JPH08205877A - ヒトリンパ球抗原複合体のＤＲβ−鎖座位のＨＬＡ−ＤＲ型別に有用なＤＮＡ配列および型別方法 - Google Patents
ヒトリンパ球抗原複合体のＤＲβ−鎖座位のＨＬＡ−ＤＲ型別に有用なＤＮＡ配列および型別方法Info
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- JPH08205877A JPH08205877A JP7290484A JP29048495A JPH08205877A JP H08205877 A JPH08205877 A JP H08205877A JP 7290484 A JP7290484 A JP 7290484A JP 29048495 A JP29048495 A JP 29048495A JP H08205877 A JPH08205877 A JP H08205877A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ひとリンパ球抗原複合体のＤＲβ−鎖座位を
コ−ドするＤＮＡ配列に関し、診断型別方法および型別
用製造物にこれらＤＮＡ配列を使用するものであって、
広範囲の病気に対する個体の感受性および組織もしくは
器官移植物の供与体もしくは受容体としての個体の特性
を決定する際に有用な方法および製造物を得る。 【構成】 ひとリンパ球抗原複合体のＤＲβ−鎖、すな
わちＤＲ座位の主要な多形質領域をコードするＤＮＡで
あって、ＤＮＡ挿入物ＤＲ−β−Ａ（ＡＴＣＣ３９１６
４）、ＤＲ−β−Ｂ（ＡＴＣＣ３９１６３）、またはこ
れらの対立遺伝子物によってコードされるポリペプチド
の： (i) 第８〜第１４アミノ酸、 (ii)第２６〜第３２アミノ酸、または (iii) 第７２〜第７８アミノ酸 によって定義される領域の過半数をコードするヌクレオ
チド配列を特徴とするＤＮＡと被検試料ＤＮＡをヒブリ
ド化し、それを検出する工程から成る。
コ−ドするＤＮＡ配列に関し、診断型別方法および型別
用製造物にこれらＤＮＡ配列を使用するものであって、
広範囲の病気に対する個体の感受性および組織もしくは
器官移植物の供与体もしくは受容体としての個体の特性
を決定する際に有用な方法および製造物を得る。 【構成】 ひとリンパ球抗原複合体のＤＲβ−鎖、すな
わちＤＲ座位の主要な多形質領域をコードするＤＮＡで
あって、ＤＮＡ挿入物ＤＲ−β−Ａ（ＡＴＣＣ３９１６
４）、ＤＲ−β−Ｂ（ＡＴＣＣ３９１６３）、またはこ
れらの対立遺伝子物によってコードされるポリペプチド
の： (i) 第８〜第１４アミノ酸、 (ii)第２６〜第３２アミノ酸、または (iii) 第７２〜第７８アミノ酸 によって定義される領域の過半数をコードするヌクレオ
チド配列を特徴とするＤＮＡと被検試料ＤＮＡをヒブリ
ド化し、それを検出する工程から成る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトリンパ球抗原
複合体のＤＲβ−鎖座位をコードするＤＮＡ配列に関す
るものである。さらに詳細には、本発明は、診断型別方
法および診断型別用製造物におけるこれらのＤＮＡ配列
の使用に関するものである。これらの診断型別および製
造物は、多種多様な病気に対する個体の感受性、および
組織もしくは器官移植物の供与体もしくは受容体として
の個体の特性を決定する際に有用である。本発明のＤＮ
Ａ配列は、さらにそれらによりコードされるポリペプチ
ドの発現においても有用である。
複合体のＤＲβ−鎖座位をコードするＤＮＡ配列に関す
るものである。さらに詳細には、本発明は、診断型別方
法および診断型別用製造物におけるこれらのＤＮＡ配列
の使用に関するものである。これらの診断型別および製
造物は、多種多様な病気に対する個体の感受性、および
組織もしくは器官移植物の供与体もしくは受容体として
の個体の特性を決定する際に有用である。本発明のＤＮ
Ａ配列は、さらにそれらによりコードされるポリペプチ
ドの発現においても有用である。
【０００２】ヒトリンパ球抗原（「ＨＬＡ」）系は、ヒ
トにおける主要な組織適合性複合体である。従って、こ
れは個体間の組織および器官移植物に対する最も強いバ
リヤを構成し、明確に自己と非自己とを区別する。さら
に、ＨＬＡ因子は、様々な病気に対する感受性の増強に
関連していることが示されている。従って、ＨＬＡ系の
抗原は、様々な病気に対する個人の感受性を決定するた
めの診断型別方法および診断型別用製造物に使用され、
かつ組織もしくは器官移植物の供与体もしくは受容体と
してのその特性を決定するのに使用される［エフ・エッ
チ・バッハおよびジエー・ジエー・バンルード、Ｎ．Ｅ
ｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第２９５巻、第８０６〜８１３
頁（１９７６）］。
トにおける主要な組織適合性複合体である。従って、こ
れは個体間の組織および器官移植物に対する最も強いバ
リヤを構成し、明確に自己と非自己とを区別する。さら
に、ＨＬＡ因子は、様々な病気に対する感受性の増強に
関連していることが示されている。従って、ＨＬＡ系の
抗原は、様々な病気に対する個人の感受性を決定するた
めの診断型別方法および診断型別用製造物に使用され、
かつ組織もしくは器官移植物の供与体もしくは受容体と
してのその特性を決定するのに使用される［エフ・エッ
チ・バッハおよびジエー・ジエー・バンルード、Ｎ．Ｅ
ｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第２９５巻、第８０６〜８１３
頁（１９７６）］。
【０００３】遺伝学的観点から、ＨＬＡ系はかなり良く
その特性が明らかにされている。たとえば、エル・ピー
・ライダー等「ＨＬＡ病関連の遺伝学」、Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｇｅｎｅｔ．、第１５巻、第１６９〜１８７頁（１
９８１）；ジエー・エル・ストローミンガー等、「免疫
学における主要組織適合性複合体の役割」、エル・ドル
フ編集、ガーランド ＳＰＴＭ プレス社、第１１５〜
１７２頁（１９８１）；テイー・ササズキ等、「主要組
織適合性複合体における遺伝子と疾病感受性との間の関
係」、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．、第２８巻、第４２５
〜４５２頁（１９７７）を参照することができる。これ
は、第６染色体の短腕における約２センチモルガン（ｃ
Ｍ）の間隔内に位置する多かれ少なかれ高度に多形性の
一連の座位から成っている。この系における３つの座位
（ＨＬＡ−Ａ，ＢおよびＣ）は、共優性的に発現される
アロ抗原の１クラスをコードする（クラスＩ）。他の座
位（ＨＬＡ−Ｄ／ＤＲ）は、高度に識別された多形性を
有する共優性アロ抗原の第２のクラスをコードする（ク
ラスII）。補体カスケードの初期成分（Ｃ２，Ｃ４およ
びＢｆ因子）の幾つかを制御する他の３つの座位もＨＬ
Ａ系に属する（種類３）。最後に、ＨＬＡ複合体におけ
るＩａと呼ばれる非特異的領域が存在する。この領域Ｉ
ａはＤＲ座位に関係すると思われるが、これとは異なる
ものである。
その特性が明らかにされている。たとえば、エル・ピー
・ライダー等「ＨＬＡ病関連の遺伝学」、Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｇｅｎｅｔ．、第１５巻、第１６９〜１８７頁（１
９８１）；ジエー・エル・ストローミンガー等、「免疫
学における主要組織適合性複合体の役割」、エル・ドル
フ編集、ガーランド ＳＰＴＭ プレス社、第１１５〜
１７２頁（１９８１）；テイー・ササズキ等、「主要組
織適合性複合体における遺伝子と疾病感受性との間の関
係」、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．、第２８巻、第４２５
〜４５２頁（１９７７）を参照することができる。これ
は、第６染色体の短腕における約２センチモルガン（ｃ
Ｍ）の間隔内に位置する多かれ少なかれ高度に多形性の
一連の座位から成っている。この系における３つの座位
（ＨＬＡ−Ａ，ＢおよびＣ）は、共優性的に発現される
アロ抗原の１クラスをコードする（クラスＩ）。他の座
位（ＨＬＡ−Ｄ／ＤＲ）は、高度に識別された多形性を
有する共優性アロ抗原の第２のクラスをコードする（ク
ラスII）。補体カスケードの初期成分（Ｃ２，Ｃ４およ
びＢｆ因子）の幾つかを制御する他の３つの座位もＨＬ
Ａ系に属する（種類３）。最後に、ＨＬＡ複合体におけ
るＩａと呼ばれる非特異的領域が存在する。この領域Ｉ
ａはＤＲ座位に関係すると思われるが、これとは異なる
ものである。
【０００４】ＨＬＡ系の生物学は、まだ充分に理解され
ていない。クラスＩの因子は、赤血球以外の全ゆる組織
に分布している。クラスIIの因子は、実質的にβ−リン
パ球および単核食細胞に限定され、そしてクラスIII の
補体因子はＣ３因子、すなわち補体系における重要成分
の活性化に直接関係する。ＨＬＡ−ＤＲ抗原は免疫学的
現象、すなわち免疫反応性、Ｔ−細胞抑制、Ｔ−細胞お
よびβ−細胞の共働ならびにＴ−細胞と大食細胞の相互
作用に関係するものと思われる［ビー・ベナセラフ、
「免疫生物学における主要組織適合性複合体の役割」、
エム・イー・ドルフ編、ガーランド ＳＰＴＭ プレス
社、第２５５〜２６９頁（１９８１）］。
ていない。クラスＩの因子は、赤血球以外の全ゆる組織
に分布している。クラスIIの因子は、実質的にβ−リン
パ球および単核食細胞に限定され、そしてクラスIII の
補体因子はＣ３因子、すなわち補体系における重要成分
の活性化に直接関係する。ＨＬＡ−ＤＲ抗原は免疫学的
現象、すなわち免疫反応性、Ｔ−細胞抑制、Ｔ−細胞お
よびβ−細胞の共働ならびにＴ−細胞と大食細胞の相互
作用に関係するものと思われる［ビー・ベナセラフ、
「免疫生物学における主要組織適合性複合体の役割」、
エム・イー・ドルフ編、ガーランド ＳＰＴＭ プレス
社、第２５５〜２６９頁（１９８１）］。
【０００５】ＨＬＡ−ＤＲ抗原は２種の非共有結合グリ
コシル化ペプチド鎖、すなわち分子量約３５０００の重
鎖すなわちα−鎖と分子量約２９０００の軽鎖すなわち
β−鎖とから構成され、これらは細胞膜を画成する［ス
トロミンガー等、上記；およびライダー等、上記］。細
胞内において、分子量約３２０００の第３のペプチド鎖
がα−鎖およびβ−鎖に関連する［デー・ジエー・シャ
ロンおよびエッチ・オー・マックデビット、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．、第１５２巻、第１８ｓ〜３６ｓ頁（１９
８０）；ストロミンガー、上記］。軽鎖すなわちβ−鎖
はＨＬＡ−ＤＲ抗原の多形性を担う一方、α−鎖および
第３の鎖は種々異なる個体において同一であると思われ
る［ジー・コルテ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７８巻、第５３４〜５３８頁（１９
８１）；シャロンおよびマックデビット、上記］。数種
の血清学的に異なるＨＬＡ−ＤＲ抗原が同定されており
（ＨＬＡ−ＤＲ１乃至ＨＬＡ−ＤＲ８）、さらにモノク
ローン抗体によって、同型接合細胞系内におけるＤＲ抗
原の従属部分が決定されている［ヴイ・クワランタ等、
ジャーナル・イミュノロジー、第１２５巻、第１４２１
〜１４２５頁（１９８０）；エス・カレル等、モレキユ
ラ・イミュノロジー、第１８巻、第４０３〜４１１頁
（１９８１）］。さらに、少なくとも２種のＤＲβ−鎖
を、ペプチド分析により数種の同型接合細胞系において
区別することができる［アール・エス・アコラ等、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７８
巻、第４５４９〜４５５１頁（１９８１）］。
コシル化ペプチド鎖、すなわち分子量約３５０００の重
鎖すなわちα−鎖と分子量約２９０００の軽鎖すなわち
β−鎖とから構成され、これらは細胞膜を画成する［ス
トロミンガー等、上記；およびライダー等、上記］。細
胞内において、分子量約３２０００の第３のペプチド鎖
がα−鎖およびβ−鎖に関連する［デー・ジエー・シャ
ロンおよびエッチ・オー・マックデビット、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．、第１５２巻、第１８ｓ〜３６ｓ頁（１９
８０）；ストロミンガー、上記］。軽鎖すなわちβ−鎖
はＨＬＡ−ＤＲ抗原の多形性を担う一方、α−鎖および
第３の鎖は種々異なる個体において同一であると思われ
る［ジー・コルテ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７８巻、第５３４〜５３８頁（１９
８１）；シャロンおよびマックデビット、上記］。数種
の血清学的に異なるＨＬＡ−ＤＲ抗原が同定されており
（ＨＬＡ−ＤＲ１乃至ＨＬＡ−ＤＲ８）、さらにモノク
ローン抗体によって、同型接合細胞系内におけるＤＲ抗
原の従属部分が決定されている［ヴイ・クワランタ等、
ジャーナル・イミュノロジー、第１２５巻、第１４２１
〜１４２５頁（１９８０）；エス・カレル等、モレキユ
ラ・イミュノロジー、第１８巻、第４０３〜４１１頁
（１９８１）］。さらに、少なくとも２種のＤＲβ−鎖
を、ペプチド分析により数種の同型接合細胞系において
区別することができる［アール・エス・アコラ等、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７８
巻、第４５４９〜４５５１頁（１９８１）］。
【０００６】さらに、ＨＬＡ−ＤＲに近縁であるが同一
でない多形性Ｉａ様抗原をコードする種類の他の座位も
存在する［ジー・コルテ等、ネイチヤー誌、第２９２
巻、第３５７〜３６０頁（１９８１）；ナドラー等、ネ
イチヤー誌、第２９０巻、第５９１〜５９３頁（１９８
１）］。これらの明確なサブ領域はＤＣと呼ばれ［アー
ル・トシ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１４８巻、第１
５９２〜１６１１頁（１９７８）；デー・エー・シャッ
ケルフオード等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，第７８巻、第４５６６〜４５７０頁（１９
８１）］、およびＳＢと呼ばれる［エス・ジヨー等、
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１５６巻、第７３１〜７４３
頁（１９８２）］。ＤＣ抗原は、ＤＲ抗原との強い結合
不均衡にある。ＳＢ抗原は、二次的リンパ球反応を制御
しかつＤＲ座位に対し動原体性の領域でコードされる。
でない多形性Ｉａ様抗原をコードする種類の他の座位も
存在する［ジー・コルテ等、ネイチヤー誌、第２９２
巻、第３５７〜３６０頁（１９８１）；ナドラー等、ネ
イチヤー誌、第２９０巻、第５９１〜５９３頁（１９８
１）］。これらの明確なサブ領域はＤＣと呼ばれ［アー
ル・トシ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１４８巻、第１
５９２〜１６１１頁（１９７８）；デー・エー・シャッ
ケルフオード等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，第７８巻、第４５６６〜４５７０頁（１９
８１）］、およびＳＢと呼ばれる［エス・ジヨー等、
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１５６巻、第７３１〜７４３
頁（１９８２）］。ＤＣ抗原は、ＤＲ抗原との強い結合
不均衡にある。ＳＢ抗原は、二次的リンパ球反応を制御
しかつＤＲ座位に対し動原体性の領域でコードされる。
【０００７】
【従来の技術】現在、ＨＬＡ−ＤＲ抗原は、抗血清での
沈殿により血清学的に単離される。従って、ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ抗原決定基の正確な性質は未確定である。しかしなが
ら、これらの抗原は、組織もしくは器官移植物に対する
供与体および受容体の適合性を決定するための、或いは
広範囲の病気に対する個体の感受性を決定するための型
別方法および型別用製造物に使用されている。たとえ
ば、ライダー等（上記）は、ＤＲ１乃至ＤＲ８型別に基
づく次の病気の感受性を報告している：
沈殿により血清学的に単離される。従って、ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ抗原決定基の正確な性質は未確定である。しかしなが
ら、これらの抗原は、組織もしくは器官移植物に対する
供与体および受容体の適合性を決定するための、或いは
広範囲の病気に対する個体の感受性を決定するための型
別方法および型別用製造物に使用されている。たとえ
ば、ライダー等（上記）は、ＤＲ１乃至ＤＲ８型別に基
づく次の病気の感受性を報告している：
【０００８】
【表１】
【０００９】これらの型別からわかるように、Ｄ／ＤＲ
４につき陽性と型別された個体は、Ｄ／ＤＲ４につき陰
性と型別された個体よりも６．４倍高くインシュリン依
存性糖尿病を発生する危険がある。
４につき陽性と型別された個体は、Ｄ／ＤＲ４につき陰
性と型別された個体よりも６．４倍高くインシュリン依
存性糖尿病を発生する危険がある。
【００１０】ある場合には、ある疾病が、疾病関連性の
抗原を有する患者において、この抗原を持たない患者に
おけるよりもさらに重度に現れることも示されている。
たとえば、多発性硬化症の経過は、Ｄ／ＤＲ２陰性の患
者におけるよりもＤ／ＤＲ２陽性の患者においてより急
速である。さらに、ある種の疾病の再発は、疾病関連性
抗原につき陽性の患者においてより一般的である。要す
るに、ＨＬＡ−ＤＲ型別は、大きな診断的および予後判
断的価値を有する。
抗原を有する患者において、この抗原を持たない患者に
おけるよりもさらに重度に現れることも示されている。
たとえば、多発性硬化症の経過は、Ｄ／ＤＲ２陰性の患
者におけるよりもＤ／ＤＲ２陽性の患者においてより急
速である。さらに、ある種の疾病の再発は、疾病関連性
抗原につき陽性の患者においてより一般的である。要す
るに、ＨＬＡ−ＤＲ型別は、大きな診断的および予後判
断的価値を有する。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この様
な型別方法および型別用製造物の使用、ならびに許容し
うる移植供与体および受容体と病気感受性の個体とを同
定する際にこれらがもたらす重要な利点は著しく制約さ
れている。何故なら、現在の型別方法は複雑かつ時間の
かかるものであり、またこの様な型別方法および型別用
製造物に対する有用かつ経済的な原料を供給するために
入手しうるＨＬＡ−ＤＲ抗原が不充分であるからであ
る。
な型別方法および型別用製造物の使用、ならびに許容し
うる移植供与体および受容体と病気感受性の個体とを同
定する際にこれらがもたらす重要な利点は著しく制約さ
れている。何故なら、現在の型別方法は複雑かつ時間の
かかるものであり、またこの様な型別方法および型別用
製造物に対する有用かつ経済的な原料を供給するために
入手しうるＨＬＡ−ＤＲ抗原が不充分であるからであ
る。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＤＲ−β−鎖
をコードするＤＮＡ配列、すなわちヒトリンパ球抗原複
合体のＤＲ座位の主要な多形性領域、およびこれらに関
連する診断型別方法ならびに型別用製造物を提供するこ
とにより上記の問題を解決する。
をコードするＤＮＡ配列、すなわちヒトリンパ球抗原複
合体のＤＲ座位の主要な多形性領域、およびこれらに関
