JPH0670758A - 動物細胞増殖促進物質及びそれを用いた動物細胞増殖方法 - Google Patents
動物細胞増殖促進物質及びそれを用いた動物細胞増殖方法Info
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- JPH0670758A JPH0670758A JP3033805A JP3380591A JPH0670758A JP H0670758 A JPH0670758 A JP H0670758A JP 3033805 A JP3033805 A JP 3033805A JP 3380591 A JP3380591 A JP 3380591A JP H0670758 A JPH0670758 A JP H0670758A
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Abstract
(57)【要約】
〔目的〕 安定した品質を有し、且つ、安価に供給し得
る動物細胞増殖促進物質及びそれを使用した動物細胞増
殖方法を提供する。 〔構成〕 少量の牛胎児血清を含有するダルベッコ改変
ＭＥＭ培地中に、２‐（９‐メチルデシル）‐５‐（４
‐メチルペンチル）レゾルシンを０．１〜１．０ｍｇ／
ｍｌの濃度になるように添加して、マウス繊維芽細胞Ｎ
ＩＨ３Ｔ３を培養する。
る動物細胞増殖促進物質及びそれを使用した動物細胞増
殖方法を提供する。 〔構成〕 少量の牛胎児血清を含有するダルベッコ改変
ＭＥＭ培地中に、２‐（９‐メチルデシル）‐５‐（４
‐メチルペンチル）レゾルシンを０．１〜１．０ｍｇ／
ｍｌの濃度になるように添加して、マウス繊維芽細胞Ｎ
ＩＨ３Ｔ３を培養する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、２‐（９‐メチルデシ
ル）‐５‐（４‐メチルペンチル）レゾルシンを含有す
る動物細胞増殖促進物質及びそれを使用した動物細胞増
殖方法に関する。
ル）‐５‐（４‐メチルペンチル）レゾルシンを含有す
る動物細胞増殖促進物質及びそれを使用した動物細胞増
殖方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞の増殖は単に栄養分を補給するだけ
では行え得ず細胞増殖因子が存在しなければならない。
従来、この目的で動物細胞の増殖に使用されてきたのは
主として牛胎児血清等の血清である。しかしながら、血
清中には複数の細胞増殖因子が存在すると推定されてお
り、その大多数は未知の成分である。従って、血清中の
特定の成分の含有量を検査して製品の細胞増殖活性を決
定することは、現時点では不可能であり、製品によって
品質が一定しないという問題がある。また、単離、精製
された細胞増殖因子も存在するが、極めて高価であり、
これを多量に使用するのは現実的ではない。それ故、化
学構造が特定されている結果、品質の検査が容易であ
り、且つ、安価に供給し得る細胞増殖促進物質の開発が
望まれているのである。
では行え得ず細胞増殖因子が存在しなければならない。
従来、この目的で動物細胞の増殖に使用されてきたのは
主として牛胎児血清等の血清である。しかしながら、血
清中には複数の細胞増殖因子が存在すると推定されてお
り、その大多数は未知の成分である。従って、血清中の
特定の成分の含有量を検査して製品の細胞増殖活性を決
定することは、現時点では不可能であり、製品によって
品質が一定しないという問題がある。また、単離、精製
された細胞増殖因子も存在するが、極めて高価であり、
これを多量に使用するのは現実的ではない。それ故、化
学構造が特定されている結果、品質の検査が容易であ
り、且つ、安価に供給し得る細胞増殖促進物質の開発が
望まれているのである。
【０００３】本発明の主題である２‐（９‐メチルデシ
ル）‐５‐（４‐メチルペンチル）レゾルシンは、Che
m. Ber. 112, 1841−1848 (1979) に開示されている
が、その細胞増殖促進作用については一切言及されてい
ない。
ル）‐５‐（４‐メチルペンチル）レゾルシンは、Che
m. Ber. 112, 1841−1848 (1979) に開示されている
が、その細胞増殖促進作用については一切言及されてい
ない。
【０００４】
【発明が解決すべき課題】本発明の目的は、安定した品
質を有し、且つ、安価に供給し得る動物細胞増殖促進物
