼにより有効にリン酸化 されない。
／クロクレアチンーリン酸は試験管内のＨＣＭＶ収量を減少させるシクロクレア チン−リン酸（ＣＣｒ−Ｐ）は、公開されている方法に従ってＤａｌｔｏｎ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌによりニリチウム塩として製造した。ＭＲＣ−５細胞におけるＨ ＣＭＶの１循環の複製のウィルス収量へのＣＣｒ−Ｐの効果を決定した。２４ウ エル平板中のＭＲＣ−５細胞を１のｍ、ｏ、ｉ　においてＨＣＭＶに感染させた 。感染後１時間で、種々の濃度のＣＣｒ−Ｐ　（０，０μｇ／ｍ！、０．５ｍｇ ／ｍｌ、２重ｍｇ／ｍｌ及び４．０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。感染後９６時間で、 ゴムのポリスマンでこすり取ることにより細胞単層を収穫し、細胞及び細胞培養 上澄み液をフリーザーバイアルに移し、ＤＭＳＯを７％の最終濃度まで補足し、 −８０℃で凍結した。細胞ライセードをピペットで撹拌混合しながら３７℃で解 凍した。ウィルスを、２４ウエル平板上のＭＲＣ−５細胞上の薬物の不在下で、 順次１０倍希釈の細胞ライセードに細胞単層を感染させることにより滴定した。
７日後、単層を１０％　ＴＣＡを用い、４℃で１時間固定し、１％の氷酢酸中の ０．　４％スルホローダミンＢを用いて室温で１時間染色し、続いて１％氷酢酸 で洗浄した。
各希釈において形成されたプラークを位相差顕微鏡下の１００ｘで計数した。各 濃度のＣＣｒ−Ｐにおいて形成された細胞抽出物１ｍｌ当たりのプラーク形成単 位（ＰＦＵ）の数を図２５にグラフとして示す。ＰＦＵを９９％減少させるのに 必要なＣＣｒ−Ｐの濃度（ＥＤ９９）は４ｍＭである。付属しているニリチウム 塩が抗ウィルス活性にどのような寄与をしているかは明らかでない。リチウム自 身は抗ウィルス活性を有することが既知であり、平行したアッセイにおいてＬｉ Ｃ１は１２ｍＭの濃度でＰＦＵを９９％減少させる。ＣＣｒ−Ｐがいくらかの抗 ウィルス活性を有することが結論される。シクロクレアチンのリン酸化形態の抗 ウィルス活性は、抗ウィルス活性のためにシクロクレアチンの有効なリン酸化が 必要である可能性と一致する。
シクロクレアチン（ＡＭ２８５）によるＨＣＭＶｔＩ製の阻害の様式を理解する ために、容易に利用できるエネルギー源に頼っているＨＣＭＶ複製周期の初期の 現象、例えば付着、浸透（融合を含む）及び脱外被へのシクロクレアチンの効果 を決定する実験を行った（ＫｒｉｚａｎｏｖＡ　ａｎｄ　５ｖａｔｏｓｏｖＡ、 　Ａｃｔａ　Ｖｉｒｏｌｏｇ、、　１９：９７−１０５　（１９７４）　）。さ らに付着及びウィルスタンパク質の発現への化合物の効果も調べた。
細胞及びウィルス ヒト包皮線維芽細胞（Ｈｓ−６８）を、１０％ウシ胎児血清及びＮａＨＣＯ３を 含み、抗生物質を含まないＤｕｌｂｅｃｃｏの最少必須培地（ＤＭＥＭ）中で増 殖させた。ＨＣＭＶ株ＡＤ−１６９（Δｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉ　Ｉ　ｌ　ｅ、　ＭＤ）を１−１　 ｓ　−６８細胞中で増殖させた。
付着アッセイ 細胞を、７０％密集に達するまで２４−ウェル平板で増殖させた。続いて培地を 各ウェルから除去し、等体積のウィルス（１００ＰＦＵ）及びシクロクレアチン （ＡＭ２８５．１０００μｇ／ｍｌ）希釈液を各ウェルに加え、４℃で種々の時 間吸着させた。各時間の場合の吸着が同時に終了するように実験を設計した。ウ ィルスを含むがシクロクレアチンを含まない樟準ウェルをＡＭ２８５−処置ウェ ルと同一の条件下で平行して行った。各時点のアッセイは３重に行った。アッセ イを終了させるために各ウェルを血清を含まないＭＥＭで３回洗浄し、増殖培地 中の０゜８％アガロースを上乗せした。平板を３７℃で８−９日インキュベート し、１０％ホルマリンで固定し、０．２５％クリスタルバイオレットで染色した 。各ウェルにＰＦＵの合計数に関して得点をつけた。分散分析を用いて統計的比 較を行った。
１１ＣＭＶ漫透アッセイ ウィルス（１００ＰＦＵ）を２４−ウェル平板中の細胞に７０％密集において吸 着させた。吸着は４℃で３５時間行った。この温度における吸着は吸着時間の間 のウィルス浸透を最少にする。３５時間後、ＡＭ２８５　（１０００μｇ／ｍｌ ）又は希釈剤を細胞に加え、温度を急激９８５））。非吸着ウィルスを除去する ために細胞をＭＥＭで３回洗浄した。続いて７０分までの種々の時間の間、浸透 を進行させた。各時間の後、浸透しなかったウィルスを吸引により除去し、細胞 をＭＥＭで１回洗浄した。残りの付着ウィルスは、ＰＢＳ（ｐｉ−１３）と共に １分間インキュベートすることにより不活化した。細胞外ウィルスの不活化に続 き、ＰＢＳを各細胞単層から除去し、細胞をＭＥＭで１回洗浄した。続いて細胞 に増殖培地及び０８％のアガロースを上乗せし、３７°Ｃで７−８日間インキュ ベート−した。各ウェルにおいてＰＦＵを数えた。生存ウィルスを時間に対して プロットした。
シクロクレアチンは浸透をいくらか阻害すると思われるので、阻害のＥＣ５ｏを 決定する実験を行った。ウィルス浸透の阻害のＥＣ５ｏの決定のために、シクロ クレアチンの不在下、及び種々の濃度（最終濃度＝３０００．２０００．１５０ ０．１０００．７５０，５００又は２００μｇ／ｍ１）のシクロクレアチンの存 在下で、浸透のための最適時間の間（上記で５０分と決定）浸透を進（テさせた 。続いて上記の通りにアソセ・イを行った。各濃度は３重に検定した。分散分析 により統旧的有育性を決定しプこ。
ウィルス説外被アッセイ ウィルｘ　（ＭＯＩ＝５）をＩμＣｉ／ｍ１（７）［３Ｉ（］−チミジン（Ａｍ ｅｒｓｈａｍ　Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ：Δｒｌｉｎｇｔｏｎ）（ｅｉｇｈ ｔｓ、ＩＬ）又は５μＣｉ／ｍｉの［３５Ｓ　］−メチオニン、／スティン（Ｔ ＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ；Ｃｏ５ｔａ　Ｍｅｓａ。
Ｃａ）の存在下のＨｓ−６８細胞中で、３７°Ｃで１８時間の初期インキュベー ションの後４８時間増殖させた。続いて感染細胞を収穫し、音波処理（最大出力 において３分１５秒）により細胞を粉砕した。細胞ライセードを５０００ｘｇで １５分間遠心した。放射性標識無細胞上澄み液を、直線的３０−７０％ソルビト ール勾配上に置き、２５．０００ｒｐｍで１時間遠心した。勾配を分別し、ウィ ルスの存在をＥＴΔ及びプラークアッセイによる滴定により確認した。
放射性標識ウィルス（ｍ、ｏ、ｉ、　＝１）を接種材料として用い、シクロへキ ノミド（２００μｇ／ｍｌ）と共に１時間予備インキュベートした細胞を４°Ｃ て３５時間、標識ピリオンに感染さ也付着させ、３７°Ｃで１時間インキュベー トして浸透させた。続いて適した濃度のＡＭ２８５　（１０００μｇ／ｍｌ）又 は希釈剤を細胞に加え、細胞を３７°Ｃで４時間インキュベートした。その間に 試料を０．５時間毎に収穫した。
各インキュベーション時間の後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＮＰ−４０を含む 溶解緩衝液（Ｉｙｓｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ）中でインキュベートすることにより 細胞を粉砕した。細Ｉ１２！買及び核の両分を１０．０００ｘｇで３０分間遠心 することにより分離した。各両分の放射性をノンチレーンヨン計数により決定し た。各時点に関して３重に検定した。結果は核及び細胞質画分の両方で検出され た合計活性に対するパーセントとして表した。分散分析により統計的比較を行っ た。
