JPH07238095A - ポリペプチドおよびその製造方法並びに診断判定方法および判定用生産物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ひとリンパ球抗原複合体のＤＲβ−鎖部位を
暗号化するＤＮＡ配列に関し、診断判定方法および生産
物にこれらＤＮＡ配列を使用するものであって、広範囲
の病気に対する個体の感受性および組織もしくは器官移
植物の供与体もしくは受容体としての個体の特性を決定
する際に有用な方法および生産物を得る。 【構成】 ひとリンパ球抗原複合体のＤＲβ−鎖、すな
わちＤＲ部位の主要な多形質領域を暗号化するＤＮＡ配
列に関連するポリペプチド、およびその製造収集方法並
びにこれらポリペプチドに対して生じた抗体を使用する
改良方法および改良物である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ひとリンパ球抗原複合
体のＤＲβ−鎖部位を暗号化するＤＮＡ配列に関するも
のである。さらに詳細には、本発明は、診断判定方法お
よび生産物にこれらＤＮＡ配列を使用することに関する
ものである。この種の方法および生産物は、広範囲の病
気に対する個体の感受性および組織もしくは器官移植物
の供与体もしくは受容体としての個体の特性を決定する
際に有用である。本発明のＤＮＡ配列は、さらにそれら
により暗号化されるポリペプチドの発現においても有用
である。

【０００２】

【従来の技術】ひとリンパ球抗原（「ＨＬＡ」）系は、
ひとにおける主要な組織適合性複合体である。したがつ
て、これは個体間の組織および器官移植物に対する最も
強いバリヤを構成し、明らかに自己と非自己とを区別す
る。さらに、ＨＬＡ因子は、広範囲の病気に対する感受
性の増大に関連することが示されている。したがつて、
ＨＬＡ系の抗原は、広範囲の病気に対する個人の感受性
を決定するための診断判定方法および生産物に使用さ
れ、かつ組織もしくは器官移植物の供与体もしくは受容
体としてのその特性を決定するのに使用される［エフ・
エツチ・バツハおよびジエー・ジエー・バンルード、
Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第２９５巻、第８０６〜
８１３頁（１９７６）］。

【０００３】遺伝学的観点から、ＨＬＡ系はかなり良く
特性化されている。たとえば、エル・ピー・ライダー等
「ＨＬＡ病関連の遺伝学」、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅ
ｔ．、第１５巻、第１６９〜１８７頁（１９８１）；ジ
エー・エル・ストローミンガー等、「免疫学における主
要な組織適合性複合体の役割」、エル・ドルフ編集、ガ
ーランド ＳＰＴＭ プレス社、第１１５〜１７２頁
（１９８１）；テイー・ササズキ等、「主要な組織適合
性複合体における遺伝子と病気感受性との間の関係」、
Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．、第２８巻、第４２５〜４５
２頁（１９７７）を参照することができる。これは、染
色体６の短腕における約２センチモルガン（ｃＭ）の間
隔内に位置する多かれ少なかれ高度に多形質の一連の部
位からなつている。この系における３つの部位（ＨＬＡ
−Ａ，ＢおよびＣ）は、相互優性的に発現されるアロ抗
原の１種を暗号化する（種類１）。他の部位（ＨＬＡ−
Ｄ／ＤＲ）は、高度に識別された多形性を有する相互優
性アロ抗原の第２の種類を暗号化する（種類２）。初期
成分の幾つかを制御する補完成分の他の３つの部位（Ｃ
２，Ｃ４およびＢｆ因子）も、ＨＬＡ系に属する（種類
３）。最後に、ＨＬＡ複合体におけるＩａと呼ばれる非
特異的領域が存在する。この領域ＩａはＤＲ部位に関係
すると思われるが、これとは異なるものである。

【０００４】ＨＬＡ系の生物学は、まだ充分に理解され
ていない。種類１の因子は、赤血球以外の全ゆる組織に
分布している。種類２の因子は、実質的にβ−リンパ球
および単核食細胞に限定され、かつ種類３の補完因子は
Ｃ３因子、すなわち補完系における重要成分の活性化に
直接関係する。ＨＬＡ−ＤＲ抗原は免疫学的現象、すな
わち免疫反応性、Ｔ−細胞抑制、Ｔ−細胞およびβ−細
胞の共働ならびにＴ−細胞と大食細胞の発現に関係する
ものと思われる［ビー・ベナセラフ、「免疫生物学にお
ける主要な組織適合性複合体の役割」、エム・イー・ド
ルフ編、ガーランド ＳＰＴＭ プレス社、第２５５〜
２６９頁（１９８１）］。

【０００５】ＨＬＡ−ＤＲ抗原は２種の非共有結合グリ
コシル化ペプチド鎖、すなわち分子量約３５０００の重
鎖すなわちα−鎖と分子量約２９０００の軽鎖すなわち
β−鎖とから構成され、これらは細胞膜を画成する［ス
トロミンガー等、上記；およびライダー等、上記］。細
胞内において、分子量約３２０００の第３のペプチド鎖
がα−鎖およびβ−鎖に関連する［デー・ジエー・シヤ
ロンおよびエツチ・オー・マツクデビツト、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．、第１５２巻、第１８ｓ〜３６ｓ頁（１９
８０）；ストロミンガー、上記］。軽鎖すなわちβ−鎖
はＨＬＡ−ＤＲ抗原の多形性を有する一方、α−鎖およ
び第３の鎖は種々異なる個体において同一であると思わ
れる［ジー・コルテ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７８巻、第５３４〜５３８頁
（１９８１）；シヤロンおよびマツクデビツト、上
記］。数種の血清学的に異なるＨＬＡ−ＤＲ抗原が固定
されており（ＨＬＡ−ＤＲ１乃至ＨＬＡ−ＤＲ８）、か
つモノクローン抗体は同型接合細胞系内におけるＤＲ抗
原の１部と定義されている［ヴイ・クワランタ等、ジヤ
ーナル・イミユノロジー、第１２５巻、第１４２１〜１
４２５頁（１９８０）；エス・カレル等、モレキユラ・
イミユノロジー、第１８巻、第４０３〜４１１頁（１９
８１）］。さらに、少なくとも２種のＤＲβ−鎖を、ペ
プチド分析により数種の同型接合細胞系において区別す
ることができる［アール・エス・アコラ等、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７８巻、第４
５４９〜４５５１頁（１９８１）］。

【０００６】さらに、ＨＬＡ−ＤＲに近縁であるが同一
でない多形質Ｉａ状の抗原を暗号化する種類の他の部位
も存在する［ジー・コルテ等、ネイチヤー誌、第２９２
巻、第３５７〜３６０頁（１９８１）；ナドラー等、ネ
イチヤー誌、第２９０巻、第５９１〜５９３頁（１９８
１）］。これらの明確なサブ領域はＤＣと呼ばれ［アー
ル・トシ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１４８巻、第１
５９２〜１６１１頁（１９７８）；デー・エー・シヤツ
ケルフオード等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，第７８巻、第４５６６〜４５７０頁（１９
８１）］、さらにＳＢと呼ばれる［エス・ジヨー等、
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１５６巻、第７３１〜７４３
頁（１９８２）］。ＤＣ抗原は、ＤＲ抗原との強い結合
不均衡にある。ＳＢ抗原は、二次的リンパ球反応を制御
しかつＤＲ部位に対し中心的な領域で暗号化される。

【０００７】現在、ＨＬＡ−ＤＲ抗原は、抗血清での沈
殿により血清学的に単離される。したがつて、ＨＬＡ−
ＤＲ決定子の正確な性質は未確定である。しかしなが
ら、これらの抗原は、組織もしくは器官移植物に対する
供与体および受容体の適合性を決定するための、或いは
広範囲の病気に対する個体の感受性を決定するための判
定方法および生産物に使用されている。たとえば、ライ
ダー等（上記）は、ＤＲ１乃至ＤＲ８判定に基づく次の
病気の感受性を報告している：

【０００８】

【表１】

【０００９】これらの判定から判かるように、Ｄ／ＤＲ
４につき陽性と判定された個体は、Ｄ／ＤＲ４につき陰
性と判定された個体よりも６．４倍高いインシユリン依
存性糖尿病を発生する危険がある。

【００１０】或る場合には、さらに病気関連性の抗原を
有する患者において、この抗原を持たない患者における
よりもその病気が重度であることも示されている。たと
えば、多発性硬化症の経過は、Ｄ／ＤＲ２陰性の患者に
おけるよりもＤ／ＤＲ２陽性の患者においてより急速で
ある。さらに、或る種の病気の再発は、病気関連性抗原
につき陽性の患者においてより一般的である。要する
に、ＨＬＡ−ＤＲ判定は、診断上および予測上の大きな
価値を有する。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この種
の判定方法および生産物の使用、ならびにこれらが許容
しうる移植供与体および受容体と病気感受性の個体とを
同定する際もたらす重要な利点は著しく制約されてい
る。何故なら、現在の判定方法は複雑かつ時間のかかる
ものであり、またこの種の判定方法および生産物に対す
る有用かつ経済的な原料を供給するために入手しうるＨ
ＬＡ−ＤＲ抗原が不充分であるからである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、ひとリンパ球
抗原複合体のＤＲ−β−鎖、すなわちＤＲ部位の主要な
多形質領域を暗号化するＤＮＡ配列に関連するポリペプ
チドおよびその製造方法並びにこれらポリペプチドに対
して生じた抗体を使用する改良方法および改良物を提供
することにより上記の問題を解決する。

【００１３】

【作用】本発明により、ＨＬＡ−ＤＲ軽鎖すなわちβ−
鎖を暗号化するＤＮＡ配列がＨＬＡ−ＤＲ判定方法およ
び生産物に使用するため初めて入手しうるようになっ
た。本発明のＤＮＡ配列は経済的かつ多量に生産されう
るだけでなく、判定方法および生産物におけるその使用
は前記ＨＬＡ−ＤＲ抗原に基づく判定方法および生産物
を相当に単純化させかつそのコストを低減させる。たと
えば、本発明のＤＮＡ判定方法は簡単であり、１０〜２
０ｍｌ程度に少ない血液で行うことができ、かつ数千回
の判定まで容易に規模拡大することができる。

