JPH07238095A - ポリペプチドおよびその製造方法並びに診断判定方法および判定用生産物 - Google Patents
ポリペプチドおよびその製造方法並びに診断判定方法および判定用生産物Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ひとリンパ球抗原複合体のDRβ−鎖部位を
暗号化するDNA配列に関し、診断判定方法および生産
物にこれらDNA配列を使用するものであって、広範囲
の病気に対する個体の感受性および組織もしくは器官移
植物の供与体もしくは受容体としての個体の特性を決定
する際に有用な方法および生産物を得る。 【構成】 ひとリンパ球抗原複合体のDRβ−鎖、すな
わちDR部位の主要な多形質領域を暗号化するDNA配
列に関連するポリペプチド、およびその製造収集方法並
びにこれらポリペプチドに対して生じた抗体を使用する
改良方法および改良物である。
暗号化するDNA配列に関し、診断判定方法および生産
物にこれらDNA配列を使用するものであって、広範囲
の病気に対する個体の感受性および組織もしくは器官移
植物の供与体もしくは受容体としての個体の特性を決定
する際に有用な方法および生産物を得る。 【構成】 ひとリンパ球抗原複合体のDRβ−鎖、すな
わちDR部位の主要な多形質領域を暗号化するDNA配
列に関連するポリペプチド、およびその製造収集方法並
びにこれらポリペプチドに対して生じた抗体を使用する
改良方法および改良物である。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、ひとリンパ球抗原複合
体のDRβ−鎖部位を暗号化するDNA配列に関するも
のである。さらに詳細には、本発明は、診断判定方法お
よび生産物にこれらDNA配列を使用することに関する
ものである。この種の方法および生産物は、広範囲の病
気に対する個体の感受性および組織もしくは器官移植物
の供与体もしくは受容体としての個体の特性を決定する
際に有用である。本発明のDNA配列は、さらにそれら
により暗号化されるポリペプチドの発現においても有用
である。
体のDRβ−鎖部位を暗号化するDNA配列に関するも
のである。さらに詳細には、本発明は、診断判定方法お
よび生産物にこれらDNA配列を使用することに関する
ものである。この種の方法および生産物は、広範囲の病
気に対する個体の感受性および組織もしくは器官移植物
の供与体もしくは受容体としての個体の特性を決定する
際に有用である。本発明のDNA配列は、さらにそれら
により暗号化されるポリペプチドの発現においても有用
である。
【0002】
【従来の技術】ひとリンパ球抗原(「HLA」)系は、
ひとにおける主要な組織適合性複合体である。したがつ
て、これは個体間の組織および器官移植物に対する最も
強いバリヤを構成し、明らかに自己と非自己とを区別す
る。さらに、HLA因子は、広範囲の病気に対する感受
性の増大に関連することが示されている。したがつて、
HLA系の抗原は、広範囲の病気に対する個人の感受性
を決定するための診断判定方法および生産物に使用さ
れ、かつ組織もしくは器官移植物の供与体もしくは受容
体としてのその特性を決定するのに使用される[エフ・
エツチ・バツハおよびジエー・ジエー・バンルード、
N.Engl.J.Med.、第295巻、第806〜
813頁(1976)]。
ひとにおける主要な組織適合性複合体である。したがつ
て、これは個体間の組織および器官移植物に対する最も
強いバリヤを構成し、明らかに自己と非自己とを区別す
る。さらに、HLA因子は、広範囲の病気に対する感受
性の増大に関連することが示されている。したがつて、
HLA系の抗原は、広範囲の病気に対する個人の感受性
を決定するための診断判定方法および生産物に使用さ
れ、かつ組織もしくは器官移植物の供与体もしくは受容
体としてのその特性を決定するのに使用される[エフ・
エツチ・バツハおよびジエー・ジエー・バンルード、
N.Engl.J.Med.、第295巻、第806〜
813頁(1976)]。
【0003】遺伝学的観点から、HLA系はかなり良く
特性化されている。たとえば、エル・ピー・ライダー等
「HLA病関連の遺伝学」、Ann.Rev.Gene
t.、第15巻、第169〜187頁(1981);ジ
エー・エル・ストローミンガー等、「免疫学における主
要な組織適合性複合体の役割」、エル・ドルフ編集、ガ
ーランド SPTM プレス社、第115〜172頁
(1981);テイー・ササズキ等、「主要な組織適合
性複合体における遺伝子と病気感受性との間の関係」、
Ann.Rev.Med.、第28巻、第425〜45
2頁(1977)を参照することができる。これは、染
色体6の短腕における約2センチモルガン(cM)の間
隔内に位置する多かれ少なかれ高度に多形質の一連の部
位からなつている。この系における3つの部位(HLA
−A,BおよびC)は、相互優性的に発現されるアロ抗
原の1種を暗号化する(種類1)。他の部位(HLA−
D/DR)は、高度に識別された多形性を有する相互優
性アロ抗原の第2の種類を暗号化する(種類2)。初期
成分の幾つかを制御する補完成分の他の3つの部位(C
2,C4およびBf因子)も、HLA系に属する(種類
3)。最後に、HLA複合体におけるIaと呼ばれる非
特異的領域が存在する。この領域IaはDR部位に関係
すると思われるが、これとは異なるものである。
特性化されている。たとえば、エル・ピー・ライダー等
「HLA病関連の遺伝学」、Ann.Rev.Gene
t.、第15巻、第169〜187頁(1981);ジ
エー・エル・ストローミンガー等、「免疫学における主
要な組織適合性複合体の役割」、エル・ドルフ編集、ガ
ーランド SPTM プレス社、第115〜172頁
(1981);テイー・ササズキ等、「主要な組織適合
性複合体における遺伝子と病気感受性との間の関係」、
Ann.Rev.Med.、第28巻、第425〜45
2頁(1977)を参照することができる。これは、染
色体6の短腕における約2センチモルガン(cM)の間
隔内に位置する多かれ少なかれ高度に多形質の一連の部
位からなつている。この系における3つの部位(HLA
−A,BおよびC)は、相互優性的に発現されるアロ抗
原の1種を暗号化する(種類1)。他の部位(HLA−
D/DR)は、高度に識別された多形性を有する相互優
性アロ抗原の第2の種類を暗号化する(種類2)。初期
成分の幾つかを制御する補完成分の他の3つの部位(C
2,C4およびBf因子)も、HLA系に属する(種類
3)。最後に、HLA複合体におけるIaと呼ばれる非
特異的領域が存在する。この領域IaはDR部位に関係
すると思われるが、これとは異なるものである。
【0004】HLA系の生物学は、まだ充分に理解され
ていない。種類1の因子は、赤血球以外の全ゆる組織に
分布している。種類2の因子は、実質的にβ−リンパ球
および単核食細胞に限定され、かつ種類3の補完因子は
C3因子、すなわち補完系における重要成分の活性化に
直接関係する。HLA−DR抗原は免疫学的現象、すな
わち免疫反応性、T−細胞抑制、T−細胞およびβ−細
胞の共働ならびにT−細胞と大食細胞の発現に関係する
ものと思われる[ビー・ベナセラフ、「免疫生物学にお
ける主要な組織適合性複合体の役割」、エム・イー・ド
ルフ編、ガーランド SPTM プレス社、第255〜
269頁(1981)]。
ていない。種類1の因子は、赤血球以外の全ゆる組織に
分布している。種類2の因子は、実質的にβ−リンパ球
および単核食細胞に限定され、かつ種類3の補完因子は
C3因子、すなわち補完系における重要成分の活性化に
直接関係する。HLA−DR抗原は免疫学的現象、すな
わち免疫反応性、T−細胞抑制、T−細胞およびβ−細
胞の共働ならびにT−細胞と大食細胞の発現に関係する
ものと思われる[ビー・ベナセラフ、「免疫生物学にお
ける主要な組織適合性複合体の役割」、エム・イー・ド
ルフ編、ガーランド SPTM プレス社、第255〜
269頁(1981)]。
【0005】HLA−DR抗原は2種の非共有結合グリ
コシル化ペプチド鎖、すなわち分子量約35000の重
鎖すなわちα−鎖と分子量約29000の軽鎖すなわち
β−鎖とから構成され、これらは細胞膜を画成する[ス
トロミンガー等、上記;およびライダー等、上記]。細
胞内において、分子量約32000の第3のペプチド鎖
がα−鎖およびβ−鎖に関連する[デー・ジエー・シヤ
ロンおよびエツチ・オー・マツクデビツト、J.Ex
p.Med.、第152巻、第18s〜36s頁(19
80);ストロミンガー、上記]。軽鎖すなわちβ−鎖
はHLA−DR抗原の多形性を有する一方、α−鎖およ
び第3の鎖は種々異なる個体において同一であると思わ
れる[ジー・コルテ等、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA、第78巻、第534〜538頁
(1981);シヤロンおよびマツクデビツト、上
記]。数種の血清学的に異なるHLA−DR抗原が固定
されており(HLA−DR1乃至HLA−DR8)、か
つモノクローン抗体は同型接合細胞系内におけるDR抗
原の1部と定義されている[ヴイ・クワランタ等、ジヤ
ーナル・イミユノロジー、第125巻、第1421〜1
425頁(1980);エス・カレル等、モレキユラ・
イミユノロジー、第18巻、第403〜411頁(19
81)]。さらに、少なくとも2種のDRβ−鎖を、ペ
プチド分析により数種の同型接合細胞系において区別す
ることができる[アール・エス・アコラ等、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA、第78巻、第4
549〜4551頁(1981)]。
コシル化ペプチド鎖、すなわち分子量約35000の重
鎖すなわちα−鎖と分子量約29000の軽鎖すなわち
β−鎖とから構成され、これらは細胞膜を画成する[ス
トロミンガー等、上記;およびライダー等、上記]。細
胞内において、分子量約32000の第3のペプチド鎖
がα−鎖およびβ−鎖に関連する[デー・ジエー・シヤ
ロンおよびエツチ・オー・マツクデビツト、J.Ex
p.Med.、第152巻、第18s〜36s頁(19
80);ストロミンガー、上記]。軽鎖すなわちβ−鎖
はHLA−DR抗原の多形性を有する一方、α−鎖およ
び第3の鎖は種々異なる個体において同一であると思わ
れる[ジー・コルテ等、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA、第78巻、第534〜538頁
(1981);シヤロンおよびマツクデビツト、上
記]。数種の血清学的に異なるHLA−DR抗原が固定
されており(HLA−DR1乃至HLA−DR8)、か
つモノクローン抗体は同型接合細胞系内におけるDR抗
原の1部と定義されている[ヴイ・クワランタ等、ジヤ
ーナル・イミユノロジー、第125巻、第1421〜1
425頁(1980);エス・カレル等、モレキユラ・
イミユノロジー、第18巻、第403〜411頁(19
81)]。さらに、少なくとも2種のDRβ−鎖を、ペ
プチド分析により数種の同型接合細胞系において区別す
ることができる[アール・エス・アコラ等、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA、第78巻、第4
549〜4551頁(1981)]。
【0006】さらに、HLA−DRに近縁であるが同一
でない多形質Ia状の抗原を暗号化する種類の他の部位
も存在する[ジー・コルテ等、ネイチヤー誌、第292
巻、第357〜360頁(1981);ナドラー等、ネ
イチヤー誌、第290巻、第591〜593頁(198
1)]。これらの明確なサブ領域はDCと呼ばれ[アー
ル・トシ等、J.Exp.Med.、第148巻、第1
592〜1611頁(1978);デー・エー・シヤツ
ケルフオード等、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,第78巻、第4566〜4570頁(19
81)]、さらにSBと呼ばれる[エス・ジヨー等、
J.Exp.Med.、第156巻、第731〜743
頁(1982)]。DC抗原は、DR抗原との強い結合
不均衡にある。SB抗原は、二次的リンパ球反応を制御
しかつDR部位に対し中心的な領域で暗号化される。
でない多形質Ia状の抗原を暗号化する種類の他の部位
も存在する[ジー・コルテ等、ネイチヤー誌、第292
巻、第357〜360頁(1981);ナドラー等、ネ
イチヤー誌、第290巻、第591〜593頁(198
1)]。これらの明確なサブ領域はDCと呼ばれ[アー
ル・トシ等、J.Exp.Med.、第148巻、第1
592〜1611頁(1978);デー・エー・シヤツ
ケルフオード等、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,第78巻、第4566〜4570頁(19
81)]、さらにSBと呼ばれる[エス・ジヨー等、
J.Exp.Med.、第156巻、第731〜743
頁(1982)]。DC抗原は、DR抗原との強い結合
不均衡にある。SB抗原は、二次的リンパ球反応を制御
しかつDR部位に対し中心的な領域で暗号化される。
【0007】現在、HLA−DR抗原は、抗血清での沈
殿により血清学的に単離される。したがつて、HLA−
DR決定子の正確な性質は未確定である。しかしなが
ら、これらの抗原は、組織もしくは器官移植物に対する
供与体および受容体の適合性を決定するための、或いは
広範囲の病気に対する個体の感受性を決定するための判
定方法および生産物に使用されている。たとえば、ライ
ダー等(上記)は、DR1乃至DR8判定に基づく次の
病気の感受性を報告している:
殿により血清学的に単離される。したがつて、HLA−
DR決定子の正確な性質は未確定である。しかしなが
ら、これらの抗原は、組織もしくは器官移植物に対する
供与体および受容体の適合性を決定するための、或いは
広範囲の病気に対する個体の感受性を決定するための判
定方法および生産物に使用されている。たとえば、ライ
ダー等(上記)は、DR1乃至DR8判定に基づく次の
病気の感受性を報告している:
【0008】
【表1】
【0009】これらの判定から判かるように、D/DR
4につき陽性と判定された個体は、D/DR4につき陰
性と判定された個体よりも6.4倍高いインシユリン依
存性糖尿病を発生する危険がある。
4につき陽性と判定された個体は、D/DR4につき陰
性と判定された個体よりも6.4倍高いインシユリン依
存性糖尿病を発生する危険がある。
【0010】或る場合には、さらに病気関連性の抗原を
有する患者において、この抗原を持たない患者における
よりもその病気が重度であることも示されている。たと
えば、多発性硬化症の経過は、D/DR2陰性の患者に
おけるよりもD/DR2陽性の患者においてより急速で
ある。さらに、或る種の病気の再発は、病気関連性抗原
につき陽性の患者においてより一般的である。要する
に、HLA−DR判定は、診断上および予測上の大きな
価値を有する。
有する患者において、この抗原を持たない患者における
よりもその病気が重度であることも示されている。たと
えば、多発性硬化症の経過は、D/DR2陰性の患者に
おけるよりもD/DR2陽性の患者においてより急速で
ある。さらに、或る種の病気の再発は、病気関連性抗原
につき陽性の患者においてより一般的である。要する
に、HLA−DR判定は、診断上および予測上の大きな
価値を有する。
【0011】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この種
の判定方法および生産物の使用、ならびにこれらが許容
しうる移植供与体および受容体と病気感受性の個体とを
同定する際もたらす重要な利点は著しく制約されてい
る。何故なら、現在の判定方法は複雑かつ時間のかかる
ものであり、またこの種の判定方法および生産物に対す
る有用かつ経済的な原料を供給するために入手しうるH
LA−DR抗原が不充分であるからである。
の判定方法および生産物の使用、ならびにこれらが許容
しうる移植供与体および受容体と病気感受性の個体とを
同定する際もたらす重要な利点は著しく制約されてい
る。何故なら、現在の判定方法は複雑かつ時間のかかる
ものであり、またこの種の判定方法および生産物に対す
る有用かつ経済的な原料を供給するために入手しうるH
LA−DR抗原が不充分であるからである。
【0012】
【課題を解決するための手段】本発明は、ひとリンパ球
抗原複合体のDR−β−鎖、すなわちDR部位の主要な
多形質領域を暗号化するDNA配列に関連するポリペプ
チドおよびその製造方法並びにこれらポリペプチドに対
して生じた抗体を使用する改良方法および改良物を提供