ウィルスタンパク質合成へのシクロクレアチンの効果Ｈｓ−６８細胞を２のＭｏ ｌにおいてウィルスに感染させ、ウィルスを３７℃で２時間吸着させた。暴露後 ２時間で（浸透させる）、ＡＭ２８５を１０００μｇ／ｍｌの最終濃度で培養に 加えた。シクロクレアチンで処置した、又は未処置の感染及び疑似感染フラスコ を吸着後０５．１．２．４．８．１２．１６．２４．３２．４０．４８．６０及 び７２時間で収穫した。各フラスコを５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫プロッティング による分析まで２ｍｌのＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中の一７０℃で凍結した。各フラ スコからの試料を採取し、ＰＢＳ中で１００倍に希釈し、試料のタンパク質含有 量をビシンコニンアッセイ（ｂ　ｉ　ｃ　１ｎｃｈｏｎ　１ｎｉｃ　ａｓｓａｙ ）を用いて評価することも行った。電気泳動の前にフラスコを解凍し、全出力に おいて１５秒間で３回音波処理した。試料につき標準的方法を用いて電気泳動及 び免疫プロッティングを行った。
ＨＣＭ　Ｖタンパク質の検出に、初期及び後期抗原と反応性の市販のモノクロー ナル抗体を用いた。
細胞のフラスコは、収穫前の各期間においてウィルス細胞変性効果（細胞ラウン ディング（ｒｏｕｎｄ　ｉｎｇ）　、巨大腫脹細胞、剥離（ｄｅｔａｃｈｍｅｎ ｔ））に関しても得点評価した。ウィルス細胞変性効果は０−４の尺度で等級化 し、４の等級は単層中のすべての細胞が特定の効果を示す場合として定義した。
さらにブラークアンセイにより各期間に関してウィルスの力価を決定する別の実 験を行った。
ウィルスＤＮＡ合成への７クロクレアチンの効果感染周期の間の７クロクレアチ ンにより阻害されるウィルス現象の大体の時期を決定するために、２４ウエル平 板中でＭＲＣ−５細胞を１のｍ、ｏ、ｉ、においてＨＣＭＶ、株ＡＤ−１６９に 感染させ、感染後の種々の時間で（感染後Ｏ１５，２４，４８，７２，９６時間 ）２ｍｇ／ｍ＋の最終濃度でシクロクレアチンを加えた。感染後９６・時間で細 胞及び上澄み液をこすり取って収穫し、実施例１３のＣＣｒ−Ｐの場合の記載と 同様にして滴定した。
ＨＣＭＶ　ＤＮ八へ成へのシクロクレアチンの効果を測定するために、濃度を変 化させたシクロクレアチン（０，ＯＳＯ，５，１，０，２，ｏ１３．０、及び４ ．０ｍｇ／ｍｌ）で処置した感染ＭＲＣ−５細胞において合成されるウィルスＤ ＮＡの量を測定した。感染後９６時間で細胞を溶解し、核酸を合成膜に移し、Ｄ ｉａｇｎｏｓ　ｔ　ｉｃ　Ｈｙｂｒ　ｉｄｓ。
Ｉｎｃ　から入手可能なキットを用いて標識ＨＣＭ　Ｖ−特異的ＤＮＡプローブ で精査した。放射性プローブのハイブリッド形成の程度を液体シンチレーション カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて決定した。
杭！ ＡＭ２８５　（１０００μｇ／ｍｌ）が４℃における４時間の付着期間の間に■ イ５−６８細胞へのＨＣＭ　Ｖの付着を阻害するが否かを決定する実験を行った 。インキュベーション期間の間ずっと、薬物−処置細胞又は未処置標準細胞への ウィルス付着の量における差はないように思われた（ｐ＜０．００１）。
化合物がウィルスの細胞中への浸透を阻害するが否かを決定するための別の実験 を行った。これらの実験で、ウィルスを４℃で３時間吸着させてから温度を３７ ℃に上げ、浸透させた。これらの実験はいくらが変動を受けた。ＡＭ２８５　（ １０００μｇ／ｍｌ）と共に４０及び５０分インキュベートすると、ＨＣＭ　Ｖ の細胞中への浸透が有意に阻害されるように思われた（ｐ＜０．０５）。従って ＡＭ２８５の存在下で５０分後にウィルスの浸透を少なくとも５０％阻害するＡ Ｍ２８５の濃度（阻害のＩＣ５ｏ）があるか否かを決定する実験を行った。しか し５０％阻害は得られなかった。実際にある投薬量は標準に対して付着を増加さ せるように思われた。これらの観察は、浸透の阻害がＨＣＭＶ複製の阻害の重要 な様式でないことを示唆している。
ＨＣＭ　Ｖの脱汁液へのＡＭ２８５の効果も決定した。このアッセイの場合、未 処置標準における両標識からの活性の大部分は核両分に伴う。
シクロクレアチンー処置細胞における脱汁液の阻害は、いずれかの期間における 核に達する［３５Ｓ］−標識ウィルスの量の減少、及び咳両分に伴う［３１１］ −チミジンの欠乏により示される。しかしウィルスＤＮＡの複製が起こる細胞の 核両分において有意な量の両標識が検出された（ｐ＜　０．０５）。ＡＭ２８５ −処置細胞（ＭＥＭ中１０００μｇ／ｍｌのＡＭ２８５）と比較してＭＥＭて処 置した未処置標準において細胞質又は核両分で見いだされた標識の量に有意な差 はなかった（ＡＯＶＯｌｐく００５）。これらの結果は脱汁液の阻害が起こらな かったことを示す。
ウィルス複製周期の次の段階は、ウィルスＤＮＡの複製及びウィルス初期及びい くらかの後期のタンパク質の合成を含む。５ＤＳ−ＰＡＧＥに続く免疫プロッテ ィングにより検出される後期ウィルス抗原（Ｌ）の出現への７クロクレア千ン（ ＡＭ２８５）の効果を表２２にまとめる。
７６ｋｄの初期抗原に特異的な商業的に入手可能なモノクローナル抗体を用い、 ４３ｋｄの即時型（ＩＥ）抗原及び検出試薬としての７２　ｋ　ｄの非構造即時 型抗原のすべての抗原が処置及び未処置ウィルス感染細胞において検出された。
初期抗原合成は阻害されないと思われる。
対照的に特異的モノクローナル抗体により検出される後期抗原（１０４ｋｄ、７ ６ｋｄ及び５６ｋｃｌ抗原）は、ＡＭ２８５−処置ウィルス感染細胞において検 出されなかった。しかし６８ｋｄのペプチド（後期タンパク質）は感染後４０時 間に始まってすべてのＩ−Ｉ　ＣＭ　Ｖ−感染細胞において検出された。これら の抗原の分子量は３つの糖タンパク質（１０４ｋｄ、５ｇｋｄ、５６ｋｄ−主要 構造糖タンパク質）及びリンタンパク質（７６ｋ　ｄ）に相当する（Ｌａｎｄｉ ｎｉ　ａｎｄ　Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ、１９８８．於：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　 Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、３５．Ｍｅｌｎｉｃｋ、Ｊ、Ｌ、 ｅｄ、、（Ｓ。
Ｋａｒｇｅｌ：Ｂａ５ｅ１．５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ）、ｐｐ、１５２−１８５ ）。
免疫プロ、ト上の抗原の出現は、感染性ウィルス及び細胞変性効果の出現にも対 応する（表２３）。かくしてＡＭ２８５−処置細胞は調べた期間に感染性ウィル スを与えなかった。しかしウィルスの細胞変性効果は時間と共に検出可能になっ たので、後に感染性ウィルスはプラークアッセイにより検出可能になり得る。
これらの実験は、ウィルスの細胞への付着及びピリオンの脱汁液はシクロクレア チンにより影響されないことを示す。さらに５０％阻害濃度が得られなかったの で、浸透の阻害はおそら＜ＨＣＭＶ複製の阻害の主要な様式ではない。ウィルス の浸透及び脱汁液の間の現象の阻害が阻害の様式であり得る。これらの現象には おそらく細胞酵素及びエネルギー−依存性経路が含まれる。しかしＡＭ２８５は この過程を阻害していないと思われる。
初期及び即時型抗原は処置及び未処置細胞において検出された（表２２）。この 結果は、シクロクレアチンが初期タンパク質の発現の後の現象を阻害することを 示している。しかし後期タンパク質に関して感染細胞のライセードをスクリーニ ングすると、処置細胞は４つのウィルス後期抗原の１つの６８ｋｄ抗原しか含ま なかった。下記に示す通り、この抗原はおそらくウィルスマトリックスタンパク 質であり、その発現はＤＮＡ合成に依存していない。他の３つの後期タンパク質 の発現はＤＮＡ合成に依存している。この結果はシクロクレアチンがＤＮＡ複製 の段階又はその前の段階を阻害することを示唆している。
