JPH07120391A - 分光蛍光光度計および定量測定の方法 - Google Patents

分光蛍光光度計および定量測定の方法

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JPH07120391A
JPH07120391A JP27027093A JP27027093A JPH07120391A JP H07120391 A JPH07120391 A JP H07120391A JP 27027093 A JP27027093 A JP 27027093A JP 27027093 A JP27027093 A JP 27027093A JP H07120391 A JPH07120391 A JP H07120391A
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fluorescence
wavelength
component
excitation
sample
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JP27027093A
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Muneo Maejima
宗郎 前嶋
Minoru Owada
実 大和田
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Hitachi Ltd
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Hitachi Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【目的】複数成分からなる混合物サンプルを各成分に分
離することなしに同時定量をするための、測定条件を自
動設定し、測定を実行すること。 【構成】各成分の蛍光ピーク波長位置を順次自動検出
し、(1)その各ピーク波長位置と(2)それらを結ぶ
線分を3等分する波長位置、および(3)第1の成分と
最終成分のピークから励起短波長側,蛍光長波長側に向
かう交わらない半直線の組を選択し、ピーク蛍光強度の
1/2,1/4となる波長位置に測定条件を設定した
後、標準試料,混合物サンプルの測定を実行して成分量
推定のためのデータ処理に供す。 【効果】効果的な測定条件による同時測定が可能とな
り、前処理や予備実験が不要となった。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、医学,薬学,化学、ま
たは生産物の品質管理等の目的で実施される分光蛍光光
度計による複数成分の同時定量測定に関する。
【0002】
【従来の技術】分光蛍光光度計による定量測定の従来例
は、2波長または3波長の定量測定は、励起あるいは蛍
光側の波長値を固定し、他方の波長値を複数設定,測定
することによって定量測定を実行している。複数の波長
値による定量測定の目的は、バックグラウンドの蛍光成
分を除去することである。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】従来の技術で分光蛍光
光度計を用いて、各成分の励起スペクトル及び蛍光スペ
クトルが重なりをもった複数成分の同時定量を実施する
場合、なんらかの前処理を施し、複数成分を単一成分に
分離した後、定量測定を実行することになる。この方法
では、前処理を実施する設備が必要となり、また分離の
ために多大な時間を必要とすることになる。この場合、
規定濃度値における各成分のスペクトルが既知である場
合は、重回帰分析法などによって各成分の成分量を推定
することが可能である。しかしこの手法は、測定しよう
とする各成分の励起スペクトルあるいは蛍光スペクトル
が同一の蛍光波長、あるいは励起波長値にて観測可能で
ない場合は応用できない。また観測可能であっても、各
成分の最適励起,蛍光波長値は各々異なることが一般的
であるから、従来の技術のように、励起あるいは蛍光波
長の一方を固定して測光する手法では、各成分すべてを
最適の励起、あるいは蛍光波長値で測光することは困難
となる。
【0004】また各サンプルの励起スペクトル及び蛍光
スペクトルが重なりをもたない複数成分の同時定量を実
施する場合、分離の前処理は不要であるが従来の技術の
ように、励起あるいは蛍光波長の一方を固定して測光す
る手法では、異なる条件による測定が必要となる。
【0005】またスペクトルの重なりの有無を判断する
のは測定者であり、知識や予備実験が必要となり煩雑で
ある。
【0006】本発明は、この蛍光法による複数成分の同
時定量において、分離の前処理をすることなく、測定し
ようとする各サンプルの励起スペクトルあるいは蛍光ス
ペクトルが同一の蛍光波長、あるいは励起波長値にて観
測可能でない場合にも、同一のアルゴリズムで重回帰分
析等の手段によって分析可能とし、かつその分析の条件
を自動設定して繁雑性を排除するものである。
【0007】
【課題を解決するための手段】上記課題は定量のための
複数の励起,蛍光波長値の設定を片方の波長値を固定す
るという制約条件を排除し、両者共任意に設定可能とす
ることにより、各成分の最適な測光波長条件が選択可能
となり達成される。
【0008】また測光波長値の選択は、各成分の蛍光強
度が最大となる励起蛍光波長値の検出機能を備えた分光
蛍光光度計を使用して、自動設定させる。
【0009】
