JPH0678770A

JPH0678770A - 遺伝子増幅用プライマー

Info

Publication number: JPH0678770A
Application number: JP25889292A
Authority: JP
Inventors: Ariaki Obara; 有晶小原
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1992-09-03
Filing date: 1992-09-03
Publication date: 1994-03-22
Anticipated expiration: 2018-01-14
Also published as: JP3366999B2

Abstract

(57)【要約】【目的】柑橘系植物間の遺伝的同一性の検定に用いる遺
伝子の増幅物を提供するための、遺伝子増幅用プライマ
ーの提供。【構成】柑橘系植物の小リボゾームＲＮＡ遺伝子のう
ち、当該植物種間で高度に保存されている塩基配列を含
む遺伝子増幅用プライマー。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、柑橘系植物間の遺伝的
同一性の検定に用いる遺伝子の増幅物を提供するため
の、遺伝子増幅用プライマーに関する。

【０００２】

【従来の技術】オレンジに代表される柑橘系植物は、古
来より食用等の用途に広く用いられており、人間の生活
に最も密着している植物の一つである。そのため、より
優良な柑橘系植物品種の作出をするために、種々の品種
改良が繰り返されており、現在何百種にも及ぶ柑橘系植
物の栽培品種が確立されている。そして、これらの栽培
品種の同一性を検定するために、開花時期・結果時期・
熟期や栽培条件等の生理的特性の分析、また葉・花・果
実の構造や樹姿等の生態学的特性の観察等が詳細に行わ
れている。

【０００３】また、柑橘植物の果実あるいは果汁を主原
料とする果汁飲料においては、高品質の果実や当該果汁
を提供するために、優良な果実品種とそれに由来する原
料果汁を確保する必要がある。かかる優良な果実品種の
選定を目的として、香味試験の他に、果汁中の糖や酸の
組成等を検定するための理化学的測定手段が用いられて
いる。

【０００４】しかしながら、多くの場合、上記の方法を
実行するには品種選定の対象となる柑橘植物の成長を待
たなければならず効率的ではないことに加えて、その結
果の見極めにかなりの経験と熟練を要する。さらに、果
汁中の糖や酸の組成等を検定するための理化学的測定手
段を用いて得られる情報は少ない上、個々の農作物間の
ばらつきが大きく、直接的に品種判定をするには適して
いない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明は、上
記のような欠点がなく、迅速かつ直接的に柑橘類植物の
品種の判定を行うことが可能な手法の提供を課題とする
ものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の課題
の解決のために鋭意検討を重ねた結果、柑橘系の植物の
細胞内の小リボゾームＲＮＡ遺伝子の配列を、当該遺伝
子の増幅物として解析することで上記課題を解決するこ
とが可能であり、当該遺伝子の増幅物の提供に際して
は、柑橘系植物間で高度に保存されており、かつ解析の
対象となる遺伝子の近傍にある遺伝子配列を含むプライ
マーを用いることが有効であることを見出して本発明を
完成した。

【０００７】すなわち本願は、以下の発明を要旨とする
ものである。（１）柑橘系植物の小リボゾームＲＮＡ遺伝子のうち、
当該植物種間で高度に保存されている塩基配列を含む遺
伝子増幅用プライマー。（２）配列番号１に示される塩基配列の（１）記載の遺
伝子増幅用プライマー。（３）配列番号２に示される塩基配列の（１）記載の遺
伝子増幅用プライマー。

【０００８】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明にいう「小リボゾームＲＮＡ遺伝子」とは、リボゾ
ームを構成するサブユニットのうち、小サブユニットを
構成するリボゾームＲＮＡをコードする遺伝子であり、
全ての生物の遺伝子中に存在し、当該塩基配列中に生物
の進化に対する情報が含まれていることが判明してお
り、現在微生物の分類等に利用されている（David M.Wa
rd,Roland Weller＆Mary M.Bateson,Nature,345 ,63-65
(1990)）。そして、植物の当該遺伝子領域には、植物種
間で高度に保存された領域と、植物種間で異なる配列を
有する領域とが隣接していると推測される。

