JPH07500498A - ２，５−ジヒドロキシフェニル酢酸の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２．５−ジヒドロキシフェニル酢酸の製法本発明は、一般式Ｉ： ［式中、Ｒ１は水素−１弗素−１塩素−又は臭素原子を表わす〕の化合物を発酵 的に製造するための新規方法に関する。

一般式■の化合物は、染料−及び薬剤製造の際の重要な中間体である。

特に２．５−ジヒドロキシフェニル酢酸（ホモゲンチシン酸）は、写真現像剤と して、化粧品生成物のために、及び薬剤製造のために使用される。

微生物が芳香族化合物を水酸化し得ることは知られている。芳香族環の水酸化は 、多くの場合に、該当物質の分解に至る反応順序の第一段階である。

Ｙｏｓｈｉｚａｋｏ等によって（＾ｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、４９（ ３）、１９８５．８７７〜８７９）、種々の菌類において、フェニル酢酸の分解 が、中間生成物２．５−ジヒドロキシフェニル酢酸（ホモゲンチシン酸）を経て 、経過することが公知である。これには、例えばアスペルギルス（＾ｓｐｅｒｇ ｉｌｌｕｓ）　、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕ■）、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅ ｌｌａ）　、ムコル（Ｉｕｃｏｒ）　、ペリクラリア（Ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒｉ ａ）　、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）　、フェリヌス（Ｐｈｅｌｌ ｉｎｕｓ）及びリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属の菌類が属する。しかしながら 、フェニル酢酸の物質代謝生成物としてのホモゲンチシン酸は、極めて少量でし か生成しない、それというのもこれは通例芳香族環の開裂によって更に分解され るからである。従って、経済的観点でのホモゲンチシン酸の生産には、野生型味 は、不適当である。

欧州特許出願（Ｅ　Ｐ）第３４３３３０号明細書に、酵母株を用いる、Ｌ−チロ シン又はＬ−フェニルアラニンからのホモゲンチシン酸の製造が記載されている 。そこで使用された出発物質は、比較的に高価であり、かつ反応は億少な収率で しか経過しないので、この方法は経済的に重要ではない。

特公昭４４−６６３３号公報に、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌ ｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の人工的に製造された変異型の好気性培養 によるフェニル酢酸からのホモゲンチシン酸の製法が記載されている。そこの例 １で挙げられた方法は、フェニル酢酸からホモゲンチシン酸を、収率４７％で生 成させ、この際、累積されたフェニル酢酸濃度は５　ｔ　／　ｌであった。

経済的方法のためには、一方では高い収率及び他方では培地中のできるだけ高い 基質濃度が必要である。

従って、良好な収率をもたらし、かつ高い基質濃度を可能とする式■の化合物の 発酵的製法を提供する課題があった。

それに応じて、一般式■： ［式中、Ｒ１は水素−１弗素−１塩素−又は臭素原子を表わす］の化合物を、発 酵的に製造するための、冒頭で定義した方法は、一般式■： ［式中、Ｒ１は前記の基を表わし、Ｒ２、Ｒ１＋は、相互に無関係で、水素原子 又はヒドロキシル基又はメトキシ基を表わし、かつＲ４は、ヒドロキシル基、又 はメトキン基、又はアミノ基を表わす］の化合物を、式■の化合物を水酸化する が、Ｃ−源として利用できないアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）又は ベアウベリア特表千７−５００４９８　（３） （Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）属の微生物の存在で、水酸化する場合に、特に良好な収 率をもたらすことが判明した。

本発明による方法に必要な一般式■の出発化合物は公知である。

それは、例えば、Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ、−１１ｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒｏｒ ｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ”　、８巻中に記載された方法により、製造 可能である。

微生物による一般式■の化合物の前記出発化合物の変換は、２−及び５−位にお ける芳香族核の水酸化を包含する。出発化合物中のこれらの位置に、水素原子又 はメトキシ基が存在する場合には、これらの基は本発明による方法でヒドロキシ ル基に代えられる。