【作用】複数波長値での定量測定をバックグラウンド成
分の影響を除去することではなく複数成分の同時定量の
目的で行うことで、また複数の測定の励起,蛍光波長値
を選択可能な全波長範囲内で任意に設定可能とすること
によって、測定者は、各成分のスペクトル同士の重なり
の有無を考慮せずに、分離の前処理も行わずに測定を実
行することが可能となる。
【0010】
【実施例】以下本発明の実施例を図面に基づいて説明す
る。
【0011】図1においてa)〜c)は規定濃度の成分
1,成分2及びそれらの混合物(成分比未知)の3次元
スペクトルを示している。横軸が蛍光波長値,縦軸が励
起波長値を表し、各励起蛍光波長値に対する蛍光強度を
紙面に垂直手前方向に表示したときの、蛍光強度の等し
い点を結んだ等高線がa)〜c)である。下段に示す
d)〜f)はa)〜c)のA−A′による断面を示す。
励起波長を固定しての蛍光波長軸にそった断面であるか
らd)〜f)は蛍光スペクトルである。このような場合
通常分離の前処理を実行した後に、各成分について定量
測定を実行するが、定量される各サンプルのスペクトル
全てが独立に存在し、これらが既知である場合は、重回
帰分析の手法によってf)をd),e)のような各成分
のスペクトルに分解し、さらに各成分量を推定すること
ができる(原理的にスペクトル内には全成分数以上のデ
ータ点数が存在すれば推定可能である)。しかし図1の
場合は成分1,2の蛍光ピーク位置が励起,蛍光波長と
も異なるため、励起,蛍光波長のいずれかを固定して両
者共に最大蛍光強度を与える断面のスペクトルを得るこ
とは不可能である。よって、断面A−A′の様にピーク
からはずれた位置を選択しなければならず、蛍光強度は
小さくなるから測定の精度及び検出限界において不利で
ある。
【0012】図2はこの極端な例で成分3,4のスペク
トルは全く重なっておらず、いかなる励起,蛍光スペク
トルの断面も両サンプルを同時に表示することはできな
い。しかしこの場合は、各成分における最適な波長条件
で各々の定量測定を実行すればよい。
【0013】また各成分に分離する前処理を行わず複数
成分の同時定量を実行する場合、図1のようにデータ処
理による成分量推定を行える場合と、図2のように行え
ない場合を判断するのは測定者であり、知識や予備実験
が必要となり、繁雑である。ここで図1のc)のB−
B′,図2のc)のC−C′の断面を考える。これらは
各成分の蛍光強度のピーク位置を結んだ線分、及び各ピ
ークから蛍光長波長側に延ばした線分,励起短波長側に
延ばした線分の各々が交差しない組合せからなる断面で
ある。蛍光長波長側,励起短波長側と指定しているのは
励起の散乱成分が断面に含まれないようにするためであ
る。
【0014】図3は実際に断面を決定する例のフローチ
ャートである。フローチャートの枠において、左右端が
二重線で示してある部分は、測定者が操作する部分を表
わす。図1,図2では2成分の例を示しているが、この
アルゴリズムは3成分以上についても対応可能である。
【0015】(1)測定者が成分数を入力する。ここで
は入力した成分数をNSとおく。
【0016】(2)〜(6)で光度計が濃度既知の各成分
(標準試料)についてそのピークの波長位置(EXi,
EMi)と蛍光強度(Ii)を検出する。例えば図1
c)に示すようにP1,P2の励起蛍光波長を測定波長
値として設定する。
【0017】(7)〜(10)で制御部が各成分のピーク
位置を結ぶ線分を3等分する波長位置に測定波長を2点
ずつ設定する。図1c)においては、成分1と成分2の
ピークを結ぶ線分を3等分する位置は点P3,P4であ
り、この位置に測定波長値を設定する。
【0018】(11)〜(12)で成分1と成分NSの蛍
光強度が最大となる測定波長のうち、蛍光波長が短い方
を成分X,他方を成分Mと定義する。
【0019】(13)で成分Xを再度試料室に設置し、
励起スペクトルを測定することによって、その蛍光ピー
クから励起短波長側にのばした線分上に測定波長を2点
設定する。この2点は蛍光強度がピーク強度の1/2,
1/4となる点を選ぶものとする。この操作は図1c)
においてP5,P6を求めることに相当する。
【0020】(14)で成分Mを再度試料室に設置し、
蛍光スペクトルを測定することによって、その蛍光ピー
クから蛍光長波長側にのばした線分上に測定波長を2点
設定する。この2点も蛍光強度がピーク強度の1/2,
1/4となる点を選ぶものとする。この操作は図1c)
においてP7,P8を求めることに相当する。
【0021】(15)このようにして求めた各成分の蛍
光ピーク波長位置(図1c)の(P1,P2),ピーク間
の波長位置(P3,P4)、さらに(13)(14)で求
めたピークの蛍光強度の1/2,1/4となる点を測定
波長として条件設定する。本アルゴリズムを使用すると
成分数NSと測定波長数NWの関係は、NW=3NS+
2と表わすことができる。図1c)に示すように2成分
の場合は測定波長数は8となる。
【0022】ここで複数の成分において蛍光強度のピー
クが一致あるいは分光器のバンドパスの数倍程度しか離
れていない場合はそのピーク位置から励起/蛍光波長値
とも等しい量だけ増減する方向にピークの蛍光強度が1
/2,1/4となる点を探し、その波長値を条件として
設定する。
【0023】次に2成分系の条件の設定から成分量の推
定までを図4によって説明する。3成分以上の系につい
ても容易に拡張可能である。またここでも図3と同様に
フローチャートの枠において、左右端が二重線で示して
