JP3195784B2

JP3195784B2 - ひとリンパ球抗原複合体のＤＲ−β−鎖部位を暗号化するＤＮＡおよびその判定用生産物

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Publication number: JP3195784B2
Application number: JP14043383A
Authority: JP
Inventors: ベルナ−ル・フランソワ・マツク; エリツク・オリビエ・ロング; クライア・テレス・ウエイク
Original assignee: ビヨメリューソシエテアノニム
Priority date: 1982-07-30
Filing date: 1983-07-30
Publication date: 2001-08-06
Anticipated expiration: 2016-08-06
Also published as: US5169941A; JPH09117289A; DE3382137D1; JP3195859B2; JP3195893B2; US5503976A; EP0103960A3; JPH07238095A; JPH07147988A; JPS5995889A; JPH06172389A; JPH08205867A; JP3195894B2; EP0103960A2; JPH08205877A; CA1295562C; EP0103960B1

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の属する技術分野〕本発明は、ひとリンパ球抗原複合体のDRβ−鎖部位を
暗号化するDNA配列に関するものである。さらに詳細に
は、本発明は、診断判定方法および生産物にこれらDNA
配列を使用することに関するものである。この種の方法
および生産物は、広範囲の病気に対する個体の感受性お
よび組織もしくは器官移植物の供与体もしくは受容体と
しての個体の特性を決定する際に有用である。本発明の
DNA配列は、さらにそれらにより暗号化されるポリペプ
チドの発現においても有用である。〔従来技術とその問題点〕ひとリンパ球抗原（「HLA」）系は、ひとにおける主
要な組織適合性複合体である。したがつて、これは個体
間の組織および器官移植物に対する最も強いバリヤを構
成し、明らかに自己と非自己とを区別する。さらに、HL
A因子は、広範囲の病気に対する感受性の増大に関連す
ることが示されている。したがつて、HLA系の抗原は、
広範囲の病気に対する個人の感受性を決定するための診
断判定方法および生産物に使用され、かつ組織もしくは
器官移植物の供与体もしくは受容体としてのその特性を
決定するのに使用される〔エフ・エツチ・バツハおよび
ジエー・ジエー・パンルード、N.Engl.J.Med.、第295
巻、第806〜813頁（1976）〕。遺伝学的観点から、HLA系はかなり良く特性化されて
いる。たとえば、エル・ピー・ライダー等、「HLA病関
連の遺伝学」、Ann.Rev.Genet、第15巻、第169〜187頁
（1981）；ジエー・エル・ストローミンガー等、「免疫
学における主要な組織適合性複合体の役割」、エム・ド
ルフ編集、ガーランドSPTMプレス社、第115〜172頁（19
81）；テイー・ササズキ等、「主要な組織適合性複合体
における遺伝子と病気感受性との間の関係」、Ann.Rev.
Med.、第28巻、第425〜452頁（1977）を参照することが
できる。これは、染色体６の短腕における約２センチモ
ルガン（cM）の間隔内に位置する多かれ少なかれ高度に
多形質の一連の部位からなつている。この系における３
つの部位（HLA−Ａ、ＢおよびＣ）は、相互優性的に発
現されるアロ抗原の１種の暗号化する（種類１）。他の
部位（HLA−D/DR）は、高度に識別された多形性を有す
る相互優性アロ抗原の第２の種類を暗号化する（種類
２）。初期成分の幾つかを制御する補完成分の他の３つ
の部位（C2,C4およびBf因子）も、HLA系に属する（種類
３）。最後に、HLA複合体におけるIaと呼ばれる非特異
的領域が存在する。この領域IaはDR部位に関係すると思
われるが、これとは異なるものである。 HLA系の生物学は、まだ充分に理解されていない。種
類１の因子は、赤血球以外の全ゆる組織に分布してい
る。種類２の因子は、実質的にβ−リンパ球および単核
食細胞に限定され、かつ種類３の補完因子はC3因子、す
なわち補完系における重要成分の活性化に直接関係す
る。HLA−DR抗原は免疫学的現象、すなわち免疫反応
性、Ｔ−細胞抑制、Ｔ−細胞およびβ−細胞の共働なら
びにＴ細胞と大食細胞の発現に関係すると思われる〔ビ
ー・ベナセラフ、「免疫生物学における主要な組織適合
性複合体の役割」、エム・イー・ドルフ編、ガーランド
SPTMプレス社、第255〜269頁（1981）〕。 HLA−DR抗原は２種の非共有結合グリコシル化ペプチ
ド鎖、すなわち分子量約35,000の重鎖すなわちα−鎖と
分子量約29,000の軽鎖すなわちβ−鎖とから構成され、
これらは細胞膜を画成する〔ストロミンガー等、上記；
およびライダー等、上記〕。細胞内において、分子量約
32,000の第３のペプチド鎖がα−鎖およびβ−鎖に関連
する〔テー・ジエー・シヤロンおよびエツチ・オー・マ
ツクデビツト、J.Exp.Med.、第152巻、第18s〜36s頁（1
980）；ストロミンガー、上記〕。軽鎖すなわちβ−鎖
はHLA−DR抗原の多形性を有する一方、α−鎖および第
３の鎖は種々異なる個体において同一であると思われる
〔ジー・コルテ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第78巻、
第534〜538頁（1981）；シヤロンおよびマツクデビツ
ト、上記〕。数種の血清学的に異なるHLA−DR抗原が固
定されており（HLA−DR1乃至HLA−DR8）、かつモノクロ
ーン抗体は同型接合細胞系内におけるDR抗原の１部と定
義されている〔ヴイ・クワランタ等、ジヤーナル・イミ
ユノロジー、第125巻、第1421〜1425頁（1980）；エス
・カレル等、モレキユラ・イミユノロジー、第18巻、第
403〜411頁（1981）〕。さらに、少なくとも２種のDRβ
−鎖を、ペプチド分析により数種の同型接合細胞系にお
いて区別することができる〔アール・エス・アコラ等、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第78巻、第4549〜4551頁（19
81）〕。さらに、HLA−DRに近縁であるが同一でない多形質Ia
状の抗原を暗号化する種類の他の部位も存在する〔ジー
・コルテ等、ネイチヤー誌、第292巻、第357〜360頁（1
981）；ナドラー等、ネイチヤー誌、第290巻、第591〜5
93頁（1981）〕。これらの明確なサブ領域はDCと呼ばれ
〔アール・トシ等、J.Exp.Med.、第148巻、第1592〜161
1頁（1978）；デー・エー・シヤツケルフオード等、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA、第78巻、第4566〜4570頁（198
1）〕、さらにSBと呼ばれる〔エス・ジヨー等、J.Exp.M
ed.、第156巻、第731〜743頁（1982）〕。DC抗原は、DR
抗原との強い結合不均衡にある。SB抗原は、二次的リン
パ球反応を制御しかつDR部位に対し中心的な領域で暗号
化される。現在、HLA−DR抗原は、抗血清での沈澱により血清学
的に単離される。したがつて、HLA−DR決定子の正確な
性質は未確定である。しかしながら、これらの抗原は、
組織もしくは器官移植物に対する供与体および受容体の
適合性を決定するための、或いは広範囲の病気に対する
個体の感受性を決定するための判定方法および生産物に
使用されている。たとえば、ライダー等（上記）は、DR
1乃至DR8判定に基づく次の病気の感受性を報告してい
る：これらの判定から判かるように、D/DR4につき陽性と
判定された個体は、D/DR4につき陰性と判定された個体
よりも6.4倍高いインシユリン依存性糖尿病を発生する
危険がある。或る場合には、さらに病気関連性の抗原を有する患者
において、この抗原を持たない患者におけるよりもその
病気が重度であることも示されている。たとえば、多発
性硬化症の経過は、D/DR2陰性の患者におけるよりもD/D
R2陽性の患者においてより急速である。さらに、或る種
の病気の再発は、病気関連性抗原につき陽性の患者にお
いてより一般的である。要するに、HLA−DR判定は、診
断上および予測上の大きな価値を有する。しかしながら、この種の判定方法および生産物の使
用、ならびにこれらが許容しうる移植供与体および受容
体と病気感受性の個体とを同定する際もたらす重要な利
点は著しく制約されている。何故なら、現在の判定方法
は複雑かつ時間のかかるものであり、またこの種の判定
方法および生産物に対する有用かつ経済的な原料を供給
するために入手しうるHLA−DR抗原が不充分であるから
である。〔発明の要点〕本発明は、ひとリンパ球抗原複合体のDRβ−鎖、すな
わちDR部位の主要な多形質領域を暗号化するDNA配列、
ならびにそれに関連する診断判定方法および生産物を提