【００１４】最後に、本発明のＤＮＡ配列は、適当な宿
主におけるこれら配列の発現ならびにそれらにより暗号
化される特異的ＤＲβ−鎖抗原の生産を他のＨＬＡ−Ｄ
Ｒ因子により汚染されることなく可能にし、これらを診
断剤、予防剤または治療剤として使用することを可能に
する。

【００１５】

【実施例】本発明を一層充分に理解しうるよう、以下詳
細に説明する。本発明において次の用語を使用する。

【００１６】ヌクレオチド：糖成分（ペントース）と燐
酸と含窒素複素環式塩基とよりなるＤＮＡもしくはＲＮ
Ａのモノマ単位。この塩基はグリコシド炭素（ペントー
スの１´炭素）を介して糖成分に結合され、塩基と糖と
のこの結合をヌクレオチドと呼ぶ。塩基はヌクレオチド
を特性化する。４種のＤＮＡ塩基はアデニン
（「Ａ」），グアニン（「Ｇ」），シトシン（「Ｃ」）
およびチミン（「Ｔ」）である。４種のＲＮＡ塩基は
Ａ，Ｇ，Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）である。

【００１７】ＤＮＡ配列：隣接するペントースの３´炭
素と５´炭素との間のホスホジエステル結合により互い
に結合されたヌクレオチドの線状列。

【００１８】コドン：ｍＲＮＡを介してアミノ酸、翻訳
開始信号または翻訳停止信号を暗号化する３個のヌクレ
オチド（トリプレツト）のＤＮＡ配列。たとえば、ヌク
レオチドトリプレツトＴＴＡ，ＴＴＧ，ＣＴＴ，ＣＴ
Ｃ，ＣＴＡおよびＣＴＧはアミノ酸ロイシン（「Ｌｅ
ｕ」）を暗号化し、ＴＡＧ，ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳
停止信号であり、かつＡＴＧは翻訳開始信号である。

【００１９】読枠：ｍＲＮＡをアミノ酸配列に翻訳する
際のコドンのグループ。翻訳する際、適切な読枠を維持
しなければならない。たとえば、配列ＧＣＴＧＧＴＴＧ
ＴＡＡＧは３つの読枠もしくは相に翻訳することがで
き、そのおのおのは次の異なるアミノ酸配列を与える：

【００２０】

【化１】

【００２１】ポリペプチド：隣接するアミノ酸のαアミ
ノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合により互いに
結合されたアミノ酸の線状列。

【００２２】ゲノム：細胞もしくはウイルスの全ＤＮ
Ａ。これは特に細胞もしくはウイルスのポリペプチドを
暗号化する遺伝子、ならびにそのオペレータ、プロモー
タおよびたとえばシヤイン−ダルガルノ配列のような配
列を含むリボソーム結合および相互作用配列を包含す
る。

【００２３】遺伝子：雛型もしくはメツセンジャＲＮＡ
（「ｍＲＮＡ」）を介して特異的ポリペプチドに特性的
なアミノ酸の配列を暗号化するＤＮＡ配列。

【００２４】転写：遺伝子もしくはＤＮＡ配列からｍＲ
ＮＡを生成する過程。

【００２５】翻訳：ｍＲＮＡからポリペプチドを生成す
る過程。

【００２６】発現：ポリペプチドを生成するためＤＮＡ
配列もしくは遺伝子により行なわれる過程。これは転写
と翻訳との組合せである。

【００２７】プラスミド：完全「レプリコン」からなる
非染色体二重鎖ＤＮＡ配列であつて、このプラスミドは
宿主細胞において複製される。プラスミドを単細胞生物
内に挿入すると、この生物の特性をプラスミドのＤＮＡ
の結果として変化もしくは形質転換させることができ
る。たとえば、テトラサイクリン耐性（Ｔｅｔ^R ）に対
する遺伝子を有するプラスミドは、予めテトラサイクリ
ンに対し感受性の細胞をこれに耐性である細胞に形質転
換させる。プラスミドにより形質転換された細胞を「形
質転換体」と呼ぶ。

【００２８】フアージもしくはバクテリオフアージ：細
菌性ウイルスであつて、その多くは蛋白質エンベロプも
しくはコートにカプセル化されたＤＮＡ配列よりなつて
いる（「カプシド蛋白質」）。

【００２９】クローン化ベヒクル：プラスミド、フアー
ジＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列であつて、これは宿
主細胞中に複製することができ、被覆蛋白質の複製およ
び生産のようなＤＮＡの本質的生物機能の喪失を伴なう
ことなくまたはプロモータもしくは結合部位の喪失を伴
なうことなくＤＮＡ配列を決定可能に切断しうる１個も
しくは少数のエンドヌクレアーゼ識別部位により特性化
され、かつ形質変換細胞の同定に使用するのに適した標
識、たとえばテトラサイクリン耐性もしくはアンピシリ
ン耐性を有する。クローン化ベヒクルはしばしばベクタ
ーと呼ばれる。クローン化 ：生物の集落またはこの種の生物もしくは配
列から無性増殖により生成されるＤＮＡ配列を得るため
の過程。

【００３０】組換ＤＮＡ分子もしくはヒブリドＤＮＡ：
異なるゲノムからのＤＮＡの断片よりなる分子であつ
て、前記ゲノムは生細胞の外部で末端結合されておりか
つ幾つかの宿主細胞に感染してそこに維持される能力を
有する。

【００３１】発現制御配列：ＤＮＡ配列もしくは遺伝子
の発現を、これら配列もしくは遺伝子に作用結合された
際、制御および調整するヌクレオチドの配列。これらは
ｌａｃ系，ｔｒｐ系、フアージλの主オペレータおよび
プロモータ領域、ｆｄコート蛋白質の制御領域ならびに
原始核もしくは成熟核細胞またはそのウイルスの遺伝子
の発現を制御することが知られたその他の配列を包含す
る。

【００３２】図１は、染色体６ならびにこの染色体の短
腕におけるＨＬＡ部位の位置の略図である。ＨＬＡ系の
複雑性に鑑み、種々のＩａ状抗原と種々のＨＬＡ−ＤＲ
抗原自身とを区別しうるｍＲＮＡ翻訳分析を開発するこ
とが重要であつた。

【００３３】例えば、うさぎ網状赤血球溶解物系のよう
な無細胞翻訳系は重合蛋白質を構成しない。他方、有爪
蛙ゼノプス・レビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）
の卵細胞が各種蛋白質に対する翻訳系として使用されて
いる。したがつて、この系を選択して、ＤＲ抗原を暗号
化するｍＲＮＡにつき分析した。この系を使用して、Ｈ
ＬＡ−ＤＲ抗原の３つのポリペプチド鎖が卵細胞で組立
てられかつこれらから抗−ＤＲモノクローン抗体により
免疫沈殿させうることを示した。したがつて、この卵細
胞系は、ｍＲＮＡ暗号化ＤＲ抗原を選択する方法を与え
る。

【００３４】上記分析で同定されたｍＲＮＡ暗号化ＤＲ
抗原の豊富なフラクシヨンを使用して、ｍＲＮＡからｃ
ＤＮＡを調製し、これをクローン化させかつ選択し、そ
して本発明のＤＲβ−鎖抗原を暗号化するＤＮＡ配列を
含むクローンを単離した。次いで、これらＤＮＡ配列を
本発明の方法および生産物に使用して、組織および器官
移植物に対する適合性を決定すると共に各種の病気に対
する個体の感受性増大を決定した。さらに、これらＤＮ
Ａ配列を適当な宿主に使用して、それらの暗号化する抗
原を他のＨＬＡ−ＤＲ因子により実質的に汚染されるこ
となく生成させるのに有用であり、病気の診断、治療お
よび予防に使用することができる。

【００３５】ポリＡ⁺ ＲＮＡを含有するＨＬＡ−ＤＲの
調製 １０％胎児牛血清とグルタミンとゲンタマイシンとを補
充したＲＰＭＩ１６４０培地において、ひとβリンパ芽
球細胞系、すなわちラジ細胞（２種のＤＲ遺伝子、ＤＲ
３およびＤＲ６を有する異型接合細胞系）を増殖させた
（これについてはエス・カレル等によりモレキユラ・イ
ミユノロジー、第１８巻、第４０３〜４１１頁（１９８
１）に実質的に記載されている）。細胞の生成物を追跡
するための標識を与えるため、５０×１０⁶ 個の細胞当
り１ｍＣｉのＳ³⁵−メチオニンを補充した完成メチオニ
ン非含有培地において、２×１０⁶ 個の細胞１ｍｌの濃
度にて３７℃で１６時間培養することにより細胞を代謝
標識した。分析用として非グリコシル化ＤＲ分子を得る
ため、Ｓ³⁵−メチオユンを添加する２時間前に２μｇ／
ｍｌのツニカマイシンを添加した。

【００３６】凍結細胞ペレツトを、氷冷した溶解緩衝液
（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１Ｍ
ＮａＣｌ、１％ノニデツトＰ４０）（１ｍｌ緩衝液／１
０⁸個細胞）において１分間隔で１５秒間４回乱流させ
ることにより溶解させ、そしてこの溶解した細胞をベツ
クマンＪ−６型遠心分離器（４５００×ｇ）にて遠心分
離した（４℃、４ｍｉｎ、４０００ｒｐｍ）。次いで、
４ｍｌの細胞質上澄液を次の濃度勾配にてＳＷ４１ポリ
アロマー管に加えた：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡにおける２ｍｌ ＣｓＣｌ
（５．７Ｍ）；２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）、２ｍＭ ＥＤＴＡにおける４０％〜２０％（Ｗ／
Ｖ）の直線濃度におけるＣｓＣｌ４．２ｍｌ；および２
０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ，４ｍＭ ＥＤＴＡにおける５％（Ｗ／Ｖ）蔗糖溶
液０．８ｍｌ。１４℃にて濃度勾配を均衡化させた後、
ＲＮＡをパレツト化させた（１４℃、１４時間、３７０
００ｒｐｍ）。大型ＲＮＡ調製物につき、ＳＷ２７チユ
ーブを１４℃にて２６０００ｒｐｍで１６時間使用し
た。

