JPH066072B2 - ポリアミンの測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は酵素法によるポリアミンの測定方法に関するも
のである。

〔従来の技術及び問題点〕

ポリアミンは、自然界に広く分布する非蛋白性低分子量
の脂肪族塩基性化合物で、種々の生理活性を有し蛋白質
合成の促進や酵素活性の発現、核酸の代謝等に重要な役
割を果たし生体反応と深いかかわりをもっている。哺乳
動物の生体内ではプトレッシン、カダベリン、スペルミ
ジン及びスペルミンが主なもので、これら四種のポリア
ミンをまとめて総ポリアミンと称している。

またポリアミンは細胞増殖と深いかかわりを持つため、
細胞増殖の盛んな癌細胞を有する癌患者においては、血
液、尿等いわゆる体液中の総ポリアミン量が健常人に比
して著しく増加することが報告されている。従って体液
中総ポリアミンの測定は癌の有力な診断法として、また
癌の治療効果の判定や予後の診断等、癌床検査分野での
幅広い応用が期待されている。

また総ポリアミン測定方法も種々の方法が報告されてい
る。例えば、特公昭５６−３６９１８号，特開昭５９−
２７００号、特開昭５８−１４１７９８号などがある。

このうち特公昭５６−３６９１８号方法は、ポリアミン
を含有する試料に発芽大豆由来のアミンオキシダーゼを
作用させ、生成する過酸化水素を定量する方法であり、
特開昭５９−２７００号方法は、ポリアミンを含有する
試料にあらかじめアスコルビン酸オキシダーゼを作用さ
せて還元性物質を除去したのち、発芽大豆由来のアミン
オキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を定量す
る方法である。しかしながらこの両者の総ポリアミン測
定方法は次の欠点を有している。すなわちポリアミンの
酸化に使用する発芽大豆由来のアミンオキシダーゼは、
プトレッシン、カダベリン及びスペルミジンからは１モ
ルの過酸化水素を生成するがスペルミンからは２モルの
過酸化水素を生成するので、試料中の総ポリアミンモル
数に対応した過酸化水素生成とはならない。従ってこれ
らの方法で求めた総ポリアミン量は真値から正の誤差を
持つことになる。従って、スペルミンの含量の多い試料
例えば血液を試料とした場合には、これらの総ポリアミ
ン測定法は誤差が大きくなり使用不可能であった。

一方特開昭５８−１４１７９８号方法は、ポリアミンの
酸化にミクロコッカス・フラビダスのプトレッシンオキ
シダーゼを使用するポリアミンの分析法で優れた方法の
１つである。しかし、このプトレッシンオキシダーゼの
基質特異性が総ポリアミンのうちのスペルミンに対して
弱く、スペルミン含量の多い試料例えば血液を試料とし
て用いるとき今一歩満足出来ない傾向がある。

また、ポリアミンを含有する試料にミクロコッカス・ロ
ーゼウスのプトレッシンオキシダーゼとトウモロコシ由
来のポリアミンオキシダーゼを組み合わせて作用させる
ことにより、総ポリアミンの測定する方法も提案されて
いる。この方法は優れたポリアミンの測定法であるがト
ウモロコシ由来のポリアミンオキシダーゼは、スペルミ
ンに対するミカエリス定数（Km値）が比較的大きく、ま
た酵素生成性が低い傾向があり、多少不安定なため精製
に難がある。そのため、測定時間が長くかかりかつ測定
感度が低い正確性に欠ける場合もあり、十分に満足出来
るまでに至っていない。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者等はこのような状況に鑑み、煩雑な操作を必要
とせず、経済的・迅速かつ正確に総ポリアミン量を測定
する方法を開発すべく研究を重ねた。その結果、カラス
ムギ由来のポリアミンオキシダーゼがポリアミンに対す
るKm値が非常に小さいうえ、生産性が高く且つ該ポリア
ミンオキシダーゼとプトレッシンオキシダーゼを組み合
せしかもあるＰＨ範囲で反応させることにより、両ポリ
アミン酸化酵素がポリアミンに正確かつ迅速に作用する
という知見を得、本発明を完成するに至った。

