JPH07500254A - ヒト白血球１２−リポキシゲナーゼ経路の形成または活性の阻害 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト白血球１２−リポキシゲナーゼ経路の形成または活性の阻害本出願は１９９ ２年８月２８日に提出された米国出願第０７／９３６．６６０号の継続出願であ る。

発明の分野 本発明はヒト副腎、血管平滑筋、内皮細胞及び単核細胞における新規な形の１２ −リポキシゲナーゼ（１２−ＬＯ）　ＲＮＡおよびタンパク質に関している。本 発明はまたアンジオテンシン■（＾■）およびグルコースにより誘導される血管 及び腎の活性をこの１２−１刀経路の活性化により媒介（ｍｅｄ　ｉ　ａ　ｔ　 ｅ）することに関している。

従来の技術 アテローム硬化性心血管疾患及び腎疾患の昂進は糖尿病（ｄｉａｂｉｔｅｓｍｅ 　Ｉ　Ｉ　ｉ　ｔｕｓ）および高血圧症（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ　１ｏｎ）の患者 の罹患および死亡の主要な原因であり続けている。ＡＩＩ活性および上昇したグ ルコースが、これらの身体的不全状態へ向かう進行傾向において役割を果たすこ とが知られている。

出願人はＡＩＩがアラキドン酸の１２−リポキシゲナーゼ（１２−ＬＯ）経路の 活性を増加させ得ることを見いだした。１２−ＬＯ経路は１２−ヒドロペルオキ シエイコサテトラエン酸（１２−ＨＰＥＴＥ）および、より安定な１２　ヒドロ キシエイコサテトラエン酸（１２−ＨＥＴＥ）を含む活性産物を産生じ得る。さ らに、１２−ＬＯ酵素には、また、リノール酸を代謝してヒドロキシオクタデカ ジエン酸（ＨＯＤＥＳ）と呼ばれるさらなる活性脂質を産生じ得るものもある。

ＬＯ産物は血管及び腎疾患の進行に於て重要な役割を果たしている可能性がある 。

１２−ＲＥＴＥおよび１２−ＨＰＥＴＥは、腎臓からのレニンの放出の阻害（１ ）、ラット及びヒト副腎細胞からのアルドステロン合成の刺激（２，３）および ラットにおける血圧の上昇（４）に対する、ＡＩＩによって誘導される効果の重 要な媒介であることが示されてきた。さらに、１２−ＨＥＴＥおよび１２−ＨＰ ＥＴＥは１０”Ｍ程度の低濃度で血管平滑筋細胞遊走を引き起こすことが可能で （５）、そしてそれら両方の産物は血管保護エイコサノイドプロスタサイクリン の合成を阻害することが出来る（６゜７）。１３および９ＨＯＤＥを含むリノー ル酸代謝物は、近年、肝臓及び繊維芽細胞を含むある種の細胞タイプにおいて分 裂促進効果を起こすことができ（８，９）、上皮成長因子に誘導される増殖活性 を媒介し得ることが示されてきた。様々な種における最近の研究は、１２−ＬＯ には二つの形状が存在していることを示している（１０．１１）。一つのタイプ はブタの白血球からクローニングされたもので（１０）、ヒト気管１５−ＬＯ酵 素（１２）と配列上８５％の相同性を有していた。主にヒト血小板で見いだされ ているもう一つのタイプの１２−ＬＯは、１２−ＬＯのブタ白血球型のもの（１ １）と６５％の相同性しか示さない。１２−ＬＯのこれら二つの型はアミノ酸配 列上で異なるだけでなく、望ましい基質に於いても相違がある。１２−ＬＯの血 小板タイプのものは主にアラキドン酸と反応し、１２−ＨＥＴＥを形成する。し かしながら、１２−ＬＯのブタ白血球タイプのものは、アラキドン酸と反応して １２−ＨＥＴＥを形成するのと同様に、リノール酸と反応し、９および１３−Ｈ ＯＤＥを形成する。最近の研究では、１２−ＬＯ産物が＾■で誘導されるウシ副 腎細胞増殖を媒介し得ることもまた見いだされている。

本発明以前には、１２−ＬＯの白血球タイプのものもヒト組織で発現しているこ とは知られていなかった。

発明の概要 本発明は、ヒト副腎、単核、血管平滑筋および内皮細胞において発見された、新 規な形の１２−ＬＯＲＮ　Ａおよびタンパク質を含んでいる。この１２−ＬＯ経 路の活性化は、＾■およびグルコースによって誘導される血管及び腎の働きの媒 介において重要な役割を果たしている。この新たに発見された１２−ＬＯ経路の 産物はプロティンキナーゼＣを直接活性化することが可能で、アテローム硬化性 血管疾患の特徴である血管平滑筋細胞成長の増加を導く。

本発明は別の側面において、この新規の形の１２−ＬＯの阻害によって、糖尿病 または高血圧症の患者における血管疾患の治療または予防することを想定してい る。

本発明は従って、この新規に発見されたりポキシゲナーゼ経路を阻害する新規の 薬学的あるいは分子的方法の開発に対する理論的根拠を提供する。

図面の説明 図１は、通常のグルコース中で増殖したブタ平滑筋細胞（ＳＭＣ）から遊離され た１２−および１５−ＨＥＴＥに対する＾■の効果を示した棒グラフである。

図２は、通常（５，５ｍＭ）または高（２５ｍＭ）グルコース中で培養したブタ 血管平滑筋細胞（ＰＶＳＭＣ）における細胞に連結した１２−１１ＥＴＥレベル に対する＾■の影響を示した棒グラフである。

図３は、ブタ大動脈平滑筋細胞に於ける１２−および１５−１１ＥＴＥレベルに 対する高グルコース（２５ａｌｌ）の効果を示した棒グラフである。

図４は、通常（５，５ｍＭ）または高（２５＋ｓＭ）グルコース中（７）ＰＶＳ ＭＣ中（７）１２−ＬＯ７２Ｋ）発現に対する八Ｕ　（１０−’Ｍ）の効果を示 したウェスタンイムノプロットである。

