JPH0699403B2 - アミノアンチピリン誘導体及びその使用法 - Google Patents
アミノアンチピリン誘導体及びその使用法Info
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- JPH0699403B2 JPH0699403B2 JP7545486A JP7545486A JPH0699403B2 JP H0699403 B2 JPH0699403 B2 JP H0699403B2 JP 7545486 A JP7545486 A JP 7545486A JP 7545486 A JP7545486 A JP 7545486A JP H0699403 B2 JPH0699403 B2 JP H0699403B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、新規な発色剤化合物に関し、分析、とりわけ
臨床診断の検査法に関するものである。
臨床診断の検査法に関するものである。
［従来の技術］ 臨床検査に多用される発色系として、４−アミノアンチ
ピリン（以下4AAと略す。）とフェノール又はフェノー
ル誘導体、或いは4AAとアニリン又はアニリン誘導体と
の組合わせが知られている。従来、フェノール及びアニ
リン誘導体に関する研究は、多く見られるが、4AA誘導
体に関しては少ない。4AA誘導体に関するものとして
は、特開昭56-125373、特開昭58-12477等がある。前者
は4AAにより形成される色素の不安定性による定量誤差
を4AAの代わりに低級アルキル基又はアミノ基置換した
フェニル基を有する4AA誘導体を用いることにより解決
したものであり、後者は、湿式法で行なわれてきた反応
を4AAの代わりにクロロフェニル基又はトルクロロフェ
ニル基を有する4AA誘導体を用いることにより乾式法に
も適用できるようにしたものである。
ピリン（以下4AAと略す。）とフェノール又はフェノー
ル誘導体、或いは4AAとアニリン又はアニリン誘導体と
の組合わせが知られている。従来、フェノール及びアニ
リン誘導体に関する研究は、多く見られるが、4AA誘導
体に関しては少ない。4AA誘導体に関するものとして
は、特開昭56-125373、特開昭58-12477等がある。前者
は4AAにより形成される色素の不安定性による定量誤差
を4AAの代わりに低級アルキル基又はアミノ基置換した
フェニル基を有する4AA誘導体を用いることにより解決
したものであり、後者は、湿式法で行なわれてきた反応
を4AAの代わりにクロロフェニル基又はトルクロロフェ
ニル基を有する4AA誘導体を用いることにより乾式法に
も適用できるようにしたものである。
又、4AA誘導体に関する他の報告としては、鎮痛剤とし
ての使用を目的とするハロゲン置換したフェニル基又は
エトキシ基を有する4AA誘導体に関するもの〔金沢大学
薬研報、28頁、1957年．〕があるが、そこには、発色剤
としての検討はない。
ての使用を目的とするハロゲン置換したフェニル基又は
エトキシ基を有する4AA誘導体に関するもの〔金沢大学
薬研報、28頁、1957年．〕があるが、そこには、発色剤
としての検討はない。
［発明が解決しようとする問題点］ 従来、4AAを酵素反応系に用いた場合、4AAの酵素阻害作
用という問題があった。例えば、4AAによるコリンエス
テラーゼの阻害があり、コリンエステラーゼをパーオキ
シダーゼ／H2O2/4AA系反応で測定すると4AAの阻害によ
って真の活性値が得られないという事実があり、問題に
なっていた。〔日本臨床検査自動化学会誌、７、324、1
982.〕。本発明はこの点に着目し、なされたものであっ
て、測定に際し、酵素を阻害しない発色剤を提供しよう
とするものである。
用という問題があった。例えば、4AAによるコリンエス
テラーゼの阻害があり、コリンエステラーゼをパーオキ
シダーゼ／H2O2/4AA系反応で測定すると4AAの阻害によ
って真の活性値が得られないという事実があり、問題に
なっていた。〔日本臨床検査自動化学会誌、７、324、1
982.〕。本発明はこの点に着目し、なされたものであっ
て、測定に際し、酵素を阻害しない発色剤を提供しよう
とするものである。
［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、4AAに代わる酵素を阻害しない発色剤を
種々検討した結果、 一般式： ［式中、R1はナフチル基、フェニル基又はニトロ基を有
するフェニル基、R2は低級アルキル基を示す。ただし、
R1がフェニル基でかつR2がメチル基の場合を除く。］で
表わされるアミノアンチピリン化合物及びその塩の合成
に成功すると共にこれらの誘導体が酵素の活性を阻害し
ないことを見い出だし、本発明を完成した。
種々検討した結果、 一般式： ［式中、R1はナフチル基、フェニル基又はニトロ基を有
するフェニル基、R2は低級アルキル基を示す。ただし、
R1がフェニル基でかつR2がメチル基の場合を除く。］で
表わされるアミノアンチピリン化合物及びその塩の合成
に成功すると共にこれらの誘導体が酵素の活性を阻害し
ないことを見い出だし、本発明を完成した。
本発明に係る化合物の合成方法の一例を次に示す。
本発明の化合物は、下記の反応式で示す方法によって収
率よく得ることができる。
率よく得ることができる。
式［Ｉ］の化合物の酸化付加塩は、常法に従って、酸を
作用させることにより製造が可能である。
作用させることにより製造が可能である。
