JPH07163348A - 蛋白質分解用固定化ゲルとそれを用いた蛋白質分解法 - Google Patents
蛋白質分解用固定化ゲルとそれを用いた蛋白質分解法Info
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- JPH07163348A JPH07163348A JP28687592A JP28687592A JPH07163348A JP H07163348 A JPH07163348 A JP H07163348A JP 28687592 A JP28687592 A JP 28687592A JP 28687592 A JP28687592 A JP 28687592A JP H07163348 A JPH07163348 A JP H07163348A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本願発明は、蛋白質を良く分解する細胞表層
画分結合型酵素を新たに見出したゲル包括剤にて固定化
することにより、酵素離脱率が少なく、活性収率が良
く、しかも適度な耐久性のある良好な機能の蛋白質分解
用固定化ゲルを得ることができるようにするとともに、
これを用いた簡易なゲル包括法の開発によって、簡単に
取り扱い易い小粒状に細分化できるようにし、更に、こ
の蛋白質分解用固定化ゲルを用いて蛋白質を分解する際
の活性率を高めるのにｐＨ調整をするようにしたもので
ある。 【構成】 寒天ゲルにアルギン酸ソーダを加えたものを
お湯で溶解したゲル包括剤に細胞壁画分結合型酵素（Ｃ
ＷＥ）を混合したうえ、粒状に細分化して、細胞壁画分
結合型酵素（ＣＷＥ）をゲル包括固定化したことを特徴
とする蛋白質分解用固定化ゲルと、この蛋白質分解用固
定化ゲルのｐＨを５〜８に調整しながら分解を行ったこ
とを特徴とする蛋白質分解法。
画分結合型酵素を新たに見出したゲル包括剤にて固定化
することにより、酵素離脱率が少なく、活性収率が良
く、しかも適度な耐久性のある良好な機能の蛋白質分解
用固定化ゲルを得ることができるようにするとともに、
これを用いた簡易なゲル包括法の開発によって、簡単に
取り扱い易い小粒状に細分化できるようにし、更に、こ
の蛋白質分解用固定化ゲルを用いて蛋白質を分解する際
の活性率を高めるのにｐＨ調整をするようにしたもので
ある。 【構成】 寒天ゲルにアルギン酸ソーダを加えたものを
お湯で溶解したゲル包括剤に細胞壁画分結合型酵素（Ｃ
ＷＥ）を混合したうえ、粒状に細分化して、細胞壁画分
結合型酵素（ＣＷＥ）をゲル包括固定化したことを特徴
とする蛋白質分解用固定化ゲルと、この蛋白質分解用固
定化ゲルのｐＨを５〜８に調整しながら分解を行ったこ
とを特徴とする蛋白質分解法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、近年注目されている微
生物を触媒にして、物質の分解、合成、化学変換を行う
反応装置の一種、バイオリアクターに関する。特に本発
明は、高分子の蛋白質を生体触媒により分解する蛋白質
分解用固定化ゲルとそれを用いた蛋白質分解法を提供す
るもので、調味料、食品物性改良剤、健康食品、機能性
食品など食品工業への応用に好適なものである。
生物を触媒にして、物質の分解、合成、化学変換を行う
反応装置の一種、バイオリアクターに関する。特に本発
明は、高分子の蛋白質を生体触媒により分解する蛋白質
分解用固定化ゲルとそれを用いた蛋白質分解法を提供す
るもので、調味料、食品物性改良剤、健康食品、機能性
食品など食品工業への応用に好適なものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、酵素の触媒活性を保持したまま水
に不溶性にした、いわゆる固定化酵素・バイオリアクタ
ーは、高価な酵素を繰り返し使用できる、反応装置が小
さい、連続反応が可能である、反応制御が可能である、
生産物と酵素の分離が容易である、コストダウンを図れ
る、などの利点から、その有効性が注目されている。バ
イオリアクターを利用した食品の製造も行われはじめて
いるが、一般には、糖やアミノ酸などの低分子の基質に
限られており、高分子である蛋白質や澱粉は生態触媒と
の接触が充分でなく、反応率が下がるなどの点で難しさ
がある。従来より、生体触媒である糸状菌のプロテアー
ゼを利用する固定化バイオリアクターとしては、プロ
テアーゼを抽出してイオン交換樹脂などの単体に結合さ
せる単体結合法、糸状菌の菌体をアルギン酸ゲルやラ
バフォームなどに成育させて、菌体外酵素を利用する方
法が試みられている。
に不溶性にした、いわゆる固定化酵素・バイオリアクタ
ーは、高価な酵素を繰り返し使用できる、反応装置が小
さい、連続反応が可能である、反応制御が可能である、
生産物と酵素の分離が容易である、コストダウンを図れ
る、などの利点から、その有効性が注目されている。バ
イオリアクターを利用した食品の製造も行われはじめて
いるが、一般には、糖やアミノ酸などの低分子の基質に