【０００９】本発明の遺伝子増幅用プライマーの基とな
る小リボゾームＲＮＡ遺伝子を保有する柑橘系植物は、
特にその種類が限定されるものではない。例えば、オレ
ンジ、グレープフルーツ、温州みかん、レモン等を例示
することができる。また、柑橘系植物以外の植物の小リ
ボゾームＲＮＡの遺伝子であっても、その保存されてい
る領域は共通する傾向にあるので、柑橘系植物とその保
存領域が共通すると推測される柑橘系植物以外の植物の
既知の当該遺伝子配列に準じて、本発明遺伝子増幅用プ
ライマーを設計・調製することができる。例えば、既知
のイネの塩基配列（Takaiwa,F.,Oono,K.＆Sugiura,M.,N
ucleic Acids Res. ,12,5441-5448(1984))より、その小
リボゾームＲＮＡ遺伝子部分の塩基配列に準じて本発明
遺伝子増幅用プライマーを設計・調製することもでき
る。なお、準じた本発明遺伝子増幅用プライマーの設計
を意図する小リボゾームＲＮＡの遺伝子の配列が未知で
ある場合には、既に確立されている手法（Weller,R.＆
D.M.Ward,Appl.environ.Microbiol.,55 ,1818-1822(198
9)、Pace,N.R.,Stahl,D.A.,Lane,D.J.＆Olsen,G.Ｊ.Ad
v.microb.Ecol.,9 ,1-55(1986) 等) を用いてその小リ
ボゾームＲＮＡの遺伝子の配列を求め、当該配列に準じ
て本発明遺伝子増幅用プライマーを設計・調製すること
ができる。

【００１０】なお、本発明遺伝子増幅用プライマーの設
計に際しては、可及的に小リボゾームＲＮＡの遺伝子の
配列中における、植物間において多様性を有する領域の
近傍の前記保存性を有する配列に準じて、当該プライマ
ーを設計するのが、増幅産物同士の識別性を高めるとい
う点において好ましい。また当該プライマーの塩基長と
しては、15〜30mer 程度、好ましくは20mer 程度に設計
する。

【００１１】上記によって、設計した本発明増幅用プラ
イマーの塩基配列に従い、当該プライマーを通常公知の
手段に従い合成することができる。例えば、β- シアノ
エチル合成法を用いた、市販の自動ＤＮＡ合成装置によ
り合成することができる。次に、このようにして合成さ
れた本発明増幅用プライマーを用いた柑橘植物の遺伝的
同一性の判定方法について説明する。

【００１２】まず、サンプルとなる果実または果汁から
は、例えばフェノール抽出法により；葉からは、例えば
CTAB法（M.G.Murray,W.F.Thompson,Nucleic Acids Re
s.,8,4321(1980）) により、サンプルの染色体ＤＮＡを
抽出する。そして、当該染色体ＤＮＡに上記の本発明増
幅用プライマーを結合条件下において結合させて、これ
にＤＮＡ合成酵素を作用させ、試料中に存在する小リボ
ゾームＲＮＡ遺伝子の一部を増幅する。かかる増幅手段
は、すでに確立している既知の手法を用いることができ
るが、特に好ましくは、いわゆるPCR 法(Saiki et al.,
Science,239,487-491(1988))が特に迅速・簡便な遺伝子
増幅方法であるという点で好ましい。

【００１３】このようにして増幅して得た増幅産物は、
電気泳動法でその存在を確認することができる。そし
て、さらに当該増幅産物のクローニングを通常公知の手
法に従って行い、得られたクローンの塩基配列を通常公
知の手段に従って決定する。かかる手法により、決定さ
れた塩基配列同士を比較検討することにより、柑橘植物
間の遺伝的同一性の検定をすることができる。