連する診断型別方法ならびに型別用製造物を提供するこ
とにより上記の問題を解決する。
【００１３】
【発明の効果】本発明により、ＨＬＡ−ＤＲ軽鎖すなわ
ちβ−鎖をコードするＤＮＡ配列がＨＬＡ−ＤＲ型別方
法および型別用製造物に使用するため初めて入手しうる
ようになった。本発明のＤＮＡ配列は経済的かつ多量に
生産され得るだけでなく、型別方法および型別用製造物
におけるその使用は前記ＨＬＡ−ＤＲ抗原に基づく型別
方法および型別用製造物を相当に単純化させかつそのコ
ストを低減させる。たとえば、本発明のＤＮＡ型別方法
は簡単であり、１０〜２０ｍｌ程度の少ない血液で行う
ことができ、かつ数千回の型別まで容易に規模拡大する
ことができる。
ちβ−鎖をコードするＤＮＡ配列がＨＬＡ−ＤＲ型別方
法および型別用製造物に使用するため初めて入手しうる
ようになった。本発明のＤＮＡ配列は経済的かつ多量に
生産され得るだけでなく、型別方法および型別用製造物
におけるその使用は前記ＨＬＡ−ＤＲ抗原に基づく型別
方法および型別用製造物を相当に単純化させかつそのコ
ストを低減させる。たとえば、本発明のＤＮＡ型別方法
は簡単であり、１０〜２０ｍｌ程度の少ない血液で行う
ことができ、かつ数千回の型別まで容易に規模拡大する
ことができる。
【００１４】最後に、本発明のＤＮＡ配列は、適当な宿
主におけるこれら配列の発現ならびにそれらによりコー
ドされる特異的ＤＲβ−鎖抗原の生産を他のＨＬＡ−Ｄ
Ｒ因子により汚染されることなく可能にし、これらを診
断剤、予防剤または治療剤として使用することを可能に
する。
主におけるこれら配列の発現ならびにそれらによりコー
ドされる特異的ＤＲβ−鎖抗原の生産を他のＨＬＡ−Ｄ
Ｒ因子により汚染されることなく可能にし、これらを診
断剤、予防剤または治療剤として使用することを可能に
する。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明を一層充分に理解し得るよ
う、以下詳細に説明する。本発明において次の用語を使
用する。
う、以下詳細に説明する。本発明において次の用語を使
用する。
【００１６】ヌクレオチド：糖成分（ペントース）と燐
酸と含窒素複素環式塩基とより成るＤＮＡもしくはＲＮ
Ａのモノマ単位。この塩基はグリコシド炭素（ペントー
スの１´炭素）を介して糖成分に結合され、塩基と糖と
のこの結合をヌクレオチドと呼ぶ。塩基はヌクレオチド
を特性化する。４種のＤＮＡ塩基はアデニン
（「Ａ」），グアニン（「Ｇ」），シトシン（「Ｃ」）
およびチミン（「Ｔ」）である。４種のＲＮＡ塩基は
Ａ，Ｇ，Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）である。
酸と含窒素複素環式塩基とより成るＤＮＡもしくはＲＮ
Ａのモノマ単位。この塩基はグリコシド炭素（ペントー
スの１´炭素）を介して糖成分に結合され、塩基と糖と
のこの結合をヌクレオチドと呼ぶ。塩基はヌクレオチド
を特性化する。４種のＤＮＡ塩基はアデニン
（「Ａ」），グアニン（「Ｇ」），シトシン（「Ｃ」）
およびチミン（「Ｔ」）である。４種のＲＮＡ塩基は
Ａ，Ｇ，Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）である。
【００１７】ＤＮＡ配列：隣接するペントースの３´炭
素と５´炭素との間のホスホジエステル結合により互い
に結合されたヌクレオチドの線状列。
素と５´炭素との間のホスホジエステル結合により互い
に結合されたヌクレオチドの線状列。
【００１８】コドン：ｍＲＮＡを介してアミノ酸、翻訳
開始信号または翻訳停止信号をコードする３個のヌクレ
オチド（トリプレット）のＤＮＡ配列。たとえば、ヌク
レオチドトリプレットＴＴＡ，ＴＴＧ，ＣＴＴ，ＣＴ
Ｃ，ＣＴＡおよびＣＴＧはアミノ酸ロイシン（「Ｌｅ
ｕ」）をコードし、ＴＡＧ，ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳
停止信号であり、かつＡＴＧは翻訳開始信号である。
開始信号または翻訳停止信号をコードする３個のヌクレ
オチド（トリプレット）のＤＮＡ配列。たとえば、ヌク
レオチドトリプレットＴＴＡ，ＴＴＧ，ＣＴＴ，ＣＴ
Ｃ，ＣＴＡおよびＣＴＧはアミノ酸ロイシン（「Ｌｅ
ｕ」）をコードし、ＴＡＧ，ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳
停止信号であり、かつＡＴＧは翻訳開始信号である。
【００１９】読枠：ｍＲＮＡをアミノ酸配列に翻訳する
際のコドンのグループ。翻訳する際、適切な読枠を維持
しなければならない。たとえば、配列ＧＣＴＧＧＴＴＧ
ＴＡＡＧは３つの読枠もしくは相に翻訳することがで
き、そのおのおのは次の異なるアミノ酸配列を与える： ＧＣＴ ＧＧＴ ＴＧＴ ＡＡＧ −− Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ Ｇ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＧ −− Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ ＧＣ ＴＧＧ ＴＴＧ ＴＡＡ Ｇ −− Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−（停止）ポリペプチド ：隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボ
キシ基との間のペプチド結合により互いに結合されたア
ミノ酸の線状列。
際のコドンのグループ。翻訳する際、適切な読枠を維持
しなければならない。たとえば、配列ＧＣＴＧＧＴＴＧ
ＴＡＡＧは３つの読枠もしくは相に翻訳することがで
き、そのおのおのは次の異なるアミノ酸配列を与える： ＧＣＴ ＧＧＴ ＴＧＴ ＡＡＧ −− Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ Ｇ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＧ −− Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ ＧＣ ＴＧＧ ＴＴＧ ＴＡＡ Ｇ −− Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−（停止）ポリペプチド ：隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボ
キシ基との間のペプチド結合により互いに結合されたア
ミノ酸の線状列。
【００２０】ゲノム：細胞もしくはウイルスの全ＤＮ
Ａ。これは特に細胞もしくはウイルスのポリペプチドを
コードする遺伝子、ならびにそのオペレータ、プロモー
タおよびたとえばシャイン−ダルガルノ配列のような配
列を含むリボソーム結合および相互作用配列を包含す
る。
Ａ。これは特に細胞もしくはウイルスのポリペプチドを
コードする遺伝子、ならびにそのオペレータ、プロモー
タおよびたとえばシャイン−ダルガルノ配列のような配
列を含むリボソーム結合および相互作用配列を包含す
る。
【００２１】遺伝子：雛型もしくはメッセンジャＲＮＡ
（「ｍＲＮＡ」）を介して特異的ポリペプチドに特性的
なアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列。
（「ｍＲＮＡ」）を介して特異的ポリペプチドに特性的
なアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列。
【００２２】転写：遺伝子もしくはＤＮＡ配列からｍＲ
ＮＡを生成する過程。
ＮＡを生成する過程。
【００２３】翻訳：ｍＲＮＡからポリペプチドを生成す
る過程。
る過程。
【００２４】発現：ポリペプチドを生成するためＤＮＡ
配列もしくは遺伝子により行なわれる過程。これは転写
と翻訳との組合せである。
配列もしくは遺伝子により行なわれる過程。これは転写
と翻訳との組合せである。
【００２５】プラスミド：完全「レプリコン」からなる
非染色体二重鎖ＤＮＡ配列であって、このプラスミドは
宿主細胞において複製される。プラスミドを単細胞生物
内に挿入すると、この生物の特性をプラスミドのＤＮＡ
の結果として変化もしくは形質転換させることができ
る。たとえば、テトラサイクリン耐性（ＴｅｔR ）に対
する遺伝子を有するプラスミドは、初めテトラサイクリ
ンに対し感受性の細胞をこれに耐性である細胞に形質転
換させる。プラスミドにより形質転換された細胞を「形
質転換体」と呼ぶ。
非染色体二重鎖ＤＮＡ配列であって、このプラスミドは
宿主細胞において複製される。プラスミドを単細胞生物
内に挿入すると、この生物の特性をプラスミドのＤＮＡ
の結果として変化もしくは形質転換させることができ
る。たとえば、テトラサイクリン耐性（ＴｅｔR ）に対
する遺伝子を有するプラスミドは、初めテトラサイクリ
ンに対し感受性の細胞をこれに耐性である細胞に形質転
換させる。プラスミドにより形質転換された細胞を「形
質転換体」と呼ぶ。
【００２６】ファージもしくはバクテリオファージ：細
菌性ウイルスであって、その多くは蛋白質エンベロプも
しくはコートにカプセル化されたＤＮＡ配列より成って
いる（「カプシド蛋白質」）。
菌性ウイルスであって、その多くは蛋白質エンベロプも
しくはコートにカプセル化されたＤＮＡ配列より成って
いる（「カプシド蛋白質」）。
【００２７】クローン化ベヒクル：プラスミド、ファー
ジＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列であって、これは宿
主細胞中に複製することができコート蛋白質の複製およ
び生産のようなＤＮＡの本質的生物機能の喪失を伴なう
ことなくまたはプロモータもしくは結合部位の喪失を伴
なうことなくＤＮＡ配列を決定可能に切断しうる１個も
しくは少数のエンドヌクレアーゼ識別部位により特性化
され、かつ形質転換細胞の同定に使用するのに適した標
識、たとえばテトラサイクリン耐性もしくはアンピシリ
ン耐性を有する。クローン化ベヒクルはしばしばベクタ
ーと呼ばれる。クローン化 ：生物の集落またはこの種の生物もしくは配
列から無性増殖により生成されるＤＮＡ配列を得るため
の過程。
ジＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列であって、これは宿
主細胞中に複製することができコート蛋白質の複製およ
び生産のようなＤＮＡの本質的生物機能の喪失を伴なう
ことなくまたはプロモータもしくは結合部位の喪失を伴
なうことなくＤＮＡ配列を決定可能に切断しうる１個も
しくは少数のエンドヌクレアーゼ識別部位により特性化
され、かつ形質転換細胞の同定に使用するのに適した標
識、たとえばテトラサイクリン耐性もしくはアンピシリ
ン耐性を有する。クローン化ベヒクルはしばしばベクタ
ーと呼ばれる。クローン化 ：生物の集落またはこの種の生物もしくは配
列から無性増殖により生成されるＤＮＡ配列を得るため
の過程。
【００２８】組換ＤＮＡ分子もしくはヒブリドＤＮＡ：
異なるゲノムからのＤＮＡの断片よりなる分子であっ
て、前記ゲノムは生細胞の外部で末端結合され、そして
ある宿主細胞に感染してその中に維持される能力を有す
る。
異なるゲノムからのＤＮＡの断片よりなる分子であっ
て、前記ゲノムは生細胞の外部で末端結合され、そして
ある宿主細胞に感染してその中に維持される能力を有す
る。
【００２９】発現制御配列：ＤＮＡ配列もしくは遺伝子
に作用結合された際、これらの配列もしくは遺伝子の発
現を制御および調整するヌクレオチドの配列。これらは
ｌａｃ系，ｔｒｐ系、ファージλの主オペレータおよび
プロモータ領域、ｆｄコート蛋白質の制御領域ならびに
原核もしくは真核細胞またはそのウイルスの遺伝子の発
現を制御することが知られたその他の配列を包含する。
に作用結合された際、これらの配列もしくは遺伝子の発
現を制御および調整するヌクレオチドの配列。これらは
ｌａｃ系，ｔｒｐ系、ファージλの主オペレータおよび
プロモータ領域、ｆｄコート蛋白質の制御領域ならびに
原核もしくは真核細胞またはそのウイルスの遺伝子の発
現を制御することが知られたその他の配列を包含する。
【００３０】図１は、第６染色体ならびにこの染色体の
短腕におけるＨＬＡ座位の位置の略図である。ＨＬＡ系
の複雑性に鑑み、種々のＩａ様抗原と種々のＨＬＡ−Ｄ
Ｒ抗原自身とを区別し得るｍＲＮＡ翻訳検定法を開発す
ることが重要であった。
短腕におけるＨＬＡ座位の位置の略図である。ＨＬＡ系
の複雑性に鑑み、種々のＩａ様抗原と種々のＨＬＡ−Ｄ
Ｒ抗原自身とを区別し得るｍＲＮＡ翻訳検定法を開発す
ることが重要であった。
【００３１】例えば、ウサギ網状赤血球溶解物系のよう
な無細胞翻訳系は重合蛋白質を構成しない。他方、アフ
リカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵
細胞が各種蛋白質に対する翻訳系として使用されてい
る。従って、この系を選択してＤＲ抗原をコードするｍ
ＲＮＡにつき検定した。この系を用いてＨＬＡ−ＤＲ抗
原の３つのポリペプチド鎖を卵細胞で組立てられるこ
と、および卵細胞から抗−ＤＲモノクローン抗体により
免疫沈降させ得ることを示した。従って、この卵細胞系
は、ＤＲ抗原をコードするｍＲＮＡを選択する方法を与
えた。
な無細胞翻訳系は重合蛋白質を構成しない。他方、アフ
リカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵
細胞が各種蛋白質に対する翻訳系として使用されてい
る。従って、この系を選択してＤＲ抗原をコードするｍ
ＲＮＡにつき検定した。この系を用いてＨＬＡ−ＤＲ抗
原の３つのポリペプチド鎖を卵細胞で組立てられるこ
と、および卵細胞から抗−ＤＲモノクローン抗体により
免疫沈降させ得ることを示した。従って、この卵細胞系
は、ＤＲ抗原をコードするｍＲＮＡを選択する方法を与
えた。
【００３２】上記検定で同定されたＤＲ抗原をコードす
るｍＲＮＡの豊富な分画を使用して、ｍＲＮＡからｃＤ
ＮＡを調製し、これをクローン化させかつ選択し、そし
て本発明のＤＲβ−鎖抗原をコードするＤＮＡ配列を含
むクローンを単離した。次いで、これらＤＮＡ配列を本
発明の型別方法および型別用製造物に使用して、組織お
よび器官移植物に対する適合性を決定すると共に各種の
病気に対する個体の増強した感受性を決定した。さら
に、これらＤＮＡ配列は、それらのコードする抗原を適
当な宿主において他のＨＬＡ−ＤＲ因子により実質的に
汚染されることなく製造させるのに有用であり、病気の
診断、治療および予防に使用することができる。
るｍＲＮＡの豊富な分画を使用して、ｍＲＮＡからｃＤ
ＮＡを調製し、これをクローン化させかつ選択し、そし
て本発明のＤＲβ−鎖抗原をコードするＤＮＡ配列を含
むクローンを単離した。次いで、これらＤＮＡ配列を本
発明の型別方法および型別用製造物に使用して、組織お
よび器官移植物に対する適合性を決定すると共に各種の
病気に対する個体の増強した感受性を決定した。さら
に、これらＤＮＡ配列は、それらのコードする抗原を適
当な宿主において他のＨＬＡ−ＤＲ因子により実質的に
汚染されることなく製造させるのに有用であり、病気の
診断、治療および予防に使用することができる。
【００３３】
【実施例】ポリＡ+ ＲＮＡを含有するＨＬＡ−ＤＲの調製 １０％牛胎仔血清とグルタミンとゲンタマイシンとを補
充したＲＰＭＩ１６４０培地において、ヒトβリンパ芽
球細胞系、すなわちラジ細胞（２種のＤＲ遺伝子、ＤＲ
３およびＤＲ６を有する異型接合細胞系）を増殖させた
（これについてはエス・カレル等によりモレキュラ・イ
ミュノロジー、第１８巻、第４０３〜４１１頁（１９８
１）に実質的に記載されている）。細胞の生成物を追跡
するための標識を与えるため、５０×１０6 個の細胞当
り１ｍＣｉのＳ35−メチオニンを補充した完成メチオニ
ン非含有培地において、２×１０6 個の細胞１ｍｌの濃
度にて３７℃で１６時間培養することにより細胞を代謝
標識した。検定用として非グリコシル化ＤＲ分子を得る
ため、Ｓ35−メチオニンを添加する２時間前に２μｇ／
ｍｌのツニカマイシンを添加した。
充したＲＰＭＩ１６４０培地において、ヒトβリンパ芽
球細胞系、すなわちラジ細胞（２種のＤＲ遺伝子、ＤＲ
３およびＤＲ６を有する異型接合細胞系）を増殖させた
（これについてはエス・カレル等によりモレキュラ・イ
ミュノロジー、第１８巻、第４０３〜４１１頁（１９８
１）に実質的に記載されている）。細胞の生成物を追跡
するための標識を与えるため、５０×１０6 個の細胞当
り１ｍＣｉのＳ35−メチオニンを補充した完成メチオニ
ン非含有培地において、２×１０6 個の細胞１ｍｌの濃
度にて３７℃で１６時間培養することにより細胞を代謝
標識した。検定用として非グリコシル化ＤＲ分子を得る
ため、Ｓ35−メチオニンを添加する２時間前に２μｇ／
ｍｌのツニカマイシンを添加した。
【００３４】凍結細胞ペレットを、氷冷した溶解緩衝液
（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１Ｍ
ＮａＣｌ、１％ノニデットＰ４０）（１ｍｌ緩衝液／１
０8個細胞）において１分間隔で１５秒間４回乱流させ
ることにより溶解させ、そしてこの溶解した細胞をベッ
クマンＪ−６型遠心分離器（４５００×ｇ）にて遠心分
離した（４℃、４ｍｉｎ、４０００ｒｐｍ）。次いで、
４ｍｌの細胞質上澄液を次の濃度勾配にてＳＷ４１ポリ
アロマー管に加えた：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡにおける２ｍｌ ＣｓＣｌ
（５．７Ｍ）；２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）、２ｍＭ ＥＤＴＡにおける４０％〜２０％（Ｗ／
Ｖ）の直線濃度におけるＣｓＣｌ４．２ｍｌ；および２
０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ，４ｍＭ ＥＤＴＡにおける５％（Ｗ／Ｖ）蔗糖溶
液０．８ｍｌ。１４℃にて濃度勾配を均衡化させた後、
ＲＮＡをペレット化させた（１４℃、１４時間、３７０
００ｒｐｍ）。大型ＲＮＡ調製物につき、ＳＷ２７チユ
ーブを１４℃にて２６０００ｒｐｍで１６時間使用し
た。
（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１Ｍ
ＮａＣｌ、１％ノニデットＰ４０）（１ｍｌ緩衝液／１
０8個細胞）において１分間隔で１５秒間４回乱流させ
ることにより溶解させ、そしてこの溶解した細胞をベッ
クマンＪ−６型遠心分離器（４５００×ｇ）にて遠心分
離した（４℃、４ｍｉｎ、４０００ｒｐｍ）。次いで、
４ｍｌの細胞質上澄液を次の濃度勾配にてＳＷ４１ポリ
アロマー管に加えた：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡにおける２ｍｌ ＣｓＣｌ
（５．７Ｍ）；２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）、２ｍＭ ＥＤＴＡにおける４０％〜２０％（Ｗ／
Ｖ）の直線濃度におけるＣｓＣｌ４．２ｍｌ；および２
０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ，４ｍＭ ＥＤＴＡにおける５％（Ｗ／Ｖ）蔗糖溶
液０．８ｍｌ。１４℃にて濃度勾配を均衡化させた後、
ＲＮＡをペレット化させた（１４℃、１４時間、３７０
００ｒｐｍ）。大型ＲＮＡ調製物につき、ＳＷ２７チユ
ーブを１４℃にて２６０００ｒｐｍで１６時間使用し
た。
【００３５】チユーブからＲＮＡを回収するため、チユ
