JPH04271789A - Ｄ−パントラクトンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＤ−パント酸塩および／
またはＤ−パントラクトンの製造方法および生産菌に関
する。Ｄ−パントラクトンはＤ−パントテン酸（ビタミ
ンＢ５）やＣｏＡの重要な合成中間体として有用な物質
である。

【０００２】

【従来の技術】α−ケトパントラクトンまたはα−ケト
パント酸塩を不斉還元することによるＤ−パントラクト
ンの従来の製造法としては、（イ）有機合成による方法
および（ロ）微生物による方法がある。（イ）の方法と
してはキラルなリガンドを持つロジウム触媒で不斉還元
する方法（特開昭６２−９５１４０号など）があり、（
ロ）の方法としては、（ａ）菌株にキャンディダ・パラ
プシロシス、アグロバクテリウム・ツメファシエンス等
を用いる方法（特公昭６１−１４７９７号など）や、（
ｂ）ミコプラナ・ブラタ等を用いる方法（特開平２−１
００６９２号）がある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】前記（イ）の方法につ
いては、高価な触媒を多量に用いねばならないことや、
水素加圧下の反応であるために取り扱いが厄介であるこ
となどの欠点がある。また、（ロ）−（ａ）の方法につ
いては、低濃度のα−ケトパントラクトンを長時間の培
養および反応により不斉還元する方法で菌株スクリーニ
ングを行っているため、多くの微生物が不斉還元能を有
することは確認されているが、工業的に利用できるほど
還元能力は高くなく、生成Ｄ−パントラクトンの濃度が
低いという欠点があった。（ロ）−（ｂ）の方法につい
ては、１５％濃度のα−ケトパント酸塩を変換率９０％
で還元しているものの、菌体培養に６日、菌体反応に５
日という長時間を要し、さらに、菌体反応時にはその容
量の２０倍もの菌体培養液を用いており、実際の工業化
には問題を残していた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは前記のごと
き問題点を解決するため鋭意研究を重ねた結果、チゴサ
ッカロマイセス属に属する微生物が高濃度のα−ケトパ
ントラクトンを高収率で、しかも、高い光学純度でＤ−
パントラクトンに不斉還元することを見いだした。本菌
は培養液中での生育が早く、また、高濃度のα−ケトパ
ントラクトンをＤ−パントラクトンに迅速に還元する。 さらに、反応系への炭酸カルシウム等の金属塩類などを
添加することにより、その還元速度が高まると同時に菌
体を数回にわたって再利用することが可能となる。しか
しながら、比較的多量のα−ケトパントラクトンを培養
系あるいは菌体反応系に添加するとα−ケトパントラク
トンおよび／または生成する多量のＤ−パントラクトン
によって生菌体数は減少し、高濃度のＤ−パントラクト
ン含有液を得ることは困難となり実用化の障害となって
いた。本発明者らは、Ｄ−パントラクトンをより安価に
製造する方法を開発すべく、さらに研究を行った結果、
α−ケトパントラクトンあるいはＤ−パントラクトンに
耐性を有する微生物の中に、野生株よりさらに大量のα
−ケトパントラクトンを不斉還元しＤ−パントラクトン
を生成する能力を有する菌株があることを初めて見い出
し、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、（１）α−ケトパン
ト酸塩（例、アンモニウム塩、ナトリウム塩等）および
／またはα−ケトパントラクトンをチゴサッカロマイセ
ス属に属する微生物より選ばれた少なくとも一種の微生
物により立体選択的に還元することを特徴とするＤ−パ
ント酸塩（例、アンモニウム塩、ナトリウム塩等）およ
び／またはＤ−パントラクトンの製造方法および（２）
α−ケトパント酸塩および／またはα−ケトパントラク
トンあるいはＤ−パント酸塩および／またはＤ−パント
ラクトンに耐性を付与された微生物を用い、α−ケトパ
ント酸塩および／またはα−ケトパントラクトンを立体
選択的に還元することを特徴とするＤ−パント酸塩およ
び／またはＤ−パントラクトンの製造方法に関する。