即ち本発明は、ポリアミンを含有する試料にポリアミン
酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を定量するこ
とにより試料中の遊離のポリアミン量を求めるに際し、
該ポリアミン酸化酵素として、カラムスギ由来のポリア
ミンオキシダーゼ及びプトレッシンオキシダーゼをＰＨ
６．５〜９．３の範囲で作用させることを特徴とするポ
リアミンの測定方法である。

本発明においてポリアミンを含有する試料としては、
尿、血液、リンパ液、腹水、胸水、精液、だ液等あらゆ
る体液更には微生物培養液や動植物の組織が使用出来
る。また該試料中に測定阻害物質例えば着色物質、還元
物質が含まれるときは該試料に適当な前処理をほどこし
て使用するのが好ましい。該前処理の方法は試料によっ
て異なるが、イオン交換樹脂やシリカゲルを利用したポ
リアミンの抽出、有機溶媒によるポリアミンの抽出、ト
リクロロ酢酸や過塩素酸による除蛋白処理等が適宜用い
られる。またアセチル複合体ポリアミンなどの非遊離の
ポリアミンを含む試料例えば尿等の試料については、あ
らかじめ４〜１０規定塩酸やアシルポリアミン加水分解
酵素等による加水分解処理を行ない、すべて遊離のポリ
アミンに変換したのち本測定用の試料とするのが好まし
い。

また本発明で使用するポリアミンオキシダーゼは、カラ
スムギ由来のポリアミンオキシダーゼである必要があ
る。オキシダーゼは発芽カラスムギ中に大量に含有され
ている。

（約１０単位／グラム・芽）該カラスムギからの抽出方
法は特に限定されないが一般に例えば次の方法により調
製できる。例えばカラムスギの芽に０．１Ｍ塩化ナトリ
ウム溶液を加えてホモジネートし、ガーゼ等で濾過した
濾液に硫酸アンモニウムを加えて塩析する。遠心分離で
沈殿を採取し、この沈殿に０．０５Ｍ−クエン酸緩衝液
（ＰＨ６．０）を加えて沈殿を溶解したのち、同緩衝液
で透析する。この程度の部分精製酸素でも十分実用に耐
え得る。勿論必要に応じて再に精製して使用すればよ
い。

更に本発明で使用する他のポリアミン酸化酵素はプトレ
ッシンオキシダーゼである。該プトレッシンオキシダー
ゼは、総ポリアミンのうちの少なくともプトレッシン及
びカダベリンと反応し且つ反応性を有するポリアミンを
酸化した後、各々１モルの過酸化水素を生成するもので
あればいずれもでもよい。一般に好適に使用されるもの
を例示すればミクロコッカス・フラビダスのプトレッシ
ンオキシダーゼやミクロコッカス・ローゼウスのプトレ
ッシンオキシダーゼ等があげられる。これらのプトレッ
シンオ キシダーゼは、微生物菌体内より公知の生化学
的手法を用いて調製すればよい。

本発明においては、前記ポリアミンオキシダーセとして
カラスムギに由来のポリアミンオキシダーゼを使用し、
しかも該ポリアミンオキシダーゼをプトレッシンオキシ
ダーゼと組合せて使用することが必要である。しかしな
がら、カラスムギ由来のポリアミンオキシダーゼのどの
ような機能又は因子がプトレッシンオキシダーゼと作用
し、本発明の作用効果を発揮するのかその作用機構は現
在なお明らかではない。

本発明においては、また上記ポリアミン酸化酵素をＰＨ
６．５〜９．３好ましくは６．８〜９．０の範囲で作用
させることも重要な要因である。該ＰＨの調製は試料の
ＰＨ調製を実施することで行ってもよいが一般には緩衝
液を使用すると好適である。該緩衝液は緩衝作用を有す
るものであれば種類を問わず、例えばリン酸化緩衝液、
トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液及び一連
のグッド緩衝液等が好適に用いられる。該ＰＨの調製は
総ポリアミンを測定しようとする試料にポリアミン酸化
酵素を加える前に上記緩衝液で行うのが望ましいが、緩
衝液に溶解したポリアミン酸化酵素を加えることによっ
て同時に試料のＰＨ調整することも可能である。