質及びそれを使用した動物細胞増殖方法を提供すること
にある。
質を有し、且つ、安価に供給し得る動物細胞増殖促進物
質及びそれを使用した動物細胞増殖方法を提供すること
にある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、２‐（９‐メ
チルデシル）‐５‐（４‐メチルペンチル）レゾルシン
を含有する動物細胞増殖促進物質、及び培地中に２‐
（９‐メチルデシル）‐５‐（４‐メチルペンチル）レ
ゾルシンを添加する動物細胞増殖方法の発明である。
チルデシル）‐５‐（４‐メチルペンチル）レゾルシン
を含有する動物細胞増殖促進物質、及び培地中に２‐
（９‐メチルデシル）‐５‐（４‐メチルペンチル）レ
ゾルシンを添加する動物細胞増殖方法の発明である。
【０００６】本発明者らは、血清に代わる、または血清
と共に使用することにより血清の使用量を減少させるこ
とのできる物質を鋭意探究したところ、公知物質である
２‐（９‐メチルデシル）‐５‐（４‐メチルペンチ
ル）レゾルシン（以下、活性物質という）にそのような
作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の活性物質は、従来、抗生物質としての作用につ
いて検討された物質であるが、かかる物質に細胞増殖促
進作用が確認されたことは極めて意外であった。
と共に使用することにより血清の使用量を減少させるこ
とのできる物質を鋭意探究したところ、公知物質である
２‐（９‐メチルデシル）‐５‐（４‐メチルペンチ
ル）レゾルシン（以下、活性物質という）にそのような
作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の活性物質は、従来、抗生物質としての作用につ
いて検討された物質であるが、かかる物質に細胞増殖促
進作用が確認されたことは極めて意外であった。
【０００７】以下、本発明を詳しく説明する。本発明の
活性物質によって増殖が促進される動物細胞としては、
例えば、マウス‐マウスハイブリドーマ（４Ｅ２，ＮＳ
‐１，２Ａ５）、マウスミエローマ（ＮＳ‐１，Ｐ３Ｖ
１）、マウス白血病細胞Ｐ３８８等の浮遊性細胞、マウ
ス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ｌ‐９
２９、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、ＫＢ細胞等の付着性細胞、
好ましくはマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞が挙げら
れる。
活性物質によって増殖が促進される動物細胞としては、
例えば、マウス‐マウスハイブリドーマ（４Ｅ２，ＮＳ
‐１，２Ａ５）、マウスミエローマ（ＮＳ‐１，Ｐ３Ｖ
１）、マウス白血病細胞Ｐ３８８等の浮遊性細胞、マウ
ス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ｌ‐９
２９、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、ＫＢ細胞等の付着性細胞、
好ましくはマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞が挙げら
れる。
【０００８】本発明の方法に使用することのできる培地
は、増殖される動物細胞との相性を有するものであれ
ば、特に限定されず、市販の基本培地であっても、ま
た、これらを適宜改変したものであってもよい。具体的
な基本培地としては、例えば、ＭＥＭ培地、イスコフ培
地、ＲＰＭ１１６４０培地、Ham's Ｆ‐１２培地、ダル
ベッコ変法イーグル培地、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地、
１０％ＦＢＳ加イスコフ改変ダルベッコ培地、好ましく
はダルベッコ変法イーグル培地が挙げられ、これらは単
独で使用しても２種以上を組み合わせて使用してもよ
い。通常、これら培地には、無菌状態を維持するため、
適当な抗性物質が添加され、また、ｐＨを一定に維持す
るため、適当な緩衝剤が添加される。添加される抗性物
質の具体例としては、例えば、ペニシリン、ストレプト
マイシン等が挙げられ、添加量はペニシリンの場合に