【０００６】以下に、Ｄ−パント酸塩および／またはＤ
−パントラクトン生産菌探索の一具体例を示す。例えば
、グルコース、コーンスチープリカー、無機塩類からな
る液体培地２０ｍｌを２００ｍｌ容三角フラスコに分注
し、斜面培地から種菌を１白金耳量これに接種し、２８
℃、２４時間回転振とう機上で好気的に培養した。得ら
れた培養液から遠心分離により菌体を得、１０ｍｌの蒸
留水で洗浄した。この洗浄菌体およびグルコース４％、
α−ケトパントラクトン３％からなる反応液２０ｍｌを
２００ｍｌ容三角フラスコに入れ、２８℃で２４時間好
気的に回転振とうした。このようにして得られた反応液
は遠心分離により菌体を取り除いた後、上清液に６Ｎ−
塩酸を加え、８０℃湯浴中にて１５分間加熱した。 この操作により、平衡状態で存在するα−ケトパント酸
およびパント酸はそれぞれα−ケトパントラクトンおよ
びパントラクトンに変換される。さらに、これらを酢酸
エチルで抽出し、ＨＰＬＣにより、α−ケトパントラク
トン、Ｄ−パントラクトン、Ｌ−パントラクトンを分別
定量した。カラムはＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬＯＡ−１２０
０を用い、移動層としては　ｎ−ヘキサン／１，２−ジ
クロロエタン／エタノール＝９０／８／２の系を用いた
。この方法によって菌株を探索した結果、高濃度のα−
ケトパントラクトンを迅速にかつ高選択率でＤ−パント
ラクトンに還元する微生物はチゴサッカロマイセス属（
Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属しているこ
とがわかった。なお、このチゴサッカロマイセス属菌は
いずれも財団法人発酵研究所発行の「リスト・オブ・カ
ルチャーズ（ｌｉｓｔ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、第
８版、１９８８」に掲載されている公知菌株であり、財
団法人発酵研究所より容易に入手できる。

【０００７】本発明で使用されるα−ケトパントラクト
ンまたはＤ−パントラクトンに耐性となった変異株は、
前記のような親株を用い、これに通常の変異誘導操作、
例えば紫外線照射、あるいはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート
などの化学薬剤処理を施し、変異処理した菌体を親株が
生育できないような量のα−ケトパントラクトンあるい
はＤ−パントラクトンを含有する平板培地で培養し、該
平板培地上に生育するコロニーを分離することによって
得られる。また該微生物は前記の性質に加えて他の性質
、例えば各種栄養要求性、薬剤耐性、薬剤感受性等を併
せ持ってもよい。

【０００８】本発明に用いる変異株の具体例としては、
チゴサッカロマイセス・シドリ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｉｄｒｉ）ＩＦＯ１９９０から誘
導したチゴサッカロマイセス・シドリＦＶ−５（ＩＦＯ
　１０５２３、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−３２２３）、　ＦＶ
−４７（ＩＦＯ　１０５２５、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−３２
２４）、ＦＶ−１４３（ＩＦＯ　１０５２６、ＦＥＲＭ
　　ＢＰ−３２２５）あるいはチゴサッカロマイセス・
ファーメンタティ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ　　ｆａｒｍｅｎｔａｔｉ）ＩＦＯ　０８５２から誘
導した　チゴサッカロマイセス・ファーメンタティＦＶ
−１８（ＩＦＯ　１０５２４、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−３２
２６）等を挙げることが出来る。これらのＦＥＲＭ番号
は工業技術院微生物工業技術研究所への寄託番号を、ま
たＩＦＯ番号は財団法人発酵研究所への寄託番号を表す
。