図５は、ＰＶＳＭＣ中に於けるブタ白血球１２−ＬＯタンパク質の特異的発現を 示したウェスタンイムノプロットである。レーン１、抗原−ブタ１２−ＬＯ、レ ーン２および３、ｐｖｓｍｃ細胞質。Ａ　：　１２−ＬＯ抗体テｌ：５ＱＱノ割 合で反応、Ｂ：１２−ＬＯ抗原とともに予め保温した１２−ＬＯ抗体で反応。

図６は、逆転写Ｐ　ＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によるＰＶＳＭＣ中の１２−ＬＯｍＲ ＮＡレベルのサザンプロット解析である。結果は高グルコース中で培養した細胞 中で１２−ＬＯ発現が顕著に増大していることを示している。ＧＡＰＤＨ（マー カー遺伝子）の発現に対するグルコースの影響は全く見られなかった。

図７は、ＰＶＳＭＣにおけるＡｌｌによる１２−ＬＯｉＲＮ＾の制御を示すサザ ンプロット解析を表わしている。

図８は、通常または高グルコース中でのＰＶＳＭＣ培養物に於けるタンパク質合 成に対するＡｌｌの効果を示した棒グラフである。

図９は、１２−ＬＯ合成の阻害剤であるパイカレイン（ｂａｉｃａｌｅｉｎ）の 、ＰＶＳＭＣに於ける＾■誘導性ＤＮＡ及びタンパク賀合成に対する効果を示し た棒グラフである。

図１０は通常グルコース中で培養されたＰＶＳＭＣにおいて１２および１５−Ｌ ＯＲ物を直接添加した後のタンパク質合成を示した棒グラフである。

図１１は高グルコース中で培養されたＰＶＳＭＣにおいて１２および１５−ＬＯ 産物を添加した後のタンパク質合成を示した棒グラフである。

図１２は通常および高グルコース中でのＰＶＳＭＣの増殖曲線を示している。

図１３はヒト副腎糸球体細胞に於ける＾■による１２−ＬＯタンパク質発現の制 御を表わしている。

図１４はヒト副腎糸球体およびＵ９３７単核球細胞における１２−ＬＯＲＮ　Ａ の発現を示したサザンプロット解析である。

図１５はヒト副腎糸球体に於ける４、　ｌｋｂサイズの１２−ＬＯＲＮＡバンド の発現を示したノザンプロット解析である。

図１６はＲＴ−Ｐｃｔ？によって決定された、＾■にょる１２−ＬＯＲＮＡレベ ルの制御を表わしたサザンプロット解析である。

図１７はヒト大動脈血管平滑筋（ＨＶＳＭＣ）における＾■による１２−ＬＯタ ンパク質発現制御を示している。

図１８はヒト大動脈平滑筋および単核球細胞中での白血球型１２−ＬＯの存在を 示しており、また、ヒト血管平滑筋細胞（Ｈ３ＩＩＣ）における＾■による１２ −ＬＯ発現の誘導を示している。

図１９はヒト血管平滑筋細胞に於ける＾■による１２−ＬＯ産物１２−ＨＥＴＥ の遊離を示している。

図２０は通常グルコース（５，５＋ｍＭ）および高グルコース（２５ｍＭ）中で の平滑筋細胞の増殖に対する、１２−ＬＯ阻害剤であるパイ力レイン（１０−’ Ｍ）の効果を示している。細胞数は高グルコースの場合のみ、パイ力レインによ って顕著に減少している。

　高グルコース、パイ力レインなし マ　高グルコース、パイ力レインあり ０　通常グルコース、パイ力レインなし・　通常グルコース、バイカレインあり 図２１はヒト大動脈内皮細胞中でのヒト白血球型１２−ＬＯの存在を示している ＲＴ−ＰＣＲサザンプロット解析を表わしている。レーン１、ｃＤＮＡ陽性対照 実験。レーン２、ＤＮＡ分解酵素で処理した、発現した１２−ＬＯで、バンドは 夾雑ＤＮＡ由来ではないことを示している。レーン３、内皮細胞から得られた全 ＲＮＡで、３３３塩基対産物であることを示している。

図２２はヒト大動脈内皮細胞は１５−ＬＯＲＮＡを発現してはいないが白血球型 の１２−ＬＯＲＮ　Ａのみを発現していることを示しているＲＴ−ＰＣＲ，サザ ンプロット解析を表わしている。陽性対照実験での１５−ＬＯｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの 増幅およびヒト大動脈内皮細胞の独立した二つのサンプルに於ける完全な１５− ＬＯＲＮＡの欠如が示されている。

図２３は白血球１２−ＬＯあるいは１５−ＬＯＲＮＡいずれかの増幅および発現 に対するＰＣＲ法の特異性を示している。

発明の詳細な説明 １、ＬＯ産物形成のプロフィールと機構ＬＯ産物形成：通常グル：Ｉ−２（５， ５ｍ１１，１００ｍｇ／ｄｉ）中で培養されｔニーＰＶＳＭＣ１Ｂ胞テはＡｌｌ は１２−および１５−ＲＥＴＥ両方の培養液中への遊離を増加させる（図１）。

しかしながら、＾■は、通常グルコース中では細胞に付随する（ａｓｓｏｃｉａ ｔｅ）■ＥＴＥレベルは増加させなかった（図２）。対照的に、高グルコース（ ２５ｓＭ、　４５０■ｇ／ｄｉ）中で培養した細胞では、細胞に付随する１２− １１ＥＴＥ並びに１５−１１ＥＴＨのレベルが顕著に上昇した（図３）　（１２ −ＨＥＴＥ；１４１３±１７４　通常グルコース　対　２６００±１８１　高） および１５−ＭＥＴＥ：　（１５３０±１３４　通常　対　３３２２±２２５　 高　ｐｇ／１０”　細胞、両方とも　ｐ＜０．０１　高　対　通常グルコース） 。図２はまた、＾■は高グルコースで細胞に連結した１２−ＨＥＴＥ濃度をさら に増大させたことを示している。