供することにより上記の問題を解決する。本発明により、HLA−DR軽鎖すなわちβ−鎖を暗号化
するDNA配列がHLA−DR判定方法および生産物に使用する
ため初めて入手しうるようになつた。本発明のDNA配列
は経済的っかつ多量に生産されうるだけでなく、判定方
法および生産物におけるその使用は前記HLA−DR抗原に
基づく判定方法および生産物を相当に単純化させかつそ
のコストを低減させる。たとえば、本発明のDNA判定方
法は簡単であり、10〜20ml程度に少ない血液で行なうこ
とができ、かつ数千回の判定まで容易に規模拡大するこ
とができる。最後に、本発明のDNA配列は、適当な宿主におけるこ
れら配列の発現ならびにそれらにより暗号化される特異
的DRβ−鎖抗原の生産を他のHLA−DR因子により汚染さ
れることなく可能にし、これらを診断剤、予防剤または
治療剤として使用することを可能にする。本発明を一層充分に理解しうるよう、以下詳細に説明
する。本明細書において次の用語を使用する：ヌクレオチド：糖成分（ペントース）と燐酸と含窒素
複素環式塩基とよりなるDNAもしくはRNAのモノマ単位。
この塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′炭素）を
介して糖成分に結合され、塩基と糖とのこの結合をヌク
レオチドと呼ぶ。塩基はヌクレオチドを特性化する。４
種のDNA塩基はアデニン（「Ａ」）、グアニン
（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）およびチミン
（「Ｔ」）である。４種のRNA塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよび
ウラシル（「Ｕ」である。 DNA配列：隣接するペントースの３′炭素と５′炭素
との間のホスホジエステル結合により互いに結合された
ヌクレオチドの線状列。コドン:mRNAを介してアミノ産、翻訳開始信号または
翻訳停止信号を暗号化する３個のヌクレオチド（トリプ
レツト）のDNA配列。たとえば、ヌクレオチドトリプレ
ツトTTA,TTG,CTT,CTC,CTAおよびCTGはアミノ酸ロイシン
（「Leu」）を暗号化し、TAG,TAAおよびTGAは翻訳停止
信号であり、かつATGは翻訳開始信号である。読枠:mRNAをアミノ酸配列に翻訳する際のコドンのグ
ループ。翻訳の際、適切な読枠を維持しなければならな
い。たとえば、配列GCTGGTTGTAAGは３つの読枠もしくは
相に翻訳することができ、そのおのおのは次の異なるア
ミノ酸配列を与える：ポリペプチド：隣接するアミノ酸のαアミノ基とカル
ボキシ基との間のペプチド結合により互いに結合された
アミノ酸の線状列。ゲノム：細胞もしくはウイルスの全DNA。これは特に
細胞もしくはウイルスのポリペプチドを暗号化する遺伝
子、ならびにそのオペレータ、プロモータおよびたとえ
ばシヤイン−ダルガルノ配列のような配列を含むリボソ
ーム結合および相互作用配列を包含する。遺伝子：離型もしくはメツセンジヤRNA（「mRNA」）
を介して特異的ポリペプチドに特性的なアミノ酸の配列
を暗号化するDNA配列。転写：遺伝子もしくはDNA配列からmRNAを生成する
過程。翻訳:mRNAからポリペプチドを生成する過程。発現：ポリペプチドを生成するためDNA配列もしく
は遺伝子により行なわれる過程。これは転写と翻訳との
組合せである。プラスミド：完全「レプリコン」からなる非染色体二
重鎖DNA配列であつて、このプラスミドは宿主細胞にお
いて複製される。プラスミドを単細胞生物内に挿入する
と、この生物の特性をプラスミドのDNAの結果として変
化もしくは形質転換させることができる。たとえば、テ
トラサイクリン耐性（Tet^R）に対する遺伝子を有するプ
ラスミドは、予めテトラサイクリンに対し感受性の細胞
をこれに耐性である細胞に形質転換させる。プラスミド
により形質転換された細胞を「形質転換体」と呼ぶ。フアージもしくはバクテリオフアージ：細菌性ウイル
スであつて、その多くは蛋白質エンペロプもしくはコー
トにカプセル化されたDNA配列よりなつている（「カプ
シド蛋白質」）。クローン化ベヒクル：プラスミド、フアージDNAまた
はその他のDNA配列であつて、これは宿主細胞半に複製
することができ、被覆蛋白質の複製および生産のような
DNAの本質的生物機能の喪失を伴なうことなくまたはプ
ロモータもしくは結合部位の喪失を伴なうことなくDNA
配列を決定可能に切断しうる１個もしくは少数のエンド
ヌクレアーゼ識別部位により特性化され、かつ形質変換
細胞の同定に使用するのに適した標識、たとえばテトラ
サイクリン耐性もしくはアンピシリン耐性を有する。ク
ローン化ペヒクルはしばしばベクターと呼ばれる。クローン化：生物の集落またはこの種の生物もしくは
配列から無性増殖により生成されるDNA配列を得るため
の過程。組換DNA分子もしくはヒブリドDNA:異なるゲノムから
のDNAの断片よりなる分子であつて、前記ゲノムは生細
胞の外部で末端結合されておりかつ幾つかの宿主細胞に
感染してそこに維持される能力を有する。発現制御配列:DNA配列もしくは遺伝子の発現を、これ
ら配列もしくは遺伝子に作用結合された際、制御および
調整するヌクレオチドの配列。これらはlac系、trp系、
フアージλの主オペレータおよびプロモータ領域、fdコ
ート蛋白質の制御領域ならびに原始核もしくは成熟核細
胞またはそのウイルスの遺伝子の発現を制御することが
知られたその他の配列を包含する。第１図は、染色体６ならびにこの染色体の短腕におけ
るHLA部位の位置の略図である。HLA系の複雑性に鑑み、
種々のIa状抗原と種々のHLA−DR抗原自身とを区別しう
るmRNA翻訳分析を開発することが重要であつた。たとえばうさぎ網状赤血球溶解物系のような無細胞翻
訳系は重合蛋白質を構成しない。他方、有爪蛙ゼノプス
・レビス（Xenopus laevis）の卵細胞が各種蛋白質に対
する翻訳系として使用されている。したがつて、この系
を選択してDR抗原を暗号化するmRNAにつき分析した。こ
の系を使用して、HLA−DR抗原の３つのポリペプチド鎖
が卵細胞で組立てられかつこれらから抗−DRモノクロー
ン抗体により免疫沈澱させうることを示した。したがつ
て、この卵細胞系は、mRNA暗号化DR抗原を選択する方法
を与える。上記分析で同定されたmRNA暗号化DR抗原の豊富なフラ
クシヨンを使用して、mRNAからcDNAを調製し、これをク
ローン化させかつ選択し、そして本発明のDRβ−鎖抗原
を暗号化するDNA配列を含むクローンを単離した。次い
で、これらDNA配列を本発明の方法および生産物に使用
して、組織および器官移植物に対する適合性を決定する
と共に各種の病気に対する個体の感受性増大を決定し
た。さらに、これらDNA配列を適当な宿主に使用して、
それらの暗号化する抗原を他のHLA−DR因子により実質
的に汚染されることなく生成させるのに有用であり、病
気の診断、治療および予防に使用することができる。〔発明の実施例〕ポリA⁺RNAを含有するHLA−DRの調製 10％胎児牛血清とグルタミンとゲンタマイシンとを補
充したRPMI1640培地において、ひとβリンパ芽球細胞
系、すなわちラジ細胞（２種のDR遺伝子、DR3およびDR6
を有する異型接合細胞系）を増殖させた（これについて
はエス・カレル等によりモレキユラ・イミユノロジー、
第18巻、第403〜411頁（1981）に実質的に記載されてい
る）。細胞の生成物を追跡するための標識を与えるた
め、50×10⁶個の細胞当り1mCiのS³⁵−メチオニンを補充
した完成メチオニン非含有培地において、２×10⁶個の
細胞1mlの濃度にて37℃で16時間培養することにより細
胞を代謝標識した。分析用として非グリコシル化DR分子
を得るため、S³⁵−メチオニンを添加する２時間前に２
μg/mlのツニカマイシンを添加した。凍結細胞ペレツトを、氷冷した溶解緩衝液（10mMトリ
ス−HCl（pH7.6）、0.1MNaCl、１％ノニデツトP40）（1
ml緩衝液/10⁸個細胞）において１分間隔で15秒間４回乱
流させることにより溶解させ、そしてこの溶解した細胞
をペツクマンＪ−６型遠心分離器（4500×ｇ）にて遠心
分離した（４℃、4min、4000rpm）。次いで、4mlの細胞
質上澄液を次の濃度勾配にてSW41ポリアロマー管に加え
た:10mMトリス−HCl（pH7.4）、1mM EDTAにおける2ml C
aCl（5.7M）;20mMトリス−HCl（pH7.4）、2mM EDTAにお
ける40％〜20％（W/V）の直線濃度におけるCsCl 4.2ml;
および20mMトリス−HCl（pH7.4）、0.1M NaCl、4mM EDT
Aにおける５％（W/V）蔗糖溶液0.8ml。14℃にて濃度勾
配を均衡化させた後、RNAをペレツト化させた（14℃、1
4時間、37000rpm）。大型RNA調製物につき、SW27チユー
ブを14℃にて26000rpmで16時間使用した。チユーブからRNAを回収するため、チユーブを転倒さ
せそして底部を切除した。次いで、RNAを10mMトリス−H
Cl（pH7.4）、1mM EDTAに溶解させ、混合物を0.3M酢酸
ナトリウム（pH5.0）に調整しそしてRNAを２容量のエタ
ノールで沈澱させた。再びRNAを10mMトリス−HCl（pH7.