【０００９】本発明で用いる菌体の培養には各種培地が
考えられるが、炭素源としてはグルコースなどの各種糖
類、エタノールなどのアルコール類、炭化水素類、有機
酸類など、窒素源として硫酸アンモニウムなどのアンモ
ニウム塩、硝酸塩類、尿素、アミノ酸、ペプトン、カザ
ミノ酸、コーンスチープリカー、ふすま、米ぬか、酵母
エキスなど、無機塩類として硫酸マグネシウム、塩化ナ
トリウム、炭酸カルシウム、リン酸１水素カリウム、リ
ン酸２水素カリウムなど、他の栄養源としては麦芽エキ
ス、肉エキス、ファーマメディアなどを含む培地が用い
られるが、特にこれに限定されるものではない。この培
地に菌体を接種し、好気的または嫌気的に培養する。培
養温度は１５−６０℃がさらに好ましくは２０−４０℃
が適当である。還元反応を行うには、この培養開始時か
ら基質であるα−ケトパントラクトンを添加しても良い
し、５−４８時間の培養で生育させて後の培養液にα−
ケトパントラクトンを加え反応液として用いても良い。 あるいは、培養５−４８時間後の培養液から遠心分離ま
たは濾過により菌体を取り出し、基質のα−ケトパント
ラクトンなどを含有した反応液にこれを加えることによ
り行っても良い。反応方法としては水系（水、生理食塩
水、バッファー液、培地など）に該菌株の培養液、休止
菌体または乾燥菌体の単独または混合物を分散させ、エ
ネルギー源としてグルコース、シュークロースなどの糖
質類、あるいはグリセロール、エタノールなどを添加す
る。また、少量の有機Ｎ源、ビタミン類、あるいは炭酸
カルシウムなどの金属塩類などを添加するとよい結果を
与える。

【００１０】反応系に基質のαーケトパント酸塩および
／またはα−ケトパントラクトンや、エネルギー源のグ
ルコースなどを添加するには反応開始時に一括して添加
しても良いし、数回に分けて添加する法がよい結果を与
える場合もある。基質のαーケトパント酸塩およびα−
ケトパントラクトンはそれぞれ単独でも、任意の割合で
混合して用いてもよく、これらは固体または水溶液の形
で用いられる。αーケトパント酸はアンモニウム塩やナ
トリウム塩などの金属塩などの形で添加する。反応系に
おける、基質濃度は特に限定するものではないが、バッ
チ方式の場合、２−１８％が適当である。一般に反応は
基質添加後１０−７０℃、好ましくは２０−４０℃の温
度で、１２−９６時間回転振とう下に行う。反応中の培
養液のｐＨは１−９、好ましくは２−７がよい。また菌
株を別途固定化して作用せしめたり、該菌株から分離し
た還元酵素を用いるなど、任意の方法が採用される。当
該還元活性の発現に必要な遺伝子を人為的に取り出し、
それを組み入れた他の微生物菌体であっても本発明の方
法に使用できる。反応形式としてはバッチ方式のほか、
固定化された菌株を管や塔に充填してα−ケトパントラ
クトンおよび／またはα−ケトパント酸塩を流下させる
連続方式などの任意の手段が採用できる。

【００１１】

【発明の効果】前記のチゴサッカロマイセス属菌体を用
いて反応させることにより高濃度のα−ケトパントラク
トンからＤ−パントラクトンを短時間で製造でき、同時
に収率、光学純度がいずれも高いという長所を有する。 また、少量の有機Ｎ源やビタミン類、金属塩などを反応
系に添加することによって還元速度が飛躍的に向上し、
反応時間の短縮が可能になると共に、菌体の再利用が可
能となる。さらにα−ケトパントラクトンあるいはＤ−
パントラクトンに耐性を有する菌株を使用することによ
って、より大量のＤ−パントラクトンを生成、蓄積させ
ることが出来る。

【００１２】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明する。 実施例１ 第１表に示す組成の液体培地をオートクレーブ中１２１
℃で１５分間加熱滅菌し、２００ｍｌ容三角フラスコに
２０ｍｌずつ分注した。ここに斜面倍地からチゴサッカ
ロマイセス・ファーメンタティ（ＩＦＯ　０８５２）の
種菌を１白金耳量接種し、２８℃で２４時間回転振とう
機上で好気的に培養した。遠心分離後１０ｍｌの水で一
度洗浄して得られた菌体および４％のグルコース、３％
のα−ケトパントラクトンを含む反応液２０ｍｌを２０
０ｍｌ容三角フラスコに入れ、２８℃にて２４時間好気
的に回転振とうした。このようにして得られた反応液を
ＨＰＬＣで分析した所、収率は９６．８％、生成パント
ラクトン中のＤ−パントラクトンは９０．０％であった
。（ここに、「収率」とは対α−ケトパントラクトンの
モル収率である。以下同様。）