は、１００，０００UNIT／Ｌ、ストレプトマイシンの場
合には、１００ｍｇ／Ｌが好ましい。これらは単独で使
用しても２種以上を組み合わせて使用してもよい。ま
た、緩衝剤の具体例としては、炭酸水素ナトリウム等が
挙げられる。
は、増殖される動物細胞との相性を有するものであれ
ば、特に限定されず、市販の基本培地であっても、ま
た、これらを適宜改変したものであってもよい。具体的
な基本培地としては、例えば、ＭＥＭ培地、イスコフ培
地、ＲＰＭ１１６４０培地、Ham's Ｆ‐１２培地、ダル
ベッコ変法イーグル培地、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地、
１０％ＦＢＳ加イスコフ改変ダルベッコ培地、好ましく
はダルベッコ変法イーグル培地が挙げられ、これらは単
独で使用しても２種以上を組み合わせて使用してもよ
い。通常、これら培地には、無菌状態を維持するため、
適当な抗性物質が添加され、また、ｐＨを一定に維持す
るため、適当な緩衝剤が添加される。添加される抗性物
質の具体例としては、例えば、ペニシリン、ストレプト
マイシン等が挙げられ、添加量はペニシリンの場合に
は、１００，０００UNIT／Ｌ、ストレプトマイシンの場
合には、１００ｍｇ／Ｌが好ましい。これらは単独で使
用しても２種以上を組み合わせて使用してもよい。ま
た、緩衝剤の具体例としては、炭酸水素ナトリウム等が
挙げられる。
【０００９】活性物質の添加量は、培養する動物細胞に
あわせて選定するのが望ましいが、十分な細胞増殖促進
作用を発揮し得、且つ、培養系に悪影響を及ぼさない量
であれば、特に限定されない。一般的には、例えば、培
養液中の濃度が０．０５〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは
０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌとなる量が添加される。ダル
ベッコ変法イーグル培地中でマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３
Ｔ３細胞を増殖する場合は、０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌ
で良好な結果が得られる。活性物質の添加に際しては、
溶液で添加するのが好ましく、使用する溶媒は、活性物
質を溶解する溶媒であって、且つ、培養液中と相溶性の
ある溶媒であれば特に限定されない。具体的には、メタ
ノール、ジメチルスルホキシド、アセトン、好ましくは
アセトンが挙げられる。これらは単独で使用しても２種
以上を組み合わせて使用してもよい。かかる溶媒は、培
養液全量に対して２重量％以下の濃度となるよう使用す
るのが好ましい。
あわせて選定するのが望ましいが、十分な細胞増殖促進
作用を発揮し得、且つ、培養系に悪影響を及ぼさない量
であれば、特に限定されない。一般的には、例えば、培
養液中の濃度が０．０５〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは
０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌとなる量が添加される。ダル
ベッコ変法イーグル培地中でマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３
Ｔ３細胞を増殖する場合は、０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌ
で良好な結果が得られる。活性物質の添加に際しては、
溶液で添加するのが好ましく、使用する溶媒は、活性物
質を溶解する溶媒であって、且つ、培養液中と相溶性の
ある溶媒であれば特に限定されない。具体的には、メタ
ノール、ジメチルスルホキシド、アセトン、好ましくは
アセトンが挙げられる。これらは単独で使用しても２種
以上を組み合わせて使用してもよい。かかる溶媒は、培
養液全量に対して２重量％以下の濃度となるよう使用す
るのが好ましい。
【００１０】本発明は特定の活性物質に関するものであ
るが、かかる物質が主要な有効成分となっている限り、
本発明の目的を損なわない範囲で、任意に他の補助成分
を含んでも差し支えない。代表的な補助成分としては、
例えば、低密度リポ蛋白質等の栄養剤、インシュリン、