【００３７】チユーブからＲＮＡを回収するため、チユ
ーブを転倒させそして底部を切除した。次いで、ＲＮＡ
を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡに溶解させ、混合物を０．３Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ５．０）に調整しそしてＲＮＡを２容量のエタノ
ールで沈殿させた。再びＲＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％ＳＤＳ
に溶解させ、これを１００℃にて２分間加熱し、そして
混合物を室温まで冷却した。１容量の１０ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ Ｎａ
Ｃｌを加えた後、ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカ
ラム（コラポラテイブ・リサーチ社）に加え、そしてポ
リＡ⁺ ＲＮＡフラクシヨンをＨ₂ Ｏで溶出させそしてこ
れをＥＤＴＡの不存在下にエタノールで２回沈殿させた
（図２）。

【００３８】緩衝液系（２５ｍＭクエン酸ナトリウムに
おける６Ｍ尿素（ｐＨ３．８）を用いてポリＡ⁺ ＲＮＡ
をアルガロース−尿素ゲルにおいて寸法分画した（これ
についてはローゼン等により、バイオケミストリー（ワ
シントン）、第１４巻、第６９〜７８頁（１９７５）に
実質的に記載されている）（図２）。この緩衝液系は高
能力および高分解能の分画化によく適している。さら
に、これは充分に変性する［エツチ・レーラツハ等、バ
イオケミストリー、第１６巻、第４７４３〜４７５１頁
（１９７７）］。

【００３９】ポリＡ⁺ ＲＮＡの分画化を行なうため、５
００μｇのポリＡ⁺ ＲＮＡを１００μｌの１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５
％ＳＤＳに溶解させ、２００μｌのＤＭＳＯ（９９％）
を加え、そしてこの溶液を１ｍＭ ＥＤＴＡおよびｐＨ
８．０に調整した。次いで、この溶液を４５℃にて５分
間加熱し、４×０．５ｃｍのスロツトに加えた（２．５
％アガロースゲル）。このゲルをブロムフエノールブル
ーがゲルの底部に達するまで冷所中で３６時間電気泳動
にかけた。種々の寸法のフラクシヨン（７００×１６０
０ヌクレオチド長さ）を得るため、２ｍｍのスライスを
ゲルに沿って切断し、これらフラクシヨンを４ｍｌの１
０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、０．５％ＮａＣｌ，０．１ｍｇ／ｍｌイー・コリ
ｔＲＮＡにおいてウルトラ−ツラツクスで分散させた。
分散懸濁物を０．５％ＳＤＳまで調整した後、これを１
晩振とうし、次いでポリＡ⁺ ＲＮＡを上澄液からオリゴ
（ｄＴ）−セルロース小カラムにおけるクロマトグラフ
イーにより単離し、そしてこれをＥＤＴＡの不存在下に
エタノールで２回沈殿させた。調製ゲル電気泳動の前
に、資料中に３´末端標識されたラジｍＲＮＡを含ませ
ることにより回収を監視した。

【００４０】種々のポリＡ⁺ ＲＮＡフラクシヨンのＨＬ
Ａ−ＤＲ活性（もしあれば）を分析するため、このＲＮ
Ａを卵細胞中に移殖し、そして生成物を３種のモノクロ
ーン抗体Ｄ1 −12，Ｄ4 −22およびＢＴ2.2 ^＊で免疫沈
殿させた。この分析において、段階６の卵細胞をゼノプ
ス・レビスの卵巣から、ＣＡ⁺⁺を含有しないＯＲ２培地
における０．２％粗製コラゲナーゼ（シグマー社Ｃ−０
１３０）中で攪拌しながら室温にて９０〜１２０分間培
養した後単離した［ワラツク等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏ
ｌ．、第１８４巻、第３２１〜３３４頁（１９７
３）］。次いでこれら卵細胞に２０ｎｇのポリＡ⁺ ＲＮ
Ａの５０ｎｌを注入し（これについてはヴイ・エー・モ
ア、ジヤーナル・モレキユラー・バイオロジー、第６１
巻、第６３〜１０３頁（１９７１）に実質的に記載され
ている）、そしてこれを０．５ｍ Ｃｉ／ｍｌのＳ³⁵−
メチオニンと５０単位／ｍｌペニシリンとストレブトマ
イシンとを含有するＯＲ２培地において２４時間培養し
た。培養後、卵細胞をホモゲナイズした（これについて
はランジヤーおよびツアラーによりＰｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７５巻、第６０７３
〜６０７７頁（１９７８）に実質的に記載されてい
る）。ただし１ｍｌの緩衝液を５０個の卵細胞当りに使
用した^＊＊。

【００４１】^＊ これらのモノクローン抗体およびその
活性は既に報告されている［エス・カレル等、モレキユ
ラ・イミユノロジー、第１８巻、第４０３〜４１１頁
（１９８１）（Ｄ1 −12，Ｄ4 −22）；アール・エス・
アコラ等、ヨーロピアン・ジヤーナル・イミユノロジ
ー、第１２巻、第１６６〜１６９頁（１９８２）（ＢＴ
2.2）］。^＊＊ 分析用として非グリコシル化生成物を調製するた
め、卵細胞を５０μｇ／ｍｌのツニカマイシンの存在下
で培養し、これらに４０μｇ／ｍｌのツニカマイシンを
含有するＲＮＡ（５０ｎｌ）を注入し、そして５μｇ／
ｍｌのツニカマイシンを含有するＤＲ培地において２４
時間培養した。これについてはコールマン等により、ヨ
ーロピアン・ジヤーナル・バイオケミストリー、第１１
３巻、第３３９〜３４８頁（１９８１）に実質的に記載
されている。

【００４２】卵細胞ホモゲナイズ物からの上澄液を０．
１５Ｍ ＮａＣｌ、０．２５％ノニデツトＰ４０により
２ｍｌに調整し、そしてこれをレンチルレクチン−セフ
アローズ（フアルマシア社）の１ｍｌカラムに加えた。
このカラムを同じ緩衝液で激しく洗浄した後、０．１Ｍ
α−メチルマノシドを含有する同じ緩衝液でグリコシル
化物質を溶出させた（１．３％Ｓ³⁵−メチオニン含有物
を合併フラクシヨン中に溶出させた）。その後のクロー
ン化実験においてはレンチルカラムを省略した。

【００４３】次いで、レンチルレクチンカラムからのグ
リコシル化物質をトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）および
１％アブロテニン（シグマ社）にｐＨ８．０に調整し、
そして１ｍｌ当り２０μｌのＰＸ６３腹水液を加えた。
冷所中で２時間以上培養しかつ過剰の蛋白質Ａ−セフア
ロース（フアルマシア社）の存在下でさらに２時間培養
した後、１ｍｌ当り２０μｌの抗−ＤＲモノクローン抗
体（Ｄ1 −12，Ｄ4−22，ＢＴ2.2 ）の混合物を腹水液
として加えた。これは注入した卵細胞当り１μｌの腹水
液に相当する。４℃にて１晩培養した後、試料を３分間
遠心分離し（エツペンドルフマイクロ分離器）、そして
ペレツトを捨てた。この遠心分離は、分析における凝集
物質に基づく大きいバツクグランドを避けるために重要
である。

【００４４】次いで、蛋白質Ａ−セフアロースを上澄液
に加え、そして培養を４時間続けた。遠心分離により免
疫沈殿物を集め（マイクロ分離）、約４００μｌの５０
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％ノニデツトＰ４０、１
０ｍＭメチオニン、１％アブロテニンで２回洗浄し、約
４００μｌの同じ緩衝液（ただしアブロテニンと０．１
５Ｍ ＮａＣｌとを含有せず、０．５ＭのＮａＣｌを含
有する）で３回、さらに約４００μｌの１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５
Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ノニデツトＰ４０で２回洗浄し
た。

【００４５】次いで、免疫沈殿物を２５μｌの０．５Ｍ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１Ｍ蔗糖、５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、０．０１％ブロムフエトルブルー、３％ＳＤＳ
および８．３ｍＭジチオスレイトールの中に１００℃に
て３分間加熱することにより溶解させ、そしてこの溶液
を１２％ポリアクリルアミドＳＤＳゲルに加えた。この
ゲルを二次元で電気泳動にかけ、第一次元においては非
平衡ｐＨ濃度勾配の電気泳動にかけた（これについては
ピー・ゼツト・オーフアレル等、セル誌、第１２巻、第
１１３３〜１１４２頁（１９７７）に実質的に記載され
ている）。これらゲルを１０％トリクロル酢酸中で固定
し、エンハンス（ニユー・イングランド・ヌクレア社）
で処理し、２０％メタノールおよび３％グリセリン中で
洗浄し、そして乾燥させた。乾燥ゲルを予備フラツシユ
されたコダツクＸ−ＡＲフイルムに強化スクリーン（Ｃ
ａｗｏ社）を用いて−７０℃で露出させた。

【００４６】この分析により、ＨＬＡ−ＤＲのα−鎖、
中間鎖およびβ−鎖を暗号化するＲＮＡを含有するフラ
クシヨンとして、ｍＲＮＡ１２００−１３００ヌクレオ
チド長さを有するフラクシヨン３１を同定した。このフ
ラクシヨンのＲＮＡを全ポリＡ⁺ ＲＮＡにつき約２０倍
濃縮させた。

【００４７】寸法分画したＲＮＡの分析は、ラジ細胞か
らの翻訳ＲＮＡおよびＤＲ抗原の多数回の事前分析に基
づく。これらの分析から、卵細胞はＨＬＡ−ＤＲのα−
鎖、中間鎖およびβ−鎖を暗号化するＲＮＡを翻訳し、
これら抗原をグリコシル化させ、かつこれらを組立てる
ことを確認した。さらに、組立物はモノクローン抗体Ｄ
1 −12，Ｄ4 −22およびＢＴ2.2 により免疫沈殿された
が、β−鎖のみがＢＴ2.2 により抗原組立物が変性され
た後に免疫沈殿されたことを確認した。また、α−鎖は
３５０００〜３６０００の明確な分子量を有し、中間鎖
は約３３０００の明確な分子量を有し、かつβ−鎖はＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおいて３１０００およ
び２９０００の明確な分子量を有することを確認した。
さらに、非グリコシル化物質は次の通りである：３００
００および２９０００（α−鎖）、２７００（中間鎖）
並びに２７０００および２６０００（β−鎖）。