芳香族核の４−位の基、例えば水素−又はハロゲン原子は、本発明による方法に よって変化されない。４−位に水素原子を有する出発化合物を使用するのが有利 である。

芳香族体の水酸化のほかに、カルボキシル基の変化を、本発明による方法によっ て行なうこともできる。

すなわち、例えばメチルエステル又は酸アミドが遊離酸もしくはその塩に変えら れる。出発化合物として、遊離酸もしくはその塩を使用する場合には、これらの 基は、本方法によっては変えられない。

本発明による方法に好適な微生物は、一方では、出発化合物を芳香族核で水酸化 することができるという能力を有し、他方では出発化合物を炭素源として利用し ない。

そのような微生物は、芳香族体水酸化能力を有する野生株の突然変異によって、 有利に得られる。

微生物として、アスペルギルス又はベアウベリア属のもの１３例えば、アスペル ギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　、Ａ、　＝デユラン ス（ｎ１ｄｕｌａｎｓ）　、Ａ　。

パラジチクス（ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）　、Ａ　、カルボナリウス（ｃａｒｂ ｏｎａｒｉｕｓ）、Ａ、ホエチデュス（ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、Ａ。

オリザエ（ｏｒｙｚａｅ）　、Ａ　、スクレロチオルム（５ｃｌｅｒ。

ｔｉｏｒｕｍ：ｌ　、ベアウベリア・バッジアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ　ｂａｓ ｓｉａｎａ）、Ｂ、デンサ（ｄｅｎｓａ）　、Ｂ、プログニアルチイ（ｌ＞ｒｏ ｇｎｉａｒｔｉｉ）　、Ｂ　、アモルフ７　（ａｓｏｒｐｈａ）、Ｂ、ベルミコ ニア（ｖｅｒ■１ｃｏｎｉａ）を使用するのが有利である。ベアウベリア・バッ ジアナ種ＤＳＭ６６５０のものが特に有利である。

微生物が、出発化合物を所望の方法で芳香族核に水酸化することに適しているか どうかは、分析方法、例えば栄養培地を用いるガスクロマトグラフィーに依り、 容易に決めることができる。

栄養培地に水酸化すべき出発化合物を添加し、かつ培養しているうちに、出発化 合物が減少し、かつ所望の水酸化化合物が代謝物として出現するかどうかを調査 するのが有利である。代謝物の確認のために、常法、例えば“レスティング−セ ル（ｒｅｓｔｉｎｇ−ｃｅｌｌ）　”’　−実験、阻害物質の使用又は同位元素 標識付けが使用され得る。

好適な微生物から、もはや出発化合物を炭素源として使用することのできない突 然変異体が有利に産出される。

そのような突然変異体の産出のために、公知の微生物学的技術を使用することが できる。突然変異の誘発のために、全ての慣用方法、例えば突然変異誘発物質、 例えばニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート、亜硝酸ナトリウムの使 用、又は電磁気放射、例えばＵＶ−、ガンマ−又はレントゲン放射作用を使用す ることができる。更に突然変異誘発のためには、転移可能な遺伝因子を使用する こともできる。突然変異体の単離のために、種々の特性、例えば唯一のＣ−源と してのフェニル酢酸上で増殖することができないこと、又は生成されたホモゲン チシン酸による視覚的に認識可能な褐色化を、利用することができる。場合によ っては、その代りに、所望の突然変異体の富化をもう１度実施することもできる 。

本発明による方法は、出発化合物を１〜２０　ｔ　／　１、有利に５〜１５　ｇ ／　ｌの濃度で含有する栄養培地中で培養される好適な微生物を用いて実施され る。

本発明による方法は、使用された基質を高濃度の基質原液の添加によって再び補 充するように、有利に実施される。それによって、発酵培地中５０　ｑ　／　ｌ までの累積基質濃度を達成することが可能である。

培養時間は、出発化合物及び微生物に依る；それは通例、数日間である。培養は 、出発化合物のほとんど定量的な変換が行なわれるまで、有利に続けられる。

培養は、連続的、又は不連続的な方法で操作されうる：しかしながら不連続的な 方法が有利である。

栄養培地からの水酸化フェニル酢酸の単離及び精製は、公知方法により行なわれ る。固体の生物量を栄養培地から分離し、有価物質を、例えば有機溶剤で抽出し 、かつ有価物質を抽出相から、場合により更に、例えば結晶化により精製した後 に、単離するのが有利である。