【００１４】

【実施例】以下、本発明を実施例により説明するが、本
実施例により本願の技術的範囲が限定されるものではな
い。

【００１５】

【実施例１】本発明増幅用プライマーの合成既知のイネの塩基配列（Takaiwa,F.,Oono,K.＆Sugiura,
M.,Nucleic Acids Res.,12,5441-5448(1984))のうち、
小リボゾームＲＮＡ遺伝子の塩基配列の619 番目〜638
番目に該当する塩基配列である配列番号１に示す塩基配
列の合成ＤＮＡプライマーと、同じく755 番目〜774 番
目に該当する塩基配列である配列番号２に示す塩基配列
の合成ＤＮＡプライマーを本発明増幅用プライマーとし
て設計して、これをβ- シアノエチル合成法を用いた市
販の自動ＤＮＡ合成装置（アプライド- バイオ- システ
ム社製) によって、これを合成した。

【００１６】

【実施例２】柑橘果実の品種の判定本実施例は、実施例１で得た本発明増幅用プライマーを
用いて柑橘果実の品種を比較判定しようとするものであ
る。試料は、市販のオレンジ、グレープフルーツ、温州
みかん、レモンの果実を用いた。それぞれの果実からの
染色体ＤＮＡの抽出は、果実のさのう10 gを0.3 MTris-
HCl (pH 8.0) 、0.1 M EDTA (pH 8.0) 、0.15 M NaClを
含む緩衝液 50 ml中でホモジナイザーを用いて粉砕し、
等量のフェノール-クロロホルム(1:1)を加え良く攪拌し
た後、12,000 rpmで10 分間遠心分離を行なった。上清
を分注し、等量のクロロホルムを加え良く攪拌した後、
さらに12,000 rpmで10 分間遠心分離を行なった。上清
を分注し、1/10 量の 3 M CH₃COONa (pH 5.3)と2.5 倍
量のエタノールを加え-20 ℃に一晩放置した。12,000 r
pmで10 分間遠心分離を行なった後、沈澱を 10 mM Tris
-HCl (pH 7.4)、1 mM EDTA (pH 8.0) を含む緩衝液 1 m
lに溶解し、ＤＮＡ溶液とした。

【００１７】次に、ＤＮＡの増幅は、10 mM Tris-HCl
(pH 8.3) 、50 mM KCl 、1.5 mM MgCl₂、0.001 ％(w/v)
gelatin 、200 uM dATP 、200 uM dCTP 、200 uM dGTP
、200 uM dTTP 及び 20 pmolの実施例１で合成した2
種類の増幅用プライマーを含む反応液 98.5 ulに1 ulの
ＤＮＡ溶液と0.5 ulのアンプリタックＤＮＡポリメラー
ゼ(5 Units/ul)を加え、50 ul のミネラルオイルを重層
した後、パーキンエルマーシータス社製ＤＮＡサーマル
サイクラーを用いて、94 ℃,1 分間、55 ℃,2 分間、72
℃,1 分間の条件で 25 サイクルのPCR反応を行なっ
た。PCR反応終了後、反応液の1/10 量である10 ulを5
％アクリルアミドゲル電気泳動に供し、エチジウムブロ
マイド染色後、UV照射により増幅したＤＮＡの有無およ
び長さを確認した。その結果、図１に示すようにオレン
ジ、グレープフルーツ、温州みかん、レモンのすべての
試料で、約180 bpの単一のＤＮＡのバンドが観察された
ことから、リボゾームＲＮＡ遺伝子中の目的の領域が特
異的に増幅されていることが確認された。

【００１８】さらに、増幅されたＤＮＡの塩基配列の決
定は、残りのPCR増幅産物をフェノール-クロロフォルム
抽出、クロロフォルム抽出により精製し、エタノール沈
澱により濃縮した後、10 ulの滅菌水に溶解した。7 ul
のＤＮＡ溶液に、300 mM Tris-HCl (pH 7.4)、100 mM D
TT、100 mM MgCl₂、10 mM ATP を含む反応液 1 ul、1 u
lのM13mp19 (SmaIで切断済み、0.1 ug/ul)及びT4DNAリ
ガーゼを加え、16℃で一晩連結反応を行なった。10 ul
の反応液と200 ulのXL1-Blueコンピテントセルを混合
し、1 mM IPTG,0.02％X-galを含むLB培地に蒔き形質転
換を行なった。