【００４８】ｃＤＮＡクローンの作成 １．ＨＬＡ−ＤＲ ｃＤＮＡの調製 フラクシヨン３１のポリＡ⁺ ＲＮＡの単一鎖ｃＤＮＡコ
ピーを調製するため、ＣＨ₃ Ｈｇを５ｍＭまで加えるこ
とによりＲＮＡを変性させ、そしてこの混合物を室温で
１分間静置した。次いで、この変性ＲＮＡに１ｍｌ／４
０μｇＲＮＡの緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
８．３）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、７０ｍＭ ＫＣｌ、
３０ｍＭ β−メルカブトエタノール、４ｍＭピロ燐酸
ナトリウム）と０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよび
ｄＴＴＰと０．３ｍＭ α−Ｐ³²−ｄＣＴＰ（〜０．５
μＣｉ／ｎモル）と４０μｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ）１
２−１８（コラボラテイブ・リサーチ社）と３００単位
／ｍｌの逆転写酵素（ライフ・サイエンス社）とを加
え、この混合物を３７℃にて１０分間および４２℃にて
６０分間加熱した［ワーリ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、第
６７巻、第３７１〜３８３頁（１９７８）］（図
２）^＊。この混合物へＥＤＴＡを１０ｍＭまで加えかつ
ＳＤＳを０．１％まで加えることにより反応を停止さ
せ、そして混合物をフエノール／クロロホルム／イソア
ミルアルコール（１００：９９：１）で抽出した。水相
をセフアデツクスＧ−５０超微粒カラムにより１０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＥＤＴＡで洗
浄した。次いで、溶出された混合物をＮａＯＨにて０．
５Ｎとなし、これを３７℃で３０分間培養し、それぞれ
５ＭのＨＯＡｃおよび１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
６）の０．１容量で中和し、そして単一鎖ｃＤＮＡをエ
タノール沈殿させた。遠心分離によりｃＤＮＡを回収し
た後、これを５０μｌの０．５Ｎ ＮａＯＨ中に再懸濁
させ、３７℃にて３０分間培養し、そしてこれを０．９
Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ ＮａＯＨ、２ｍＭ ＥＤＴＡ
中で４ｍｌの５〜２０％アルカリ性蔗糖濃度勾配にて層
状化させた。この層状化されたｃＤＮＡをＳＷ６０ロー
タ（５００００ｒｐｍ、１℃、７．５時間）にて寸法分
画し、そして１０００ヌクレオチド以上の長さを有する
ｃＤＮＡを含有するフラクシヨンを集めた。集めたＤＮ
Ａを中和し、そして上記と同様に沈殿させた（図２）。

【００４９】上記の集めたフラクシヨンからｃＤＮＡを
６８℃で９０秒間加熱しかつ氷中で急冷させて変性させ
ることにより二重鎖ｃＤＮＡを調製した。次いで、次の
反応混合物を調整した：単一鎖ｃＤＮＡ（４０μｇ／ｍ
ｌ）、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ₂ 、７０ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭβ−メル
カブトエタノール、０．５ｍＭのそれぞれｄＮＴＰおよ
び３００単位／ｍｌの逆転写酵素。この混合物を３７℃
で１０分間および４２℃で９０分間加熱した。ＥＤＴＡ
を１０ｍＭまで加えることにより再び反応を停止させ、
そしてこれをフエノール／クロロホルム／イソアミルア
ルコール（１００：９９：１）で抽出し、そしてセフア
デツクスＧ−５０カラムにて１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＥＤＴＡでクロマトグラフに
かけた。

【００５０】^＊ ピロ燐酸ナトリウムの添加は沈殿を生
ぜしめ、この沈殿は反応を停止させると消失する。二重
鎖ｃＤＮＡ調製物におけるヘヤピンループを６０ｍＭ
ＮａＣｌ、６ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．８）、０．５
ｍＭ ＺｎＣｌ2 、〜３０μｇ／ｍｌ二重鎖ｃＤＮＡ、
１００単位／ｍｌＳ1 ヌクレアーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミ
カルス社）を含有する反応混合物において混合物を３７
℃で３０分間加熱することによりＳ1 ヌクレアーゼで処
理した。ＥＤＴＡを１０ｍＭまで加えかつトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．６）を１００ｍＭまで加えることにより反
応を停止させ、混合物をフエノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコール（１００：９９：１）で抽出し、そ
してこれをセフアロースＣＬ−ＧＢカラムにより１０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＥＤＴＡで
洗浄して精製した。次いで、ｃＤＮＡを上記と同様にＥ
ｔＯＨにて沈殿させた。

【００５１】２．ＨＬＡ−ＤＲ ｃＤＮＡのクローン化 広範囲の宿主／クローン化ベヒクル組合せ物を使用し
て、二重鎖ｃＤＮＡをクローン化させることができる。
さらに、それぞれ特異的クローン化ベヒクルにおいて、
種々の部位を選択することにより二重鎖ｃＤＮＡを挿入
することができる。本発明のＤＮＡ配列をクローン化さ
せるためには、これら各種の代替物から本発明の範囲を
逸脱することなく当業者により特定的に選択することが
できる。

【００５２】初期のクローン化研究において、細菌性プ
ラスミドｐＢＲ３２２（エフ・ポリバール等、「新規な
クローン化ベヒクルＩＩの作成および特性化。多目的ク
ローン化方式」、ジーン誌、第２(2) 巻、第９５〜１１
４頁（１９７７）；ジエー・ジー・サツトクリフ、「Ｄ
ＮＡ配列から得られるｐＢＲ３２２制限地図；４３６１
ヌクレオチド対長さまでの正確なＤＮＡ寸法標識」、
ヌクレイツク・アシツド・リサーチ、第５巻、第２７２
１〜２７２８（１９７８））。さらに、ＰｓｔＩ部位
［エル・ピラ・コマロフ等、「ブロインシユリンを合成
する細菌性クローン」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７５巻、第３７２７〜３７３１
頁（１９７８）］、ｄＣ／ｄＧ切断［エル・ピラ・コマ
ロフ等、上記］およびイー・コリＨＢ１０１を選択し
た。

【００５３】ａ．ＰｓｔＩ−開裂されたｄＧ−切断ｐＢ
Ｒ３２２の調製 標準条件を用いてＰｓｔＩによりｐＢＲ３２２を切断し
た。次いで、２０ｍＭＫ−カコジル酸塩、５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ６．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１
ｍＭ ｄＧＴＰ、２００μｇ／ｍｌ線状化ｐＢＲ３２２
および２５単位／ｍｌ末端トランスフエラーゼの反応混
合物を調製した。この混合物を３７℃にて４５分間加熱
した後、ＥＤＴＡを１０ｍＭまで加えかつＳＤＳを０．
５％まで加えて反応を停止させ、そしてこの混合物を氷
中で１５分間急冷し、遠心分離（マイクロ遠心分離器、
２分間、４℃）によりｄＣ切断されたＨＬＡ−ＤＲ ｃ
ＤＮＡにアニールさせるため上澄液を調製した（図
２）。

【００５４】ｂ．ｄＣ切断ＨＬＡ−ＤＲ ｃＤＮＡの調
製 ｄＣ切断物を、２００ｍＭ Ｋ−カコジル酸塩，５０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．９）、１ｍＭ ｄＣＴＰ、
１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（ペンテツクス社）、〜２μ
ｇ／ｍｌ ｃＤＮＡおよび１２５単位／ｍｌ末端デオキ
ヌクレオチジルトランスフエラーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミ
カルス社）を含有する反応混合物において３７℃でこの
混合物を１〜６分間加熱することにより上記と同様に調
製されたｃＤＮＡへ加えた。少量部を用いることによ
り、最適な反応時間を選択した（通常約４分間）。次い
で、この時間を使用してｃＤＮＡを切断した。再びＥＤ
ＴＡを１０ｍＭまで加えかつＳＤＳを０．５％まで加
え、さらに混合物を氷中で１５分間急冷することにより
反応を停止させた。ｄＣ切断されたｃＤＮＡを単離して
これを遠心分離によりｄＧ切断されたＰｓｔ−開裂ｐＢ
Ｒ３２２へアニールさせた（マイクロ遠心分離器、２分
間、４℃）。

【００５５】ｃ．ｄＣ切断ｃＤＮＡおよびｄＧ切断ｐＢ
Ｒ３２２のアニール化 上記のように調製した４０ｎｇのｄＣ切断ｃＤＮＡと、
上記のように調製した２５０ｎｇのｄＧ切断されたＰｓ
ｔ開裂ｐＢＲ３２２とをアニール化用緩衝液（１０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．２Ｍ ＮａＣｌ）において６８℃で２時間混合し、
次いで徐々に冷却した（図２）。

【００５６】上記のように調製された組換ＤＮＡ分子の
僅かのものが、実際にＨＬＡ−ＤＲのβ−鎖、すなわち
軽鎖、すなわちＨＬＡ−ＤＲ座の主たる多形質領域を暗
号化するＤＮＡ配列を含有することが了解されよう。事
実、大部分のクローン化された種類は、ＨＬＡ−ＤＲに
対し或いはそのβ−鎖に対し無関係である。

【００５７】３．ヒブリドによるイー・コリＨＢ１０１
のトランスフエクシヨン 競合イー・コリＨＢ１０１（ｒｅｃＡ^- ）を上記のヒブ
リドにより形質転換させた（これについては、デイー・
モリソンによりジヤーナル・バクテリオロジー、第１３
２巻、第３４９〜３５１頁（１９７７）に記載されてい
る）。

【００５８】プラスミドｐＢＲ３２２はアンピシリン耐
性とテトラサイクリン耐性とを暗号化する遺伝子を含
み、かつ前者の遺伝子はＰｓｔＩ部位におけるｃＤＮＡ
挿入により失活されるので、ＰｓｔＩ部位にｃＤＮＡ挿
入物を有する組換ＤＮＡ分子で形質転換された集落を、
そのように形質転換されていない集落から選択すること
ができる。したがつて、上記のように形質転換されたイ
ー・コリ菌体を１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含
有する洗浄かつオートクレープ処理されたシユライヒヤ
ーおよびシユエルのニトロセルロースフイルターに塗沫
した［デイー・ハナハンおよびエム・メセルソン、ジー
ン誌、第１０巻、第６３〜６７頁（１９８０）］。この
方法を用いて５５０種のｃＤＮＡクローンを作成した
（図２）。

