JPH06510560A - β−１，３−グルカン多糖類、それを含む組成物、およびその製造と使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 β−１，３−グルカン多糖類、それを含む組成物、およびその製造と使用 本発明はβ−１，３−グルカン多糖類、それらを含む組成物、それらの製造法、 およびそれらの使用に関する。

β−１，３−グルカン多糖類について多数の特許および技術文献か刊行された。

たとえば、Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｇｅｔｓ　Ｆｏｒｍｅｄ　ｂｙ　Ｈｅ ａｔ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｕｒｅｌｌａｎ、ａ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ 　β−１，３−Ｇｌｕｃａｎ”と題するＭｏ　ｅ　ｄ　ａらのＡｇｒ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、、のＶｏｌ、３１゜Ｎｏ、１０．１１８４−１１８８．１９６７の 輯文は、ポレートの存在かゲル強度を増大させたかその他の塩類の添加はゲル強 度を増大させなかったという発見を含めて、水性懸濁液中で加熱したときのその ゲル形成の性質、およびゲル強度に及ぼすｐＨの効果の研究、を検討した。尿素 添加がゲル形成温度の低下を生ぜしめたことも発見された。

米国特許第４，７７４，０９３号には５５°Ｃ以下の温度で水性媒質中にβ−１ ，３−グルカン多糖類をとかし、生成溶液を５０℃以上の然し６０°Ｃ以下の温 度に保持しながらｐＨをｌ０１０以下に調節することによるβ−１，３−グルカ ン多糖類ゲルの製造か記載されている。生成ゲルは実質的に均一なｐＨて凝集、 均一の非粒子状構造をもつ。このゲルは、医薬用の放出コーティングまたは担体 として、ハミガキ用の食用ゲルとして、生物学的材料のゲル・コーティングとし て、および使い捨てコンタクトレンズとして、生物学的材料の支持、分離、輸送 または処理のために使用される。

米国特許第４．０１２．３３３号にはβ−１，３−グルカン型多糖類の塩基性溶 液をガス状の酸無水物たとえば二酸化炭素および窒素やイ才つの酸化物、の雰囲 気にさらすことによってβ−１，３−グルカン型多糖類からゲルを製造する方法 が記載されている。

米国特許第４，９５０，７４９号は、可溶化グルカンの溶液に２価カチオンを加 え、次いで溶液をアルカリ性ｐＨに調節してグルカンを沈澱させることによって 、非イオン性水溶性グルカンを回収する方法に関する。この水溶性グルカンはス クレログルカンおよびシゾフィランを含む。

欧州特許出願第０３６７３９１号には小直径の管を通して２８５°Ｃの温度でカ ードランの水性懸濁液を加熱することによって線状カートラン・ゲルを製造する ことが記載されている。このゲルは食品材料として有用である。カードランと海 草エキスなどとのブレンドも記載されている。

米国特許第５，００２，６６９号にはラセミ混合物の分離、たとえば幾何学的異 性体の分離、および異なった分子量範囲をもつポリマー類の分離に１．　３−グ ルカンおよびその誘導体を使用することが記載されている。

米国特許第４，９７３，５８１号にはガラクトピラノース、Ｌ−アラビノフラノ ース、およびそれらの誘導体およびオリゴマーの側鎖ブランチをもつグルカン誘 導体が記載されている。これらのグルカン誘導体は高い殺腫瘍活性を示す。

”５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ＡｎａＩｙｓｉｓ　ｏ ｆ　Ｃｕｒｄｌａｎ　５ｕｌｆａｔｅ　ｗｉｔｈａ　Ｐｏｔｅｎｔ　Ｉｎｈｉｂ ｉｔｏｒｙ　Ｅｆｆｅｃｔ　１ｎＶｉｔｒｏ　ｏｆ　ＡＩＤＳ　Ｖｉｒｕｓ　Ｉ ｎｆｅｃｔｉｏｎ’と題するヨシダらのＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｖｏｌ 、２３゜Ｎｏ、１６．３７１７−３７２２．１９９０年の報文には、硫酸カ−ト ランが製造され、試験管内でのＨＩＶウィルスに対して試験されている。

β−１，３−グルカン多糖類は殆ど独占的にβ−１，３−ゲルコンド結合を含む エキソ−３−グルカンポリマーである。アガロースを除いて、これらの多糖類は 中性ｐＨをもち、低濃度で比較的強固なヒドロゲルを形成する唯一の現在知られ ている多糖類である。β−１，３−グルカン多糖類は天然に広く分布し、イース トの細胞壁中に、陸上および海中の植物中に、および種子細胞中に存在する。

それらは微生物醗酵によっても製造することができる。β−１，３−グルカンを 生産する微生物として、アルカリ土類金属、アグロバクテリウム属およびストレ プトコツカス属のバクテリア、があげ各種およびストレプトコッカス　ミュータ ンス種がそれらの変異および突然変異を含めて広く知られている。バクテリアで 生産されるβ−１，３−グルカン多糖類はカードランとしても知られており、本 発明の実施に使用するのに好ましい。