【００１９】組換え体を含む大腸菌からM13ファージの
一本鎖ＤＮＡを抽出し、アプライドバイオシステムズ社
製の蛍光プライマー-サイクル-シーケシング-キットを
用いてシーケンス反応を行なった後、アプライドバイオ
システムズ社製373A型DNAシーケンサーを用いて増幅さ
れたＤＮＡの塩基配列の決定を行なった。その結果、オ
レンジ、グレープフルーツ、温州みかん、レモンの試料
で配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号
６に示す塩基配列を決定した。

【００２０】決定された柑橘果実の塩基配列と既知のダ
イズの18S リボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列(Eckenro
de.V.K. et.al.,J.Mol.Evol.,21,259-269,1985)または
トマトの17S(18S)リボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列(K
iss,T. et.al.,Nucleic Acids Res.,17,2127-2127,198
9)と比較して約90％の相同性があることから、決定され
た塩基配列はリボソームＲＮＡ遺伝子の一部であると推
定され、本発明により柑橘果実から目的のリボソームＲ
ＮＡ遺伝子の検出が可能であることが示された。さら
に、決定された柑橘果実の塩基配列を比較したところ、
オレンジ果実とグレープフルーツ果実ではほぼ一致した
が、温州みかん、レモン果実とでは、2,3ケ所違いが見
られた。従って、本発明増幅用プライマーを用いること
により、柑橘果実の品種の比較判定が可能であることが
示された。

【００２１】

【実施例３】本実施例は、本発明増幅用プライマーを用
いてオレンジの葉を試料として品種を判定すること、及
びオレンジ品種内で塩基配列が保存されていることを明
らかにしようとするものである。試料は、オレンジの品
種であるバレンシア、ハムリン、ペラ、ワシントンの葉
を用いた。それぞれの葉からの染色体ＤＮＡの抽出は、
約0.5 gの成葉からCTAB法（M.G.Murray,W.F.Thompson,N
ucleic Acids Res.,8,4321(1980）) により行ない得ら
れた沈澱を 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)、1 mM EDTA (pH
8.0) を含む緩衝液 1 mlに溶解し、ＤＮＡ溶液とした。
ＤＮＡの増幅および増幅産物の確認は、実施例２に示し
た方法に従った。その結果、図２に示すようにバレンシ
ア、ハムリン、ペラ、ワシントンのすべての試料で、約
180 bpの単一のＤＮＡのバンドが観察されたことから、
成葉を試料としてもリボゾームＲＮＡ遺伝子中の目的の
領域が特異的に増幅されていることが確認された。さら
に、増幅されたＤＮＡの塩基配列の決定を実施例１に従
って行った（配列番号７、配列番号８、配列番号９、及
び配列番号10) 。その結果、決定されたバレンシア、ハ
ムリン、ペラ、ワシントンの塩基配列はほぼ一致し、さ
らに実施例１で決定されたオレンジ果実由来の塩基配列
と一致することが明らかとなった。

【００２２】従って、本発明増幅用プライマーはオレン
ジの成葉を用いてもオレンジの品種の同定が可能である
ことが示された。

【００２３】

【実施例４】本実施例は、本発明増幅用プライマー本発
明を用いて果汁飲料製造に用いられる濃縮果汁の品種を
比較判定しようとするものである。試料としては、4〜5
倍濃縮のオレンジ、グレープフルーツ、温州みかん、レ
モンの原料濃縮果汁を用いた。