ＨＣＭＶタンパク質発現及びウィルスＤＮＡ合成合成 図２６は感染周期における時間の関数としてのプラーク形成への７クロクレアチ ンの効果を示す。未処置細胞は１．２ｘ１０７ＰＦＵ／ｍｌを与える。感染後０ 又は５時間でシクロクレアチンを加えると、ウィルス収量は実質的に減少する（ ３　ｘ　１０’Ｐ　ＦＵ）。シクロクレアチンを感染後２４時間で加えると、弱 いがまだ実質的な抗ウイルス効果（９ｘ１．０’ＰＦＵ／ｍｌ）が観察される。
対照的にシクロクレアチンを感染後４８．７２又は９６時間で加えると、プラー ク形成は未処置細胞と同等であった。かくしてシクロクレアチンは感染後約２４ 時間で起こる複製周期の段階を阻害する。この段階は複製周期における多（の即 時型及び初期現象の後であり、ＨＣＭＶ　ＤＮＡ複製の開始と符合する。
図２７は濃度を変化させたシクロクレアチンで処置した感染ＭＲＣ−５細胞にお いて合成されるウィルスＤＮＡの量（ｃｐｍ、分出たりのカウント）へのシクロ クレアチンの効果を示す。シクロクレアチンは投薬量−依存的方法でＨＣＭＶ　 ＤＮＡの複製を阻害する。ＨＣＭＶ　ＤＮＡの複製を５０％阻害するのに必要な シクロクレアチンの濃度は７５０ｇｇ／ｍｌであり、これはプラーク形成の５０ ％の阻害に必要な濃度と密接に対応している。従ってウィルスＤＮＡ複製の直接 又は間接的阻害は化合物の抗ウィルス活性を説明することができる。シクロクレ アチン又はシクロクレアチンの主要な細胞内誘導体であるシクロクレアチン−リ ン酸はＨＣＭＶのＤＮＡポリメラーゼを試験管内で阻害することができ、それは 標準的方法で決定することができる（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１構造５及び６（図１ ９）により特定される化合物は５−員環に置換基（Ｒ）が付加されていることに よりシクロクレアチンと異なる。この置換基はリン酸基の転移が起こることを許 しながら基質結合のエネルギー論を強化するように設計されている。Ｒ＝ＣＨ３ である構造５及び６に特定される化合物の混合物を製造し、組成物をＡＭ３６１ と呼ぶ。
これらのシクロクレアチンのメチル−置換誘導体の製造は、図２２に記載の方法 などによる種々に保護されたキシル１．２−ジアミンの挿入に頼った。特に化合 物５及び６はＧｒｉｆｆｉｔｈ　ａｎｄ　Ｗａｌｋｅｒ　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅｍ、、２５１　（７）：２０４９−２０５４（１９７６））に従うシクロクレ アチンの製造と同様にして製造した。
要するに下記に示す反応１において、クロロ酢酸のナトリウム塩を（±）−１， ２−ジアミノプロパンと水中で縮合し、２つの位置異性体カルボキシメチルジア ミンを生成した。続いて下記の反応２に示す通り、カルボキノメチルンアミンの 混合物をノアノゲンブロミドと縮合して化合物５及び６　（Ｒ−メチル）を生成 した。水からの結晶化及び続く熱エタノール−水（８０：　２０．ｖ／ｖ）から の再結晶により、同定されていない１つの異性体が約９５％に濃縮された５及び ６の混合生成物が得られる。この混合生成物がＡＭ３６１を構成する。詳細な実 験法を下記に示す。
合成法 最初にｏ’ｃのＨｚＯ（１４０ｍＬ）中のりｏｏ酢酸（１４２ｇ）の溶液にＨ２ Ｏ（１２０ｍＬ）中のＮａＯＨ（６２ｇ）の溶液を加えた。得られた溶液を（± ）−１，２−ジアミノプロパン（１２５ｍＬ）及びＨ２Ｏ（７５ｍＬ）の７０− ８０℃の溶液に９０分かけて加えた。得られた混合物をさらに２時間６０−７０ ℃に保ち、続いて１０−１５℃に冷却した。反応混合物の温度を１５−３２℃な 保ちながらメタノール（２００ｍＬ）中のシアノゲンブロミド（１５０ｇ）の溶 液を加えた。
得られた混合物を終夜撹拌し、沈澱したＮａＢｒを濾過により除去した。
アセトン及びジエチルエーテルを加え、さらに沈澱したＮａＢｒを濾過により除 去した。溶媒を真空中で除去し、残留物を熱Ｈ２０から結晶化した。第１の結晶 生成物（’ＨＮＭＲにより１つの異性体が濃縮された混合物であることが示され た）を単離し、熱エタノール−８２０（８０：　２０．ｖ／ｖ）から再結晶した 。１３０及び’）Ｉ　ＮＭＲ分析によりこの第２の再結晶生成物がメチル位置異 性体５及び６を含み、同定されていない１つの位置異性体が約９５％に濃縮され ていることが示された。
第２の再結晶生成物を本明細書で“化合物５／６”と呼ぶ。どちらの化合物が主 成分であり、どちらが副成分であるかは決定されなかった。
化合物５／６のリン酸化 Ｒ＝ＣＨ３である化合物５／６　（ＡＭ３６１）を上記の通りに製造し、Ｅｎｇ ｌｉｓｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｖｏｌｕｍｅ　４．　（Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉ ｅ　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ　ａｎｄ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、、： Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｌｏｎｄｏｎ）ｐｐ　１７７２−１７７９）に記載のピルベ ートキナーゼ及びラクテートデヒドロゲナーゼを用いた共役活性測定においてク レアチンキナーゼによるリン酸化に関して検定した。
下記に挙げる各化合物を４０ｍＭの濃度において調べた。化合物５／６　（ＡＭ ３６１）はゆっくりリン酸化された。
シクロクレアチン　０．５４　４６ 化合物５／６　０．０４１　２．　４ 化合物５／６　（ＡＭ３６１）の抗ウイルス活性クレアチン類似体５／６（八Ｍ ３６１）を基本的に実施例１に記載した通りに細胞変性効果アッセイにおいて抗 ウィルス活性に関して検定した。Ｈ３Ｖ−１に対するＡＭ３６１の抗ウイルス効 果を決定するために、ベロ細胞に上記の通りに変化させた濃度のウィルスを攻撃 させた。平板を数種の異なる濃度のＡＭ３６１の存在下で、ウィルスのみを含む 標準ウェルで細胞変性性が観察されるまでインキュベートした。無薬物標準平板 を用意し、薬物ではなく低血清培地を感染単層に加える以外は第１の平板と同様 に処理した。
１つの実験の場合、ＡＭ３６１をＯ，ＯｍＭ、２．７３ｍＭ、５．４７ｍＭ、１ １．０ｍＭ、２２．１ｍＭ及び４４．２ｍＭの濃度で調べた。
４４．２ｍＭの濃度のおいてＡＭ３６１はウィルス−誘導単層死を、関連する無 薬物標準て観察された９０％（２００ＰＦＵ／ウエル）、４０％（Ｉ００ＰＦＵ ／ウェル）、４５％（５０ＰＦＵ／ウエル）、３０％（２５ＰＦＵ／ウエル）及 び５０％（１２ＰＦＵ／ウエル）から各接種材料の場合に２％の値まで減少させ た。２２．１ｍＭの濃度の場合、実験条件下でＡＭ３６１は、２５又は５０ＰＦ Ｕ／ウエルを接種したウェルにおいて無薬物標準と比較して細胞変性効果を減少 させまたが、２００ＰＦＵ／ウエル、１００ＰＦＵ／ウエル又は１２ＰＦＵ／・ ウェルを接種したウェルにおいては減少させなかった。
別の実験の場合、より高いＡＭ３６１濃度において投薬量関連応答が明らかであ った。図１７はそのようなベロ細胞におけるＨ３Ｖ−１の細胞変性性研究の結果 を示す。種々の濃度のＡＭ３６１（異なる陰影の棒で示す）における各ウェルで 観察された単層死のパーセンテージ（ｘ軸）をウィルス接種材料の範囲に関して プロットしである（ｙ軸：接種材斜出たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ））。図 １７Ａは自消−欠乏べ口細胞の場合、濃度を変化させたウィルス接種材料におい てＡＭ３６１がＨｓｖ−１の細胞変性効果を阻害することを示している。