これらの結果はＰＶＳＭＣにおいて＾■が１２−および１５−ＬＯ産物（ＭＥＴ Ｅ）の形成を刺激したことを示唆している。さらに、グルコースの上昇した培地 で培養したＰＶＳＭＣはより多くのＬＯ産物を産生じ、＾■にたいする強い１０ 反応を示す。

ＬＯタンパク質発現二図４はブタ白血球１２−ＬＯに対する抗体を用いたウェス タンイムノプロットで、４５時間目の１２−ＬＯ酵素（７２ＫＤ）発現に対する 高グルコース（２５麟Ｍ）と八ｎ　（１０−’ＩＩ）の影響を示している。１２ −ＬＯ酵素の基礎的な発現が高グルコース中で培養したＰＶＳＭＣにおいて顕著 に増大していることが明らかに観察される。さらに、＾■が通常および高グルコ ース中での１２−ＬＯ発現に顕著な刺激を与えていた。抗体阻害実験を用いたこ れらの結果の特異性もまた確認された。図５は真正なブタ白血球１２−ＬＯ酵素 で得られたバンド（レーン１）はＰＶＳＭＣ細胞質（レーン２および３）同様に （Ａ）　、１２−ＬＯ酵素と予め２時間保温された１２−ＬＯ抗体で処理した場 合、すべて消失することを示している（Ｂ）。

これらの結果はｐｖｓｉｔｃが白血球型の１２−ＬＯを発現し、ブタ１２−ＬＯ 酵素発現はＡＩＩおよび高グルコースによって増大することを示唆している。

ＬＯｍＲＮＡ発現二本発明はまた、＾■が高グルコース同様、１２−ＬＯｓ＋Ｒ ＮＡ発現を上昇制御し得ることの発見を含んでいる。この発見を立証するために 、ＰＶＳＭＣ。

ヒト副腎糸球体、ヒト血管平滑筋および単核球に於ける基礎的及び刺激時の１２ −および１５−ＬＯｍＲＮＡレベルを評価するための特異的な逆転写酵素重合連 鎖ＰＣＲ法が計画された。

プライマーとプローブの配列は既知の遺伝子配列（１０，１２，１３，１４）に 基づいて設計され、ブタ１２−ＬＯと１５−ＬＯ配列の間で最も保存されていな い領域（１１）から選択された。

ヒト１５−ＬＯ（参考文献１２）。全ての配列は５’　−３’　である。

配列番号１：　プライマー１＝５゛＾＾ＣＴＣ＾＾ＧＧＴＧＧ＾＾ＧＴＡＣＣＧ ＧＡＧ　３　’塩基　１４６から１６８ 配列番号２：　プライマー ２：５°ＡＴＡＴＡＧＴＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＡＴＡＴＴＣ３°塩基４５３ から４７７ニ相補的配列番号３：　プローブ＝　５°ＡＧＧＣＴＣＡＧＧＡＣＧ ＣＣＧＴＴＧＣＣＣ３’塩基３０６から３２６に相補的 ブタ白血球１２−ＬＯ（参考文献Ｎｏ、１０）。

配列番号４：　プ５イマ−１：５°ＴＴＣＡＧＴＧ丁ＡＧＡＣＧＴＧＴＣＧＧＡ Ｇ　３゜塩基１４５から１６５゜ 配列番号５：　プ５　イｖ　−２：　５　’　ＡＴＧＴＡＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴ ＧＧＣＴＡＴＡＴＴＴＡＧ　３　’塩基４５１から４７７に相補的。

配列番号６：　プローブ：　５’　ＴＣＡＧＧＡＴＧＣＧＧＴＣＧＣＣＣＴＣＣ ＡＣ３’塩基３０１から３２２に相補的。

ヒト副腎糸球体組織及び培養細胞の両方の全ＲＮＡはＲＮＡｚｏｌ　（Ｃｉｎｎ ａ／ＢｉｏｔｅｃｘＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、 Ｉｎｃ、　、Ｔｅｘａｓ）を用いたグアニジン　チオシアネート−フェノール− クロロホルムで抽出された。ポ１バ＾）’ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）セルロースク ロマトグラフィーカラム（５プライム→３プライム、Ｉｎｃ、、　１ｌｅｓｔ　 Ｃｈｅｓｔｅｒ　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ）によって精製された。ｌμｇの全 ＲＮＡまルはｍＲＮ＾はＰＣＲ／＜−／　７　ｙ　−（１０＋ｉＭ　Ｔｒｉｓ− ＨＣＩ、　ｐＨ８，３，５ｈｌｌ　ＫＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣ１１，０，００ １％[ラ チン）、４つのデオキシヌクレオチドトリフォスフ二−ト各２００ｇＭ、　５’ 　およヒ３゛　プライマー５°ＴＴＣＡＧＴＧＴＡＧＡＣＧＴＧＴＣＧＧＡＧ３ ’　（配列番号４）および５゛＾−ＴＧＴＡＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＧＣＴＡＴ ＡＴＴＴ＾６３°　（配列番号５）各２５ｐｖａｏｌｅ、　工ヴイアンミエロブ ラストシスウィルス（Ａｖｉａｎ　Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ　Ｖｉｒｕｓ ）逆転写酵素（２０Ｕ／μｌ、Ｌｉｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｓｔ、　Ｐｅｔｅ ｒｓｂｕｒｇ、　ＦＬ）　２ユニツトおよび２．５−Ｌ−１−ットのＴａｑポリ メラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）と、最終体積が５０ｕｌと なるように混合された。いくっがの反応には、β２ミクログロブリンあるいはＧ ＡＰＤＦＩの５°および３°プライマー各５　ｐｍｏｌｅが内部標準として添加 された。サンプルは逆転写酵素反応を行うために３７℃で８分間サーマルサイク ラ−中に放置された。続いてＰＣＨに用いられた条件は、９４℃１分の変性ステ ップ、５４℃２分のアニーリング、および７２℃２分の伸長を２５−３０サイク ルというものである。ＲＴおよびＰＣＨの各ステップを通じて、鋳型ＲＮＡなし 、あるいは逆転写酵素なし、のブランク反応が行われた。ＨＥＬ細胞あるいはＩ Ｍ−９細胞からのＲＮＡサンプルはＰＣＲおよびノザン解析の両方に於いて対照 実験として用いられた。ヒト１５−ＬＯｃＤＮＡ、ブタ白血球１２−ＬＯｃＤＮ Ａおよびヒト血小板１２−ＬＯｃＤＮ＾増幅（ま、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 、　ｐｌ’１８．３．５０ｍ１　ＫＣｌ、　１．５ｍＭ　ＩＩｇｃｌｔ、　０． ００１％ゼラチン、４つのデオキシヌクレオチドトリフオスフ二−ト各２００μ Ｍ、５°および３゛プライマー各２５ｐｍｏｌｅおよび２．５ＵのＴａｑポリメ ラーゼを含む５０μｍ体積中でｃＤＮＡを２２−５μ混合することによって行わ れた。