【００２４】それぞれの原料濃縮果汁からの染色体ＤＮ
Ａの抽出は、1 gの原料濃縮果汁から実施例２に従って
行なった。また、ＤＮＡの増幅および増幅産物の確認
も、実施例２に従った。その結果、図３に示すようにオ
レンジ、グレープフルーツ、温州みかん、レモンのすべ
ての試料で、約180 bpの単一のＤＮＡのバンドが観察さ
れたことから、原料濃縮果汁を試料としてもリボゾーム
ＲＮＡ中の目的の領域が特異的に増幅されていることが
確認された。さらに、増幅されたＤＮＡの塩基配列の決
定を実施例２に従って行なった。その結果、どの原料濃
縮果汁の塩基配列も実施例２で決定された柑橘果実の塩
基配列とほぼ一致した（配列番号11、配列番号12、配列
番号13、配列番号14) 。

【００２５】原料濃縮果汁においてもオレンジとグレー
プフルーツを区別することができなかったが、温州みか
んとレモン果汁では、果実でも見られた特徴的な塩基の
違いが認められた。従って、本発明により原料濃縮果汁
の品種の比較判定が可能であることが示された。

【００２６】

【発明の効果】本発明により、柑橘系植物間の遺伝的同
一性の検定に用いる遺伝子の増幅物を提供するための、
遺伝子増幅用プライマーが提供される。

【００２７】

【配列表】

配列番号: １配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA プライマー配列：AGTTAAAAAGCTCGTAGTTG 配列番号：２配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA プライマー配列：GCACTCTAATTTCTTCAAAG 配列番号：３配列の長さ：114 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 PCR 法によって増幅されたDNA 起源：オレンジ配列：GAC CTT GGG TTG GGT CGG CCG GTC CGC CTC 30 GCG GTG TGC ACC GGC CGT CTC GTC CCT TCT 60 GCC GGT GAT GCG CTC CTG GCC TTA ATT GGC 90 CGG GTC GTG CCA CCG GCG CTG TTA 114 配列番号：４配列の長さ：114 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 PCR 法によって増幅されたDNA 起源：グレープフルーツ配列：GAC CTT GGG TTG GGT CGG CCG GTC CGC CTC 30 GCG GTG TGC ACC GGC CGT CTC GTC CCT TCT 60 GCC GGT GAT GCG CTC CTG GCC TTA ATT GGC 90 CGG GTC GTG CCA CCG GCG CTG TTA 114 配列番号：５配列の長さ：114 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 PCR 法によって増幅されたDNA 起源：温州みかん配列の特徴：配列番号３に表された塩基配列上の48番
目、66番目、及び80番目の塩基が置換している。

【００２８】配列：GAC CTT GGG TTG GGT CGG CCG GTC CGC CTC 30 GCG GTG TGC ACC GGC CGG CTC GTC CCT TCT 60 GCC GGC GAT GCG CTC CTG GAC TTA ATT GGC 90 CGG GTC GTG CCA CCG GCG CTG TTA 114 配列番号：６配列の長さ：114 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 PCR 法によって増幅されたDNA 起源：レモン配列の特徴：配列番号３に表された塩基配列上の66番
目、及び86番目の塩基が置換している。