ーブを転倒させそして底部を切除した。次いで、ＲＮＡ
を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡに溶解させ、混合物を０．３Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ５．０）に調整しそしてＲＮＡを２容量のエタノ
ールで沈殿させた。再びＲＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％ＳＤＳ
に溶解させ、これを１００℃にて２分間加熱し、そして
混合物を室温まで冷却した。１容量の１０ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ Ｎａ
Ｃｌを加えた後、ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカ
ラム（コラポラテイブ・リサーチ社）に加え、そしてポ
リＡ+ ＲＮＡ分画をＨ2 Ｏで溶出させそしてこれをＥＤ
ＴＡの不存在下にエタノールで２回沈殿させた（図
２）。
ーブを転倒させそして底部を切除した。次いで、ＲＮＡ
を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡに溶解させ、混合物を０．３Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ５．０）に調整しそしてＲＮＡを２容量のエタノ
ールで沈殿させた。再びＲＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％ＳＤＳ
に溶解させ、これを１００℃にて２分間加熱し、そして
混合物を室温まで冷却した。１容量の１０ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ Ｎａ
Ｃｌを加えた後、ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカ
ラム（コラポラテイブ・リサーチ社）に加え、そしてポ
リＡ+ ＲＮＡ分画をＨ2 Ｏで溶出させそしてこれをＥＤ
ＴＡの不存在下にエタノールで２回沈殿させた（図
２）。
【００３６】緩衝液系（２５ｍＭクエン酸ナトリウムに
おける６Ｍ尿素（ｐＨ３．８）を用いてポリＡ+ ＲＮＡ
をアルガロース−尿素ゲルにおいてサイズ分画した（こ
れについてはローゼン等により、バイオケミストリー
（ワシントン）、第１４巻、第６９〜７８頁（１９７
５）に実質的に記載されている）（図２）。この緩衝液
系は高能力および高分解能の分画化によく適している。
さらに、これは充分に変性する［エッチ・レーラッハ
等、バイオケミストリー、第１６巻、第４７４３〜４７
５１頁（１９７７）］。
おける６Ｍ尿素（ｐＨ３．８）を用いてポリＡ+ ＲＮＡ
をアルガロース−尿素ゲルにおいてサイズ分画した（こ
れについてはローゼン等により、バイオケミストリー
（ワシントン）、第１４巻、第６９〜７８頁（１９７
５）に実質的に記載されている）（図２）。この緩衝液
系は高能力および高分解能の分画化によく適している。
さらに、これは充分に変性する［エッチ・レーラッハ
等、バイオケミストリー、第１６巻、第４７４３〜４７
５１頁（１９７７）］。
【００３７】ポリＡ+ ＲＮＡの分画化を行なうため、５
００μｇのポリＡ+ ＲＮＡを１００μｌの１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５
％ＳＤＳに溶解させ、２００μｌのＤＭＳＯ（９９％）
を加え、そしてこの溶液を１ｍＭ ＥＤＴＡおよびｐＨ
８．０に調整した。次いで、この溶液を４５℃にて５分
間加熱し、４×０．５ｃｍのスロットに加えた（２．５
％アガロースゲル）。このゲルをブロムフェノールブル
ーがゲルの底部に達するまで冷所中で３６時間電気泳動
にかけた。種々のサイズの分画（７００×１６００ヌク
レオチド長）を得るため、２ｍｍの切片をゲルに沿って
切断し、これら分画を４ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＮａＣ
ｌ，０．１ｍｇ／ｍｌイー・コリｔＲＮＡにおいてウル
トラ−ツラックスで分散させた。分散懸濁物を０．５％
ＳＤＳまで調整した後、これを１晩震盪し、次いでポリ
Ａ+ ＲＮＡを上澄液からオリゴ（ｄＴ）−セルロース小
カラムにおけるクロマトグラフィーにより単離し、そし
てこれをＥＤＴＡの不存在下にエタノールで２回沈殿さ
せた。調製ゲル電気泳動の前に、試料中に３´末端標識
されたラジｍＲＮＡを含ませることにより回収を監視し
た。
００μｇのポリＡ+ ＲＮＡを１００μｌの１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５
％ＳＤＳに溶解させ、２００μｌのＤＭＳＯ（９９％）
を加え、そしてこの溶液を１ｍＭ ＥＤＴＡおよびｐＨ
８．０に調整した。次いで、この溶液を４５℃にて５分
間加熱し、４×０．５ｃｍのスロットに加えた（２．５
％アガロースゲル）。このゲルをブロムフェノールブル
ーがゲルの底部に達するまで冷所中で３６時間電気泳動
にかけた。種々のサイズの分画（７００×１６００ヌク
レオチド長）を得るため、２ｍｍの切片をゲルに沿って
切断し、これら分画を４ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＮａＣ
ｌ，０．１ｍｇ／ｍｌイー・コリｔＲＮＡにおいてウル
トラ−ツラックスで分散させた。分散懸濁物を０．５％
ＳＤＳまで調整した後、これを１晩震盪し、次いでポリ
Ａ+ ＲＮＡを上澄液からオリゴ（ｄＴ）−セルロース小
カラムにおけるクロマトグラフィーにより単離し、そし
てこれをＥＤＴＡの不存在下にエタノールで２回沈殿さ
せた。調製ゲル電気泳動の前に、試料中に３´末端標識
されたラジｍＲＮＡを含ませることにより回収を監視し
た。
【００３８】種々のポリＡ+ ＲＮＡ分画のＨＬＡ−ＤＲ
活性（もしあれば）を検定するため、このＲＮＡを卵細
胞中に移殖し、そして生成物を３種のモノクローン抗体
Ｄ1−12，Ｄ4 −22およびＢＴ2.2 ＊で免疫沈降させ
た。この検定において、段階６の卵細胞をアフリカツメ
ガエルの卵巣から、ＣＡ++を含有しないＯＲ２培地にお
ける０．２％粗製コラゲナーゼ（シグマー社Ｃ−０１３
０）中で攪拌しながら室温にて９０〜１２０分間培養し
た後単離した［ワラック等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．、
第１８４巻、第３２１〜３３４頁（１９７３）］。次い
でこれら卵細胞に２０ｎｇのポリＡ+ ＲＮＡの５０ｎｌ
を注入し（これについてはヴイ・エー・モア、ジャーナ
ル・モレキユラー・バイオロジー、第６１巻、第６３〜
１０３頁（１９７１）に実質的に記載されている）、そ
してこれを０．５ｍＣｉ／ｍｌのＳ35−メチオニンと５
０単位／ｍｌペニシリンとストレブトマイシンとを含有
するＯＲ２培地において２４時間培養した。培養後、卵
細胞をホモゲナイズした（これについてはランジャーお
よびツアラーによりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ、第７５巻、第６０７３〜６０７７頁（１
９７８）に実質的に記載されている）。ただし１ｍｌの
緩衝液を５０個の卵細胞当りに使用した＊＊。
活性（もしあれば）を検定するため、このＲＮＡを卵細
胞中に移殖し、そして生成物を３種のモノクローン抗体
Ｄ1−12，Ｄ4 −22およびＢＴ2.2 ＊で免疫沈降させ
た。この検定において、段階６の卵細胞をアフリカツメ
ガエルの卵巣から、ＣＡ++を含有しないＯＲ２培地にお
ける０．２％粗製コラゲナーゼ（シグマー社Ｃ−０１３
０）中で攪拌しながら室温にて９０〜１２０分間培養し
た後単離した［ワラック等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．、
第１８４巻、第３２１〜３３４頁（１９７３）］。次い
でこれら卵細胞に２０ｎｇのポリＡ+ ＲＮＡの５０ｎｌ
を注入し（これについてはヴイ・エー・モア、ジャーナ
ル・モレキユラー・バイオロジー、第６１巻、第６３〜
１０３頁（１９７１）に実質的に記載されている）、そ
してこれを０．５ｍＣｉ／ｍｌのＳ35−メチオニンと５
０単位／ｍｌペニシリンとストレブトマイシンとを含有
するＯＲ２培地において２４時間培養した。培養後、卵
細胞をホモゲナイズした（これについてはランジャーお
よびツアラーによりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ、第７５巻、第６０７３〜６０７７頁（１
９７８）に実質的に記載されている）。ただし１ｍｌの
緩衝液を５０個の卵細胞当りに使用した＊＊。
【００３９】＊ これらのモノクローン抗体およびその
活性は既に報告されている［エス・カレル等、モレキユ
ラ・イミュノロジー、第１８巻、第４０３〜４１１頁
（１９８１）（Ｄ1 −12，Ｄ4 −22）；アール・エス・
アコラ等、ヨーロピアン・ジャーナル・イミュノロジ
ー、第１２巻、第１６６〜１６９頁（１９８２）（ＢＴ
2.2）］。＊＊ 検定用として非グリコシル化生成物を調製するた
め、卵細胞を５０μｇ／ｍｌのツニカマイシンの存在下
で培養し、これらに４０μｇ／ｍｌのツニカマイシンを
含有するＲＮＡ（５０ｎｌ）を注入し、そして５μｇ／
ｍｌのツニカマイシンを含有するＤＲ培地において２４
時間培養した。これについてはコールマン等により、ヨ
ーロピアン・ジャーナル・バイオケミストリー、第１１
３巻、第３３９〜３４８頁（１９８１）に実質的に記載
されている。
活性は既に報告されている［エス・カレル等、モレキユ
ラ・イミュノロジー、第１８巻、第４０３〜４１１頁
（１９８１）（Ｄ1 −12，Ｄ4 −22）；アール・エス・
アコラ等、ヨーロピアン・ジャーナル・イミュノロジ
ー、第１２巻、第１６６〜１６９頁（１９８２）（ＢＴ
2.2）］。＊＊ 検定用として非グリコシル化生成物を調製するた
め、卵細胞を５０μｇ／ｍｌのツニカマイシンの存在下
で培養し、これらに４０μｇ／ｍｌのツニカマイシンを
含有するＲＮＡ（５０ｎｌ）を注入し、そして５μｇ／
ｍｌのツニカマイシンを含有するＤＲ培地において２４
時間培養した。これについてはコールマン等により、ヨ
ーロピアン・ジャーナル・バイオケミストリー、第１１
３巻、第３３９〜３４８頁（１９８１）に実質的に記載
されている。
【００４０】卵細胞ホモゲナイズ物からの上澄液を０．
１５Ｍ ＮａＣｌ、０．２５％ノニデットＰ４０により
２ｍｌに調整し、そしてこれをレンチルレクチン−セフ
ァローズ（ファルマシア社）の１ｍｌカラムに加えた。
このカラムを同じ緩衝液で激しく洗浄した後、０．１Ｍ
α−メチルマノシドを含有する同じ緩衝液でグリコシル
化物質を溶出させた（１．３％Ｓ35−メチオニン含有物
を合併分画中に溶出させた）。その後のクローン化実験
においてはレンチルカラムを省略した。
１５Ｍ ＮａＣｌ、０．２５％ノニデットＰ４０により
２ｍｌに調整し、そしてこれをレンチルレクチン−セフ
ァローズ（ファルマシア社）の１ｍｌカラムに加えた。
このカラムを同じ緩衝液で激しく洗浄した後、０．１Ｍ
α−メチルマノシドを含有する同じ緩衝液でグリコシル
化物質を溶出させた（１．３％Ｓ35−メチオニン含有物
を合併分画中に溶出させた）。その後のクローン化実験
においてはレンチルカラムを省略した。
【００４１】次いで、レンチルレクチンカラムからのグ
リコシル化物質をトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）および
１％アブロテニン（シグマ社）にｐＨ８．０に調整し、
そして１ｍｌ当り２０μｌのＰＸ６３腹水液を加えた。
冷所中で２時間以上培養しかつ過剰の蛋白質Ａ−セファ
ロース（ファルマシア社）の存在下でさらに２時間培養
した後、１ｍｌ当り２０μｌの抗−ＤＲモノクローン抗
体（Ｄ1 −12，Ｄ4−22，ＢＴ2.2 ）の混合物を腹水液
として加えた。これは注入した卵細胞当り１μｌの腹水
液に相当する。４℃にて１晩培養した後、試料を３分間
遠心分離し（エッペンドルフマイクロ分離器）、そして
ペレットを捨てた。この遠心分離は、検定における凝集
物質に基づく大きいバックグランドを避けるために重要
である。
リコシル化物質をトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）および
１％アブロテニン（シグマ社）にｐＨ８．０に調整し、
そして１ｍｌ当り２０μｌのＰＸ６３腹水液を加えた。
冷所中で２時間以上培養しかつ過剰の蛋白質Ａ−セファ
ロース（ファルマシア社）の存在下でさらに２時間培養
した後、１ｍｌ当り２０μｌの抗−ＤＲモノクローン抗
体（Ｄ1 −12，Ｄ4−22，ＢＴ2.2 ）の混合物を腹水液
として加えた。これは注入した卵細胞当り１μｌの腹水
液に相当する。４℃にて１晩培養した後、試料を３分間
遠心分離し（エッペンドルフマイクロ分離器）、そして
ペレットを捨てた。この遠心分離は、検定における凝集
物質に基づく大きいバックグランドを避けるために重要
である。
【００４２】次いで、蛋白質Ａ−セファロースを上澄液
に加え、そして培養を４時間続けた。遠心分離により免
疫沈降物を集め（マイクロ分離）、約４００μｌの５０
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％ノニデットＰ４０、１
０ｍＭメチオニン、１％アブロテニンで２回洗浄し、約
４００μｌの同じ緩衝液（ただしアブロテニンと０．１
５Ｍ ＮａＣｌとを含有せず、０．５ＭのＮａＣｌを含
有する）で３回、さらに約４００μｌの１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５
Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ノニデットＰ４０で２回洗浄し
た。
に加え、そして培養を４時間続けた。遠心分離により免
疫沈降物を集め（マイクロ分離）、約４００μｌの５０
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％ノニデットＰ４０、１
０ｍＭメチオニン、１％アブロテニンで２回洗浄し、約
４００μｌの同じ緩衝液（ただしアブロテニンと０．１
５Ｍ ＮａＣｌとを含有せず、０．５ＭのＮａＣｌを含
有する）で３回、さらに約４００μｌの１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５
Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ノニデットＰ４０で２回洗浄し
た。
【００４３】次いで、免疫沈降物を２５μｌの０．５Ｍ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１Ｍ蔗糖、５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、０．０１％ブロムフェノールブルー、３％ＳＤ
Ｓおよび８．３ｍＭジチオスレイトールの中に１００℃
にて３分間加熱することにより溶解させ、そしてこの溶
液を１２％ポリアクリルアミドＳＤＳゲルに加えた。こ
のゲルを二次元で電気泳動にかけ、第一次元においては
非平衡ｐＨ濃度勾配の電気泳動にかけた（これについて
はピー・ゼット・オーファレル等、セル誌、第１２巻、
第１１３３〜１１４２頁（１９７７）に実質的に記載さ
れている）。これらゲルを１０％トリクロル酢酸中で固
定し、エンハンス（ニュー・イングランド・ヌクレア
社）で処理し、２０％メタノールおよび３％グリセリン
中で洗浄し、そして乾燥させた。乾燥ゲルを予備フラッ
シュされたコダックＸ−ＡＲフィルムに強化スクリーン
（Ｃａｗｏ社）を用いて−７０℃で露出させた。
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１Ｍ蔗糖、５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、０．０１％ブロムフェノールブルー、３％ＳＤ
Ｓおよび８．３ｍＭジチオスレイトールの中に１００℃
にて３分間加熱することにより溶解させ、そしてこの溶
液を１２％ポリアクリルアミドＳＤＳゲルに加えた。こ
のゲルを二次元で電気泳動にかけ、第一次元においては
非平衡ｐＨ濃度勾配の電気泳動にかけた（これについて
はピー・ゼット・オーファレル等、セル誌、第１２巻、
第１１３３〜１１４２頁（１９７７）に実質的に記載さ
れている）。これらゲルを１０％トリクロル酢酸中で固
定し、エンハンス（ニュー・イングランド・ヌクレア
社）で処理し、２０％メタノールおよび３％グリセリン
中で洗浄し、そして乾燥させた。乾燥ゲルを予備フラッ
シュされたコダックＸ−ＡＲフィルムに強化スクリーン
（Ｃａｗｏ社）を用いて−７０℃で露出させた。
【００４４】この検定により、ＨＬＡ−ＤＲのα−鎖、
中間鎖およびβ−鎖をコードするＲＮＡを含有する分画
として、ｍＲＮＡ１２００−１３００ヌクレオチド長を
有する分画３１を同定した。この分画のＲＮＡを全ポリ
Ａ+ ＲＮＡにつき約２０倍濃縮させた。
中間鎖およびβ−鎖をコードするＲＮＡを含有する分画
として、ｍＲＮＡ１２００−１３００ヌクレオチド長を
有する分画３１を同定した。この分画のＲＮＡを全ポリ
Ａ+ ＲＮＡにつき約２０倍濃縮させた。
【００４５】サイズ分画したＲＮＡの検定は、ラジ細胞
からの翻訳ＲＮＡおよびＤＲ抗原の多数回の事前検定に
基づく。これらの検定から、卵細胞はＨＬＡ−ＤＲのα
−鎖、中間鎖およびβ−鎖をコードするＲＮＡを翻訳
し、これら抗原をグリコシル化させ、かつこれらを組立
てることを確認した。さらに、組立物はモノクローン抗
体Ｄ1 −12，Ｄ4 −22およびＢＴ2.2 により免疫沈降さ
れたが、β−鎖のみがＢＴ2.2 により抗原組立物が変性
された後に免疫沈降されたことを確認した。また、α−
鎖は３５０００〜３６０００の明確な分子量を有し、中
間鎖は約３３０００の明確な分子量を有し、かつβ−鎖
はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおいて３１０００
および２９０００の明確な分子量を有することを確認し
た。さらに、非グリコシル化物質は次の通りである：３
００００および２９０００（α−鎖）、２７００（中間
鎖）並びに２７０００および２６０００（β−鎖）。
からの翻訳ＲＮＡおよびＤＲ抗原の多数回の事前検定に
基づく。これらの検定から、卵細胞はＨＬＡ−ＤＲのα
−鎖、中間鎖およびβ−鎖をコードするＲＮＡを翻訳
し、これら抗原をグリコシル化させ、かつこれらを組立
てることを確認した。さらに、組立物はモノクローン抗
体Ｄ1 −12，Ｄ4 −22およびＢＴ2.2 により免疫沈降さ
れたが、β−鎖のみがＢＴ2.2 により抗原組立物が変性
された後に免疫沈降されたことを確認した。また、α−
鎖は３５０００〜３６０００の明確な分子量を有し、中
間鎖は約３３０００の明確な分子量を有し、かつβ−鎖
はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおいて３１０００
および２９０００の明確な分子量を有することを確認し
た。さらに、非グリコシル化物質は次の通りである：３
００００および２９０００（α−鎖）、２７００（中間
鎖）並びに２７０００および２６０００（β−鎖）。
【００４６】ｃＤＮＡクローンの作成 １．ＨＬＡ−ＤＲ ｃＤＮＡの調製 分画３１のポリＡ+ ＲＮＡの単一鎖ｃＤＮＡコピーを調
製するため、ＣＨ3 Ｈｇを５ｍＭまで加えることにより
ＲＮＡを変性させ、そしてこの混合物を室温で１分間静