【表１】

【００１３】実施例２ 実施例１と同じ培養方法で得られたチゴサッカロマイセ
ス・シドリ（ＩＦＯ１９９０）の培養液２０ｍｌを種菌
液とし同じ培地２００ｍｌに加え、１リットル容三角フ
ラスコで２８℃、２２時間好気的に振とう培養した。さ
らに得られた培養液を種菌液として１．８リットルの前
記培地に添加し、５リットル容ジャーファーメンターで
２８℃、２４時間好気的に培養した。遠心分離によって
得られた菌体を１ｌの蒸留水で洗菌した後、この菌体、
およびグルコース１２ｇ、α−ケトパントラクトン２０
ｇを溶かした反応液１９００ｍｌを５リットル容ジャー
ファーメンターに入れ、２８℃で撹拌し、反応させた。 さらに、グルコースおよびα−ケトパントラクトン濃度
がそれぞれ３４％の水溶液を１２．８ｍｌ／ｈｒの速さ
で１８時間連続的にフィードした（フィード体積２３２
ｃｃ）。フィード終了より５０時間後の上清液をＨＰＬ
Ｃで分析したところ、収率は９６．６％、パントラクト
ン中のＤ体の比率９７．９％であり、生成パントラクト
ン以外は残存α−ケトパントラクトンであった。この反
応液を水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．０に調整した後
さらに硫酸でｐＨ３．５とした。この操作により、基質
であるα−ケトパントラクトンはすべてα−ケトパント
酸に開環し、生成物の開環体であるパント酸はパントラ
クトンとなる。ｐＨ調整後同容量の酢酸イソプロピルで
５回抽出し濃縮及び晶出の操作によりパントラクトンの
精結晶８４．６ｇを得た。得られた精結晶の純度は９９
．８％、比旋光度は［α］Ｄ＝−５０．５３゜であった
。

【００１４】実施例３ 実施例２と同じ方法で得られたチゴサッカロマイセス・
シドリ（ＩＦＯ１９９０）の培養液１００ｍｌを遠心し
、５０ｍｌの蒸留水で洗菌した。得られた菌体およびグ
ルコース０．６ｇ、α−ケトパントラクトン１ｇを含む
水溶液８０ｍｌに、塩化カルシウム０．２ｇまたは硫酸
亜鉛０．２ｇを添加、あるいは金属塩無添加の条件で２
００ｍｌ容マイクロジャーファーメンターを用いて２８
℃にて好気的に撹拌し、反応させた。これらの反応液に
グルコースおよびα−ケトパントラクトン濃度がそれぞ
れ１５％及び２５％の水溶液を１ｍｌ／ｈｒの速さで２
６時間連続的にフィードした。反応開始後４８時間後の
上清液をＨＰＬＣで分析した。結果を第２表に示す。

【表２】

【００１５】実施例４ 実施例１の方法でチゴサッカロマイセス・シドリ（ＩＦ
Ｏ１９９０）を培養、遠心分離し、洗菌した。得られた
菌体および５％のグルコース、３％のα−ケトパントラ
クトンを含む反応液２０ｍｌに第３表に示す添加物を第
３表に示す濃度になるように添加し、２００ｍｌ容三角
フラスコ中で、２８℃にて２４時間回転振とうした。得
られた反応後の液を遠心分離し、上清は所定の分析に供
し、菌体は再び前記の条件の反応に用いた。このように
して菌体の再使用を３回（反応は計４回）行い、無添加
のものと比較した。結果を第３表に示す。