トランスフェリン、リノレイン酸、セレニウム、牛血清
アルブミン等の栄養補助剤等が挙げられる。
るが、かかる物質が主要な有効成分となっている限り、
本発明の目的を損なわない範囲で、任意に他の補助成分
を含んでも差し支えない。代表的な補助成分としては、
例えば、低密度リポ蛋白質等の栄養剤、インシュリン、
トランスフェリン、リノレイン酸、セレニウム、牛血清
アルブミン等の栄養補助剤等が挙げられる。
【００１１】本発明の活性物質の製造は、有機化学的合
成法及び微生物を利用した生物学的方法のいずれによっ
ても行うことができる。前者の方法としては、例えば、
Chem. Ber. 112, 1841−1848 (1979) に記載された方法
がある。これは、３，５‐ジメトキシベンズアルデヒド
を３‐メチルブチルマグネシウムブロマイドとのグリニ
ャール反応に付し、生成物を水素化して、５‐（４‐メ
チルペンチル）レゾルシンジメチルエーテルを製造し、
次いで、これをＮ‐メチルホルムアニリドでホルミル化
して、４‐（４‐メチルペンチル）‐２，６‐ジメトキ
シベンズアルデヒドとし、８‐メチルノニルマグネシウ
ムブロマイドとのグリニャール反応及び水素化反応を経
て本発明の活性物質のエーテル体を得、これを加水分解
する方法である。一方、後者の方法は、サイトファーガ
・ヤンソニエ（Cytophaga Jhnsonae )（ＡＪ１２５８
９）（ＦＥＲＭ Ｐ‐１２００１）を生産菌とし、これ
をカジトン培地中で培養し、得られた菌体から目的物質
を適当な溶媒で抽出する方法である。いずれの方法にお
いても、得られた活性物質を更に精製して使用する等は
任意である。
成法及び微生物を利用した生物学的方法のいずれによっ
ても行うことができる。前者の方法としては、例えば、
Chem. Ber. 112, 1841−1848 (1979) に記載された方法
がある。これは、３，５‐ジメトキシベンズアルデヒド
を３‐メチルブチルマグネシウムブロマイドとのグリニ
ャール反応に付し、生成物を水素化して、５‐（４‐メ
チルペンチル）レゾルシンジメチルエーテルを製造し、
次いで、これをＮ‐メチルホルムアニリドでホルミル化
して、４‐（４‐メチルペンチル）‐２，６‐ジメトキ
シベンズアルデヒドとし、８‐メチルノニルマグネシウ
ムブロマイドとのグリニャール反応及び水素化反応を経
て本発明の活性物質のエーテル体を得、これを加水分解
する方法である。一方、後者の方法は、サイトファーガ
・ヤンソニエ（Cytophaga Jhnsonae )（ＡＪ１２５８
９）（ＦＥＲＭ Ｐ‐１２００１）を生産菌とし、これ
をカジトン培地中で培養し、得られた菌体から目的物質
を適当な溶媒で抽出する方法である。いずれの方法にお
いても、得られた活性物質を更に精製して使用する等は
任意である。
【００１２】本発明の活性物質を使用した動物細胞の増
殖は、例えば、以下のようにして行うことができる。ま
ず、血清を含有する培地中、本発明の活性物質を用いて
増殖しようとする細胞をセミコンフルエント（Semiconf
luent ）の状態まで生育（第１次培養）させる。次い
で、これを同血清を含有する培地中に５，０００〜５
０，０００個／ｍｌ、好ましくは１０，０００〜３０，
０００個／ｍｌの濃度で播種し、第２次培養に付する。
ここで、第１次培養及び第２次培養において培地中に含
有せしめる血清としては、牛胎児血清、馬血清、牛血
清、ヒト血清、好ましくは牛胎児血清を挙げることがで
きる。第１次培養における培地中での血清の濃度は、５
〜２０％、好ましくは８〜１２％であり、これに対し、
第２次培養に使用する血清の濃度は第１次培養における
使用量の５〜２０％、好ましくは１０％である。例え
ば、ダルベッコ変法イーグル培地でマウス繊維芽細胞Ｎ
ＩＨ３Ｔ３細胞を増殖する場合、第１次培養における牛
胎児血清の濃度が１０％である場合に第２次培養では１
％でよい。この第２次培養を常法により約２〜２４時間
行った段階で、本発明の活性物質を、好ましくは溶液で
添加する。溶液で添加する場合には、活性物質の溶解に
使用した溶媒の濃度が上述のように培養液全量に対して
２重量％以下のになるよう、添加すべき活性物質の量と
溶解性とを考慮する必要がある。活性物質の添加は、一
括添加、逐次添加のいずれであってもよい。活性物質添
加後の培養条件は特別なものではなく、例えば、温度３
６〜３７℃、ｐＨ７．１〜７．４、好ましくは５％ＣＯ