【００２９】配列：GAC CTT GGG TTG GGT CGG CCG GTC CGC CTC 30 GCG GTG TGC ACC GGC CGT CTC GTC CCT TCT 60 GCC GGC GAT GCG CTC CTG GCC TTA ACT GGC 90 CGG GTC GTG CCA CCG GCG CTG TTA 114 配列番号：７配列の長さ：114 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 PCR 法によって増幅されたDNA 起源：バレンシアオレンジ配列：GAC CTT GGG TTG GGT CGG CCG GTC CGC CTC 30 GCG GTG TGC ACC GGC CGT CTC GTC CCT TCT 60 GCC GGT GAT GCG CTC CTG GCC TTA ATT GGC 90 CGG GTC GTG CCA CCG GCG CTG TTA 114 配列番号：８配列の長さ：114 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 PCR 法によって増幅されたDNA 起源：ハムリンオレンジ配列：GAC CTT GGG TTG GGT CGG CCG GTC CGC CTC 30 GCG GTG TGC ACC GGC CGT CTC GTC CCT TCT 60 GCC GGT GAT GCG CTC CTG GCC TTA ATT GGC 90 CGG GTC GTG CCA CCG GCG CTG TTA 114 配列番号：９配列の長さ：114 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 PCR 法によって増幅されたDNA 起源：ペラオレンジ配列：GAC CTT GGG TTG GGT CGG CCG GTC CGC CTC 30 GCG GTG TGC ACC GGC CGT CTC GTC CCT TCT 60 GCC GGT GAT GCG CTC CTG GCC TTA ATT GGC 90 CGG GTC GTG CCA CCG GCG CTG TTA 114 配列番号：10 配列の長さ：114 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 PCR 法によって増幅されたDNA 起源：ワシントンオレンジ配列：GAC CTT GGG TTG GGT CGG CCG GTC CGC CTC 30 GCG GTG TGC ACC GGC CGT CTC GTC CCT TCT 60 GCC GGT GAT GCG CTC CTG GCC TTA ATT GGC 90 CGG GTC GTG CCA CCG GCG CTG TTA 114 配列番号：11 配列の長さ：114 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 PCR 法によって増幅されたDNA 起源：オレンジ果汁配列：GAC CTT GGG TTG GGT CGG CCG GTC CGC CTC 30 GCG GTG TGC ACC GGC CGT CTC GTC CCT TCT 60 GCC GGT GAT GCG CTC CTG GCC TTA ATT GGC 90 CGG GTC GTG CCA CCG GCG CTG TTA 114 配列番号：12 配列の長さ：114 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 PCR 法によって増幅されたDNA 起源：グレープフルーツ果汁配列：GAC CTT GGG TTG GGT CGG CCG GTC CGC CTC 30 GCG GTG TGC ACC GGC CGT CTC GTC CCT TCT 60 GCC GGT GAT GCG CTC CTG GCC TTA ATT GGC 90 CGG GTC GTG CCA CCG GCG CTG TTA 114 配列番号：13 配列の長さ：114 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 PCR 法によって増幅されたDNA 起源：温州みかん果汁配列の特徴：配列番号11に表された塩基配列上の48番
目、66番目、及び80番目の塩基が置換している。

【００３０】配列：GAC CTT GGG TTG GGT CGG CCG GTC CGC CTC 30 GCG GTG TGC ACC GGC CGG CTC GTC CCT TCT 60 GCC GGC GAT GCG CTC CTG GAC TTA ATT GGC 90 CGG GTC GTG CCA CCG GCG CTG TTA 114 配列番号：14 配列の長さ：114 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 PCR 法によって増幅されたDNA 起源：レモン果汁配列の特徴：配列番号11に表された塩基配列上の66番
目、及び86番目の塩基が置換している。

【００３１】配列：GAC CTT GGG TTG GGT CGG CCG GTC CGC CTC 30 GCG GTG TGC ACC GGC CGT CTC GTC CCT TCT 60 GCC GGC GAT GCG CTC CTG GCC TTA ACT GGC 90 CGG GTC GTG CCA CCG GCG CTG TTA 114

【図面の簡単な説明】

【図１】柑橘果実由来の、PCR 増幅産物の電気泳動図。

【図２】オレンジ品種の葉由来の、PCR 増幅産物の電気
泳動図。

【図３】柑橘果実の濃縮果汁由来の、PCR 増幅産物の電
気泳動図。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】柑橘系植物の小リボゾームＲＮＡ遺伝子の
うち、当該植物種間で高度に保存されている塩基配列を
含む遺伝子増幅用プライマー。
【請求項２】配列番号１に示される塩基配列の、請求項
１記載の遺伝子増幅用プライマー。
【請求項３】配列番号２に示される塩基配列の、請求項
１記載の遺伝子増幅用プライマー。