図１７Ａにおいてウィルス感染の不在下（ＯＰＦＵ）におけるパーセント単層死 が感染細胞と同一の平板からの薬物毒性の標準となった。さらに無薬物標準平板 からの結果（図１７Ｂ）は、シクロクレアチンの不在下であるＨ３Ｖ−１ウイル スの接種材料を与えられたベロ細胞のほとんどのウェルが同程度の細胞死を示す ことを示している。従ってこのクレアチン類似体は認識できる抗ウイルス効果を 有する。
化合物７を以下の通りにグリシルグリシンとシアナミドの１段階綿合により製造 した。
グリシルグリシン（２，６４ｇ）及び２２％のＮＨ４ＯＨ水溶液（１添加当たり 数滴）を、Ｈ２Ｏ（２０ｍｌ）中のシアナミド（２，１ｇ）の溶液に何回かに分 けて交互に加え、時々振って完全に溶解させた。得られた溶液を密閉し、４日間 放置した。得られた結晶性の固体を濾過により集め、Ｈ２Ｏで洗浄し、乾燥して 約０．７ｇの化合物７を得た。生成物の’ＨＮＭＲスペクトルは所望の構造と一 致した。
細胞変性効果アッセイにおける活性 化合物７（図１９）をＡＭ３６１　（実施例１５）と平行し、ベロ細胞における Ｈ３Ｖ−１に対する細胞変性効果アッセイにおいて、ＯｍＭ。
２．５８ｍＭ、５．１６ｍＭ、１０．４ｍＭ、２０．８ｍＭ及び４１７ｍＭの濃 度で調べた。４］、、７ｍＭにおいて化合物７は一貫した抗ウィルス活性を示し 、調べた各接種材料において（１２，２５，５０，１００又は２００ＰＦＵ／ウ エル）無薬物標準と比較して単層死を減少させた。調べた他の濃度のいずれも用 いられた条件下におけるアンセイで一貫した抗ウイルス効果を示さなかった。ウ ィルスの不在下で４１７ｍＭの化合物７に暴露した細胞においていくらかの単層 死（４％）が観察され、この濃度におけるわずかな細胞毒性を示唆した。抗ウイ ルス効果の有量性を確立するためにさらに実験が必要である。
化合物１０ａ及び１０ｂの抗ウイルス効果類似体１０ａ及び１０ｂをＪ、Ｍｅｄ 、Ｃｈｅｍ、２３．１２３２−１２３５　（１９８０）に記載の方法と類似の方 法によりエチレンジアミン−酢酸とＮ−メチル又はＮ−アリルチオウロニウム塩 の縮合により製造した。エチレンジアミン−酢酸はＮｇｕｙｅｎ　（Ｎｇｕｙｅ ｎ、Ａ。
Ｃ，に、、Ｐｈ、Ｄ、Ｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＵＣ３Ｆ、１９８３．Ｄ、４０）に記載の通りに製造し、チ オウロニウム塩はＲｏｗｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、９ ３．５５４２−５５５１　（１９７１）；及びＣｕｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃ ｈｅｍ、Ｓｏｃ　ｐ、１７４２　（１９４９）に記載の方法に従って商業的に入 手可能なＮ−メチル及びＮ−アリルチオウレアから製造した。
メタノール（５０ｍＬ）中のＮ−メチルチオウレア（８，２５ｇ、９１ミリモル ）の溶液にヨウ化メチル（１４，３３ｇ、７．２ｍＬ、１０１ミリモル）を加え た。得られた溶液を１５時間加軌還流し、その後回転医発器により溶媒を除去し た。残った固体を酢酸エチルに懸濁し、白色結晶生成物を濾過により集め、真空 下で乾燥し、’ＨＮＭＲにより特性化される１９．１ｇの所望の生成物を得た。
Ｓ−メチル−Ｎ−アリルチオウロニウムヨウ化水素塩の製造メタノール（５０ｍ Ｌ）中のＮ−アリルチオウレア（１０，５７ｇ、９１ミリモル）の溶液にヨウ化 メチル（１４，３３ｇ、７．２ｍＬ、１０１ミリモル）を加えた。得られた溶液 を２２時間加熱還流し、その後回転蒸発器により溶媒を除去した。残った油をア セトン（１ｍＬ）、酢酸エチル（１ｍＬ）及びジエチルエーテル（２００ｍＬ） に加え、白色沈澱を形成させた。固体を濾過により集め、酢酸エチル、及びその 後ジエチルエーテルで洗浄し、真空中で乾燥して’ＨＮＭＲにより特性化される ２３．８ｇの所望の生成物を得た。
化合物１０ａ及び１０ｂの製造 Ｈ２０（２、５ｍ　Ｌ　）中のＮ−メチル又はＮ−アリルチオウロニウム塩（１ １ミリモル）の溶液を８２０　（２，７５ｍＬ）中のエチレンジアミン−酢酸（ １，３ｇ、１１ミリモル）及びＮａＯＨ（１１ミリモル）の室温における撹拌溶 液に２時間かけて加えた。得られた透明の溶液を室温で１２時間撹拌し、その後 溶媒を回転蒸発器により除去した。メタノール（２ｘ１５ｍＬ）を加え、残留物 から２回蒸発させた。残留物にメタノール（２−３ｍ　Ｌ　）及びジエチルエー テル（２００ｍＬ）を加え、ゴム状の固体を形成させた。上澄み液をデカンテー ションし、残留物を真空下で乾燥し、１０ａ及び１０ｂを吸湿性の固体として得 た。
細胞変性効果アッセイにおける活性 Ｒ＝メチルの化合物１０ａをＯｍＭ、２．３６ｍＭ、４．７３ｍＭ。
９．５４ｍＭ、１９．］、ｍＭ及び３８．２ｍＭの濃度を用い、実施例１に記載 の細胞変性効果アッセイにおいてＨ３Ｖ−１に対する抗ウィルス活性を調べた。
対応する無薬物標準と比較して、１９．１ｍＭの濃度の化合物１０　ａ　ニ暴露 した場合に１２．５０、ｉｏｏ又は２００ＰＦＵ／ウエルを接種したウェルにお いて単層死の減少が観察されたが、２５ＰＦＵ／ウエルを接種したウェルにおい ては観察されなかった。しかし本実験における他の濃度において、−貫的ではな いが単層死の類似の減少が観察された。ウィルスの不在下で３８．２ｍＭの化合 物１０ａで処理したウェルにおいていくらかの単層死（５％）が観察された。ウ ィルスの存在下で３８．２ｍＭの化合物１０ａを用いて処置すると１９．１ｍＭ という低い投薬量より一貫して％単層死が大きくなった。１９．１ｍＭにおける 見掛けの抗ウイルス効果が薬物の２倍高い濃度において初めて明らかになる細胞 毒性に起因するという可能性は排除できなかった。
Ｒ＝アリルである化合物１０ｂをベロ細胞におけるｌｌ５Ｖ−１に対する抗ウィ ルス活性に関して同様に検定した。それぞれ２．５８ｍＭ１５゜５９ｍＭ、１１ ．４８ｍＭ、２２．９５ｍＭ又は４５．９０ｍＭの化合物１０ｂにおいて、１２ ．２５．５０．１００又は１００ＰＦＵ／ウエルにおける実験条件下で一貫した 抗ウイルス効果は観察されなかった。
無ウィルス標準において、細胞毒性が２３ｍＭで明らかになり（７％単層死）　 、４５．９ｍＭでより顕著になった（３０％単層死）。
ＧＰＥＩＢＩｌｍにおけるモルモットサイトメガロウィルス、株２２１２２に対 するシクロクレアチン（ＡＭ−２８５）又はＤＨＰＣの抗ウィルス活性（ＣＰＥ 減少）ＡＭ−２８５ＤＨＰＧ 濃度　可視の　平均　濃度　可視の　平均（μｇ／ｍ＋）　細胞変性性　ＣＰＥ 　（μｇ／ｍｌ）　細胞変性性　ＣＰＥ１００００　４０　０．０　１０００　 ４０　０５０００　２０　１．７　３２０　０　０１２５０　０　３．３　３２ 　０　０．７６２５　０　３．５　１０　０　３．５３１２．５　０　４．０　 ３．２　０　４．０１５６．２５　０　４．０　１．０　０　４．００　平均Ｃ ＰＥ４．Ｏ（ウィルス標準、８日）ＥＤ５０°（μｇ／ｍｌ）：　３２７１　１ ８．４ＣＤ５０’（Ｉｚｇ／ｍｌ）：　＞１００００　＞１０００ＴＩ５０’、 　＞３．０　＞５４ ゛平均ＣＩ）　Ｅをウィルス標準で観察される平均ＣＰＥの５０％に減少させる 濃度（有効投薬量、５０％終点）。
５１００％細胞毒性及びＯ％細胞毒性が観察される濃度の中点の濃度。
゛治療指数（ＣＤ５０二ＥＤ５０）。
表２ 濃度　＃プラーク　％減少　＃プラーク　％減少（μｇ／ｍ１） １０　０．５　９８ ８のウィルス標準ウェルからの＃プラーク：２６．４±５．２ＥＤ５０’　（μ ｇ／ｍｌ）：６１０　３．７ＣＤ５０ｂ（μｇ／ｍｌ）：＞４０００　＞１００ ＴＩ５０’：　＞６．５　＞２７ °プラークの平均数をウィルス標準て観察されるプラークの平均数の５０％に減 少させる濃度（有効投薬量、５０％終点）。