2 下で行えばよい。培養後は、その細胞の使用目的に応
じて常法により処理すればよい。尚、本発明の活性物質
は、単層培養、懸濁培養、更にそれらの改良法のいずれ
にも適用できることはいうまでもよい。
殖は、例えば、以下のようにして行うことができる。ま
ず、血清を含有する培地中、本発明の活性物質を用いて
増殖しようとする細胞をセミコンフルエント（Semiconf
luent ）の状態まで生育（第１次培養）させる。次い
で、これを同血清を含有する培地中に５，０００〜５
０，０００個／ｍｌ、好ましくは１０，０００〜３０，
０００個／ｍｌの濃度で播種し、第２次培養に付する。
ここで、第１次培養及び第２次培養において培地中に含
有せしめる血清としては、牛胎児血清、馬血清、牛血
清、ヒト血清、好ましくは牛胎児血清を挙げることがで
きる。第１次培養における培地中での血清の濃度は、５
〜２０％、好ましくは８〜１２％であり、これに対し、
第２次培養に使用する血清の濃度は第１次培養における
使用量の５〜２０％、好ましくは１０％である。例え
ば、ダルベッコ変法イーグル培地でマウス繊維芽細胞Ｎ
ＩＨ３Ｔ３細胞を増殖する場合、第１次培養における牛
胎児血清の濃度が１０％である場合に第２次培養では１
％でよい。この第２次培養を常法により約２〜２４時間
行った段階で、本発明の活性物質を、好ましくは溶液で
添加する。溶液で添加する場合には、活性物質の溶解に
使用した溶媒の濃度が上述のように培養液全量に対して
２重量％以下のになるよう、添加すべき活性物質の量と
溶解性とを考慮する必要がある。活性物質の添加は、一
括添加、逐次添加のいずれであってもよい。活性物質添
加後の培養条件は特別なものではなく、例えば、温度３
６〜３７℃、ｐＨ７．１〜７．４、好ましくは５％ＣＯ
2 下で行えばよい。培養後は、その細胞の使用目的に応
じて常法により処理すればよい。尚、本発明の活性物質
は、単層培養、懸濁培養、更にそれらの改良法のいずれ
にも適用できることはいうまでもよい。
【００１３】本発明の活性物質は、動物細胞の増殖を促
進するものであり、これを培地に添加することにより、
血清の使用量を減少させることができるものである。例
えば、上述のダルベッコ変法イーグル培地でのマウス繊
維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖の場合に、本発明の活
性物質の使用により、１０％血清下と同等の細胞増殖を
行うのに、約１／１０の牛胎児血清で済む。
進するものであり、これを培地に添加することにより、
血清の使用量を減少させることができるものである。例
えば、上述のダルベッコ変法イーグル培地でのマウス繊
維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖の場合に、本発明の活
性物質の使用により、１０％血清下と同等の細胞増殖を
行うのに、約１／１０の牛胎児血清で済む。
【００１４】
【実施例】実施例１ 活性物質の製造 容量０．５Ｌの坂口フラスコに２％カジトン培地（Difc
o 社製；０．２％ＭｇＣｌ2 、ｐＨ７．２））０．１Ｌ
を張り込み、サイトファーガ・ヤンソニエ（ＡＪ１２５
８９）（ＦＥＲＭ Ｐ‐１２００１）を１白金耳接種し
て、２８℃で４０時間振盪培養した。次いで、この培養
液全量を同培地１Ｌを張り込んだ容量５Ｌの坂口フラス
コに移し、２８℃で２日間振盪培養した。得られた種母
液を同培地２０Ｌを張り込んだ容量３０Ｌのジャーファ
ーメンターに接種し、回転数２１０ｒｐｍの撹拌下、
０．２５Ｖ／Ｖ／分の流速で通気しながら、２８℃で２
４時間培養し、遠心分離して菌体２２０ｇ（湿菌体量）
を得た。この間、培地のｐＨは７．２から８．３に上昇
した。
o 社製；０．２％ＭｇＣｌ2 、ｐＨ７．２））０．１Ｌ
を張り込み、サイトファーガ・ヤンソニエ（ＡＪ１２５
８９）（ＦＥＲＭ Ｐ‐１２００１）を１白金耳接種し
て、２８℃で４０時間振盪培養した。次いで、この培養
液全量を同培地１Ｌを張り込んだ容量５Ｌの坂口フラス
コに移し、２８℃で２日間振盪培養した。得られた種母
液を同培地２０Ｌを張り込んだ容量３０Ｌのジャーファ
ーメンターに接種し、回転数２１０ｒｐｍの撹拌下、
０．２５Ｖ／Ｖ／分の流速で通気しながら、２８℃で２
４時間培養し、遠心分離して菌体２２０ｇ（湿菌体量）
を得た。この間、培地のｐＨは７．２から８．３に上昇
した。