【００５９】ＨＬＡ−ＤＲ ｃＤＮＡを含有するクロー
ンの選別 特定の組換ＤＮＡ分子を含有するクローン、すなわちＨ
ＬＡ−ＤＲ−β−鎖関連のＤＮＡ挿入物を含有するクロ
ーンにつき、クローンの保存物を選別するには幾つかの
方法がある。これらの方法は当業界で充分周知されてい
る。初期のクローン選別において、ポリＡ⁺ ＲＮＡに対
する高基準の陽性ヒブリド化選択をジアゾベンジルオキ
シメチル紙（シユライヒヤーおよびシユエル）において
使用するよう選択した。本発明の方法はゴールドベルク
等、メソツド・エンチモロジー、第６８巻、第２０６〜
２２０頁（１９７９）の方法から改変させた。ヒブリド
化に対する実験基準としては、５０個の集落の保存物に
おいて１個のＤＲ−β−ｃＤＮＡ−関連クローンを検出
しうると予想した。

【００６０】５５０個の選別したクローンをそれぞれ５
０個のクローンの１１群に分け、これらを１０μｇ／ｍ
ｌのテトラサイクリンを補充したＬ−培地で増殖させ
た。次いで、クロラムフエニコール（５０μｇ／ｍｌ）
によりプラスミドを１晩処理し、そして慣用の清澄溶菌
物ＣｓＣｌ濃度勾配法を使用してこれら保存物からプラ
スミドＤＮＡを調製した。次いで、プラスミドＤＮＡを
０．５％ジエチルピロ炭酸エステルで処理し、これをセ
フアロースＢカラム（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．６），１ｍＭ ＥＤＴＡ）に通して、小さい汚染性
ＲＮＡ分子を除去した。プラスミドＤＮＡを０．２５Ｎ
ＨＣｌ中で室温にて１０分間部分的に処理し、混合物
を０．５ＮのＮａＯＨ、０．５Ｍ ＮａＣｌまで調製
し、２０分間培養し、ＨＣｌで中和し、そしてＤＮＡを
ＥｔＯＨにより２回沈殿させた。次いで、調製されたジ
アゾベンジルオキシメチル紙（シユライヒヤーおよびシ
ユエル）を調製し、これに上記で調製されたＤＮＡを共
融結合させた（これについてはゴールドベルク等、上記
により実質的に記載されている）。Ｐ³²−標識ＤＮＡト
レーサを混合物中に含ませることによりＤＮＡの滞留に
つき監視した。平均して１５μｇのＤＮＡがそれぞれ１
ｃｍ² のフイルタに結合された。

【００６１】これらフイルタを５０％ホルムアミド（２
回再結晶化させかつ脱イオン化したもの）、２０ｍＭ
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、２
ｍＭＥＤＴＡ、０．４％ＳＤＳ、１％グリシン、０．３
ｍｇ／ｍｌイー・コリｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍｌポリ
Ａにおいて３７℃で２〜４時間予備ヒブリド化させた。
ヒブリド化するため、１１枚のフイルタを〜２００ｍｌ
の同じ緩衝液（グリシン，ｔＲＮＡおよびポリＡを含ま
ない）において３７℃で２０時間にわたり３００μｇの
全ポリＡ⁺ ＲＮＡ（上記のように調製）で処理した。次
いで、これらフイルタをヒブリド化緩衝液で３７℃にて
３０分間３回洗浄し、２２℃で１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．１％ＳＤＳにて３０分間３回洗浄し、次いで５
０℃にて１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡにより１０分間３回洗浄した。

【００６２】ヒブリド化ＲＮＡを１５０μｌの５ｍＭト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、
６μｇ／ｍｌうさぎｔＲＮＡにより２つの部分に溶出
し、その際フイルタを含む溶液を９８℃にて７５秒間加
熱した。次いで、混合物を０．３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ
５．０）まで調整し、そしてＲＮＡをＥｔＯＨにより２
回沈殿させた。

【００６３】上記からのＲＮＡにＨＬＡ−ＤＲ α−鎖
および中間鎖（ｃＤＮＡ過剰の条件下で２５μｇのポリ
Ａ⁺ ＲＮＡから選択し、かつ卵細胞分析により確認）に
対するｍＲＮＡを補充し、そして補充されたＲＮＡを卵
細胞に注入して上記と同様に分析した。ＲＮＡをこのよ
うに処理して免疫沈殿のレベルを増大させると共に、可
能なクローンを検出する機会を増大させた。卵細胞によ
り合成されたα−鎖および中間鎖抗原の存在を監視する
ため、各卵細胞抽出物の１／４を、遊離α−鎖および中
間鎖を結合する抗−ＤＲ−うさぎ血清１３３［カレル
等、モレキユラ・イミユノロジー、第１８巻、第４０３
〜４１１頁（１９８１）］で免疫沈殿させた。各卵細胞
抽出物の残部３／４を抗−ＤＲ−モノクローン抗体（Ｄ
1 −12，Ｄ4 −22，ＢＴ2.2 ）によつて免疫沈殿させ
た。１１個の保存物のうち２個において、少量のＤＲ−
抗原（β）が注入卵細胞で合成された^＊。

【００６４】^＊ 幾つかの保存物においてはさらに３７
０００ダルトンのバンドも免疫沈殿された。この蛋白質
は同定しなかつた。

【００６５】２種の陽性のものの各々を１０個のクロー
ンからなる５群に分け、かつヒブリド化させて、これら
を上記と同様に分析した。元の２種の陽性のものの各々
から誘導された５群のうちの１群は、再び陽性であつ
た。次いで、２つの陽性の群の各々を、それぞれ１個の
クローンよりなる１０群に分け、かつヒブリド化させて
これらを上記と同様に分析した。２つの陽性クローンを
選択した：クローン６８およびクローン８３−７。

【００６６】クローン８３−７はヒブリド化の条件下で
ＤＲ−β鎖ｍＲＮＡを極めて効率的に選択した。このｍ
ＲＮＡは卵細胞において抗原を生成し、この抗原をαお
よび中間鎖ＲＮＡによる補充なしに抗−ＤＲモノクロー
ン抗体（Ｄ1 −12，Ｄ4 −22，ＢＴ2.2 ）により免疫沈
殿させた。逆に、クローン６８−６はＤＲ−β鎖ｍＲＮ
Ａの選択においてずつと効率が低かつた。クローン８３
−７は１８０ｂｐの挿入物を有し、かつクローン６８−
６は４７０ｂｐの挿入物を有した。これら挿入物はクロ
スヒブリド化しなかつた。

【００６７】図３はＤＲ領域におけるクローン８３−７
のｃＤＮＡ挿入物の位置およびＩａ状領域におけるクロ
ーン６８−６のｃＤＮＡ挿入物の位置を示している。Ｉ
ａ状領域をＨＬＡ部位の領域と呼び（図１）。クローン
６８−６はＩａと名付けられる。何故なら、これはＨＬ
Ａ／ＤＲに関連するがそれと同一でない領域を示すから
である。

【００６８】さらに、ゲル移動ヒブリド化によりこれら
２種のｃＤＮＡクローンに同族であるＲＮＡを分析し
た。両ｃＤＮＡクローンは長さ約１３００ヌクレオチド
のポリＡ⁺ ＲＮＡとヒブリド化し、２種のβ−細胞系お
よび慢性リンパ白血病を有する患者からのβ−細胞で発
現されたが、３種のＴ細胞系、膵臓および肝臓には存在
しなかった。また、６８−６ｃＤＮＡ挿入物は長さ１６
５０ヌクレオチドの他のＲＮＡバンドにヒブリド化した
が、８３−７ｃＤＮＡ挿入物は長さ１９００ヌクレオチ
ドの他のＲＮＡバンドにヒブリド化した。

【００６９】クローン８３−７および６８−６にヒブリ
ド化するラジ由来のクローンの選別 クローン８３−７および６８−６のＤＮＡ挿入物を試料
として使用し、上記と同様に調製された全ポリＡ⁺ ＲＮ
Ａ由来のクローン（ラジ細胞）の保存物を鋭意選別し
て、ＨＬＡ−ＤＲ β暗号化領域から他の好ましいより
長くかつより完全なＤＮＡ配列を位置決定した。

【００７０】ＰｓｔＩでの処理により２種のクローンの
プラスミドＤＮＡから挿入物を切除し、これらを中性蔗
糖勾配遠心分離およびアクリルアミドゲル電気泳動によ
り精製した。溶出された断片をＤＥＡＥカラムに通し、
精製された挿入物を標識した（これについてはエム・グ
ルンシユタインおよびデイー・ホグネスにより「コロニ
ーヒブリド化：特異的遺伝子を含有するクローン化ＤＮ
Ａの単離方法」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、第７２巻、第３９６１〜３９６５頁（１９
７５）；リグビー等、ジヤーナル・モレキユラ・バイオ
ロジー、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（１９７７）
に実質的に記載されている）。そして（α−Ｐ³²）ヌク
レオチドおよびＤＮＡポリメラーゼＩ（ベ−リンガーマ
ンハイム社）によつてニツク翻訳により２×１０⁸ ｃｐ
ｍ／μｇ、まで精製した［リグビー等、上記］。次い
で、この試料を使用して、高基準条件（下記）を用いて
より長いヒブリド化関連ｃＤＮＡクローンにつき保存物
を選別した。

【００７１】この選別から、より長いｃＤＮＡ挿入物を
含有する多数のクローンを単離した。これらクローンの
挿入物をＤＲ−β₁ 、ＤＲ−β₂ およびＩａ−β₁ と名
付けた。これら挿入物により画成される領域を第３図に
示す。第３図に示したように、ＤＮＡ挿入物ＤＲ−β₁
およびＤＲ−β₂ はＤＲ部位に関連する一方、Ｉａ−β
₁ はＩａ領域に関連する。

【００７２】さらに、これらクローンの種々の断片を用
いて幾つかのヒブリド化基準でクロスヒブリド化実験を
行ない、選択された種々異なるｃＤＮＡクローン間の類
似性の程度を決定した。ｃＤＮＡクローンの３´未翻訳
部分からのＤＮＡ配列は高基準（Ｔｍより５℃低い）、
中間基準（Ｔｍより２４℃低い）または低基準（Ｔｍよ
り４３℃低い）においてクロスヒブリド化しなかつた。