本発明における前記ポリアミン酸化酵素の作用温度は特
に限定されず適宜選択して採用すればよいが一般には２
０゜C〜４５゜C好ましくは３０゜C〜４０゜Cの範囲が好適で
ある。

本発明においては前記ポリアミン酸化酵素の作用によ
り、試料中の総ポリアミン量に対応したモル数の過酸化
水素が生成する。この生成した過酸化水素を測定するこ
とによりポリアミン量を求めることが出来る。該過酸化
水素の定量には公知の過酸化水素定量法のいずれでも適
用できる。例えばペルオキシダーゼの存在下、４−アミ
ノアンチピリンと水素供与体である色原体とを過酸化水
素によって酸化縮合させ、生成した色素を比色する方法
が好適である。この場合の色原体としては、フェノー
ル，２，４−ジクロロフェノール，Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイ
ジン・ナトリウム塩、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリ
ン・ナトリウム塩及びジエチルアニンなどが用いられ
る。

本発明における試料中の総ポリアミン量の求め方は特に
限定されないが例えば次の方法で求められる。既知濃度
（Ｃｐ）のポリアミン標準液を調製し、該ポリアミン標
準液と試料とを同じ操作で反応させ、生成した過酸化水
素を前記の定量法に従い発色させ、測定したポリアミン
標準液の吸光度（Ｅｓ）と試料の吸光度（Ｅｔ）及び試
薬盲検の吸光度（Ｅｂ）から式１に従って計算する。

式１ 〔作用及び効果〕 本発明の特徴の１つは、プトレッシンオキシダーゼとカ
ラスムギ由来のポリアミンオキシダーゼを組み合せるこ
とである。両者を組み合せて作用させることにより、１
段階で試料中の総ポリアミン量に対応したモル数の過酸
化水素を生成させ、該過酸化水素を定量することにより
試料中の総ポリアミン量を経済的かつ正確に求めること
ができる。

本発明のもう１つの特徴は、ポリアミンに対するKm値の
非常に小さいカラスムギ由来のポリアミドオキシダーゼ
とプトレッシンオキシダーゼを組み合せて特定のＰＨ範
囲で作用させることにより、全ポリアミンの酸化反応が
非常に速く完了することである。作用ＰＨ範囲としては
前記のようにＰＨ６．５〜９．３好ましくはＰＨ６．８
〜９．０更に好ましくはＰＨ７．２〜８．２が好適であ
る。このＰＨ範囲で両ポリアミン酸化酵素を組み合せる
効果を具体的に示す。

表−１はプトレッシン２０nmole／ｍ及びスペルミン
２０nmole／ｍを基質とし、０．１Ｍトリス−塩酸緩
衝液（ＰＨ８．０）中、３０゜Cで、カラムスギ由来のポ
ルアミンオキシダーゼ０．２単位のみを作用させた場合
と、ミクロコッカス・フラビダス由来のプトレッシンオ
キシダーゼ２．０単位のみを作用させた場合と、及び両
者を共に作用させた場合の反応時間と吸光度の関係を示
したものである。表−１に示される結果を第１図として
表わす。第１図中、の曲線はカラムスギ由来のポリア
ミンオキシダーゼ０．２単位のみを作用させた場合を、
の曲線はミクロコッカス・フラビダス由来のプトレッ
シンオキシダーゼ２．０単位のみを作用させた場合を、
の曲線は両者を共に作用させた場合を示している。

両者を共に作用させた場合、全ポリアミン量（この場合
プトレッシン＋スペルミン）に対応した発色強度が得ら
れるのみでなく、プトレッシンオキシダーゼを単独で作
用させたときプトレッシンオキシダーゼが基質（プトレ
ッシン）をすべて酸化するに要する時間（約１５分）よ
りはるかに速く（約７．５分）全ポリアミンを酸化し終
っている。