【００１５】得られた菌体を室温にてアセトン中に一夜
浸漬し、菌体中の産生物を抽出した。抽出後、これを濾
過して不溶物を除去したのち、減圧下にアセトンを留去
し、酢酸エチルに再溶解した。この溶液を再度、濾過、
濃縮し、粗抽出物約２ｇを得た。次いで、該粗抽出物を
シリカゲル（ワコーゲルＣ‐２００；和光純薬社製）を
担体とした２回のカラムクロマトグラフィー（展開溶
媒：１回目；クロロホルム、２回目；ｎ‐ヘキサン：酢
酸エチル＝１５：１）に付したあと、更にセファデック
スＬＨ‐２０を用いてカラムクロマトグラフィー（展開
溶媒；クロロホルム：メタノール＝１：１）に付し、淡
黄色油状物約３０ｍｇを得た。
浸漬し、菌体中の産生物を抽出した。抽出後、これを濾
過して不溶物を除去したのち、減圧下にアセトンを留去
し、酢酸エチルに再溶解した。この溶液を再度、濾過、
濃縮し、粗抽出物約２ｇを得た。次いで、該粗抽出物を
シリカゲル（ワコーゲルＣ‐２００；和光純薬社製）を
担体とした２回のカラムクロマトグラフィー（展開溶
媒：１回目；クロロホルム、２回目；ｎ‐ヘキサン：酢
酸エチル＝１５：１）に付したあと、更にセファデック
スＬＨ‐２０を用いてカラムクロマトグラフィー（展開
溶媒；クロロホルム：メタノール＝１：１）に付し、淡
黄色油状物約３０ｍｇを得た。
【００１６】この物質の1 Ｈ‐ＮＭＲ、13Ｃ‐ＮＭＲ、
ＩＲ、ＦＡＢ‐ＭＳ及びＥＩ‐ＭＳの各スペクトルか
ら、２‐（９‐メチルデシル）‐５‐（４‐メチルペン
チル）レゾルシンであることを確認した。 測定結果：1 Ｈ‐ＮＭＲ 溶媒；重クロロホルム、第１
図参照13 Ｃ‐ＮＭＲ 溶媒；重クロロホルム、第２、３図参照 ＩＲ ＫＢｒディスク法、第４図参照 高分解能ＦＡＢ‐ＭＳ：ｍ／ｚ＝３４９．３０９５（Ｍ
＋Ｈ） ＥＩ‐ＭＳ：ｍ／ｅ＝３４８実施例２ 動物細胞の培養 容量５０ｍｌの無菌ボトルに牛胎児血清１０％を含有し
たダルベッコ変法イーグル培地〔日水製薬（株）製〕５
ｍｌを張り込み、これにマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３
細胞を５０，０００個接種して、３７℃、５％ＣＯ2 、
ｐＨ７．２の条件で４８時間培養した。次いで、牛胎児
血清１％を含有した同培地５ｍｌを張り込んだシャーレ
に、セミコンフルエントまで生育した細胞を２０，００
０個／ｍｌの濃度で播き、３７℃、５％ＣＯ2 、ｐＨ
７．２の条件で培養した。２時間後、このシャーレに２
‐（９‐メチルデシル）‐５‐（４‐メチルペンチル）
レゾルシンを５０マイクログラム／ｍｌの濃度で含有す
るメタノール溶液０．１ｍｌを上積添加した。これを３
７℃、５％ＣＯ2 、ｐＨ７．２の条件で２０時間培養し
た。 培養後、培養液全量中での濃度が１マイクロキュ
リー／ｍｌになるように、トリチウムチミジンのＰＢＳ
（−）バッファー溶液を添加し、更に、３７℃、５％Ｃ
Ｏ2 、ｐＨ７．２の条件で１時間培養した。培養後、培
地を除去し、１ＮＮａＯＨ２．５ｍｌを添加して細胞を
溶解した。１時間静置後、６ＮＨＣｌ０．５ｍｌを添加
して液を酸性（ｐＨ３）にした。この沈澱物をワットマ
ンＧＦ／ｃのガラスフィルターで濾取し、５％ＴＣＡ、
次いでエタノールで洗浄し、乾燥した。 得られた沈澱
物をトルエンの液体シンチレーター用カクテルに入れ、
細胞に取り込まれたトリチウムチミジンの量を測定し
た。
ＩＲ、ＦＡＢ‐ＭＳ及びＥＩ‐ＭＳの各スペクトルか
ら、２‐（９‐メチルデシル）‐５‐（４‐メチルペン
チル）レゾルシンであることを確認した。 測定結果：1 Ｈ‐ＮＭＲ 溶媒；重クロロホルム、第１
図参照13 Ｃ‐ＮＭＲ 溶媒；重クロロホルム、第２、３図参照 ＩＲ ＫＢｒディスク法、第４図参照 高分解能ＦＡＢ‐ＭＳ：ｍ／ｚ＝３４９．３０９５（Ｍ
＋Ｈ） ＥＩ‐ＭＳ：ｍ／ｅ＝３４８実施例２ 動物細胞の培養 容量５０ｍｌの無菌ボトルに牛胎児血清１０％を含有し
たダルベッコ変法イーグル培地〔日水製薬（株）製〕５
ｍｌを張り込み、これにマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３
細胞を５０，０００個接種して、３７℃、５％ＣＯ2 、
ｐＨ７．２の条件で４８時間培養した。次いで、牛胎児
血清１％を含有した同培地５ｍｌを張り込んだシャーレ
に、セミコンフルエントまで生育した細胞を２０，００
０個／ｍｌの濃度で播き、３７℃、５％ＣＯ2 、ｐＨ