本発明を次の実施例により更に詳説する。

例１ ベアウベリア・パンアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉ　ｂａｓｓｉａｎａ）からの突然変 異体（Ｌｕ６５７７）の製造菌類ベアウベリア・パンアナＤＳＭ６６５０を、Ｎ −メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロングアニジン（ＭＮＮＧ）によって、突然 変異させた。０．１Ｍ燐酸塩緩衝液ｐ　Ｈ７，０，０，１重量％ポリエトキシソ ルビタンオレエート（トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）　８０■）中の菌類の胞子懸濁 液を、１ｍｌ当り胞子１０７の力価に調整した。この胞子懸濁液１０ｍｌを、Ｍ ＮＮＧ５ｍｇ／ｍ／（ジメチルホルムアミド中に溶かした）の原液の添加により 、Ｍ　Ｎ　Ｎ　Ｇ　０　、２　ｍ　ｑ　／　ｍ　ｌの濃度に調整し、かつ弱振盪 下で、３０℃で、１５分間恒温保持した。次いで、胞子を遠心分離（５０００Ｕ ｐｍで５分間）によって収得し、かつトウィーン緩衝液１０ｍ１で２回洗浄した 。胞子をトウィーン緩衝液に入れ、希釈し、かつ複合培地上に拡げた。非処理胞 子との比較で、数回の実験で、規則的に、１〜２％の突然変異化胞子の残生率を 生じた。

突然変異化胞子を、次の組成の複合培地を有する寒天平板上に拡げ、かつ３０℃ で５日間恒温保持した：Ｄ−グルコース　５０　ｇ／ｊ！ 酵母エキス　１０　ｇ／Ｉ Ｋ２ＨＰ０．　３．６　９／ｌ ＫＨ２ＰＯ４１，５ｑ／ｌ Ｍｇ５０４Ｘ７Ｈ２００，５ｑ／７！ Ｍｎ５Ｏ４ｘＨ２００，０５ｑ／１ 微量元素溶液　２ｍ１ｌ／１ 寒天　２０ｙ／１ 微量元素溶液： 硫酸鉄（ｎ）−１水和物　２００ｍｇ／ｌ硫酸亜鉛（ＩＩ）−４水和物　１０ｍ ｇ／ｌ塩化マンガンー４水和物　３７Ｆ！９／１硼酸　３０ｍｑ／１ 塩化コバルト（ＩＩ）　−６水和物　２０ｍｑ／１塩化銅（■）−２水和物　１ ｍｇ／ｌ 塩化ニッケル（、Ｉ［）−６水和物　２ｍｑ／１モリブデン酸ナトリウム−２水 和物　３ｍｑ／１エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）５００ｍｑ／１ 生成した単コロニーから、つまようじで、小さな菌糸体片を、唯一の炭素源とし てフェニル酢酸を有する次の最小培地各２ｒｒＬｌを有する試験管中に、接種し たフェニル酢酸　５ｑ／１ （ＮＨ４）　２ＳＯ４５９／　ｅ Ｋ２ＨＰＯ４３，６ｑ／Ｉ Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４１、５ｑ　／　９ ＭｇＳＯ４Ｘ７Ｈ２００，５ｙ／ｌ Ｍｎ５Ｏ４ｘｒ−ｔ２ｏ　Ｏ，０５ｑ／１微量元素溶液　２　ｍｌ／Ｌ バッチを３０℃で７日間振盪した（１８０Ｕ、、）。

この期間中に、培地を厚（被わなかったクローン（Ｋｌｏｎｅ）の特性を更に調 べた。増殖しなかったクローンの割合は、種々の実験で、３及び８％の間であっ た。

特性を更に調べるべきクローンを、この保留試料（Ｒｕｅｃｋｓｔｅｌｌｍｕｓ ｔｅｒ）から、フェニル酢酸２ｇ／ｌを有するｍ＝培地各２ｍｌ中に接種し、か つ３０℃で１０日間振盪しながら培養した。