限られており、高分子である蛋白質や澱粉は生態触媒と
の接触が充分でなく、反応率が下がるなどの点で難しさ
がある。従来より、生体触媒である糸状菌のプロテアー
ゼを利用する固定化バイオリアクターとしては、プロ
テアーゼを抽出してイオン交換樹脂などの単体に結合さ
せる単体結合法、糸状菌の菌体をアルギン酸ゲルやラ
バフォームなどに成育させて、菌体外酵素を利用する方
法が試みられている。
【０００３】しかし、の方法は、プロテアーゼを抽
出、固定化するので、コスト高になるだけでなく、多く
の場合共有結合させるので、プロテアーゼの活性が下が
る等の欠点がある。の菌体固定化方法は、固定化生体
触媒を応用する方法として注目されているが、菌体外酵
素しか利用できず、ペプチターゼなど有効な生体触媒は
菌体内に含まれている場合が多いので、効率が悪いとい
う欠点がある。そこで微生物が持つ細胞質内酵素を利用
しようとすると、〓細胞を破壊するか、〓基質や反応生
成物が微生物の細胞表層を透過すること、〓生成物の分
解系副反応が欠損していること、が必要条件となる。〓
の場合には、細菌を破壊すると細胞質内酵素が不安定に
なることが多いし、〓〓の必要条件を満足する場合が稀
であるうえ、生きたままだと代謝機能を一定に制御する
ことが難しく、微生物の増殖による菌の汚れが起きる
等、目的とする生産物の均一かが困難となる等の欠点が
ある。このため、実用性のある固体化生体触媒系のバイ
オリアクターは、具現化されていないというのが現状で
ある。
出、固定化するので、コスト高になるだけでなく、多く
の場合共有結合させるので、プロテアーゼの活性が下が
る等の欠点がある。の菌体固定化方法は、固定化生体
触媒を応用する方法として注目されているが、菌体外酵
素しか利用できず、ペプチターゼなど有効な生体触媒は
菌体内に含まれている場合が多いので、効率が悪いとい
う欠点がある。そこで微生物が持つ細胞質内酵素を利用
しようとすると、〓細胞を破壊するか、〓基質や反応生
成物が微生物の細胞表層を透過すること、〓生成物の分
解系副反応が欠損していること、が必要条件となる。〓
の場合には、細菌を破壊すると細胞質内酵素が不安定に
なることが多いし、〓〓の必要条件を満足する場合が稀
であるうえ、生きたままだと代謝機能を一定に制御する
ことが難しく、微生物の増殖による菌の汚れが起きる
等、目的とする生産物の均一かが困難となる等の欠点が
ある。このため、実用性のある固体化生体触媒系のバイ
オリアクターは、具現化されていないというのが現状で
ある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかるに、発明者は、
細胞表層画分結合型酵素が、次のような特徴があり、従
来の固定化酵素や固定化増殖微生物と区別される中間的
固定化方法をもった新しい固定化生体触媒であること、
高分子蛋白質をよく分解し、かつ比較的高温においても
安定であるため、食品工業への利用に好適であると考
え、実用性のある固体化生体触媒系のバイオリアクター
の研究をおこなってきた。
細胞表層画分結合型酵素が、次のような特徴があり、従
来の固定化酵素や固定化増殖微生物と区別される中間的
固定化方法をもった新しい固定化生体触媒であること、
高分子蛋白質をよく分解し、かつ比較的高温においても
安定であるため、食品工業への利用に好適であると考
え、実用性のある固体化生体触媒系のバイオリアクター
の研究をおこなってきた。
【０００５】細胞表層画分には酸性プロティナーゼ、
酸性カルボキシペプチターゼ、グルタミナーゼなどの複
合酵素群が自然に結合している。 細胞表層画分に結合している酸性プロティナーゼ、酸
性カルボキシペプチターゼは低酸性領域で最適活性を示
し、かつ比較的高温においても安定であった。 細胞表層画分は、細胞膜に酵素が疎水的に結合し、細
胞壁に露出されている。 細胞表層画分を構成する細胞壁は、キチンとグルカン
を主体とする多糖体を主成分としており、それらの多糖
体は固定化酵素担体として用いられる。 細胞表層画分結合型酵素は、高分子蛋白質をよく分解
した。 細胞表層画分結合型酵素は、生理的な代謝機能を持た
ない一種のオルガネラである。
酸性カルボキシペプチターゼ、グルタミナーゼなどの複
合酵素群が自然に結合している。 細胞表層画分に結合している酸性プロティナーゼ、酸
性カルボキシペプチターゼは低酸性領域で最適活性を示
し、かつ比較的高温においても安定であった。 細胞表層画分は、細胞膜に酵素が疎水的に結合し、細
胞壁に露出されている。 細胞表層画分を構成する細胞壁は、キチンとグルカン
を主体とする多糖体を主成分としており、それらの多糖
体は固定化酵素担体として用いられる。 細胞表層画分結合型酵素は、高分子蛋白質をよく分解
した。 細胞表層画分結合型酵素は、生理的な代謝機能を持た
ない一種のオルガネラである。
【０００６】すなわち発明者は、酵素として細胞表層画
分結合型酵素を用い、これをゲル包括剤を用いて固定化
したうえ、取り扱い易くこれを細分化した蛋白質分解用