4）、1mM EDTAおよび１％SDSに溶解させ、これを100℃
にて２分間加熱し、そして混合物を室温まで冷却した。
１容量の10mMトリス−HCl（pH7.4）、1mM EDTA、1M NaC
lを加えた後、RNAをオリゴ（dT）セルロースカラム（コ
ラボラテイブ・リサーチ社）に加え、そしてポリA⁺RNA
フラクシヨンをH₂Oで溶出させそしてこれをEDTAの不存
在下にエタノールで２回沈澱させた（第２図）。緩衝液系（25mMクエン酸ナトリウムにおける6M尿素
（pH3.8）を用いてポリA⁺RNAをアガロース−尿素ゲルに
おいて寸法分画した（これについてはローゼン等によ
り、バイオケミストリー（ワシントン）、第14巻、第69
〜78頁（1975）に実質的に記載されている）（第２
図）。この緩衝液系は、高能力および高分解能の分画化
によく適している。さらに、これは充分に変性する〔エ
ツチ・レーラツハ等、バイオケミストリー、第16巻、第
4743〜4751頁（1977）〕。ポリA⁺RNAの分画化を行なうため、500μｇのポリA⁺RN
Aを100μの10mMトリス−HCl（pH7.4）、1mM EDTA、0.
5％SDSに溶解させ、200μのDMSO（99％）を加え、そ
してこの溶液を1mM EDTAおよびpH8.0に調整した。次い
で、この溶液を45℃にて５分間加熱し、これを４×0.5c
mのスロツトに加えた（2.5％アガロースゲル）。このゲ
ルをブロムフエノールブルーがゲルの底部に達するまで
冷所中で36時間電気泳動にかけた。種々の寸法のフラク
シヨン（700×1600ヌクレオチド長さ）を得るため、2mm
のスライスをゲルに沿つて切断し、これらフラクシヨン
を4mlの10mMトリス−HCl（pH7.4）、10mM EDTA、0.5％N
aCl、0.1mg/mlイー・コリtRNAにおいてウルトラ−ツラ
ツクスで分散させた。分散懸濁物０を0.5％SDSまで調整
した後、これを１晩振とうし、次いでポリA⁺RNAを上澄
液からオリゴ（dT）−セルロース小カラムにおけるクロ
マトグラフィーにより単離し、そしてこれをEDTAの不存
在下にエタノールで２回沈澱させた。調製ゲル電気泳動
の前に、試料中に３′末端標識されたラジmRNAを含ませ
ることにより回収を監視した。種々のポリA⁺RNAフラクシヨンのHLA−DR活性（もしあ
れば）を分析するため、このRNAを卵細胞中に移植し、
そして生成物を３種のモノクローン抗体D1−12、D4−22
およびBT2.2^＊で免疫沈澱させた。この分析において、
段階６の卵細胞をゼノプス・レビスの卵巣から、CA⁺⁺を
含有しないOR2培地における0.2％粗製コラゲナーゼ（シ
グマー社Ｃ−0130）中で攪拌しながら室温にて90〜120
分間培養した後単離した〔ワラツク等、J.Exp.Zool.、
第184巻、第321〜334頁（1973）〕。次いでこれら卵細
胞に20ngのポリA⁺RNAの50nlを注入し（これについては
ヴイ・エー・モア、ジヤーナル・モレキユラー・バイオ
ロジー、第61巻、第63〜103頁（1971）に実質的に記載
されている）、そしてこれを0.5mCi/mlのS³⁵−メチオニ
ンと50単位/mlペニシリンとストレプトマイシンとを含
有するOR2培地において24時間培養した。培養後、卵細
胞をホモゲナイズした（これについてはランジヤーおよ
びツアラーによりProc.Natl.Acad.Sci.USA、第75巻、第
6073〜6077頁（1978）に実質的に記載されている）。た
だし、1mlの緩衝液を50個の卵細胞当りに使用し
た^＊＊。＊これらのモノクローン抗体およびその活性は既に報
告されている〔エス・カレル等、モレキユラ・イミユノ
ロジー、第18巻、第403〜411頁（1981）（D1−12,D4−2
2）；アール・エス・アコラ等、ヨーロピアン・ジヤー
ナル・イミユノロジー、第12巻、第166〜169頁（1982）
（BT2.2）〕。＊＊分析用として非グリコシル化生成物を調製するた
め、卵細胞を50μg/mlのツニカマイシンの存在下で培養
し、これらに40μg/mlのツニカマイシンを含有するRNA
（50nl）を注入し、そして５μg/mlのツニカマイシンを
含有するDR培地において24時間培養した。これについて
はコールマン等により、ヨーロピアン・ジヤーナル・バ
イオケミストリー、第113巻、第339〜348頁（1981）に
実質的に記載されている。卵細胞ホモゲナイズ物からの上澄液を0.15M NaCl、0.
25％ノニデツトP40により2mlに調整し、そしてこれをレ
ンチルレクチン−セフアローズ（フアルマシア社）の1m
lカラムに加えた。このカラムを同じ緩衝液で激しく洗
浄した後、0.1Mα−メチルマノシドを含有する同じ緩衝
液でグリコシル化物質を溶出させた（1.3％S³⁵−メチオ
ニン含有物を合併フラクシヨン中に溶出させた）。その
後のクローン化実験においてはレンチルカラムを省略し
た。次いで、レンチルレクチンカラムからのグリコシル化
物質をトリス−HCl（pH7.0）および１％アプロテニン
（シグマ社）にpH8.0に調整し、そして1ml当り20μの
PX63腹水液を加えた。冷所中で２時間以上培養しかつ過
剰の蛋白質Ａ−セフアロース（フアルマシア社）の存在
下でさらに２時間培養した後、1ml当り20μの抗−DR
モノクローン抗体（D1−12,D4−22,BT2.2）の混合物を
腹水液として加えた。これは注入した卵細胞当り１μ
の腹水液に相当する。４℃にて１晩培養した後、試料を
３分間遠心分離し（エツペンドルフマイクロ分離器）、
そしてペレツトを捨てた。この遠心分離は、分析におけ
る凝集物質に基づく大きいパツクグランドを避けるため
に重要である。次いで、蛋白質Ａ−セフアロースを上澄液に加え、そ
して培養を４時間続けた。遠心分離により免疫沈澱物を
集め（マイクロ分離）、約400μの50mMトリス−HCl
（pH7.4）、5mM EDTA、0.15M NaCl、１％ノニデツトP
40、10mMメチオニン、１％アプロテニンで２回洗浄し、
約400μの同じ緩衝液（ただしアプロテニンと0.15M N
aClとを含有せず、0.5MのNaClを含有する）で３回、さ
らに約400μの10mMトリス−HCl（pH7.4）、1mM EDT
A、0.15M NaCl、0.5％ノニデツトP40で２回洗浄した。次いで、免疫沈澱物を25μの0.5Mトリス−HCl（pH
8.8）、1M蔗糖、5mM EDTA、0.01％ブロムフエトルブル
ー、３％SDSおよび8.3mMジチオスレイトールの中に100
℃にて３分間加熱することにより溶解させ、そしてこの
溶液を12％ポリアクリルアミドSDSゲルに加えた。この
ゲルを二次元で電気泳動にかけ、第一次元においては非
平衡pH濃度勾配の電気泳動にかけた（これについてはピ
ー・ゼツト・オーフアレル等、セル誌、第12巻、第1133
〜1142頁（1977）に実質的に記載されている）。これら
ゲルを10％トリクロル酢酸中で固定し、エンハンス（ニ