表−２には表−１と同じ実験を反応液のＰＨを変えて行
なった結果を示す。ＰＨと反応完了に要する時間（反応
時間）との関係を示す。ＰＨ緩衝液としてＰＨ５．０〜
６．０では０．１Ｍクエン酸緩衝液を、ＰＨ６．５〜
７．０では０．１Ｍリン酸緩衝液を、ＰＨ７．５〜９．
０では０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液を、ＰＨ９．５〜１
０．０では０．１Ｍホウ酸緩衝液を使用した。表中プト
レッシンオキシダーゼをＰＵＯと、ポリアミンオキシダ
ーぜをＰＡＯと、プトレッシンをＰｕｔと、スペルミン
をＳｐｍと略記した。

本反応条件において、ＰＨ６．５〜９．３の範囲では著
しく短時間で酸化が可能で特にＰＨ６．８〜９．０では
全ポリアミンを３０分以内に酸化できる。更にＰＨ７．
２〜８．２の範囲では反応は１０分以内に完了し、プト
レッシンオキシダーゼを単独で作用させたとき全プトレ
ッシンを酸化するに要する時間の半分程度となってい
る。もちろんこの反応時間は使用するそれぞれの酵素量
を変えることにより変動する。

この現像はおそらく、プトレッシンオキシダーゼが基質
類似体であるスペルミンによって阻害を受けるが、カラ
スムギ由来のポリアミンオキシダーゼは基質類似体であ
るプトリレッシンで阻害を受けず、しかも該ポリアミン
オキシダーゼのスペルミンに対すKm値が非常に小さいた
め、試料中のスペルミンはすみやかに酸化され消失す
る。スペルミンの消失に伴ないプトレッシンオキシダー
ゼにかかっていたスペルミンによる阻害は短時間のうち
に軽減され、プトレッシンオキシダーゼの酸化反応も迅
速に完了できるのであろう。

次に実施例において本発明を更に詳細に説明する。尚実
施例におけるプトレッシンオキシダーゼ、ポリアミンオ
キシダーゼ及びペルオキシダーゼの活性は下記測定法に
よって求めた。

(1)プトレッシンオキシダーゼの活性測定法０．１Ｍリ
トス−塩酸緩衝液（ＰＨ８．０）１００ｍに４−アミ
ノアンチピリン１０．２mg、２，４−ジクロロフェノー
ル４．９mg，ペルオキシダーゼ（シグマ社製、タイプI
I）５mgを溶解し発色液とする。発色液０．７５ｍに
５ｍＭプトレッシン０．１５ｍを加え３０゜Cで３分間
保温したのち、酸素液０．０５ｍを添加し反応させ
る。反応開始後１分間の５１０ｎｍにおける吸光度の上
昇（ΔＡ５１０）を測定し、式２に従って酵素活性を計
算する。なおこの場合の発色の分子吸光係数として９，
６００（Ｍ^−１cm^-1）を用いている。プトレッシンオキ
シダーゼ１単位とは、ＰＨ８．０，３０゜Cにおいて毎分
１nmoleのプトレッシンを酸化する酵素量である。

式２ (2)ポリアミンオキシダーゼの活性測定法 前記(1)のプトレッシンオキシダーゼの活性測定法にお
いて、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ＰＨ８．０）の変
わりに０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６．５）を使用し、
基質の５ｍＭプトレッシンの変わりに５ｍＭスペルミン
を使用すれば、(1)と全く同様にしてポリアミンオキシ
ダーゼ活性を求められる。

(3)ペルオキシダーゼの活性測定法 グアヤコール０．２２ｍを１００ｍの精製水に溶解
しグアヤコール試薬とする。３０％過酸化水素水０．０
８３ｍを１００ｍの精製水に溶解して過酸化水素試
薬とする。