することにより上記の問題を解決する。
抗原複合体のDR−β−鎖、すなわちDR部位の主要な
多形質領域を暗号化するDNA配列に関連するポリペプ
チドおよびその製造方法並びにこれらポリペプチドに対
して生じた抗体を使用する改良方法および改良物を提供
することにより上記の問題を解決する。
【0013】
【作用】本発明により、HLA−DR軽鎖すなわちβ−
鎖を暗号化するDNA配列がHLA−DR判定方法およ
び生産物に使用するため初めて入手しうるようになっ
た。本発明のDNA配列は経済的かつ多量に生産されう
るだけでなく、判定方法および生産物におけるその使用
は前記HLA−DR抗原に基づく判定方法および生産物
を相当に単純化させかつそのコストを低減させる。たと
えば、本発明のDNA判定方法は簡単であり、10〜2
0ml程度に少ない血液で行うことができ、かつ数千回
の判定まで容易に規模拡大することができる。
鎖を暗号化するDNA配列がHLA−DR判定方法およ
び生産物に使用するため初めて入手しうるようになっ
た。本発明のDNA配列は経済的かつ多量に生産されう
るだけでなく、判定方法および生産物におけるその使用
は前記HLA−DR抗原に基づく判定方法および生産物
を相当に単純化させかつそのコストを低減させる。たと
えば、本発明のDNA判定方法は簡単であり、10〜2
0ml程度に少ない血液で行うことができ、かつ数千回
の判定まで容易に規模拡大することができる。
【0014】最後に、本発明のDNA配列は、適当な宿
主におけるこれら配列の発現ならびにそれらにより暗号
化される特異的DRβ−鎖抗原の生産を他のHLA−D
R因子により汚染されることなく可能にし、これらを診
断剤、予防剤または治療剤として使用することを可能に
する。
主におけるこれら配列の発現ならびにそれらにより暗号
化される特異的DRβ−鎖抗原の生産を他のHLA−D
R因子により汚染されることなく可能にし、これらを診
断剤、予防剤または治療剤として使用することを可能に
する。
【0015】
【実施例】本発明を一層充分に理解しうるよう、以下詳
細に説明する。本発明において次の用語を使用する。
細に説明する。本発明において次の用語を使用する。
【0016】ヌクレオチド:糖成分(ペントース)と燐
酸と含窒素複素環式塩基とよりなるDNAもしくはRN
Aのモノマ単位。この塩基はグリコシド炭素(ペントー
スの1´炭素)を介して糖成分に結合され、塩基と糖と
のこの結合をヌクレオチドと呼ぶ。塩基はヌクレオチド
を特性化する。4種のDNA塩基はアデニン
(「A」),グアニン(「G」),シトシン(「C」)
およびチミン(「T」)である。4種のRNA塩基は
A,G,Cおよびウラシル(「U」)である。
酸と含窒素複素環式塩基とよりなるDNAもしくはRN
Aのモノマ単位。この塩基はグリコシド炭素(ペントー
スの1´炭素)を介して糖成分に結合され、塩基と糖と
のこの結合をヌクレオチドと呼ぶ。塩基はヌクレオチド
を特性化する。4種のDNA塩基はアデニン
(「A」),グアニン(「G」),シトシン(「C」)
およびチミン(「T」)である。4種のRNA塩基は
A,G,Cおよびウラシル(「U」)である。
【0017】DNA配列:隣接するペントースの3´炭
素と5´炭素との間のホスホジエステル結合により互い
に結合されたヌクレオチドの線状列。
素と5´炭素との間のホスホジエステル結合により互い
に結合されたヌクレオチドの線状列。
【0018】コドン:mRNAを介してアミノ酸、翻訳
開始信号または翻訳停止信号を暗号化する3個のヌクレ
オチド(トリプレツト)のDNA配列。たとえば、ヌク
レオチドトリプレツトTTA,TTG,CTT,CT
C,CTAおよびCTGはアミノ酸ロイシン(「Le
u」)を暗号化し、TAG,TAAおよびTGAは翻訳
停止信号であり、かつATGは翻訳開始信号である。
開始信号または翻訳停止信号を暗号化する3個のヌクレ
オチド(トリプレツト)のDNA配列。たとえば、ヌク
レオチドトリプレツトTTA,TTG,CTT,CT
C,CTAおよびCTGはアミノ酸ロイシン(「Le
u」)を暗号化し、TAG,TAAおよびTGAは翻訳
停止信号であり、かつATGは翻訳開始信号である。
【0019】読枠:mRNAをアミノ酸配列に翻訳する
際のコドンのグループ。翻訳する際、適切な読枠を維持
しなければならない。たとえば、配列GCTGGTTG
TAAGは3つの読枠もしくは相に翻訳することがで
き、そのおのおのは次の異なるアミノ酸配列を与える:
際のコドンのグループ。翻訳する際、適切な読枠を維持
しなければならない。たとえば、配列GCTGGTTG
TAAGは3つの読枠もしくは相に翻訳することがで
き、そのおのおのは次の異なるアミノ酸配列を与える:
【0020】
【化1】
【0021】ポリペプチド:隣接するアミノ酸のαアミ
ノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合により互いに
結合されたアミノ酸の線状列。
ノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合により互いに
結合されたアミノ酸の線状列。
【0022】ゲノム:細胞もしくはウイルスの全DN
A。これは特に細胞もしくはウイルスのポリペプチドを
暗号化する遺伝子、ならびにそのオペレータ、プロモー
タおよびたとえばシヤイン−ダルガルノ配列のような配
列を含むリボソーム結合および相互作用配列を包含す
る。
A。これは特に細胞もしくはウイルスのポリペプチドを
暗号化する遺伝子、ならびにそのオペレータ、プロモー
タおよびたとえばシヤイン−ダルガルノ配列のような配
列を含むリボソーム結合および相互作用配列を包含す
る。
【0023】遺伝子:雛型もしくはメツセンジャRNA
(「mRNA」)を介して特異的ポリペプチドに特性的
なアミノ酸の配列を暗号化するDNA配列。
(「mRNA」)を介して特異的ポリペプチドに特性的
なアミノ酸の配列を暗号化するDNA配列。
【0024】転写:遺伝子もしくはDNA配列からmR
NAを生成する過程。
NAを生成する過程。
【0025】翻訳:mRNAからポリペプチドを生成す
る過程。
る過程。
【0026】発現:ポリペプチドを生成するためDNA
配列もしくは遺伝子により行なわれる過程。これは転写
と翻訳との組合せである。
配列もしくは遺伝子により行なわれる過程。これは転写
と翻訳との組合せである。
【0027】プラスミド:完全「レプリコン」からなる
非染色体二重鎖DNA配列であつて、このプラスミドは
宿主細胞において複製される。プラスミドを単細胞生物
内に挿入すると、この生物の特性をプラスミドのDNA
の結果として変化もしくは形質転換させることができ
る。たとえば、テトラサイクリン耐性(TetR )に対
する遺伝子を有するプラスミドは、予めテトラサイクリ
ンに対し感受性の細胞をこれに耐性である細胞に形質転
換させる。プラスミドにより形質転換された細胞を「形
質転換体」と呼ぶ。
非染色体二重鎖DNA配列であつて、このプラスミドは
宿主細胞において複製される。プラスミドを単細胞生物
内に挿入すると、この生物の特性をプラスミドのDNA
の結果として変化もしくは形質転換させることができ
る。たとえば、テトラサイクリン耐性(TetR )に対
する遺伝子を有するプラスミドは、予めテトラサイクリ
ンに対し感受性の細胞をこれに耐性である細胞に形質転
換させる。プラスミドにより形質転換された細胞を「形
質転換体」と呼ぶ。
【0028】フアージもしくはバクテリオフアージ:細
菌性ウイルスであつて、その多くは蛋白質エンベロプも
しくはコートにカプセル化されたDNA配列よりなつて
いる(「カプシド蛋白質」)。
菌性ウイルスであつて、その多くは蛋白質エンベロプも
しくはコートにカプセル化されたDNA配列よりなつて
いる(「カプシド蛋白質」)。
【0029】クローン化ベヒクル:プラスミド、フアー
ジDNAまたはその他のDNA配列であつて、これは宿
主細胞中に複製することができ、被覆蛋白質の複製およ
び生産のようなDNAの本質的生物機能の喪失を伴なう
ことなくまたはプロモータもしくは結合部位の喪失を伴
なうことなくDNA配列を決定可能に切断しうる1個も
しくは少数のエンドヌクレアーゼ識別部位により特性化
され、かつ形質変換細胞の同定に使用するのに適した標
識、たとえばテトラサイクリン耐性もしくはアンピシリ
ン耐性を有する。クローン化ベヒクルはしばしばベクタ
ーと呼ばれる。クローン化 :生物の集落またはこの種の生物もしくは配
列から無性増殖により生成されるDNA配列を得るため
の過程。
ジDNAまたはその他のDNA配列であつて、これは宿
主細胞中に複製することができ、被覆蛋白質の複製およ
び生産のようなDNAの本質的生物機能の喪失を伴なう
ことなくまたはプロモータもしくは結合部位の喪失を伴
なうことなくDNA配列を決定可能に切断しうる1個も
しくは少数のエンドヌクレアーゼ識別部位により特性化
され、かつ形質変換細胞の同定に使用するのに適した標
識、たとえばテトラサイクリン耐性もしくはアンピシリ
ン耐性を有する。クローン化ベヒクルはしばしばベクタ
ーと呼ばれる。クローン化 :生物の集落またはこの種の生物もしくは配
列から無性増殖により生成されるDNA配列を得るため
の過程。
【0030】組換DNA分子もしくはヒブリドDNA:
異なるゲノムからのDNAの断片よりなる分子であつ
て、前記ゲノムは生細胞の外部で末端結合されておりか
つ幾つかの宿主細胞に感染してそこに維持される能力を
有する。
異なるゲノムからのDNAの断片よりなる分子であつ
て、前記ゲノムは生細胞の外部で末端結合されておりか
つ幾つかの宿主細胞に感染してそこに維持される能力を
有する。
【0031】発現制御配列:DNA配列もしくは遺伝子
の発現を、これら配列もしくは遺伝子に作用結合された
際、制御および調整するヌクレオチドの配列。これらは
lac系,trp系、フアージλの主オペレータおよび
プロモータ領域、fdコート蛋白質の制御領域ならびに
原始核もしくは成熟核細胞またはそのウイルスの遺伝子
の発現を制御することが知られたその他の配列を包含す
る。
の発現を、これら配列もしくは遺伝子に作用結合された
際、制御および調整するヌクレオチドの配列。これらは
lac系,trp系、フアージλの主オペレータおよび
プロモータ領域、fdコート蛋白質の制御領域ならびに
原始核もしくは成熟核細胞またはそのウイルスの遺伝子
の発現を制御することが知られたその他の配列を包含す
る。
【0032】図1は、染色体6ならびにこの染色体の短
腕におけるHLA部位の位置の略図である。HLA系の
複雑性に鑑み、種々のIa状抗原と種々のHLA−DR
抗原自身とを区別しうるmRNA翻訳分析を開発するこ
とが重要であつた。
腕におけるHLA部位の位置の略図である。HLA系の
複雑性に鑑み、種々のIa状抗原と種々のHLA−DR
抗原自身とを区別しうるmRNA翻訳分析を開発するこ
とが重要であつた。
【0033】例えば、うさぎ網状赤血球溶解物系のよう
な無細胞翻訳系は重合蛋白質を構成しない。他方、有爪
蛙ゼノプス・レビス(Xenopus laevis)
の卵細胞が各種蛋白質に対する翻訳系として使用されて
いる。したがつて、この系を選択して、DR抗原を暗号
化するmRNAにつき分析した。この系を使用して、H
LA−DR抗原の3つのポリペプチド鎖が卵細胞で組立
てられかつこれらから抗−DRモノクローン抗体により
免疫沈殿させうることを示した。したがつて、この卵細
胞系は、mRNA暗号化DR抗原を選択する方法を与え
る。
な無細胞翻訳系は重合蛋白質を構成しない。他方、有爪
蛙ゼノプス・レビス(Xenopus laevis)
の卵細胞が各種蛋白質に対する翻訳系として使用されて
いる。したがつて、この系を選択して、DR抗原を暗号
化するmRNAにつき分析した。この系を使用して、H
LA−DR抗原の3つのポリペプチド鎖が卵細胞で組立
てられかつこれらから抗−DRモノクローン抗体により
免疫沈殿させうることを示した。したがつて、この卵細
胞系は、mRNA暗号化DR抗原を選択する方法を与え
る。
【0034】上記分析で同定されたmRNA暗号化DR
抗原の豊富なフラクシヨンを使用して、mRNAからc
DNAを調製し、これをクローン化させかつ選択し、そ
して本発明のDRβ−鎖抗原を暗号化するDNA配列を
含むクローンを単離した。次いで、これらDNA配列を
本発明の方法および生産物に使用して、組織および器官
移植物に対する適合性を決定すると共に各種の病気に対
する個体の感受性増大を決定した。さらに、これらDN
A配列を適当な宿主に使用して、それらの暗号化する抗
原を他のHLA−DR因子により実質的に汚染されるこ
となく生成させるのに有用であり、病気の診断、治療お
よび予防に使用することができる。
抗原の豊富なフラクシヨンを使用して、mRNAからc
DNAを調製し、これをクローン化させかつ選択し、そ
して本発明のDRβ−鎖抗原を暗号化するDNA配列を
含むクローンを単離した。次いで、これらDNA配列を
本発明の方法および生産物に使用して、組織および器官
移植物に対する適合性を決定すると共に各種の病気に対
する個体の感受性増大を決定した。さらに、これらDN
A配列を適当な宿主に使用して、それらの暗号化する抗
原を他のHLA−DR因子により実質的に汚染されるこ
となく生成させるのに有用であり、病気の診断、治療お
よび予防に使用することができる。
【0035】ポリA+ RNAを含有するHLA−DRの
調製 10%胎児牛血清とグルタミンとゲンタマイシンとを補
充したRPMI1640培地において、ひとβリンパ芽
球細胞系、すなわちラジ細胞(2種のDR遺伝子、DR
3およびDR6を有する異型接合細胞系)を増殖させた
(これについてはエス・カレル等によりモレキユラ・イ
ミユノロジー、第18巻、第403〜411頁(198
1)に実質的に記載されている)。細胞の生成物を追跡
するための標識を与えるため、50×106 個の細胞当
り1mCiのS35−メチオニンを補充した完成メチオニ
ン非含有培地において、2×106 個の細胞1mlの濃
度にて37℃で16時間培養することにより細胞を代謝
標識した。分析用として非グリコシル化DR分子を得る
ため、S35−メチオユンを添加する2時間前に2μg/
mlのツニカマイシンを添加した。
調製 10%胎児牛血清とグルタミンとゲンタマイシンとを補
充したRPMI1640培地において、ひとβリンパ芽
球細胞系、すなわちラジ細胞(2種のDR遺伝子、DR
3およびDR6を有する異型接合細胞系)を増殖させた
(これについてはエス・カレル等によりモレキユラ・イ
ミユノロジー、第18巻、第403〜411頁(198
1)に実質的に記載されている)。細胞の生成物を追跡
するための標識を与えるため、50×106 個の細胞当
り1mCiのS35−メチオニンを補充した完成メチオニ
ン非含有培地において、2×106 個の細胞1mlの濃
度にて37℃で16時間培養することにより細胞を代謝
標識した。分析用として非グリコシル化DR分子を得る
ため、S35−メチオユンを添加する2時間前に2μg/
mlのツニカマイシンを添加した。
【0036】凍結細胞ペレツトを、氷冷した溶解緩衝液
(10mMトリス−HCl(pH7.6)、0.1M
NaCl、1%ノニデツトP40)(1ml緩衝液/1
08個細胞)において1分間隔で15秒間4回乱流させ
ることにより溶解させ、そしてこの溶解した細胞をベツ
クマンJ−6型遠心分離器(4500×g)にて遠心分
離した(4℃、4min、4000rpm)。次いで、
4mlの細胞質上澄液を次の濃度勾配にてSW41ポリ
アロマー管に加えた:10mMトリス−HCl(pH
7.4)、1mM EDTAにおける2ml CsCl
(5.7M);20mMトリス−HCl(pH7.
4)、2mM EDTAにおける40%〜20%(W/
V)の直線濃度におけるCsCl4.2ml;および2
0mMトリス−HCl(pH7.4),0.1M Na
Cl,4mM EDTAにおける5%(W/V)蔗糖溶
液0.8ml。14℃にて濃度勾配を均衡化させた後、
RNAをパレツト化させた(14℃、14時間、370
00rpm)。大型RNA調製物につき、SW27チユ
ーブを14℃にて26000rpmで16時間使用し
た。
(10mMトリス−HCl(pH7.6)、0.1M
NaCl、1%ノニデツトP40)(1ml緩衝液/1
08個細胞)において1分間隔で15秒間4回乱流させ
ることにより溶解させ、そしてこの溶解した細胞をベツ
クマンJ−6型遠心分離器(4500×g)にて遠心分
離した(4℃、4min、4000rpm)。次いで、
4mlの細胞質上澄液を次の濃度勾配にてSW41ポリ
アロマー管に加えた:10mMトリス−HCl(pH
7.4)、1mM EDTAにおける2ml CsCl
(5.7M);20mMトリス−HCl(pH7.