【００７３】逆に、ＤＲ β−鎖部位ではなくＩａ状領
域の第１領域を暗号化するクローンの５´末端における
ＤＮＡ配列は、中間基準でクロスヒブリド化した。した
がつて、ＤＲ関連ＤＮＡ配列はＩａ関連配列にクロスヒ
ブリド化しないが、Ｉａ関連配列は他のＩａ関連配列に
クロスヒブリド化する。

【００７４】ｃＤＮＡ挿入物の制限地図 各種の制限エンドヌクレアーゼによる単一および二重処
理を用いた制限分析により、各種のｃＤＮＡクローンの
ＨＬＡ関連挿入物を地図化した。エンドヌクレアーゼの
供給業者（ニユー・イングランド・バイオラブ社、ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリー社、ベーリンガー社）に
より推奨される条件および緩衝液を使用し、そして得ら
れた断片をアガロースゲル上で分析した。

【００７５】さらに図３は、選別工程において位置決定
された各種のｃＤＮＡ挿入物の部分制限地図を示してい
る。勿論、図３に示された制限部位の実際の位置は不正
確である。慣用方法を用いるヌクレオチド配列は、他の
予測部位と同様に特定部位に適切に位置決定するであろ
う。

【００７６】上記したように、ラジ細胞は異型接合性、
すなわちＤＲ３／６である。したがつて、２種の異なる
配列ＤＲ−β₁ およびＤＲ−β₂ がこれら細胞から生成
されるｃＤＮＡに存在するという事実は、これらクロー
ンを特性化する２種のＤＮＡ配列がβ−鎖暗号化配列の
異なる種類から生ずるということを明確に示していな
い。寧ろ、これら２種は異型接合細胞系の２種のＤＲ型
の対立型種類である。

【００７７】クローンＤＲ−β₁ にヒブリド化するＩＢ
Ｗ９由来のクローンの選別 ヒブリド化試料としてＤＮＡ挿入物ＤＲ−β₁ を使用し
て、ひとβ細胞系、ＩＢＷ９から得られた全ポリＡ⁺ Ｒ
ＮＡの２００００個のクローンの保存物を選別した。こ
の保存物は、ラジ細胞保存物について前記したと同様に
調製した。ＩＢＷ９は、血族関係によりＨＬＡに対し元
来同型接合性であると思われた細胞系である。しかしな
がら、これはその後、２つの研究室によりＤＲ４，Ｗ６
異型接合系として個々に分類された。

【００７８】同型接合細胞系と思われるものを使用し
て、ラジ細胞のような異型接合細胞系に存在しうる対立
多形質性を検出するのが困難な上記の可能性を回避し
た。異型接合系に対比して、同型接合細胞系からのクロ
ーンに検出されるβ−鎖クローンは、定義において異な
るβ−鎖遺伝子族を示すであろう。しかしながら、上記
したように、本発明に使用した系統は実際には異型接合
系であった。

【００７９】この異型接合細胞系由来の保存物を選別し
た結果、ＨＬＡ−ＤＲ−関連ＤＮＡ配列の４つの種類を
位置決定した。これら種類の暗号化配列を制限地図化^＊
に基づきＤＲ−β−Ａ，ＤＲ−β−Ｂ，ＤＲ−β−Ｃお
よびＤＲ−β−Ｄと名付けた。勿論、他のβ−鎖種類も
存在しうることを了解すべきである。たとえば、アコラ
（上記）は７種のこの種のものを予測している。このよ
うな種類は、本発明のＤＲ−β₁ ，ＤＲ−β₂ ，ＤＲ−
β−Ａ，ＤＲ−β−Ｂ，ＤＲ−β−ＣまたはＤＲ−β−
Ｄ配列またはその断片を用いて高基準のヒブリド化にて
（実質的に上記したと同様）または他の同様な方法を用
いて選別しうるので本発明の１部である。

【００８０】^＊ これら挿入物を含むクローンをイー・
コリＨＢ１０１（ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ−β−Ａ乃至Ｄ）と命名し、これはそのＰｓｔＩ制限
部位に特定のＨＬＡ−ＤＲ−β関連ＤＮＡ挿入物を有す
るｐＢＲ３２２からなる組換ＤＮＡ分子により形質転換
されたイー・コリＨＢ１０１菌体であることを意味す
る。

【００８１】４種のＤＲ−βクローンにおけるクローン
はその暗号化領域および非暗号化領域全体にわたり充分
にクロスヒブリド化する。これらは、極めて厳密に制限
地図およびクロスヒブリド化によつて区別することがで
きる（図４）。したがつて、これらは恐らく４種の異な
るＤＲ−遺伝子から得られた４種のｍＲＮＡを示してい
る。これらはＤＲ（４，Ｗ６）に対し異型接合細胞系か
ら得られるので、これら４種のＤＲ−β遺伝子はＤＲ−
鎖を暗号化する少なくとも２つの非対立部位を示すと思
われる。この結論は、さらにβ₁ 試料を用いて同じβ細
胞系から単離したゲノムＤＮＡクローンの分析により裏
付けらる。

【００８２】ｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列 ヌクレオチド配列を決定するため、上記のように、ＤＮ
Ａ挿入物ＤＲ−β−Ａ，ＤＲ−β−Ｂ，ＤＲ−β−Ｃお
よびＤＲ−β−Ｄからの制限断片を調製し、これらをア
クリルアミドゲルから抽出し、そしてＤＥＡＥセルロー
スカラムで精製した。これら断片を（α−Ｐ³²）コルジ
アピン−５´−トリホスフエート（アメルシヤム社）お
よび末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ
（Ｐ−Ｌバイオケミカルス社）により３´標識し、或い
はこれらを牛の腸ホスフアターゼ（エス・クラークソン
による寄贈）およびポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌ
バイオケミカルス社）により５´標識した。これら標識
された断片につき、マキサムおよびギルバートにより
「ＤＮＡの新規な配列決定方法」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７４巻、第５２０〜５６４頁
（１９７７）に実質的記載されているように配列決定し
た。殆んどのｃＤＮＡについては両ストランドから配列
決定し、かつ標識末端として作用する殆んどの制限部位
についてはそれらを画成する断片を用いて配列決定し
た。

【００８３】図５、図６、図７、図８および図９は、配
列決定方法およびｃＤＮＡクローンＨＬＡ−ＤＲ−β−
Ａ^＊の暗号化ストランドのヌクレオチドおよびアミノ酸
配列を示している。クローンＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａにお
いて、３５個のヌクレオチドが最初のＡＴＧトリブレツ
トに先行する。このＡＴＧは長さ２６６個のアミノ酸の
開放読枠における最初のコドンである。１１個の連続し
た疎水性残基のコアを有する最初の２９個のアミノ酸
は、ひとＩａ抗原のβ−鎖につき決定された部分アミノ
酸配列と高度の類似性を有する配列に先行する［デイー
・エー・シヤツケルフオード等、イミユノロジー・レビ
ユー、第６６巻、第１３３〜１８７頁（１９８２）］。
したがつて、最初の２９個のアミノ酸（図６においてＮ
ｏ−１〜−２９）は恐らく信号配列を示し、残部２３７
個のアミノ酸（図６、図７、図８および図９においてＮ
ｏ１〜２３７）は成熟蛋白質（１９９個のアミノ酸）と
トランスメンブラン領域（２２個のアミノ酸）と細胞質
末端（１６個のアミノ酸）とを示す。図６、図７および
図８に示したように、暗号化配列の細胞外部分には４個
のシステインが存在する（位置１５，７９，１１７およ
び１７３）。

【００８４】^＊ このクローンに対する部分ヌクレオチ
ドおよびアミノ酸配列（ＡＡ７９−９５）は英国特許出
願第８２２２０６６号および第８２３０４４１号明細書
に示された。

【００８５】図１０、図１１、図１２および図１３は、
クローンＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａから推定したアミノ酸配
列と、ＤＲ２同型接合系［エツチ・クラツチン等、ホツ
ペ・セイラース・ツアイトシユリフト・フイジオロジツ
シエ・ケミー、第３６２巻、第１６６５〜１６９９頁
（１９８１）］から単離されたＩａ抗原β−鎖につきク
ラツチンにより決定された配列と、ＤＲ３，Ｗ６細胞系
［デイー・ラルハンマー等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７９巻、第３６８７〜３６９
１頁（１９８２）］から単離されたｃＤＮＡクローンに
より推定される配列とのアミノ酸配列比較を示してい
る。最後の配列は、ＤＣβ−鎖クローンであると思われ
る。何故なら、その推定配列はＤＳβ−鎖［エス・エム
・ゴイエルト等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１５６巻、
第５５０〜５６６頁（１９８２）］^＊につき決定された
部分Ｎ−末端配列に匹敵するからである。

【００８６】^＊ ＤＳおよびＤＣ抗原は同一であり、か
つねずみＩ−Ａ Ｉａ抗原に対し極めて良好な類似性を
示すことがエス・エム・ゴイエルト等により、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．、第１５６巻、第５５０〜５６６頁（１９
８２）；アール・ボノおよびジエー・エル・ストロミン
ガー、ネイチヤー誌、第２９９巻、第８３６〜８３８頁
（１９８２）に記載されている。

【００８７】図１４および図１５は、他のＨＬＡ−ＤＲ
−βクローン［ＨＬＡ−ＤＥ−β−Ｂ］のヌクレオチド
およびアミノ酸配列を示している。さらに、このクロー
ンから推定されるアミノ酸配列は２９個のアミノ酸より
なる推定信号配列と、２３７個の他のアミノ酸とを暗号
化領域に有する。

【００８８】ＨＬＡ−ＤＲ判定における本発明のｃＤＮ
Ａ挿入物の使用 ＨＬＡ−ＤＲ−β−鎖抗原またはその断片の種類を暗号
化するｃＤＮＡ挿入物を、ＤＲ判定法およびキツトに使
用することができる。一般に、この種の判定方法は、
（１）慣用のエンドヌクレアーゼと条件とを用いて個体
のＤＮＡを制限し、（２）制限ＤＮＡをたとえば慣用の
ゲルにおいて寸法分画し、（３）寸法分画されたＤＮＡ
を本発明のＨＬＡ−ＤＲ−β−鎖関連試料またはその断
片にヒブリド化し、かつ（４）ヒブリド化の領域を検出
する工程からなつている。