いずれの化合物においても、酸付加塩を構成する酸の例
として、塩化水素酸、臭化水素酸、沃化水素酸、硝酸、
過塩素酸、硫酸等の無機酸、及び酢酸、蓚酸、酒石酸、
ｐ−トルエンスルホン酸等を挙げることができる。
として、塩化水素酸、臭化水素酸、沃化水素酸、硝酸、
過塩素酸、硫酸等の無機酸、及び酢酸、蓚酸、酒石酸、
ｐ−トルエンスルホン酸等を挙げることができる。
又、R1とR2の組合わせは、例えば次の様にすることが可
能である。
能である。
このようにして、合成される化合物の例を挙げると、ｐ
−ニトロフェニル−2,3−ジメチル−４−アミノ−５−
ピラゾロン、１−ナフチル−2,3−ジメチル−４−アミ
ノ−５−ピラゾロン、１−フェニル−２−エチル−３−
メチル−４−アミノ−５−ピラゾロン、１−フェニル−
２−プロピル−４−ミアノ−５−ピラゾロン等である。
−ニトロフェニル−2,3−ジメチル−４−アミノ−５−
ピラゾロン、１−ナフチル−2,3−ジメチル−４−アミ
ノ−５−ピラゾロン、１−フェニル−２−エチル−３−
メチル−４−アミノ−５−ピラゾロン、１−フェニル−
２−プロピル−４−ミアノ−５−ピラゾロン等である。
次に本発明のもう一つの目的である分析法について以下
に述べる。
に述べる。
本発明で得られる化合物は、特にコリンエステラーゼ活
性の測定に適しているが、分析しようとする酵素活性が
4AAにより阻害を受ける時、本発明で得られる化合物を
用いると、従来4AA系で生じた酵素阻害の影響のない正
確な測定が期待できる。
性の測定に適しているが、分析しようとする酵素活性が
4AAにより阻害を受ける時、本発明で得られる化合物を
用いると、従来4AA系で生じた酵素阻害の影響のない正
確な測定が期待できる。
例えば、本発明の化合物を用いるコリンエステラーゼの
比色法による測定は、以下のような反応である。
比色法による測定は、以下のような反応である。
他に、ｍ−トルオイルコリン、ｏ−トルオイルコリン等
の基質を用いて測定することも可能である。
の基質を用いて測定することも可能である。
又、本発明の化合物は、従来、発色剤として用いられて
きた4AAに置き換えて用いることができる。例えば、公
知のカプラーと本発明の化合物とをパーオキシダーゼ及
び過酸化水素の存在下で酸化縮合させ、又は公知の酸化
剤の存在下で酸化縮合させて、発色させる方法に用いる
ことができる。
きた4AAに置き換えて用いることができる。例えば、公
知のカプラーと本発明の化合物とをパーオキシダーゼ及
び過酸化水素の存在下で酸化縮合させ、又は公知の酸化
剤の存在下で酸化縮合させて、発色させる方法に用いる
ことができる。
このような方法で分析できる物質としては、例えば、過
酸化水素、コレステロール、グルコース、尿酸、トリグ
リセライド等を挙げることができる。
酸化水素、コレステロール、グルコース、尿酸、トリグ
リセライド等を挙げることができる。
公知の酸化剤としては、過ヨウ素酸塩、過硫酸カリウ
ム、フェリシアン化カリウム等を用いることができる。
公知のカプラーとして、フェノール系カプラーの例を挙
げると、フェノール、ｐ−クロロフェノール、ｐ−ヒド
ロキシベンゾエート、ジクロロフェノール、ジクロロク
レゾール、ジブロムフェノール等があり、アニリン系カ
プラーとしては、N,N−ジメチルアニリン、N,N−ジエチ
ルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）
−アニリン、ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スル
ホプロピル−アミノ）フェノール等があり、トルイジン
系カプラーとしては、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−
Ｎ−エチル−３−メチルアニリン、N,N−ジエチル−ｍ
−トルイジン、N,N−ジメチル−ｍ−トルイジン、N,N−
ジエタノール−ｍ−トルイジン、３−メチル−Ｎ−エチ
ル−Ｎ′−ヒドロキシ−エチルアニリン等があり、アニ
シジン系カプラーとしては、N,N−ジメチル−ｍ−メト
キシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、アセトアミノ−
N,N−ジエチルアニリン等があり、ナフタレン系カプラ
ーとしては、1,7−ジヒドロキシナフタレン等がある。
ム、フェリシアン化カリウム等を用いることができる。
公知のカプラーとして、フェノール系カプラーの例を挙
げると、フェノール、ｐ−クロロフェノール、ｐ−ヒド
ロキシベンゾエート、ジクロロフェノール、ジクロロク
レゾール、ジブロムフェノール等があり、アニリン系カ
プラーとしては、N,N−ジメチルアニリン、N,N−ジエチ
ルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）
−アニリン、ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スル
ホプロピル−アミノ）フェノール等があり、トルイジン
系カプラーとしては、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−
Ｎ−エチル−３−メチルアニリン、N,N−ジエチル−ｍ
−トルイジン、N,N−ジメチル−ｍ−トルイジン、N,N−
ジエタノール−ｍ−トルイジン、３−メチル−Ｎ−エチ
ル−Ｎ′−ヒドロキシ−エチルアニリン等があり、アニ
シジン系カプラーとしては、N,N−ジメチル−ｍ−メト
キシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、アセトアミノ−
N,N−ジエチルアニリン等があり、ナフタレン系カプラ
ーとしては、1,7−ジヒドロキシナフタレン等がある。
尚、本発明の化合物の溶解性を高めるためにアルコール
又は、界面活性剤等を系に加えることも、それが酵素を
阻害しない場合には効果的である。
又は、界面活性剤等を系に加えることも、それが酵素を
阻害しない場合には効果的である。
［作用］ 本発明の4AA誘導体の使用により、従来、阻害のため正
確に測定できなかった酵素を正確に定量することが可能
となった。
確に測定できなかった酵素を正確に定量することが可能
となった。
以下、実施例により詳細に説明するが、本発明はこれに
よって何ら限定されるものではない。
よって何ら限定されるものではない。
実施例１ ｐ−ニトロフェニル−2,3−ジメチル−４−アミノ−５
−ピラゾロン（化合物Ｉ）の合成 ｐ−ニトロフェニル−３−メチル−５−ピラゾロン
の合成 ｐ−ニトロフェニルヒドラジン25gを200mlエタノール50
mlの水を加えた溶液に加え、80℃前後に加熱して溶解さ
せた。アセト酢酸エチルエステル22gを滴下して加え90
〜130℃にて、４時間加熱還流した。放冷後一晩放置し
たところ結晶が析出した。これを濾取して乾燥させたと
ころ33gの結晶が得られた。
−ピラゾロン（化合物Ｉ）の合成 ｐ−ニトロフェニル−３−メチル−５−ピラゾロン
の合成 ｐ−ニトロフェニルヒドラジン25gを200mlエタノール50
mlの水を加えた溶液に加え、80℃前後に加熱して溶解さ
せた。アセト酢酸エチルエステル22gを滴下して加え90
〜130℃にて、４時間加熱還流した。放冷後一晩放置し
たところ結晶が析出した。これを濾取して乾燥させたと
ころ33gの結晶が得られた。
ｐ−ニトロフェニル−2,3−ジメチル−５−ピラゾ
ロンの合成 で得たｐ−ニトロフェニル−３−メチル−５−ピラゾ
ロン8gにｐ−トルエンスルホン酸メチル12gを加えて160
℃〜180℃で４時間加熱攪拌を行なった。その後25％水
酸化ナトリウム溶液を用いて中和し、クロロホルム100m
lで２回抽出を行なった。クロロホルム層を分離留去
後、酢酸エチルにて再結晶を行なったところ5gのｐ−ニ
トロフェニル−2,3−ジメチル−５−ピラゾロンの粗生
成物が得られた。
ロンの合成 で得たｐ−ニトロフェニル−３−メチル−５−ピラゾ
ロン8gにｐ−トルエンスルホン酸メチル12gを加えて160
℃〜180℃で４時間加熱攪拌を行なった。その後25％水
酸化ナトリウム溶液を用いて中和し、クロロホルム100m
lで２回抽出を行なった。クロロホルム層を分離留去
後、酢酸エチルにて再結晶を行なったところ5gのｐ−ニ
トロフェニル−2,3−ジメチル−５−ピラゾロンの粗生
成物が得られた。
ｐ−ニトロフェニル−2,3−ジメチル−４−アミノ
−５−ピラゾロン（化合物Ｉ）の合成 で得たｐ−ニトロフェニル−2,3−ジメチル−５−ピ
ラゾロン5.0gに酢酸30ml、水15mlを加え、更に塩酸3ml
を加え溶解した。５℃に氷冷したのち亜硝酸ナトリウム
1.5gを冷水8mlで溶解したものを加え30分放置したのち
緑色結晶を濾取したところ3.7gの生成物が得られた。こ
の生成物2gに水30mlを加え硫化ナトリウム0.1gを加え硫
化水素を緑色が消失するまで通じた。酢酸エチルで抽出
し、酢酸エチルを留去したのちメタノールにて再結晶を
行なって約0.5gのｐ−ニトロフェニル−2,3−ジメチル
−４−アミノ−５−ピラゾロン（化合物Ｉ）を得た。
−５−ピラゾロン（化合物Ｉ）の合成 で得たｐ−ニトロフェニル−2,3−ジメチル−５−ピ
ラゾロン5.0gに酢酸30ml、水15mlを加え、更に塩酸3ml
を加え溶解した。５℃に氷冷したのち亜硝酸ナトリウム
1.5gを冷水8mlで溶解したものを加え30分放置したのち
緑色結晶を濾取したところ3.7gの生成物が得られた。こ
の生成物2gに水30mlを加え硫化ナトリウム0.1gを加え硫
化水素を緑色が消失するまで通じた。酢酸エチルで抽出
し、酢酸エチルを留去したのちメタノールにて再結晶を
行なって約0.5gのｐ−ニトロフェニル−2,3−ジメチル
−４−アミノ−５−ピラゾロン（化合物Ｉ）を得た。
融点:155〜157℃ NMR（CDCl3，δ）:2.15（3H,s）、2.75（5H,s）、7.6
（7H,m）。
（7H,m）。
実施例２ １−ナフチル−2,3−ジメチル−４−アミノ−５−ピラ
ゾロン（化合物II）の合成 １−ナフチル−３−メチル−５−ピラゾロンの合成 １−ナフチルヒドラジン塩酸塩8.5gとアセト酢酸エチル
エステル6.0gをエタノール80mlに水20ml加えた溶媒に加
え、120℃〜140℃にて２時間加熱還流を行なった。溶媒
を留去したのち酢酸エチルを15ml加え数日間冷蔵にて放
置したところ約9.4gの１−ナフチル−３−メチル−５−
ピラゾロンの粗生成物が得られた。
ゾロン（化合物II）の合成 １−ナフチル−３−メチル−５−ピラゾロンの合成 １−ナフチルヒドラジン塩酸塩8.5gとアセト酢酸エチル
エステル6.0gをエタノール80mlに水20ml加えた溶媒に加
え、120℃〜140℃にて２時間加熱還流を行なった。溶媒
を留去したのち酢酸エチルを15ml加え数日間冷蔵にて放
置したところ約9.4gの１−ナフチル−３−メチル−５−
ピラゾロンの粗生成物が得られた。
１−ナフチル−2,3−ジメチル−５−ピラゾロンの
合成 で得た１−ナフチル−３−メチル−５−ピラゾロン3.