０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７．０）３．０ｍにグア
ヤコール試薬０．０５ｍと過酸化水素試薬０．２０ｍ
を加え、３０゜Cで３分間保温したのち、酵素液０．０
５ｍを添加し反応させる。反応開始後１分間の４３６
ｎｍにおける吸光度の上昇（ΔＡ４３６）を測定し、式
３に従って酵素活性を計算する。

式３ また以下の実施例で使用す試薬類の略記は下記の定義の
通りである。

標準液：３０nmole／ｍ プトレッシン水溶液。

緩衝液Ａ：０．４Ｍトリス−塩酸緩衝液（ＰＨ８．０） 酵素試薬Ａ：アシルポリアミン加水分解酵素３０単位／
ｍを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７．２）。

溶血液：１、５ｇ トリトン×−１００を含む０．１Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（ＰＨ８．０） カラムＡ：弱酸性カチオン交換樹脂０．１２ｇを充填し
たミニカラム。

脱着液Ａ：０．４Ｍトリクロロ酢酸溶液。

脱着液Ｂ：０．４Ｍ塩酸溶液。

中和液：０．３Ｍトリス−（ヒドロキシメタル）−アミ
ノメタン溶液。

酵素試薬Ｂ：プトレッシンオキシダーゼ（ミクコッカス
・フラビダス由来）２．０単位／ｍ、ポリアミンオキ
シダーゼ（カラスムギ由来）０．２単位／ｍ、ペルオ
キシダーゼ（シグマ社製、タイプII）１０単位／ｍ、
４−アミノアンチピリン０．３mg／ｍ、２，４−ジク
ロロフェノール１．５mg／ｍを含む０．１Ｍトリス−
塩酸緩衝液（ＰＨ８．０） 更にまた以下の実施例において、プトレッシンはＰｕｔ
と、カダベリンはＣａｄと、スペルミジンはＳｐｄと、
スペルミンはＳｐｍとそれぞれ略記する。

実施例１ ４−アミノアンチピリ１０．２mg，２，４−ジクロロフ
ェノール４．９mg、ペルオキシダーゼ３３０単位を０．
１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ＰＨ７．８）に溶解し発色試
薬Ａとした。

発色試薬Ａ２．８２ｍに基質液として２ｍＭＰｕｔ又
は２ｍＭＣａｄ又は２ｍＭＳｐｄ又は２ｍＭＳｐｍ又は
これら四種ポリアミン溶液の１：１：１：１の混合液の
いずれかを０．０８ｍ添加し、３７゜C３分間保温す
る。保温後ミクロコッカス・フラビダス由来のプトレッ
シンオキシダーゼ２０単位のみ、又はカスラスムギ由来
のポリアミンオキシダーゼ０．２単位のみ、又はプトレ
ッシンオキシダーゼ２０単位とカラスムギ由来のポリア
ミンオキシダーゼ０．２単位の両方のいずれかの酵素を
加え（添加量はいずれも０．１ｍ）、混合液３７゜Cで
１０分間反応させたのち、精製水を対照として５１０ｎ
ｍにおける吸光度を測定した。結果は表−３に示した。

実験番号１〜５により、このプトレッシンオキシダーゼ
がＰｕｔ．Ｃａｄ及びＳｐｄを基質とし、等モルの過酸
化水素を生成していることがわかる。０．０１０の吸光
度は試薬盲検に相当する。実験番号５でＰｕｔ．Ｃａｄ
及びＳｐｄの総量に相当する吸光度（およそ０．６１）
が得られていないのは、Ｓｐｍの阻害により反応がまだ
完了していないからである。実験番号６〜１０により、
カラスムギ由来のポリアミンオキシダーゼがＳｐｄ及び
Ｓｐｍを基質とし等モルの過酸化水素を生成しているこ
とがわかる。実験番号１１〜１５から、両酵素を組み合
わせることにより、いかなる組成のポリアミン試料でも
総ポリアミン量が正確かつ迅速に測定できることが判
る。