【００８９】たとえば、この種の方法の１例として、確
立された細胞系からの４種の異なる個体［ＨＬＡ−ＤＲ
につき３種の同型接合体（１／１，６／６，７／７）お
よび１種の異型接合体（３／６）］から高分子量ＤＮＡ
を得た。このＤＮＡを３７℃にてＥｃｏＲＩ（ベーリン
ガー・マンハイム社）とＨｉｎｄIII （ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリース社）またはＢａｍ ＨＩにより、
標準緩衝液条件および１単位酵素／μｇ ＤＮＡを用い
て１晩処理した。ＥＤＴＡにより反応を停止させ、制限
ＤＮＡをクロロホルムイソアミルアルコール（２４：
１）により１回抽出し、そしてＥＴＯＨで沈殿させた。
遠心分離の後、ペレツトを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、０．
０５％ブロムフエノールブルー、０．０５％キシレンシ
アノールおよび５％グリセリン中に再懸濁させた。ＤＮ
Ａを３７℃にて４時間培養した後、これを６５℃にて５
分間処理し、２０ｍＭグリシン，１５ｍＭ ＮａＯＨ
（ｐＨ８．３）における０．６％アガロースゲルに加え
た。これらゲルを６０−１００Ｖにて１２時間処理し、
次いで０．２μのニトロセルロースフイルタ（シユライ
ヒヤーおよびシユエル）に移した（これについてはジー
・エム・バール等によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７６巻、第３６８３〜３６８７
頁（１９７９）に実質的に記載されている。）。

【００９０】移動させた後、これらフイルタを４×ＳＳ
Ｃ（ＳＳＣは１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン
酸ナトリウムである）において洗浄し、次いでこれらを
減圧オーブン内で８０℃にて２時間処理した。次いで、
フイルタを５×ＳＳＣ、５×デンハルツ試薬で６５℃に
てゆつくりと振とうしながら１〜２時間、および１×デ
ンハルツ試薬、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）、１０％
デキストラン硫酸塩、０．１％ＳＤＳ、５０μｇ／ｍｌ
ポリＧおよび２５０μｇ／ｍｌ超音波変性されたＤＮＡ
にて６５℃で２時間、順次に培養した。次いで、濾紙に
結合したＤＮＡを１×デンハルツ試薬、０．７５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７）および１×１０⁶ ｃｐｍ／ｍｌの本発明
のＰ³²−標識ｃＤＮＡ試料において６５℃で８〜１２時
間ヒブリド化させた。

【００９１】ヒブリド化の後、フイルタをそれぞれ５×
ＳＳＣ、１×デンハルト試薬、０．１％ＳＤＳ、０．１
％ピロ燐酸ナトリウムと、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
と、０．５×ＳＳＣと、０．１×ＳＳＣとにより２回洗
浄した（６５℃、３０分間）。次いで、乾燥したフイル
タを予備フラツシユしたコダツクＸ−ＡＲフイルムに強
化スクリーン（Ｃａｗｏ社）を用いて−７０℃にて４８
時間露出させた。

【００９２】図１６はヒブリド化の結果を示している。
図１６に見られるように、それぞれ異なるひとＤＮＡ
（ＤＲ７／７（レーン１）、ＤＲ６／６（レーン２）、
ＤＲ３／６（レーン３）およびＤＲ１１／１（レーン
４））は各制限エンドヌクレアーゼにつき異なる電気泳
動パターンを示す^＊。したがつて、本発明の試料を用い
る種々のＨＬＡ／ＤＲ判定された個体からのＤＮＡのサ
ウザンブロツトは、異なるＨＬＡ−ＤＲ特異性を有する
個体から簡単かつ経済的に区別することができる^{＊ ＊}。
さらに、この判定方法および生産物で得られた簡単なブ
ロツトパターンは従来の判定方法では可能でなかつたよ
うな判定を可能にし、したがつて従来のＨＬＡ−ＤＲ群
における各種のサブ群を同定しかつ区別することがで
き、しかも種々の病気に対するこれらサブ群の感受性を
より良好に決定することができる。

【００９３】^＊ 図１６のレーン５はねずみＤＮＡであ
る。^＊＊ 上記の「判定」方法は１０〜２０ｍｌの血液を用
いて行うことができ、１００回または１０００回の試験
まで用意に規模拡大される。

【００９４】勿論、特定の制限ＤＮＡのヒブリド化部分
の検出はＰ³²−標識試料により行なう必要がないことを
了解すべきである。寧ろ、他のヒブリド化検出方法を同
等に使用することができる。この種の方法は、試料を染
色活性化剤、検出酵素、アビジンまたは他の検出手段に
結合させることを含む。

【００９５】本発明のｃＤＮＡ挿入物の合成試料を使用
する改良ＨＬＡ−ＤＲ判定 短かい（１９塩基）のオリゴヌクレオチドＤＮＡ断片を
用いるサウザンブロツトの条件下におけるヒブリド化
は、完全に適合する配列（同一もしくは対立）を非適合
配列（異なる配列または対立）から区別しうることを示
している。たとえば、ビー・ジエー・コナー等、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８０巻、
第２７８〜２８２頁（１９８３）。

【００９６】本発明のＨＬＡ−ＤＲ−β−ｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列を分析し、そしてこれら配列内に配列の
相違（多形質的相違を含む）を示す少なくとも３つの領
域を確認した。これらの３つの領域は次の通りである：
（１）アミノ酸８〜１４に対する暗号化配列；（２）ア
ミノ酸２６〜３２に対する暗号化配列；および（３）ア
ミノ酸７２〜７８に対する暗号化配列（図１７）。さら
に、異なるＤＲ−β鎖遺伝子ならびにＤＣおよびＳＢβ
−鎖遺伝子のうち同一である領域（アミノ酸３９〜４５
に対する暗号化配列）も確認した。

【００９７】不適合の３つの領域（図１７における黒
丸）を画成する合成オリゴヌクレオチド（１９−化合
体）の試料を調製した。第９図の指示した領域は、２種
のＨＬＡ−ＤＲ−β ｃＤＮＡクローンの３つの領域の
それぞれにつき調製した特定の１９−化合体を示してい
る。これら１９−化合体のそれぞれは２個以上の不適合
部分を有するので、各試料につきＨＬＡ−ＤＲ配列の明
確な区別を行なうことができる。さらに、１９−化合体
を上記のように同族領域から調製して、陽性ヒブリド化
比較として使用することができる。

【００９８】同様にして、他のＨＬＡ−ＤＲ−β鎖遺伝
子のうち不適合および同一の領域から１９−化合体ＤＮ
Ａ試料のコレクシヨンを作成することができる。かくし
て、それぞれの試料は所定のＤＲ特異性に対し特定的で
ある。したがつて、試料コレクシヨンおよび比較のヒブ
リド化は、多数の個体の迅速かつ正確なＤＲ判定を可能
にする。

【００９９】本発明のＤＮＡ配列の発現 蛋白質の生産レベルは２つの主たる因子により支配され
る：すなわち細胞内のその遺伝子のコピー数およびこれ
ら遺伝子コピーが転写しかつ翻訳する効率である。転写
および翻訳の効率（これらは一緒になつて発現を構成す
る）は、通常、所望の暗号化配列の前方に位置するヌク
レオチド配列に依存する。これらのヌクレオチド配列ま
たは発現制御配列は、特にＲＮＡポリメラーゼが反応し
て転写を開始する位置（プロモータ配列）およびリボソ
ームがｍＲＮＡと結合して相互反応し（転写生産物）翻
訳を開始する位置を規定する。この種の発現制御配列
は、必らずしも同等な効率で機能しない。したがつて、
所望の蛋白質に関する特異的暗号化配列を隣接するヌク
レオチド配列から分離し、そしてこれを他の発現制御配
列に融合させて高レベルの発現を得ることが有利であ
る。これが達成されると、新たに作成されたＤＮＡ断片
をマチルコピーのプラスミドまたはバクテリオフアージ
誘導体に挿入して、細胞内における遺伝子コピー数を増
大させ、かくして発現蛋白質の収率をさらに向上させる
ことができる。

【０１００】したがって、広範囲の宿主−発現制御配列
のベクター組合せを使用して、本発明の方法により適当
な暗号化配列を挿入することによつてＨＬＡ−ＤＲ−β
鎖と同様なポリペプチドを生産することができる。たと
えば、有用なベクターは染色体、非染色体および合成の
ＤＮＡ配列の断片からなり、たとえば ｃｏｌ Ｅｌ，
ｐＣＲＩ，ｐＢＲ３２２およびその誘導体を含めイー・
コリからの各種公知の細菌プラスミド、広範囲の宿主プ
ラスミド、たとえばＲＰ４、フアージＤＮＡ、たとえば
多くのフアージλの誘導体ならびに上記の組合せから得
られるベクター、たとえばｐＢＲ３２２、フアージλの
一部および合成部分を含むベクターが包含される。有用
な宿主はたとえばイー・コリの菌株、たとえばイー・コ
リＫ１２ＭＣ１０６１、イー・コリＨＢ１０１、イー・
コリ×１７７６、イー・コリ×２２８２、イー・コリＭ
ＲＣＩのような細菌性宿主ならびにシユウドモナス、枯
草菌、高熱細菌およびその他細菌類、酵母およびその他
の真菌類の菌株、動物もしくは植物宿主、たとえば動物
（ひとを含む）もしくは植物の培養細胞またはその他の
宿主を包含することができる。有用な発現制御配列はイ
ー・コリのラクトースオペロンのオペレータ、プロモー
タならびにリボゾーム結合および相互作用配列（「ｌａ
ｃ系」）、イー・コリのトリプトフアンシンセターゼ系
の対応する配列（「ｔｒｐ系」）、フアージλの主オペ
レータおよびプロモータ領域（Ｏ_LＰ_L およびＯ_R Ｐ^I
_R ）、フアージｆｄコート蛋白質の制御領域、または原
始核細胞もしくは成熟核細胞およびそのウイルスの遺伝
子の発現を制御かつ促進するその他の配列、或いは各種
のこれらの組合せを包含することができる。