2gにｐ−トルエンスルホン酸メチル5mlを加え140〜160
℃の油浴上で80〜10時間加熱攪拌を行なった。100℃前
後に放冷したのち25％水酸化ナトリウム溶液35mlを加え
た。後に濃塩酸を加えて中和したのち水50mlを加えてク
ロロホルム50mlで２回抽出を行なった。クロロホルム層
を濃縮したのちシリカゲルカラムクロマトグラフィー
（溶媒：酢酸エチル）にて単一物質の約1.0gの１−ナフ
チル−2,3−ジメチル−５−ピラゾロンが得られた。
合成 で得た１−ナフチル−３−メチル−５−ピラゾロン3.
2gにｐ−トルエンスルホン酸メチル5mlを加え140〜160
℃の油浴上で80〜10時間加熱攪拌を行なった。100℃前
後に放冷したのち25％水酸化ナトリウム溶液35mlを加え
た。後に濃塩酸を加えて中和したのち水50mlを加えてク
ロロホルム50mlで２回抽出を行なった。クロロホルム層
を濃縮したのちシリカゲルカラムクロマトグラフィー
（溶媒：酢酸エチル）にて単一物質の約1.0gの１−ナフ
チル−2,3−ジメチル−５−ピラゾロンが得られた。
１−ナフチル−2,3−ジメチル−４−アミノ−５−
ピラゾロン（化合物II）の合成 で得た１−ナフチル−2,3−ジメチル−５−ピラゾロ
ン1.0gに酢酸6.0ml、水3.0mlを加え溶解させた後、５℃
以下に氷冷した。亜硝酸ナトリウム0.5gを冷水1.5mlに
溶解したものを滴下して加え、析出した緑色結晶を乾燥
したところ0.6gの粗生成物が得られた。この生成分0.6g
をエタノール8ml、水1.5mlに溶解させ10℃以下に冷却し
た。ヒドロスルフィドナトリウム2.0gを冷水8mlに溶解
したものを加えて室温で２時間放置したのちクロロホル
ムで抽出したところ単一の油状の0.44gの１−ナフチル
−2,3−ジメチル−４アミノ−５−ピラゾロン（化合物I
I）が得られた。
ピラゾロン（化合物II）の合成 で得た１−ナフチル−2,3−ジメチル−５−ピラゾロ
ン1.0gに酢酸6.0ml、水3.0mlを加え溶解させた後、５℃
以下に氷冷した。亜硝酸ナトリウム0.5gを冷水1.5mlに
溶解したものを滴下して加え、析出した緑色結晶を乾燥
したところ0.6gの粗生成物が得られた。この生成分0.6g
をエタノール8ml、水1.5mlに溶解させ10℃以下に冷却し
た。ヒドロスルフィドナトリウム2.0gを冷水8mlに溶解
したものを加えて室温で２時間放置したのちクロロホル
ムで抽出したところ単一の油状の0.44gの１−ナフチル
−2,3−ジメチル−４アミノ−５−ピラゾロン（化合物I
I）が得られた。
NMR（CDCl3，δ）:2.15（3H,s）、2.85（5H,s）、8.0
（4H,m）。
（4H,m）。
残渣をテトロヒドロフラン（THF）20mlに溶解し、塩化
水素を通し、生じた沈澱を濾取してTHFにて洗浄を行な
い１−ナフチル−2,3−ジメチル−４−アミノ−５−ピ
ラゾロン（化合物II）の塩酸塩を得た。収量は0.45gで
あった。
水素を通し、生じた沈澱を濾取してTHFにて洗浄を行な
い１−ナフチル−2,3−ジメチル−４−アミノ−５−ピ
ラゾロン（化合物II）の塩酸塩を得た。収量は0.45gで
あった。
分解融点:238℃。
実施例３ １−フェニル−２−エチル−３−メチル−４−アミノ−
５−ピラゾロン（化合物III）の合成 １−フェニル−２−エチル−３−メチル−５−ピラ
ゾロンの合成 １−フェニル−２−エチル−３−メチル−５−ピラゾロ
ン10.4gにｐ−トルエンスルホン酸エチル18gを加えて、
油浴上で180℃、８時間加熱した。この反応混合物を放
冷した後に25％水酸化ナトリウム溶液を加え中和した。
次に水を50ml加えた後にクロロホルムで抽出を行なっ
た。クロロホルム層分離後濃縮を行ない、酢酸エチルに
て再結晶を行ない１−フェニル−２−エチル−３−メチ
ル−５−ピラゾロンが5.0g得られた。
５−ピラゾロン（化合物III）の合成 １−フェニル−２−エチル−３−メチル−５−ピラ
ゾロンの合成 １−フェニル−２−エチル−３−メチル−５−ピラゾロ