固定化ゲルとそれを用いた蛋白質分解法の研究をおこな
った結果、新しいゲル包括剤と、これを用いた簡易なゲ
ル包括法の開発によって、酵素離脱率が少なく、活性収
率が良く、しかも適度な耐久性のある良好な機能の蛋白
質分解用固定化ゲルを得ることができたし、この蛋白質
分解用固定化ゲルを用いて蛋白質を分解する際の活性率
を高めるのにｐＨ調整をすると効果的であることを見出
した。
分結合型酵素を用い、これをゲル包括剤を用いて固定化
したうえ、取り扱い易くこれを細分化した蛋白質分解用
固定化ゲルとそれを用いた蛋白質分解法の研究をおこな
った結果、新しいゲル包括剤と、これを用いた簡易なゲ
ル包括法の開発によって、酵素離脱率が少なく、活性収
率が良く、しかも適度な耐久性のある良好な機能の蛋白
質分解用固定化ゲルを得ることができたし、この蛋白質
分解用固定化ゲルを用いて蛋白質を分解する際の活性率
を高めるのにｐＨ調整をすると効果的であることを見出
した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記の技術的
課題を解決するため、次のような手段をとったものであ
る。
課題を解決するため、次のような手段をとったものであ
る。
【０００８】特許を受けようとする第１発明は、寒天ゲ
ルにアルギン酸ソーダを加えたものをお湯で溶解したゲ
ル包括剤に細胞壁画分結合型酵素（ＣＷＥ）を混合した
うえ、粒状に細分化して、細胞壁画分結合型酵素（ＣＷ
Ｅ）をゲル包括固定化したことを特徴とする蛋白質分解
用固定化ゲルである。
ルにアルギン酸ソーダを加えたものをお湯で溶解したゲ
ル包括剤に細胞壁画分結合型酵素（ＣＷＥ）を混合した
うえ、粒状に細分化して、細胞壁画分結合型酵素（ＣＷ
Ｅ）をゲル包括固定化したことを特徴とする蛋白質分解
用固定化ゲルである。
【０００９】本発明は、ゲル包括剤として寒天ゲルにア
ルギン酸ソーダを用いた点に第１の特徴がある。ゲル包
括剤としては、寒天、アルギン酸カルシウム、κ−カラ
ギーナン、光架橋性樹脂ポリマー、ポリアクリルアミ
ド、ウレタンプレポリマー、セルロース等がある。これ
らのうち種類を選定し、濃度を調製することにより、目
的に適した網目や強さをもって酵素を包括固定化でき
る。
ルギン酸ソーダを用いた点に第１の特徴がある。ゲル包
括剤としては、寒天、アルギン酸カルシウム、κ−カラ
ギーナン、光架橋性樹脂ポリマー、ポリアクリルアミ
ド、ウレタンプレポリマー、セルロース等がある。これ
らのうち種類を選定し、濃度を調製することにより、目
的に適した網目や強さをもって酵素を包括固定化でき
る。
【００１０】本発明のゲル包括剤を用いた固定化とは、
寒天とアルギン酸ソーダの混合物を用いて、細片化した
細胞表層画分を固定化するものである。酵素群は、もと
もと細胞膜に酵素が疎水的に結合し、細胞壁に橋を作っ
ているので、細胞膜と細胞壁にかなり強く結合した状態
になっている。このため、その細胞表層画分をゲル包括
剤によって更に固定化すると、麹菌細胞（菌体の直径役
５μｍ）のように小さいものでも寒天網目から漏れない
ことにより、酵素の活性収率を増加させることができる
とともに、数十万〜数百万の高分子である蛋白質と酵素
の接触可能性が大きくなり、酵素活性発現率を高めるこ
とができる。その様式は図５に示すとおりである。
寒天とアルギン酸ソーダの混合物を用いて、細片化した
細胞表層画分を固定化するものである。酵素群は、もと
もと細胞膜に酵素が疎水的に結合し、細胞壁に橋を作っ
ているので、細胞膜と細胞壁にかなり強く結合した状態
になっている。このため、その細胞表層画分をゲル包括
剤によって更に固定化すると、麹菌細胞（菌体の直径役
５μｍ）のように小さいものでも寒天網目から漏れない
ことにより、酵素の活性収率を増加させることができる
とともに、数十万〜数百万の高分子である蛋白質と酵素
の接触可能性が大きくなり、酵素活性発現率を高めるこ
とができる。その様式は図５に示すとおりである。
【００１１】従来より、寒天やアルギン酸カルシウムは
ゲル包括剤として単独で使用されることはあるが、寒天
は、高分子の蛋白質を通し易く、細胞壁画分結合型酵素
（ＣＷＥ）をよく保持するが、材質的にもろく、撹拌な
どが伴うことのおおい実用的なゲル包括剤としては、不
向きであった。また、これを細片化するには刃物で切断
しなければならず、手間がかかり過ぎて自動化するのが
容易でない。従来、寒天を油中に滴下しビーズ状にする
技術はあるが、後で油を石鹸やアセトンなどの溶剤で洗
浄せねばならず、しかもこの溶剤の食品への影響が心配
されるので、食品の蛋白質分解用ゲル包括剤として適当
ではない。
ゲル包括剤として単独で使用されることはあるが、寒天
は、高分子の蛋白質を通し易く、細胞壁画分結合型酵素
（ＣＷＥ）をよく保持するが、材質的にもろく、撹拌な
どが伴うことのおおい実用的なゲル包括剤としては、不
向きであった。また、これを細片化するには刃物で切断
しなければならず、手間がかかり過ぎて自動化するのが