次いで、培養物を遠心分離し、かつ培養上澄液で光度測定試験を実施した：培養 上澄液０　、５　ｍ　１！に、１．６％ＮａＮＯ２０，５ｍｌ及びＩＭ　Ｈ２Ｓ ０４０．２ｍｌを加え、かつ１０分間恒温保持した。次いで、２．３Ｍ　ＮａＯ Ｈ中の０．２重量％　ＥＤＴＡＯ，２５ｍ１を添加し、かつ試料を４５０ｎ■で 交鎖に対して測定した。交鎖については、その他は同じ方法で、ＮａＮＯ２−溶 液の代りに、水を添加した。

光度測定試験で、吸光度Ａ４６０＞１．８を有したクローン（試験したクローン の１−５％）を、振盪フラスコ実験で更に検査した。そのために、各々クローン の予備培養物を、フェニル酢酸２．５ｑ／ｌを有する複合培地中で調合した（２ ５０ｙｎ＆’−エルシンマイヤーフラスコ中３０ｍｊり。３０℃で３日間の振盪 後に、予備培養物各５　ｍ　ｌを用いて、主培養を、フェニル酢酸１０　ｑ　／ 　ｌと共に行ない、かっ３０’Ｃで振盪した。

各々３及び７日間後に、試料を取り出し、かつフェニル酢酸及びその誘導体の含 量をガスクロマトグラフィーで分析した。

培養物１　ｍ　ｌを取り、５Ｍ　ＨＣＩ　１００μｌ及び酢酸エステル８００μ ｌを加え、１５秒Ｍ？ｆ１合し、かつ２分間１２０００ｓで遠心分離した。有機 相５０μｌを取り、かつＮ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）−トリフルオル アセトアミド（ＭＳＴＦＡ）５０μｌを加えた。

試料をガスクロマトグラフィーで分離した（１６５℃等温性、カラム：メチルシ リコン１２．５ｍ、　Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、注入容量１μｍ）。フ ェニル酢酸は、クロマトグラムに、１．７分間後に現われ、ホモゲンチシン酸は 、７．８分間後に現われた。

突然変異体Ｌｕ６５７７は、この試験で、７日間後に、フェニル酢酸からホモゲ ンチシン酸への完全な変換を示した。

例２ フェニル酢酸からホモゲンチシン酸の製造突然変異体Ｌｕ６５７７を、２５０ｍ Ｊ−エルシンマイヤーフラスコ中の次の培地５　Ｘ　３０　ｍ　ｌ中に接種し、 かつ３０℃で、１８０Ｕｐｍで好気的に、振盪しながら３日間恒温保持した： フェニル酢酸　２．５ｅ／Ｉ Ｄ−グルコース　５０ｑ／１ 酵母エキス　１０ｔ／Ｉ Ｍｇ　３０４　Ｘ　７１（＋ａＯ０，５９／　ＩＫ　Ｈ＠　Ｐ　０４　１　、５ 　９　／　ＩＫｌ！ＨＰＯ４３，６ｅ／１ 微量元素溶液　２　ｍｌ／［ 同−培地及びフェニル酢酸濃度ＬＯｅ／ｌを有する１１−発酵槽に、この予備培 養物を接種した。発酵槽を６００Ｕｐｍで撹拌し、かつ１分間当り、反応器１容 量当り、空気１容量でガス処理した。フェニル酢酸濃度が０．５及び５　ｙ　／ 　ｌの間の値に下降してしまうまで、反応が進んでしまった場合にはいつでも、 水中２０％の原液の形でフェニル酢酸を数回供給し、従って、そのつど再び、培 地中のフェニル酢酸の５及び１０　ｑ／ｌの間の濃度が達成された。この方法で 、合計の達成後に、培養物を、それ以上のフェニル酢酸の供給なしに、更に恒温 保持した。フェニル酢酸が完全にホモゲンチシン酸に変換した時に、セル（Ｚｅ ｌｌｅｎ）を遠心分離した。培養上澄液をＨＣＩでｐＨ＝２に調整し、かつ生成 したホモゲンチシン酸を、酢酸エチルエステルでの抽出により得た。溶剤の蒸発 除去後に、ホモゲンチシン酸２６．８＃を得た。