増幅された断片のサイズは１２−ＬＯおよび１５−ＬＯのいずれの場合も３３３ ｂｐである。

ブタ白血球１２−ＬＯｃＤＮＡまたはヒト１５−１ｏ　ｃＤＮＡを鋳型として得 られたＰＣＲ増幅された３３３ｂｐの断片゛は、２５サイクルの増幅の後に臭化 エチジウム染色されたゲル中に観察可能であった（データは示していない）。し かじな力（ら、ヒト細胞力１ら得られたＲＮＡサンプルを用いると、３３３ｂｐ の増幅された産物は３５サイクルの増幅の後でさえ臭化エチジウム染色されたゲ ル中に観察されなかった。産物３まブタ白血球１２−ＬＯオリゴヌクレオチドプ ローブを用いて）１イブリダイゼーシヨンしたプロットのオートラジオグラフィ ーでのみ検出可能であった。

ブタ白血球１２−ＬＯとヒト１５−ＬＯのアミノ酸配列は高度に保存されてしす るため、ブタ白血球１２−ＬＯｃＤＮＡプローブがブタ白血球１２−ＬＯあるい はヒ目５−Ｌｏｔこ相当する３３３ｂｐの増幅産物をすぐに区別することは不可 能であった（デー９１１示して６ｓｒｊ＋＋））。さらに、ヒト１５−ＬＯ，ｔ リボヌクレオチドおよびブタ白血球１２−ＬＯ第１ノゴヌクレオチドブローブは 、それぞれ増幅の鋳型として１２−ｔ、ｏあるＬ）１１１５−ＬＯｃＤＮＡを用 Ｌ）た１２−ＬＯあるいは１５−ＬＯ増幅産物に交差！！ブリダイズし得る。高 ストＩＪンジエント条件下、例えばハイブリダイズしたメンブレンを６０℃で洗 浄すると、ｃ　ＤＮＡプローブによってブタ１２−ＬＯとヒト１５−ＬＯの産物 は区別可能であった。

図２３はヒト１５−ＬＯのｃＤＮＡおよびブタ白血球１２−ＬＯのｃＤＮＡのＰ ＣＲのオートラジオグラムの比較を示している。ｃＤＮ＾サンプルは遺伝子に特 異的なプライマーを用いて２５サイクル増幅され（表１）、ラベルされたブタ白 血球１２−ＬＯ第１ノゴヌクレオチドプローブ（パネルＡ）またはラベルされた ヒト１５−ＬＯ第１ノゴヌクレオチドブローブ（パネルＢ）でハイブリダイズさ れた。レーン１（よ豚白血球１２−ＬＯのｃＤＮＡに対するブタ白血球１２−Ｌ Ｏプライマーである。レーン２はヒト１５−ＬＯのｃＤＮＡｌこ対するヒト１５ −ＬＯプライマーである。

ＰＣＲ産物の直接ＤＮＡシークエンシングＰＣＲ増幅：ＲＮＡは以下のように逆 転写された：反応混合物は最終体積９μｌ中ニ、フタ白血球１２−ＬＯ相補フラ イｖ　−５’　ＡＴＧＴＡＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＧＣＴＡＴＡＴＴＴＡＧ３’ （配列番号５）　、ｄＮＴＰおよび２μｇのＲＮＡを含んでいた。混合物は８０ ℃で５分間温められ、３７℃まで冷やされた。２ユニツトのＡＭＶ逆転写酵素が 添加され、３分間３７℃で保温された。それからさらに２ユニツトのＡＩＩＶ逆 転写酵素が添加され、サンプルは変性のため９５℃まで熱せられ、上述したよう にＰＣＲによって４０サイクルの増幅を受けた。ＰＣＲ産物はハイブリダイゼー ションによって解析された。シーフェンシングのための充分量のＰＣＲ産物を得 るため、ＰＣＲ反応の全産物のうち１μｌが、５′および３°プライマー、　［ １９３７細胞に対するプライマー（１４５〜１６５および４５１−４７７）　； ヒト副腎に対するプライマー（１７７−１９８および４２８−４５０）とともに 、２回目のＰＣＲ増幅の鋳型として用いられた。反応条件はサイクル数が３０で あったこと以外は上述の通りである。

シーフェンシングのためのＤＮＡの媒介＝２２回目ＰＣＲ産物は非変性８％ポリ アクリルアミドゲルの電気泳動によって精製された。単離されたＤＮＡ断片は直 接シーフェンシングに用いられた。

シークエンシング：シークエンシングには二つの方法が用いられた。

（Ａ）　［９３７細胞の精製されたＰＣＲ産物のシーフェンシング反応は０．５ ％　ＮＰ−４０界面活性剤および［γ８１−ｐ］＾ＴＰラベルされたブタ白血球 １２−１０オリゴヌクレオチド１４５−１６５．４５１−４７７、および３０１ −３２２の存在下で開始された。ＤＮＡシークエンシング反応はシークエネース （Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｃ１ｅｖｅｌａ ｎｄ、　０ｈｉｏ）を用いたグイデオキシヌクレオチド連鎖終止法で、５°プラ イマーおよび３゛プライマーを用いて両方の方向に向かって行われた。