ある部分は、測定者が操作する部分を表わすものとす
る。
【0024】(1)で図3のアルゴリズムによって2成
分系で8組の波長条件を決定する。(2)でこの条件に
おける、成分1〜成分2(一般的には図3の成分数で入
力した成分数NSまで)の標準試料の蛍光強度を測定す
る。これを標準データと呼ぶことにし、成分1の標準デ
ータをs1,成分2の標準データをs2とする。ここでは
濃度と成分量が正比例することを仮定して1つの標準試
料についてのみ測定しているが、その他の場合について
も、ピークの波長位置を検出した後に、濃度の異なる標
準試料を測定し、各成分についての検量線を作成するこ
ともできる。(3)で実際の混合物試料について測定を
実行する。これを試料データxとする。
【0025】(4)で光度計のデータ処理部あるいはデ
ータ処理用のコンピュータによってs1,s2,xから成
分量を推定する。
【0026】データ処理の例として重回帰分析を実行す
る例を示す。ここでs1,s2,xは2×1行列である。
試料データxは成分1の濃度をc1,成分2の濃度をc
2としたときに、 x=c1s1+c2s2+n と表せる。ただしnは雑音成分を表す。さらにcをc
1,c2を成分とする2×1行列とし、S=(s1
2)とすると、 x=S・c+n となる。cが成分量を表す行列であるからその推定量を
ceとし、転置行列をt,逆行列をiという添字で表す
とすると、 ce=(St・S)i・St・x の式によって成分推定量を求めることができる。
【0027】必要に応じて重みつきの計算を実行した
り、非負拘束をかけて処理を実施してもよい。
【0028】
【発明の効果】本発明によれば、スペクトルの重なりを
持つ、持たないに関わらず複数の成分の混合物サンプル
を、各成分に分離することなしに、効果的な測定条件に
よる同時測定が可能となり、前処理や予備実験が不要と
なった。
【図面の簡単な説明】
【図1】スペクトルに重なりのある混合物サンプルのス
ペクトル例を示す図である。
【図2】スペクトルに重なりを持たない混合物サンプル
のスペクトル例を示す図である。
【図3】測定波長条件を設定するためのフローチャート
である。
【図4】条件設定から成分量推定までのフローチャート
である。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】光源,この光源からの光を分光し単色光を
    試料に照射する励起側分光器,上記試料から発せられた
    蛍光を分光する蛍光側分光器,この蛍光側分光器の射出
    光を検出する検出器,上記2つの分光器の波長移動と検
    出器からのデータ取得、及びデータの表示,処理等を行
    う制御部によって構成され、また上記2つの分光器の一
    方を任意の波長に固定し他方を波長走査したときのピー
    ク波長を検出する手段,検出されたピーク波長に上記他
    方の分光器を固定し一方を波長走査したときの第1のス
    ペクトルを記憶する手段,上記他方の分光器を上記ピー
    ク波長と異なる波長に固定し一方を波長走査したときの
    第2のスペクトルを記憶する手段,上記第1,第2のス
    ペクトルを比較し、概略同じ波長のピークを蛍光による
    ピークに設定することによって試料から発せられた蛍光
    強度の最大となる励起蛍光強度を自動検出する機能を備
    えた分光蛍光光度計において、複数成分の混在する試料
    の蛍光定量測定を行うときに、各成分の蛍光強度の最大
    となる励起蛍光波長を事前の測定時に記憶し、各成分
    の、蛍光強度の最大となる励起蛍光波長の組み、および
    励起、蛍光波長をそれぞれ軸とする平面上で各成分の蛍
    光強度の最大となる励起蛍光波長値をあらわす点を結ん
    だ線分を内分する点の励起蛍光波長に測定波長を自動的
    に設定して複数成分の混在する試料内各成分の同時定量
    を実行することを特徴とする分光蛍光光度計。
  2. 【請求項2】分光蛍光光度計による定量測定の方法にお
    いて、各成分の蛍光強度の最大となる励起蛍光波長を事
    前の測定時に記憶し、各成分の蛍光強度の最大となる励
    起蛍光波長の組み、および励起,蛍光波長をそれぞれ軸
    とする平面上で各成分の蛍光強度の最大となる励起蛍光
    波長値をあらわす点を結んだ線分を内分する点の励起蛍
    光波長に測定波長を設定して複数成分の混在する試料内
    各成分の同時定量を実行することを特徴とする分光蛍光
    光度計による定量測定の方法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009074866A (ja) * 2007-09-19 2009-04-09 Hamamatsu Photonics Kk 分光測定装置、分光測定方法、及び分光測定プログラム
JP2011012983A (ja) * 2009-06-30 2011-01-20 Nippon Steel Corp 系外流域への特定化学物質の漏洩検知方法
WO2011092766A1 (ja) * 2010-01-28 2011-08-04 株式会社 日立ハイテクノロジーズ 分光蛍光光度計、および液体クロマトグラフ用蛍光検出器
JP5519841B1 (ja) * 2013-07-22 2014-06-11 日本分光株式会社 三次元スペクトルデータ上のピーク検出方法

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