ユー・イングランド・ヌクレア社）で処理し、20％メタ
ノールおよび３％グリセリン中で洗浄し、そして乾燥さ
せた。乾燥ゲルを予備フラツシユされたコダツクＸ−AR
フイルムに強化スクリーン（Cawo社）を用いて−70℃で
露出させた。この分析により、HLA−DRのα−鎖、中間鎖およびβ
−鎖を暗号化するRNAを含有するフラクシヨンとして、m
RNA1200−1300ヌクレオチド長さを有するフラクシヨン3
1を同定した。このフラクシヨンのRNAを、全ポリA⁺RNA
につき約20倍濃縮させた。寸法分画したRNAの分析は、ラジ細胞からの翻訳RNAお
よびDR抗原の多数回の事前分析に基づく。これらの分析
から、卵細胞はHLA−DRのα−鎖、中間鎖およびβ−鎖
を暗号化するRNAを翻訳し、これら抗原をグリコシル化
させ、かつこれらを組立てることを確認した。さらに、
組立物はモノクローン抗体D1−12,D4−22およびBT2・２
により免疫沈澱されたが、β−鎖のみがT2・２により抗
原組立物が変性された後に免疫沈澱されたことを確認し
た。また、α−鎖は35000〜36000の明確な分子量を有
し、中間鎖は約33000の明確な分子量を有し、かつβ−
鎖はSDS−ポリアクリルアミドゲルにおいて31000および
29000の明確な分子量を有することを確認した。さら
に、非グリコシル化物質は次の通りである:30000および
29000（α−鎖）、2700（中間鎖）ならびに27000および
26000（β−鎖）。 cDNAクローンの作成 1. HLA−DR cDNAの調製フラクシヨン31のポリA⁺RNAの単一鎖cDNAコピーを調
製するため、CH₃Hgを5mMまで加えることによりRNAを変
性させ、そしてこの混合物を室温で１分間静置した。次
いで、この変性RNAに1ml/40μg RNAの緩衝液（50mMトリ
ス−HCl（pH8.3）、10mM MgCl₂、70Mm KCl、30mM β
−メルカプトエタノール、4mMピロ燐酸ナトリウム）と
0.5mM dGTP,dATPおよびdTTPと0.3mM α−P³²−dCTP
（〜0.5μCi/nモル）と40μg/mlのオリゴ（dT）12−18
（コラボラテイブ・リサーチ社）と300単位/mlの逆転写
酵素（ライフ・サイエンス社）とを加え、この混合物を
37℃にて10分間および42℃にて60分間加熱した〔ワーリ
等、Dev.Biol.、第67巻、第371〜383頁（1978）〕（第
２図）^＊。この混合物へEDTAを10mMまで加えかつSDSを
0.1％まで加えることにより反応を停止させ、そして混
合物をフエノール／クロロホルム／イソアミルアルコー
ル（100:99:1）で抽出した。水相をセフアデツクスＧ−
50超微粒カラムにより10mMトリス−HCl（pH7.6）、1mM
EDTAで洗浄した。次いで、溶出された混合物をNaOHにて
0.5Nとなし、これを37℃で30分間培養し、それぞれ5Mの
HOAcおよび1Mのトリス−HCl（pH7.6）の0.1容量で中和
し、そして単一鎖cDNAをエタノール沈澱させた。遠心分
離によりcDNAを回収した後、これを50μの0.5N NaOH
中に再懸濁させ、37℃にて30分間培養し、そしてこれを
0.9M NaCl、0.1M NaOH、2mM EDTA中で4mlの５〜20％
アルカリ性蔗糖濃度勾配にて層状化させた。この層状化
されたcDNAをSW60ロータ（50000rpm、１℃、7.5時間）
にて寸法分画し、そして1000ヌクレオチド以上の長さを
有するcDNAを含有するフラクシヨンを集めた。集めたDN
Aを中和し、そして上記と同様に沈澱させた（第２
図）。上記の集めたフラクシヨンからcDNAを68℃で90秒間加
熱しかつ氷中で急冷させて変性させることにより二重鎖
cDNAを調製した。次いで、次の反応混合物を調製した：
単一鎖cDNA（40μg/ml）、50mMトリス−HCl（pH8.3）、
10mM MgCl₂、70mM KCl、30mM β−メルカプトエタノー
ル、0.5mMのそれぞれdNTPおよび300単位/mlの逆転写酵
素。この混合物を37℃で10分間および42℃で90分間加熱
した。EDTAを10mMまで加えることにより再び反応を停止
させ、そしてこれをフエノール／クロロホルム／イソア
ミルアルコール（100:99:1）で抽出し、そしてセフアデ
ツクスＧ−50カラムにて10mMトリス−HCl（pH7.6）、1m
M EDTAでクロマトグラフにかけた。＊ピロ燐酸ナトリウムの添加は沈澱を生ぜしめ、この
沈澱は反応を停止させると消失する。二重鎖cDNA調製物におけるヘヤピンループを60mM NaC
l、6mM NaOAc（pH4.8）、0.5mM ZnCl₂、〜30μg/ml二重
鎖cDNA、100単位/ml S₁ヌクレアーゼ（Ｐ−Ｌバイオケ
ミカルス社）を含有する反応混合物において混合物を37
℃で30分間加熱することによりS₁ヌクレアーゼで処理し
た。EDTAを10mMまで加えかつトリス−HCl（pH7.6）を10
0mMまで加えることにより反応を停止させ、混合物をフ
エノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（100:
99:1）で抽出し、そしてこれをセフアロースCL−GBカラ
ムにより10mMトリス−HCl（pH7.6）、1mM EDTAで洗浄し
て精製した。次いで、cDNAを上記と同様にEtOHにて沈澱
させた。 2.HLA−DR cDNAのクローン化広範囲の宿主／クローン化ベヒクル組合せ物を使用し
て、二重鎖cDNAをクローン化させることができる。さら
に、それぞれ特異的クローン化ベヒクルにおいて、種々
の部位を選択することにより二重鎖cDNAを挿入すること
ができる。本発明のDNA配列をクローン化させるために
は、これら各種の代替物から本発明の範囲を逸脱するこ
となく当業者により特定的に選択することができる。初期のクローン化研究において、細菌性プラスミドpB
R322（エフ・ポリバール等、「新規なクローン化ベヒク
ルIIの作成および特性化。多目的クローン化方式」、ジ
ーン誌、第２（２）巻、第95〜114頁（1977）；ジエー
・ジー・サツトクリフ、「DNA配列から得られるpBR322
制限地図:4361ヌクレオチド対長さまでの正確なDNA寸法
標識」、ヌクレイツク・アシツド・リサーチ、第５巻、
第2721〜2728（1978））。さらに、Pst I部位〔エル・
ピラ・コマロフ等、「プロインシユリンを合成する細菌
性クローン」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第75巻、第37
27〜3731頁（1978）〕、dC/dG切断〔エル・ピラ・コマ
フロ等、上記〕およびイー・コリHB101を選択した。ａ、 Pst I−開裂されたdG−切断pBR322の調製標準条件を用いてPst IによりpBR322を切断した。次
いで、20mM K−カコジル酸塩、50mMトリス−HCl（pH6.