（Ｂ）ヒト副腎糸球体組織およびＵ９３７細胞のＰＣＲ産物のシーフェンシング 反応はサイクルシークエンスキット（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、 　Ｎｏｒｖａｌｋ、ＣＴ）を用いた＾ｍｐｌｉＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼのサ イクルシーフェンシング法によって行われた。１５ｎｇのヒト副腎ＰＣＲ産物と ２ｐ■ｏｌｅの［γ！　！−ｐ］＾ＴＰラベルされたブタ白血球１２−ＬＯオリ ゴヌクレオチド（１７７−１９８または４２８−４５０）が用いられた。サイク ルプログラムは、９５℃１分、および６０℃１分で２０サイクルであった。

図２３で示したように、それらのｃＤＮＡの増幅によって白血球型１２−ＬＯお よびヒ）１５−ＬＯの特異的な発現の確認がなされた。

ブタ１２−ＬＯａ＋ＲＮ＾の制御： 本発明の別の側面は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いた、通常（５，５＋ｗＭ、　Ｎ のあるいは高（２５ｍＭ、ＲＧ）グルコース中で培養されたＰＶＳＭＣ中のブタ 白血球型１２−ＬＯｗ＋ＲＮ＾の制御である。図６はＰＶＳＭＣ全ＲＮＡからの ＲＴ−ＰＣＲ（２５サイクル）増幅された産物のサザンプロット解析である。ハ イブリダイゼーションはブタ白血球型の３２Ｐ−ラベルされた１２−ＬＯオリゴ ヌクレオチドプローブで行われた。高グルコース中で培養された細胞では通常グ ルコース中で培養されたものに比べて３３３ｂｐ　１２−ＬＯＰＣＲ増幅産物の 発現がずっと多いことが観察された。ＧＡＰＤＨｍＲＮ＾増幅が内部標準として 用いられた（２８０ｂｐ）。デンシトメーターによる解析により、高グルコース 中では２０倍近くの１２−ＬＯ発現が起きていることが明らかになった。さらに 、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、＾１１　（１０−’ＩＩ）による２４時間目での１２ −ＬＯｍＲＮ八発への制御を研究するための実験が行われた。図７は３３３ｂｐ の１２−ＬＯ＋ｉＲＮ＾発現が高グルコース中でずっと高いことを示している（ 通常グルコースでは基礎的発現がほとんどない）。さらに、ＡＩＩは通常および 高グルコース中の両方で３−４倍の顕著な発現の上昇を引き起こした。これらの 結果は１２−ＬＯｍＲＮＡの制御を初めて立証したものであり、グルコース及び ＾■が転写レベルで１２−ＬＯタンパク質の発現を制御してることを示唆してい る。転写産物のサイズ（４，０ｋｂ）はノザン解析によって確認されている（デ ータは供給されていない）。

■、肥大（取ｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）と過形成（Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）に対す る効果肥大に対する効果ニス８はＡｎ（１０−’ＩＩ）が通常グルコース中で培 養されたＰＶＳＭＣ中の全細胞タンパク質を増大させた（対照実験の１２６％） ことを示している。

類似した結果が１０−’Ｍおよび１０１Ｍの＾■で得られた。しかしながら、全 細胞タンパク質に対する＾■の効果は、グルコース濃度の高い条件下で培養され たＰＶＳＭＣにおいてさらに顕著であった（対照実験の１４７％）。これらの結 果はグルコース濃度の上昇が＾■の肥大応答を強めることを示唆している。

＾■の肥大応答は少なくとも部分的には１２−ＬＯ経路の活性化によって媒介さ れている。＾■によって誘導された肥大効果に於けるＬＯ経路の役割は、特異的 １２−ＬＯ阻害剤であるバイカレインによって通常グルコース中でのＡＩＩ誘導 タンパク質合成が断たれたことを示す図９によって説明される。同様の結果は高 グルコースにおいて得られた。さらに、図１０は１２−ＬＯ産物である１２−Ｍ ＥＴＥが、通常グルコース中でＡｎが行ったのと同じ効力でタンパク質合成を直 接増加する事が出来たことを示している。さらに、Ａｎの効果だけではなく　、 　１２−１’１ＥＴＨの効果もグルコース濃度の上昇によって強められた（図１ １）。１５−ＨＥＴＥは１２−ＭＥＴＥよりも効果が低（、グルコース濃度が上 昇している場合にのみ顕著な効果を示した（図１０および１１）図１２に示され ている。増殖速度は高グルコース中で培養した細胞で約３０％速かった。さらに 、図２０では特異的１２−ＬＯ阻害剤であるパイ力レイン（ｔｏ−’ＩＩ）が増 殖応答を停止させていることが観察され、増殖応答にはＬＯ産物形成が役割を果 たしている可能性が示唆された。

ＤＮＡ合成に対する＾■のみまたはＬＯ阻害条件での効果は、［”ｌｌＦチミジ ンの取り込みによって決定することにより測定された。＾■は通常グルコース中 で小さいながらも有意なりＮＡ合成の増加を引き起こした。１２−ＬＯ阻害剤で ある）くイカレインは＾■誘導性ＤＮＡ合成を阻害しく図９）　、１２−ＬＯ経 路の産物が部分的にＡｎ誘導性増殖効果を媒介している可能性が示唆された。＾ ■誘導性ＤＮＡ合成はまた、グルコース濃度の上昇（２５ｍＭ）によっても強め られた（通常グルコース、１４６±７％　対　高グルコース　１７４±８％　対 照実験、　ｐ＜０．０５）　（データは示していない）。

従って上昇したグルコースは基礎的な増殖を促進し、また＾■誘導性増殖応答を 促進する。さらに、１２−ＬＯ経路の阻止によって、グルコース及びＡＩＩの増 殖作用を減少させることが可能である。