4)、2mM EDTAにおける40%〜20%(W/
V)の直線濃度におけるCsCl4.2ml;および2
0mMトリス−HCl(pH7.4),0.1M Na
Cl,4mM EDTAにおける5%(W/V)蔗糖溶
液0.8ml。14℃にて濃度勾配を均衡化させた後、
RNAをパレツト化させた(14℃、14時間、370
00rpm)。大型RNA調製物につき、SW27チユ
ーブを14℃にて26000rpmで16時間使用し
た。
【0037】チユーブからRNAを回収するため、チユ
ーブを転倒させそして底部を切除した。次いで、RNA
を10mMトリス−HCl(pH7.4)、1mM E
DTAに溶解させ、混合物を0.3M酢酸ナトリウム
(pH5.0)に調整しそしてRNAを2容量のエタノ
ールで沈殿させた。再びRNAを10mMトリス−HC
l(pH7.4)、1mM EDTAおよび1%SDS
に溶解させ、これを100℃にて2分間加熱し、そして
混合物を室温まで冷却した。1容量の10mMトリス−
HCl(pH7.4)、1mM EDTA、1M Na
Clを加えた後、RNAをオリゴ(dT)セルロースカ
ラム(コラポラテイブ・リサーチ社)に加え、そしてポ
リA+ RNAフラクシヨンをH2 Oで溶出させそしてこ
れをEDTAの不存在下にエタノールで2回沈殿させた
(図2)。
ーブを転倒させそして底部を切除した。次いで、RNA
を10mMトリス−HCl(pH7.4)、1mM E
DTAに溶解させ、混合物を0.3M酢酸ナトリウム
(pH5.0)に調整しそしてRNAを2容量のエタノ
ールで沈殿させた。再びRNAを10mMトリス−HC
l(pH7.4)、1mM EDTAおよび1%SDS
に溶解させ、これを100℃にて2分間加熱し、そして
混合物を室温まで冷却した。1容量の10mMトリス−
HCl(pH7.4)、1mM EDTA、1M Na
Clを加えた後、RNAをオリゴ(dT)セルロースカ
ラム(コラポラテイブ・リサーチ社)に加え、そしてポ
リA+ RNAフラクシヨンをH2 Oで溶出させそしてこ
れをEDTAの不存在下にエタノールで2回沈殿させた
(図2)。
【0038】緩衝液系(25mMクエン酸ナトリウムに
おける6M尿素(pH3.8)を用いてポリA+ RNA
をアルガロース−尿素ゲルにおいて寸法分画した(これ
についてはローゼン等により、バイオケミストリー(ワ
シントン)、第14巻、第69〜78頁(1975)に
実質的に記載されている)(図2)。この緩衝液系は高
能力および高分解能の分画化によく適している。さら
に、これは充分に変性する[エツチ・レーラツハ等、バ
イオケミストリー、第16巻、第4743〜4751頁
(1977)]。
おける6M尿素(pH3.8)を用いてポリA+ RNA
をアルガロース−尿素ゲルにおいて寸法分画した(これ
についてはローゼン等により、バイオケミストリー(ワ
シントン)、第14巻、第69〜78頁(1975)に
実質的に記載されている)(図2)。この緩衝液系は高
能力および高分解能の分画化によく適している。さら
に、これは充分に変性する[エツチ・レーラツハ等、バ
イオケミストリー、第16巻、第4743〜4751頁
(1977)]。
【0039】ポリA+ RNAの分画化を行なうため、5
00μgのポリA+ RNAを100μlの10mMトリ
ス−HCl(pH7.4)、1mM EDTA、0.5
%SDSに溶解させ、200μlのDMSO(99%)
を加え、そしてこの溶液を1mM EDTAおよびpH
8.0に調整した。次いで、この溶液を45℃にて5分
間加熱し、4×0.5cmのスロツトに加えた(2.5
%アガロースゲル)。このゲルをブロムフエノールブル
ーがゲルの底部に達するまで冷所中で36時間電気泳動
にかけた。種々の寸法のフラクシヨン(700×160
0ヌクレオチド長さ)を得るため、2mmのスライスを
ゲルに沿って切断し、これらフラクシヨンを4mlの1
0mMトリス−HCl(pH7.4)、10mM ED
TA、0.5%NaCl,0.1mg/mlイー・コリ
tRNAにおいてウルトラ−ツラツクスで分散させた。
分散懸濁物を0.5%SDSまで調整した後、これを1
晩振とうし、次いでポリA+ RNAを上澄液からオリゴ
(dT)−セルロース小カラムにおけるクロマトグラフ
イーにより単離し、そしてこれをEDTAの不存在下に
エタノールで2回沈殿させた。調製ゲル電気泳動の前
に、資料中に3´末端標識されたラジmRNAを含ませ
ることにより回収を監視した。
00μgのポリA+ RNAを100μlの10mMトリ
ス−HCl(pH7.4)、1mM EDTA、0.5
%SDSに溶解させ、200μlのDMSO(99%)
を加え、そしてこの溶液を1mM EDTAおよびpH
8.0に調整した。次いで、この溶液を45℃にて5分
間加熱し、4×0.5cmのスロツトに加えた(2.5
%アガロースゲル)。このゲルをブロムフエノールブル
ーがゲルの底部に達するまで冷所中で36時間電気泳動
にかけた。種々の寸法のフラクシヨン(700×160
0ヌクレオチド長さ)を得るため、2mmのスライスを
ゲルに沿って切断し、これらフラクシヨンを4mlの1
0mMトリス−HCl(pH7.4)、10mM ED
TA、0.5%NaCl,0.1mg/mlイー・コリ
tRNAにおいてウルトラ−ツラツクスで分散させた。
分散懸濁物を0.5%SDSまで調整した後、これを1
晩振とうし、次いでポリA+ RNAを上澄液からオリゴ
(dT)−セルロース小カラムにおけるクロマトグラフ
イーにより単離し、そしてこれをEDTAの不存在下に
エタノールで2回沈殿させた。調製ゲル電気泳動の前
に、資料中に3´末端標識されたラジmRNAを含ませ
ることにより回収を監視した。
【0040】種々のポリA+ RNAフラクシヨンのHL
A−DR活性(もしあれば)を分析するため、このRN
Aを卵細胞中に移殖し、そして生成物を3種のモノクロ
ーン抗体D1 −12,D4 −22およびBT2.2 *で免疫沈
殿させた。この分析において、段階6の卵細胞をゼノプ
ス・レビスの卵巣から、CA++を含有しないOR2培地
における0.2%粗製コラゲナーゼ(シグマー社C−0
130)中で攪拌しながら室温にて90〜120分間培
養した後単離した[ワラツク等、J.Exp.Zoo
l.、第184巻、第321〜334頁(197
3)]。次いでこれら卵細胞に20ngのポリA+ RN
Aの50nlを注入し(これについてはヴイ・エー・モ
ア、ジヤーナル・モレキユラー・バイオロジー、第61
巻、第63〜103頁(1971)に実質的に記載され
ている)、そしてこれを0.5m Ci/mlのS35−
メチオニンと50単位/mlペニシリンとストレブトマ
イシンとを含有するOR2培地において24時間培養し
た。培養後、卵細胞をホモゲナイズした(これについて
はランジヤーおよびツアラーによりProc.Nat
l.Acad.Sci.USA、第75巻、第6073
〜6077頁(1978)に実質的に記載されてい
る)。ただし1mlの緩衝液を50個の卵細胞当りに使
用した**。
A−DR活性(もしあれば)を分析するため、このRN
Aを卵細胞中に移殖し、そして生成物を3種のモノクロ
ーン抗体D1 −12,D4 −22およびBT2.2 *で免疫沈
殿させた。この分析において、段階6の卵細胞をゼノプ
ス・レビスの卵巣から、CA++を含有しないOR2培地
における0.2%粗製コラゲナーゼ(シグマー社C−0
130)中で攪拌しながら室温にて90〜120分間培
養した後単離した[ワラツク等、J.Exp.Zoo
l.、第184巻、第321〜334頁(197
3)]。次いでこれら卵細胞に20ngのポリA+ RN
Aの50nlを注入し(これについてはヴイ・エー・モ
ア、ジヤーナル・モレキユラー・バイオロジー、第61
巻、第63〜103頁(1971)に実質的に記載され
ている)、そしてこれを0.5m Ci/mlのS35−
メチオニンと50単位/mlペニシリンとストレブトマ
イシンとを含有するOR2培地において24時間培養し
た。培養後、卵細胞をホモゲナイズした(これについて
はランジヤーおよびツアラーによりProc.Nat
l.Acad.Sci.USA、第75巻、第6073
〜6077頁(1978)に実質的に記載されてい
る)。ただし1mlの緩衝液を50個の卵細胞当りに使
用した**。
【0041】* これらのモノクローン抗体およびその
活性は既に報告されている[エス・カレル等、モレキユ
ラ・イミユノロジー、第18巻、第403〜411頁
(1981)(D1 −12,D4 −22);アール・エス・
アコラ等、ヨーロピアン・ジヤーナル・イミユノロジ
ー、第12巻、第166〜169頁(1982)(BT
2.2)]。** 分析用として非グリコシル化生成物を調製するた
め、卵細胞を50μg/mlのツニカマイシンの存在下
で培養し、これらに40μg/mlのツニカマイシンを
含有するRNA(50nl)を注入し、そして5μg/
mlのツニカマイシンを含有するDR培地において24
時間培養した。これについてはコールマン等により、ヨ
ーロピアン・ジヤーナル・バイオケミストリー、第11
3巻、第339〜348頁(1981)に実質的に記載
されている。
活性は既に報告されている[エス・カレル等、モレキユ
ラ・イミユノロジー、第18巻、第403〜411頁
(1981)(D1 −12,D4 −22);アール・エス・
アコラ等、ヨーロピアン・ジヤーナル・イミユノロジ
ー、第12巻、第166〜169頁(1982)(BT
2.2)]。** 分析用として非グリコシル化生成物を調製するた
め、卵細胞を50μg/mlのツニカマイシンの存在下
で培養し、これらに40μg/mlのツニカマイシンを
含有するRNA(50nl)を注入し、そして5μg/
mlのツニカマイシンを含有するDR培地において24
時間培養した。これについてはコールマン等により、ヨ
ーロピアン・ジヤーナル・バイオケミストリー、第11
3巻、第339〜348頁(1981)に実質的に記載
されている。
【0042】卵細胞ホモゲナイズ物からの上澄液を0.
15M NaCl、0.25%ノニデツトP40により
2mlに調整し、そしてこれをレンチルレクチン−セフ
アローズ(フアルマシア社)の1mlカラムに加えた。
このカラムを同じ緩衝液で激しく洗浄した後、0.1M
α−メチルマノシドを含有する同じ緩衝液でグリコシル
化物質を溶出させた(1.3%S35−メチオニン含有物
を合併フラクシヨン中に溶出させた)。その後のクロー
ン化実験においてはレンチルカラムを省略した。
15M NaCl、0.25%ノニデツトP40により
2mlに調整し、そしてこれをレンチルレクチン−セフ
アローズ(フアルマシア社)の1mlカラムに加えた。
このカラムを同じ緩衝液で激しく洗浄した後、0.1M
α−メチルマノシドを含有する同じ緩衝液でグリコシル
化物質を溶出させた(1.3%S35−メチオニン含有物
を合併フラクシヨン中に溶出させた)。その後のクロー
ン化実験においてはレンチルカラムを省略した。
【0043】次いで、レンチルレクチンカラムからのグ
リコシル化物質をトリス−HCl(pH7.0)および
1%アブロテニン(シグマ社)にpH8.0に調整し、
そして1ml当り20μlのPX63腹水液を加えた。
冷所中で2時間以上培養しかつ過剰の蛋白質A−セフア
ロース(フアルマシア社)の存在下でさらに2時間培養
した後、1ml当り20μlの抗−DRモノクローン抗
体(D1 −12,D4−22,BT2.2 )の混合物を腹水液
として加えた。これは注入した卵細胞当り1μlの腹水
液に相当する。4℃にて1晩培養した後、試料を3分間
遠心分離し(エツペンドルフマイクロ分離器)、そして
ペレツトを捨てた。この遠心分離は、分析における凝集
物質に基づく大きいバツクグランドを避けるために重要
である。
リコシル化物質をトリス−HCl(pH7.0)および
1%アブロテニン(シグマ社)にpH8.0に調整し、
そして1ml当り20μlのPX63腹水液を加えた。
冷所中で2時間以上培養しかつ過剰の蛋白質A−セフア
ロース(フアルマシア社)の存在下でさらに2時間培養
した後、1ml当り20μlの抗−DRモノクローン抗
体(D1 −12,D4−22,BT2.2 )の混合物を腹水液
として加えた。これは注入した卵細胞当り1μlの腹水
液に相当する。4℃にて1晩培養した後、試料を3分間
遠心分離し(エツペンドルフマイクロ分離器)、そして
ペレツトを捨てた。この遠心分離は、分析における凝集
物質に基づく大きいバツクグランドを避けるために重要
である。
【0044】次いで、蛋白質A−セフアロースを上澄液
に加え、そして培養を4時間続けた。遠心分離により免
疫沈殿物を集め(マイクロ分離)、約400μlの50
mMトリス−HCl(pH7.4)、5mM EDT
A、0.15M NaCl、1%ノニデツトP40、1
0mMメチオニン、1%アブロテニンで2回洗浄し、約
400μlの同じ緩衝液(ただしアブロテニンと0.1
5M NaClとを含有せず、0.5MのNaClを含
有する)で3回、さらに約400μlの10mMトリス
−HCl(pH7.4)、1mM EDTA、0.15
M NaCl、0.5%ノニデツトP40で2回洗浄し
た。
に加え、そして培養を4時間続けた。遠心分離により免
疫沈殿物を集め(マイクロ分離)、約400μlの50
mMトリス−HCl(pH7.4)、5mM EDT
A、0.15M NaCl、1%ノニデツトP40、1
0mMメチオニン、1%アブロテニンで2回洗浄し、約
400μlの同じ緩衝液(ただしアブロテニンと0.1
5M NaClとを含有せず、0.5MのNaClを含
有する)で3回、さらに約400μlの10mMトリス
−HCl(pH7.4)、1mM EDTA、0.15
M NaCl、0.5%ノニデツトP40で2回洗浄し
た。
【0045】次いで、免疫沈殿物を25μlの0.5M
トリス−HCl(pH8.8)、1M蔗糖、5mM E
DTA、0.01%ブロムフエトルブルー、3%SDS
および8.3mMジチオスレイトールの中に100℃に
て3分間加熱することにより溶解させ、そしてこの溶液
を12%ポリアクリルアミドSDSゲルに加えた。この
ゲルを二次元で電気泳動にかけ、第一次元においては非
平衡pH濃度勾配の電気泳動にかけた(これについては
ピー・ゼツト・オーフアレル等、セル誌、第12巻、第
1133〜1142頁(1977)に実質的に記載され
ている)。これらゲルを10%トリクロル酢酸中で固定
し、エンハンス(ニユー・イングランド・ヌクレア社)
で処理し、20%メタノールおよび3%グリセリン中で
洗浄し、そして乾燥させた。乾燥ゲルを予備フラツシユ
されたコダツクX−ARフイルムに強化スクリーン(C
awo社)を用いて−70℃で露出させた。
トリス−HCl(pH8.8)、1M蔗糖、5mM E
DTA、0.01%ブロムフエトルブルー、3%SDS
および8.3mMジチオスレイトールの中に100℃に
て3分間加熱することにより溶解させ、そしてこの溶液
を12%ポリアクリルアミドSDSゲルに加えた。この
ゲルを二次元で電気泳動にかけ、第一次元においては非
平衡pH濃度勾配の電気泳動にかけた(これについては
ピー・ゼツト・オーフアレル等、セル誌、第12巻、第
1133〜1142頁(1977)に実質的に記載され
ている)。これらゲルを10%トリクロル酢酸中で固定
し、エンハンス(ニユー・イングランド・ヌクレア社)
で処理し、20%メタノールおよび3%グリセリン中で
洗浄し、そして乾燥させた。乾燥ゲルを予備フラツシユ
されたコダツクX−ARフイルムに強化スクリーン(C
awo社)を用いて−70℃で露出させた。
【0046】この分析により、HLA−DRのα−鎖、
中間鎖およびβ−鎖を暗号化するRNAを含有するフラ
クシヨンとして、mRNA1200−1300ヌクレオ
チド長さを有するフラクシヨン31を同定した。このフ
ラクシヨンのRNAを全ポリA+ RNAにつき約20倍
濃縮させた。
中間鎖およびβ−鎖を暗号化するRNAを含有するフラ
クシヨンとして、mRNA1200−1300ヌクレオ
チド長さを有するフラクシヨン31を同定した。このフ
ラクシヨンのRNAを全ポリA+ RNAにつき約20倍
濃縮させた。
【0047】寸法分画したRNAの分析は、ラジ細胞か
らの翻訳RNAおよびDR抗原の多数回の事前分析に基
づく。これらの分析から、卵細胞はHLA−DRのα−
鎖、中間鎖およびβ−鎖を暗号化するRNAを翻訳し、
これら抗原をグリコシル化させ、かつこれらを組立てる
ことを確認した。さらに、組立物はモノクローン抗体D
1 −12,D4 −22およびBT2.2 により免疫沈殿された
が、β−鎖のみがBT2.2 により抗原組立物が変性され
た後に免疫沈殿されたことを確認した。また、α−鎖は
35000〜36000の明確な分子量を有し、中間鎖
は約33000の明確な分子量を有し、かつβ−鎖はS
DS−ポリアクリルアミドゲルにおいて31000およ
び29000の明確な分子量を有することを確認した。
さらに、非グリコシル化物質は次の通りである:300
00および29000(α−鎖)、2700(中間鎖)
並びに27000および26000(β−鎖)。
らの翻訳RNAおよびDR抗原の多数回の事前分析に基
づく。これらの分析から、卵細胞はHLA−DRのα−
鎖、中間鎖およびβ−鎖を暗号化するRNAを翻訳し、
これら抗原をグリコシル化させ、かつこれらを組立てる
ことを確認した。さらに、組立物はモノクローン抗体D
1 −12,D4 −22およびBT2.2 により免疫沈殿された
が、β−鎖のみがBT2.2 により抗原組立物が変性され
た後に免疫沈殿されたことを確認した。また、α−鎖は
35000〜36000の明確な分子量を有し、中間鎖
は約33000の明確な分子量を有し、かつβ−鎖はS
DS−ポリアクリルアミドゲルにおいて31000およ
び29000の明確な分子量を有することを確認した。
さらに、非グリコシル化物質は次の通りである:300
00および29000(α−鎖)、2700(中間鎖)
並びに27000および26000(β−鎖)。
【0048】cDNAクローンの作成 1.HLA−DR cDNAの調製 フラクシヨン31のポリA+ RNAの単一鎖cDNAコ
ピーを調製するため、CH3 Hgを5mMまで加えるこ
とによりRNAを変性させ、そしてこの混合物を室温で
1分間静置した。次いで、この変性RNAに1ml/4
0μgRNAの緩衝液(50mMトリス−HCl(pH
8.3)、10mM MgCl2 、70mM KCl、
30mM β−メルカブトエタノール、4mMピロ燐酸
ナトリウム)と0.5mM dGTP、dATPおよび
dTTPと0.3mM α−P32−dCTP(〜0.5
μCi/nモル)と40μg/mlのオリゴ(dT)1
2−18(コラボラテイブ・リサーチ社)と300単位
/mlの逆転写酵素(ライフ・サイエンス社)とを加
え、この混合物を37℃にて10分間および42℃にて
60分間加熱した[ワーリ等、Dev.Biol.、第
67巻、第371〜383頁(1978)](図
2)*。この混合物へEDTAを10mMまで加えかつ
SDSを0.1%まで加えることにより反応を停止さ
せ、そして混合物をフエノール/クロロホルム/イソア
ミルアルコール(100:99:1)で抽出した。水相
をセフアデツクスG−50超微粒カラムにより10mM
トリス−HCl(pH7.6)、1mM EDTAで洗
浄した。次いで、溶出された混合物をNaOHにて0.