9）、10mM MgCl₂、1mM dGTP、200μg/ml線状化pBR322お
よび25単位/ml末端トランスフエラーゼの反応混合物を
調製した。この混合物を37℃にて45分間加熱した後、ED
TAを10mMまで加えかつSDSを0.5％まで加えて反応を停止
させ、そしてこの混合物を氷中で15分間急冷し、遠心分
離（マイクロ遠心分離器、２分間、４℃）によりdC切断
されたHLA−DR cDNAにアニールさせるため上澄液を調製
した（第２図）。ｂ、 dC切断HLA−DR cDNAの調製 dC切断物を、200mM K−カコジル酸塩、50mMトリス−H
Cl（pH6.9）、1mM dCTP、100μg/ml BSA（ペンテツクス
社）、〜２μg/ml cDNAおよび125単位/ml末端デオキヌ
クレオチジルトランスフエラーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカ
ルス社）を含有する反応混合物において37℃でこの混合
物を１〜６分間加熱することにより上記と同様に調製さ
れたcDNAへ加えた。少量部を用いることにより、最適な
反応時間を選択した（通常約４分間）。次いで、この時
間を使用してcDNAを切断した。再びEDTAを10mMまで加え
かつSDSを0.5％まで加え、さらに混合物を氷中で15分間
急冷することにより反応を停止させた。dC切断されたcD
NAを単離してこれを遠心分離によりdG切断されたPst−
開裂pBR322へアニールさせた（マイクロ遠心分離器、２
分間、４℃）（第２図）。ｃ、 dC切断cDNAおよびdG切断pBR322のアニール化上記のように調製した40ngのdC切断cDNAと、上記のよ
うに調製した250ngのdG切断されたPst開裂pBR322とをア
ニール化用緩衝液（10mMトリス−HCl（pH7.6）、1mM ED
TA、0.2M NaCl）において68℃で２時間混合し、次いで
徐々に冷却した（第２図）。上記のように調製された組換DNA分子の僅かのもの
が、実際にHLA−DRのβ−鎖、すなわち軽鎖、すなわちH
LA−DR座の主たる多形質領域を暗号化する鎖を暗号化す
るDNA配列を含有することが了解されよう。事実、大部
分のクローン化された種類は、HLA−DRに対し或いはそ
のβ−鎖に対し無関係である。 3. ヒプリドによるイー・コリHB101のトランスフエク
シヨン競合イー・コリHB101（recA^-）を上記のヒブリドによ
り形質転換させた（これについては、デイー・モリソン
によりジヤーナル・バクテリオロジー、第132巻、第349
〜351頁（1977）に記載されている）。プラスミドpBR322はアンピシリン耐性とテトラサイク
リン耐性とを暗号化する遺伝子を含み、かつ前者の遺伝
子はPst I部位におけるcDNA挿入により失活されるの
で、Pst I部位にcDNA挿入物を有する組換DNA分子で形質
転換された集落を、そのように形質転換されていない集
落から選択することができる。したがつて、上記のよう
に形質転換されたイー・コリ菌体を10μg/mlのテトラサ
イクリンを含有する洗浄かつオートクレーブ処理された
シユライヒヤーおよびシユエルのニトロセルロースフイ
ルターに塗沫した〔テイー・ハナハンおよびエム・メセ
ルソン、ジーン誌、第10巻、第63〜67頁（1980）〕。こ
の方法を用いて550種のcDNAクローンを作成した（第２
図）。 HLA−DR cDNAを含有するクローンの選別特定の組換DNA分子を含有するクローン、すなわちHLA
−DR−β−鎖関連のDNA挿入物を含有するクローンにつ
き、クローンの保存物を選別するには幾つかの方法があ
る。これらの方法は当業界で充分周知されている。初期
のクローン選別において、ポリA⁺RNAに対する高基準の
陽性ヒブリド化選択をジアゾベンジルオキシメチル紙
（シユライヒヤーおよびシユエル）において使用するよ
う選択した。本発明の方法はゴールドベルク等、メソツ
ド・エンチモロジー、第68巻、第206〜220頁（1979）の
方法から改変させた。ヒブリド化に対する実験基準とし
ては、50個の集落の保存物において１個のDR−β−cDNA
−関連クローンを検出しうると予想した。 550個の選別したクローンをそれぞれ50個のクローン
の11群に分け、これらを10μg/mlのテトラサイクリンを
補充したＬ−培地で増殖させた。次いで、クロラムフエ
ニコール（50μg/ml）によりプラスミドを１晩処理し、
そして慣用の清澄溶菌物CsCl濃度勾配法を使用してこれ
ら保存物からプラスミドDNAを調製した。次いで、プラ
スミドDNAを0.5％ジエチルピロ炭酸エステルで処理し、
これをセフアロースＢカラム（10mMトリス−HCl（pH7.
6）、1mM EDTA）に通して、小さい汚染性RNA分子を除去
した。プラスミドDNAを0.25N HCl中で室温にて10分間部
分的に処理し、混合物を0.5NのNaOH、0.5M NaClまで調
整し、20分間培養し、HClで中和し、そしてDNAをEtOHに
より２回沈澱させた。次いで、調製されたジアゾベンジ
ルオキシメチル紙（シユライヒヤーおよびシユエル）を
調製し、これに上記で調製されたDNAを共融結合させた
（これについてはゴールドベルク等、上記により実質的
に記載されている）。P³²−標識DNAトレーサを混合物中
に含ませることによりDNAの滞留につき監視した。平均
して15μｇのDNAがそれぞれ1cm²のフイルタに結合され
た。これらフイルタを50％ホルムアミド（２回再結晶化さ
れかつ脱イオン化したもの）、20mM PIPES（pH6.4）、
0.75M NaCl、2mM EDTA、0.4％SDS、１％グリシン、0.3m
g/mlイー・コリtRNA、0.1mg/mlポリＡにおいて37℃で２
〜４時間予備ヒブリド化させた。ヒブリド化するため、
11枚のフイルタを〜200mlの同じ緩衝液（グリシン、tRN
AおよびポリＡを含まない）において37℃で20時間にわ
たり300μｇの全ポリA⁺RNA（上記のように調製）で処理
した。次いで、これらフイルタをヒブリド化緩衝液で37
℃にて30分間３回洗浄し、22℃で10mMトリス−HCl（pH
7.4）、1mM EDTA、0.1M NaCl、0.1％SDSにて30分間３回
洗浄し、次いで50℃にて10mMトリス−HCl（pH7.4）、1m
M EDTAにより10分間３回洗浄した。ヒブリド化RNAを150μの5mMトリス−HCl（pH7.
4）、0.5mM EDTA、６μg/mlうさぎtRNAにより２つの部
分に溶出し、その際フイルタを含む溶液を98℃にて75秒
間加熱した。次いで、混合物を0.3M NaOAc（pH5.0）ま
で調整し、そしてRNAをEtOHにより２回沈澱させた。上記からのRNAにHLA−DR α−鎖および中間鎖（cDNA
過剰の条件下で25μｇのポリA⁺RNAから選択し、かつ卵
細胞分析により確認）に対するmRNAを補充し、そして補
充されたRNAを卵細胞に注入して上記と同様に分析し
た。RNAをこのように処理して免疫沈澱のレベルを増大
させると共に、可能なクローンを検出する機会を増大さ
せた。卵細胞により合成されたα−鎖および中間鎖抗原
の存在を監視するため、各卵細胞抽出物の1/4を、遊離
α−鎖および中間鎖を結合する抗−DR−うさぎ血清133
〔カレル等、モルキユラ・イミユノロジー、第18巻、第
403〜411頁（1981）〕で免疫沈澱させた。各卵細胞抽出
物の残部3/4を抗−DR−モノクローン抗体（D1−12,D4−
22,BT2.2）によつて免疫沈澱させた。11個の保存物のう
ち２個において、少量のDR−抗原（β）が注入卵細胞で
合成された^＊。＊幾つかの保存物においてはさらに37000ダルトンの
バンドも免疫沈澱された。この蛋白質は同定しなかつ
た。２種の陽性のものの各々を10個のクローンからなる５
群に分け、かつヒブリド化させて、これらを上記と同様
に分析した。元の２種の陽性のものの各々から誘導され
た５群の内の１群は、再び陽性であった。次いで、２つ
の陽性の群の各々を、それぞれ１個のクローンよりなる
10群に分け、かつヒブリド化させて、これらを上記と同
様に分析した。２つの陽性クローンを選択した：クロー
ン68およびクローン83−７。クローン83−７はヒブリド化の条件下でDR−β鎖mRNA
を極めて効率的に選択した。このmRNAは卵細胞において
抗原を生成し、この抗原をαおよび中間鎖RNAによる補
充なしに抗−DRモノクローン抗体（D1−12,D4−22,BT2.