置した。次いで、この変性ＲＮＡに１ｍｌ／４０μｇＲ
ＮＡの緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、７０ｍＭＫＣｌ、３０ｍ
Ｍ β−メルカプトエタノール、４ｍＭピロ燐酸ナトリ
ウム）と０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＴＴ
Ｐと０．３ｍＭ α−Ｐ32−ｄＣＴＰ（〜０．５μＣｉ
／ｎモル）と４０μｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ）１２−１
８（コラボラティブ・リサーチ社）と３００単位／ｍｌ
の逆転写酵素（ライフ・サイエンス社）とを加え、この
混合物を３７℃にて１０分間および４２℃にて６０分間
加熱した［ワーリ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、第６７巻、
第３７１〜３８３頁（１９７８）］（図２）。〔燐酸ナ
トリウムの添加は沈殿を生ぜしめ、この沈殿は反応を停
止させると消失する。〕 この混合物へＥＤＴＡを１０
ｍＭまで加えかつＳＤＳを０．１％まで加えることによ
り反応を停止させ、そして混合物をフェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコール（１００：９９：１）で
抽出した。水相をセファデックスＧ−５０超微粒カラム
により１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ
ＥＤＴＡで洗浄した。次いで、溶出された混合物をＮ
ａＯＨにて０．５Ｎとなし、これを３７℃で３０分間培
養し、それぞれ５ＭのＨＯＡｃおよび１Ｍのトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．６）の０．１容量で中和し、そして単一
鎖ｃＤＮＡをエタノール沈殿させた。遠心分離によりｃ
ＤＮＡを回収した後、これを５０μｌの０．５Ｎ Ｎａ
ＯＨ中に再懸濁させ、３７℃にて３０分間培養し、そし
てこれを０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ ＮａＯＨ、２
ｍＭ ＥＤＴＡ中で４ｍｌの５〜２０％アルカリ性蔗糖
濃度勾配にて層状化させた。この層状化されたｃＤＮＡ
をＳＷ６０ロータ（５００００ｒｐｍ、１℃、７．５時
間）にてサイズ分画し、そして１０００ヌクレオチド以
上の長さを有するｃＤＮＡを含有する分画を集めた。集
めたＤＮＡを中和し、そして上記と同様に沈殿させた
（図２）。
製するため、ＣＨ3 Ｈｇを５ｍＭまで加えることにより
ＲＮＡを変性させ、そしてこの混合物を室温で１分間静
置した。次いで、この変性ＲＮＡに１ｍｌ／４０μｇＲ
ＮＡの緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、７０ｍＭＫＣｌ、３０ｍ
Ｍ β−メルカプトエタノール、４ｍＭピロ燐酸ナトリ
ウム）と０．５ｍＭ ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＴＴ
Ｐと０．３ｍＭ α−Ｐ32−ｄＣＴＰ（〜０．５μＣｉ
／ｎモル）と４０μｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ）１２−１
８（コラボラティブ・リサーチ社）と３００単位／ｍｌ
の逆転写酵素（ライフ・サイエンス社）とを加え、この
混合物を３７℃にて１０分間および４２℃にて６０分間
加熱した［ワーリ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、第６７巻、
第３７１〜３８３頁（１９７８）］（図２）。〔燐酸ナ
トリウムの添加は沈殿を生ぜしめ、この沈殿は反応を停
止させると消失する。〕 この混合物へＥＤＴＡを１０
ｍＭまで加えかつＳＤＳを０．１％まで加えることによ
り反応を停止させ、そして混合物をフェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコール（１００：９９：１）で
抽出した。水相をセファデックスＧ−５０超微粒カラム
により１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ
ＥＤＴＡで洗浄した。次いで、溶出された混合物をＮ
ａＯＨにて０．５Ｎとなし、これを３７℃で３０分間培
養し、それぞれ５ＭのＨＯＡｃおよび１Ｍのトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．６）の０．１容量で中和し、そして単一
鎖ｃＤＮＡをエタノール沈殿させた。遠心分離によりｃ
ＤＮＡを回収した後、これを５０μｌの０．５Ｎ Ｎａ
ＯＨ中に再懸濁させ、３７℃にて３０分間培養し、そし
てこれを０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ ＮａＯＨ、２
ｍＭ ＥＤＴＡ中で４ｍｌの５〜２０％アルカリ性蔗糖
濃度勾配にて層状化させた。この層状化されたｃＤＮＡ
をＳＷ６０ロータ（５００００ｒｐｍ、１℃、７．５時
間）にてサイズ分画し、そして１０００ヌクレオチド以
上の長さを有するｃＤＮＡを含有する分画を集めた。集
めたＤＮＡを中和し、そして上記と同様に沈殿させた
（図２）。
【００４７】上記の集めた分画からｃＤＮＡを６８℃で
９０秒間加熱しかつ氷中で急冷させて変性させることに
より二重鎖ｃＤＮＡを調製した。次いで、次の反応混合
物を調整した：単一鎖ｃＤＮＡ（４０μｇ／ｍｌ）、５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2 、７０ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭβ−メルカプトエ
タノール、０．５ｍＭのそれぞれｄＮＴＰおよび３００
単位／ｍｌの逆転写酵素。この混合物を３７℃で１０分
間および４２℃で９０分間加熱した。ＥＤＴＡを１０ｍ
Ｍまで加えることにより再び反応を停止させ、そしてこ
れをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール
（１００：９９：１）で抽出し、そしてセファデックス
Ｇ−５０カラムにて１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
６）、１ｍＭ ＥＤＴＡでクロマトグラフにかけた。
９０秒間加熱しかつ氷中で急冷させて変性させることに
より二重鎖ｃＤＮＡを調製した。次いで、次の反応混合
物を調整した：単一鎖ｃＤＮＡ（４０μｇ／ｍｌ）、５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2 、７０ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭβ−メルカプトエ
タノール、０．５ｍＭのそれぞれｄＮＴＰおよび３００
単位／ｍｌの逆転写酵素。この混合物を３７℃で１０分
間および４２℃で９０分間加熱した。ＥＤＴＡを１０ｍ
Ｍまで加えることにより再び反応を停止させ、そしてこ
れをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール
（１００：９９：１）で抽出し、そしてセファデックス
Ｇ−５０カラムにて１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
６）、１ｍＭ ＥＤＴＡでクロマトグラフにかけた。
【００４８】二重鎖ｃＤＮＡ調製物におけるヘヤピンル
ープを６０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭＮａＯＡｃ（ｐＨ
４．８）、０．５ｍＭ ＺｎＣｌ2 、〜３０μｇ／ｍｌ
二重鎖ｃＤＮＡ、１００単位／ｍｌＳ1 ヌクレアーゼ
（Ｐ−Ｌバイオケミカルス社）を含有する反応混合物に
おいて混合物を３７℃で３０分間加熱することによりＳ
1 ヌクレアーゼで切断した。ＥＤＴＡを１０ｍＭまで加
えかつトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を１００ｍＭまで
加えることにより反応を停止させ、混合物をフェノール
／クロロホルム／イソアミルアルコール（１００：９
９：１）で抽出し、そしてこれをセファロースＣＬ−Ｇ
Ｂカラムにより１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
６）、１ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄して精製した。次いで、
ｃＤＮＡを上記と同様にＥｔＯＨにて沈殿させた。
ープを６０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭＮａＯＡｃ（ｐＨ
４．８）、０．５ｍＭ ＺｎＣｌ2 、〜３０μｇ／ｍｌ
二重鎖ｃＤＮＡ、１００単位／ｍｌＳ1 ヌクレアーゼ
（Ｐ−Ｌバイオケミカルス社）を含有する反応混合物に
おいて混合物を３７℃で３０分間加熱することによりＳ
1 ヌクレアーゼで切断した。ＥＤＴＡを１０ｍＭまで加
えかつトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を１００ｍＭまで
加えることにより反応を停止させ、混合物をフェノール
／クロロホルム／イソアミルアルコール（１００：９
９：１）で抽出し、そしてこれをセファロースＣＬ−Ｇ
Ｂカラムにより１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
６）、１ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄して精製した。次いで、
ｃＤＮＡを上記と同様にＥｔＯＨにて沈殿させた。
【００４９】２．ＨＬＡ−ＤＲ ｃＤＮＡのクローン化 広範囲の宿主／クローン化ベヒクル組合せ物を使用し
て、二重鎖ｃＤＮＡをクローン化させることができる。
さらに、それぞれ特異的クローン化ベヒクルにおいて、
種々の部位を選択することにより二重鎖ｃＤＮＡを挿入
することができる。当業者が本発明の範囲を逸脱するこ
となく、本発明のＤＮＡ配列をクローン化するために、
これらの様々な選択肢の中から特定して選択することが
できることは理解されるであろう。
て、二重鎖ｃＤＮＡをクローン化させることができる。
さらに、それぞれ特異的クローン化ベヒクルにおいて、
種々の部位を選択することにより二重鎖ｃＤＮＡを挿入
することができる。当業者が本発明の範囲を逸脱するこ
となく、本発明のＤＮＡ配列をクローン化するために、
これらの様々な選択肢の中から特定して選択することが
できることは理解されるであろう。
【００５０】初期のクローン化研究において、細菌性プ
ラスミドｐＢＲ３２２（エフ・ポリバール等、「新規な
クローン化ベヒクルの作成および特性化II. 多目的クロ
ーン化方式」、ジーン誌、第２(2) 巻、第９５〜１１４
頁（１９７７）；ジエー・ジー・サットクリフ、「ＤＮ
Ａ配列から得られるｐＢＲ３２２制限地図；４３６１ヌ
クレオチド対長さまでの正確なＤＮＡサイズ標識」、ヌ
クレイック・アシッド・リサーチ、第５巻、第２７２１
〜２７２８（１９７８））。さらに、ＰｓｔＩ部位［エ
ル・ピラ・コマロフ等、「プロインシュリンを合成する
細菌性クローン」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ、第７５巻、第３７２７〜３７３１頁（１
９７８）］、ｄＣ／ｄＧ切断［エル・ピラ・コマロフ
等、上記］およびイー・コリＨＢ１０１を選択した。
ラスミドｐＢＲ３２２（エフ・ポリバール等、「新規な
クローン化ベヒクルの作成および特性化II. 多目的クロ
ーン化方式」、ジーン誌、第２(2) 巻、第９５〜１１４
頁（１９７７）；ジエー・ジー・サットクリフ、「ＤＮ
Ａ配列から得られるｐＢＲ３２２制限地図；４３６１ヌ
クレオチド対長さまでの正確なＤＮＡサイズ標識」、ヌ
クレイック・アシッド・リサーチ、第５巻、第２７２１
〜２７２８（１９７８））。さらに、ＰｓｔＩ部位［エ
ル・ピラ・コマロフ等、「プロインシュリンを合成する
細菌性クローン」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ、第７５巻、第３７２７〜３７３１頁（１
９７８）］、ｄＣ／ｄＧ切断［エル・ピラ・コマロフ
等、上記］およびイー・コリＨＢ１０１を選択した。
【００５１】ａ．ＰｓｔＩ−開裂されたｄＧ−切断ｐＢ
Ｒ３２２の調製 標準条件を用いてＰｓｔＩによりｐＢＲ３２２を切断し
た。次いで、２０ｍＭＫ−カコジル酸塩、５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ６．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１
ｍＭ ｄＧＴＰ、２００μｇ／ｍｌ線状化ｐＢＲ３２２
および２５単位／ｍｌ末端トランスフェラーゼの反応混
合物を調製した。この混合物を３７℃にて４５分間加熱
した後、ＥＤＴＡを１０ｍＭまで加えかつＳＤＳを０．
５％まで加えて反応を停止させ、そしてこの混合物を氷
中で１５分間急冷し、遠心分離（マイクロ遠心分離器、
２分間、４℃）によりｄＣ切断されたＨＬＡ−ＤＲ ｃ
ＤＮＡにアニールさせるため上澄液を調製した（図
２）。
Ｒ３２２の調製 標準条件を用いてＰｓｔＩによりｐＢＲ３２２を切断し
た。次いで、２０ｍＭＫ−カコジル酸塩、５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ６．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１
ｍＭ ｄＧＴＰ、２００μｇ／ｍｌ線状化ｐＢＲ３２２
および２５単位／ｍｌ末端トランスフェラーゼの反応混
合物を調製した。この混合物を３７℃にて４５分間加熱
した後、ＥＤＴＡを１０ｍＭまで加えかつＳＤＳを０．
５％まで加えて反応を停止させ、そしてこの混合物を氷
中で１５分間急冷し、遠心分離（マイクロ遠心分離器、
２分間、４℃）によりｄＣ切断されたＨＬＡ−ＤＲ ｃ
ＤＮＡにアニールさせるため上澄液を調製した（図
２）。
【００５２】ｂ．ｄＣ切断ＨＬＡ−ＤＲ ｃＤＮＡの調
製 ｄＣ切断物を、２００ｍＭ Ｋ−カコジル酸塩，５０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．９）、１ｍＭ ｄＣＴＰ、
１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（ペンテックス社）、〜２μ
ｇ／ｍｌ ｃＤＮＡおよび１２５単位／ｍｌ末端デオキ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミ
カルス社）を含有する反応混合物において３７℃でこの
混合物を１〜６分間加熱することにより上記と同様に調
製されたｃＤＮＡへ加えた。少量部を用いることによ
り、最適な反応時間を選択した（通常約４分間）。次い
で、この時間を使用してｃＤＮＡを切断した。再びＥＤ
ＴＡを１０ｍＭまで加えかつＳＤＳを０．５％まで加
え、さらに混合物を氷中で１５分間急冷することにより
反応を停止させた。ｄＣ切断されたｃＤＮＡを単離して
これを遠心分離によりｄＧ切断されたＰｓｔ−開裂ｐＢ
Ｒ３２２へアニールさせた（マイクロ遠心分離器、２分
間、４℃）。
製 ｄＣ切断物を、２００ｍＭ Ｋ−カコジル酸塩，５０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．９）、１ｍＭ ｄＣＴＰ、
１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（ペンテックス社）、〜２μ
ｇ／ｍｌ ｃＤＮＡおよび１２５単位／ｍｌ末端デオキ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミ
カルス社）を含有する反応混合物において３７℃でこの
混合物を１〜６分間加熱することにより上記と同様に調
製されたｃＤＮＡへ加えた。少量部を用いることによ
り、最適な反応時間を選択した（通常約４分間）。次い
で、この時間を使用してｃＤＮＡを切断した。再びＥＤ
ＴＡを１０ｍＭまで加えかつＳＤＳを０．５％まで加
え、さらに混合物を氷中で１５分間急冷することにより
反応を停止させた。ｄＣ切断されたｃＤＮＡを単離して
これを遠心分離によりｄＧ切断されたＰｓｔ−開裂ｐＢ
Ｒ３２２へアニールさせた（マイクロ遠心分離器、２分
間、４℃）。
【００５３】ｃ．ｄＣ切断ｃＤＮＡおよびｄＧ切断ｐＢ
Ｒ３２２のアニール化 上記のように調製した４０ｎｇのｄＣ切断ｃＤＮＡと、
上記のように調製した２５０ｎｇのｄＧ切断されたＰｓ
ｔ開裂ｐＢＲ３２２とをアニール化用緩衝液（１０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．２Ｍ ＮａＣｌ）において６８℃で２時間混合し、
次いで徐々に冷却した（図２）。
Ｒ３２２のアニール化 上記のように調製した４０ｎｇのｄＣ切断ｃＤＮＡと、
上記のように調製した２５０ｎｇのｄＧ切断されたＰｓ
ｔ開裂ｐＢＲ３２２とをアニール化用緩衝液（１０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．２Ｍ ＮａＣｌ）において６８℃で２時間混合し、
次いで徐々に冷却した（図２）。
【００５４】上記のように調製された組換ＤＮＡ分子の
僅かのものが、実際にＨＬＡ−ＤＲのβ−鎖、すなわち
軽鎖、すなわちＨＬＡ−ＤＲ座の主たる多形性領域をコ
ードするＤＮＡ配列を含有することが了解されよう。事
実、大部分のクローン化された種類は、ＨＬＡ−ＤＲに
対し或いはそのβ−鎖に対し無関係である。
僅かのものが、実際にＨＬＡ−ＤＲのβ−鎖、すなわち
軽鎖、すなわちＨＬＡ−ＤＲ座の主たる多形性領域をコ
ードするＤＮＡ配列を含有することが了解されよう。事
実、大部分のクローン化された種類は、ＨＬＡ−ＤＲに
対し或いはそのβ−鎖に対し無関係である。
【００５５】３．ヒブリドによるイー・コリＨＢ１０１
のトランスフェクション 競合イー・コリＨＢ１０１（ｒｅｃＡ- ）を上記のヒブ
リドにより形質転換させた（これについては、ディー・
モリソンによりジャーナル・バクテリオロジー、第１３
２巻、第３４９〜３５１頁（１９７７）に記載されてい
る）。
のトランスフェクション 競合イー・コリＨＢ１０１（ｒｅｃＡ- ）を上記のヒブ
リドにより形質転換させた（これについては、ディー・
モリソンによりジャーナル・バクテリオロジー、第１３
２巻、第３４９〜３５１頁（１９７７）に記載されてい
る）。
【００５６】プラスミドｐＢＲ３２２はアンピシリン耐
性とテトラサイクリン耐性とをコードする遺伝子を含
み、かつ前者の遺伝子はＰｓｔＩ部位におけるｃＤＮＡ
挿入により失活されるので、ＰｓｔＩ部位にｃＤＮＡ挿
入物を有する組換ＤＮＡ分子で形質転換された集落を、
そのように形質転換されていない集落から選択すること
ができる。従って、上記のように形質転換されたイー・
コリ菌体を１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有す
る洗浄かつオートクレープ処理されたシュライヒャーお
よびシュエルのニトロセルロースフィルターに塗沫した
［ディー・ハナハンおよびエム・メセルソン、ジーン
誌、第１０巻、第６３〜６７頁（１９８０）］。この方
法を用いて５５０種のｃＤＮＡクローンを作成した（図
２）。
性とテトラサイクリン耐性とをコードする遺伝子を含
み、かつ前者の遺伝子はＰｓｔＩ部位におけるｃＤＮＡ