例３ ２−ヒドロキシフェニル酢酸からのホモゲンチシン酸の製造 例２と同様に、しかしながらフェニル酢酸無しで、菌株Ｌｕ６５７７の予備培養 物（３０ｍｌ）を調合した。予備培養物５　ｍ　ｌを用いて、３日間後に、主培 養物（３０ｍｌ）を、２−ヒドロキシフェニル酢酸５ｇ／ｌを有する同−培地中 に接種した。１８０Ｕｐｍ及び３０℃で４日間振盪した後に、２−ヒドロキシフ ェニル酢酸は、完全にホモゲンチシン酸に変換した。

例４ ３−ヒドロキシフェニル酢酸からのホモゲンチシン酸の製造 基質として、３−ヒドロキシフェニル酢酸１　ｅ　／　１を添加したことを相違 して、例３におけると同様の方法で、Ｌｕ６５Ｖ７の主培養物を調合した。３０ ℃で４日間の振盪恒温保持後に、３−ヒドロキシフェニル酢酸はホモゲンチシン 酸に変換した。

例５ ３−メトキシフェニル酢酸からのホモゲンチシン酸の製造 例３におけるように、Ｌｕ６５７７を有する主培養物を接種した。基質として、 ３−メトキシフェニル酢酸１　ｑ　／　ｌを添加した。４日間の経過で、基質は ３−ヒドロキシフェニル酢酸に脱メチル化され、かつ更にホモゲンチシン酸に水 酸化された。

例６及び７ ハロゲン化ヒドロキシフェニル酢酸の製造例２に記載したように、突然変異体Ｌ Ｕ６５７７の予備培養物（３Ｘ３３０ｍ／）を、１０１−発酵槽に各々接種し、 かつ３０℃で３日間恒温保持した。予備培養物中のエダクト（Ｅｄｕｋｔ）濃度 は、０．５ｙ／ｌであった。主培養物中では、エダクト濃度は５　ａ　／　ｌで あった。実験結果は第１表から明らかである。

国際調査報告 °′″”−°°°°“°２′”Ｔｅａｌ　１５ｍ１）ｙ−”−７°１１４１＊ｎ ＠−−′−゛″゛°゛”−”−−＋に−１“δ７ンｉフタ’煤|’″″７ 丁ｔ１・［ＩＨｇｐ＠ｕＩＩＰ＠Ｉｅ＋−電ｍｎ＋ａＩｎ＋＋＋Ｒ１１ｗｈｙ１ ｍ−１−ｈＪ＋ｈｔ＋ｅｔｓｒ＋＋ｅｗ＋ｓｎｗｈｌ＄ａｎ高浮香翌戟{ｅｓ＋ ａ＋ＩＭｐｗ−＋１ｅｌｌＲＩ＃Ｍ＠１ｌｆｉフロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号（Ｃ１２Ｐ　７／４２ Ｃ１２Ｒ１：６４５） （７２）発明者　ラードナー、ヴオルフガングドイツ連邦共和国　Ｄ−６７０１ フスゲンハイム　イン　デン　ベレン　５ （７２）発明者　ミュラー、ウルズラ ドイツ連邦共和国　Ｄ−６７０１フスゲンハイム　メロヴインガーシュトシーセ 　８Ｉ （７２）発明者　プレスラー、ウーヴエドイツ連邦共和国　Ｄ−６７０１アルト リップ　グローセ　ホルストシュトシーセ　１５（７２）発明者　マイアー、ヨ アヒム ドイツ連邦共和国　Ｄ−６７０１マックスドルフ　カルミットシュトラーセ　４

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. １．一般式Ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）［式中Ｒ１は水素−、弗素−、塩素− 又は臭素原子を表わす］の化合物を、発酵的に製造するために、一般式ＩＩ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）［式中Ｒ１は前記の基を表わし、Ｒ ２、Ｒ３は相互に無関係に、水素原子又はヒドロキシル基又はメトキシ基を表わ し、かつＲ４はヒドロキシル基又はメトキシ基又はアミノ基を表わす］の化合物 を、式ＩＩの化合物を水酸化するが、Ｃ−源としては利用し得ないアスペルギル ス又はベアウベリア属の徴生物の存在で、水酸化することを特徴とする、２．５ −ジヒドロキシフェニル酢酸の製法。
2. ２．徴生物として、ベアウベリア・パッシアナＤＳＭ６６５０を使用する、請求 項１に記載の方法。