７．２の条件で培養した。２時間後、このシャーレに２
‐（９‐メチルデシル）‐５‐（４‐メチルペンチル）
レゾルシンを５０マイクログラム／ｍｌの濃度で含有す
るメタノール溶液０．１ｍｌを上積添加した。これを３
７℃、５％ＣＯ2 、ｐＨ７．２の条件で２０時間培養し
た。 培養後、培養液全量中での濃度が１マイクロキュ
リー／ｍｌになるように、トリチウムチミジンのＰＢＳ
（−）バッファー溶液を添加し、更に、３７℃、５％Ｃ
Ｏ2 、ｐＨ７．２の条件で１時間培養した。培養後、培
地を除去し、１ＮＮａＯＨ２．５ｍｌを添加して細胞を
溶解した。１時間静置後、６ＮＨＣｌ０．５ｍｌを添加
して液を酸性（ｐＨ３）にした。この沈澱物をワットマ
ンＧＦ／ｃのガラスフィルターで濾取し、５％ＴＣＡ、
次いでエタノールで洗浄し、乾燥した。 得られた沈澱
物をトルエンの液体シンチレーター用カクテルに入れ、
細胞に取り込まれたトリチウムチミジンの量を測定し
た。
【００１７】第５図は、ダルベッコ変法イーグル培地中
でマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞を増殖した場合
の、培養液中の活性物質の濃度とトリチウムチミジンの
取り込み量の関係を図示したものである。
でマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞を増殖した場合
の、培養液中の活性物質の濃度とトリチウムチミジンの
取り込み量の関係を図示したものである。
【図１】重クロロホルムを溶媒として測定した２‐（９
‐メチルデシル）‐５‐（４‐メチルペンチル）レゾル
シンの1 Ｈ‐ＮＭＲスペクトルチャートである。
‐メチルデシル）‐５‐（４‐メチルペンチル）レゾル
シンの1 Ｈ‐ＮＭＲスペクトルチャートである。
【図２】重クロロホルムを溶媒として測定した２‐（９
‐メチルデシル）‐５‐（４‐メチルペンチル）レゾル
シンの13Ｃ‐ＮＭＲスペクトルチャートである。
‐メチルデシル）‐５‐（４‐メチルペンチル）レゾル
シンの13Ｃ‐ＮＭＲスペクトルチャートである。
【図３】重クロロホルムを溶媒として測定した２‐（９
‐メチルデシル）‐５‐（４‐メチルペンチル）レゾル
シンの13Ｃ‐ＮＭＲスペクトルチャート及びその部分拡
大チャートである。
‐メチルデシル）‐５‐（４‐メチルペンチル）レゾル
シンの13Ｃ‐ＮＭＲスペクトルチャート及びその部分拡
大チャートである。
【図４】ＫＢｒディスク法で測定した２‐（９‐メチル
デシル）‐５‐（４‐メチルペンチル）レゾルシンのＩ
Ｒスペクトルチャートである。
デシル）‐５‐（４‐メチルペンチル）レゾルシンのＩ
Ｒスペクトルチャートである。
【図５】ダルベッコ変法イーグル培地中でマウス繊維芽
細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞を増殖した場合の、培養液中の２
‐（９‐メチルデシル）‐５‐（４‐メチルペンチル）
レゾルシンの濃度とトリチウムチミジンの取り込み量の
関係を図示したものである。
細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞を増殖した場合の、培養液中の２
‐（９‐メチルデシル）‐５‐（４‐メチルペンチル）
レゾルシンの濃度とトリチウムチミジンの取り込み量の
関係を図示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 藤岡 耕太郎 大阪府東大阪市御厨栄町１丁目５番７号 ハウス食品工業株式会社内 (72)発明者 瀬戸 治男 東京都八王子市上野町100
Claims (5)
- 【請求項１】 ２‐（９‐メチルデシル）‐５‐（４‐
メチルペンチル）レゾルシンを含有する動物細胞増殖促
進物質。 - 【請求項２】 ２‐（９‐メチルデシル）‐５‐（４‐
メチルペンチル）レゾルシンを含有するマウス繊維芽細
胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞増殖促進物質。 - 【請求項３】 培地中に２‐（９‐メチルデシル）‐５
‐（４‐メチルペンチル）レゾルシンを添加する動物細
胞増殖方法。 - 【請求項４】 培地がダルベッコ変法イーグル培地であ
る、請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 培地中における２‐（９‐メチルデシ