ｍ、ｔｏ産物の作用機構 表１は通常及び高グルコース中で培養したＰＶＳＭＣにおけるプロティンキナー ゼＣ（ＰＫＣ）活性測定の結果を示している。

ＰＶＳＭＣ（通常あるいは高グルコース）におけるＰＫＣ活性に対する様々な試 薬の影響処理　通常グルコース　５．５ｍＭ　高グルコース　２５１１Ｍ細胞質 　膜　細胞質　膜 対照実験　１８５　６３．２　１２６　９４．５ＴＰ＾　（１０μＭ）　１０９ 　１８１　７２．４　２４２ＡＩＩ　（１０μＭ）　１５９　６５．１　９７． ３　７８＾ＩＩ＋９ＨＯＤＥ（１００ｎ）ｌ）　１４２　８９．８　１０９　１ ２１＾１１＋１３ＨＯＤＥ（１００ｎＭ）　１２７　１０２　１２０　１１？通 常グルコースと比較して、高グルコースでは膜活性が高い一方で細胞質活性が低 いことが観察され、高グルコースではＰＫＣ活性が上昇していることが示唆され ている。細胞は試薬で１５分間処理された。Ａｎ単独ではＴＰ＾と比較してＰＫ Ｃをほんのわずかしか活性化していない。しかしながら、１３−あるいは９−） １０ＤＥと組み合わせることにより、＾■は膜画分での活性を上昇させ、該当す る細胞質画分での活性を減少させた。イムノブロッティング実験によって、ＰＶ ＳＭＣはＰＫＣのαおよびεアイソフオームを発現しているがβあるいはγ型は 発現していないことが示されている。

これらの結果は、高グルコース中で培養された細胞ではＰＫＣ活性が上昇し、＾ ■がＬＯ産物との組み合わせによって、更に高いＰＫＣ活性を誘導することを示 している。従って、ある種のＰＫＣアイソフオームはグルコース＾■およびＬＯ 産物に応答した血管細胞増殖に関する重要な機構で有り得る。

■、ヒト副腎、単核球、血管平滑筋および内皮細胞における研究これまでに発表 された研究は、ラットおよびヒト副腎糸球体細胞における＾■誘導性アルドステ ロン合成は１２−ＬＯ経路の活性化によって媒介されていることを示している（ ２．　３）。本出願はヒト糸球体細胞中のある種の１２−ＬＯのアイソフオーム が”ブタ白血球型”であることの新たな証拠を提出している。図１３はウェスタ ンイムノブロッティングによって評価した正常ヒト副腎糸球体細胞中の１２−Ｌ Ｏタンパク質の発現に対する＾ＩＩ　（１０−’Ｍ）の効果を示している。デン シトメトリーによる解析によるとＡ１１は１２−ＬＯの発現（図１３Ａ）を基礎 発現量の約２倍に増加させていた（図１３Ｂ）。従つて、ブタ白血球１２−ＬＯ に対する抗体で観察されたように、培養されたヒト糸球体細胞に於いて１２−Ｌ Ｏタンパク質は存在している。

さらに、１２−ＬＯタンパク質の発現は３０時間にわたって＾■の存在下で培養 した細胞において増加している。　Ａ＝はデータのイムノプロットを示し、一方 Ｂ：はＡのデータのデンシトメーターによる解析を示している。

図１４では、ヒト糸球体細胞及び単核球白血球型細胞（０９３７細胞）における この形の１２−ＬＯに対するＲＮＡの同定が、この形の１２−ＬＯ特異的な上述 したＰＣＲ分析法によって可能であることが観察される。ＲＮＡサンプルは配列 番号４および５ブタ０血球１２−ＬＯプライマーを用いて３０サイクルで増幅さ れる。メンブレンは内部のブタ白血球１２−ＬＯオリゴヌクレオチドプローブ（ 配列番号６）でハイブリダイズされる。パネルＡル−ン１はＲＴ−ＰＣＲを用い た正常ヒト副腎糸球体から得られた全ＲＮＡを示している。レーン２は鋳型なし のネガティブ対照実験で、レーン３はヒト１５−ＬＯｃＤＮＡを用いたネガティ ブ対照実験である。パネルＢのサンプルは、ヒト糸球体細胞から得られたｍＲＮ Ａあるいは全ＲＮＡである。レーン１および５はそれぞれｍＲＮＡおよび全ＲＮ Ａに対して逆転写酵素を用いなかったネガティブ対照実験である。レーン２はｍ ＲＮＡの、レーン６は全ＲＮＡの本当のＲＴ−ＰＣＲである。レーン３はブタ白 血球１２−ＬＯｃＤＮＡを用いたポジティブ対照実験である。レーン４は鋳型Ｒ Ｎ＾を用いなかったその他のネガティブ対照実験である。

図１５は１２−ＬＯプローブ（配列番号６）を用いたノザン解析である。レーン １および２はヒト副腎糸球体からの２０μｇｏ）ＲＮＡで、発現しているＲＮＡ のサイズ（約４．　１ｋｂ）がブタ白血球１２−ＬＯＲＮＡサイズと類似してい ることを示している。

図１６はＲＴ−ＰＣＨによって決定された＾■による１２−ＬＯｉＲＮ＾レベル の制御を示している。全ＲＮＡは、単独でまたは１０−’Ｍ　＾■の存在下で２ ４時間保温した培養副腎糸球体細胞から抽出された。ＲＮＡサンプルはブタ１２ −ＬＯを増幅するプライマーとともに２５サイクル増幅された。実験の全ての反 応はまた、ヒトＧＡＰＤＨを増幅するプライマーも含んでいた。ＲＮＡなし、あ るいは予めＲＮＡ分解酵素で処理したＲＮＡを含んだ対照実験も同時に行われた 。特異的な産物の位置は矢印で示されている。２８４ｂｐおよび３３３ｂｐはそ れぞれヒトＧＡＰＤ）Ｉおよびブタ白血球１２−ＬＯの増幅産物を表わしている 。パネルＡはブタ１２−ＬＯ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブでハ イブリダイズされたプロットのオートラジオグラムである。パネルＢは同じプロ ットをＧＡＰＤＩ（に対するオリゴヌクレオチドプローブで続いてハイブリダイ ズしたもののオートラジオグラムである。レーン１および４は対照実験で保温し た糸球体細胞である。レーン２および５は１０−７Ｍ　＾■と保温した糸球体細 胞である。レーン４および５のサンプルはＲＴ−ＰＣＨに先だってＲＮａｓｅ　 Ａで処理された。レーン３はＲＮＡを含んでいない。これらの結果は１２−ＬＯ 遺伝子がヒト糸球体および単核球中に存在し、ＲＮＡが＾■によって正に制御を 受けていることを示している。