2）により免疫沈澱させた。逆に、クローン68−６はDR
−β−鎖mRNAの選択においてずつと効率が低かつた。ク
ローン83−７は180bpの挿入物を有し、かつクローン68
−６は470bpの挿入物を有した。これら挿入物はクロス
ヒブリド化しなかつた。第３図はDR領域におけるクローン83−７のcDNA挿入物
の位置およびIa状領域におけるクローン68−６のcDNA挿
入物の位置を示している。Ia状領域をHLA部位の領域と
呼び（第１図）。クローン68−６はIaと名付けられる。
何故なら、これはHLA/DRに関連するがそれとは同一でな
い領域を示すからである。さらに、ゲル移動ヒブリド化によりこれら２種のcDNA
クローンに同族であるRNAを分析した。両cDNAクローン
は長さ約1300ヌクレオチドのポリA⁺RNAとヒブリド化
し、２種のβ−細胞系および慢性リンパ白血病を有する
患者からのβ−細胞で発現されたが、３種のＴ細胞系、
膵臓および肝臓には存在しなかつた。また、68−6cDNA
挿入物は長さ1650ヌクレオチドのRNAバンドにヒブリド
化したが、83−7cDNA挿入物は長さ1900ヌクレオチドの
他のRNAバンドにヒブリド化した。クローン83−７および68−６にヒブリド化するラジ由来
のクローンの選別クローン83−７および68−６のDNA挿入物を試料とし
て使用し、上記と同様に調製された金ポリA⁺RNA由来の
クローン（ラジ細胞）の保存物を鋭意選別して、HLA−D
R β暗号化領域から他の好ましいより長くかつより完全
なDNA配列を位置決定した。 Pst Iでの処理により２種のクローンのプラスミドDNA
から挿入物を切除し、これらを中性蔗糖勾配遠心分離お
よびアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。溶出
された断片をDEAEカラムに通し、精製された挿入物を標
識した（これについてはエム・グルンシユタインおよび
デイー・ホグネスにより「コロニーヒブリド化：特異的
遺伝子を含有するクローン化DNAの単離方法」、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA、第72巻、第3961〜3965頁（1975）；
リグビー等、ジヤーナル・モレキユラ・バイオロジー、
第113巻、第237〜251頁（1977）に実質的に記載されて
いる）。そして（α−P³²）ヌクレオチドおよびDNAポリ
メラーゼＩ（ベーリンガーマンハイム社）によつてニツ
ク翻訳により２×10⁸cpm/μｇまで精製した〔リグビー
等、上記〕。次いで、この試料を使用して、高基準条件
（下記）を用いてより長いヒブリド化関連cDNAクローン
につき保存物を選別した。この選別から、より長いcDNA挿入物を含有する多数の
クローンを単離した。これらクローンの挿入物をDR−β
₁,DR−β_２およびIa−β_１と名付けた。これら挿入物に
より画成される領域を第３図に示す。第３図に示したよ
うに、DNA挿入物DR−β_１およびDR−β_２はDR部位に関
連する一方、Ia−β_１はIa領域に関連する。さらに、これらクローンの種々の断片を用いて幾つか
のヒブリド化基準でクロスヒブリド化実験を行ない、選
択された種々異なるcDNAクローン間の類似性の程度を決
定した。cDNAクローンの３′未翻訳部分からのDNA配列
は高基準（Tmより５℃低い）、中間基準（Tmより24℃低
い）または低基準（Tmより43℃低い）においてクロスヒ
ブリド化しなかつた。逆に、DRβ−鎖部位ではなくIa状
領域の第１領域を暗号化するクローンの５′末端におけ
るDNA配列は、中間基準でクロスヒブリド化した。した
がつて、DR関連DNA配列はIa関連配列にクロスヒブリド
化しないが、Ia関連配列は他のIa関連配列にクロスヒブ
リド化する。 cDNA挿入物の制限地図各種の制限エンドヌクレアーゼによる単一および二重
処理を用いた制限分析により、各種のcDNAクローンのHL
A関連挿入物を地図化した。エンドヌクレアーゼの供給
業者（ニユー・イングランド・バイオラブ社、ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリー社、ベーリンガー社）により
推奨される条件および緩衝液を使用し、そして得られた
断片をアガロースゲル上で分析した。さらに第３図は、選別工程において位置決定された各
種のcDNA挿入物の部分制限地図を示している。勿論、第
３図に示された制限部位の実際の位置は不正確である。
慣用方法を用いるヌクレオチド配列は、他の予測部位と
同様に特定部位に適切に位置決定するであろう。上記したように、ラジ細胞は異型接合性、すなわちDR
3/6である。したがつて、２種の異なる配列DR−β_１お
よびDR−β_２がこれら細胞から生成されるcDNAに存在す
るという事実は、これらクローンを特性化する２種のDN
A配列がβ−鎖暗号化配列の異なる種類から生ずるとい
うことを明確には示していない。寧ろ、これら２種は異
型接合細胞系の２種のDR型の対立型種類である。クローンDR−β_１にヒブリド化するIBW9由来のクローン
の選別ヒブリド化試料としてDNA挿入物DR−β_１を使用し
て、ひとβ細胞系、IBW9から得られた全ポリA⁺RNAの200
00個のクローンの保存物を選別した。この保存物は、ラ
ジ細胞保存物について前記したと同様に調製した。IBW9
は、血族関係によりHLAに対し元来同型接合性であると
思われた細胞系である。しかしながら、これはその後、
２つの研究室によりDR4,W6異型接合系として個々に分類
された。同型接合細胞系と思われるものを使用して、ラジ細胞
のような異型接合細胞系に存在しうる対立多形質性を検
出するのが困難な上記の可能性を回避した。異型接合系
に対比して、同型接合細胞系からのクローンに検出され
るβ−鎖クローンは、定義において異なるβ−鎖遺伝子
族を示すであろう。しかしながら、上記したように、本
発明に使用した系統は実際には異型接合系であつた。この異型接合細胞系由来の保存物を選別した結果、HL
A−DR−関連DNA配列の４つの種類を位置決定した。これ
ら種類の暗号化配列を制限地図化^＊に基づきDR−β−A,
DR−β−B,DR−β−ＣおよびDR−β−Ｄと名付けた。勿
論、他のβ−鎖種類も存在しうることを了解すべきであ
る。たとえば、アコラ（上記）は７種のこの種のものを
予測している。このような種類は、本発明のDR−β₁,DR
−β₂,DR−β−A,DR−β−B,DR−β−ＣまたはDR−β−
Ｄ配列またはその断片を用いて高基準のヒブリド化にて
（実質的に上記したと同様）または他の同様な方法を用
いて選別しうるので本発明の１部である。＊これら挿入物を含むクローンをイー・コリHB101（p
BR322（Pst）/HLA−DR−β−Ａ乃至Ｄ）と命名し、これ
はそのPst I制限部位に特定のHLA−DR−β関連DNA挿入
物を有するpBR322からなる組換DNA分子により形質転換
されたイー・コリHB101菌体であることを意味する。４種のDR−βクローンにおけるクローンはその暗号化
領域および非暗号化領域全体にわたり充分にクロスビブ
リド化する。これらは、極めて厳密に制限地図およびク
ロスヒブリド化によつて区別することができる（第４
図）。したがつて、これらは恐らく４種の異なるDR−遺
伝子から得られた４種のmRNAを示している。これらはDR
（4,W6）に対し異型接合細胞系から得られるので、これ
ら４種のDR−β遺伝子はDR−β鎖を暗号化する少なくと
も２つの非対立部位を示すと思われる。この結論は、さ
らにβ_１試料を用いて同じβ細胞系から単離したゲノム
DNAクローンの分析により裏付けられる。 cDNA挿入物のヌクレオチド配列ヌクレオチド配列を決定するため、上記のように、DN
A挿入物DR−β−A,DR−β−B,DR−β−ＣおよびDR−β
−Ｄからの制限断片を調製し、これらをアクリルアミド
ゲルから抽出し、そしてDEAEセルロースカラムで精製し
た。これら断片を（α−P³²）コルジアピン−５′−ト
リホスフエート（アメルシヤム社）および末端デオキシ
ヌクレオチジルトランスフエラーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミ
カルス社）により３′標識し、或いはこれらを牛の腸ホ
スフアターゼ（エス・クラークソンによる寄贈）および
ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカルス
社）により５′標識した。これら標識された断片につ
き、マキサムおよびギルバートにより「DNAの新規な配
列決定方法」、Proc.Natl.Sci.USA、第74巻、第520〜56
4頁（1977）に実質的記載されているように配列決定し
た。殆んどのcDNAについては両ストランドから配列決定
し、かつ標識末端として作用する殆んどの制限部位につ
いてはそれらを画成する断片を用いて配列決定した。第５図は配列決定方法およびcDNAクローンHLA−DR−
β−Ａ^＊の暗号化ストランドのヌクレオチドおよびアミ
ノ酸配列を示している。クローンHLA−DR−β−Ａにお
いて、35個のヌクレオチドが最初のATGトリプレツトに
先行する。このATGは長さ266個のアミノ酸の開放読枠に
おける最初のコドンである。11個の連続した疎水性残基
のコアを有する最初の29個のアミノ酸は、ひとIa抗原の
β−鎖につき決定された部分アミノ酸配列と高度の類似
性を有する配列に先行する〔テイー・エー・シヤツケル
フオード等、イミユノロジー・レビユー、第66巻、第13