挿入により失活されるので、ＰｓｔＩ部位にｃＤＮＡ挿
入物を有する組換ＤＮＡ分子で形質転換された集落を、
そのように形質転換されていない集落から選択すること
ができる。従って、上記のように形質転換されたイー・
コリ菌体を１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有す
る洗浄かつオートクレープ処理されたシュライヒャーお
よびシュエルのニトロセルロースフィルターに塗沫した
［ディー・ハナハンおよびエム・メセルソン、ジーン
誌、第１０巻、第６３〜６７頁（１９８０）］。この方
法を用いて５５０種のｃＤＮＡクローンを作成した（図
２）。
【００５７】ＨＬＡ−ＤＲ ｃＤＮＡを含有するクロー
ンの選別 特定の組換ＤＮＡ分子を含有するクローン、すなわちＨ
ＬＡ−ＤＲ−β−鎖関連のＤＮＡ挿入物を含有するクロ
ーンにつき、クローンの保存物を選別するには幾つかの
方法がある。これらの方法は当業界で充分周知されてい
る。初期のクローン選別において、ポリＡ+ ＲＮＡに対
する高基準の陽性ヒブリド化選択をジアゾベンジルオキ
シメチル紙（シュライヒャーおよびシュエル）において
使用するよう選択した。本発明の方法はゴールドベルク
等、メソッド・エンチモロジー、第６８巻、第２０６〜
２２０頁（１９７９）の方法から改変させた。ヒブリド
化に対する実験基準としては、５０個の集落の保存物に
おいて１個のＤＲ−β−ｃＤＮＡ−関連クローンを検出
しうると予想した。
ンの選別 特定の組換ＤＮＡ分子を含有するクローン、すなわちＨ
ＬＡ−ＤＲ−β−鎖関連のＤＮＡ挿入物を含有するクロ
ーンにつき、クローンの保存物を選別するには幾つかの
方法がある。これらの方法は当業界で充分周知されてい
る。初期のクローン選別において、ポリＡ+ ＲＮＡに対
する高基準の陽性ヒブリド化選択をジアゾベンジルオキ
シメチル紙（シュライヒャーおよびシュエル）において
使用するよう選択した。本発明の方法はゴールドベルク
等、メソッド・エンチモロジー、第６８巻、第２０６〜
２２０頁（１９７９）の方法から改変させた。ヒブリド
化に対する実験基準としては、５０個の集落の保存物に
おいて１個のＤＲ−β−ｃＤＮＡ−関連クローンを検出
しうると予想した。
【００５８】５５０個の選別したクローンをそれぞれ５
０個のクローンの１１群に分け、これらを１０μｇ／ｍ
ｌのテトラサイクリンを補充したＬ−培地で増殖させ
た。次いで、クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）
によりプラスミドを１晩処理し、そして慣用の清澄溶菌
物ＣｓＣｌ濃度勾配法を使用してこれら保存物からプラ
スミドＤＮＡを調製した。次いで、プラスミドＤＮＡを
０．５％ジエチルピロ炭酸エステルで処理し、これをセ
ファロースＢカラム（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．６），１ｍＭ ＥＤＴＡ）に通して、小さい汚染性
ＲＮＡ分子を除去した。プラスミドＤＮＡを０．２５Ｎ
ＨＣｌ中で室温にて１０分間部分的に処理し、混合物
を０．５ＮのＮａＯＨ、０．５Ｍ ＮａＣｌまで調製
し、２０分間培養し、ＨＣｌで中和し、そしてＤＮＡを
ＥｔＯＨにより２回沈殿させた。次いで、調製されたジ
アゾベンジルオキシメチル紙（シュライヒャーおよびシ
ュエル）を調製し、これに上記で調製されたＤＮＡを共
融結合させた（これについてはゴールドベルク等、上記
により実質的に記載されている）。Ｐ32−標識ＤＮＡト
レーサを混合物中に含ませることによりＤＮＡの滞留に
つき監視した。平均して１５μｇのＤＮＡがそれぞれ１
ｃｍ2 のフィルタに結合された。
０個のクローンの１１群に分け、これらを１０μｇ／ｍ
ｌのテトラサイクリンを補充したＬ−培地で増殖させ
た。次いで、クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）
によりプラスミドを１晩処理し、そして慣用の清澄溶菌
物ＣｓＣｌ濃度勾配法を使用してこれら保存物からプラ
スミドＤＮＡを調製した。次いで、プラスミドＤＮＡを
０．５％ジエチルピロ炭酸エステルで処理し、これをセ
ファロースＢカラム（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．６），１ｍＭ ＥＤＴＡ）に通して、小さい汚染性
ＲＮＡ分子を除去した。プラスミドＤＮＡを０．２５Ｎ
ＨＣｌ中で室温にて１０分間部分的に処理し、混合物
を０．５ＮのＮａＯＨ、０．５Ｍ ＮａＣｌまで調製
し、２０分間培養し、ＨＣｌで中和し、そしてＤＮＡを
ＥｔＯＨにより２回沈殿させた。次いで、調製されたジ
アゾベンジルオキシメチル紙（シュライヒャーおよびシ
ュエル）を調製し、これに上記で調製されたＤＮＡを共
融結合させた（これについてはゴールドベルク等、上記
により実質的に記載されている）。Ｐ32−標識ＤＮＡト
レーサを混合物中に含ませることによりＤＮＡの滞留に
つき監視した。平均して１５μｇのＤＮＡがそれぞれ１
ｃｍ2 のフィルタに結合された。
【００５９】これらフィルタを５０％ホルムアミド（２
回再結晶化させかつ脱イオン化したもの）、２０ｍＭ
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、２
ｍＭＥＤＴＡ、０．４％ＳＤＳ、１％グリシン、０．３
ｍｇ／ｍｌイー・コリｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍｌポリ
Ａにおいて３７℃で２〜４時間予備ヒブリド化させた。
ヒブリド化するため、１１枚のフィルタを〜２００ｍｌ
の同じ緩衝液（グリシン，ｔＲＮＡおよびポリＡを含ま
ない）において３７℃で２０時間にわたり３００μｇの
全ポリＡ+ ＲＮＡ（上記のように調製）で処理した。次
いで、これらフィルタをヒブリド化緩衝液で３７℃にて
３０分間３回洗浄し、２２℃で１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．１％ＳＤＳにて３０分間３回洗浄し、次いで５
０℃にて１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡにより１０分間３回洗浄した。
回再結晶化させかつ脱イオン化したもの）、２０ｍＭ
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、２
ｍＭＥＤＴＡ、０．４％ＳＤＳ、１％グリシン、０．３
ｍｇ／ｍｌイー・コリｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍｌポリ
Ａにおいて３７℃で２〜４時間予備ヒブリド化させた。
ヒブリド化するため、１１枚のフィルタを〜２００ｍｌ
の同じ緩衝液（グリシン，ｔＲＮＡおよびポリＡを含ま
ない）において３７℃で２０時間にわたり３００μｇの
全ポリＡ+ ＲＮＡ（上記のように調製）で処理した。次
いで、これらフィルタをヒブリド化緩衝液で３７℃にて
３０分間３回洗浄し、２２℃で１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．１％ＳＤＳにて３０分間３回洗浄し、次いで５
０℃にて１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡにより１０分間３回洗浄した。
【００６０】ヒブリド化ＲＮＡを１５０μｌの５ｍＭト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、
６μｇ／ｍｌウサギｔＲＮＡにより２つの部分に溶出
し、その際フィルタを含む溶液を９８℃にて７５秒間加
熱した。次いで、混合物を０．３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ
５．０）まで調整し、そしてＲＮＡをＥｔＯＨにより２
回沈殿させた。
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、
６μｇ／ｍｌウサギｔＲＮＡにより２つの部分に溶出
し、その際フィルタを含む溶液を９８℃にて７５秒間加
熱した。次いで、混合物を０．３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ
５．０）まで調整し、そしてＲＮＡをＥｔＯＨにより２
回沈殿させた。
【００６１】上記からのＲＮＡにＨＬＡ−ＤＲ α−鎖
および中間鎖（ｃＤＮＡ過剰の条件下で２５μｇのポリ
Ａ+ ＲＮＡから選択し、かつ卵細胞分析により確認）に
対するｍＲＮＡを補充し、そして補充されたＲＮＡを卵
細胞に注入して上記と同様に分析した。ＲＮＡをこのよ
うに処理して免疫沈降のレベルを増大させると共に、可
能なクローンを検出する機会を増大させた。卵細胞によ
り合成されたα−鎖および中間鎖抗原の存在を監視する
ため、各卵細胞抽出物の１／４を、遊離α−鎖および中
間鎖を結合する抗−ＤＲ−ウサギ血清１３３［カレル
等、モレキュラ・イミュノロジー、第１８巻、第４０３
〜４１１頁（１９８１）］で免疫沈降させた。各卵細胞
抽出物の残部３／４を抗−ＤＲ−モノクローン抗体（Ｄ
1 −12，Ｄ4 −22，ＢＴ2.2 ）によって免疫沈降させ
た。１１個の保存物のうち２個において、少量のＤＲ−
抗原（β）が注入卵細胞で合成された＊。
および中間鎖（ｃＤＮＡ過剰の条件下で２５μｇのポリ
Ａ+ ＲＮＡから選択し、かつ卵細胞分析により確認）に
対するｍＲＮＡを補充し、そして補充されたＲＮＡを卵
細胞に注入して上記と同様に分析した。ＲＮＡをこのよ
うに処理して免疫沈降のレベルを増大させると共に、可
能なクローンを検出する機会を増大させた。卵細胞によ
り合成されたα−鎖および中間鎖抗原の存在を監視する
ため、各卵細胞抽出物の１／４を、遊離α−鎖および中
間鎖を結合する抗−ＤＲ−ウサギ血清１３３［カレル
等、モレキュラ・イミュノロジー、第１８巻、第４０３
〜４１１頁（１９８１）］で免疫沈降させた。各卵細胞
抽出物の残部３／４を抗−ＤＲ−モノクローン抗体（Ｄ
1 −12，Ｄ4 −22，ＢＴ2.2 ）によって免疫沈降させ
た。１１個の保存物のうち２個において、少量のＤＲ−
抗原（β）が注入卵細胞で合成された＊。
【００６２】＊ 幾つかの保存物においてはさらに３７
０００ダルトンのバンドも免疫沈降された。この蛋白質
は同定しなかった。
０００ダルトンのバンドも免疫沈降された。この蛋白質
は同定しなかった。
【００６３】２種の陽性のものの各々を１０個のクロー
ンからなる５群に分け、かつヒブリド化させて、これら
を上記と同様に分析した。元の２種の陽性のものの各々
から誘導された５群のうちの１群は、再び陽性であっ
た。次いで、２つの陽性の群の各々を、それぞれ１個の
クローンよりなる１０群に分け、かつヒブリド化させて
これらを上記と同様に分析した。２つの陽性クローンを
選択した：クローン６８およびクローン８３−７。
ンからなる５群に分け、かつヒブリド化させて、これら
を上記と同様に分析した。元の２種の陽性のものの各々
から誘導された５群のうちの１群は、再び陽性であっ
た。次いで、２つの陽性の群の各々を、それぞれ１個の
クローンよりなる１０群に分け、かつヒブリド化させて
これらを上記と同様に分析した。２つの陽性クローンを
選択した：クローン６８およびクローン８３−７。
【００６４】クローン８３−７はヒブリド化の条件下で
ＤＲ−β鎖ｍＲＮＡを極めて効率的に選択した。このｍ
ＲＮＡは卵細胞において抗原を生成し、この抗原をαお
よび中間鎖ＲＮＡによる補充なしに抗−ＤＲモノクロー
ン抗体（Ｄ1 −12，Ｄ4 −22，ＢＴ2.2 ）により免疫沈
降させた。逆に、クローン６８−６はＤＲ−β鎖ｍＲＮ
Ａの選択において遥かに効率が低かった。クローン８３
−７は１８０ｂｐの挿入物を有し、かつクローン６８−
６は４７０ｂｐの挿入物を有した。これら挿入物はクロ
スヒブリド化しなかった。
ＤＲ−β鎖ｍＲＮＡを極めて効率的に選択した。このｍ
ＲＮＡは卵細胞において抗原を生成し、この抗原をαお
よび中間鎖ＲＮＡによる補充なしに抗−ＤＲモノクロー
ン抗体（Ｄ1 −12，Ｄ4 −22，ＢＴ2.2 ）により免疫沈
降させた。逆に、クローン６８−６はＤＲ−β鎖ｍＲＮ
Ａの選択において遥かに効率が低かった。クローン８３
−７は１８０ｂｐの挿入物を有し、かつクローン６８−
６は４７０ｂｐの挿入物を有した。これら挿入物はクロ
スヒブリド化しなかった。
【００６５】図３はＤＲ領域におけるクローン８３−７
のｃＤＮＡ挿入物の位置およびＩａ様領域におけるクロ
ーン６８−６のｃＤＮＡ挿入物の位置を示している。Ｉ
ａ様領域をＨＬＡ座位の領域と呼び（図１）。クローン
６８−６はＩａと名付けられる。何故なら、これはＨＬ
Ａ／ＤＲに関連するがそれと同一でない領域を示すから
である。
のｃＤＮＡ挿入物の位置およびＩａ様領域におけるクロ
ーン６８−６のｃＤＮＡ挿入物の位置を示している。Ｉ
ａ様領域をＨＬＡ座位の領域と呼び（図１）。クローン
６８−６はＩａと名付けられる。何故なら、これはＨＬ
Ａ／ＤＲに関連するがそれと同一でない領域を示すから
である。
【００６６】さらに、ゲル移動ヒブリド化によりこれら
２種のｃＤＮＡクローンに相同であるＲＮＡを分析し
た。両ｃＤＮＡクローンは長さ約１３００ヌクレオチド
のポリＡ+ ＲＮＡとヒブリド化し、２種のβ−細胞系お
よび慢性リンパ白血病を有する患者からのβ−細胞で発
現されたが、３種のＴ細胞系、膵臓および肝臓には存在
しなかった。また、６８−６ｃＤＮＡ挿入物は長さ１６
５０ヌクレオチドの他のＲＮＡバンドにヒブリド化した
が、８３−７ｃＤＮＡ挿入物は長さ１９００ヌクレオチ
ドの他のＲＮＡバンドにヒブリド化した。
２種のｃＤＮＡクローンに相同であるＲＮＡを分析し
た。両ｃＤＮＡクローンは長さ約１３００ヌクレオチド
のポリＡ+ ＲＮＡとヒブリド化し、２種のβ−細胞系お
よび慢性リンパ白血病を有する患者からのβ−細胞で発
現されたが、３種のＴ細胞系、膵臓および肝臓には存在
しなかった。また、６８−６ｃＤＮＡ挿入物は長さ１６
５０ヌクレオチドの他のＲＮＡバンドにヒブリド化した
が、８３−７ｃＤＮＡ挿入物は長さ１９００ヌクレオチ
ドの他のＲＮＡバンドにヒブリド化した。
【００６７】クローン８３−７および６８−６にヒブリ
ド化するラジ由来のクローンの選別 クローン８３−７および６８−６のＤＮＡ挿入物を試料
として使用し、上記と同様に調製された全ポリＡ+ ＲＮ
Ａ由来のクローン（ラジ細胞）の保存物を鋭意選別し
て、ＨＬＡ−ＤＲ βコード領域から他の好ましいより
長くかつより完全なＤＮＡ配列を位置決定した。
ド化するラジ由来のクローンの選別 クローン８３−７および６８−６のＤＮＡ挿入物を試料
として使用し、上記と同様に調製された全ポリＡ+ ＲＮ
Ａ由来のクローン（ラジ細胞）の保存物を鋭意選別し
て、ＨＬＡ−ＤＲ βコード領域から他の好ましいより
長くかつより完全なＤＮＡ配列を位置決定した。
【００６８】ＰｓｔＩでの処理により２種のクローンの
プラスミドＤＮＡから挿入物を切除し、これらを中性蔗
糖勾配遠心分離およびアクリルアミドゲル電気泳動によ
り精製した。溶出された断片をＤＥＡＥカラムに通し、
精製された挿入物を標識した（これについてはエム・グ
ルンシュタインおよびディー・ホグネスにより「コロニ
ーヒブリド化：特異的遺伝子を含有するクローン化ＤＮ
Ａの単離方法」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、第７２巻、第３９６１〜３９６５頁（１９
７５）；リグビー等、ジャーナル・モレキュラ・バイオ
ロジー、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（１９７７）
に実質的に記載されている）。そして（α−Ｐ32）ヌク
レオチドおよびＤＮＡポリメラーゼＩ（ベ−リンガーマ
ンハイム社）によってニック翻訳により２×１０8 ｃｐ
ｍ／μｇ、まで精製した［リグビー等、上記］。次い
で、この試料を使用して、高基準条件（下記）を用いて
より長いヒブリド化関連ｃＤＮＡクローンにつき保存物
を選別した。
プラスミドＤＮＡから挿入物を切除し、これらを中性蔗
糖勾配遠心分離およびアクリルアミドゲル電気泳動によ
り精製した。溶出された断片をＤＥＡＥカラムに通し、
精製された挿入物を標識した（これについてはエム・グ
ルンシュタインおよびディー・ホグネスにより「コロニ
ーヒブリド化：特異的遺伝子を含有するクローン化ＤＮ
Ａの単離方法」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、第７２巻、第３９６１〜３９６５頁（１９
７５）；リグビー等、ジャーナル・モレキュラ・バイオ
ロジー、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（１９７７）
に実質的に記載されている）。そして（α−Ｐ32）ヌク
レオチドおよびＤＮＡポリメラーゼＩ（ベ−リンガーマ
ンハイム社）によってニック翻訳により２×１０8 ｃｐ
ｍ／μｇ、まで精製した［リグビー等、上記］。次い
で、この試料を使用して、高基準条件（下記）を用いて
より長いヒブリド化関連ｃＤＮＡクローンにつき保存物
を選別した。
【００６９】この選別から、より長いｃＤＮＡ挿入物を
含有する多数のクローンを単離した。これらクローンの
挿入物をＤＲ−β1 、ＤＲ−β2 およびＩａ−β1 と名
付けた。これら挿入物により画成される領域を第３図に
示す。第３図に示したように、ＤＮＡ挿入物ＤＲ−β1
およびＤＲ−β2 はＤＲ座位に関連する一方、Ｉａ−β
1 はＩａ領域に関連する。
含有する多数のクローンを単離した。これらクローンの
挿入物をＤＲ−β1 、ＤＲ−β2 およびＩａ−β1 と名
付けた。これら挿入物により画成される領域を第３図に
示す。第３図に示したように、ＤＮＡ挿入物ＤＲ−β1
およびＤＲ−β2 はＤＲ座位に関連する一方、Ｉａ−β
1 はＩａ領域に関連する。
【００７０】さらに、これらクローンの種々の断片を用
いて幾つかのヒブリド化基準でクロスヒブリド化実験を
行ない、選択された種々異なるｃＤＮＡクローン間の類
似性の程度を決定した。ｃＤＮＡクローンの３´未翻訳
部分からのＤＮＡ配列は高基準（Ｔｍより５℃低い）、
中間基準（Ｔｍより２４℃低い）または低基準（Ｔｍよ
り４３℃低い）においてクロスヒブリド化しなかった。
いて幾つかのヒブリド化基準でクロスヒブリド化実験を
行ない、選択された種々異なるｃＤＮＡクローン間の類
似性の程度を決定した。ｃＤＮＡクローンの３´未翻訳
部分からのＤＮＡ配列は高基準（Ｔｍより５℃低い）、
中間基準（Ｔｍより２４℃低い）または低基準（Ｔｍよ
り４３℃低い）においてクロスヒブリド化しなかった。
【００７１】逆に、ＤＲβ−鎖座位ではなくＩａ様領域
の第１領域をコードするクローンの５´末端におけるＤ
ＮＡ配列は、中間基準でクロスヒブリド化した。従っ
て、ＤＲ関連ＤＮＡ配列はＩａ関連配列にクロスヒブリ
ド化しないが、Ｉａ関連配列は他のＩａ関連配列にクロ
スヒブリド化する。
の第１領域をコードするクローンの５´末端におけるＤ
ＮＡ配列は、中間基準でクロスヒブリド化した。従っ
て、ＤＲ関連ＤＮＡ配列はＩａ関連配列にクロスヒブリ
ド化しないが、Ｉａ関連配列は他のＩａ関連配列にクロ
スヒブリド化する。
【００７２】ｃＤＮＡ挿入物の制限地図 各種の制限エンドヌクレアーゼによる単一および二重処
理を用いた制限分析により、各種のｃＤＮＡクローンの
ＨＬＡ関連挿入物を地図化した。エンドヌクレアーゼの
供給業者（ニユー・イングランド・バイオラブ社、ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリー社、ベーリンガー社）に
より推奨される条件および緩衝液を使用し、そして得ら