5Nとなし、これを37℃で30分間培養し、それぞれ
5MのHOAcおよび1Mのトリス−HCl(pH7.
6)の0.1容量で中和し、そして単一鎖cDNAをエ
タノール沈殿させた。遠心分離によりcDNAを回収し
た後、これを50μlの0.5N NaOH中に再懸濁
させ、37℃にて30分間培養し、そしてこれを0.9
M NaCl、0.1M NaOH、2mM EDTA
中で4mlの5〜20%アルカリ性蔗糖濃度勾配にて層
状化させた。この層状化されたcDNAをSW60ロー
タ(50000rpm、1℃、7.5時間)にて寸法分
画し、そして1000ヌクレオチド以上の長さを有する
cDNAを含有するフラクシヨンを集めた。集めたDN
Aを中和し、そして上記と同様に沈殿させた(図2)。
ピーを調製するため、CH3 Hgを5mMまで加えるこ
とによりRNAを変性させ、そしてこの混合物を室温で
1分間静置した。次いで、この変性RNAに1ml/4
0μgRNAの緩衝液(50mMトリス−HCl(pH
8.3)、10mM MgCl2 、70mM KCl、
30mM β−メルカブトエタノール、4mMピロ燐酸
ナトリウム)と0.5mM dGTP、dATPおよび
dTTPと0.3mM α−P32−dCTP(〜0.5
μCi/nモル)と40μg/mlのオリゴ(dT)1
2−18(コラボラテイブ・リサーチ社)と300単位
/mlの逆転写酵素(ライフ・サイエンス社)とを加
え、この混合物を37℃にて10分間および42℃にて
60分間加熱した[ワーリ等、Dev.Biol.、第
67巻、第371〜383頁(1978)](図
2)*。この混合物へEDTAを10mMまで加えかつ
SDSを0.1%まで加えることにより反応を停止さ
せ、そして混合物をフエノール/クロロホルム/イソア
ミルアルコール(100:99:1)で抽出した。水相
をセフアデツクスG−50超微粒カラムにより10mM
トリス−HCl(pH7.6)、1mM EDTAで洗
浄した。次いで、溶出された混合物をNaOHにて0.
5Nとなし、これを37℃で30分間培養し、それぞれ
5MのHOAcおよび1Mのトリス−HCl(pH7.
6)の0.1容量で中和し、そして単一鎖cDNAをエ
タノール沈殿させた。遠心分離によりcDNAを回収し
た後、これを50μlの0.5N NaOH中に再懸濁
させ、37℃にて30分間培養し、そしてこれを0.9
M NaCl、0.1M NaOH、2mM EDTA
中で4mlの5〜20%アルカリ性蔗糖濃度勾配にて層
状化させた。この層状化されたcDNAをSW60ロー
タ(50000rpm、1℃、7.5時間)にて寸法分
画し、そして1000ヌクレオチド以上の長さを有する
cDNAを含有するフラクシヨンを集めた。集めたDN
Aを中和し、そして上記と同様に沈殿させた(図2)。
【0049】上記の集めたフラクシヨンからcDNAを
68℃で90秒間加熱しかつ氷中で急冷させて変性させ
ることにより二重鎖cDNAを調製した。次いで、次の
反応混合物を調整した:単一鎖cDNA(40μg/m
l)、50mMトリス−HCl(pH8.3)、10m
M MgCl2 、70mM KCl、30mMβ−メル
カブトエタノール、0.5mMのそれぞれdNTPおよ
び300単位/mlの逆転写酵素。この混合物を37℃
で10分間および42℃で90分間加熱した。EDTA
を10mMまで加えることにより再び反応を停止させ、
そしてこれをフエノール/クロロホルム/イソアミルア
ルコール(100:99:1)で抽出し、そしてセフア
デツクスG−50カラムにて10mMトリス−HCl
(pH7.6)、1mM EDTAでクロマトグラフに
かけた。
68℃で90秒間加熱しかつ氷中で急冷させて変性させ
ることにより二重鎖cDNAを調製した。次いで、次の
反応混合物を調整した:単一鎖cDNA(40μg/m
l)、50mMトリス−HCl(pH8.3)、10m
M MgCl2 、70mM KCl、30mMβ−メル
カブトエタノール、0.5mMのそれぞれdNTPおよ
び300単位/mlの逆転写酵素。この混合物を37℃
で10分間および42℃で90分間加熱した。EDTA
を10mMまで加えることにより再び反応を停止させ、
そしてこれをフエノール/クロロホルム/イソアミルア
ルコール(100:99:1)で抽出し、そしてセフア
デツクスG−50カラムにて10mMトリス−HCl
(pH7.6)、1mM EDTAでクロマトグラフに
かけた。
【0050】* ピロ燐酸ナトリウムの添加は沈殿を生
ぜしめ、この沈殿は反応を停止させると消失する。二重
鎖cDNA調製物におけるヘヤピンループを60mM
NaCl、6mM NaOAc(pH4.8)、0.5
mM ZnCl2 、〜30μg/ml二重鎖cDNA、
100単位/mlS1 ヌクレアーゼ(P−Lバイオケミ
カルス社)を含有する反応混合物において混合物を37
℃で30分間加熱することによりS1 ヌクレアーゼで処
理した。EDTAを10mMまで加えかつトリス−HC
l(pH7.6)を100mMまで加えることにより反
応を停止させ、混合物をフエノール/クロロホルム/イ
ソアミルアルコール(100:99:1)で抽出し、そ
してこれをセフアロースCL−GBカラムにより10m
Mトリス−HCl(pH7.6)、1mM EDTAで
洗浄して精製した。次いで、cDNAを上記と同様にE
tOHにて沈殿させた。
ぜしめ、この沈殿は反応を停止させると消失する。二重
鎖cDNA調製物におけるヘヤピンループを60mM
NaCl、6mM NaOAc(pH4.8)、0.5
mM ZnCl2 、〜30μg/ml二重鎖cDNA、
100単位/mlS1 ヌクレアーゼ(P−Lバイオケミ
カルス社)を含有する反応混合物において混合物を37
℃で30分間加熱することによりS1 ヌクレアーゼで処
理した。EDTAを10mMまで加えかつトリス−HC
l(pH7.6)を100mMまで加えることにより反
応を停止させ、混合物をフエノール/クロロホルム/イ
ソアミルアルコール(100:99:1)で抽出し、そ
してこれをセフアロースCL−GBカラムにより10m
Mトリス−HCl(pH7.6)、1mM EDTAで
洗浄して精製した。次いで、cDNAを上記と同様にE
tOHにて沈殿させた。
【0051】2.HLA−DR cDNAのクローン化 広範囲の宿主/クローン化ベヒクル組合せ物を使用し
て、二重鎖cDNAをクローン化させることができる。
さらに、それぞれ特異的クローン化ベヒクルにおいて、
種々の部位を選択することにより二重鎖cDNAを挿入
することができる。本発明のDNA配列をクローン化さ
せるためには、これら各種の代替物から本発明の範囲を
逸脱することなく当業者により特定的に選択することが
できる。
て、二重鎖cDNAをクローン化させることができる。
さらに、それぞれ特異的クローン化ベヒクルにおいて、
種々の部位を選択することにより二重鎖cDNAを挿入
することができる。本発明のDNA配列をクローン化さ
せるためには、これら各種の代替物から本発明の範囲を
逸脱することなく当業者により特定的に選択することが
できる。
【0052】初期のクローン化研究において、細菌性プ
ラスミドpBR322(エフ・ポリバール等、「新規な
クローン化ベヒクルIIの作成および特性化。多目的ク
ローン化方式」、ジーン誌、第2(2) 巻、第95〜11
4頁(1977);ジエー・ジー・サツトクリフ、「D
NA配列から得られるpBR322制限地図;4361
ヌクレオチド対長さまでの正確なDNA寸法標識」、
ヌクレイツク・アシツド・リサーチ、第5巻、第272
1〜2728(1978))。さらに、PstI部位
[エル・ピラ・コマロフ等、「ブロインシユリンを合成
する細菌性クローン」、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA、第75巻、第3727〜3731
頁(1978)]、dC/dG切断[エル・ピラ・コマ
ロフ等、上記]およびイー・コリHB101を選択し
た。
ラスミドpBR322(エフ・ポリバール等、「新規な
クローン化ベヒクルIIの作成および特性化。多目的ク
ローン化方式」、ジーン誌、第2(2) 巻、第95〜11
4頁(1977);ジエー・ジー・サツトクリフ、「D
NA配列から得られるpBR322制限地図;4361
ヌクレオチド対長さまでの正確なDNA寸法標識」、
ヌクレイツク・アシツド・リサーチ、第5巻、第272
1〜2728(1978))。さらに、PstI部位
[エル・ピラ・コマロフ等、「ブロインシユリンを合成
する細菌性クローン」、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA、第75巻、第3727〜3731
頁(1978)]、dC/dG切断[エル・ピラ・コマ
ロフ等、上記]およびイー・コリHB101を選択し
た。
【0053】a.PstI−開裂されたdG−切断pB
R322の調製 標準条件を用いてPstIによりpBR322を切断し
た。次いで、20mMK−カコジル酸塩、50mMトリ
ス−HCl(pH6.9)、10mM MgCl2 、1
mM dGTP、200μg/ml線状化pBR322
および25単位/ml末端トランスフエラーゼの反応混
合物を調製した。この混合物を37℃にて45分間加熱
した後、EDTAを10mMまで加えかつSDSを0.
5%まで加えて反応を停止させ、そしてこの混合物を氷
中で15分間急冷し、遠心分離(マイクロ遠心分離器、
2分間、4℃)によりdC切断されたHLA−DR c
DNAにアニールさせるため上澄液を調製した(図
2)。
R322の調製 標準条件を用いてPstIによりpBR322を切断し
た。次いで、20mMK−カコジル酸塩、50mMトリ
ス−HCl(pH6.9)、10mM MgCl2 、1
mM dGTP、200μg/ml線状化pBR322
および25単位/ml末端トランスフエラーゼの反応混
合物を調製した。この混合物を37℃にて45分間加熱
した後、EDTAを10mMまで加えかつSDSを0.
5%まで加えて反応を停止させ、そしてこの混合物を氷
中で15分間急冷し、遠心分離(マイクロ遠心分離器、
2分間、4℃)によりdC切断されたHLA−DR c
DNAにアニールさせるため上澄液を調製した(図
2)。
【0054】b.dC切断HLA−DR cDNAの調
製 dC切断物を、200mM K−カコジル酸塩,50m
Mトリス−HCl(pH6.9)、1mM dCTP、
100μg/ml BSA(ペンテツクス社)、〜2μ
g/ml cDNAおよび125単位/ml末端デオキ
ヌクレオチジルトランスフエラーゼ(P−Lバイオケミ
カルス社)を含有する反応混合物において37℃でこの
混合物を1〜6分間加熱することにより上記と同様に調
製されたcDNAへ加えた。少量部を用いることによ
り、最適な反応時間を選択した(通常約4分間)。次い
で、この時間を使用してcDNAを切断した。再びED
TAを10mMまで加えかつSDSを0.5%まで加
え、さらに混合物を氷中で15分間急冷することにより
反応を停止させた。dC切断されたcDNAを単離して
これを遠心分離によりdG切断されたPst−開裂pB
R322へアニールさせた(マイクロ遠心分離器、2分
間、4℃)。
製 dC切断物を、200mM K−カコジル酸塩,50m
Mトリス−HCl(pH6.9)、1mM dCTP、
100μg/ml BSA(ペンテツクス社)、〜2μ
g/ml cDNAおよび125単位/ml末端デオキ
ヌクレオチジルトランスフエラーゼ(P−Lバイオケミ
カルス社)を含有する反応混合物において37℃でこの
混合物を1〜6分間加熱することにより上記と同様に調
製されたcDNAへ加えた。少量部を用いることによ
り、最適な反応時間を選択した(通常約4分間)。次い
で、この時間を使用してcDNAを切断した。再びED
TAを10mMまで加えかつSDSを0.5%まで加
え、さらに混合物を氷中で15分間急冷することにより
反応を停止させた。dC切断されたcDNAを単離して
これを遠心分離によりdG切断されたPst−開裂pB
R322へアニールさせた(マイクロ遠心分離器、2分
間、4℃)。
【0055】c.dC切断cDNAおよびdG切断pB
R322のアニール化 上記のように調製した40ngのdC切断cDNAと、
上記のように調製した250ngのdG切断されたPs
t開裂pBR322とをアニール化用緩衝液(10mM
トリス−HCl(pH7.6)、1mM EDTA、
0.2M NaCl)において68℃で2時間混合し、
次いで徐々に冷却した(図2)。
R322のアニール化 上記のように調製した40ngのdC切断cDNAと、
上記のように調製した250ngのdG切断されたPs
t開裂pBR322とをアニール化用緩衝液(10mM
トリス−HCl(pH7.6)、1mM EDTA、
0.2M NaCl)において68℃で2時間混合し、
次いで徐々に冷却した(図2)。
【0056】上記のように調製された組換DNA分子の
僅かのものが、実際にHLA−DRのβ−鎖、すなわち
軽鎖、すなわちHLA−DR座の主たる多形質領域を暗
号化するDNA配列を含有することが了解されよう。事
実、大部分のクローン化された種類は、HLA−DRに
対し或いはそのβ−鎖に対し無関係である。
僅かのものが、実際にHLA−DRのβ−鎖、すなわち
軽鎖、すなわちHLA−DR座の主たる多形質領域を暗
号化するDNA配列を含有することが了解されよう。事
実、大部分のクローン化された種類は、HLA−DRに
対し或いはそのβ−鎖に対し無関係である。
【0057】3.ヒブリドによるイー・コリHB101
のトランスフエクシヨン 競合イー・コリHB101(recA- )を上記のヒブ
リドにより形質転換させた(これについては、デイー・
モリソンによりジヤーナル・バクテリオロジー、第13
2巻、第349〜351頁(1977)に記載されてい
る)。
のトランスフエクシヨン 競合イー・コリHB101(recA- )を上記のヒブ
リドにより形質転換させた(これについては、デイー・
モリソンによりジヤーナル・バクテリオロジー、第13
2巻、第349〜351頁(1977)に記載されてい
る)。
【0058】プラスミドpBR322はアンピシリン耐
性とテトラサイクリン耐性とを暗号化する遺伝子を含
み、かつ前者の遺伝子はPstI部位におけるcDNA
挿入により失活されるので、PstI部位にcDNA挿
入物を有する組換DNA分子で形質転換された集落を、
そのように形質転換されていない集落から選択すること
ができる。したがつて、上記のように形質転換されたイ
ー・コリ菌体を10μg/mlのテトラサイクリンを含
有する洗浄かつオートクレープ処理されたシユライヒヤ
ーおよびシユエルのニトロセルロースフイルターに塗沫
した[デイー・ハナハンおよびエム・メセルソン、ジー
ン誌、第10巻、第63〜67頁(1980)]。この
方法を用いて550種のcDNAクローンを作成した
(図2)。
性とテトラサイクリン耐性とを暗号化する遺伝子を含
み、かつ前者の遺伝子はPstI部位におけるcDNA
挿入により失活されるので、PstI部位にcDNA挿
入物を有する組換DNA分子で形質転換された集落を、
そのように形質転換されていない集落から選択すること
ができる。したがつて、上記のように形質転換されたイ
ー・コリ菌体を10μg/mlのテトラサイクリンを含
有する洗浄かつオートクレープ処理されたシユライヒヤ
ーおよびシユエルのニトロセルロースフイルターに塗沫
した[デイー・ハナハンおよびエム・メセルソン、ジー
ン誌、第10巻、第63〜67頁(1980)]。この
方法を用いて550種のcDNAクローンを作成した
(図2)。
【0059】HLA−DR cDNAを含有するクロー
ンの選別 特定の組換DNA分子を含有するクローン、すなわちH
LA−DR−β−鎖関連のDNA挿入物を含有するクロ
ーンにつき、クローンの保存物を選別するには幾つかの
方法がある。これらの方法は当業界で充分周知されてい
る。初期のクローン選別において、ポリA+ RNAに対
する高基準の陽性ヒブリド化選択をジアゾベンジルオキ
シメチル紙(シユライヒヤーおよびシユエル)において
使用するよう選択した。本発明の方法はゴールドベルク
等、メソツド・エンチモロジー、第68巻、第206〜
220頁(1979)の方法から改変させた。ヒブリド
化に対する実験基準としては、50個の集落の保存物に
おいて1個のDR−β−cDNA−関連クローンを検出
しうると予想した。
ンの選別 特定の組換DNA分子を含有するクローン、すなわちH
LA−DR−β−鎖関連のDNA挿入物を含有するクロ
ーンにつき、クローンの保存物を選別するには幾つかの
方法がある。これらの方法は当業界で充分周知されてい
る。初期のクローン選別において、ポリA+ RNAに対
する高基準の陽性ヒブリド化選択をジアゾベンジルオキ
シメチル紙(シユライヒヤーおよびシユエル)において
使用するよう選択した。本発明の方法はゴールドベルク
等、メソツド・エンチモロジー、第68巻、第206〜
220頁(1979)の方法から改変させた。ヒブリド
化に対する実験基準としては、50個の集落の保存物に
おいて1個のDR−β−cDNA−関連クローンを検出
しうると予想した。
【0060】550個の選別したクローンをそれぞれ5
0個のクローンの11群に分け、これらを10μg/m
lのテトラサイクリンを補充したL−培地で増殖させ