ｂ１００％細胞毒性及び０％細胞毒性が観察される濃度の中点の濃度。
°治療指数（ＣＤ５０÷ＥＤ５０）。
表３ 濃度　＃プラーク　％減少　濃度　＃プラーク　％減少（μｇ／ｍｌ）　（μｇ ／ｍ１） ４０００　０　１００　３．２　７　９０２０００　１．５　９８　１．０６８ ．５０１０００　１９．５　７４　．３２　１００．５　０６２．５７１　０ ８のウィルス標準ウェルからの＃プラークニア４．２±８．６ＥＤ５０°（μｇ ／ｍｌ）＋６４７　１．９ＣＤ５０ｂ（μｇ／ｍｌ）：　＞４０００　＞１００ ０（前データ） Ｔ［５０’：　＞６．２　＞５２６ ゛プラークの平均数をウィルス標準で観察されるプラークの平均数の５０％に減 少させる濃度（有効投薬量、５０％終点）。
ｂ１００％細胞毒性及び０％細胞毒性が観察される濃度の中点の濃度。
゛治療指数（ＣＤ５０二ＥＤ５０）。
嚢Ｊ− 濃度　＃プラーク　％減少　濃度　＃プラーク　％減少５０００　３．５　９６ 　１０　８０　０２５００　１４．５　８４　３．２　８５　０ＥＤ５０°（μ ｇ／ｍｌ）：９００　＞３２　（約４１）ＣＤ５０ｈ（μｇ／ｍｌ）：＞１００ ００　＞１０００“プラークの平均数をウィルス標準で観察されるプラークの平 均数の５０％に減少させる濃度（有効投薬量、５０％終点）。
ｒ′１００％細胞毒性及び０％細胞毒性が観察される濃度の中点の濃度。
’　治ｉ指数（ＣＤ５０＋ＥＤ５０）。
表５ ａ度　＃プラーク　％減少　濃度　＃プラーク　％減少（μｇ／ｍｌ）　（μｇ ／ｍ１） １００００　０　１００　３２　４．５　６１５０００　１．５　８７　１０　 １０　０２５００　６．５　４３　３．２　６．５　４３１２５０　９．５　０ 　１．０１３　０６２５　１０．５　０ ３１２．５　１２　０ １５６．２５　９．５　０ ８のウィルス標準ウェルからの＃プラーク：１１．５±２．１ＥＤ５０°（μｇ ／ｍｌ）：２７８０　１１ＣＤ５０１′（μｇ／ｍｌ）：　＞１００００　＞１ ０００（前データ） ＴＩ５０’：　＞３．６　＞９１ °プラークの平均数をウィルス標準て観察されるプラークの平均数の５０％に減 少させる濃度（有効投薬量、５０％終点）。
１′１００％細胞毒性及び０％細胞毒性が観察される濃度の中点の濃度。
゛治療指数（ＣＤ５０＋ＥＤ５０）。
表６ 濃度　可視　平均　濃度　可視　平均 （μｇ／ｍ　Ｉ　）細胞毒性　ＣＰＥ　（μｇ／ｍｌ）細胞毒性　ＣＰＥ２００ ０　２０　２．０　３１６　０　０．２１０００　０　１．８　１００　０　０ ．５５００　０　１．７　３２　０　０．３２６０　０　３．２　１０　０　１ ．５１２５　０　３．５　３．２　０　：３．２６２．５　０　３．２　１，０ 　０　４．００　平均ＣＰＥ４．０（ウィルス標準）ＥＤ５０°（μｇ／ｍｌ） ：８８４．６　１０．６　−ＣＤ５０ｂ（μｇ／ｍｌ）：　＞４０００　＞１０ ００ＴＩ５０’・　＞４．　５　＞９４ “平均ＣＰＥをウィルス標準で観察される平均ＣＰＥの５０％に減少させる濃度 （有効投薬量、５０％終点）。
ｂ１００％細胞毒性及び０％細胞毒性が観察される濃度の中点の濃度。
゛治療指数（ＣＤ５０−；ＥＤ５０）。
表７Ａ 濃度　＃プラーク　％減少　濃度　＃プラーク　％減少（μｇ／ｍｌ）　（μｇ ／ｍ１） ４０００　０　１００　１０　１２．５　６２２０００　３　９１　３．２　２ ５　０１０００　９．５　７１　１．０　３７　０５００　１９　４２　０．３ ２　２４．５　０６２．５　２６　０ ７のウィルス欅準ウェルからの＃プラーク：３２．７±９３ＥＤ５０°（μｇ／ ｍ＋）：　５６４　８．０ＣＤ５０″’（μｇ／ｍｌ）：＞４０００　＞１００ ０°プラークの平均数をウィルス標準で観察されるプラークの平均数の５０％に 減少させる濃度（有効投薬量、５０％終点）。
ｂ１００％細胞毒性及び０％細胞毒性が観察される濃度の中点の濃度。
゛治療指数（ＣＤ５０＋ＥＤ５０）。
表７Ｂ 濃度　＃プラーク　％減少　濃度　＃プラーク　％減少（μｇ／ｍｌ）　（μｇ ／ｍ１） ５０００　０　１００　３．２　７７　Ｑ３１２．５　１２　８３ １５６　２８．５　５９ ウイルス標準ウエルからの＃プラークニア０．２５±６．９ＥＤ５０°（μｇ／ ｍｌ）：＜１５６　（約１０７）　＞１０ＣＤ５０ｂ（μｇ／ｍｌ）：５７９０ 　＞ＩＱＴＩ５０ｅ：　約５４ “プラークの平均数をウィルス標準で観察されるプラークの平均数の５０％に減 少させる濃度（有効投薬量、５０％終点）。
５１００％細胞毒性及び０％細胞毒性が観察される濃度の中点の濃度。
′治療指数（ＣＤ５０÷ＥＤ５０）。
マウスにおける単純ヘルペスウィルス２型膣炎へのΔＭ２８５処置の効果ＡＭ２ ８５　ＡＭ２８５　ＡＭ２８５　アシクロビル日＊　１０％　５％　２５％　５ ％　ブラセボ３　０．２±０．２　０．３±０．３　０．２±０．２　０．１± ０．１　０．２±０．３４　０．１”０．２’　０．４＋０．４　０．４ｆ０． ６　０．１±０．１’　０．６＋０．５５　０．９±１．９’　１５±１．１　 １２±１．３　０．１±０．２ｃ　１９±１．４６　１．４±１．９　２．１± １６　１８±１８　０．２±０．２″　２．５±１，６７　１．６±１９’　２ ．０±１．：ｌ　２．２±１．８　０．２±０．２″　２．９±１．５８　２． ０±２．０　２．８±１．８　２．７±１７　０．２±０．３″　３．０±１． ７９　２．２±１．９　３．２±１６　２．４±１９　０．２±０．２’　３． １±１．６１０　２．２”１．９　３．２　±　１．５　２．６　±　１７　０ ．６”０．８’　１Ｏｆ１．６１１　２．１±１．９　：１．ｌ±１．５　２． ６±１７　０．５±０．７１３．０±１．６１２　２．０”１．９　］、Ｏ”１ ．５　２．６：：Ｌ、７　０−３＋０．６”　３．０＋１．６１３　２．０±１ ９　３．０±１．５　２．６±１７　０４±Ｑ、６’　３．０±１．６１４　２ ．０±１．９　３．０±１．５　２．６ｆＬ７　０．３±σ、６’　３．０±１ ．６総平均 （３−１４日） １、６４０．８°　２３＋１１　２０＋０．９　０．３＋０２’　２４４１０＊ ウイルス攻撃後 ’ｐ＜０　０５　（二端分析５ｔｕｄｅｎｔのｔテスト）ｂｐ＜０．０１　（二 端分析５ｔｕｄｅｎｔのｔテスト）’ｐ＜０．００１　（二端分析５ｔｕｄｅｎ ｔのｔテスト）表９Ａ マウスにおける単純ヘルペスウィルス２型１ｍ炎へのＡＭ２８５及びアシ知ビル （ＡＣＶ）処置の効果ＡＭ２８５　ＡＭ２８５＋　ＡＭ２８５＋　ＡＭ２８５＋ 日＊　１％’　ＡＣＶ１００＃　ＡＣＶ５０　ＡＣＶ２５　ブラ（ｒボ紛平均 （３−１４日） ０８±０．２’　０３±０．２’　０．７±０．５ｃ［１，８±０５″′１８± ０７＊ウィルス攻撃後 ゛粉砕したマウスの餌と直接混合したン知クレアチンのパーセンテージ。供給は ウィルス接種の３日前に開始し、ウィルス攻撃の１５日後まで続けた。