れた断片をアガロースゲル上で分析した。
理を用いた制限分析により、各種のｃＤＮＡクローンの
ＨＬＡ関連挿入物を地図化した。エンドヌクレアーゼの
供給業者（ニユー・イングランド・バイオラブ社、ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリー社、ベーリンガー社）に
より推奨される条件および緩衝液を使用し、そして得ら
れた断片をアガロースゲル上で分析した。
【００７３】さらに図３は、選別工程において位置決定
された各種のｃＤＮＡ挿入物の部分制限地図を示してい
る。勿論、図３に示された制限部位の実際の位置は不正
確である。慣用方法を用いるヌクレオチド配列は、他の
予測部位と同様に特定部位に適切に位置決定するであろ
う。
された各種のｃＤＮＡ挿入物の部分制限地図を示してい
る。勿論、図３に示された制限部位の実際の位置は不正
確である。慣用方法を用いるヌクレオチド配列は、他の
予測部位と同様に特定部位に適切に位置決定するであろ
う。
【００７４】上記したように、ラジ細胞は異型接合性、
すなわちＤＲ３／６である。従って、２種の異なる配列
ＤＲ−β1 およびＤＲ−β2 がこれら細胞から生成され
るｃＤＮＡに存在するという事実は、これらクローンを
特性化する２種のＤＮＡ配列がβ−鎖コード配列の異な
る種類から生ずるということを明確に示していない。寧
ろ、これら２種は異型接合細胞系の２種のＤＲ型の対立
型種類である。
すなわちＤＲ３／６である。従って、２種の異なる配列
ＤＲ−β1 およびＤＲ−β2 がこれら細胞から生成され
るｃＤＮＡに存在するという事実は、これらクローンを
特性化する２種のＤＮＡ配列がβ−鎖コード配列の異な
る種類から生ずるということを明確に示していない。寧
ろ、これら２種は異型接合細胞系の２種のＤＲ型の対立
型種類である。
【００７５】クローンＤＲ−β1 にヒブリド化するＩＢ
Ｗ９由来のクローンの選別 ヒブリド化試料としてＤＮＡ挿入物ＤＲ−β1 を使用し
て、ヒトβ細胞系、ＩＢＷ９から得られた全ポリＡ+ Ｒ
ＮＡの２００００個のクローンの保存物を選別した。こ
の保存物は、ラジ細胞保存物について前記したと同様に
調製した。ＩＢＷ９は、血族関係によりＨＬＡに対し元
来同型接合性であると思われた細胞系である。しかしな
がら、これはその後、２つの研究室によりＤＲ４，Ｗ６
異型接合系として個々に分類された。
Ｗ９由来のクローンの選別 ヒブリド化試料としてＤＮＡ挿入物ＤＲ−β1 を使用し
て、ヒトβ細胞系、ＩＢＷ９から得られた全ポリＡ+ Ｒ
ＮＡの２００００個のクローンの保存物を選別した。こ
の保存物は、ラジ細胞保存物について前記したと同様に
調製した。ＩＢＷ９は、血族関係によりＨＬＡに対し元
来同型接合性であると思われた細胞系である。しかしな
がら、これはその後、２つの研究室によりＤＲ４，Ｗ６
異型接合系として個々に分類された。
【００７６】同型接合細胞系と思われるものを使用し
て、ラジ細胞のような異型接合細胞系に存在しうる対立
多形性を検出するのが困難な上記の可能性を回避した。
異型接合系に対比して、同型接合細胞系からのクローン
に検出されるβ−鎖クローンは、定義において異なるβ
−鎖遺伝子族を示すであろう。しかしながら、上記した
ように、本発明に使用した系統は実際には異型接合系で
あった。
て、ラジ細胞のような異型接合細胞系に存在しうる対立
多形性を検出するのが困難な上記の可能性を回避した。
異型接合系に対比して、同型接合細胞系からのクローン
に検出されるβ−鎖クローンは、定義において異なるβ
−鎖遺伝子族を示すであろう。しかしながら、上記した
ように、本発明に使用した系統は実際には異型接合系で
あった。
【００７７】この異型接合細胞系由来の保存物を選別し
た結果、ＨＬＡ−ＤＲ−関連ＤＮＡ配列の４つの種類を
位置決定した。これら種類のコード配列を制限地図化＊
に基づきＤＲ−β−Ａ，ＤＲ−β−Ｂ，ＤＲ−β−Ｃお
よびＤＲ−β−Ｄと名付けた。勿論、他のβ−鎖種類も
存在しうることを了解すべきである。たとえば、アコラ
（上記）は７種のこの種のものを予測している。このよ
うな種類は、本発明のＤＲ−β1 ，ＤＲ−β2 ，ＤＲ−
β−Ａ，ＤＲ−β−Ｂ，ＤＲ−β−ＣまたはＤＲ−β−
Ｄ配列またはその断片を用いて高基準のヒブリド化にて
（実質的に上記したと同様）または他の同様な方法を用
いて選別しうるので本発明の１部である。
た結果、ＨＬＡ−ＤＲ−関連ＤＮＡ配列の４つの種類を
位置決定した。これら種類のコード配列を制限地図化＊
に基づきＤＲ−β−Ａ，ＤＲ−β−Ｂ，ＤＲ−β−Ｃお
よびＤＲ−β−Ｄと名付けた。勿論、他のβ−鎖種類も
存在しうることを了解すべきである。たとえば、アコラ
（上記）は７種のこの種のものを予測している。このよ
うな種類は、本発明のＤＲ−β1 ，ＤＲ−β2 ，ＤＲ−
β−Ａ，ＤＲ−β−Ｂ，ＤＲ−β−ＣまたはＤＲ−β−
Ｄ配列またはその断片を用いて高基準のヒブリド化にて
（実質的に上記したと同様）または他の同様な方法を用
いて選別しうるので本発明の１部である。
【００７８】＊ これら挿入物を含むクローンをイー・
コリＨＢ１０１（ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ−β−Ａ乃至Ｄ）と命名し、これはそのＰｓｔＩ制限
部位に特定のＨＬＡ−ＤＲ−β関連ＤＮＡ挿入物を有す
るｐＢＲ３２２からなる組換ＤＮＡ分子により形質転換
されたイー・コリＨＢ１０１菌体であることを意味す
る。
コリＨＢ１０１（ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ−β−Ａ乃至Ｄ）と命名し、これはそのＰｓｔＩ制限
部位に特定のＨＬＡ−ＤＲ−β関連ＤＮＡ挿入物を有す
るｐＢＲ３２２からなる組換ＤＮＡ分子により形質転換
されたイー・コリＨＢ１０１菌体であることを意味す
る。
【００７９】４種のＤＲ−βクローンにおけるクローン
はそのコード領域および非コード領域全体にわたり充分
にクロスヒブリド化する。これらは、極めて厳密に制限
地図およびクロスヒブリド化によって区別することがで
きる（図４）。従って、これらは恐らく４種の異なるＤ
Ｒ−遺伝子から得られた４種のｍＲＮＡを示している。
これらはＤＲ（４，Ｗ６）に対し異型接合細胞系から得
られるので、これら４種のＤＲ−β遺伝子はＤＲ−鎖を
コードする少なくとも２つの非対立座位を示すと思われ
る。この結論は、さらにβ1 試料を用いて同じβ細胞系
から単離したゲノムＤＮＡクローンの分析により裏付け
らる。
はそのコード領域および非コード領域全体にわたり充分
にクロスヒブリド化する。これらは、極めて厳密に制限
地図およびクロスヒブリド化によって区別することがで
きる（図４）。従って、これらは恐らく４種の異なるＤ
Ｒ−遺伝子から得られた４種のｍＲＮＡを示している。
これらはＤＲ（４，Ｗ６）に対し異型接合細胞系から得
られるので、これら４種のＤＲ−β遺伝子はＤＲ−鎖を
コードする少なくとも２つの非対立座位を示すと思われ
る。この結論は、さらにβ1 試料を用いて同じβ細胞系
から単離したゲノムＤＮＡクローンの分析により裏付け
らる。
【００８０】ｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列 ヌクレオチド配列を決定するため、上記のように、ＤＮ
Ａ挿入物ＤＲ−β−Ａ，ＤＲ−β−Ｂ，ＤＲ−β−Ｃお
よびＤＲ−β−Ｄからの制限断片を調製し、これらをア
クリルアミドゲルから抽出し、そしてＤＥＡＥセルロー
スカラムで精製した。これら断片を（α−Ｐ32）コルジ
アピン−５´−トリホスフェート（アメルシャム社）お
よび末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
（Ｐ−Ｌバイオケミカルス社）により３´標識し、或い
はこれらを牛の腸ホスファターゼ（エス・クラークソン
による寄贈）およびポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌ
バイオケミカルス社）により５´標識した。これら標識
された断片につき、マキサムおよびギルバートにより
「ＤＮＡの新規な配列決定方法」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７４巻、第５２０〜５６４頁
（１９７７）に実質的記載されているように配列決定し
た。殆んどのｃＤＮＡについては両ストランドから配列
決定し、かつ標識末端として作用する殆んどの制限部位
についてはそれらを画成する断片を用いて配列決定し
た。
Ａ挿入物ＤＲ−β−Ａ，ＤＲ−β−Ｂ，ＤＲ−β−Ｃお
よびＤＲ−β−Ｄからの制限断片を調製し、これらをア
クリルアミドゲルから抽出し、そしてＤＥＡＥセルロー
スカラムで精製した。これら断片を（α−Ｐ32）コルジ
アピン−５´−トリホスフェート（アメルシャム社）お
よび末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
（Ｐ−Ｌバイオケミカルス社）により３´標識し、或い
はこれらを牛の腸ホスファターゼ（エス・クラークソン
による寄贈）およびポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌ
バイオケミカルス社）により５´標識した。これら標識
された断片につき、マキサムおよびギルバートにより
「ＤＮＡの新規な配列決定方法」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７４巻、第５２０〜５６４頁
（１９７７）に実質的記載されているように配列決定し
た。殆んどのｃＤＮＡについては両ストランドから配列
決定し、かつ標識末端として作用する殆んどの制限部位
についてはそれらを画成する断片を用いて配列決定し
た。
【００８１】図５、図６、図７、図８および図９は、配
列決定方法およびｃＤＮＡクローンＨＬＡ−ＤＲ−β−
Ａ＊のコードストランドのヌクレオチドおよびアミノ酸
配列を示している。クローンＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａにお
いて、３５個のヌクレオチドが最初のＡＴＧトリプレッ
トに先行する。このＡＴＧは長さ２６６個のアミノ酸の
開放読枠における最初のコドンである。１１個の連続し
た疎水性残基のコアを有する最初の２９個のアミノ酸
は、ヒトＩａ抗原のβ−鎖につき決定された部分アミノ
酸配列と高度の類似性を有する配列に先行する［ディー
・エー・シャッケルフオード等、イミュノロジー・レビ
ユー、第６６巻、第１３３〜１８７頁（１９８２）］。
従って、最初の２９個のアミノ酸（図６においてＮｏ−
１〜−２９）は恐らく信号配列を示し、残部２３７個の
アミノ酸（図６、図７、図８および図９においてＮｏ１
〜２３７）は成熟蛋白質（１９９個のアミノ酸）とトラ
ンスメンブラン領域（２２個のアミノ酸）と細胞質末端
（１６個のアミノ酸）とを示す。図６、図７および図８
に示したように、コード配列の細胞外部分には４個のシ
ステインが存在する（位置１５，７９，１１７および１
７３）。
列決定方法およびｃＤＮＡクローンＨＬＡ−ＤＲ−β−
Ａ＊のコードストランドのヌクレオチドおよびアミノ酸
配列を示している。クローンＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａにお
いて、３５個のヌクレオチドが最初のＡＴＧトリプレッ
トに先行する。このＡＴＧは長さ２６６個のアミノ酸の
開放読枠における最初のコドンである。１１個の連続し
た疎水性残基のコアを有する最初の２９個のアミノ酸
は、ヒトＩａ抗原のβ−鎖につき決定された部分アミノ
酸配列と高度の類似性を有する配列に先行する［ディー
・エー・シャッケルフオード等、イミュノロジー・レビ
ユー、第６６巻、第１３３〜１８７頁（１９８２）］。
従って、最初の２９個のアミノ酸（図６においてＮｏ−
１〜−２９）は恐らく信号配列を示し、残部２３７個の
アミノ酸（図６、図７、図８および図９においてＮｏ１
〜２３７）は成熟蛋白質（１９９個のアミノ酸）とトラ
ンスメンブラン領域（２２個のアミノ酸）と細胞質末端
（１６個のアミノ酸）とを示す。図６、図７および図８
に示したように、コード配列の細胞外部分には４個のシ
ステインが存在する（位置１５，７９，１１７および１
７３）。
【００８２】＊ このクローンに対する部分ヌクレオチ
ドおよびアミノ酸配列（ＡＡ７９−９５）は英国特許出
願第８２２２０６６号および第８２３０４４１号明細書
に示された。
ドおよびアミノ酸配列（ＡＡ７９−９５）は英国特許出
願第８２２２０６６号および第８２３０４４１号明細書
に示された。
【００８３】図１０、図１１、図１２および図１３は、
クローンＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａから推定したアミノ酸配
列と、ＤＲ２同型接合系［エッチ・クラッチン等、ホッ
ペ・セイラース・ツァイトシュリフト・フィジオロジッ
シエ・ケミー、第３６２巻、第１６６５〜１６９９頁
（１９８１）］から単離されたＩａ抗原β−鎖につきク
ラッチンにより決定された配列と、ＤＲ３，Ｗ６細胞系
［ディー・ラルハンマー等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７９巻、第３６８７〜３６９
１頁（１９８２）］から単離されたｃＤＮＡクローンに
より推定される配列とのアミノ酸配列比較を示してい
る。最後の配列は、ＤＣβ−鎖クローンであると思われ
る。何故なら、その推定配列はＤＳβ−鎖［エス・エム
・ゴイエルト等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１５６巻、
第５５０〜５６６頁（１９８２）］＊につき決定された
部分Ｎ−末端配列に匹敵するからである。
クローンＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａから推定したアミノ酸配
列と、ＤＲ２同型接合系［エッチ・クラッチン等、ホッ
ペ・セイラース・ツァイトシュリフト・フィジオロジッ
シエ・ケミー、第３６２巻、第１６６５〜１６９９頁
（１９８１）］から単離されたＩａ抗原β−鎖につきク
ラッチンにより決定された配列と、ＤＲ３，Ｗ６細胞系
［ディー・ラルハンマー等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７９巻、第３６８７〜３６９
１頁（１９８２）］から単離されたｃＤＮＡクローンに
より推定される配列とのアミノ酸配列比較を示してい
る。最後の配列は、ＤＣβ−鎖クローンであると思われ
る。何故なら、その推定配列はＤＳβ−鎖［エス・エム
・ゴイエルト等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１５６巻、
第５５０〜５６６頁（１９８２）］＊につき決定された
部分Ｎ−末端配列に匹敵するからである。
【００８４】＊ ＤＳおよびＤＣ抗原は同一であり、か
つマウスＩ−Ａ Ｉａ抗原に対し極めて良好な類似性を
示すことがエス・エム・ゴイエルト等により、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．、第１５６巻、第５５０〜５６６頁（１９
８２）；アール・ボノおよびジエー・エル・ストロミン
ガー、ネイチヤー誌、第２９９巻、第８３６〜８３８頁
（１９８２）に記載されている。
つマウスＩ−Ａ Ｉａ抗原に対し極めて良好な類似性を
示すことがエス・エム・ゴイエルト等により、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．、第１５６巻、第５５０〜５６６頁（１９
８２）；アール・ボノおよびジエー・エル・ストロミン
ガー、ネイチヤー誌、第２９９巻、第８３６〜８３８頁
（１９８２）に記載されている。
【００８５】図１４および図１５は、他のＨＬＡ−ＤＲ
−βクローン［ＨＬＡ−ＤＥ−β−Ｂ］のヌクレオチド
およびアミノ酸配列を示している。さらに、このクロー
ンから推定されるアミノ酸配列は２９個のアミノ酸より
なる推定信号配列と、２３７個の他のアミノ酸とをコー
ド領域に有する。
−βクローン［ＨＬＡ−ＤＥ−β−Ｂ］のヌクレオチド
およびアミノ酸配列を示している。さらに、このクロー
ンから推定されるアミノ酸配列は２９個のアミノ酸より
なる推定信号配列と、２３７個の他のアミノ酸とをコー
ド領域に有する。
【００８６】ＨＬＡ−ＤＲ型別における本発明のｃＤＮ
Ａ挿入物の使用 ＨＬＡ−ＤＲ−β−鎖抗原またはその断片の種類をコー
ドするｃＤＮＡ挿入物を、ＤＲ型別法およびキットに使
用することができる。一般に、この種の型別方法は、
（１）慣用のエンドヌクレアーゼと条件とを用いて個体
のＤＮＡを制限し、（２）制限ＤＮＡをたとえば慣用の
ゲルにおいてサイズ分画し、（３）サイズ分画されたＤ
ＮＡを本発明のＨＬＡ−ＤＲ−β−鎖関連試料またはそ
の断片にヒブリド化し、かつ（４）ヒブリド化の領域を
検出する工程からなっている。
Ａ挿入物の使用 ＨＬＡ−ＤＲ−β−鎖抗原またはその断片の種類をコー
ドするｃＤＮＡ挿入物を、ＤＲ型別法およびキットに使
用することができる。一般に、この種の型別方法は、
（１）慣用のエンドヌクレアーゼと条件とを用いて個体
のＤＮＡを制限し、（２）制限ＤＮＡをたとえば慣用の
ゲルにおいてサイズ分画し、（３）サイズ分画されたＤ
ＮＡを本発明のＨＬＡ−ＤＲ−β−鎖関連試料またはそ
の断片にヒブリド化し、かつ（４）ヒブリド化の領域を
検出する工程からなっている。
【００８７】たとえば、この種の方法の１例として、確
立された細胞系からの４種の異なる個体［ＨＬＡ−ＤＲ
につき３種の同型接合体（１／１，６／６，７／７）お
よび１種の異型接合体（３／６）］から高分子量ＤＮＡ
を得た。このＤＮＡを３７℃にてＥｃｏＲＩ（ベーリン
ガー・マンハイム社）とＨｉｎｄIII （ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリース社）またはＢａｍ ＨＩにより、
標準緩衝液条件および１単位酵素／μｇ ＤＮＡを用い
て１晩処理した。ＥＤＴＡにより反応を停止させ、制限
ＤＮＡをクロロホルムイソアミルアルコール（２４：
１）により１回抽出し、そしてＥＴＯＨで沈殿させた。
遠心分離の後、ペレットを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、０．
０５％ブロムフェノールブルー、０．０５％キシレンシ
アノールおよび５％グリセリン中に再懸濁させた。ＤＮ
Ａを３７℃にて４時間培養した後、これを６５℃にて５
分間処理し、２０ｍＭグリシン，１５ｍＭ ＮａＯＨ
（ｐＨ８．３）における０．６％アガロースゲルに加え
た。これらゲルを６０−１００Ｖにて１２時間処理し、
次いで０．２μのニトロセルロースフィルタ（シュライ
ヒヤーおよびシュエル）に移した（これについてはジー
・エム・バール等によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７６巻、第３６８３〜３６８７
頁（１９７９）に実質的に記載されている。）。
立された細胞系からの４種の異なる個体［ＨＬＡ−ＤＲ
につき３種の同型接合体（１／１，６／６，７／７）お
よび１種の異型接合体（３／６）］から高分子量ＤＮＡ
を得た。このＤＮＡを３７℃にてＥｃｏＲＩ（ベーリン
ガー・マンハイム社）とＨｉｎｄIII （ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリース社）またはＢａｍ ＨＩにより、
標準緩衝液条件および１単位酵素／μｇ ＤＮＡを用い
て１晩処理した。ＥＤＴＡにより反応を停止させ、制限
ＤＮＡをクロロホルムイソアミルアルコール（２４：