た。次いで、クロラムフエニコール(50μg/ml)
によりプラスミドを1晩処理し、そして慣用の清澄溶菌
物CsCl濃度勾配法を使用してこれら保存物からプラ
スミドDNAを調製した。次いで、プラスミドDNAを
0.5%ジエチルピロ炭酸エステルで処理し、これをセ
フアロースBカラム(10mMトリス−HCl(pH
7.6),1mM EDTA)に通して、小さい汚染性
RNA分子を除去した。プラスミドDNAを0.25N
HCl中で室温にて10分間部分的に処理し、混合物
を0.5NのNaOH、0.5M NaClまで調製
し、20分間培養し、HClで中和し、そしてDNAを
EtOHにより2回沈殿させた。次いで、調製されたジ
アゾベンジルオキシメチル紙(シユライヒヤーおよびシ
ユエル)を調製し、これに上記で調製されたDNAを共
融結合させた(これについてはゴールドベルク等、上記
により実質的に記載されている)。P32−標識DNAト
レーサを混合物中に含ませることによりDNAの滞留に
つき監視した。平均して15μgのDNAがそれぞれ1
cm2 のフイルタに結合された。
0個のクローンの11群に分け、これらを10μg/m
lのテトラサイクリンを補充したL−培地で増殖させ
た。次いで、クロラムフエニコール(50μg/ml)
によりプラスミドを1晩処理し、そして慣用の清澄溶菌
物CsCl濃度勾配法を使用してこれら保存物からプラ
スミドDNAを調製した。次いで、プラスミドDNAを
0.5%ジエチルピロ炭酸エステルで処理し、これをセ
フアロースBカラム(10mMトリス−HCl(pH
7.6),1mM EDTA)に通して、小さい汚染性
RNA分子を除去した。プラスミドDNAを0.25N
HCl中で室温にて10分間部分的に処理し、混合物
を0.5NのNaOH、0.5M NaClまで調製
し、20分間培養し、HClで中和し、そしてDNAを
EtOHにより2回沈殿させた。次いで、調製されたジ
アゾベンジルオキシメチル紙(シユライヒヤーおよびシ
ユエル)を調製し、これに上記で調製されたDNAを共
融結合させた(これについてはゴールドベルク等、上記
により実質的に記載されている)。P32−標識DNAト
レーサを混合物中に含ませることによりDNAの滞留に
つき監視した。平均して15μgのDNAがそれぞれ1
cm2 のフイルタに結合された。
【0061】これらフイルタを50%ホルムアミド(2
回再結晶化させかつ脱イオン化したもの)、20mM
PIPES(pH6.4)、0.75M NaCl、2
mMEDTA、0.4%SDS、1%グリシン、0.3
mg/mlイー・コリtRNA、0.1mg/mlポリ
Aにおいて37℃で2〜4時間予備ヒブリド化させた。
ヒブリド化するため、11枚のフイルタを〜200ml
の同じ緩衝液(グリシン,tRNAおよびポリAを含ま
ない)において37℃で20時間にわたり300μgの
全ポリA+ RNA(上記のように調製)で処理した。次
いで、これらフイルタをヒブリド化緩衝液で37℃にて
30分間3回洗浄し、22℃で10mMトリス−HCl
(pH7.4)、1mM EDTA、0.1M NaC
l、0.1%SDSにて30分間3回洗浄し、次いで5
0℃にて10mMトリス−HCl(pH7.4)、1m
M EDTAにより10分間3回洗浄した。
回再結晶化させかつ脱イオン化したもの)、20mM
PIPES(pH6.4)、0.75M NaCl、2
mMEDTA、0.4%SDS、1%グリシン、0.3
mg/mlイー・コリtRNA、0.1mg/mlポリ
Aにおいて37℃で2〜4時間予備ヒブリド化させた。
ヒブリド化するため、11枚のフイルタを〜200ml
の同じ緩衝液(グリシン,tRNAおよびポリAを含ま
ない)において37℃で20時間にわたり300μgの
全ポリA+ RNA(上記のように調製)で処理した。次
いで、これらフイルタをヒブリド化緩衝液で37℃にて
30分間3回洗浄し、22℃で10mMトリス−HCl
(pH7.4)、1mM EDTA、0.1M NaC
l、0.1%SDSにて30分間3回洗浄し、次いで5
0℃にて10mMトリス−HCl(pH7.4)、1m
M EDTAにより10分間3回洗浄した。
【0062】ヒブリド化RNAを150μlの5mMト
リス−HCl(pH7.4)、0.5mM EDTA、
6μg/mlうさぎtRNAにより2つの部分に溶出
し、その際フイルタを含む溶液を98℃にて75秒間加
熱した。次いで、混合物を0.3M NaOAc(pH
5.0)まで調整し、そしてRNAをEtOHにより2
回沈殿させた。
リス−HCl(pH7.4)、0.5mM EDTA、
6μg/mlうさぎtRNAにより2つの部分に溶出
し、その際フイルタを含む溶液を98℃にて75秒間加
熱した。次いで、混合物を0.3M NaOAc(pH
5.0)まで調整し、そしてRNAをEtOHにより2
回沈殿させた。
【0063】上記からのRNAにHLA−DR α−鎖
および中間鎖(cDNA過剰の条件下で25μgのポリ
A+ RNAから選択し、かつ卵細胞分析により確認)に
対するmRNAを補充し、そして補充されたRNAを卵
細胞に注入して上記と同様に分析した。RNAをこのよ
うに処理して免疫沈殿のレベルを増大させると共に、可
能なクローンを検出する機会を増大させた。卵細胞によ
り合成されたα−鎖および中間鎖抗原の存在を監視する
ため、各卵細胞抽出物の1/4を、遊離α−鎖および中
間鎖を結合する抗−DR−うさぎ血清133[カレル
等、モレキユラ・イミユノロジー、第18巻、第403
〜411頁(1981)]で免疫沈殿させた。各卵細胞
抽出物の残部3/4を抗−DR−モノクローン抗体(D
1 −12,D4 −22,BT2.2 )によつて免疫沈殿させ
た。11個の保存物のうち2個において、少量のDR−
抗原(β)が注入卵細胞で合成された*。
および中間鎖(cDNA過剰の条件下で25μgのポリ
A+ RNAから選択し、かつ卵細胞分析により確認)に
対するmRNAを補充し、そして補充されたRNAを卵
細胞に注入して上記と同様に分析した。RNAをこのよ
うに処理して免疫沈殿のレベルを増大させると共に、可
能なクローンを検出する機会を増大させた。卵細胞によ
り合成されたα−鎖および中間鎖抗原の存在を監視する
ため、各卵細胞抽出物の1/4を、遊離α−鎖および中
間鎖を結合する抗−DR−うさぎ血清133[カレル
等、モレキユラ・イミユノロジー、第18巻、第403
〜411頁(1981)]で免疫沈殿させた。各卵細胞
抽出物の残部3/4を抗−DR−モノクローン抗体(D
1 −12,D4 −22,BT2.2 )によつて免疫沈殿させ
た。11個の保存物のうち2個において、少量のDR−
抗原(β)が注入卵細胞で合成された*。
【0064】* 幾つかの保存物においてはさらに37
000ダルトンのバンドも免疫沈殿された。この蛋白質
は同定しなかつた。
000ダルトンのバンドも免疫沈殿された。この蛋白質
は同定しなかつた。
【0065】2種の陽性のものの各々を10個のクロー
ンからなる5群に分け、かつヒブリド化させて、これら
を上記と同様に分析した。元の2種の陽性のものの各々
から誘導された5群のうちの1群は、再び陽性であつ
た。次いで、2つの陽性の群の各々を、それぞれ1個の
クローンよりなる10群に分け、かつヒブリド化させて
これらを上記と同様に分析した。2つの陽性クローンを
選択した:クローン68およびクローン83−7。
ンからなる5群に分け、かつヒブリド化させて、これら
を上記と同様に分析した。元の2種の陽性のものの各々
から誘導された5群のうちの1群は、再び陽性であつ
た。次いで、2つの陽性の群の各々を、それぞれ1個の
クローンよりなる10群に分け、かつヒブリド化させて
これらを上記と同様に分析した。2つの陽性クローンを
選択した:クローン68およびクローン83−7。
【0066】クローン83−7はヒブリド化の条件下で
DR−β鎖mRNAを極めて効率的に選択した。このm
RNAは卵細胞において抗原を生成し、この抗原をαお
よび中間鎖RNAによる補充なしに抗−DRモノクロー
ン抗体(D1 −12,D4 −22,BT2.2 )により免疫沈
殿させた。逆に、クローン68−6はDR−β鎖mRN
Aの選択においてずつと効率が低かつた。クローン83
−7は180bpの挿入物を有し、かつクローン68−
6は470bpの挿入物を有した。これら挿入物はクロ
スヒブリド化しなかつた。
DR−β鎖mRNAを極めて効率的に選択した。このm
RNAは卵細胞において抗原を生成し、この抗原をαお
よび中間鎖RNAによる補充なしに抗−DRモノクロー
ン抗体(D1 −12,D4 −22,BT2.2 )により免疫沈
殿させた。逆に、クローン68−6はDR−β鎖mRN
Aの選択においてずつと効率が低かつた。クローン83
−7は180bpの挿入物を有し、かつクローン68−
6は470bpの挿入物を有した。これら挿入物はクロ
スヒブリド化しなかつた。
【0067】図3はDR領域におけるクローン83−7
のcDNA挿入物の位置およびIa状領域におけるクロ
ーン68−6のcDNA挿入物の位置を示している。I
a状領域をHLA部位の領域と呼び(図1)。クローン
68−6はIaと名付けられる。何故なら、これはHL
A/DRに関連するがそれと同一でない領域を示すから
である。
のcDNA挿入物の位置およびIa状領域におけるクロ
ーン68−6のcDNA挿入物の位置を示している。I
a状領域をHLA部位の領域と呼び(図1)。クローン
68−6はIaと名付けられる。何故なら、これはHL
A/DRに関連するがそれと同一でない領域を示すから
である。
【0068】さらに、ゲル移動ヒブリド化によりこれら
2種のcDNAクローンに同族であるRNAを分析し
た。両cDNAクローンは長さ約1300ヌクレオチド
のポリA+ RNAとヒブリド化し、2種のβ−細胞系お
よび慢性リンパ白血病を有する患者からのβ−細胞で発
現されたが、3種のT細胞系、膵臓および肝臓には存在
しなかった。また、68−6cDNA挿入物は長さ16
50ヌクレオチドの他のRNAバンドにヒブリド化した
が、83−7cDNA挿入物は長さ1900ヌクレオチ
ドの他のRNAバンドにヒブリド化した。
2種のcDNAクローンに同族であるRNAを分析し
た。両cDNAクローンは長さ約1300ヌクレオチド
のポリA+ RNAとヒブリド化し、2種のβ−細胞系お
よび慢性リンパ白血病を有する患者からのβ−細胞で発
現されたが、3種のT細胞系、膵臓および肝臓には存在
しなかった。また、68−6cDNA挿入物は長さ16
50ヌクレオチドの他のRNAバンドにヒブリド化した
が、83−7cDNA挿入物は長さ1900ヌクレオチ
ドの他のRNAバンドにヒブリド化した。
【0069】クローン83−7および68−6にヒブリ
ド化するラジ由来のクローンの選別 クローン83−7および68−6のDNA挿入物を試料
として使用し、上記と同様に調製された全ポリA+ RN
A由来のクローン(ラジ細胞)の保存物を鋭意選別し
て、HLA−DR β暗号化領域から他の好ましいより
長くかつより完全なDNA配列を位置決定した。
ド化するラジ由来のクローンの選別 クローン83−7および68−6のDNA挿入物を試料
として使用し、上記と同様に調製された全ポリA+ RN
A由来のクローン(ラジ細胞)の保存物を鋭意選別し
て、HLA−DR β暗号化領域から他の好ましいより
長くかつより完全なDNA配列を位置決定した。
【0070】PstIでの処理により2種のクローンの
プラスミドDNAから挿入物を切除し、これらを中性蔗
糖勾配遠心分離およびアクリルアミドゲル電気泳動によ
り精製した。溶出された断片をDEAEカラムに通し、
精製された挿入物を標識した(これについてはエム・グ
ルンシユタインおよびデイー・ホグネスにより「コロニ
ーヒブリド化:特異的遺伝子を含有するクローン化DN
Aの単離方法」、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA、第72巻、第3961〜3965頁(19
75);リグビー等、ジヤーナル・モレキユラ・バイオ
ロジー、第113巻、第237〜251頁(1977)
に実質的に記載されている)。そして(α−P32)ヌク
レオチドおよびDNAポリメラーゼI(ベ−リンガーマ
ンハイム社)によつてニツク翻訳により2×108 cp
m/μg、まで精製した[リグビー等、上記]。次い
で、この試料を使用して、高基準条件(下記)を用いて
より長いヒブリド化関連cDNAクローンにつき保存物
を選別した。
プラスミドDNAから挿入物を切除し、これらを中性蔗
糖勾配遠心分離およびアクリルアミドゲル電気泳動によ
り精製した。溶出された断片をDEAEカラムに通し、
精製された挿入物を標識した(これについてはエム・グ
ルンシユタインおよびデイー・ホグネスにより「コロニ
ーヒブリド化:特異的遺伝子を含有するクローン化DN
Aの単離方法」、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA、第72巻、第3961〜3965頁(19
75);リグビー等、ジヤーナル・モレキユラ・バイオ
ロジー、第113巻、第237〜251頁(1977)
に実質的に記載されている)。そして(α−P32)ヌク
レオチドおよびDNAポリメラーゼI(ベ−リンガーマ
ンハイム社)によつてニツク翻訳により2×108 cp
m/μg、まで精製した[リグビー等、上記]。次い
で、この試料を使用して、高基準条件(下記)を用いて
より長いヒブリド化関連cDNAクローンにつき保存物
を選別した。
【0071】この選別から、より長いcDNA挿入物を
含有する多数のクローンを単離した。これらクローンの
挿入物をDR−β1 、DR−β2 およびIa−β1 と名
付けた。これら挿入物により画成される領域を第3図に
示す。第3図に示したように、DNA挿入物DR−β1
およびDR−β2 はDR部位に関連する一方、Ia−β
1 はIa領域に関連する。
含有する多数のクローンを単離した。これらクローンの
挿入物をDR−β1 、DR−β2 およびIa−β1 と名
付けた。これら挿入物により画成される領域を第3図に
示す。第3図に示したように、DNA挿入物DR−β1
およびDR−β2 はDR部位に関連する一方、Ia−β
1 はIa領域に関連する。
【0072】さらに、これらクローンの種々の断片を用
いて幾つかのヒブリド化基準でクロスヒブリド化実験を
行ない、選択された種々異なるcDNAクローン間の類
似性の程度を決定した。cDNAクローンの3´未翻訳
部分からのDNA配列は高基準(Tmより5℃低い)、
中間基準(Tmより24℃低い)または低基準(Tmよ
り43℃低い)においてクロスヒブリド化しなかつた。
いて幾つかのヒブリド化基準でクロスヒブリド化実験を
行ない、選択された種々異なるcDNAクローン間の類
似性の程度を決定した。cDNAクローンの3´未翻訳
部分からのDNA配列は高基準(Tmより5℃低い)、
中間基準(Tmより24℃低い)または低基準(Tmよ
り43℃低い)においてクロスヒブリド化しなかつた。
【0073】逆に、DR β−鎖部位ではなくIa状領
域の第1領域を暗号化するクローンの5´末端における
DNA配列は、中間基準でクロスヒブリド化した。した
がつて、DR関連DNA配列はIa関連配列にクロスヒ
ブリド化しないが、Ia関連配列は他のIa関連配列に
クロスヒブリド化する。
域の第1領域を暗号化するクローンの5´末端における
DNA配列は、中間基準でクロスヒブリド化した。した
がつて、DR関連DNA配列はIa関連配列にクロスヒ
ブリド化しないが、Ia関連配列は他のIa関連配列に
クロスヒブリド化する。
【0074】cDNA挿入物の制限地図 各種の制限エンドヌクレアーゼによる単一および二重処
理を用いた制限分析により、各種のcDNAクローンの
HLA関連挿入物を地図化した。エンドヌクレアーゼの
供給業者(ニユー・イングランド・バイオラブ社、ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリー社、ベーリンガー社)に
より推奨される条件および緩衝液を使用し、そして得ら
れた断片をアガロースゲル上で分析した。
理を用いた制限分析により、各種のcDNAクローンの
HLA関連挿入物を地図化した。エンドヌクレアーゼの
供給業者(ニユー・イングランド・バイオラブ社、ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリー社、ベーリンガー社)に
より推奨される条件および緩衝液を使用し、そして得ら
れた断片をアガロースゲル上で分析した。
【0075】さらに図3は、選別工程において位置決定
された各種のcDNA挿入物の部分制限地図を示してい
る。勿論、図3に示された制限部位の実際の位置は不正
確である。慣用方法を用いるヌクレオチド配列は、他の
予測部位と同様に特定部位に適切に位置決定するであろ
う。
された各種のcDNA挿入物の部分制限地図を示してい
る。勿論、図3に示された制限部位の実際の位置は不正
確である。慣用方法を用いるヌクレオチド配列は、他の
予測部位と同様に特定部位に適切に位置決定するであろ
う。
【0076】上記したように、ラジ細胞は異型接合性、
すなわちDR3/6である。したがつて、2種の異なる
配列DR−β1 およびDR−β2 がこれら細胞から生成
されるcDNAに存在するという事実は、これらクロー