【０１０１】勿論、必ずしも全ての宿主−発現制御配列
−ベクター組合せ物が、特定のＨＬＡ／ＤＲ暗号化配列
につき同等の効果を有するとは限らない。しかしなが
ら、上記したように、生物安全性の観点から特定の構造
につき本発明のＨＬＡ−ＤＲ−β暗号化配列に使用しう
る部位、発現すべきＨＬＡ−ＤＲ−β鎖ポリペプチドの
寸法、宿主細胞酵素による蛋白質分解に対するポリペプ
チドの感受性、精製の際除去するのが困難な宿主細胞蛋
白質によるポリペプチドの汚染、ＨＬＡ−ＤＲ−β暗号
化配列の発現特性、たとえばＤＮＡ暗号化配列の構造お
よび発現制御配列に関する開始および停止コドンの位
置、ならびに当業者に認識されたその他の因子を考慮し
て、本発明のＨＬＡ／ＤＲ−β−鎖暗号化配列をベクタ
ーにおける発現制御配列へ作用結合させる適当な組合せ
を選択し、これを使用して宿主を形質転換させ、その宿
主を培養して挿入暗号化配列により暗号化されるポリペ
プチドを生産することができる。

【０１０２】ＤＮＡ配列および発現制御配列をベクター
中に挿入するための種々の方法が当業界で知られてい
る。たとえば、これらは直接的結合、合成リンカ、エキ
ソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ結合した修復反応に
続く結合、或いはＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の
延長および適当な単一鎖雛型の作成に続く結合を包含す
る。さらに、当業者はこれら方法の１種もしくはそれ以
上を選択して、本発明の範囲を逸脱することなく本発明
のＤＮＡ配列を発現させることができる。

【０１０３】さらに、本発明の選択宿主−発現制御配列
−ベクター組合せにおいて発現された実際のＨＬＡ／Ｄ
Ｒ−β−鎖暗号化配列は、標準のＨＬＡ−ＤＲ−β−鎖
抗原とは同一でない生産物を生成しうることを了解すべ
きである。たとえば、発現された暗号化配列は、ＨＬＡ
−ＤＲ−β−鎖とは無関係なＨＬＡ−ＤＲ−β鎖プラス
メチオニンもしくはその他アミノ酸を暗号化しうるであ
ろう。或いは、発現されたＤＮＡ配列は、ＨＬＡ−ＤＲ
−β鎖の１部のみ、或いはメチオニンもしくはその他の
アミノ酸と共に暗号化しうるであろう。これらの作成お
よび生産物も本発明に包含される。たとえば、ＨＬＡ−
ＤＲ−β−鎖状のポリペプチドを暗号化するヌクレオチ
ド配列により形質転換された宿主は、その化合物のみを
生産しうるか、または他のアミノ酸と融合させうるか、
或いはその生産物を分泌することができる。発酵培養物
から単離した後、または慣用の処理方法、たとえば開
裂、合成結合またはその他周知の方法による処理の後、
生産物がＨＬＡ−ＤＲ−β−鎖抗原の免疫学的もしくは
生物学的活性を示すことのみが必要とされる。

【０１０４】精製後の上記ＨＬＡ−ＤＲ−ポリペプチド
またはそれに対して生成される抗体を使用して、慣用の
ＨＬＡ−ＤＲ判定法もしくはキツトにおいて個体を判定
するのに使用することができ、或いはその他の診断、予
防もしくは治療剤もしくは方法に使用することができ
る。

【０１０５】本発明の方法により作成される微生物およ
び組換ＤＮＡ分子は、メリーランド州・ロツクビル在の
アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンに１９
８２年７月２８日付けで寄託され、かつ次のＤＲ−β−
Ａ、ＤＲ−β−ＢおよびＤＲ−β−Ｃ：

【０１０６】

【化２】

【０１０７】として同定された培養物を例とする。

【０１０８】これら培養物は、それぞれ寄託番号ＡＴＣ
Ｃ３９１６４、３９１６３および３９１６５を得てい
る。

【０１０９】以上、本発明の多くの具体例につき説明し
たが、この基本構成を改変して本発明の方法および組成
物を使用する他の具体例を与えうることが明らかであ
る。したがって、本発明の範囲は上記実施例のみに限定
されることなく、種々の改変をなしうることが了解され
よう。

【０１１０】

【発明の効果】ひとリンパ球抗原複合体のＤＲ−β−鎖
部位の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチ
ドおよびその製造方法並びに診断判定方法および判定用
生産物につき開示する。β−鎖ＤＲ部位を暗号化するＤ
ＮＡ配列は、簡単かつ効率的な判定方法および生産物に
おいて有用であり、かつ診断、予防および治療剤に使用
するＨＬＡ−ＤＲ−β−鎖の抗原の免疫学的もしくは生
物学的活性を示すポリペプチドを発現するのに有用であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】染色体６および短腕上のＨＬＡ部位の位置を示
す略図である。

【図２】本発明のクローン化法における一具体例の略図
である。

【図３】本発明のクローン８３−７，６８−６，ＤＲ−
β₁ ，ＤＲ−β₂ およびＩａ−βの部位制限地図であ
り、この地図に示された制限部位は正確でないが、慣用
のヌクレオチド配列はこれらの部位の正確な位置の決定
を可能にすることを示す。

【図４】ＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａ，ＨＬＡ−ＤＲ−β−
Ｂ，ＨＬＡ−ＤＲ−β−ＣおよびＨＬＡ−ＤＲ−β−Ｄ
のｃＤＮＡ配列の部位制限地図である。

【図５】ｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａの配列決定
方法を示す説明図である。

【図６】ｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａのヌクレオ
チドおよびアミノ酸配列を示す説明図である。

【図７】図６と同じｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａ
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図であ
る。

【図８】図６と同じｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａ
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図であ
る。

【図９】図６と同じｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａ
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図であ
る。

【図１０】ｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａから推測
されるアミノ酸配列と、ＤＲ２の同型接合系から単離さ
れたＩａ抗原β−鎖につきクラツチンにより決定された
アミノ酸配列と、ＤＲ３，Ｗ６細胞系からラールハンマ
ーにより単離されたｃＤＮＡクローンから推測されるア
ミノ酸配列との比較図である。

【図１１】図１０と同じｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β
−Ａから推測されるアミノ酸配列と、ＤＲ２の同型接合
系から単離されたＩａ抗原β−鎖につきクラツチンによ
り決定されたアミノ酸配列と、ＤＲ３，Ｗ６細胞系から
ラールハンマーにより単離されたｃＤＮＡクローンから
推測されるアミノ酸配列との比較図である。

【図１２】図１０と同じｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β
−Ａから推測されるアミノ酸配列と、ＤＲ２の同型接合
系から単離されたＩａ抗原β−鎖につきクラツチンによ
り決定されたアミノ酸配列と、ＤＲ３，Ｗ６細胞系から
ラールハンマーにより単離されたｃＤＮＡクローンから
推測されるアミノ酸配列との比較図である。

【図１３】図１０と同じｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β
−Ａから推測されるアミノ酸配列と、ＤＲ２の同型接合
系から単離されたＩａ抗原β−鎖につきクラツチンによ
り決定されたアミノ酸配列と、ＤＲ３，Ｗ６細胞系から
ラールハンマーにより単離されたｃＤＮＡクローンから
推測されるアミノ酸配列との比較図である。

【図１４】ｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β−Ｂのヌクレ
オチドおよびアミノ酸配列を示す説明図である。

【図１５】図１４と同じｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β
−Ｂのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図で
ある。

【図１６】本発明の判定方法の一具体例を使用して判定
された４種の個体（ＤＲ７／７，６／６，３／６および
１／１）からのＤＮＡのサウザンブロツト図である。

【図１７】ｃＤＮＡクローンＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａおよ
びＨＬＡ−ＤＲ−β−Ｂの暗号化領域間におけるヌクレ
オチド配列不適合の３つの領域を示す説明図であり、黒
丸はヌクレオチド不適合を示し、かつ枠はこれら配列か
ら調製された１９−化合体を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 9453−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 クライア テレス ウエイク アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02145、ソマービル、キッダー ストリー ト 33番

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポリペプチドが汚染ＨＬＡ−ＤＲ因子か
   らフリーであり、かつ発現制御配列に作用結合されたＤ
   ＮＡ挿入物を含有する組換ＤＮＡ分子により形質転換さ
   れた宿主を培養する過程で生産されるヒトリンパ球抗原
   複合体のＨＬＡ−ＤＲ部位の少なくとも１つのβ−鎖抗
   原の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチド
   において、前記ＤＮＡ挿入物は、前記ポリペプチドを暗
   号化し、そして （ａ）ＤＮＡ挿入物ＤＲ−β−Ｃ； （ｂ）前記ＤＮＡ挿入物にヒブリド化するＤＮＡ；およ
   び （ｃ）前記ＤＮＡのいずれかにより暗号化されたポリペ
   プチドを発現に際して暗号化するヌクレオチド配列を有
   するＤＮＡ； よりなる群から選択されることを特徴とするポリペプチ
   ド。
2. 【請求項２】 発現制御配列に作用結合されたＤＮＡ挿
   入物を含有する組換ＤＮＡ分子により形質転換された宿
   主を培養する工程からなるヒトリンパ球抗原複合体のＨ
   ＬＡ−ＤＲ部位の少なくとも１つのβ−鎖抗原の免疫学
   的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドを製造し、
   かつそのポリペプチドを収集する方法において、前記Ｄ
   ＮＡ挿入物は、 （ａ）ＤＮＡ挿入物ＤＲ−β−Ｃ； （ｂ）前記ＤＮＡ挿入物にヒブリド化するＤＮＡ；およ
   び （ｃ）前記ＤＮＡのいずれかにより暗号化されたポリペ
   プチドを発現に際して暗号化するヌクレオチド配列を有
   するＤＮＡ； よりなる群から選択されることを特徴とするポリペプチ
   ドの製造収集方法。
3. 【請求項３】 ＨＬＡ−ＤＲ判定方法において、請求項
   １に記載のポリペプチドまたは前記ポリペプチドに対し
   て生じた抗体を使用することを特徴とする改良方法。
4. 【請求項４】 ＨＬＡ−ＤＲ判定用キットにおいて、請
   求項１に記載のポリペプチドまたはこれらポリペプチド
   に対して生じた抗体を使用することを特徴とする改良
   物。