１）により１回抽出し、そしてＥＴＯＨで沈殿させた。
遠心分離の後、ペレットを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、０．
０５％ブロムフェノールブルー、０．０５％キシレンシ
アノールおよび５％グリセリン中に再懸濁させた。ＤＮ
Ａを３７℃にて４時間培養した後、これを６５℃にて５
分間処理し、２０ｍＭグリシン，１５ｍＭ ＮａＯＨ
（ｐＨ８．３）における０．６％アガロースゲルに加え
た。これらゲルを６０−１００Ｖにて１２時間処理し、
次いで０．２μのニトロセルロースフィルタ（シュライ
ヒヤーおよびシュエル）に移した（これについてはジー
・エム・バール等によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７６巻、第３６８３〜３６８７
頁（１９７９）に実質的に記載されている。）。
【００８８】移動させた後、これらフィルタを４×ＳＳ
Ｃ（ＳＳＣは１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン
酸ナトリウムである）において洗浄し、次いでこれらを
減圧オーブン内で８０℃にて２時間処理した。次いで、
フィルタを５×ＳＳＣ、５×デンハルツ試薬で６５℃に
てゆっくりと震盪しながら１〜２時間、および１×デン
ハルツ試薬、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）、１０％
デキストラン硫酸塩、０．１％ＳＤＳ、５０μｇ／ｍｌ
ポリＧおよび２５０μｇ／ｍｌ超音波変性されたＤＮＡ
にて６５℃で２時間、順次に培養した。次いで、濾紙に
結合したＤＮＡを１×デンハルツ試薬、０．７５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７）および１×１０6 ｃｐｍ／ｍｌの本発明
のＰ32−標識ｃＤＮＡ試料において６５℃で８〜１２時
間ヒブリド化させた。
Ｃ（ＳＳＣは１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン
酸ナトリウムである）において洗浄し、次いでこれらを
減圧オーブン内で８０℃にて２時間処理した。次いで、
フィルタを５×ＳＳＣ、５×デンハルツ試薬で６５℃に
てゆっくりと震盪しながら１〜２時間、および１×デン
ハルツ試薬、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）、１０％
デキストラン硫酸塩、０．１％ＳＤＳ、５０μｇ／ｍｌ
ポリＧおよび２５０μｇ／ｍｌ超音波変性されたＤＮＡ
にて６５℃で２時間、順次に培養した。次いで、濾紙に
結合したＤＮＡを１×デンハルツ試薬、０．７５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７）および１×１０6 ｃｐｍ／ｍｌの本発明
のＰ32−標識ｃＤＮＡ試料において６５℃で８〜１２時
間ヒブリド化させた。
【００８９】ヒブリド化の後、フィルタをそれぞれ５×
ＳＳＣ、１×デンハルト試薬、０．１％ＳＤＳ、０．１
％ピロ燐酸ナトリウムと、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
と、０．５×ＳＳＣと、０．１×ＳＳＣとにより２回洗
浄した（６５℃、３０分間）。次いで、乾燥したフィル
タを予備フラッシュしたコダックＸ−ＡＲフィルムに強
化スクリーン（Ｃａｗｏ社）を用いて−７０℃にて４８
時間露出させた。
ＳＳＣ、１×デンハルト試薬、０．１％ＳＤＳ、０．１
％ピロ燐酸ナトリウムと、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
と、０．５×ＳＳＣと、０．１×ＳＳＣとにより２回洗
浄した（６５℃、３０分間）。次いで、乾燥したフィル
タを予備フラッシュしたコダックＸ−ＡＲフィルムに強
化スクリーン（Ｃａｗｏ社）を用いて−７０℃にて４８
時間露出させた。
【００９０】図１６はヒブリド化の結果を示している。
図１６に見られるように、それぞれ異なるヒトＤＮＡ
（ＤＲ７／７（レーン１）、ＤＲ６／６（レーン２）、
ＤＲ３／６（レーン３）およびＤＲ１１／１（レーン
４））は各制限エンドヌクレアーゼにつき異なる電気泳
動パターンを示す＊。従って、本発明の試料を用いる種
々のＨＬＡ／ＤＲ型別された個体からのＤＮＡのサザン
ブロットは、異なるＨＬＡ−ＤＲ特異性を有する個体か
ら簡単かつ経済的に区別することができる＊＊。さら
に、この型別方法および型別用製造物で得られた簡単な
ブロットパターンは従来の型別方法では可能でなかった
ような型別を可能にし、従って従来のＨＬＡ−ＤＲ群に
おける各種のサブ群を同定しかつ区別することができ、
しかも種々の病気に対するこれらサブ群の感受性をより
良好に決定することができる。
図１６に見られるように、それぞれ異なるヒトＤＮＡ
（ＤＲ７／７（レーン１）、ＤＲ６／６（レーン２）、
ＤＲ３／６（レーン３）およびＤＲ１１／１（レーン
４））は各制限エンドヌクレアーゼにつき異なる電気泳
動パターンを示す＊。従って、本発明の試料を用いる種
々のＨＬＡ／ＤＲ型別された個体からのＤＮＡのサザン
ブロットは、異なるＨＬＡ−ＤＲ特異性を有する個体か
ら簡単かつ経済的に区別することができる＊＊。さら
に、この型別方法および型別用製造物で得られた簡単な
ブロットパターンは従来の型別方法では可能でなかった
ような型別を可能にし、従って従来のＨＬＡ−ＤＲ群に
おける各種のサブ群を同定しかつ区別することができ、
しかも種々の病気に対するこれらサブ群の感受性をより
良好に決定することができる。
【００９１】＊ 図１６のレーン５はマウスＤＮＡであ
る。＊＊ 上記の「型別」手法は１０〜２０ｍｌの血液を用
いて行うことができ、１００回または１０００回の試験
まで容易に規模拡大される。
る。＊＊ 上記の「型別」手法は１０〜２０ｍｌの血液を用
いて行うことができ、１００回または１０００回の試験
まで容易に規模拡大される。
【００９２】勿論、特定の制限ＤＮＡのヒブリド化部分
の検出はＰ32−標識試料により行なう必要がないことを
了解すべきである。寧ろ、他のヒブリド化検出方法を同
等に使用することができる。この種の方法は、試料を染
色活性化剤、検出酵素、アビジンまたは他の検出手段に
結合させることを含む。
の検出はＰ32−標識試料により行なう必要がないことを
了解すべきである。寧ろ、他のヒブリド化検出方法を同
等に使用することができる。この種の方法は、試料を染
色活性化剤、検出酵素、アビジンまたは他の検出手段に
結合させることを含む。
【００９３】本発明のｃＤＮＡ挿入物の合成試料を使用
する改良ＨＬＡ−ＤＲ型別 短かい（１９塩基）のオリゴヌクレオチドＤＮＡ断片を
用いるサザンブロットの条件下におけるヒブリド化は、
完全に適合する配列（同一もしくは対立）を非適合配列
（異なる配列または対立）から区別しうることを示して
いる。たとえば、ビー・ジエー・コナー等、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８０巻、第２
７８〜２８２頁（１９８３）。
する改良ＨＬＡ−ＤＲ型別 短かい（１９塩基）のオリゴヌクレオチドＤＮＡ断片を
用いるサザンブロットの条件下におけるヒブリド化は、
完全に適合する配列（同一もしくは対立）を非適合配列
（異なる配列または対立）から区別しうることを示して
いる。たとえば、ビー・ジエー・コナー等、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８０巻、第２
７８〜２８２頁（１９８３）。
【００９４】本発明のＨＬＡ−ＤＲ−β−ｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列を分析し、そしてこれら配列内に配列の
相違（多形性的相違を含む）を示す少なくとも３つの領
域を確認した。これらの３つの領域は次の通りである：
（１）アミノ酸８〜１４をコードする配列；（２）アミ
ノ酸２６〜３２をコードする配列；および（３）アミノ
酸７２〜７８をコードする配列（図１７）。さらに、異
なるＤＲ−β鎖遺伝子ならびにＤＣおよびＳＢβ−鎖遺
伝子のうち同一である領域（アミノ酸３９〜４５をコー
ドする配列）も確認した。
クレオチド配列を分析し、そしてこれら配列内に配列の
相違（多形性的相違を含む）を示す少なくとも３つの領
域を確認した。これらの３つの領域は次の通りである：
（１）アミノ酸８〜１４をコードする配列；（２）アミ
ノ酸２６〜３２をコードする配列；および（３）アミノ
酸７２〜７８をコードする配列（図１７）。さらに、異
なるＤＲ−β鎖遺伝子ならびにＤＣおよびＳＢβ−鎖遺
伝子のうち同一である領域（アミノ酸３９〜４５をコー
ドする配列）も確認した。
【００９５】不整合の３つの領域（図１７における黒
丸）を画成する合成オリゴヌクレオチド（１９−化合
体）の試料を調製した。第９図の指示した領域は、２種
のＨＬＡ−ＤＲ−β ｃＤＮＡクローンの３つの領域の
それぞれにつき調製した特定の１９−化合体を示してい
る。これら１９−化合体のそれぞれは２個以上の不整合
部分を有するので、各試料につきＨＬＡ−ＤＲ配列の明
確な区別を行なうことができる。さらに、１９−化合体
を上記のように同族領域から調製して、陽性ヒブリド化
比較として使用することができる。
丸）を画成する合成オリゴヌクレオチド（１９−化合
体）の試料を調製した。第９図の指示した領域は、２種
のＨＬＡ−ＤＲ−β ｃＤＮＡクローンの３つの領域の
それぞれにつき調製した特定の１９−化合体を示してい
る。これら１９−化合体のそれぞれは２個以上の不整合
部分を有するので、各試料につきＨＬＡ−ＤＲ配列の明
確な区別を行なうことができる。さらに、１９−化合体
を上記のように同族領域から調製して、陽性ヒブリド化
比較として使用することができる。
【００９６】同様にして、他のＨＬＡ−ＤＲ−β鎖遺伝
子のうち不整合および同一の領域から１９−化合体ＤＮ
Ａ試料のコレクションを作成することができる。かくし
て、それぞれの試料は所定のＤＲ特異性にみあう特異性
を示す。従って、試料コレクションおよび比較のヒブリ
ド化は、多数の個体の迅速かつ正確なＤＲ型別を可能に
する。
子のうち不整合および同一の領域から１９−化合体ＤＮ
Ａ試料のコレクションを作成することができる。かくし
て、それぞれの試料は所定のＤＲ特異性にみあう特異性
を示す。従って、試料コレクションおよび比較のヒブリ
ド化は、多数の個体の迅速かつ正確なＤＲ型別を可能に
する。
【００９７】本発明のＤＮＡ配列の発現 蛋白質の生産レベルは２つの主たる因子により支配され
る：すなわち細胞内のその遺伝子のコピー数およびこれ
ら遺伝子コピーが転写しかつ翻訳する効率である。転写
および翻訳の効率（これらは一緒になって発現を構成す
る）は、通常、所望のコード配列の前方に位置するヌク
レオチド配列に依存する。これらのヌクレオチド配列ま
たは発現制御配列は、特にＲＮＡポリメラーゼが反応し
て転写を開始する位置（プロモータ配列）およびリボソ
ームがｍＲＮＡと結合して相互反応し（転写生産物）翻
訳を開始する位置を規定する。この種の発現制御配列
は、必らずしも同等な効率で機能しない。従って、所望
の蛋白質に関する特異的コード配列を隣接するヌクレオ
チド配列から分離し、そしてこれを他の発現制御配列に
融合させて高レベルの発現を得ることが有利である。こ
れが達成されると、新たに作成されたＤＮＡ断片をマチ
ルコピーのプラスミドまたはバクテリオフアージ誘導体
に挿入して、細胞内における遺伝子コピー数を増大さ
せ、かくして発現蛋白質の収率をさらに向上させること
ができる。
る：すなわち細胞内のその遺伝子のコピー数およびこれ
ら遺伝子コピーが転写しかつ翻訳する効率である。転写
および翻訳の効率（これらは一緒になって発現を構成す
る）は、通常、所望のコード配列の前方に位置するヌク
レオチド配列に依存する。これらのヌクレオチド配列ま
たは発現制御配列は、特にＲＮＡポリメラーゼが反応し
て転写を開始する位置（プロモータ配列）およびリボソ
ームがｍＲＮＡと結合して相互反応し（転写生産物）翻
訳を開始する位置を規定する。この種の発現制御配列
は、必らずしも同等な効率で機能しない。従って、所望
の蛋白質に関する特異的コード配列を隣接するヌクレオ
チド配列から分離し、そしてこれを他の発現制御配列に
融合させて高レベルの発現を得ることが有利である。こ
れが達成されると、新たに作成されたＤＮＡ断片をマチ
ルコピーのプラスミドまたはバクテリオフアージ誘導体
に挿入して、細胞内における遺伝子コピー数を増大さ
せ、かくして発現蛋白質の収率をさらに向上させること
ができる。
【００９８】従って、広範囲の宿主−発現制御配列のベ
クター組合せを使用して、本発明の方法により適当なコ
ード配列を挿入することによってＨＬＡ−ＤＲ−β鎖と
同様なポリペプチドを生産することができる。たとえ
ば、有用なベクターは染色体、非染色体および合成のＤ
ＮＡ配列の断片からなり、たとえば ｃｏｌ Ｅｌ，ｐ
ＣＲＩ，ｐＢＲ３２２およびその誘導体を含めイー・コ
リからの各種公知の細菌プラスミド、広範囲の宿主プラ
スミド、たとえばＲＰ４、フアージＤＮＡ、たとえば多
くのフアージλの誘導体ならびに上記の組合せから得ら
れるベクター、たとえばｐＢＲ３２２、フアージλの一
部および合成部分を含むベクターが包含される。有用な
宿主はたとえばイー・コリの菌株、たとえばイー・コリ
Ｋ１２ ＭＣ１０６１、イー・コリＨＢ１０１、イー・
コリ×１７７６、イー・コリ×２２８２、イー・コリＭ
ＲＣＩのような細菌性宿主ならびにシュードモナス、枯
草菌、高熱細菌およびその他細菌類、酵母およびその他
の真菌類の菌株、動物もしくは植物宿主、たとえば動物
（ヒトを含む）もしくは植物の培養細胞またはその他の
宿主を包含することができる。有用な発現制御配列はイ
ー・コリのラクトースオペロンのオペレータ、プロモー
タならびにリボゾーム結合および相互作用配列（「ｌａ
ｃ系」）、イー・コリのトリプトフアンシンセターゼ系
の対応する配列（「ｔｒｐ系」）、フアージλの主オペ
レータおよびプロモータ領域（ＯL ＰLおよびＯR ＰI
R ）、フアージｆｄコート蛋白質の制御領域、または原
始核細胞もしくは成熟核細胞およびそのウイルスの遺伝
子の発現を制御かつ促進するその他の配列、或いは各種
のこれらの組合せを包含することができる。
クター組合せを使用して、本発明の方法により適当なコ
ード配列を挿入することによってＨＬＡ−ＤＲ−β鎖と
同様なポリペプチドを生産することができる。たとえ
ば、有用なベクターは染色体、非染色体および合成のＤ
ＮＡ配列の断片からなり、たとえば ｃｏｌ Ｅｌ，ｐ
ＣＲＩ，ｐＢＲ３２２およびその誘導体を含めイー・コ
リからの各種公知の細菌プラスミド、広範囲の宿主プラ
スミド、たとえばＲＰ４、フアージＤＮＡ、たとえば多
くのフアージλの誘導体ならびに上記の組合せから得ら
れるベクター、たとえばｐＢＲ３２２、フアージλの一
部および合成部分を含むベクターが包含される。有用な
宿主はたとえばイー・コリの菌株、たとえばイー・コリ
Ｋ１２ ＭＣ１０６１、イー・コリＨＢ１０１、イー・
コリ×１７７６、イー・コリ×２２８２、イー・コリＭ
ＲＣＩのような細菌性宿主ならびにシュードモナス、枯
草菌、高熱細菌およびその他細菌類、酵母およびその他
の真菌類の菌株、動物もしくは植物宿主、たとえば動物
（ヒトを含む）もしくは植物の培養細胞またはその他の
宿主を包含することができる。有用な発現制御配列はイ
ー・コリのラクトースオペロンのオペレータ、プロモー
タならびにリボゾーム結合および相互作用配列（「ｌａ
ｃ系」）、イー・コリのトリプトフアンシンセターゼ系
の対応する配列（「ｔｒｐ系」）、フアージλの主オペ
レータおよびプロモータ領域（ＯL ＰLおよびＯR ＰI
R ）、フアージｆｄコート蛋白質の制御領域、または原
始核細胞もしくは成熟核細胞およびそのウイルスの遺伝
子の発現を制御かつ促進するその他の配列、或いは各種
のこれらの組合せを包含することができる。
【００９９】勿論、必ずしも全ての宿主−発現制御配列
−ベクター組合せ物が、特定のＨＬＡ／ＤＲコード配列
につき同等の効果を有するとは限らない。しかしなが
ら、上記したように、生物安全性の観点から特定の構造
につき本発明のＨＬＡ−ＤＲ−βコード配列に使用しう
る部位、発現すべきＨＬＡ−ＤＲ−β鎖ポリペプチドの
サイズ、宿主細胞酵素による蛋白質分解に対するポリペ
プチドの感受性、精製の際除去するのが困難な宿主細胞
蛋白質によるポリペプチドの汚染、ＨＬＡ−ＤＲ−βコ
ード配列の発現特性、たとえばＤＮＡコード配列の構造
および発現制御配列に関する開始および停止コドンの位
置、ならびに当業者に認識されたその他の因子を考慮し
て、本発明のＨＬＡ／ＤＲ−β−鎖コード配列をベクタ
ーにおける発現制御配列へ作用結合させる適当な組合せ
を選択し、これを使用して宿主を形質転換させ、その宿
主を培養して挿入コード配列によりコードされるポリペ
プチドを生産することができる。
−ベクター組合せ物が、特定のＨＬＡ／ＤＲコード配列
につき同等の効果を有するとは限らない。しかしなが
ら、上記したように、生物安全性の観点から特定の構造
につき本発明のＨＬＡ−ＤＲ−βコード配列に使用しう
る部位、発現すべきＨＬＡ−ＤＲ−β鎖ポリペプチドの
サイズ、宿主細胞酵素による蛋白質分解に対するポリペ
プチドの感受性、精製の際除去するのが困難な宿主細胞
蛋白質によるポリペプチドの汚染、ＨＬＡ−ＤＲ−βコ
ード配列の発現特性、たとえばＤＮＡコード配列の構造
および発現制御配列に関する開始および停止コドンの位
置、ならびに当業者に認識されたその他の因子を考慮し
て、本発明のＨＬＡ／ＤＲ−β−鎖コード配列をベクタ
ーにおける発現制御配列へ作用結合させる適当な組合せ
を選択し、これを使用して宿主を形質転換させ、その宿
主を培養して挿入コード配列によりコードされるポリペ
プチドを生産することができる。
【０１００】ＤＮＡ配列および発現制御配列をベクター
中に挿入するための種々の方法が当業界で知られてい
る。たとえば、これらは直接的結合、合成リンカ、エキ
ソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ結合した修復反応に
続く結合、或いはＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の
延長および適当な単一鎖雛型の作成に続く結合を包含す
る。さらに、当業者はこれら方法の１種もしくはそれ以
上を選択して、本発明の範囲を逸脱することなく本発明
のＤＮＡ配列を発現させることができる。
中に挿入するための種々の方法が当業界で知られてい
る。たとえば、これらは直接的結合、合成リンカ、エキ
ソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ結合した修復反応に
続く結合、或いはＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の
延長および適当な単一鎖雛型の作成に続く結合を包含す
る。さらに、当業者はこれら方法の１種もしくはそれ以
上を選択して、本発明の範囲を逸脱することなく本発明
のＤＮＡ配列を発現させることができる。
【０１０１】さらに、本発明の選択宿主−発現制御配列
−ベクター組合せにおいて発現された実際のＨＬＡ／Ｄ
Ｒ−β−鎖コード配列は、標準のＨＬＡ−ＤＲ−β−鎖
抗原とは同一でない生産物を生成しうることを了解すべ
きである。たとえば、発現されたコード配列は、ＨＬＡ
−ＤＲ−β−鎖とは無関係なＨＬＡ−ＤＲ−β鎖プラス
メチオニンもしくはその他アミノ酸をコードしうるであ
ろう。或いは、発現されたＤＮＡ配列は、ＨＬＡ−ＤＲ