容易でない。従来、寒天を油中に滴下しビーズ状にする
技術はあるが、後で油を石鹸やアセトンなどの溶剤で洗
浄せねばならず、しかもこの溶剤の食品への影響が心配
されるので、食品の蛋白質分解用ゲル包括剤として適当
ではない。
【００１２】他方、アルギン酸はＮａ塩には可溶である
が、Ｃａ塩には不溶であるため、微生物の包括には多く
用いられている。しかし、アルギン酸は高分子の蛋白質
分子が入りにくく、入らなければ蛋白質の分解はできな
いので、蛋白質分解用ゲル包括剤としては不向きであっ
た。しかも、アルギン酸ソーダだけだと、ゲルが軟らか
過ぎるため撹拌などが伴うことのおおい実用的なゲル包
括剤としては使用できないものであった。ただ、アルギ
ン酸ナトリウム塩はＮａがＣａと置換して不溶性となる
性質があるので、これを利用するとアルギン酸ソーダを
Ｃａ塩やＣａＣｌ2 に適下するだけで簡単にビーズ状に
小粒化することができる利点がある。そこで、発明者
は、寒天ゲルにアルギン酸ソーダを量的な比率を変化さ
せて加えたものをゲル包括剤として採用してみたとこ
ろ、寒天の高分子の蛋白質を通し易く、細胞壁画分結合
型酵素（ＣＷＥ）をよく保持する性質と、アルギン酸の
有する弾力性とアルギン酸ナトリウム塩がＣａ塩やＣａ
Ｃｌ2 に不溶性となる性質とが加わって、両方の性質を
適度に保有したゲル包括剤ができることを見出した。こ
の新たに見出したゲル包括剤は、高分子の蛋白質を通
し、且つ細胞壁画分結合型酵素（ＣＷＥ）をよく保持
し、しかも適度の固さと弾力性があって多少の衝撃があ
っても壊れにくく、撹拌などにも充分耐えることができ
るものとなっているので、実用性に富んだものとなって
いる。
が、Ｃａ塩には不溶であるため、微生物の包括には多く
用いられている。しかし、アルギン酸は高分子の蛋白質
分子が入りにくく、入らなければ蛋白質の分解はできな
いので、蛋白質分解用ゲル包括剤としては不向きであっ
た。しかも、アルギン酸ソーダだけだと、ゲルが軟らか
過ぎるため撹拌などが伴うことのおおい実用的なゲル包
括剤としては使用できないものであった。ただ、アルギ
ン酸ナトリウム塩はＮａがＣａと置換して不溶性となる
性質があるので、これを利用するとアルギン酸ソーダを
Ｃａ塩やＣａＣｌ2 に適下するだけで簡単にビーズ状に
小粒化することができる利点がある。そこで、発明者
は、寒天ゲルにアルギン酸ソーダを量的な比率を変化さ
せて加えたものをゲル包括剤として採用してみたとこ
ろ、寒天の高分子の蛋白質を通し易く、細胞壁画分結合
型酵素（ＣＷＥ）をよく保持する性質と、アルギン酸の
有する弾力性とアルギン酸ナトリウム塩がＣａ塩やＣａ
Ｃｌ2 に不溶性となる性質とが加わって、両方の性質を
適度に保有したゲル包括剤ができることを見出した。こ
の新たに見出したゲル包括剤は、高分子の蛋白質を通
し、且つ細胞壁画分結合型酵素（ＣＷＥ）をよく保持
し、しかも適度の固さと弾力性があって多少の衝撃があ
っても壊れにくく、撹拌などにも充分耐えることができ
るものとなっているので、実用性に富んだものとなって
いる。
【００１３】本発明にかかる蛋白質分解用固定化ゲル
は、上記の新たに開発したゲル包括剤に、細胞壁画分結
合型酵素（ＣＷＥ）を混合したうえ、粒状に細分化し
て、細胞壁画分結合型酵素（ＣＷＥ）をゲル包括固定化
してなる蛋白質分解用固定化ゲルである。この蛋白質分
解用固定化ゲルは、細胞壁画分結合型酵素（ＣＷＥ）の
ゲル内拡散度および包括状態が良好で、細胞壁画分結合
型酵素（ＣＷＥ）のゲル脱離率が１％以下と極めて少な
いし、適度の弾力性と固さを有するため、包括には適し
たものになっている（図３）。尚、蛋白質分解用固定化
ゲルは、細胞壁画分結合型酵素（ＣＷＥ）のゲル内拡散
度および包括状態の結果より寒天３：アルギン酸１の割
合が最適であった。
は、上記の新たに開発したゲル包括剤に、細胞壁画分結
合型酵素（ＣＷＥ）を混合したうえ、粒状に細分化し
て、細胞壁画分結合型酵素（ＣＷＥ）をゲル包括固定化
してなる蛋白質分解用固定化ゲルである。この蛋白質分
解用固定化ゲルは、細胞壁画分結合型酵素（ＣＷＥ）の
ゲル内拡散度および包括状態が良好で、細胞壁画分結合
型酵素（ＣＷＥ）のゲル脱離率が１％以下と極めて少な
いし、適度の弾力性と固さを有するため、包括には適し
たものになっている（図３）。尚、蛋白質分解用固定化
ゲルは、細胞壁画分結合型酵素（ＣＷＥ）のゲル内拡散
度および包括状態の結果より寒天３：アルギン酸１の割
合が最適であった。
【００１４】特許を受けようとする第２発明は、寒天ゲ
ルにアルギン酸ソーダを加えたものをお湯で溶解したゲ
ル包括剤に細胞壁画分結合型酵素（ＣＷＥ）を混合した
うえ、これを冷カルシュム塩中に滴下し、粒状に細胞壁
画分結合型酵素（ＣＷＥ）をゲル包括固定化したことを
特徴とする蛋白質分解用固定化ゲルである。
ルにアルギン酸ソーダを加えたものをお湯で溶解したゲ
ル包括剤に細胞壁画分結合型酵素（ＣＷＥ）を混合した
うえ、これを冷カルシュム塩中に滴下し、粒状に細胞壁
画分結合型酵素（ＣＷＥ）をゲル包括固定化したことを