ンを特性化する2種のDNA配列がβ−鎖暗号化配列の
異なる種類から生ずるということを明確に示していな
い。寧ろ、これら2種は異型接合細胞系の2種のDR型
の対立型種類である。
すなわちDR3/6である。したがつて、2種の異なる
配列DR−β1 およびDR−β2 がこれら細胞から生成
されるcDNAに存在するという事実は、これらクロー
ンを特性化する2種のDNA配列がβ−鎖暗号化配列の
異なる種類から生ずるということを明確に示していな
い。寧ろ、これら2種は異型接合細胞系の2種のDR型
の対立型種類である。
【0077】クローンDR−β1 にヒブリド化するIB
W9由来のクローンの選別 ヒブリド化試料としてDNA挿入物DR−β1 を使用し
て、ひとβ細胞系、IBW9から得られた全ポリA+ R
NAの20000個のクローンの保存物を選別した。こ
の保存物は、ラジ細胞保存物について前記したと同様に
調製した。IBW9は、血族関係によりHLAに対し元
来同型接合性であると思われた細胞系である。しかしな
がら、これはその後、2つの研究室によりDR4,W6
異型接合系として個々に分類された。
W9由来のクローンの選別 ヒブリド化試料としてDNA挿入物DR−β1 を使用し
て、ひとβ細胞系、IBW9から得られた全ポリA+ R
NAの20000個のクローンの保存物を選別した。こ
の保存物は、ラジ細胞保存物について前記したと同様に
調製した。IBW9は、血族関係によりHLAに対し元
来同型接合性であると思われた細胞系である。しかしな
がら、これはその後、2つの研究室によりDR4,W6
異型接合系として個々に分類された。
【0078】同型接合細胞系と思われるものを使用し
て、ラジ細胞のような異型接合細胞系に存在しうる対立
多形質性を検出するのが困難な上記の可能性を回避し
た。異型接合系に対比して、同型接合細胞系からのクロ
ーンに検出されるβ−鎖クローンは、定義において異な
るβ−鎖遺伝子族を示すであろう。しかしながら、上記
したように、本発明に使用した系統は実際には異型接合
系であった。
て、ラジ細胞のような異型接合細胞系に存在しうる対立
多形質性を検出するのが困難な上記の可能性を回避し
た。異型接合系に対比して、同型接合細胞系からのクロ
ーンに検出されるβ−鎖クローンは、定義において異な
るβ−鎖遺伝子族を示すであろう。しかしながら、上記
したように、本発明に使用した系統は実際には異型接合
系であった。
【0079】この異型接合細胞系由来の保存物を選別し
た結果、HLA−DR−関連DNA配列の4つの種類を
位置決定した。これら種類の暗号化配列を制限地図化*
に基づきDR−β−A,DR−β−B,DR−β−Cお
よびDR−β−Dと名付けた。勿論、他のβ−鎖種類も
存在しうることを了解すべきである。たとえば、アコラ
(上記)は7種のこの種のものを予測している。このよ
うな種類は、本発明のDR−β1 ,DR−β2 ,DR−
β−A,DR−β−B,DR−β−CまたはDR−β−
D配列またはその断片を用いて高基準のヒブリド化にて
(実質的に上記したと同様)または他の同様な方法を用
いて選別しうるので本発明の1部である。
た結果、HLA−DR−関連DNA配列の4つの種類を
位置決定した。これら種類の暗号化配列を制限地図化*
に基づきDR−β−A,DR−β−B,DR−β−Cお
よびDR−β−Dと名付けた。勿論、他のβ−鎖種類も
存在しうることを了解すべきである。たとえば、アコラ
(上記)は7種のこの種のものを予測している。このよ
うな種類は、本発明のDR−β1 ,DR−β2 ,DR−
β−A,DR−β−B,DR−β−CまたはDR−β−
D配列またはその断片を用いて高基準のヒブリド化にて
(実質的に上記したと同様)または他の同様な方法を用
いて選別しうるので本発明の1部である。
【0080】* これら挿入物を含むクローンをイー・
コリHB101(pBR322(Pst)/HLA−D
R−β−A乃至D)と命名し、これはそのPstI制限
部位に特定のHLA−DR−β関連DNA挿入物を有す
るpBR322からなる組換DNA分子により形質転換
されたイー・コリHB101菌体であることを意味す
る。
コリHB101(pBR322(Pst)/HLA−D
R−β−A乃至D)と命名し、これはそのPstI制限
部位に特定のHLA−DR−β関連DNA挿入物を有す
るpBR322からなる組換DNA分子により形質転換
されたイー・コリHB101菌体であることを意味す
る。
【0081】4種のDR−βクローンにおけるクローン
はその暗号化領域および非暗号化領域全体にわたり充分
にクロスヒブリド化する。これらは、極めて厳密に制限
地図およびクロスヒブリド化によつて区別することがで
きる(図4)。したがつて、これらは恐らく4種の異な
るDR−遺伝子から得られた4種のmRNAを示してい
る。これらはDR(4,W6)に対し異型接合細胞系か
ら得られるので、これら4種のDR−β遺伝子はDR−
鎖を暗号化する少なくとも2つの非対立部位を示すと思
われる。この結論は、さらにβ1 試料を用いて同じβ細
胞系から単離したゲノムDNAクローンの分析により裏
付けらる。
はその暗号化領域および非暗号化領域全体にわたり充分
にクロスヒブリド化する。これらは、極めて厳密に制限
地図およびクロスヒブリド化によつて区別することがで
きる(図4)。したがつて、これらは恐らく4種の異な
るDR−遺伝子から得られた4種のmRNAを示してい
る。これらはDR(4,W6)に対し異型接合細胞系か
ら得られるので、これら4種のDR−β遺伝子はDR−
鎖を暗号化する少なくとも2つの非対立部位を示すと思
われる。この結論は、さらにβ1 試料を用いて同じβ細
胞系から単離したゲノムDNAクローンの分析により裏
付けらる。
【0082】cDNA挿入物のヌクレオチド配列 ヌクレオチド配列を決定するため、上記のように、DN
A挿入物DR−β−A,DR−β−B,DR−β−Cお
よびDR−β−Dからの制限断片を調製し、これらをア
クリルアミドゲルから抽出し、そしてDEAEセルロー
スカラムで精製した。これら断片を(α−P32)コルジ
アピン−5´−トリホスフエート(アメルシヤム社)お
よび末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ
(P−Lバイオケミカルス社)により3´標識し、或い
はこれらを牛の腸ホスフアターゼ(エス・クラークソン
による寄贈)およびポリヌクレオチドキナーゼ(P−L
バイオケミカルス社)により5´標識した。これら標識
された断片につき、マキサムおよびギルバートにより
「DNAの新規な配列決定方法」、Proc.Nat
l.Sci.USA、第74巻、第520〜564頁
(1977)に実質的記載されているように配列決定し
た。殆んどのcDNAについては両ストランドから配列
決定し、かつ標識末端として作用する殆んどの制限部位
についてはそれらを画成する断片を用いて配列決定し
た。
A挿入物DR−β−A,DR−β−B,DR−β−Cお
よびDR−β−Dからの制限断片を調製し、これらをア
クリルアミドゲルから抽出し、そしてDEAEセルロー
スカラムで精製した。これら断片を(α−P32)コルジ
アピン−5´−トリホスフエート(アメルシヤム社)お
よび末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ
(P−Lバイオケミカルス社)により3´標識し、或い
はこれらを牛の腸ホスフアターゼ(エス・クラークソン
による寄贈)およびポリヌクレオチドキナーゼ(P−L
バイオケミカルス社)により5´標識した。これら標識
された断片につき、マキサムおよびギルバートにより
「DNAの新規な配列決定方法」、Proc.Nat
l.Sci.USA、第74巻、第520〜564頁
(1977)に実質的記載されているように配列決定し
た。殆んどのcDNAについては両ストランドから配列
決定し、かつ標識末端として作用する殆んどの制限部位
についてはそれらを画成する断片を用いて配列決定し
た。
【0083】図5、図6、図7、図8および図9は、配
列決定方法およびcDNAクローンHLA−DR−β−
A*の暗号化ストランドのヌクレオチドおよびアミノ酸
配列を示している。クローンHLA−DR−β−Aにお
いて、35個のヌクレオチドが最初のATGトリブレツ
トに先行する。このATGは長さ266個のアミノ酸の
開放読枠における最初のコドンである。11個の連続し
た疎水性残基のコアを有する最初の29個のアミノ酸
は、ひとIa抗原のβ−鎖につき決定された部分アミノ
酸配列と高度の類似性を有する配列に先行する[デイー
・エー・シヤツケルフオード等、イミユノロジー・レビ
ユー、第66巻、第133〜187頁(1982)]。
したがつて、最初の29個のアミノ酸(図6においてN
o−1〜−29)は恐らく信号配列を示し、残部237
個のアミノ酸(図6、図7、図8および図9においてN
o1〜237)は成熟蛋白質(199個のアミノ酸)と
トランスメンブラン領域(22個のアミノ酸)と細胞質
末端(16個のアミノ酸)とを示す。図6、図7および
図8に示したように、暗号化配列の細胞外部分には4個
のシステインが存在する(位置15,79,117およ
び173)。
列決定方法およびcDNAクローンHLA−DR−β−
A*の暗号化ストランドのヌクレオチドおよびアミノ酸
配列を示している。クローンHLA−DR−β−Aにお
いて、35個のヌクレオチドが最初のATGトリブレツ
トに先行する。このATGは長さ266個のアミノ酸の
開放読枠における最初のコドンである。11個の連続し
た疎水性残基のコアを有する最初の29個のアミノ酸
は、ひとIa抗原のβ−鎖につき決定された部分アミノ
酸配列と高度の類似性を有する配列に先行する[デイー
・エー・シヤツケルフオード等、イミユノロジー・レビ
ユー、第66巻、第133〜187頁(1982)]。
したがつて、最初の29個のアミノ酸(図6においてN
o−1〜−29)は恐らく信号配列を示し、残部237
個のアミノ酸(図6、図7、図8および図9においてN
o1〜237)は成熟蛋白質(199個のアミノ酸)と
トランスメンブラン領域(22個のアミノ酸)と細胞質
末端(16個のアミノ酸)とを示す。図6、図7および
図8に示したように、暗号化配列の細胞外部分には4個
のシステインが存在する(位置15,79,117およ
び173)。
【0084】* このクローンに対する部分ヌクレオチ
ドおよびアミノ酸配列(AA79−95)は英国特許出
願第8222066号および第8230441号明細書
に示された。
ドおよびアミノ酸配列(AA79−95)は英国特許出
願第8222066号および第8230441号明細書
に示された。
【0085】図10、図11、図12および図13は、
クローンHLA−DR−β−Aから推定したアミノ酸配
列と、DR2同型接合系[エツチ・クラツチン等、ホツ
ペ・セイラース・ツアイトシユリフト・フイジオロジツ
シエ・ケミー、第362巻、第1665〜1699頁
(1981)]から単離されたIa抗原β−鎖につきク
ラツチンにより決定された配列と、DR3,W6細胞系
[デイー・ラルハンマー等、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA、第79巻、第3687〜369
1頁(1982)]から単離されたcDNAクローンに
より推定される配列とのアミノ酸配列比較を示してい
る。最後の配列は、DCβ−鎖クローンであると思われ
る。何故なら、その推定配列はDSβ−鎖[エス・エム
・ゴイエルト等、J.Exp.Med.、第156巻、
第550〜566頁(1982)]*につき決定された
部分N−末端配列に匹敵するからである。
クローンHLA−DR−β−Aから推定したアミノ酸配
列と、DR2同型接合系[エツチ・クラツチン等、ホツ
ペ・セイラース・ツアイトシユリフト・フイジオロジツ
シエ・ケミー、第362巻、第1665〜1699頁
(1981)]から単離されたIa抗原β−鎖につきク
ラツチンにより決定された配列と、DR3,W6細胞系
[デイー・ラルハンマー等、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA、第79巻、第3687〜369
1頁(1982)]から単離されたcDNAクローンに
より推定される配列とのアミノ酸配列比較を示してい
る。最後の配列は、DCβ−鎖クローンであると思われ
る。何故なら、その推定配列はDSβ−鎖[エス・エム
・ゴイエルト等、J.Exp.Med.、第156巻、
第550〜566頁(1982)]*につき決定された
部分N−末端配列に匹敵するからである。
【0086】* DSおよびDC抗原は同一であり、か
つねずみI−A Ia抗原に対し極めて良好な類似性を
示すことがエス・エム・ゴイエルト等により、J.Ex
p.Med.、第156巻、第550〜566頁(19
82);アール・ボノおよびジエー・エル・ストロミン
ガー、ネイチヤー誌、第299巻、第836〜838頁
(1982)に記載されている。
つねずみI−A Ia抗原に対し極めて良好な類似性を
示すことがエス・エム・ゴイエルト等により、J.Ex
p.Med.、第156巻、第550〜566頁(19
82);アール・ボノおよびジエー・エル・ストロミン
ガー、ネイチヤー誌、第299巻、第836〜838頁
(1982)に記載されている。
【0087】図14および図15は、他のHLA−DR
−βクローン[HLA−DE−β−B]のヌクレオチド
およびアミノ酸配列を示している。さらに、このクロー
ンから推定されるアミノ酸配列は29個のアミノ酸より
なる推定信号配列と、237個の他のアミノ酸とを暗号
化領域に有する。
−βクローン[HLA−DE−β−B]のヌクレオチド
およびアミノ酸配列を示している。さらに、このクロー
ンから推定されるアミノ酸配列は29個のアミノ酸より
なる推定信号配列と、237個の他のアミノ酸とを暗号
化領域に有する。
【0088】HLA−DR判定における本発明のcDN
A挿入物の使用 HLA−DR−β−鎖抗原またはその断片の種類を暗号
化するcDNA挿入物を、DR判定法およびキツトに使
用することができる。一般に、この種の判定方法は、
(1)慣用のエンドヌクレアーゼと条件とを用いて個体
のDNAを制限し、(2)制限DNAをたとえば慣用の
ゲルにおいて寸法分画し、(3)寸法分画されたDNA
を本発明のHLA−DR−β−鎖関連試料またはその断
片にヒブリド化し、かつ(4)ヒブリド化の領域を検出
する工程からなつている。
A挿入物の使用 HLA−DR−β−鎖抗原またはその断片の種類を暗号
化するcDNA挿入物を、DR判定法およびキツトに使
用することができる。一般に、この種の判定方法は、
(1)慣用のエンドヌクレアーゼと条件とを用いて個体
のDNAを制限し、(2)制限DNAをたとえば慣用の
ゲルにおいて寸法分画し、(3)寸法分画されたDNA
を本発明のHLA−DR−β−鎖関連試料またはその断
片にヒブリド化し、かつ(4)ヒブリド化の領域を検出
する工程からなつている。
【0089】たとえば、この種の方法の1例として、確
立された細胞系からの4種の異なる個体[HLA−DR
につき3種の同型接合体(1/1,6/6,7/7)お
よび1種の異型接合体(3/6)]から高分子量DNA
を得た。このDNAを37℃にてEcoRI(ベーリン
ガー・マンハイム社)とHindIII (ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリース社)またはBam HIにより、
標準緩衝液条件および1単位酵素/μg DNAを用い
て1晩処理した。EDTAにより反応を停止させ、制限
DNAをクロロホルムイソアミルアルコール(24:
1)により1回抽出し、そしてETOHで沈殿させた。
遠心分離の後、ペレツトを10mMトリス−HCl(p
H7.6)、1mM EDTA、0.1%SDS、0.
05%ブロムフエノールブルー、0.05%キシレンシ
アノールおよび5%グリセリン中に再懸濁させた。DN
Aを37℃にて4時間培養した後、これを65℃にて5
分間処理し、20mMグリシン,15mM NaOH
(pH8.3)における0.6%アガロースゲルに加え
た。これらゲルを60−100Vにて12時間処理し、
次いで0.2μのニトロセルロースフイルタ(シユライ
ヒヤーおよびシユエル)に移した(これについてはジー
・エム・バール等によりProc.Natl.Aca
d.Sci.USA、第76巻、第3683〜3687
頁(1979)に実質的に記載されている。)。
立された細胞系からの4種の異なる個体[HLA−DR
につき3種の同型接合体(1/1,6/6,7/7)お
よび1種の異型接合体(3/6)]から高分子量DNA
を得た。このDNAを37℃にてEcoRI(ベーリン
ガー・マンハイム社)とHindIII (ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリース社)またはBam HIにより、
標準緩衝液条件および1単位酵素/μg DNAを用い
て1晩処理した。EDTAにより反応を停止させ、制限
DNAをクロロホルムイソアミルアルコール(24:
1)により1回抽出し、そしてETOHで沈殿させた。
遠心分離の後、ペレツトを10mMトリス−HCl(p
H7.6)、1mM EDTA、0.1%SDS、0.