＃ウィルス攻撃の２４時間後に開始して１日２回、１日の投薬量の半分を５日間 与えたｍｇ／ｋｇ／日 ＠標準偏差 ’ｐ＜０．　０５　（二端分析５ｔｕｄｅｎｔのｔテスト）ｂｐ＜０．０１　（ 二端分析５ｔｕｄｅｎｔのｔテスト）’ｐ＜０．００１　（二端分析５ｔｕｄｅ ｎｔのｔテスト）表９Ｂ マウスにおける単純ヘルペスウィルス２型膣炎へのアンクロビル（ＡＣＶ）処置 の効果平均疾患得点 ＡＣＶ　ＡＣＶ　ＡＣＶ　ＡＣＶ 日＊　’２００ｗ＋ｇ／ｋｇ＃　ＩＱＯｍｇ／ｋｇ　５０ａ＋ｇ／ｋｇ　２５ｍ ｇ／ｋｇ　ブラセボ１４　０．７　１０．７’　Ｏ，’）　±　０．９’　１． ０　±　１．３′　１．８　±　１．５　２．１　±　１．９総平均（３−１４ 日） ０６±０３″　０７±０．４″　０．８±０．３’　１．５ｉ０．６　１．８土 ０７＊ウイルス攻撃後 ＃ウィルス攻撃の２４時間後に開始して１日２回、１日の投薬量の半分を５日間 与えたｍｇ／ｋｇ／日 ＠棒準偏差 ’ｐ＜０．　０５　＜二端分析５ｔｕｄｅｎｔのｔテスト）ｂｐ＜０．０１．（ 二端分析５ｔｕｄｅｎｔのｔテスト）’ｐ＜０．００１　（二端分析５ｔｕｄｅ ｎｔのｔテスト）表９０ Ｈ３Ｖ−２を膣内に感染させたマウスにおける生存へのＡＭ−２８５及びアシク ロビル（ＡＣＶ）処置の効果ＡＣＶ（２５ｍｇ／ｋｇ）　５／１０　（，５０） 　１０．４±２，５＠ＡＣＶ（５０ｍｇ／ｋｇ）　７／１０　（７０）　１１． ３±２、ＩＡＣＶ（ＩＱＱｍｇ／ｋｇ）　８／１０（８０）　１２．０±１．４ ＡＣＶ（２００ｎｇ／ｋｇ）　７／１０（７０）　１１．３±２．５ＡＭ−２８ ５（１％＞　８／１０　（８０）　６．０±０゜ＯＡＭ−２８５（１％）＋２５ ｍｇ／ｋｇＡＣＶ　７／１０　（７０）　１２．７＋０．６ＡＭ−２８５（１％ ）＋５０ｍｇ／ｋｇ　Ａ（７８／　１０　（８０）　１４．５±３．５ＡＭ−２ ８５（１％）＋１１００１１Ｉ／ｋｇＡＣｖ１０／１０　（１００）　”　＞２ １プラセボ　８／２０　（４０）　９．２±３．２ＡＣＶ（５０ｍｇ／ｋｇ）　 ５１５　（１００）　４．０ＡＣＶ（１００ｍｇ／ｋｇ）　５１５　（１００） 　３．５ＡＣＶ（２００ｍｇ／ｋｇ）　５１５　（１００）　４．８ＡＭ−２８ ５（１％）　５１５　（１００）　７．８ＡＭ−２８５（１％）＋２５ｍｇ／ｋ ｇＡｆＪ　５１５　（１００）　６．８ＡＭ−２８５（１％）＋５０ｍｇ／ｋｇ 　ＡＣＶ　５／　５　（１００）　９．０ＡＭ−２８５（１％）＋１００ｍｇ／ ｋｇＡＣＶ　５１５　（１００）　７．０＠標準偏差 ＊感染の０日及び１５日における合計の動物の体重の差。
“ｐ＜Ｑ、０５　（二端分析Ｆｉｓｈｅｒ厳正テスト［生存数］又は二端分析５ ｔｕｄｅｎｔのＴテスト［平均死亡日数］。
嚢旦且 ＡＭ２８５及びアシクロビル（ＡＣＶ）処置の効果平均疾患得点 ＡＣＶ　ＡＭ２８５　ＡＭ２８５　Ａ１１２８５　Ａ１１２８５日＊　（２００ ）＃　１％゛０７５％４０９５％４１％５　プラセボ３　０．２＋０．３’　０ ．５＋０．３　０．３＋０．３ｂ０．４＋０．４’　０．５＋０．５　０．７＋ ０．３４　０．３＋０．３ｃＯ，４ｔ０．６’　０．４±０．４”　０．５±０ ．６“　０．７：１ｍ０．７　１．２＋０．８１４、＋１’２．０＋２．　１． ＋］、　］、７＋２．　２．＋、　、＋］、４総平均（３−１４日） ＋　ζ　］　＋、’　＋、’ｌ、＋　ｂ２．＋、７　＋＊ウィルス攻撃後。
ウィルス接種の３日前に開始し、１５日後まて続けた。
９粉砕しこマウスの餌と直接混合した７クロクレアチンのパーセンテージ。供給 はウィルス接種の２４時間後に開始し、１５日１麦まで続けた。
’ｐ＜０．　０５　（二端分析５ｔｕｄｅｎｔのｔテスト）ｂｐ＜Ｑ、０１　（ 二端分析５ｔｕｄｅｎｔのｔテスト）’ｐ＜Ｑ　００１　（二端分析５ｔｕｄｅ ｎｔのｔテスト）表１０ マウスにおける単純ヘルペスウィルス２型（Ｈ３Ｖ−２）膣炎へのＡＭ２８５及 び関連化合物の効果 総平均（３−１４日） ５ウイルス攻撃の１時間前に開始して１日２回、１日の投薬量の半分を８日間径 口的に与えたｍｇ／ｋｇ／日 ゛ウィルス攻撃の３日前に開始して１日２回、１日の投薬量の半分を１１日日間 径的に与えたｍｇ／ｋｇ／日 ６粉砕したマウスの餌と直接混合したシクロクレアチンのパーセンテージ。供給 はウィルス攻撃の３日前に開始し、１１日間続けた。
゛標準偏差 ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜Ｑ、０１、＊＊＊ｐ＜０．００１点よよ マウスにおける単純ヘルペスウィルス２型（ＩＩＳＶ−２）ＩｌｌへのＡＭ２８ ５及び関連化合物の効果 総平均（３−１４日） ０．４　土０．１””　１．７　土０．６””　１．６　土０．６申”　０．７ 　土０．３傘傘”　１．３土０．５””　３．０土１．０゛ウイルス攻撃後。
ｂウィルス攻撃の１時間前に開始して１日２回、１日の投薬量の半分を８日間経 口的に与えたｍｇ／ｋｇ／日 ′ウィルス攻撃の３日前に開始して１日２回、１日の投薬量の半分を１１日間経 口的に与えたｍｇ／ｋｇ／日 ｄ粉砕したマウスの餌と直接混合しこシクロクレアチンのパーセンテージ。供給 はウィルス攻撃の３日前に開始し、１１日間続けた。
゛５準偏差 ＊ｐ＜Ｑ、０５、＊＊ｐ＜０．　０１、＊＊＊ｐ＜０．００１表１７ 単純ヘルペスウィルス２型（Ｈ３Ｖ−２）を膣内に感染さゼたマウスにおける生 存数及び膣つィルス力化へのＡＭ２８５及び関連化合物を用いた処置の効果化合 物　処置　生存数／　平均　２８目のウィルス感染 非感染毒性標準 体重変化（ｇ）′ ６ウイルス攻撃にたいして ５欅準偏差 −３日と＋８日におけ動物の体重の差 ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊才＊ｐ＜０．００１゜表１５ 単純ベルヘスウィルス２型（Ｈ３Ｖ−２）を膣内に感染させたマウスの生存数へ のＡＭ２８５及び関連化合物を用いた処置の効果化合物　生存数／・総数（％） 平均死亡日数１％アルギニン　６／１０　（６０）　１０．０±６．７１％Ｎ− アセトイミド イルサルコシン　６／１０　（６０）　９．５±３．１１％ＡＭ２８５　４／１ ０　（４０）　１０．８±３．９１％グアニジノ酢酸　３／１０　（３０）　９ ．１±３．７１％ＡＭ２８６　３／１０　（３０）　８．６±２．９２％クレア チンリン酸　６／１０　（６０）　８．０±１．８１％カルボキックレアチン　 １０／１０　（１００）＊　＞２１．０１％クレアチン　７／１０　（７０）　 ７．３±２４３０．７５％クレアチン　４／１０　（４０）　８．３±３，００ ．５％クレアチン　５／１０　（５０）　１２．０±７．３０２５％クレアチン 　４／１０　（４０）　８．０±２．８アサイクロビル、　２００ｍｇ／ｋｇ　 ９／　１０　（９０）　１４．０±０．０表１７ 単純ヘルペスウィルス２型（Ｈ３Ｖ−２）を膣内に感染させたマウスにおける生 存数及び膣ウィルス力価へのＡＭ２８５及び関連化合物を用いた処置の効果 処置　生存数／　平均死亡　２日目の膣化合物　開始日“　総数（％）　日数　 ウィルス力価１％ＡＭ２８５　−３　５／１０（５０）　６．６±１．１　３． ７±１．２＊＊２％ＡＭ２８５　−３　５／１０（５０）　９．６＋４．２　２ ．８±１．３木本１九ＡＭ６８９　−３　２／１０（２０）　６．４±１．１　 ５．４±１．８１％ΔＭ６９０　−３　４／１ｏ（４０）　６．０±０．０　３ ．２±１．３木本１冗ＡＭ６９６　−３　１／１．０（１０）　７．３±１．１ 　５．９±２．００．３％ＬｉＣＯ３−３２／１０（２０）　７．９±２．９　 ６．２±０．７１％クレアチン　−３５／１０（５０）　７．０±１．４　４． ４±１５＊アサイクロビル。
２００ｍｇ／ｋｇ　＋５時間　４／９（４４）　１３．５±３．９＊零本　３． ４±１．９木零＊　ｐ＞０．０５．＊＊ｐ＞０．０１．＊＊＊ｐ＞０．００１　 （プラセボ樟準に対して） 表１８ 腹腔内にＨＳ　Ｖ　−２を感染させたマウスの生存数に対するシクロクレアチン （ＡＭ２８５）及びアシクロビルの効果化合物　生存数／総数（％）　平均死亡 日数ウィルス感染グループ ＡＭ　２　８　５　（３２００釦ｇ／ｋｇ／日）　４／９　（４４）″　１３． ２±３．３ＣＡＭ２８５　（１６００ｍｇ／ｋｇ／日）　３／８　（３８）”　 １１．４±２．８ＡＭ２８５　（１，０％食餌的）　５／１０　（５０）ｂｌｏ 、８±２．４アシクロビル（２００ｍｇ／ｋｇ／日）　７／１０　（７０）’　 １２．０±３．５ブラセボ　１／１９　（５）　１０．２±２．３Ａ　Ｍ　２８ ５　（３２００ｍｇ／ｋｇ／日）　５１５　（１００）　＋６．５Ａ　Ｍ　２８ ５　（１６００ｍｇ／ｋｇ／日）　５１５　（１００）　＋５．３ＡＭ２８５（ １，０％）　５１５　（１００）　＋８．１アシクロビル（２００ｍｇ／ｋｇ／ 日）　５１５　（１，００）　＋６．１ブラセボ　５１５　（１００）　＋４． ８＊　標準偏差 ＃　−１４日及び＋８日における動物の体重の差’　ｐ＞０．００１ 表１９ ヌードマウスにおけるＨ３Ｖ−１感染へのＡＭ２８５及びアシクロビル（ＡＣＶ ）の効果 平−患得点 ３０．３±Ｑ、５　０．５±０．４　０．６±０．４４　０．６　ｆ　Ｏ，５ｂ Ｌ６±０．４　１．８　±０．９５０．４±０．３″　３．１±１９　’３．９ ±２．０６　０．２　±　０．３（３，９±　２．１　４．５　±　２．１７　 ０．１　＋　０．２ｅ２．９±２．０　４．４　±２．２８　０．１　±　Ｑｊ ’　４．５　±　３．０　３．９　±　２．５９　０．０　±　０．０”　４ｊ 　±　２．７　３．４　±　２．７ＩＱ　０．０±０６０″　４．１±２．８　 ２．９±３．０１１　０．０　土　ｏ、ｏ’　３．６　±　２．１１１　２．６ 　±　３．２１２　０−０±０．０’　３．６±２．８　２．６±３．２１３　 ０．０±Ｏ，ゲ　３．５±２．８　２．５±３．２工−−−ユＬニムー」正≦土 −−Ｍ工二＊ウィルス攻撃後。