特徴とする蛋白質分解用固定化ゲルである。
【００１５】本発明は、上記第１発明の蛋白質分解用固
定化ゲルを粒状に細分化するために、アルギン酸ナトリ
ウム塩のＮａがＣａと置換して不溶性となる性質に着目
し、蛋白質分解用固定化ゲルにアルギン酸ソーダを加え
ることにより、固定化する性質を保有させ、溶解したも
のをポンプで押し出しチューブの先端から１滴づづＣａ
塩やＣａＣｌ2 の溶液中に適下すると、落下したゲル化
素材は、Ｃａ塩やＣａＣｌ2 の溶液中で不溶化し、簡単
にビーズ状に小粒化することができる（図１）。このよ
うな固定化ゲルビーズの製造法は、連続的な大量生産が
可能で工業化に適したものとなる。
定化ゲルを粒状に細分化するために、アルギン酸ナトリ
ウム塩のＮａがＣａと置換して不溶性となる性質に着目
し、蛋白質分解用固定化ゲルにアルギン酸ソーダを加え
ることにより、固定化する性質を保有させ、溶解したも
のをポンプで押し出しチューブの先端から１滴づづＣａ
塩やＣａＣｌ2 の溶液中に適下すると、落下したゲル化
素材は、Ｃａ塩やＣａＣｌ2 の溶液中で不溶化し、簡単
にビーズ状に小粒化することができる（図１）。このよ
うな固定化ゲルビーズの製造法は、連続的な大量生産が
可能で工業化に適したものとなる。
【００１６】特許を受けようとする第３発明は、第１発
明または第２発明の蛋白質分解用固定化ゲルを用意し、
この蛋白質分解用固定化ゲルのｐＨを５〜８に調整しな
がら分解を行ったことを特徴とする蛋白質分解法であ
る。この発明は、第１発明または第２発明の蛋白質分解
用固定化ゲルの固定化酵素の安定性を改善するととも
に、良好な活性のために、ｐＨ調整をした点に特徴があ
る。従来は、食品の腐敗防止の観点から酸性の蛋白質分
解酵素による分解を中心に考えていたため、ｐＨ３〜４
の酸性領域での分解が望ましいと考えられていたが、細
胞壁画分結合型酵素には、酸性だけでなく、中性、アル
カリ性プロテアーゼも相当量含まれているため、トータ
ルな分解力としてはｐＨ５〜８の中・アルカリ領域のほ
うがより高い活性を示した（図３）。
明または第２発明の蛋白質分解用固定化ゲルを用意し、
この蛋白質分解用固定化ゲルのｐＨを５〜８に調整しな
がら分解を行ったことを特徴とする蛋白質分解法であ
る。この発明は、第１発明または第２発明の蛋白質分解
用固定化ゲルの固定化酵素の安定性を改善するととも
に、良好な活性のために、ｐＨ調整をした点に特徴があ
る。従来は、食品の腐敗防止の観点から酸性の蛋白質分
解酵素による分解を中心に考えていたため、ｐＨ３〜４
の酸性領域での分解が望ましいと考えられていたが、細
胞壁画分結合型酵素には、酸性だけでなく、中性、アル
カリ性プロテアーゼも相当量含まれているため、トータ
ルな分解力としてはｐＨ５〜８の中・アルカリ領域のほ
うがより高い活性を示した（図３）。
【００１７】
「実施例１」 細胞壁結合型酵素の調製。 麹菌（Aspergillus oryzae）を下記の液体培地を用い
て、ｐＨ５．６、２６℃で７２時間振盪培養を行ったと
ころ、１０００mlの培地から菌体が乾燥重量にして約７
ｇ得られた。また１ｇの菌体から細胞壁結合型酵素が約
０．５ｇ得られた。
て、ｐＨ５．６、２６℃で７２時間振盪培養を行ったと
ころ、１０００mlの培地から菌体が乾燥重量にして約７
ｇ得られた。また１ｇの菌体から細胞壁結合型酵素が約
０．５ｇ得られた。
【００１８】 ＜培地組成＞ Ｇｌｕｃｏｓｅ ５. ０ｇ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ ０. ５ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 ０. ０５ｇ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０. ０５ｇ ＭｇＳＯ4 ０. ０４ｇ ＣａＣｌ2 ０．０４ｇ ／ １００ｍｌ 蒸留水
【００１９】「実施例２」 細胞壁結合型酵素の調製 凍結乾燥した菌体を緩衝液に分散後、French-Press（大
岳製作所）を用いて、５００ (Kg/cm2) の圧力をかけて
磨砕した。これを遠心分離後、沈殿物を凍結乾燥して細
胞壁結合酵素を得た。１ｇの菌体から細胞壁結合型酵素
が約０．５ｇ得られた。
岳製作所）を用いて、５００ (Kg/cm2) の圧力をかけて
磨砕した。これを遠心分離後、沈殿物を凍結乾燥して細
胞壁結合酵素を得た。１ｇの菌体から細胞壁結合型酵素
が約０．５ｇ得られた。
【００２０】「実施例３」 細胞壁結合型酵素系の至適
ｐＨの検討 ０．５ｇの酸沈殿大豆蛋白質およびＮａＮ3 0.025 ｇ
を、クエン酸−バルビタ−ル系の広域緩衝液であるBrit
ton-Robinson buffer 50mlに溶解させ、ｐＨを３〜１０
に調整後１００mlにfill up 、０．５％酸沈殿大豆蛋白
質溶液とした。これを３５℃に保温した後、細胞壁合型
酵素０．５ｇと１２０rpm でインキュベ−ト、反応せし