3〜187頁（1982）〕。したがつて、最初の29個のアミノ
酸（第５図においてNo.−１〜−29）は恐らく信号配列
を示し、残部237個のアミノ酸（第５図においてNo.1〜2
37）は成熟蛋白質（199個のアミノ酸）とトランスメン
ブラン領域（22個のアミノ酸）と細胞質末端（16個のア
ミノ酸）とを示す。第５図に示したように、暗号化配列
の細胞外部分には４個のシステインが存在する（位置1
5,79,117および173）。＊このクローンに対する部分ヌクレオチドおよびアミ
ノ酸配列（AA79−95）は英国特許出願第8222066号およ
び第8230441号明細書に示された。第６図はクローンHLA−DR−β−Ａから推定したアミ
ノ酸配列と、DR2同型接合系〔エツチ・クラツチン等、
ホツペ・セイラース・ツアイトシユリフト・フイジオロ
ジツシエ・ケミー、第362巻、第1665〜1669頁（198
1）〕から単離されたIa抗原β−鎖につきクラツチンに
より決定された配列と、DR3,W6細胞系〔テイー・ラルハ
ンマー等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第79巻、第3687〜
3691頁（1982）〕から単離されたcDNAクローンにより推
定される配列とのアミノ酸配列比較を示している。最後
の配列は、DCβ−鎖クローンであると思われる。何故な
ら、その推定配列はDSβ−鎖〔エス・エム・ゴイエルト
等、J.Exp.Med.、第156巻、第550〜566頁（1982）〕^＊
につき決定された部分Ｎ−末端配列に匹敵するからであ
る。＊ DSおよびDC抗原は同一であり、かつねずみＩ−A Ia
抗原に対し極めて良好な類似性を示すことが、エス・エ
ム・ゴイエルト等によりJ.Exp.Med.、第156巻、第550〜
566頁（1982）；アール・ボノおよびジエー・エル・ス
トロミンガー・ネイチヤー誌、第299巻、第836〜838頁
（1982）に記載されている。第７図は他のHLA−DR−βクローン〔HLA−DR−β−
Ｂ〕のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示している。
さらに、このクローンから推定されるアミノ酸配列は29
個のアミノ酸よりなる推定信号配列と、237個の他のア
ミノ酸とを暗号化領域に有する。 HLA−DR判定における本発明のcDNA挿入物の使用 HLA−DR−β−鎖抗原またはその断片の種類を暗号化
するcDNA挿入物を、DR判定法およびキツトに使用するこ
とができる。一般に、この種の判定方法は、（１）慣用
のエンドヌクレアーゼと条件とを用いて個体のDNAを制
限し、（２）制限DNAをたとえば慣用のゲルにおいて寸
法分画し、（３）寸法分画されたDNAを本発明のHLA−DR
−β−鎖関連試料またはその断片にヒブリド化し、かつ
（４）ヒブリド化の領域を検出する工程からなつてい
る。たとえば、この種の方法の１例として、確立された細
胞系からの４種の異なる個体〔HLA−DRにつき３種の同
型接合体（1/1,6/6,7/7）および１種の異型接合体（3/
6）〕から高分子量DNAを得た。このDNAを37℃にてEcoR
I（ベーリンガー・マンハイム社）とHind II（ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリース社）またはBamH Iにより、
標準緩衝液条件および１単位酵素／μg DNAを用いて１
晩処理した。EDTAにより反応を停止させ、制限DNAをク
ロロホルム／イソアミルアルコール（24:1）により１回
抽出し、そしてETOHで沈澱させた。遠心分離の後、ペレ
ツトを10mMトリス−HCl（pH7.6）、1mM EDTA、0.1％SD
S、0.05％ブロムフエノールブルー、0.05％キシレンシ
アノールおよび５％グリセリン中に再懸濁させた。DNA
を37℃にて４時間培養した後、これを65℃にて５分間処
理し、20mMグリシン、15mM NaOH（pH8.3）における0.6
％アガロースゲルに加えた。これらゲルを60−100Vにて
12時間処理し、次いで0.2μのニトロセルロースフイル
タ（シユライヒヤーおよびシユエル）に移した（これに
ついてはジー・エム・バール等によりProc.Natl.Acad.S
ci.USA、第76巻、第3683〜3687頁（1979）に実質的に記
載されている）。移動させた後、これらフイルタを４×SSC（SSCは150m
M NaCl、15mMクエン酸ナトリウムである）において
洗浄し、次いでこれらを減圧オーブン内で80℃にて２時
間処理した。次いで、フイルタを５×SSC,5×デンハル
ツ試薬中で65℃にてゆつくり振とうしながら１〜２時
間、および１×デンハルツ試薬、0.75M NaCl、5mM EDT
A、50mM燐酸ナトリウム緩衝液（pH7）、10％デキストラ
ン硫酸塩、0.1％SDS、50μg/mlポリＧおよび250μg/ml
超音波変性されたDNAにて65℃で２時間、順次に培養し
た。次いで、紙に結合したDNAを１×デンハルツ試
薬、0.75M NaCl、5mM EDTA、50mM燐酸ナトリウム緩衝液
（pH7）および１×10⁶cpm/mlの本発明のP³²−標識cDNA
試料において65℃で８〜12時間ヒブリド化させた。ヒブリド化の後、フイルタをそれぞれ５×SSC,1×デ
ンハルト試薬、0.1％SDS、0.1％ピロ燐酸ナトリウム
と、２×SSC、0.1％SDSと、0.5×SSCと、0.1×SSCとに
より２回洗浄した（65℃、30分間）。次いで、乾燥した
フイルタを予備フラツシユしたコダツクＸ−ARフイルタ
に強化スクリーン（Cawo社）を用いて−70℃にて48時間
露出させた。第８図はヒブリド化の結果を示している。第８図に見
られるように、それぞれ異なるひとDNA（DR7/7（レーン
１）、DR6/6（レーン２）、DR3/6（レーン３）およびDR
11/1（レーン４））は各制限エンドヌクレアーゼにつき
異なる電気泳動パターンを示す^＊。したがつて、本発明
の試料を用いる種々のHLA/DR判定された個体からのDNA
のサウザンプロツトは、異なるHLA−DR特異性を有する
個体から簡単かつ経済的に区別することができる^＊＊。
さらに、この判定方法および生産物で得られた簡単なプ
ロツトパターンは従来の判定方法では可能でなかつたよ
うな判定を可能にし、したがつて従来のHLA−DR群にお
ける各種のサブ群を同定しかつ区別することができ、し
かも種々の病気に対するこれらサブ群の感受性をより良
好に決定することができる。＊第８図のレーン５はねずみDNAである。＊＊上記の「判定」方法は10〜20mlの血液を用いて行
なうことができ、100回または1000回の試験まで容易に
規模拡大される。勿論、特定の制限DNAのヒブリド化部分の検出はP³²−
標識試料により行なう必要がないことを了解すべきであ
る。寧ろ、他のヒブリド化検出方法を同等に使用するこ
とができる。この種の方法は、試料を染色活性化剤、検
出酵素、アビジンまたは他の検出手段に結合させること
を含む。本発明のcDNA挿入物の合成試料を使用する改良HLA−DR
判定短かい（19塩基）のオリゴヌクレオチドDNA断片を用
いるサウザンプロツトの条件下におけるヒブリド化は、
完全に適合する配列（同一もしくは対立）を非適合配列
（異なる配列または対立）から区別しうることを示して
いる。たとえば、ビー・ジエー・コナー等、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、第80巻、第278〜282頁（1983）。本発明のHLA−DR−β−cDNAのヌクレオチド配列を分
析し、そしてこれら配列内に配列の相違（多形質的相違
を含む）を示す少なくとも３つの領域を確認した。これ
らの３つの領域は次の通りである：（１）アミノ酸８〜
14に対する暗号化配列；（２）アミノ酸26〜32に対する
暗号化配列；および（３）アミノ酸72〜78に対する暗号
化配列（第９図）。さらに、異なるDR−β鎖遺伝子なら
びにDCおよびSBβ−鎖遺伝子のうち同一である領域（ア
ミノ酸39〜45に対する暗号化配列）も確認した。不適合の３つの領域（第９図における黒丸）を画成す
る合成オリゴヌクレオチド（19−化合体）の試料を調製
した。第９図の指示した領域は、２種のHLA−DR−β cD
NAクローンの３つの領域のそれぞれにつき調製した特定
の19−化合体を示している。これら19−化合体のそれぞ
れは２個以上の不適合部分を有するので、各試料につき
HLA−DR配列の明確な区別を行なうことができる。さら
に、19−化合物を上記のように同族領域から調製して、
陽性ヒブリド化比較として使用することができる。同様にして、他のHLA−DR−β鎖遺伝子のうち不適合
および同一の領域から19−化合体DNA試料のコレクシヨ
ンを作成することができる。かくして、それぞれの試料
は所定のDR特異性に対し特定的である。したがつて、試
料コレクシヨンおよび比較のヒブリド化は、多数の個体
の迅速かつ正確なDR判定を可能にする。本発明のDNA配列の発現蛋白質の生産レベルは２つの主たる因子により支配さ
れる：すなわち細胞内のその遺伝子のコピー数およびこ
れら遺伝子コピーが転写しかつ翻訳する効率である。転
写および翻訳の効率（これらは一緒になつて発現を構成
する）は、通常、所望の暗号化配列の前方に位置するヌ
クレオチド配列に依存する。これらのヌクレオチド配列
または発現制御配列は、特にRNAポリメラーゼが反応し