ン10.4gにｐ−トルエンスルホン酸エチル18gを加えて、
油浴上で180℃、８時間加熱した。この反応混合物を放
冷した後に25％水酸化ナトリウム溶液を加え中和した。
次に水を50ml加えた後にクロロホルムで抽出を行なっ
た。クロロホルム層分離後濃縮を行ない、酢酸エチルに
て再結晶を行ない１−フェニル−２−エチル−３−メチ
ル−５−ピラゾロンが5.0g得られた。
１−フェニル−２−エチル−３−メチル−４−ニト
ロソ−５−ピラゾロンの合成 で得た１−フェニル−２−エチル−３−メチル−５−
ピラゾロン2.0gに酢酸12mlと水6.0mlを加え溶解したの
ち濃塩酸0.6mlを加え２〜４℃に冷却した。冷水3mlの中
に亜硝酸ナトリウム1gを溶かし、これを少量ずつ滴下
し、析出した緑色結晶を濾別した。これをエーテルで洗
浄し、乾燥して1.0gの１−フェニル−２−エチル−３−
メチル−４−ニトロソ−５−ピラゾロンを得た。
ロソ−５−ピラゾロンの合成 で得た１−フェニル−２−エチル−３−メチル−５−
ピラゾロン2.0gに酢酸12mlと水6.0mlを加え溶解したの
ち濃塩酸0.6mlを加え２〜４℃に冷却した。冷水3mlの中
に亜硝酸ナトリウム1gを溶かし、これを少量ずつ滴下
し、析出した緑色結晶を濾別した。これをエーテルで洗
浄し、乾燥して1.0gの１−フェニル−２−エチル−３−
メチル−４−ニトロソ−５−ピラゾロンを得た。
１−フェニル−２−エチル−３−メチル−４−アミ
ノ−５−ピラゾロン（化合物III）の合成 で得た１−フェニル−２−エチル−３−メチル−４−
ニトロソ−５−ピラゾロン1.0gにエタノール7.0ml、水
2.0mlを加え冷却して10℃以下とした。この反応混液に2
gのヒドロスルフィドナトリウムを3mlの冷水に溶解し20
℃以下で３時間攪拌したのちクロロホルムで抽出した。
濃縮し、0.8gの１−フェニル−２−エチル−３−メチル
−４−アミノ−５−ピラゾロン（化合物III）を得た。
ノ−５−ピラゾロン（化合物III）の合成 で得た１−フェニル−２−エチル−３−メチル−４−
ニトロソ−５−ピラゾロン1.0gにエタノール7.0ml、水
2.0mlを加え冷却して10℃以下とした。この反応混液に2
gのヒドロスルフィドナトリウムを3mlの冷水に溶解し20
℃以下で３時間攪拌したのちクロロホルムで抽出した。
濃縮し、0.8gの１−フェニル−２−エチル−３−メチル
−４−アミノ−５−ピラゾロン（化合物III）を得た。
NMR（CDCl3，δ）:2.15（3H,s）、2.85（5H,s）、8.0
（4H,m）。
（4H,m）。
残渣をテトラヒドロフラン（THF）20mlに溶解し、塩化
水素を通し、生じた沈澱を濾取してTHFにて洗浄を行な
い１−フェニル−２−エチル−３−メチル−４−アミノ
−５−ピラゾロン（化合物III）の塩酸塩0.8gを得た。
水素を通し、生じた沈澱を濾取してTHFにて洗浄を行な
い１−フェニル−２−エチル−３−メチル−４−アミノ
−５−ピラゾロン（化合物III）の塩酸塩0.8gを得た。
分解融点:217℃。
実施例４ １−フェニル−２−プロピル−３−メチル−４−アミノ
−５−ピラゾロン（化合物IV）の合成 １−フェニル−２−プロピル−３−メチル−５−ピ
ラゾロンの合成 １−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン3.0gにｐ−
トルエンスルホン酸プロピル3.5gを加え、油浴上で180
℃12時間加熱した。この反応混合物に水30mlを加えて放
冷した。25％水酸化ナトリウムを加え中和した。この溶
液をクロロホルムで抽出を行ないクロロホルム層を分離
後、濃縮を行なった。酢酸エチルから再結晶を行ない１
−フェニル−２−プロピル−３−メチル−５−ピラゾロ
ンが2.0g得られた。
−５−ピラゾロン（化合物IV）の合成 １−フェニル−２−プロピル−３−メチル−５−ピ
ラゾロンの合成 １−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン3.0gにｐ−
トルエンスルホン酸プロピル3.5gを加え、油浴上で180