めた。反応液を経時的にサンプリングし、ＯＰＡ（ο−
phthalaldehyde）法によりタンパク質の分解率を、全ペ
プチド結合数に対する分解されたペプチド結合の割合と
して測定した。以上の結果は図３に示したように、ｐＨ
５．５〜７．０が最も分解率がよく、ｐＨ５．０〜８．
０では酸性、およびアルカリ性領域の分解率より高かっ
た。
ｐＨの検討 ０．５ｇの酸沈殿大豆蛋白質およびＮａＮ3 0.025 ｇ
を、クエン酸−バルビタ−ル系の広域緩衝液であるBrit
ton-Robinson buffer 50mlに溶解させ、ｐＨを３〜１０
に調整後１００mlにfill up 、０．５％酸沈殿大豆蛋白
質溶液とした。これを３５℃に保温した後、細胞壁合型
酵素０．５ｇと１２０rpm でインキュベ−ト、反応せし
めた。反応液を経時的にサンプリングし、ＯＰＡ（ο−
phthalaldehyde）法によりタンパク質の分解率を、全ペ
プチド結合数に対する分解されたペプチド結合の割合と
して測定した。以上の結果は図３に示したように、ｐＨ
５．５〜７．０が最も分解率がよく、ｐＨ５．０〜８．
０では酸性、およびアルカリ性領域の分解率より高かっ
た。
【００２１】「実施例４」 細胞壁結合型酵素のゲル包
括固定化 寒天とアルギン酸ナトリウムを、試料Ａ（４：０）、試
料Ｂ（３：１）、試料Ｃ（２：２）、試料Ｄ（１：
３）、試料Ｅ（０：４）の各割合で２％濃度になるよう
に混ぜ、以下のように細胞壁結合型酵素の包括剤として
用いた。
括固定化 寒天とアルギン酸ナトリウムを、試料Ａ（４：０）、試
料Ｂ（３：１）、試料Ｃ（２：２）、試料Ｄ（１：
３）、試料Ｅ（０：４）の各割合で２％濃度になるよう
に混ぜ、以下のように細胞壁結合型酵素の包括剤として
用いた。
【００２２】 ・寒天のみ ・３：１〜０：４配合の 寒天０．２５ｇ 寒天＋アルギン酸０．２５ｇ ↓ ↓ 水１２．５mlに１００℃で溶解 水１２．５mlに１００℃で溶解 ↓ ↓ ４５℃に冷却 ４５℃に冷却 ↓ ↓ 細胞壁結合型酵素 細胞壁結合型酵素 ０．７５ｇと混合 ０．７５ｇと混合 ↓ ↓ ２〜３mm角に切断 冷CaCl2 中に滴下、ビ−ズ化
【００２３】「実施例５」 各組成固定化ゲルによる酸
沈殿大豆蛋白質の分解率 ０．５％酸沈殿大豆蛋白質-Britton Robinson buffer溶
液（ｐＨ７．０）５０mlに、細胞壁結合型酵素０．７５
ｇを含む固定化酵素１２．５mlを加え、３５℃、１２０
rpm で４８時間インキュベ−ト後、ＯＰＡ法で分解率を
測定した。また、同様の酸沈殿大豆蛋白質溶液に細胞壁
結合型酵素０．７５ｇを加え、同じ条件で反応させ比較
した。
沈殿大豆蛋白質の分解率 ０．５％酸沈殿大豆蛋白質-Britton Robinson buffer溶
液（ｐＨ７．０）５０mlに、細胞壁結合型酵素０．７５
ｇを含む固定化酵素１２．５mlを加え、３５℃、１２０
rpm で４８時間インキュベ−ト後、ＯＰＡ法で分解率を
測定した。また、同様の酸沈殿大豆蛋白質溶液に細胞壁
結合型酵素０．７５ｇを加え、同じ条件で反応させ比較
した。
【００２４】細胞壁結合型酵素のゲル脱離率は次のよう
にして測定した。固定化した細胞壁結合酵素を蒸留水50
ml中で48時間振盪、上済みを１００００rpm で遠心分離
した後、沈殿をポリリン酸ナトリウム水溶液中に分散さ
せ、アルギン酸分を溶かした。その後100 ℃に加熱、寒
天分を溶解せしめ、再び10000rpmで遠心分離後、沈殿を
洗浄、凍結乾燥し『脱離細胞壁結合型酵素』として回収
した。以上の結果を図４に示した。寒天のみでは分解率
が８７％と高いが、細胞壁結合型酵素の脱離率が１１．
３％と高い。これに比べて、アルギン酸を寒天に加えた
ものは、分解率が８０〜８１％であるが、細胞壁結合型
酵素の脱離率はきわめて低く０．７〜０．１％である。
結局、分解率から脱離率を差し引くと、寒天にアルギン
酸を加えた場合のほうが分解率が高かった。
にして測定した。固定化した細胞壁結合酵素を蒸留水50
ml中で48時間振盪、上済みを１００００rpm で遠心分離
した後、沈殿をポリリン酸ナトリウム水溶液中に分散さ
せ、アルギン酸分を溶かした。その後100 ℃に加熱、寒
天分を溶解せしめ、再び10000rpmで遠心分離後、沈殿を
洗浄、凍結乾燥し『脱離細胞壁結合型酵素』として回収
した。以上の結果を図４に示した。寒天のみでは分解率
が８７％と高いが、細胞壁結合型酵素の脱離率が１１．
３％と高い。これに比べて、アルギン酸を寒天に加えた
ものは、分解率が８０〜８１％であるが、細胞壁結合型
酵素の脱離率はきわめて低く０．７〜０．１％である。
結局、分解率から脱離率を差し引くと、寒天にアルギン
酸を加えた場合のほうが分解率が高かった。
【００２５】「実施例６」 包括固定化ゲルによるカラ
ムリアクタ−分解 ＜固定化酵素＞ ・ゲル 寒天- アルギン酸（３：１）２％ゲ
ル，１００ml ・酵素 細胞壁結合型酵素 ６．０ｇ ＜基質＞ ・１．０％酸沈殿大豆蛋白質（Britton Robinson buffe