＃ウィルス攻撃の２４時間後に開始して１日２回、１日の投薬量の半分を５日間 与えたｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ　／日＋粉砕したマウスの餌と直接混合したシクロク レアチンの）く−センテーン。供給はウィルス接種の３日前に開始し、１５日後 まで続けた。
’ｐ＜０．　０５　（二端分析５ｔｕｄｅｎｔのｔテスト）ｌｌｐ＜０．　０１ 　（二端分析５ｔｕｄｅｎｔのｔテスト）ｅｐ＜’０．００１．（二端分析５ｔ ｕｄｅｎｔのｔテスト）表２０ ネズミサイトメガロウイルスを腹腔内感染させたマウスの生存数へのＡＭ２８５ 及び関連化合物を用いた処置の効果化合物（投薬量）゛　生存数／総数（％）　 変化死亡日数ウィルス感染 クレアチン　３／１０　（３０）　５．４±０．５５クレアチンリン酸２Ｎａ（ ２％’）　１／１０　（１０）　５．３±０．７ＡＭ２８５（１％）　４／１０ 　（４０）　５．８±１．０グアニジノ酢酸　５／１０　（５０）　５．４±０ ．５β−グアニジノプロピオン酸（１％）　１／１０　（１０）　５．８±０． ７クレアチン／ｌＩｃ１（］、、　３３％　１／１０　（１０）　６．３±１． ４■、−アルギニン−１に１（１２％）　６／１０　（６０）　６．３±０．５ し一グリシンーＮａ（２，２％）７／１０　（Ｔｏ）　６．０±０．０ガン／ク ロビル（５０ｍｇ／ｋｇ）　１０／１０　（１００）本　）２１プラセボ　１０ ／２０　（５０）　６．０±０．８非感染毒性標準 体重変化（ｇ）゛ クレアチン　５１５　（ｔｏｏ）　＞２１　＋ＬＬ。５りＬ／７チンリン酸２Ｎ ａ（２％）　４１５　（８０）　４．０±０．０　＋１１．５ＡＭ２８５（１％ ）　５１５　（１００）　＞２１　＋１３．６グアニジノ酢酸　５１５　（１０ ０）　＞２１　＋１１．７β−グアニジノプロピオン酸（１％）　５１５　（１ ００）　＞２１　４９エクレアチン／ＨＣＩ（１，３％）４１５　（８０）　６ ．０±０．０　＋７．３Ｌ−アルギニン−１−ＩＣＩ（１，２％）　５１５　（ １００）　＞２１　＋９．９Ｌ−グリシン−Ｎａ（２，２％）　５１５　（１０ ０）　＞２１　＋１１．２ガンンクロビル（５０ｍｇ／ｋｇ）　５１５　（１０ ０）　＞２１　＋１０．４′ガンシクロビルを除くすべての化合物は粉砕したマ ウスの餌中の合計食餌のパーセンテージとして示す。供給はウィルスの攻撃前３ 日に開始し、その後７日間続けた。ガンシクロビルを用いた経口的強制飼養処置 はウィルス攻撃の１時間前に開始し、さらに６日間、毎日２回続けた。
５標準偏差 ｅ−３日と＋８日における動物の体重の差。
＊ｐ＜Ｑ、０１ 表２１ 細胞系　ＣＫ活性（単位／ｍｇ）　％リン酸化シクロクレアチン ＭＥ１８０　０．９　８５ ＤＵ１４５　０．４　７６ ベロ　０．０５　６８ Ａ２０５８　０．０１　１３ （パーセントリン酸化シクロクレアチンはＲｏｂｅｒｔｓ　ａｎｄ　Ｗａｌｋｅ ｒ　（Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｊ、Ｊ、ａｎｄ　Ｊ、Ｂ、Ｗａｌｋｅｒ。
Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、２２０＋５６３−５７１（１９８ ３））の方法により決定した。合計クレアチンキナーゼ活性はＳｉｇｍａ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手したキット（Ｓ ｉｇｍａ　Ｋｉｔ　＃４９　ＵＶ）を用い、製造者の指示に従って各細胞系から の粗タンパク質抽出物において決定した。すべての細胞系はＡＴＣＣから入手し た。）の範囲に含まれるものとする。
く ■咀９／ＳＩ’ｌＡｄ＃ の ＠叫営／Ｓ口Ａｄ＃ Ｕ 脂沓２／ＳｎＡ、３＃ 肘祖ｉ／５ｎＡｄ＃ 尉叫２／Ｓ１”ｌＡｄ＃ 肘沓’Ｎ／５ｆｌＡｃＩ＃ 寸 ○ し− 動射営／Ｓｌ″１Ｊｃ（＃ ■ 口］ トー ■’ｍＷ／５ｎＡｃｌ＃ 耐滴営／ｊｌｌｄ＃ ω 肘射営／５ｆｌＡｄ＃ ＡＭ２８５　（ミリモル） 記号： Ｈ３Ｖ−２接種後の日数 アシクロビル部分阻害濃度 ＦＩＧ、１２ ○　０．２　０４　０．６　０．８　１アシクロビル部分阻害濃度 ０　０．２　０．４　０．６　０．８　１アシクロビル部分阻害濃度 ＦＩＧ、１４ 肘眞営／５ｎＡｄ＃ ぽ） 討」営／Ｓｌｄ＃ 新湊Ｗ／Ｓｆ’ｌＡｄ＃ ｂ− 脂射９／Ｓｆ”１．（ｄ＃ ド 新湊営／５１１ｄｃｉ＃ ト ヒ 酎犯μＳｆ’ｌＡｄ＃ １−カルボキシメチル−２１−カルボキンメチル−２＝アミノイミダゾール（１ ）　、（ミ／ヘキサヒドロピリミジン（ＩＩ）１−カルボキンエチル−２−Ｎ− エチ、レーＮ−イミノイミダゾリジン（ＩＶ）　アヨジノグ、ノツｙ（Ｖ）ンス 異性１木 Ｆ工Ｇ、２０ Ｊ、Ｅ　８ａｌｄｗｉｎ　ｅイｏ１．、Ｔｅｆｒｏｈｅｄｒｏｎ、１９８６゜４ ２４８７９−４８８８．本明細書の化合物１５ＦＩＧ、　２１ ＮＨ２ Ｄ又は工、アミノ酸 （ｒＡＪＩＬｌ）９９２１：ｌ〜■ω中Ｗ叩ｆユｑ、　２４ ＦＩＧ、２５ Ａ１００Ａの添加時間 （感染後時） 補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成６年６月１７日

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. １．化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物７及び化合物８から成る 群より選ばれるクレアチン類似体。
  2. ２．図１９の構造５、構造６、構造９及び構造１０により特定され、Ｒがアルキ ル又は置換アルキル基である化合物から成る群より選ばれるクレアチン類似体。
  3. ３．哺乳類の抗ウィルス治療のための薬剤として用いるための請求の範囲１又は ２に記載のクレアチン類似体の利用。
  4. ４．細胞をクレァチン又は適したクレアチン類似体と接触させることを含む細胞 上のウィルスの細胞変性効果を減少させる方法。
  5. ５．クレアチン類似体が： （ａ）クレァチンキナーゼに対する動力学的生存性基質であるか；（ｂ）類似体 のリン酸化形態のリン酸基転移ポテンシャルがＡＴＰのリン酸基転移ポテンシャ ルより大又はそれと等しいがホスホロクレァチンのリン酸基転移ポテンシャルよ り小又はそれと等しいことを特徴とするか；あるいは （ｃ）クレァチンキナーゼに対する動力学的生存性基質であり、類似体のリン酸 化形態のリン酸基転移ポテンシャルが（ｂ）で特定した通りであることを特徴と する、請求の範囲４に記載の方法。
  6. ６．クレアチン類似体が； （ａ）シクロクレアチン； （ｂ）ホモシクロクレアチン； （ｃ）β−グアニジノプロピオネート；（ｄ）１−カルボキシメチル−２−イミ ノイミダゾリジン−４−オン；（ｅ）図１９の化合物１−４、７−８；及び（ｆ ）図１９の構造５、６、９及び１０により特定され、式中Ｒがアルキル又は置換 アルキル基である化合物から成る群より選ばれる、請求の範囲４に記載の方法。