℃12時間加熱した。この反応混合物に水30mlを加えて放
冷した。25％水酸化ナトリウムを加え中和した。この溶
液をクロロホルムで抽出を行ないクロロホルム層を分離
後、濃縮を行なった。酢酸エチルから再結晶を行ない１
−フェニル−２−プロピル−３−メチル−５−ピラゾロ
ンが2.0g得られた。
１−フェニル−２−プロピル−３−メチル−４−ニ
トロソ−５−ピラゾロンの合成 で得た１−フェニル−２−プロピル−３−メチル−５
−ピラゾロン2.0gに酢酸12mlと水6.0mlを加え溶解した
のち濃塩酸0.6mlを加え、５℃以下に冷却した。次い
で、亜硝酸ナトリウム1gを冷水3.0mlに溶解したのち滴
下した。析出した結晶を濾別し、エーテルで洗浄ののち
乾燥して、0.8gの１−フェニル−２−プロピル−３−メ
チル−４−ニトロソ−５−ピラゾロンを得た。
トロソ−５−ピラゾロンの合成 で得た１−フェニル−２−プロピル−３−メチル−５
−ピラゾロン2.0gに酢酸12mlと水6.0mlを加え溶解した
のち濃塩酸0.6mlを加え、５℃以下に冷却した。次い
で、亜硝酸ナトリウム1gを冷水3.0mlに溶解したのち滴
下した。析出した結晶を濾別し、エーテルで洗浄ののち
乾燥して、0.8gの１−フェニル−２−プロピル−３−メ
チル−４−ニトロソ−５−ピラゾロンを得た。
１−フェニル−２−プロピル−３−メチル−４−ア
ミノ−５−ピラゾロン（化合物IV）の合成 で得た１−フェニル−２−プロピル−３−メチル−４
−ニトロソ−５−ピラゾロン0.8gにエタノール7ml、水2
mlを加え冷却して10℃以下とした。この反応混液に2gの
ヒドロスルフィドナトリウムを3mlの冷水に溶解し、20
℃以下で攪拌したのちクロロホルムで抽出した。クロロ
ホルム層を濃縮し、0.5gの１−フェニル−２−プロピル
−３−メチル−４−アミノ−５−ピラゾロン（化合物I
V）を得た。
ミノ−５−ピラゾロン（化合物IV）の合成 で得た１−フェニル−２−プロピル−３−メチル−４
−ニトロソ−５−ピラゾロン0.8gにエタノール7ml、水2
mlを加え冷却して10℃以下とした。この反応混液に2gの
ヒドロスルフィドナトリウムを3mlの冷水に溶解し、20
℃以下で攪拌したのちクロロホルムで抽出した。クロロ
ホルム層を濃縮し、0.5gの１−フェニル−２−プロピル
−３−メチル−４−アミノ−５−ピラゾロン（化合物I
V）を得た。
NMR（CDCl3，δ）:0.75（3H,t）、1.15（2H,m）、2.10
（3H,s）、3.25（4H,m）、7.40（5H,m）。
（3H,s）、3.25（4H,m）、7.40（5H,m）。
残渣をテトラヒドロフラン（THF）20mlに溶解し、塩化
水素を通し、生じた沈澱を濾取してTHFにて洗浄を行な
い１−フェニル−２−プロピル−３−メチル−４−アミ
ノ−５−ピラゾロン（化合物IV）の塩酸塩0.4gを得た。
水素を通し、生じた沈澱を濾取してTHFにて洗浄を行な
い１−フェニル−２−プロピル−３−メチル−４−アミ
ノ−５−ピラゾロン（化合物IV）の塩酸塩0.4gを得た。
分解融点:218℃。
比較例 4AAと本発明の4AA誘導体とによる酵素反応阻害の比較 （１）試薬の調製 イ．基質緩衝液 ｐ−ヒドロキシベンゾイルコリン・ヨード塩1.0mMを含
有する。pH8.2の50mMホウ酸緩衝液を調製する。
有する。pH8.2の50mMホウ酸緩衝液を調製する。
ロ．色素液 1.4−アミノアンチピリン30mMを含有するpH8.2、50mMホ
ウ酸緩衝液を調製する。
ウ酸緩衝液を調製する。
2.1−フェニル−２−エチル−３−メチル−４−アミノ
−５−ピラゾロン（化合物III）を30mM含有するpH8.2、
50mMホウ酸緩衝液を調製する。
−５−ピラゾロン（化合物III）を30mM含有するpH8.2、
50mMホウ酸緩衝液を調製する。
3.1−フェニル−２−プロピル−３−メチル−４−アミ
ノ−５−ピラゾロン（化合物IV）を50mM含有するpH8.
2、50mMホウ酸緩衝液を調製する。
ノ−５−ピラゾロン（化合物IV）を50mM含有するpH8.