r ） 溶液（ｐＨ7.0 ）２００ml ＜リアクタ−条件＞ ・カラム ジャケット付ガラスカラム（φ２０
mm×１８０mm） ・流速 ５（ml／min ） ・反応温度 ３５℃ 以上の結果を図５、図６に示した。リアクタ−運転開始
後、分解率は上昇し続け３６時間後、一定の値（４３．
０％）に達した。
ムリアクタ−分解 ＜固定化酵素＞ ・ゲル 寒天- アルギン酸（３：１）２％ゲ
ル，１００ml ・酵素 細胞壁結合型酵素 ６．０ｇ ＜基質＞ ・１．０％酸沈殿大豆蛋白質（Britton Robinson buffe
r ） 溶液（ｐＨ7.0 ）２００ml ＜リアクタ−条件＞ ・カラム ジャケット付ガラスカラム（φ２０
mm×１８０mm） ・流速 ５（ml／min ） ・反応温度 ３５℃ 以上の結果を図５、図６に示した。リアクタ−運転開始
後、分解率は上昇し続け３６時間後、一定の値（４３．
０％）に達した。
【００２６】
【発明の効果】本願発明は、蛋白質を良く分解する細胞
表層画分結合型酵素を新たに見出したゲル包括剤にて固
定化することにより、酵素離脱率が少なく、活性収率が
良く、しかも適度な耐久性のある良好な機能の蛋白質分
解用固定化ゲルを得ることができるようにするととも
に、これを用いた簡易なゲル包括法の開発によって、簡
単に取り扱い易い小粒状に細分化できるようにし、更
に、この蛋白質分解用固定化ゲルを用いて蛋白質を分解
する際の活性率を高めるのにｐＨ調整をするようにした
ものである。
表層画分結合型酵素を新たに見出したゲル包括剤にて固
定化することにより、酵素離脱率が少なく、活性収率が
良く、しかも適度な耐久性のある良好な機能の蛋白質分
解用固定化ゲルを得ることができるようにするととも
に、これを用いた簡易なゲル包括法の開発によって、簡
単に取り扱い易い小粒状に細分化できるようにし、更
に、この蛋白質分解用固定化ゲルを用いて蛋白質を分解
する際の活性率を高めるのにｐＨ調整をするようにした
ものである。
【００２７】本願第１発明は、寒天ゲルにアルギン酸ソ
ーダを加えたものをお湯で溶解したゲル包括剤に細胞壁
画分結合型酵素（ＣＷＥ）を混合したうえ、粒状に細分
化して、細胞壁画分結合型酵素（ＣＷＥ）をゲル包括固
定化したことにより、酵素離脱率が少なく、活性収率が
良く、しかも適度な耐久性のある実用性の高い良好な機
能の蛋白質分解用固定化ゲルを得ることができるように
したものである。本願第２発明は、寒天ゲルにアルギン
酸ソーダを加えたものをお湯で溶解したゲル包括剤に細
胞壁画分結合型酵素（ＣＷＥ）を混合したうえ、これを
冷カルシュム塩中に滴下し、粒状に細胞壁画分結合型酵
素（ＣＷＥ）をゲル包括固定化したもので、溶解しゲル
素材を１滴づづＣａ塩やＣａＣｌ2 の溶液中に適下する
ことにより、簡単にビーズ状に小粒化することができる
ようにしたものである（図１）。このような固定化ゲル
ビーズの製造法は、連続的な大量生産が可能で工業化に
適したものとなる。
ーダを加えたものをお湯で溶解したゲル包括剤に細胞壁
画分結合型酵素（ＣＷＥ）を混合したうえ、粒状に細分
化して、細胞壁画分結合型酵素（ＣＷＥ）をゲル包括固
定化したことにより、酵素離脱率が少なく、活性収率が
良く、しかも適度な耐久性のある実用性の高い良好な機
能の蛋白質分解用固定化ゲルを得ることができるように
したものである。本願第２発明は、寒天ゲルにアルギン
酸ソーダを加えたものをお湯で溶解したゲル包括剤に細
胞壁画分結合型酵素（ＣＷＥ）を混合したうえ、これを
冷カルシュム塩中に滴下し、粒状に細胞壁画分結合型酵
素（ＣＷＥ）をゲル包括固定化したもので、溶解しゲル
素材を１滴づづＣａ塩やＣａＣｌ2 の溶液中に適下する
ことにより、簡単にビーズ状に小粒化することができる
ようにしたものである（図１）。このような固定化ゲル
ビーズの製造法は、連続的な大量生産が可能で工業化に
適したものとなる。
【００２８】本願第３発明は、第１発明または第２発明
の蛋白質分解用固定化ゲルを用意し、この蛋白質分解用
固定化ゲルのｐＨを５〜８に調整しながら分解を行った
ことを特徴とする蛋白質分解法で、このｐＨ調整をする
ことによって、第１発明または第２発明の蛋白質分解用
固定化ゲルの固定化酵素の安定性を改善するとともに、
従来より良好な酵素の活性化を図ることができたもので
ある。
の蛋白質分解用固定化ゲルを用意し、この蛋白質分解用
固定化ゲルのｐＨを５〜８に調整しながら分解を行った
ことを特徴とする蛋白質分解法で、このｐＨ調整をする
ことによって、第１発明または第２発明の蛋白質分解用
固定化ゲルの固定化酵素の安定性を改善するとともに、
従来より良好な酵素の活性化を図ることができたもので
ある。
【図１】本発明に係る固定かゲルビーズの製造法を示す
説明図である。
説明図である。
【図２】固定化細胞壁画分結合型酵素と蛋白質のゲル格
子中の存在様式を示す説明図である。
子中の存在様式を示す説明図である。
【図３】実施例における細胞壁画分結合型酵素のｐＨに
よる活性変化を示すグラフ。
よる活性変化を示すグラフ。