実験例２ 精製水、標準液、尿、各１２．５nmole／ｍのＰｕ
ｔ，Ｃａｄ，Ｓｐｄ，Ｓｐｍを添加した尿（添加尿
１）、各２５．０nmole／ｍのＰｕｔ，Ｃａｄ，Ｓｐ
ｄ，Ｓｐｍを添加した尿（添加尿２）の５本を試料と
し、以下の測定操作に従い総ポリアミン量を測定した。

〔測定操作〕

(1)試料１．０ｍに緩衝液Ａ１．０ｍと酵素試薬Ａ
１．０ｍを添加し攪拌後３７゜Cで１時間保温して、ア
セチルポリアミンを遊離化する。

(2)３０００rpm、５分間遠心分離し、上澄液全量をカラ
ムＡに流し込みポリアミンをイオン交換樹脂に吸着させ
る。

(3)精製水３．０ｍでカラムＡを洗浄する。

(4)脱着液Ａ１．０ｍでポリアミンを溶出し、中和液
１．０ｍを加えて中和する。（ＰＨは約８．０とな
る） (5)酵素試薬Ｂを１．０ｍ添加し、３７゜Cで１０分間
保温後、精製水を対照に５１０ｎｍにおける吸光度を測
定する。

本測定操作に基づく５本の試料の吸光度は表−４のとお
りであった。また前述の式１により計算したポリアミン
量もあわせて記す。

表中の値から添加回収率を計算すると、添加尿１は９
７．６％、添加尿２は９８．３％と良好であり、尿中ポ
リアミン量が正しく測定されたことが判る。

実施例３ 精製水、標準液、血液、各１２．５nmole／ｍのＰｕ
ｔ，Ｃａｄ，Ｓｐｄ，Ｓｐｍを添加した血液（添加血液
１）、各２５．０nmole／ｍのＰｕｔ，Ｃａｄ，Ｓｐ
ｄ，Ｓｐｍを添加した血液（添加血液２）の５種類を試
料とし以下の測定操作に従い総ポリアミン量を測定し
た。３種類の血液試料については各１０本ずつ測定し同
時再現性試験を行った。

〔測定操作〕

(1)試料１．０ｍに溶血液３．０ｍを添加し、赤血
球を溶血する。

(2)３０００rpm５分間遠心分離し、上澄液全量をカラム
Ａに流し込みポリアミンをイオン交換樹脂に吸着させ
る。

(3)精製水３．０ｍ×２回、カラムＡを洗浄する。

(4)脱着液Ｂ１．０ｍでポリアミンを溶出し、中和液
１．０ｍを加えて中和する。（ＰＨは約８．０とな
る） (5)酵素試薬Ｂを１．０ｍ添加し、３７゜Cで１０分間
保温後、精製水を対照に５１０nmにおける吸光度を測定
する。

表−５には同時再現在試験結果が示される。

同時再現性は２％以下と非常に良好であり、本測定法に
より血液中総ポリアミン量が精度よく測定できることが
判る。

表−６には５種の試料の吸光度とポリアミン値が示され
る。血液試料については１０本の平均値を採用した。

表中の値から添加回収率を計算すると、添加血液１は９
９．４％、添加血液２は１００．９％と非常に良好であ
り、本測定法により血液が中総ポリアミン量が正確に測
定されることが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プトレッシン及びスペルミンを含む系にスラ
スムギ由来のポリアミンオキシダーゼのみを作用させた
場合の反応時間と生成過酸化水素に基づく吸光度の変化
との関係を示すグラフを曲線に、同様にプトレッシン
オキシダーゼのみを作用させたときのグラフを曲線に
及び両酵素を共に作用させたときのグラフを曲線にそ
れぞれ示した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ポリアミンを含有する試料にポリアミン酸
   化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を定量すること
   により試料中の遊離のポリアミン量を求めるに際し、該
   ポリアミン酸化酵素としてカラスムギ由来のポリアミン
   オキシダーゼ及びプトレッシンオキシダーゼをＰＨ６．
   ５〜９．３の範囲で作用させることを特徴とするポリア
   ミンの測定方法。