ル）‐５‐（４‐メチルペンチル）レゾルシンの濃度が
０．１ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌである、請求項３
または４記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3033805A JP2895641B2 (ja) | 1991-02-28 | 1991-02-28 | 動物細胞増殖促進剤及びそれを用いた動物細胞増殖方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3033805A JP2895641B2 (ja) | 1991-02-28 | 1991-02-28 | 動物細胞増殖促進剤及びそれを用いた動物細胞増殖方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0670758A true JPH0670758A (ja) | 1994-03-15 |
| JP2895641B2 JP2895641B2 (ja) | 1999-05-24 |
Family
ID=12396698
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3033805A Expired - Fee Related JP2895641B2 (ja) | 1991-02-28 | 1991-02-28 | 動物細胞増殖促進剤及びそれを用いた動物細胞増殖方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2895641B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1057405A1 (en) * | 1999-06-02 | 2000-12-06 | MG Pharmacy Ltd. | A storage agent for preservation of animal cells, tissues or organs, and corresponding process |
| JP2010233580A (ja) * | 1997-02-14 | 2010-10-21 | Life Technologies Corp | 乾燥粉末細胞および細胞培養試薬ならびにこれらの生成方法 |
-
1991
- 1991-02-28 JP JP3033805A patent/JP2895641B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010233580A (ja) * | 1997-02-14 | 2010-10-21 | Life Technologies Corp | 乾燥粉末細胞および細胞培養試薬ならびにこれらの生成方法 |
| JP2014054267A (ja) * | 1997-02-14 | 2014-03-27 | Life Technologies Corp | 乾燥粉末細胞および細胞培養試薬ならびにこれらの生成方法 |
| JP2016152821A (ja) * | 1997-02-14 | 2016-08-25 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 乾燥粉末細胞および細胞培養試薬ならびにこれらの生成方法 |
| EP1057405A1 (en) * | 1999-06-02 | 2000-12-06 | MG Pharmacy Ltd. | A storage agent for preservation of animal cells, tissues or organs, and corresponding process |
| KR20010029692A (ko) * | 1999-06-02 | 2001-04-06 | 슐양자 | 동물의 세포 또는 장기의 보존제 및 그 보존방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2895641B2 (ja) | 1999-05-24 |
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