【図４】実施例における寒天−アルギン酸含量比の異な
る同定化ゲルの酵素比活性を示すグラフ。
る同定化ゲルの酵素比活性を示すグラフ。
【図５】実施例におけるバイオリアクターシステムを示
す説明図
す説明図
【図６】実施例におけるタンパク分解率（ＯＤＡ法）を
示すグラフ。
示すグラフ。
Claims (3)
- 【請求項１】 寒天ゲルにアルギン酸ソーダを加えたも
のをお湯で溶解したゲル包括剤に細胞壁画分結合型酵素
（ＣＷＥ）を混合したうえ、粒状に細分化して、細胞壁
画分結合型酵素（ＣＷＥ）をゲル包括固定化したことを
特徴とする蛋白質分解用固定化ゲル。 - 【請求項２】 寒天ゲルにアルギン酸ソーダを加えたも
のをお湯で溶解したゲル包括剤に細胞壁画分結合型酵素
（ＣＷＥ）を混合したうえ、これを冷カルシュム塩中に
滴下し、粒状に細胞壁画分結合型酵素（ＣＷＥ）をゲル
包括固定化したことを特徴とする蛋白質分解用固定化ゲ
ル。 - 【請求項３】 請求項１または請求項２の蛋白質分解用
固定化ゲルを用意し、この蛋白質分解用固定化ゲルのｐ
Ｈを５〜８に調整しながら分解を行ったことを特徴とす
る蛋白質分解法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28687592A JPH07163348A (ja) | 1992-09-30 | 1992-09-30 | 蛋白質分解用固定化ゲルとそれを用いた蛋白質分解法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28687592A JPH07163348A (ja) | 1992-09-30 | 1992-09-30 | 蛋白質分解用固定化ゲルとそれを用いた蛋白質分解法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07163348A true JPH07163348A (ja) | 1995-06-27 |
Family
ID=17710136
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28687592A Pending JPH07163348A (ja) | 1992-09-30 | 1992-09-30 | 蛋白質分解用固定化ゲルとそれを用いた蛋白質分解法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07163348A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998021985A1 (es) * | 1996-11-22 | 1998-05-28 | Lipotec, S.A. | Un producto para incorporar ingredientes dieteticos y alimentarios en bebidas, alimentos y productos dieteticos |
| WO2006009764A1 (en) | 2004-06-17 | 2006-01-26 | Amano Enzyme Usa., Ltd. | Controlled release formulations of enzymes, microorganisms, and antibodies with mucoadhesive polymers |
-
1992
- 1992-09-30 JP JP28687592A patent/JPH07163348A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998021985A1 (es) * | 1996-11-22 | 1998-05-28 | Lipotec, S.A. | Un producto para incorporar ingredientes dieteticos y alimentarios en bebidas, alimentos y productos dieteticos |
| WO2006009764A1 (en) | 2004-06-17 | 2006-01-26 | Amano Enzyme Usa., Ltd. | Controlled release formulations of enzymes, microorganisms, and antibodies with mucoadhesive polymers |
| EP2422804A1 (en) * | 2004-06-17 | 2012-02-29 | Amano Enzyme USA., Ltd. | Controlled release formulations of enzymes, microorganisms, and antibodies with mucoadhesive polymers |
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