2、50mMホウ酸緩衝液を調製する。
ハ．反応停止液 50mMネオスチグミンを含有する水溶液を調製する。
ニ．発色液 過ヨウ素酸カリウム10mM、ｐ−クロルベンゼンスルホン
酸2mMを含有するpH9.8、50mMホウ酸緩衝液を調製する。
酸2mMを含有するpH9.8、50mMホウ酸緩衝液を調製する。
（２）測定操作法 測定１（色素液の共存なしで酵素反応を行なった場合） 基質緩衝液1.0mlを３本の試験管に分注し、血清0.05ml
を加えよく混和し、37℃で５分間加温した。次いで、そ
れぞれの試験管に反応停止液を0.2mlずつ加え酵素反応
を停止させた。３本の試験管のうち１本目に色素液１を
２本目の試験管に色素液２を、３本目の試験管には色素
液３をそれぞれ0.1mlずつ加え、次いで発色液2.0mlを加
え試薬ブランクを対照として試料液の吸光度を500nmで
測定した。
を加えよく混和し、37℃で５分間加温した。次いで、そ
れぞれの試験管に反応停止液を0.2mlずつ加え酵素反応
を停止させた。３本の試験管のうち１本目に色素液１を
２本目の試験管に色素液２を、３本目の試験管には色素
液３をそれぞれ0.1mlずつ加え、次いで発色液2.0mlを加
え試薬ブランクを対照として試料液の吸光度を500nmで
測定した。
測定２（色素液の共存下で酵素反応を行なった場合） 基質緩衝液1.0mlを３本の試験管に分注し、１本目に色
素液１を２本目の試験管に色素液２を、３本目の試験管
には色素液３をそれぞれ0.1mlずつ加えた。これら３本
の試験管に測定１で用いた血清0.05mlを加えよく混和
し、37℃で５分間加温した。次いでそれぞれの試験管に
反応停止液0.2mlを加え更に発色液2.0mlを加えて発色を
行ない試薬ブランクを対照として試料液の吸光度を500n
mで測定した。
素液１を２本目の試験管に色素液２を、３本目の試験管
には色素液３をそれぞれ0.1mlずつ加えた。これら３本
の試験管に測定１で用いた血清0.05mlを加えよく混和
し、37℃で５分間加温した。次いでそれぞれの試験管に
反応停止液0.2mlを加え更に発色液2.0mlを加えて発色を
行ない試薬ブランクを対照として試料液の吸光度を500n
mで測定した。
（３）結果 測定１及び２で行なった結果は、表１に示す通りであ
る。
る。
4AA共存下では、表１にあるように、コリンエステラー
ゼへの阻害は認められた。ところが本発明の4AA誘導体
では、このような阻害は見られず、正確な測定が行なわ
れることを確認した。
ゼへの阻害は認められた。ところが本発明の4AA誘導体
では、このような阻害は見られず、正確な測定が行なわ
れることを確認した。
実施例５ コリンエステラーゼの測定 （１）試薬の調製 イ．基質緩衝液 ｐ−ヒドロキシベンゾイルコリン・ヨード塩1.0mM、１
−フェニル−２−エチル−３−メチル−４−アミノ−５
−ピラゾロン（化合物III）3.0mMを含有するpH8.2の50m
Mホウ酸緩衝液を調製する。
−フェニル−２−エチル−３−メチル−４−アミノ−５
−ピラゾロン（化合物III）3.0mMを含有するpH8.2の50m
Mホウ酸緩衝液を調製する。
ロ．発色液 過ヨウ素酸カリウム10mM、ネオスチグミン5mM、ｐ−ク
ロルベンゼンスルホン酸2mMを含有するpH9.8の50mMホウ
酸緩衝液を調製する。
ロルベンゼンスルホン酸2mMを含有するpH9.8の50mMホウ
酸緩衝液を調製する。
（２）測定操作法 基質緩衝液1.0mlを試験管に分注し、各段階に純水で希
釈した既知単位（Ch−ＥオートセットＦ“シノテスト”
により測定）血清0.05mlに加え、これらを37℃で５分間
加温した。次いで、それぞれの試験管に発色液2.0mlを
加えて酵素反応を停止し、発色させた。試薬ブランクを
対照として試料液の吸光度を500nmで測定した。この時
の血清の希釈度と吸光度との関係を第１図に示す。
釈した既知単位（Ch−ＥオートセットＦ“シノテスト”
により測定）血清0.05mlに加え、これらを37℃で５分間
加温した。次いで、それぞれの試験管に発色液2.0mlを
加えて酵素反応を停止し、発色させた。試薬ブランクを
対照として試料液の吸光度を500nmで測定した。この時
の血清の希釈度と吸光度との関係を第１図に示す。
（３）結果 吸光度は、血清中コリンエステラーゼ活性に比例して増
大しており、本発明の4AA誘導体は、コリンエステラー
ゼの定量にも有効に利用し得ることが認められた。
大しており、本発明の4AA誘導体は、コリンエステラー
ゼの定量にも有効に利用し得ることが認められた。
実施例６ 過酸化水素の定量 （１）反応試液の調製 １−フェニル−２−エチル−３−メチル−４−アミノ−
５−ピラゾロン（化合物III）1.0mM、パーオキシダーゼ
30U/ml、フェノール5mMを含有する50mMリン酸緩衝液pH
7.8を調製した。過酸化水素濃度を０、４、８、12、1
6、20mMの各々に調製した。
５−ピラゾロン（化合物III）1.0mM、パーオキシダーゼ
30U/ml、フェノール5mMを含有する50mMリン酸緩衝液pH
7.8を調製した。過酸化水素濃度を０、４、８、12、1
6、20mMの各々に調製した。
（２）測定操作法 上記反応試液3.0mlに過酸化水素溶液20μｌを加えて攪
拌し、37℃で５分間加温した。
拌し、37℃で５分間加温した。
室温まで冷却し、波長500nmで各々の吸光度を測定し
た。過酸化水素濃度を横軸に、吸光度を縦軸にとり検量
線を作成した。この時の吸光度と過酸化水素濃度の関係
を第２図に示す。
た。過酸化水素濃度を横軸に、吸光度を縦軸にとり検量
線を作成した。この時の吸光度と過酸化水素濃度の関係
を第２図に示す。
（３）結果 吸光度は、過酸化水素濃度に比例して増大しており、本
発明の4AA誘導体は過酸化水素の定量に有効に利用でき
ることが判明した。
発明の4AA誘導体は過酸化水素の定量に有効に利用でき
ることが判明した。
実施例７ グルコースの測定 （１）反応試液の調製 パーオキシダーゼ0.07U/ml、グルコースオキシダーゼ1.