【表３】

【００１６】実施例５ チゴサッカロマイセス・シドリ　ＩＦＯ　１９９０　あ
るいはチゴサッカロマイセス・ファーメンタティ　ＩＦ
Ｏ　０８５２　を酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．
３％、ペプトン０．５％，グルコース１％、寒天２％か
らなる平板培地に塗布し、２８℃にて１日培養し、得ら
れた菌体を０．８５％食塩水１０ｍｌを含む直径９ｃｍ
のシャーレに懸濁し、６００ｎｍにおける吸光度を３．
０に調整した。無菌箱内に設置してある殺菌ランプの下
方４５ｃｍにこの懸濁液を置き、撹拌しながら２５４ｎ
ｍの紫外線（１．７μＷ／ｃｍ２）を６５秒照射した。 紫外線照射後の菌液を第４表あるいは第５表に示す平板
培地に０．１ｍｌずつ塗布し、２８℃にて４日間培養し
た。生じてきたコロニーを分離し、α−ケトパントラク
トンに耐性（ＫＰＬｒ）あるいはＤ−パントラクトンに
耐性（ＤＰＬｒ）となった株を得た。第６表に示すよう
なこれらの株を第１表に示す組成の培地に斜面培地から
１白金耳ずつ接種し、２８℃で２４時間振とう培養を行
った。一方、第１表に示す組成の培地に第６表に示す濃
度となるようにα−ケトパントラクトンあるいはＤ−パ
ントラクトンを加え、直径１６ｍｍの試験管に５ｍｌず
つ分注し、１２１℃で１０分間加熱殺菌して培地を調製
した。これらの培地に前記のようにして培養した培養液
を０．１ｍｌずつ接種し、２８℃で４８時間振とう培養
を行った。培養液の５０倍希釈液の６００ｎｍでの吸光
度を測定した。その結果を第６表に示す。

【００１７】実施例６ 第１表に示す組成の培地を２００ｍｌ容三角フラスコに
２０ｍｌずつ分注し、１２１℃で１５分間加熱殺菌して
培地を調製した。第６表に示すようなα−ケトパントラ
クトンに耐性（ＫＰＬｒ）あるいはＤ−パントラクトン
に耐性（ＤＰＬｒ）となった株を斜面培地から１白金耳
ずつ前記培地に接種し、２８℃で２４時間振とう培養を
行い、遠心分離後、１０ｍｌの水で１回洗菌して洗浄菌
体を得た。この洗浄菌体およびグルコース４％、α−ケ
トパントラクトン６％、塩化カルシウム０．５％を含む
２０ｍｌの反応液を２００ｍｌ容三角フラスコに入れ、
２８℃で２４時間振とうし、反応させた。反応後の液の
分析結果を第６表に示す。

【表４】

【表５】

【表６】

【００１８】実施例７ 第１表の組成からなる滅菌第一種培地２０ｍｌを含む２
００ｍｌ容三角フラスコに、チゴサッカロマイセス・シ
ドリＦＶ−１４３を斜面培地より１白金耳量接種し、２
８℃にて２４時間振とう培養した。この培養液２０ｍｌ
を種菌液とし、同じ組成の滅菌第二種培地２００ｍｌを
含む１リットル容三角フラスコに移植し、２８℃にて２
２時間振とう培養した。さらに、得られた培養液全量を
種菌液として第１表の組成の滅菌培地２．３リットルを
含む５リットル容ジャーファーメンターに移植し、２８
℃にて２４時間好気的に撹拌し、培養した。この培養液
から実施例２と同様の方法で洗浄菌体を得た。この洗浄
菌体およびグルコース１．６％、α−ケトパントラクト
ン２．７％、炭酸カルシウム０．６％，酵母エキス０．
３％を含む反応液２リットルを５リットル容ジャーファ
ーメンターに入れ、２８℃にて撹拌し、反応を行った。 反応開始直後よりグルコース２３％、α−ケトパントラ
クトン４０％の水溶液を３０時間にわたって連続的にフ
ィードした。反応５０時間後のパントラクトンの蓄積濃
度は１４０ｇ／リットル、うちＤ体の比率は９７．８％
であり、対α−ケトパントラクトンのモル収率は９２．
５％であった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　α−ケトパント酸塩および／またはα
   −ケトパントラクトンをチゴサッカロマイセス属に属す
   る微生物より選ばれた少なくとも一種の微生物により立
   体選択的に還元することを特徴とするＤ−パント酸塩お
   よび／またはＤ−パントラクトンの製造方法。
2. 【請求項２】　　α−ケトパント酸塩および／またはα
   −ケトパントラクトンあるいはＤ−パント酸塩および／
   またはＤ−パントラクトンに耐性を付与された微生物を
   用い、α−ケトパント酸塩および／またはα−ケトパン
   トラクトンを立体選択的に還元することを特徴とするＤ
   −パント酸塩および／またはＤ−パントラクトンの製造
   方法。