ヒト単核球および副腎細胞中の増幅されたＰＣＲ産物がブタ１２−ＬＯｃＤＮＡ の夾雑によるものではないことを確かめるために、増幅された産物は配列決定さ れた。

表２に示されたように、ヒト細胞に配列はブタの配列と２塩基異なっている。

発表されているブタ白血球ｃＤＮＡ配列（１４）の位置１９９および４３７の間 の領域におけるブタ白血球１２−ＬＯ（ｐ１２−ＬＯ）　ｃＤＮＡとヒト副腎１ ２−ＬＯ（ＩＩ＾１２−ＬＯ）　ｃＤＮＡの核酸配列の比較。二つの核酸の相違 は位置２５５　（Ｔ／Ｃ）および位置２６７（Ｃ／Ｔ）である。

さらに、ヒト白面球核から増幅されたゲノム由来のＤＮＡは増幅された部分の遺 伝子サイズ（１［ｂ）がブタ遺伝子における同じ領域から期待されるサイズより も実質的に多きことを示している。

図１７はヒト大動脈平滑筋細胞において＾■が１２−ＬＯタンパク賀の発現を増 加させ得るというタンパク質発現に関して先に概説したのと同じ方法を示してい る。

発現の増加はコンピューターと連結したビデオデンシトメーターシステムを用い た計測したところによると７倍であった。図１８は類似したＲＴ−ＰＣＲ法を用 いたヒト血管平滑筋細胞中の１２−ＬＯＲＮＡの発現を示している。レーン５は ヒト血管平滑筋細胞中の期待される３３３塩基対の１２−ＬＯバンドを示してお り、レーン３は単核球細胞から得られたサンプル中の同じＲＮＡバンドを示して いる。刺激されない平滑筋細胞における１２−ＬＯの基礎発現はこの実験の検出 限界以下である（レーン７）。しかしながら、＾■によって刺激された平滑筋細 胞は顕著な１２−ＬＯ発現の増加を示す（レーン５）。パネルＢはＲＴ−ＰＣＲ 実験の臭化エチジウム染色を表わしており、これらの実験に対する内部マーカー ＲＮＡ　（Ｂ２　ミクログロブリン）を示している（レーン２．　４．　６）。

図１９は、１２−ＦＩＥＴＥの合成とヒト大動脈平滑筋細胞からの遊離に対する 、１０→および１０１輩のＡｎの刺激効果を示している。１２−ＨＥＴＥは）Ｉ ＰＬＣ及び特異的な放射性免疫分析法によって分析された。

これらの研究は、既にヒト血小板で見いだされているものとは異なった１２−Ｌ Ｏをコードする新しい遺伝子が、いくつかのヒトの組織中に見いだされたことを 確証している。これらの研究はこの１．２−ＬＯ遺伝子およびタンパク質がヒト 副腎、単核球、および大動脈平滑筋細胞中に存在しており、＾■がこれらの組織 のうちのいくつかにおいて１２−ＬＯのタンパク質とＲＮＡの両方の発現を著し く上昇制御していることを示唆している（図１３．１６．１７および１８）。

ヒト大動脈内皮細胞からのＲＮＡおよび上述したＲＴ−ＰＣＲ法を用いたさらな る研究において、白血球１２−ＬＯはこれらの細胞内で発現していることが見い だされた。

図２１はＲＴ−ＰＣＲサザンプロット解析で、ヒト大動脈内皮細胞においてヒト 白血球型１２−ＬＯが存在していることを示している。レーン１、ｃＤＮＡ陽性 対照実験。

レーン２、ＤＮＡ分解酵素によって処理された内皮細胞からの全ＲＮＡで、パン ３３３塩基対産物であることを示している。これらの結果は１２−ＬＯはこの鍵 となる血管壁で発現されていることを示唆している。図２２はヒト大動脈内皮細 胞において１５−ＬＯが発現していることと対立する証拠を示している。１５− ＬＯ特異的プライマーおよびプローブ（それぞれ配列番号１−３）を用いること によって、鋳型として用いられた１５−ＬＯｃＤＮＡの特異的な増幅が観察され た。しかしながら、２回の独立した実験において、内皮細胞から得られたＲＮＡ を用いると１５−ＬＯＲＮＡのバンドは観察されない。従って、ヒト大動脈内皮 細胞においては白血球型の１２−ＬＯのみが発現されている。

ヒト組織における新しい型の１２−ＬＯ遺伝子の存在が記述されてきた。この１ ２−ＬＯ遺伝子は、アンジオテンシン■およびグルコース誘導性血管作用及びお そらく装作用を媒介する活性産物を形成するタンパク質をコードしていると考え られる。

肥大および糖尿病の血管及び腎疾患の防止のための、この１２−ＬＯ経路の活性 あるいは形成を阻止するような薬剤はまだ開発されていない。いくつかの化合物 が１２−ＬＯ活性を阻害するものとしてインビトロでの使用が可能である。しか しながら、臨床用に用いられるものは開発されていない。

＾■および上昇したグルコースがそれぞれ進行した血管及び腎疾患に関わる因子 であることを示唆する証拠が増加してきている。さらに、糖尿病の患者において アテローム硬化性心血管疾患及び腎疾患が昂進している機構は未知のままである 。ここに記述された本発明はこれらの不全状態に重要な経路を減少させるか阻害 するために計画された明らかに最初の療法である。

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１１、Ｆｕｎｋ、Ｃ，Ｄ、、ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａａｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ。

旦１：５６３Ｂ−５６４２（１９９０）。

１２、　Ｓｉｇａｌ、　Ｅ、、　ａｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　 ｈ　ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ。

Ｍフ：４５１−４６４　（１９８８）。

１３、　Ｎａｔａｒａｊａｎ　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ 　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ１９９２゜ １４、　工ｚｕｍｉ、Ｔ、、ａｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ東７：７４７７−７４８１　（１９９０）。