7U/ml、リン酸6.7mM、１−フェニル−２−エチル−３−
メチル−４−アミノ−５−ピラゾロン（化合物III）3.0
mM、コール酸ナトリウム0.08mM、フェノール0.07（W/
V）％を含有する溶液を調製する。
7U/ml、リン酸6.7mM、１−フェニル−２−エチル−３−
メチル−４−アミノ−５−ピラゾロン（化合物III）3.0
mM、コール酸ナトリウム0.08mM、フェノール0.07（W/
V）％を含有する溶液を調製する。
（２）測定操作法 上記反応試液3.0mlに血清20μｌを加え、37℃で20分間
反応させ、室温下に10分間放置後、試薬ブランクを対照
として500nmで比色する。この時の血清の希釈度と吸光
度との関係を第３図に示す。
反応させ、室温下に10分間放置後、試薬ブランクを対照
として500nmで比色する。この時の血清の希釈度と吸光
度との関係を第３図に示す。
（３）結果 吸光度は、血清中のグルコースの量に比例して増大して
おり、本発明の4AA誘導体をグルコースの測定に適用で
きることが確認された。
おり、本発明の4AA誘導体をグルコースの測定に適用で
きることが確認された。
実施例８ コレステロールの測定 （１）反応試液の調製 コレステロールオキシダーゼ0.3U/ml、パーオキシダー
ゼ0.3U/ml、コール酸ナトリウム0.3mM、１−フェニル−
２−エチル−３−メチル−４−アミノ−５−ピラゾロン
（化合物III）3.0mM、非イオン系界面活性剤0.17（V/
V）％、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウム1.3mMを含有
する溶液を調製する。
ゼ0.3U/ml、コール酸ナトリウム0.3mM、１−フェニル−
２−エチル−３−メチル−４−アミノ−５−ピラゾロン
（化合物III）3.0mM、非イオン系界面活性剤0.17（V/
V）％、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウム1.3mMを含有
する溶液を調製する。
（２）測定操作法 上記反応試液3.0mlに血清0.1mlを加え、37℃で20分間反
応させ、室温下に10分間放置後、試薬ブランクを対照と
して555nmで比色する。この時の血清の希釈度と吸光度
との関係を第４図に示す。
応させ、室温下に10分間放置後、試薬ブランクを対照と
して555nmで比色する。この時の血清の希釈度と吸光度
との関係を第４図に示す。
（３）結果 吸光度は、血清中のコレステロールの量に比例してお
り、本発明の4AA誘導体はコレステロールの定量にも有
効に利用できることが判明した。
り、本発明の4AA誘導体はコレステロールの定量にも有
効に利用できることが判明した。
第１図は実施例５、第２図は実施例６、第３図は実施例
７及び第４図は実施例８における血清試料の希釈度と吸
光度との関係を示す。
７及び第４図は実施例８における血清試料の希釈度と吸
光度との関係を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】一般式： ［式中、R1はナフチル基、フェニル基又はニトロ基を有
するフェニル基、R2は低級アルキル基を示す。ただし、
R1がフェニル基でかつR2がメチル基の場合を除く。］で
表わされるアミノアンチピリン化合物、又はその塩。 - 【請求項２】一般式： ［式中、R1はナフチル基、フェニル基又はニトロ基を有
するフェニル基、R2は低級アルキル基を示す。ただし、
R1がフェニル基でかつR2がメチル基の場合を除く。］で
表わされるアミノアンチピリン化合物、又はその塩を用
いることを特徴とする分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7545486A JPH0699403B2 (ja) | 1986-04-03 | 1986-04-03 | アミノアンチピリン誘導体及びその使用法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7545486A JPH0699403B2 (ja) | 1986-04-03 | 1986-04-03 | アミノアンチピリン誘導体及びその使用法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62234070A JPS62234070A (ja) | 1987-10-14 |
| JPH0699403B2 true JPH0699403B2 (ja) | 1994-12-07 |
Family
ID=13576744
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7545486A Expired - Lifetime JPH0699403B2 (ja) | 1986-04-03 | 1986-04-03 | アミノアンチピリン誘導体及びその使用法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0699403B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6011052A (en) * | 1996-04-30 | 2000-01-04 | Warner-Lambert Company | Pyrazolone derivatives as MCP-1 antagonists |
| JP5230986B2 (ja) * | 2007-09-28 | 2013-07-10 | テルモ株式会社 | 酸化発色化合物、試薬組成物、および試験具 |
| JP5189816B2 (ja) * | 2007-09-28 | 2013-04-24 | テルモ株式会社 | 酸化発色化合物、試薬組成物、および試験具 |
-
1986
- 1986-04-03 JP JP7545486A patent/JPH0699403B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62234070A (ja) | 1987-10-14 |
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