て転写を開始する位置（プロモータ配列）およびリポソ
ームがmRNAと結合して相互反応し（転写生産物）翻訳を
開始する位置を規定する。この種の発現制御配列は、必
らずしも同等な効率で機能しない。したがつて、所望の
蛋白質に関する特異的暗号化配列を隣接するヌクレオチ
ド配列から分離し、そしてこれを他の発現制御配列に融
合させて高レベルの発現を得ることが有利である。これ
が達成されると、新たに作成されたDNA断片をマチルコ
ピーのプラスミドまたはバクテリオフアージ誘導体に挿
入して、細胞内における遺伝子コピー数を増大させ、か
くして発現蛋白質の収率をさらに向上させることができ
る。したがつて、広範囲の宿主−発現制御配列のベクター
組合せを使用して、本発明の方法により適当な暗号化配
列を挿入することによつてHLA−DR−β鎖と同様なポリ
ペプチドを生産することができる。たとえば、有用なベ
クターは染色体、非染色体および合成のDNA配列の断片
からなり、たとえばcol El,pCRl,pBR322およびその誘導
体を含めイー・コリからの各種公知の細菌プラスミド、
広範囲の宿主プラスミド、たとえばRP4、フアージDNA、
たとえば多くのフアージλの誘導体ならびに上記の組合
せから得られるベクター、たとえばpBR322、フアージλ
の一部および合成部分を含むベクターが包含される。有
用な宿主はたとえばイー・コリの菌株、たとえばイー・
コリK12 MC1061、イー・コリHB101、イー・コリ×177
6、イー・コリ×2282、イー・コリMRCIのような細菌性
宿主ならびにシユウドモナス、枯草菌、高熱細菌および
その他細菌類、酵母およびその他の真菌類の菌株、動物
もしくは植物宿主、たとえば動物（ひとを含む）もしく
は植物の培養細胞またはその他の宿主を包含することが
できる。有用な発現制御配列はイー・コリのラクトース
オペロンのオペレータ、プロモータならびにリポソーム
結合および相互作用配列（「lac系」）、イー・コリの
トリプトフアンシンセターゼ系の対応する配列（「trp
系」）、フアージλの主オペレータおよびプロモータ領
域（O_LP_LおよびO_RP^I _R）、フアージfdコート蛋白質の制
御領域、または原始核細胞もしくは成熟核細胞およびそ
のウイルスの遺伝子の発現を制御しかつ促進するその他
の配列、或いは各種のこれらの組合せを包含することが
できる。勿論、必らずしも全ての宿主−発現制御配列−ベクタ
ー組合せ物が、特定のHLA/DR暗号化配列につき同等の効
果を有するとは限らない。しかしながら、上記したよう
に、生物安全性の観点から特定の構造につき本発明のHL
A−DR−β暗号化配列に使用しうる部位、発現すべきHLA
−DR−β−鎖ポリペプチドの寸法、宿主細胞酵素による
蛋白質分解に対するポリペプチドの感受性、精製の際除
去するのが困難な宿主細胞蛋白質によるポリペプチドの
汚染、HLA−DR−β暗号化配列の発現特性、たとえばDNA
暗号化配列の構造および発現制御配列に関する開始およ
び停止コドンの位置、ならびに当業者に認識されたその
他の因子を考慮して、本発明のHLA/DR−β−鎖暗号化配
列をベクターにおける発現制御配列へ作用結合させる適
当な組合せを選択し、これを使用して宿主を形質転換さ
せ、その宿主を培養して挿入暗号化配列により暗号化さ
れるポリペプチドを生産することができる。 DNA配列および発現制御配列をベクター中に挿入する
ための種々の方法が当業界で知られている。たとえば、
これらは直接的結合、合成リンカ、エキソヌクレアーゼ
およびポリメラーゼ結合した修復反応に続く結合、或い
はDNAポリメラーゼによるDNA鎖の延長および適当な単一
鎖離型の作成に続く結合を包含する。さらに、当業者は
これらの方法の１種もしくはそれ以上を選択し、本発明
の範囲を逸脱することなく本発明のDNA配列を発現させ
ることができる。さらに、本発明の選択宿主−発現制御配列−ベクター
組合せにおいて発現された実際のHLA/DR−β−鎖暗号化
配列は、標準のHLA−DR−β−鎖抗原とは同一でない生
産物を生成しうることを了解すべきである。たとえば、
発現された暗号化配列は、HLA−DR−β−鎖とは無関係
なHLA−DR−β−鎖プラスメチオニンもしくはその他ア
ミノ酸を暗号化しうるであろう。或いは、発現されたDN
A配列は、HLA−DR−β−鎖の１部のみ、或いはメチオニ
ンもしくはその他のアミノ酸と共に暗号化しうるであろ
う。これらの作成および生産物も本発明に包含される。
たとえば、HLA−DR−β−鎖状のポリペプチドを暗号化
するヌクレオチド配列により形質転換された宿主は、そ
の化合物のみを生産しうるか、または他のアミノ酸と融
合させうるか、或いはその生産物を分泌することができ
る。発酵培養物から単離した後、または慣用の処理方
法、たとえば開裂、合成結合またはその他周知の方法に
よる処理の後、生産物がHLA−DR−β−鎖抗原の免疫学
的もしくは生物学的活性を示すことのみが必要とされ
る。精製後の上記HLA−DR−ポリペプチドまたはそれに対
して生成される抗体を使用して、慣用のHLA−DR判定法
もしくはキツトにおいて個体を判定するのに使用するこ
とができ、或いはその他の診断、予防もしくは治療剤も
しくは方法に使用することができる。本発明の方法により作成される微生物および組換DNA
分子は、メリーランド州・ロツクビル在のアメリカン・
タイプ・カルチヤー・コレクシヨンに1982年７月28日付
けで寄託され、かつ次のDR−β−A,DR−β−ＢおよびDR
−β−C: DR−β−A:E.coli HB101（pBR322（Pst）/HLA−DR−β
−Ａ） DR−β−B:E.coli HB101（pBR322（Pst）/HLA−DR−β
−Ｂ） DR−β−C:E.coli HB101（pBR322（Pst）HLA−DR−β−
Ｃ）として同定された培養物を例とする。これら培養物は、それぞれ寄託番号ATCC39164,39163
および39165を得ている。以上、本発明の多くの具体例につき説明したが、この
基本構成を改変して本発明の方法および組成物を使用す
る他の具体例を与えうることが明らかである。したがつ
て、本発明の範囲は上記実施例のみに限定されることな
く、種々の改変をなしうることが了解されよう。〔発明の効果〕ひとリンパ球抗原複合体のDR−β−鎖部位を暗号化す
るDNA配列、ならびにそれに関連する診断判定方法およ
び生産物につき開示する。β−鎖DR部位を暗号化するDN
A配列は、簡単かつ効率的な判定方法および生産物にお
いて有用であり、かつ診断、予防および治療剤に使用す
るHLA−DR−β−鎖の抗原の免疫学的もしくは生物学的
活性を示すポリペプチドを発現するのに有用である。

【図面の簡単な説明】第１図は染色体６および短腕上のHLA部位の位置を示す
略図であり、第２図は本発明のクローン化法における１具体例の略図
であり、第３図は本発明のクローン83−7,68−6,DR−β₁,DR−β
_２およびIa−βの部分制限地図であり、この地図に示さ
れた制限部位は正確でないが、慣用のヌクレオチド配列
はこれら部位の正確な位置の決定を可能にし、第４図はHLA−DR−β−A,HLA−DR−β−B,HLA−DR−β
−ＣおよびHLA−DR−β−ＤのcDNA配列の部分制限地図
であり、第５図は配列決定法ならびにcDNA配列HLA−DR−β−Ａ
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す説明図であ
り、第６図はcDNA配列HLA−DR−β−Ａから推測されるアミ
ノ酸配列と、DR2の同型接合系から単離されたIa抗原β
−鎖につきクラツチンにより決定されたアミノ酸配列
と、DR3,w6細胞系からラールハンマーにより単離された
cDNAクローンから推測されるアミノ酸配列との比較図で
あり、第７図はcDNA配列HLA−DR−β−Ｂのヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列を示す説明図であり、第８図は本発明の判定方法の１具体例を使用して判定さ
れた４種の個体（DR7/7,6/6,3/6および1/1）からのDNA
のサウザンプロツト図であり、第９図はcDNAクローンHLA−DR−β−ＡおよびHLA−DR−
β−Ｂの暗号化領域間におけるヌクレオチド配列不適合
の３つの領域を示し、第９図において黒丸はヌクレオチ
ド不適合を示し、かつ枠はこれら配列から調製された19
−化合体を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者クライア・テレス・ウエイクアメリカ合衆国マサチユ−セツツ02145 ソマ−ビル・キツダ−・ストリ−ト33番

Claims

(57)【特許請求の範囲】１．HLA−DR判定用プローブとして使用され得るDNAであ
って、前記DNAは、（ａ）TTGGAGCTGCTTAAGTCTGAG （ｂ）TTCCTGGAGAGACACTTCCAT （ｃ）CGCTTCGACAGCGACGTGGGG （ｄ）CGGGGCCAGGTGGACAATTAC （ｅ）TTGGAGCAGGTTAAACATGAG （ｆ）TTCCTGGACAGATACTTCTAT （ｇ）CGGGCCGCGGTGGACACCTAC （ｈ）（ａ）〜（ｇ）のDNAのいずれかの対立遺伝子で
あるDNA、（ｉ）（ａ）〜（ｈ）のDNAのいずれかに相補的配列を
有するDNA、並びに（ｊ）（ａ）〜（ｉ）のDNAのいずれかの断片よりなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるDN
A。