１５、　Ｔｓｏ、　Ｊ、Ｙ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ貝：２４８５−２５０２　（１９８５）。

配列表 （２）配列番号＝１ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：２３塩基 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本部 （Ｄ）トポロジー二未知 （ｖｉｉ）直接の起源二合成産物 （ｘ　ｉ）配列二　配列番号＝１ ＭＣＴＣＡＡＧＧＴ　ＧＧＭＧＴＡＣＣＧ　ＧＡＧ　２３（２）配列番号＝２ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：２５塩基 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本部 （Ｄ）トポロジー二未知 （ｖｉｉ）直接の起源：合成産物 （ｘ　ｉ）配列：　配列番号＝２ ＡＴＡＴＡＧＴＴＴＧ　ＧＣＣＣＣＡＧＣＣＡ　ＴＡＴＴＣ２５（２）配列番号 ：３ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：２１塩基 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本部 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｖｉｉ）直接の起源二合成産物 （ｘｉ）配列：　配列番号：３ ＡＧＧＣＴＣＡＧＧＡ　ＣＧＣＣＧＴＴＧＣＣＣ２１（２）配列番号：４ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ＝２１塩基 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）＊の数ニ一本部 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｖｉｉ）直接の起源二合成産物 （ｘｉ）配列：　配列番号：４ ＴＴＣＡＧＴＧＴＡＧ　ＡＣＧＴＧＴＣＧＧＡ　Ｇ　２１（２）配列番号：５ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：２７塩基 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本部 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｖｉｉ）直接の起源二合成産物 （ｘ　ｉ）配列：　配列番号：５ ＡＴＧＴＡＴＧＣＣＧ　ＧＴＧＣＴＧＧＣＴＡ　ＴＡＴｒＴＡＧ　２７（２）配 列番号＝６ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：２２塩基 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本部 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｖｉｉ）直接の起源二合成産物 （ｘ　ｉ）配列：　配列番号：５ ＴＣＡＧＧＡＴＧＣＧ　ＧＴＣＧＣＣＣＴＣＣＡＣ２２（２）配列番号ニア （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ＝２３９塩基 （Ｂ）配列の型二核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本部 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｖ　ｉ　ｉ）直接の起源：合成産物 （ｘ　ｉ）配列：　配列番号ニア （２）配列番号：８ （ｉ）配列の特性 （Ａ）配列の長さ：２３９塩基 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）　Ｉｌｌの数ニ一本部 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｖｉｉ）直接の起源：合成産物 （ｘ　ｉ）配列：　配列番号：８ ＦＩＧ、Ｉ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、　５Ａ　ＦＩＧ、　５Ｂ ＦＩＧ、　６Ａ ・　・　−３３３ｂｐ ＦＩＧ、　６Ｂ　−２８０ｂｐ 喝−一一一し ＦＩＧ、　８ 全細胞タンパク質 （コントロール％） ＦＩＧ、　ＩＱ ＦＩＧ、ＩＩ ＦＩＧ、　１３ＡＦＩＧ、　１３８ ＦＩＧ、　１４ＡＦＩＧ、　１４８ ＦＩＧ、１５ ｂ １８８−　−２．４ −１．４ ＦＩＧ、　１６Ａ　ＦＩＧ、　１６８ ＦＩＧ、　１７ ＦＩＧ、　１８Ａ　ＦＩＧ、　１８Ｂ ■コントローｊｔＱＡＩｌ　１０−８　口Ａｌｌ　ｔｏ−９ＦＩＧ、　１９ 時　間　（時間） ＦＩＧ、　２０ １２置０　１２１０ ＦＩＧ、２１ ＦＩＧ、　２２ フロントページの続き （７２）発明者　グ、ジアリ アメリカ合衆国カリフォルニア用９１０１０゜デュアーテ、シンコ・ロブレス　 １９１０

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト血管平滑筋細胞またはヒト副腎細胞または単核球細胞または内皮細胞で 発現された、単離され精製された１２−ＬＯであって、ヒト血小板で見いだされ ているものおよびヒト１５−ＬＯとは異なる、単離及び精製された１２−ＬＯ。
2. ２．アンジオテンシンＩＩ及びグルコース誘導性血管及び腎作用を媒介する（ｍ ｅｄｉａｔｅ）ために請求項１で定義されたヒト１２−ＬＯの発現を阻害するこ とを含む、ヒト血管障害を治療するための方法。
3. ３．治療が例えばバイカレイン等の１２−ＬＯ阻害剤の投与を伴う、請求項２に 記載の方法。
4. ４．ヒト血管平滑筋細胞またはヒト副腎細胞または単核球細胞または内皮細胞か ら得られた単離され精製されたヒト１２−ＬＯＲＮＡであって、該単離及び精製 された１２−ＬＯは、ヒト血小板で見いだされているものとは異なる、ヒト１２ −ＬＯＲＮＡ。
5. ５．ヒト白血球１２−ＬＯ。
6. ６．本質的に配列番号１、２、３、４、５、６、７、あるいは８からなる単離精 製され、あるいは実質的に精製された核酸配列。
7. ７．細胞をアンジオテンシンＩＩ濃度が制御された培養液中でインビトロで培養 することによって、請求項１で定義されたヒト１２−ＬＯのタンパク質及びＲＮ Ａ発現を制御することを含む方法。
8. ８．アンジオテンシンＩＩの濃度を、１２−ＬＯタンパク質及びＲＮＡ野発現を 上昇制御するように増加させるか、または、１２−ＬＯタンパク質及びＲＮＡの 発現を負に制御するように減少させる、請求項７に記載の方法。
9. ９．ヒト血管平滑筋あるいは腎あるいは内皮あるいは単核球細胞によって発現さ れている１２−ＬＯの発現の活性を制御することによって、アンジオテンシンＩ Ｉおよびグルコース誘導性血管及び腎作用を媒介する方法。
10. １０．活性化が、細胞を浸している周囲のグルコース濃度のレベルを調節するこ とによって制御される、請求項９に記載の方法。