  7. ７．選ばれたクレアチン類似体がＮ−リン酸化形態である、請求の範囲５に記載 の方法。
  8. ８．感染細胞をシクロクレアチンを含む組成物と接触させることを含む、ウィル スＤＮＡ複製及び／又はウィルスの細胞から細胞へのひろがりの程度を軽減する 方法。
  9. ９．ウィルスがＤＮＡウィルスである、請求の範囲４−８のいずれか１つに記載 の方法。
  10. １０．ＤＮＡウィルスがヘルペスウィルス及びアデノウイルスから成る群より選 ばれる、請求の範囲９に記載の方法。
  11. １１．ヘルペスウィルスが単純ヘルペスウィルス、サイトメガロウイルス及び水 痘ウィルスから成る群より選ばれる、請求の範囲１０に記載の方法。
  12. １２．単純ヘルペスウィルスが単純ヘルペスウィルス１型又は単純ヘルペスウィ ルス２型である、請求の範囲１１に記載の方法。
  13. １３．サイトメガロウイルスがヒトサイトメガロウイルスである、請求の範囲１ ２に記載の方法。
  14. １４．細胞を、細胞変性効果の観察に必要な条件下でシクロクレアチンを含む第 １の組成物、及びヌクレオシド又はヌクレオチド類似体を含む第２の組成物と接 触させることを含む、細胞に対するウィルスの細胞変性効果を減少させる方法。
  15. １５．ウィルスがヘルペスウィルスであり、ヌクレオシド類似体がアシクロビル 、ガンシクロピル、イドクスウリジン、トリフルリジン、ビダラビン、ジデオキ シイノシン及びアジドチミジンから成る群より選ばれる、請求の範囲１４に記載 の方法。
  16. １６．ウィルスがヘルペスウィルスであり、ヌクレオチド類似体がフォスカルネ ット及びフォスフォネットから成る群より選ばれる、請求の範囲１４に記載の方 法。
  17. １７．抗ウィルス治療用の薬剤の製造のためのクレアチン又は適したクレアチン 類似体の利用。
  18. １８．クレアチン又は類似体が一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、 （ａ）Ｙは−ＣＯ２Ｈ及び−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＳＯ２Ｊから成る群より選ばれ、こ こでＪは水素及びアリール（例えばフェニル）から成る群より選ばれ； （ｂ）ＡはＣ１−Ｃ４アルキル又はＣ１アルケニルから成る群より選ばれ、場合 によりそれぞれ置換基−ＮＨ２を有することができ；（ｃ）ＸはＮＲ１、ＣＨＲ １及びＲ１置換基を有するＣｌアルケニルから成る群より選ばれ、ここでＲ１は １）水素及び ２）Ｋから成る群より選ばれ、ここでＫはＣ１−Ｃ３直鎖状アルキル、Ｃ３−Ｃ ６分枝鎖状アルキル及びＣ１−Ｃ２直鎖状アルコイルから成る群より選ばれ； （ｄ）ＡがＣ１アルケニル基として選ばれる場合Ｘもアルケニル基として選ばれ ねばならず、ＸがＣ１アルケニル基として選ばれる場合Ａはアルケニル基でなけ ればならず、ここでＡとＸは二重結合により結合し；（ｅ）Ｚ１及びＺ２は−Ｎ ＨＲ２及び−ＣＨ２Ｒ２から成る群より独立して選ばれ、−ＮＨＲ２が選ばれた 場合Ｒ２は１）水素、 ２）Ｋ、ここでＫはＣ１−Ｃ３直鎖状アルキル、Ｃ３−Ｃ■分枝鎖状アルキル及 びＣ１−Ｃ２直鎖状アルコイルから選ばれる、及び３）−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（ ＯＨ）から成る群より選ばれ、−ＣＨ２Ｒ２が選ばれた場合Ｒ２は １）水素及び ２）Ｋから成る群より選ばれ、ここでＫはＣ１−Ｃ３直鎖状アルキル、Ｃ３−Ｃ ■分枝鎖状アルキル及びＣ１−Ｃ２直鎖状アルコイルから成る群より選ばれ； （ｆ）Ｒ１及び少なくとも１つのＲ２基が存在する場合、Ｒ１は単結合によりＲ ２に結合して５−７員環を形成することができ；（ｇ）Ｒ１が存在する場合、Ｒ １はＺ１又はＺ２の炭素又は窒素に単結合あるいは二重結合により結合して５− ７員環を形成することができる］及びそれらの製薬学的に許容し得る塩により特 定される、抗ウィルス治療に用いるための薬剤の製造のためのクレアチン又は適 したクレアチン類似体の利用。
  19. １９．クレアチン類似体が： （ａ）クレアチンキナーゼに対する動力学的生存性基質であるか；（ｂ）類似体 のリン酸化形態のリン酸基転移ポテンシャルがＡＴＰのリン酸基転移ポテンシャ ルより大又はそれと等しいがホスホロクレアチンのリン酸基転移ポテンシャルよ り小又はそれと等しいことを特徴とするか；あるいは （ｃ）クレアチンキナーゼに対する動力学的生存性基質であり、類似体のリン酸 化形態のリン酸基転移ポテンシャルが（ｂ）で特定した通りであることを特徴と する、請求の範囲１８に記載の利用。
  20. ２０．クレアチン類似体が： （ａ）シクロクレアチン； （ｂ）ホモシクロクレアチン； （ｃ）β−グアニジノプロビオネート；（ｄ）１−カルボキシメチル−２−イミ ノイミダゾリジン−４−オン；（ｅ）図１９の化合物１−４、７−８；及び（ｆ ）図１９の構造５、６、９及び１０により特定され、式中Ｒがアルキル又は置換 アルキル基である化合物から成る群より選ばれる、請求の範囲１８に記載の利用 。
  21. ２１．選ばれたクレアチン類似体がＮ−リン酸化形態である、請求の範囲２０に 記載の利用。
  22. ２２．ウィルスがＤＮＡウィルスである、請求の範囲１８−２１のいずれか１つ に記載の利用。
  23. ２３．ＤＮＡウィルスがヘルペスウィルス及びアデノウイルスから成る群より選 ばれる、請求の範囲２２に記載の利用。
  24. ２４．ヘルペスウィルスに感染した哺乳類における抗ウィルス治療用の薬剤の製 造のためのシクロクレアチンの利用。
  25. ２５．ヘルペスウィルスが単純ヘルペスウィルス、サイトメガロウイルス及び水 痘ウィルスから成る群より選ばれる、請求の範囲２３又は２４のいずれか１つに 記載の利用。
  26. ２６．単純ヘルペスウィルスが単純ヘルペスウィルス２型である、請求の範囲２ ５に記載の利用。
  27. ２７．サイトメガロウイルスがヒトサイトメガロウイルスである、請求の範囲２ ５に記載の方法又は利用。
  28. ２８．ヒトサイトメガロウイルスに感染した哺乳類における抗ウィルス治療用の 薬剤の製造のためのクレアチン又は適したクレアチン類似体の利用。
  29. ２９．クレアチン類似体が： （ａ）シクロクレアチン； （ｂ）シクロクレアチンリン酸； （ｃ）Ｎ−アセトイミドイルサルコシン；（ｄ）β−グアニジノアセテート；及 び（ｅ）グァニジノアセテートから成る群より選ばれる、請求の範囲２７に記載 の利用。
  30. ３０．粘膜皮膚表面のヘルペスウィルス感染を有する哺乳類における抗ウィルス 治療用の薬剤の製造のためのシクロクレアチンの利用。
  31. ３１．薬剤が局処的、経口的又は非経口的投与用である、請求の範囲３０に記載 の利用。
  32. ３２．該薬剤がヌクレオシド類似体と組み合わせて用いられる、請求の範囲３１ に記載の利用。
  33. ３３．ヌクレオシド類似体がアシクロビル、ガンシクロビル、イドクスウリジン 、トリフルリジン、ビダラビン、ジデオキシイノシン及びアジドチミジンから成 る群より選ばれる、請求の範囲３２に記載の利用。
  34. ３４．哺乳類における粘膜皮膚表面の単純ヘルペスウィルス感染の処置用の薬剤 の製造のためのシクロクレアチン及びヌクレオシド類似体の利用。
  35. ３５．薬剤が局処的投与用であり、ヌクレオシド類似体がアシクロビルである、 請求の範囲３４に記載の利用。
  36. ３６．生理学的に許容し得るビヒクル中にシクロクレ了チン及びヌクレオシド類 似体を含む抗ウィルス性組成物。
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