05%ブロムフエノールブルー、0.05%キシレンシ
アノールおよび5%グリセリン中に再懸濁させた。DN
Aを37℃にて4時間培養した後、これを65℃にて5
分間処理し、20mMグリシン,15mM NaOH
(pH8.3)における0.6%アガロースゲルに加え
た。これらゲルを60−100Vにて12時間処理し、
次いで0.2μのニトロセルロースフイルタ(シユライ
ヒヤーおよびシユエル)に移した(これについてはジー
・エム・バール等によりProc.Natl.Aca
d.Sci.USA、第76巻、第3683〜3687
頁(1979)に実質的に記載されている。)。
【0090】移動させた後、これらフイルタを4×SS
C(SSCは150mM NaCl、15mM クエン
酸ナトリウムである)において洗浄し、次いでこれらを
減圧オーブン内で80℃にて2時間処理した。次いで、
フイルタを5×SSC、5×デンハルツ試薬で65℃に
てゆつくりと振とうしながら1〜2時間、および1×デ
ンハルツ試薬、0.75M NaCl、5mM EDT
A、50mM燐酸ナトリウム緩衝液(pH7)、10%
デキストラン硫酸塩、0.1%SDS、50μg/ml
ポリGおよび250μg/ml超音波変性されたDNA
にて65℃で2時間、順次に培養した。次いで、濾紙に
結合したDNAを1×デンハルツ試薬、0.75M N
aCl、5mM EDTA、50mM燐酸ナトリウム緩
衝液(pH7)および1×106 cpm/mlの本発明
のP32−標識cDNA試料において65℃で8〜12時
間ヒブリド化させた。
C(SSCは150mM NaCl、15mM クエン
酸ナトリウムである)において洗浄し、次いでこれらを
減圧オーブン内で80℃にて2時間処理した。次いで、
フイルタを5×SSC、5×デンハルツ試薬で65℃に
てゆつくりと振とうしながら1〜2時間、および1×デ
ンハルツ試薬、0.75M NaCl、5mM EDT
A、50mM燐酸ナトリウム緩衝液(pH7)、10%
デキストラン硫酸塩、0.1%SDS、50μg/ml
ポリGおよび250μg/ml超音波変性されたDNA
にて65℃で2時間、順次に培養した。次いで、濾紙に
結合したDNAを1×デンハルツ試薬、0.75M N
aCl、5mM EDTA、50mM燐酸ナトリウム緩
衝液(pH7)および1×106 cpm/mlの本発明
のP32−標識cDNA試料において65℃で8〜12時
間ヒブリド化させた。
【0091】ヒブリド化の後、フイルタをそれぞれ5×
SSC、1×デンハルト試薬、0.1%SDS、0.1
%ピロ燐酸ナトリウムと、2×SSC、0.1%SDS
と、0.5×SSCと、0.1×SSCとにより2回洗
浄した(65℃、30分間)。次いで、乾燥したフイル
タを予備フラツシユしたコダツクX−ARフイルムに強
化スクリーン(Cawo社)を用いて−70℃にて48
時間露出させた。
SSC、1×デンハルト試薬、0.1%SDS、0.1
%ピロ燐酸ナトリウムと、2×SSC、0.1%SDS
と、0.5×SSCと、0.1×SSCとにより2回洗
浄した(65℃、30分間)。次いで、乾燥したフイル
タを予備フラツシユしたコダツクX−ARフイルムに強
化スクリーン(Cawo社)を用いて−70℃にて48
時間露出させた。
【0092】図16はヒブリド化の結果を示している。
図16に見られるように、それぞれ異なるひとDNA
(DR7/7(レーン1)、DR6/6(レーン2)、
DR3/6(レーン3)およびDR11/1(レーン
4))は各制限エンドヌクレアーゼにつき異なる電気泳
動パターンを示す*。したがつて、本発明の試料を用い
る種々のHLA/DR判定された個体からのDNAのサ
ウザンブロツトは、異なるHLA−DR特異性を有する
個体から簡単かつ経済的に区別することができる* *。
さらに、この判定方法および生産物で得られた簡単なブ
ロツトパターンは従来の判定方法では可能でなかつたよ
うな判定を可能にし、したがつて従来のHLA−DR群
における各種のサブ群を同定しかつ区別することがで
き、しかも種々の病気に対するこれらサブ群の感受性を
より良好に決定することができる。
図16に見られるように、それぞれ異なるひとDNA
(DR7/7(レーン1)、DR6/6(レーン2)、
DR3/6(レーン3)およびDR11/1(レーン
4))は各制限エンドヌクレアーゼにつき異なる電気泳
動パターンを示す*。したがつて、本発明の試料を用い
る種々のHLA/DR判定された個体からのDNAのサ
ウザンブロツトは、異なるHLA−DR特異性を有する
個体から簡単かつ経済的に区別することができる* *。
さらに、この判定方法および生産物で得られた簡単なブ
ロツトパターンは従来の判定方法では可能でなかつたよ
うな判定を可能にし、したがつて従来のHLA−DR群
における各種のサブ群を同定しかつ区別することがで
き、しかも種々の病気に対するこれらサブ群の感受性を
より良好に決定することができる。
【0093】* 図16のレーン5はねずみDNAであ
る。** 上記の「判定」方法は10〜20mlの血液を用
いて行うことができ、100回または1000回の試験
まで用意に規模拡大される。
る。** 上記の「判定」方法は10〜20mlの血液を用
いて行うことができ、100回または1000回の試験
まで用意に規模拡大される。
【0094】勿論、特定の制限DNAのヒブリド化部分
の検出はP32−標識試料により行なう必要がないことを
了解すべきである。寧ろ、他のヒブリド化検出方法を同
等に使用することができる。この種の方法は、試料を染
色活性化剤、検出酵素、アビジンまたは他の検出手段に
結合させることを含む。
の検出はP32−標識試料により行なう必要がないことを
了解すべきである。寧ろ、他のヒブリド化検出方法を同
等に使用することができる。この種の方法は、試料を染
色活性化剤、検出酵素、アビジンまたは他の検出手段に
結合させることを含む。
【0095】本発明のcDNA挿入物の合成試料を使用
する改良HLA−DR判定 短かい(19塩基)のオリゴヌクレオチドDNA断片を
用いるサウザンブロツトの条件下におけるヒブリド化
は、完全に適合する配列(同一もしくは対立)を非適合
配列(異なる配列または対立)から区別しうることを示
している。たとえば、ビー・ジエー・コナー等、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA、第80巻、
第278〜282頁(1983)。
する改良HLA−DR判定 短かい(19塩基)のオリゴヌクレオチドDNA断片を
用いるサウザンブロツトの条件下におけるヒブリド化
は、完全に適合する配列(同一もしくは対立)を非適合
配列(異なる配列または対立)から区別しうることを示
している。たとえば、ビー・ジエー・コナー等、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA、第80巻、
第278〜282頁(1983)。
【0096】本発明のHLA−DR−β−cDNAのヌ
クレオチド配列を分析し、そしてこれら配列内に配列の
相違(多形質的相違を含む)を示す少なくとも3つの領
域を確認した。これらの3つの領域は次の通りである:
(1)アミノ酸8〜14に対する暗号化配列;(2)ア
ミノ酸26〜32に対する暗号化配列;および(3)ア
ミノ酸72〜78に対する暗号化配列(図17)。さら
に、異なるDR−β鎖遺伝子ならびにDCおよびSBβ
−鎖遺伝子のうち同一である領域(アミノ酸39〜45
に対する暗号化配列)も確認した。
クレオチド配列を分析し、そしてこれら配列内に配列の
相違(多形質的相違を含む)を示す少なくとも3つの領
域を確認した。これらの3つの領域は次の通りである:
(1)アミノ酸8〜14に対する暗号化配列;(2)ア
ミノ酸26〜32に対する暗号化配列;および(3)ア
ミノ酸72〜78に対する暗号化配列(図17)。さら
に、異なるDR−β鎖遺伝子ならびにDCおよびSBβ
−鎖遺伝子のうち同一である領域(アミノ酸39〜45
に対する暗号化配列)も確認した。
【0097】不適合の3つの領域(図17における黒
丸)を画成する合成オリゴヌクレオチド(19−化合
体)の試料を調製した。第9図の指示した領域は、2種
のHLA−DR−β cDNAクローンの3つの領域の
それぞれにつき調製した特定の19−化合体を示してい
る。これら19−化合体のそれぞれは2個以上の不適合
部分を有するので、各試料につきHLA−DR配列の明
確な区別を行なうことができる。さらに、19−化合体
を上記のように同族領域から調製して、陽性ヒブリド化
比較として使用することができる。
丸)を画成する合成オリゴヌクレオチド(19−化合
体)の試料を調製した。第9図の指示した領域は、2種
のHLA−DR−β cDNAクローンの3つの領域の
それぞれにつき調製した特定の19−化合体を示してい
る。これら19−化合体のそれぞれは2個以上の不適合
部分を有するので、各試料につきHLA−DR配列の明
確な区別を行なうことができる。さらに、19−化合体
を上記のように同族領域から調製して、陽性ヒブリド化
比較として使用することができる。
【0098】同様にして、他のHLA−DR−β鎖遺伝
子のうち不適合および同一の領域から19−化合体DN
A試料のコレクシヨンを作成することができる。かくし
て、それぞれの試料は所定のDR特異性に対し特定的で
ある。したがつて、試料コレクシヨンおよび比較のヒブ
リド化は、多数の個体の迅速かつ正確なDR判定を可能
にする。
子のうち不適合および同一の領域から19−化合体DN
A試料のコレクシヨンを作成することができる。かくし
て、それぞれの試料は所定のDR特異性に対し特定的で
ある。したがつて、試料コレクシヨンおよび比較のヒブ
リド化は、多数の個体の迅速かつ正確なDR判定を可能
にする。
【0099】本発明のDNA配列の発現 蛋白質の生産レベルは2つの主たる因子により支配され
る:すなわち細胞内のその遺伝子のコピー数およびこれ
ら遺伝子コピーが転写しかつ翻訳する効率である。転写
および翻訳の効率(これらは一緒になつて発現を構成す
る)は、通常、所望の暗号化配列の前方に位置するヌク
レオチド配列に依存する。これらのヌクレオチド配列ま
たは発現制御配列は、特にRNAポリメラーゼが反応し
て転写を開始する位置(プロモータ配列)およびリボソ
ームがmRNAと結合して相互反応し(転写生産物)翻
訳を開始する位置を規定する。この種の発現制御配列
は、必らずしも同等な効率で機能しない。したがつて、
所望の蛋白質に関する特異的暗号化配列を隣接するヌク
レオチド配列から分離し、そしてこれを他の発現制御配
列に融合させて高レベルの発現を得ることが有利であ
る。これが達成されると、新たに作成されたDNA断片
をマチルコピーのプラスミドまたはバクテリオフアージ
誘導体に挿入して、細胞内における遺伝子コピー数を増
大させ、かくして発現蛋白質の収率をさらに向上させる
ことができる。
る:すなわち細胞内のその遺伝子のコピー数およびこれ
ら遺伝子コピーが転写しかつ翻訳する効率である。転写
および翻訳の効率(これらは一緒になつて発現を構成す
る)は、通常、所望の暗号化配列の前方に位置するヌク
レオチド配列に依存する。これらのヌクレオチド配列ま
たは発現制御配列は、特にRNAポリメラーゼが反応し
て転写を開始する位置(プロモータ配列)およびリボソ
ームがmRNAと結合して相互反応し(転写生産物)翻
訳を開始する位置を規定する。この種の発現制御配列
は、必らずしも同等な効率で機能しない。したがつて、
所望の蛋白質に関する特異的暗号化配列を隣接するヌク
レオチド配列から分離し、そしてこれを他の発現制御配
列に融合させて高レベルの発現を得ることが有利であ
る。これが達成されると、新たに作成されたDNA断片
をマチルコピーのプラスミドまたはバクテリオフアージ
誘導体に挿入して、細胞内における遺伝子コピー数を増
大させ、かくして発現蛋白質の収率をさらに向上させる
ことができる。
【0100】したがって、広範囲の宿主−発現制御配列
のベクター組合せを使用して、本発明の方法により適当
な暗号化配列を挿入することによつてHLA−DR−β
鎖と同様なポリペプチドを生産することができる。たと
えば、有用なベクターは染色体、非染色体および合成の
DNA配列の断片からなり、たとえば col El,
pCRI,pBR322およびその誘導体を含めイー・
コリからの各種公知の細菌プラスミド、広範囲の宿主プ
ラスミド、たとえばRP4、フアージDNA、たとえば
多くのフアージλの誘導体ならびに上記の組合せから得
られるベクター、たとえばpBR322、フアージλの
一部および合成部分を含むベクターが包含される。有用
な宿主はたとえばイー・コリの菌株、たとえばイー・コ
リK12MC1061、イー・コリHB101、イー・
コリ×1776、イー・コリ×2282、イー・コリM
RCIのような細菌性宿主ならびにシユウドモナス、枯
草菌、高熱細菌およびその他細菌類、酵母およびその他
の真菌類の菌株、動物もしくは植物宿主、たとえば動物
(ひとを含む)もしくは植物の培養細胞またはその他の
宿主を包含することができる。有用な発現制御配列はイ
ー・コリのラクトースオペロンのオペレータ、プロモー
タならびにリボゾーム結合および相互作用配列(「la
c系」)、イー・コリのトリプトフアンシンセターゼ系
の対応する配列(「trp系」)、フアージλの主オペ
レータおよびプロモータ領域(OLPL およびOR PI
R )、フアージfdコート蛋白質の制御領域、または原
始核細胞もしくは成熟核細胞およびそのウイルスの遺伝
子の発現を制御かつ促進するその他の配列、或いは各種
のこれらの組合せを包含することができる。
のベクター組合せを使用して、本発明の方法により適当
な暗号化配列を挿入することによつてHLA−DR−β
鎖と同様なポリペプチドを生産することができる。たと
えば、有用なベクターは染色体、非染色体および合成の
DNA配列の断片からなり、たとえば col El,
pCRI,pBR322およびその誘導体を含めイー・
コリからの各種公知の細菌プラスミド、広範囲の宿主プ
ラスミド、たとえばRP4、フアージDNA、たとえば
多くのフアージλの誘導体ならびに上記の組合せから得
られるベクター、たとえばpBR322、フアージλの
一部および合成部分を含むベクターが包含される。有用
な宿主はたとえばイー・コリの菌株、たとえばイー・コ
リK12MC1061、イー・コリHB101、イー・
コリ×1776、イー・コリ×2282、イー・コリM
RCIのような細菌性宿主ならびにシユウドモナス、枯
草菌、高熱細菌およびその他細菌類、酵母およびその他
の真菌類の菌株、動物もしくは植物宿主、たとえば動物
(ひとを含む)もしくは植物の培養細胞またはその他の
宿主を包含することができる。有用な発現制御配列はイ
ー・コリのラクトースオペロンのオペレータ、プロモー
タならびにリボゾーム結合および相互作用配列(「la
c系」)、イー・コリのトリプトフアンシンセターゼ系
の対応する配列(「trp系」)、フアージλの主オペ
レータおよびプロモータ領域(OLPL およびOR PI
R )、フアージfdコート蛋白質の制御領域、または原
始核細胞もしくは成熟核細胞およびそのウイルスの遺伝
子の発現を制御かつ促進するその他の配列、或いは各種
のこれらの組合せを包含することができる。
【0101】勿論、必ずしも全ての宿主−発現制御配列
−ベクター組合せ物が、特定のHLA/DR暗号化配列
につき同等の効果を有するとは限らない。しかしなが
ら、上記したように、生物安全性の観点から特定の構造
につき本発明のHLA−DR−β暗号化配列に使用しう
る部位、発現すべきHLA−DR−β鎖ポリペプチドの
寸法、宿主細胞酵素による蛋白質分解に対するポリペプ
チドの感受性、精製の際除去するのが困難な宿主細胞蛋
白質によるポリペプチドの汚染、HLA−DR−β暗号
化配列の発現特性、たとえばDNA暗号化配列の構造お
よび発現制御配列に関する開始および停止コドンの位
置、ならびに当業者に認識されたその他の因子を考慮し
て、本発明のHLA/DR−β−鎖暗号化配列をベクタ
ーにおける発現制御配列へ作用結合させる適当な組合せ
を選択し、これを使用して宿主を形質転換させ、その宿
主を培養して挿入暗号化配列により暗号化されるポリペ
プチドを生産することができる。
−ベクター組合せ物が、特定のHLA/DR暗号化配列
につき同等の効果を有するとは限らない。しかしなが
ら、上記したように、生物安全性の観点から特定の構造
につき本発明のHLA−DR−β暗号化配列に使用しう
る部位、発現すべきHLA−DR−β鎖ポリペプチドの
寸法、宿主細胞酵素による蛋白質分解に対するポリペプ
チドの感受性、精製の際除去するのが困難な宿主細胞蛋
白質によるポリペプチドの汚染、HLA−DR−β暗号
化配列の発現特性、たとえばDNA暗号化配列の構造お
よび発現制御配列に関する開始および停止コドンの位
置、ならびに当業者に認識されたその他の因子を考慮し
て、本発明のHLA/DR−β−鎖暗号化配列をベクタ
ーにおける発現制御配列へ作用結合させる適当な組合せ
を選択し、これを使用して宿主を形質転換させ、その宿
主を培養して挿入暗号化配列により暗号化されるポリペ
プチドを生産することができる。
【0102】DNA配列および発現制御配列をベクター
中に挿入するための種々の方法が当業界で知られてい
る。たとえば、これらは直接的結合、合成リンカ、エキ
ソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ結合した修復反応に
続く結合、或いはDNAポリメラーゼによるDNA鎖の
延長および適当な単一鎖雛型の作成に続く結合を包含す
る。さらに、当業者はこれら方法の1種もしくはそれ以
上を選択して、本発明の範囲を逸脱することなく本発明
のDNA配列を発現させることができる。
中に挿入するための種々の方法が当業界で知られてい
る。たとえば、これらは直接的結合、合成リンカ、エキ
ソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ結合した修復反応に
続く結合、或いはDNAポリメラーゼによるDNA鎖の
延長および適当な単一鎖雛型の作成に続く結合を包含す
る。さらに、当業者はこれら方法の1種もしくはそれ以
上を選択して、本発明の範囲を逸脱することなく本発明
のDNA配列を発現させることができる。
【0103】さらに、本発明の選択宿主−発現制御配列
−ベクター組合せにおいて発現された実際のHLA/D
R−β−鎖暗号化配列は、標準のHLA−DR−β−鎖
抗原とは同一でない生産物を生成しうることを了解すべ
きである。たとえば、発現された暗号化配列は、HLA
−DR−β−鎖とは無関係なHLA−DR−β鎖プラス
メチオニンもしくはその他アミノ酸を暗号化しうるであ
ろう。或いは、発現されたDNA配列は、HLA−DR
−β鎖の1部のみ、或いはメチオニンもしくはその他の
アミノ酸と共に暗号化しうるであろう。これらの作成お
よび生産物も本発明に包含される。たとえば、HLA−
DR−β−鎖状のポリペプチドを暗号化するヌクレオチ
ド配列により形質転換された宿主は、その化合物のみを
生産しうるか、または他のアミノ酸と融合させうるか、
或いはその生産物を分泌することができる。発酵培養物
から単離した後、または慣用の処理方法、たとえば開
裂、合成結合またはその他周知の方法による処理の後、
生産物がHLA−DR−β−鎖抗原の免疫学的もしくは
生物学的活性を示すことのみが必要とされる。
−ベクター組合せにおいて発現された実際のHLA/D
R−β−鎖暗号化配列は、標準のHLA−DR−β−鎖
抗原とは同一でない生産物を生成しうることを了解すべ
きである。たとえば、発現された暗号化配列は、HLA
−DR−β−鎖とは無関係なHLA−DR−β鎖プラス
メチオニンもしくはその他アミノ酸を暗号化しうるであ
ろう。或いは、発現されたDNA配列は、HLA−DR
−β鎖の1部のみ、或いはメチオニンもしくはその他の
アミノ酸と共に暗号化しうるであろう。これらの作成お
よび生産物も本発明に包含される。たとえば、HLA−
DR−β−鎖状のポリペプチドを暗号化するヌクレオチ
ド配列により形質転換された宿主は、その化合物のみを
生産しうるか、または他のアミノ酸と融合させうるか、
或いはその生産物を分泌することができる。発酵培養物
から単離した後、または慣用の処理方法、たとえば開
裂、合成結合またはその他周知の方法による処理の後、
生産物がHLA−DR−β−鎖抗原の免疫学的もしくは
生物学的活性を示すことのみが必要とされる。
【0104】精製後の上記HLA−DR−ポリペプチド
またはそれに対して生成される抗体を使用して、慣用の
HLA−DR判定法もしくはキツトにおいて個体を判定
するのに使用することができ、或いはその他の診断、予
防もしくは治療剤もしくは方法に使用することができ
る。
またはそれに対して生成される抗体を使用して、慣用の
HLA−DR判定法もしくはキツトにおいて個体を判定
するのに使用することができ、或いはその他の診断、予
防もしくは治療剤もしくは方法に使用することができ
る。
【0105】本発明の方法により作成される微生物およ
び組換DNA分子は、メリーランド州・ロツクビル在の
アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンに19
82年7月28日付けで寄託され、かつ次のDR−β−
A、DR−β−BおよびDR−β−C:
び組換DNA分子は、メリーランド州・ロツクビル在の
アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンに19
82年7月28日付けで寄託され、かつ次のDR−β−
A、DR−β−BおよびDR−β−C:
【0106】
【化2】
【0107】として同定された培養物を例とする。
【0108】これら培養物は、それぞれ寄託番号ATC
C39164、39163および39165を得てい
る。
C39164、39163および39165を得てい
る。
【0109】以上、本発明の多くの具体例につき説明し
たが、この基本構成を改変して本発明の方法および組成
物を使用する他の具体例を与えうることが明らかであ
る。したがって、本発明の範囲は上記実施例のみに限定
されることなく、種々の改変をなしうることが了解され
よう。
たが、この基本構成を改変して本発明の方法および組成
物を使用する他の具体例を与えうることが明らかであ
る。したがって、本発明の範囲は上記実施例のみに限定
されることなく、種々の改変をなしうることが了解され
よう。
【0110】
【発明の効果】ひとリンパ球抗原複合体のDR−β−鎖
部位の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチ
ドおよびその製造方法並びに診断判定方法および判定用
生産物につき開示する。β−鎖DR部位を暗号化するD
NA配列は、簡単かつ効率的な判定方法および生産物に
おいて有用であり、かつ診断、予防および治療剤に使用
するHLA−DR−β−鎖の抗原の免疫学的もしくは生
物学的活性を示すポリペプチドを発現するのに有用であ
る。
部位の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチ
ドおよびその製造方法並びに診断判定方法および判定用
生産物につき開示する。β−鎖DR部位を暗号化するD
NA配列は、簡単かつ効率的な判定方法および生産物に
おいて有用であり、かつ診断、予防および治療剤に使用
するHLA−DR−β−鎖の抗原の免疫学的もしくは生
物学的活性を示すポリペプチドを発現するのに有用であ
る。
【図1】染色体6および短腕上のHLA部位の位置を示
す略図である。
す略図である。
【図2】本発明のクローン化法における一具体例の略図
である。
である。
【図3】本発明のクローン83−7,68−6,DR−
β1 ,DR−β2 およびIa−βの部位制限地図であ
り、この地図に示された制限部位は正確でないが、慣用
のヌクレオチド配列はこれらの部位の正確な位置の決定
を可能にすることを示す。
β1 ,DR−β2 およびIa−βの部位制限地図であ
り、この地図に示された制限部位は正確でないが、慣用
のヌクレオチド配列はこれらの部位の正確な位置の決定
を可能にすることを示す。
【図4】HLA−DR−β−A,HLA−DR−β−
B,HLA−DR−β−CおよびHLA−DR−β−D
のcDNA配列の部位制限地図である。
B,HLA−DR−β−CおよびHLA−DR−β−D
のcDNA配列の部位制限地図である。
【図5】cDNA配列HLA−DR−β−Aの配列決定
方法を示す説明図である。
方法を示す説明図である。
【図6】cDNA配列HLA−DR−β−Aのヌクレオ
チドおよびアミノ酸配列を示す説明図である。
チドおよびアミノ酸配列を示す説明図である。
【図7】図6と同じcDNA配列HLA−DR−β−A
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図であ
る。
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図であ
る。
【図8】図6と同じcDNA配列HLA−DR−β−A
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図であ
る。
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図であ
る。
【図9】図6と同じcDNA配列HLA−DR−β−A
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図であ
る。
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図であ
る。
【図10】cDNA配列HLA−DR−β−Aから推測
されるアミノ酸配列と、DR2の同型接合系から単離さ
れたIa抗原β−鎖につきクラツチンにより決定された
アミノ酸配列と、DR3,W6細胞系からラールハンマ
ーにより単離されたcDNAクローンから推測されるア
ミノ酸配列との比較図である。
されるアミノ酸配列と、DR2の同型接合系から単離さ
れたIa抗原β−鎖につきクラツチンにより決定された
アミノ酸配列と、DR3,W6細胞系からラールハンマ
ーにより単離されたcDNAクローンから推測されるア
ミノ酸配列との比較図である。
【図11】図10と同じcDNA配列HLA−DR−β
−Aから推測されるアミノ酸配列と、DR2の同型接合
系から単離されたIa抗原β−鎖につきクラツチンによ
り決定されたアミノ酸配列と、DR3,W6細胞系から
ラールハンマーにより単離されたcDNAクローンから
推測されるアミノ酸配列との比較図である。
−Aから推測されるアミノ酸配列と、DR2の同型接合
系から単離されたIa抗原β−鎖につきクラツチンによ
り決定されたアミノ酸配列と、DR3,W6細胞系から
ラールハンマーにより単離されたcDNAクローンから
推測されるアミノ酸配列との比較図である。
【図12】図10と同じcDNA配列HLA−DR−β
−Aから推測されるアミノ酸配列と、DR2の同型接合
系から単離されたIa抗原β−鎖につきクラツチンによ
り決定されたアミノ酸配列と、DR3,W6細胞系から
ラールハンマーにより単離されたcDNAクローンから
推測されるアミノ酸配列との比較図である。
−Aから推測されるアミノ酸配列と、DR2の同型接合
系から単離されたIa抗原β−鎖につきクラツチンによ
り決定されたアミノ酸配列と、DR3,W6細胞系から
ラールハンマーにより単離されたcDNAクローンから
推測されるアミノ酸配列との比較図である。
【図13】図10と同じcDNA配列HLA−DR−β
−Aから推測されるアミノ酸配列と、DR2の同型接合
系から単離されたIa抗原β−鎖につきクラツチンによ
り決定されたアミノ酸配列と、DR3,W6細胞系から
ラールハンマーにより単離されたcDNAクローンから
推測されるアミノ酸配列との比較図である。
−Aから推測されるアミノ酸配列と、DR2の同型接合
系から単離されたIa抗原β−鎖につきクラツチンによ
り決定されたアミノ酸配列と、DR3,W6細胞系から
ラールハンマーにより単離されたcDNAクローンから
推測されるアミノ酸配列との比較図である。
【図14】cDNA配列HLA−DR−β−Bのヌクレ
オチドおよびアミノ酸配列を示す説明図である。
オチドおよびアミノ酸配列を示す説明図である。
【図15】図14と同じcDNA配列HLA−DR−β
−Bのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図で
ある。
−Bのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図で
ある。
【図16】本発明の判定方法の一具体例を使用して判定
された4種の個体(DR7/7,6/6,3/6および
1/1)からのDNAのサウザンブロツト図である。
された4種の個体(DR7/7,6/6,3/6および
1/1)からのDNAのサウザンブロツト図である。
【図17】cDNAクローンHLA−DR−β−Aおよ
びHLA−DR−β−Bの暗号化領域間におけるヌクレ
オチド配列不適合の3つの領域を示す説明図であり、黒
丸はヌクレオチド不適合を示し、かつ枠はこれら配列か
ら調製された19−化合体を示す。
びHLA−DR−β−Bの暗号化領域間におけるヌクレ
オチド配列不適合の3つの領域を示す説明図であり、黒
丸はヌクレオチド不適合を示し、かつ枠はこれら配列か
ら調製された19−化合体を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 // C12N 15/09 ZNA C12Q 1/68 Z 9453−4B (C12P 21/02 C12R 1:19) (72)発明者 クライア テレス ウエイク アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02145、ソマービル、キッダー ストリー ト 33番
Claims (4)
- 【請求項1】 ポリペプチドが汚染HLA−DR因子か
らフリーであり、かつ発現制御配列に作用結合されたD
NA挿入物を含有する組換DNA分子により形質転換さ
れた宿主を培養する過程で生産されるヒトリンパ球抗原
複合体のHLA−DR部位の少なくとも1つのβ−鎖抗
原の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチド
において、前記DNA挿入物は、前記ポリペプチドを暗
号化し、そして (a)DNA挿入物DR−β−C; (b)前記DNA挿入物にヒブリド化するDNA;およ
び (c)前記DNAのいずれかにより暗号化されたポリペ
プチドを発現に際して暗号化するヌクレオチド配列を有
するDNA; よりなる群から選択されることを特徴とするポリペプチ
ド。 - 【請求項2】 発現制御配列に作用結合されたDNA挿
入物を含有する組換DNA分子により形質転換された宿
主を培養する工程からなるヒトリンパ球抗原複合体のH
LA−DR部位の少なくとも1つのβ−鎖抗原の免疫学
的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドを製造し、
かつそのポリペプチドを収集する方法において、前記D
NA挿入物は、 (a)DNA挿入物DR−β−C; (b)前記DNA挿入物にヒブリド化するDNA;およ
び (c)前記DNAのいずれかにより暗号化されたポリペ
プチドを発現に際して暗号化するヌクレオチド配列を有
するDNA; よりなる群から選択されることを特徴とするポリペプチ
ドの製造収集方法。 - 【請求項3】 HLA−DR判定方法において、請求項
1に記載のポリペプチドまたは前記ポリペプチドに対し
て生じた抗体を使用することを特徴とする改良方法。 - 【請求項4】 HLA−DR判定用キットにおいて、請
求項1に記載のポリペプチドまたはこれらポリペプチド
に対して生じた抗体を使用することを特徴とする改良
物。
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GB8230441 | 1982-10-25 | ||
GB8230441 | 1982-10-25 | ||
GB8222066 | 1982-10-25 |
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JP8207450A Division JPH09117289A (ja) | 1982-07-30 | 1996-08-06 | Hla−dr判定方法および判定用製造物 |
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JP13767993A Expired - Lifetime JP3195859B2 (ja) | 1982-07-30 | 1993-06-08 | ひとリンパ球抗原複合体のDR−β−鎖部位の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドおよびその製造方法並びに診断判定方法および判定用生産物 |
JP6214865A Pending JPH07147988A (ja) | 1982-07-30 | 1994-09-08 | ひとリンパ球抗原複合体のDR−β−鎖部位を暗号化するDNAおよびその製造方法並びに診断判定方法および判定用生産物 |
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JP29048595A Expired - Lifetime JP3195894B2 (ja) | 1982-07-30 | 1995-10-11 | ヒトリンパ球抗原複合体のDRβ−鎖座位の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドをコードするDNAおよびそれを使用する診断型別方法および型別用製造物 |
JP8207450A Pending JPH09117289A (ja) | 1982-07-30 | 1996-08-06 | Hla−dr判定方法および判定用製造物 |
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JP6214865A Pending JPH07147988A (ja) | 1982-07-30 | 1994-09-08 | ひとリンパ球抗原複合体のDR−β−鎖部位を暗号化するDNAおよびその製造方法並びに診断判定方法および判定用生産物 |
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EP (1) | EP0103960B1 (ja) |
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US6818393B1 (en) * | 1982-07-30 | 2004-11-16 | Biomirieux Sa | DNA sequences coding for the DR beta-chain locus of the human lymphocyte antigen complex and polypeptides, diagnostic typing processes and products related thereto |
DE3382137D1 (de) * | 1982-07-30 | 1991-02-28 | Bernard Francois Mach | Dns-sequenzenkodieren fuer den dr-beta-kettenlocus des menschlichen lymphocytantigenkomplexes und polypeptiden, diagnostische typierungsverfahren und produkte die darauf bezug haben. |
CA1314811C (en) * | 1985-06-14 | 1993-03-23 | Gerald T. Nepom | Methods for identifying alleles associated with increased risk of diabetes |
US5066581A (en) * | 1987-02-25 | 1991-11-19 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Differentiation antigen, nda3, associated with the receptor for b cell growth factor |
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FR2684688B1 (fr) * | 1991-12-04 | 1994-03-18 | Bertin Et Cie | Procede de selection d'au moins un crible de mutations, son application a un procede d'identification rapide d'alleles de systemes polymorphes et dispositif pour sa mise en óoeuvre. |
EP1138766A3 (en) * | 1992-10-15 | 2003-05-02 | Toray Industries, Inc. | Process for preparing major histocompatibility antigen class II protein and materials having the same immobilized thereon |
WO1997033904A1 (en) * | 1996-03-12 | 1997-09-18 | Human Genome Sciences, Inc. | Death domain containing receptors |
FR2749308B1 (fr) * | 1996-06-03 | 1998-07-24 | Bio Merieux | Sondes nucleotidiques et procede pour determiner le typage hla dqb1 |
US6391550B1 (en) * | 1996-09-19 | 2002-05-21 | Affymetrix, Inc. | Identification of molecular sequence signatures and methods involving the same |
CA2266745A1 (en) * | 1996-09-19 | 1998-03-26 | Affymetrix, Inc. | Identification of molecular sequence signatures and methods involving the same |
WO1998036091A1 (en) * | 1997-02-14 | 1998-08-20 | Medical Research Council | Method of determining susceptibility to late-onset alzheimer's disease and dementia with lewy bodies |
US7175988B2 (en) * | 2001-02-09 | 2007-02-13 | Human Genome Sciences, Inc. | Human G-protein Chemokine Receptor (CCR5) HDGNR10 |
JP3668942B2 (ja) * | 2002-10-18 | 2005-07-06 | 独立行政法人理化学研究所 | アフリカツメガエル卵母細胞抽出液を用いるタンパク質合成システム |
CA2560349C (en) * | 2006-09-21 | 2014-04-22 | Mohini H. Sain | Manufacturing process for hybrid organic and inorganic fibre-filled composite materials |
US20080283557A1 (en) * | 2007-05-17 | 2008-11-20 | Julianne Desautels | Spout for food stuff container |
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FR2422956A1 (fr) * | 1978-04-13 | 1979-11-09 | Pasteur Institut | Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede |
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DE3047860A1 (de) * | 1980-12-18 | 1982-07-15 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur bestimmung von hla-antigenen |
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DE3381518D1 (de) * | 1982-01-22 | 1990-06-07 | Cetus Corp | Verfahren zur charakterisierung von hla und die darin benutzten cdns-testmittel. |
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DE3382137D1 (de) * | 1982-07-30 | 1991-02-28 | Bernard Francois Mach | Dns-sequenzenkodieren fuer den dr-beta-kettenlocus des menschlichen lymphocytantigenkomplexes und polypeptiden, diagnostische typierungsverfahren und produkte die darauf bezug haben. |
-
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- 1983-07-28 CA CA000433424A patent/CA1295562C/en not_active Expired
- 1983-07-29 US US06/518,393 patent/US5169941A/en not_active Expired - Lifetime
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-
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