−β鎖の１部のみを、或いはメチオニンもしくはその他
のアミノ酸を共にコードしうるであろう。これらの作成
および生産物も本発明に包含される。たとえば、ＨＬＡ
−ＤＲ−β−鎖状のポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列により形質転換された宿主は、その化合物のみ
を生産しうるか、または他のアミノ酸と融合させうる
か、或いはその生産物を分泌することができる。発酵培
養物から単離した後、または慣用の処理方法、たとえば
開裂、合成結合またはその他周知の方法による処理の
後、生産物がＨＬＡ−ＤＲ−β−鎖抗原の免疫学的もし
くは生物学的活性を示すことのみが必要とされる。
−ベクター組合せにおいて発現された実際のＨＬＡ／Ｄ
Ｒ−β−鎖コード配列は、標準のＨＬＡ−ＤＲ−β−鎖
抗原とは同一でない生産物を生成しうることを了解すべ
きである。たとえば、発現されたコード配列は、ＨＬＡ
−ＤＲ−β−鎖とは無関係なＨＬＡ−ＤＲ−β鎖プラス
メチオニンもしくはその他アミノ酸をコードしうるであ
ろう。或いは、発現されたＤＮＡ配列は、ＨＬＡ−ＤＲ
−β鎖の１部のみを、或いはメチオニンもしくはその他
のアミノ酸を共にコードしうるであろう。これらの作成
および生産物も本発明に包含される。たとえば、ＨＬＡ
−ＤＲ−β−鎖状のポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列により形質転換された宿主は、その化合物のみ
を生産しうるか、または他のアミノ酸と融合させうる
か、或いはその生産物を分泌することができる。発酵培
養物から単離した後、または慣用の処理方法、たとえば
開裂、合成結合またはその他周知の方法による処理の
後、生産物がＨＬＡ−ＤＲ−β−鎖抗原の免疫学的もし
くは生物学的活性を示すことのみが必要とされる。
【０１０２】精製後の上記ＨＬＡ−ＤＲ−ポリペプチド
またはそれに対して生成される抗体を使用して、慣用の
ＨＬＡ−ＤＲ型別法もしくはキットにおいて個体を型別
するのに使用することができ、或いはその他の診断、予
防もしくは治療剤もしくは方法に使用することができ
る。
またはそれに対して生成される抗体を使用して、慣用の
ＨＬＡ−ＤＲ型別法もしくはキットにおいて個体を型別
するのに使用することができ、或いはその他の診断、予
防もしくは治療剤もしくは方法に使用することができ
る。
【０１０３】本発明の方法により作成される微生物およ
び組換ＤＮＡ分子は、メリーランド州・ロックビル在の
アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクションに１９
８２年７月２８日付けで寄託され、かつ次のＤＲ−β−
Ａ、ＤＲ−β−ＢおよびＤＲ−β−Ｃ： ＤＲ−β−Ａ：E.coli ＨＢ１０１（pBR322(Pst)/ＨＬ
Ａ−ＤＲ−β−Ａ） ＤＲ−β−Ｂ：E.coli ＨＢ１０１（pBR322(Pst)/ＨＬ
Ａ−ＤＲ−β−Ｂ） ＤＲ−β−Ｃ：E.coli ＨＢ１０１（pBR322(Pst)/ＨＬ
Ａ−ＤＲ−β−Ｃ） として同定された培養物によって例証される。
び組換ＤＮＡ分子は、メリーランド州・ロックビル在の
アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクションに１９
８２年７月２８日付けで寄託され、かつ次のＤＲ−β−
Ａ、ＤＲ−β−ＢおよびＤＲ−β−Ｃ： ＤＲ−β−Ａ：E.coli ＨＢ１０１（pBR322(Pst)/ＨＬ
Ａ−ＤＲ−β−Ａ） ＤＲ−β−Ｂ：E.coli ＨＢ１０１（pBR322(Pst)/ＨＬ
Ａ−ＤＲ−β−Ｂ） ＤＲ−β−Ｃ：E.coli ＨＢ１０１（pBR322(Pst)/ＨＬ
Ａ−ＤＲ−β−Ｃ） として同定された培養物によって例証される。
【０１０４】これら培養物は、それぞれ寄託番号ＡＴＣ
Ｃ３９１６４、３９１６３および３９１６５を得てい
る。
Ｃ３９１６４、３９１６３および３９１６５を得てい
る。
【０１０５】以上、本発明の多くの具体例につき説明し
たが、この基本構成を改変して本発明の方法および組成
物を使用する他の具体例を与え得ることが明らかであ
る。従って、本発明の範囲は上記実施例のみに限定され
ることなく、種々の改変をなしうることが了解されよ
う。
たが、この基本構成を改変して本発明の方法および組成
物を使用する他の具体例を与え得ることが明らかであ
る。従って、本発明の範囲は上記実施例のみに限定され
ることなく、種々の改変をなしうることが了解されよ
う。
【図１】第６染色体および短腕上のＨＬＡ座位の位置を
示す略図である。
示す略図である。
【図２】本発明のクローン化法における一具体例の略図
である。
である。
【図３】本発明のクローン８３−７，６８−６，ＤＲ−
β1 ，ＤＲ−β2 およびＩａ−βの部位制限地図であ
る。この地図に示された制限部位は正確でないが、慣用
的なヌクレオチド配列決定法によりこれらの部位の正確
な位置を決定することは可能である。
β1 ，ＤＲ−β2 およびＩａ−βの部位制限地図であ
る。この地図に示された制限部位は正確でないが、慣用
的なヌクレオチド配列決定法によりこれらの部位の正確
な位置を決定することは可能である。
【図４】ＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａ，ＨＬＡ−ＤＲ−β−
Ｂ，ＨＬＡ−ＤＲ−β−ＣおよびＨＬＡ−ＤＲ−β−Ｄ
のｃＤＮＡ配列の部位制限地図である。
Ｂ，ＨＬＡ−ＤＲ−β−ＣおよびＨＬＡ−ＤＲ−β−Ｄ
のｃＤＮＡ配列の部位制限地図である。
【図５】ｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａの配列決定
方法を示す説明図である。
方法を示す説明図である。
【図６】ｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａのヌクレオ
チドおよびアミノ酸配列を示す説明図である。
チドおよびアミノ酸配列を示す説明図である。
【図７】図６と同じｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａ
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図であ
る。
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図であ
る。
【図８】図６と同じｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａ
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図であ
る。
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図であ
る。
【図９】図６と同じｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａ
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図であ
る。
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図であ
る。
【図１０】ｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａから推測
されるアミノ酸配列と、ＤＲ２の同型接合系から単離さ
れたＩａ抗原β−鎖につきクラッチンにより決定された
アミノ酸配列と、ＤＲ３，Ｗ６細胞系からラールハンマ
ーにより単離されたｃＤＮＡクローンから推測されるア
ミノ酸配列との比較図である。
されるアミノ酸配列と、ＤＲ２の同型接合系から単離さ
れたＩａ抗原β−鎖につきクラッチンにより決定された
アミノ酸配列と、ＤＲ３，Ｗ６細胞系からラールハンマ
ーにより単離されたｃＤＮＡクローンから推測されるア
ミノ酸配列との比較図である。
【図１１】図１０と同じｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β
−Ａから推測されるアミノ酸配列と、ＤＲ２の同型接合
系から単離されたＩａ抗原β−鎖につきクラッチンによ
り決定されたアミノ酸配列と、ＤＲ３，Ｗ６細胞系から
ラールハンマーにより単離されたｃＤＮＡクローンから
推測されるアミノ酸配列との比較図である。
−Ａから推測されるアミノ酸配列と、ＤＲ２の同型接合
系から単離されたＩａ抗原β−鎖につきクラッチンによ
り決定されたアミノ酸配列と、ＤＲ３，Ｗ６細胞系から
ラールハンマーにより単離されたｃＤＮＡクローンから
推測されるアミノ酸配列との比較図である。
【図１２】図１０と同じｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β
−Ａから推測されるアミノ酸配列と、ＤＲ２の同型接合
系から単離されたＩａ抗原β−鎖につきクラッチンによ
り決定されたアミノ酸配列と、ＤＲ３，Ｗ６細胞系から
ラールハンマーにより単離されたｃＤＮＡクローンから
推測されるアミノ酸配列との比較図である。
−Ａから推測されるアミノ酸配列と、ＤＲ２の同型接合
系から単離されたＩａ抗原β−鎖につきクラッチンによ
り決定されたアミノ酸配列と、ＤＲ３，Ｗ６細胞系から
ラールハンマーにより単離されたｃＤＮＡクローンから
推測されるアミノ酸配列との比較図である。
【図１３】図１０と同じｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β
−Ａから推測されるアミノ酸配列と、ＤＲ２の同型接合
系から単離されたＩａ抗原β−鎖につきクラッチンによ
り決定されたアミノ酸配列と、ＤＲ３，Ｗ６細胞系から
ラールハンマーにより単離されたｃＤＮＡクローンから
推測されるアミノ酸配列との比較図である。
−Ａから推測されるアミノ酸配列と、ＤＲ２の同型接合
系から単離されたＩａ抗原β−鎖につきクラッチンによ
り決定されたアミノ酸配列と、ＤＲ３，Ｗ６細胞系から
ラールハンマーにより単離されたｃＤＮＡクローンから
推測されるアミノ酸配列との比較図である。
【図１４】ｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β−Ｂのヌクレ
オチドおよびアミノ酸配列を示す説明図である。
オチドおよびアミノ酸配列を示す説明図である。
【図１５】図１４と同じｃＤＮＡ配列ＨＬＡ−ＤＲ−β
−Ｂのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図で
ある。
−Ｂのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図で
ある。
【図１６】本発明の型別方法の一具体例を使用して型別
された４種の個体（ＤＲ７／７，６／６，３／６および
１／１）からのＤＮＡのサザンブロット図である。
された４種の個体（ＤＲ７／７，６／６，３／６および
１／１）からのＤＮＡのサザンブロット図である。
【図１７】ｃＤＮＡクローンＨＬＡ−ＤＲ−β−Ａおよ
びＨＬＡ−ＤＲ−β−Ｂのコード領域間におけるヌクレ
オチド配列不整合の３つの領域を示す説明図であり、黒
丸はヌクレオチド不整合を示し、かつ枠はこれら配列か
ら調製された１９−化合体を示す。
びＨＬＡ−ＤＲ−β−Ｂのコード領域間におけるヌクレ
オチド配列不整合の３つの領域を示す説明図であり、黒
丸はヌクレオチド不整合を示し、かつ枠はこれら配列か
ら調製された１９−化合体を示す。
フロントページの続き (72)発明者 クライア テレス ウエイク アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02145、ソマービル、キッダー ストリー ト 33番
Claims (7)
- 【請求項１】 (a) 型別されるべき個体から単離した第
一のＤＮＡを少なくとも１種の制限エンドヌクレアーゼ
で切断する工程と；(b) 制限エンドヌクレアーゼで切断
されたＤＮＡをサイズ分画する工程と；(c) サイズ分画
されたＤＮＡを第二のＤＮＡにヒブリド化する工程と；
(d) 前記サイズ分画されたＤＮＡと前記第二のＤＮＡの
間でヒブリド化した領域を検出する工程と；そして(e)
前記ヒブリド化した領域を既知のＨＬＡ−ＤＲ型のＤＮ
Ａと前記第二のＤＮＡの間でヒブリド化した領域と比較
する工程とから成るＨＬＡ−ＤＲ型別方法であって、前
記第二のＤＮＡは、ＤＮＡ挿入物ＤＲ−β−Ａ（ＡＴＣ
Ｃ３９１６４）、ＤＲ−β−Ｂ（ＡＴＣＣ３９１６
３）、またはこれらの対立遺伝子物によってコードされ
るポリペプチドの： (i) 第８〜第１４アミノ酸、 (ii) 第２６〜第３２アミノ酸、 (iii) 第３９〜第４５アミノ酸、または (iv) 第７２〜第７８アミノ酸 によって定義される領域の過半数をコードするヌクレオ
チド配列を特徴とするＤＮＡである、ＨＬＡ−ＤＲ型別
方法。 - 【請求項２】 前記第二のＤＮＡが、 ＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＡＡＧＴＣＴＧＡ、 ＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＣＴＴＣＣＡ、 ＧＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＴＴＡ、 ＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＡＡＡＣＡＴＧＡ、 ＴＣＣＴＧＧＡＣＡＧＡＴＡＣＴＴＣＴＡ、および ＧＧＧＣＣＧＣＧＧＴＧＧＡＣＡＣＣＴＡ より成る群から選択されるヌクレオチド配列を特徴とす
る、請求項１に記載のＨＬＡ−ＤＲ型別方法。 - 【請求項３】 (a) 被検試料中の第一のＤＮＡを第二の
ＤＮＡにヒブリド化する工程と；(b) 前記第一のＤＮＡ
と前記第二のＤＮＡとの間のヒブリド化を検出する工程
とから成るＨＬＡ−ＤＲ型別方法であって、前記第二の
ＤＮＡは、ＤＮＡ挿入物ＤＲ−β−Ａ（ＡＴＣＣ３９１
６４）、ＤＲ−β−Ｂ（ＡＴＣＣ３９１６３）、または
これらの対立遺伝子物によってコードされるポリペプチ
ドの： (i) 第８〜第１４アミノ酸、 (ii) 第２６〜第３２アミノ酸、 (iii) 第３９〜第４５アミノ酸、または (iv) 第７２〜第７８アミノ酸 によって定義される領域の過半数をコードするヌクレオ
チド配列を特徴とするＤＮＡである、ＨＬＡ−ＤＲ型別
方法。 - 【請求項４】 前記第二のＤＮＡが、 ＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＡＡＧＴＣＴＧＡ、 ＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＣＴＴＣＣＡ、 ＧＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＴＴＡ、 ＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＴＡＡＡＣＡＴＧＡ、 ＴＣＣＴＧＧＡＣＡＧＡＴＡＣＴＴＣＴＡ、および ＧＧＧＣＣＧＣＧＧＴＧＧＡＣＡＣＣＴＡ より成る群から選択されるヌクレオチド配列を特徴とす
る、請求項３に記載のＨＬＡ−ＤＲ型別方法。 - 【請求項５】 さらに前記ヒブリド化を既知のＨＬＡ−
ＤＲ型のＤＮＡと前記第二のＤＮＡとの間のヒブリド化
と比較する工程とから成る、請求項３または請求項４に
記載のＨＬＡ−ＤＲ型別方法。 - 【請求項６】 前記ヒブリド化した領域を検出する工程
の前に、さらに前記サイズ分画されたＤＮＡとヒブリド
化対照をヒブリド化する工程を包含する、請求項１また
は請求項２に記載のＨＬＡ−ＤＲ型別方法であって、前
記ヒブリド化対照は、 ＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＣＧＧ のヌクレオチド配列を有するＤＮＡである、ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ型別方法。 - 【請求項７】 前記ヒブリド化を検出する工程の前に、
さらに前記第一のＤＮＡとヒブリド化対照をヒブリド化
する工程を包含する、請求項３乃至請求項５のいずれか
に記載のＨＬＡ−ＤＲ型別方法であって、前記ヒブリド
化対照は、 ＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＣＧＧ のヌクレオチド配列を有するＤＮＡである、ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ型別方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8222066 | 1982-07-30 | ||
| GB8230441 | 1982-10-25 | ||
| GB8222066 | 1982-10-25 | ||
| GB8230441 | 1982-10-25 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14043383A Division JP3195784B2 (ja) | 1982-07-30 | 1983-07-30 | ひとリンパ球抗原複合体のＤＲ−β−鎖部位を暗号化するＤＮＡおよびその判定用生産物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08205877A true JPH08205877A (ja) | 1996-08-13 |
| JP3195893B2 JP3195893B2 (ja) | 2001-08-06 |
Family
ID=26283470
Family Applications (7)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14043383A Expired - Lifetime JP3195784B2 (ja) | 1982-07-30 | 1983-07-30 | ひとリンパ球抗原複合体のＤＲ−β−鎖部位を暗号化するＤＮＡおよびその判定用生産物 |
| JP13767993A Expired - Lifetime JP3195859B2 (ja) | 1982-07-30 | 1993-06-08 | ひとリンパ球抗原複合体のＤＲ−β−鎖部位の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドおよびその製造方法並びに診断判定方法および判定用生産物 |
| JP6214865A Pending JPH07147988A (ja) | 1982-07-30 | 1994-09-08 | ひとリンパ球抗原複合体のＤＲ−β−鎖部位を暗号化するＤＮＡおよびその製造方法並びに診断判定方法および判定用生産物 |
| JP7010867A Pending JPH07238095A (ja) | 1982-07-30 | 1995-01-26 | ポリペプチドおよびその製造方法並びに診断判定方法および判定用生産物 |
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| JP29048595A Expired - Lifetime JP3195894B2 (ja) | 1982-07-30 | 1995-10-11 | ヒトリンパ球抗原複合体のＤＲβ−鎖座位の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡおよびそれを使用する診断型別方法および型別用製造物 |
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