ゲル形成性β−１，３−グルカン多糖類は水性塩基には可溶であるか水および水 性の酸には不溶である。

β−１，３−グルカン多糖類は食品の用途に始め使用されたが、天然不純物の濃 度のためにバイオ技術およびバイオ医薬の用途には有用でなかった。たとえば精 製していない醗酵β−１，３−グルカンはかなりな量の細胞片、核酸、タンパク 、酸性多糖類、などを含む。技術の進歩は米国特許第４，７７４，０９３号の臨 界温度中和法のような便利で経済的なゲルの製造法をもたらし、この方法はバイ オ技術の用途を含む広範囲の用途に生成ゲルを使用しうるようにしたけれとも、 臭化エチジウムで汚染されたときに背景の蛍光を実質的に示さず、２６０ｎｍで 実質的にベースラインＵＶ吸収を示すゲルを形成する透明なゲル形成性ゾルをも たらす実質的に純粋なβ−１，３−グルカン多糖類を予め得たものはなかった。

従って、従来技術のβ−１，３−グルカン多糖類ゲルは上記の性質をもつゲルの 使用を必要とするＤＮＡ電気泳動に均一に有用ではなかった。

本発明の態様■は実質的に純粋なβ−１，３−グルカン多糖類の製造法、この方 法で製造した実質的に純粋なβ−１，３−グルカン多糖類、それらを含む水性ゲ ル、およびＤＮＡｔ気泳動における使用を含むバイオ技術およびその他の用途に おけるこの水性ゲルの使用である。

本発明の態様［１は実質的に純粋なβ−１，３−グルカン多糖類の水溶性塩の製 造法、このようにしてえられた水溶性塩、およびそれらの使用である。

本発明の態様ＩＩＩはβ−１，３−グルカン多糖類ゲルの製造における力オトロ ビン剤の使用、カオトロビン剤の除去後にえられるゲル、カオトロピン剤を除去 していないゲル、および上記ゲルのすへての使用である。

本発明の態様１ｖは実質的に純粋なβ−１，３−グルカン多糖類の誘導体の製造 法、これらの誘導体を用いてえられる水溶性可逆性ゲル、およびそれらの使用で ある。

本発明の態様Ｖは実質的に純粋なβ−１，３−グルカン多糖類を含む共処理され たヒドロコロイド組成物、およびこれらの組成物の使用である。

本発明の態様ｖ１は照射された実質的に純粋なβ−１，３−グルカン多糖類、そ れらから生成されたゲル、およびこれらのゲルの使用である。

操作実施例以外に、または他に示した場所において、ここに使用する成分または 反応条件の量を表すすべての数字は、すべての場合に「約」なる用語によって変 形されるものと理解されるべきである。

実質的に純粋なβ−１，３−グルカン多糖類（以下“β−１，３−グルカンと呼 ぶ）の製造および特に実質的に純粋なカードランの製造に特に有用な本発明の方 法は次の諸工程を使用して行われる。

１　粗β−１，３−グルカン、たとえば日本の武田薬品工業株式会社によって販 売されているカードラン、を炭酸カリウムまたは炭酸ナトリウムのような水性炭 酸アルカリ金属で洗浄する。炭酸ナトリウムが好ましい。水溶液は好ましくは０ ．１−１０重量％の炭酸アルカリ金属を含む。１重量％が好ましい。水性炭酸ア ルカリ金属溶液のｐＨを７．０〜９．５好ましくは８．５に保つ。上記のｐＨ範 囲は緩衝液の使用によって容易に保持することができるがＮａｔＣＯ，／ＮａＨ ＣＯ，緩衝液が好ましい。洗浄工程は０．５〜ｌＯ時間、通常は１時間行われる 。洗浄した粗β−１，３−グルカンを次いで濾過し、有利には追加の水性炭酸ア ルカリ金属で洗浄し、その後に蒸留水または脱イオン水にたとえば１時間浸漬し 、濾過する。

２、濾過したβ−１，３−グルカンを次いで任意に然し好ましくは追加の蒸留水 または脱イオン水で洗浄し、次いで十分な水性アルカリ金属水酸化物たとえばＮ ａＯＨまたはＫＯＨ好ましくは水酸化ナトリウムに加えてβ−１，３−グルカン を溶解させる。アルカリ金属水酸化物の濃度は臨界的ではないが、一般には０． ０ＩＮ−１゜ＯＮであり、Ｏ，ＩＮが好ましい。

３、生成溶液を好ましくは濾過助剤を用い且つ任意に圧力下に、濾過する。

４、濾過溶液を次いて５０〜６０°Ｃの範囲の温度好ましくは５５°Ｃに加熱す る。

５、溶液を３〜ｌＯのｐＨ１好ましくはｐＨ７に、有機酸または無機酸を用いて 中和する。酸は酢酸が好ましいが、他の酸たとえば塩酸、リン酸、硫酸、および クエン酸を使用することもできる。

６、中和した溶液を、過剰量の水混和性溶媒たとえばＣ＋　Ｃｓアルコール、ア セトンまたはメチルエチルケトンの添加によって、凝固させる。イソプロピルア ルコールか好ましい。

７、凝固物を液体成分から、たとえば濾過または遠心によって、分離する。次い で凝固物を更にたとえば水性溶媒、蒸留水次いで有機溶媒で更に洗浄してから所 望により乾燥および粉砕することもできる。

えられるβ−１，３−グルカンは実質的に純粋である。水性ゾル、およびそれか ら製造される次のゲルである０、５〜４重量％のβ−１，３−グルカンを含むゲ ル、は次の諸性質をもっ：ａ）エチジウム・ブロマイドで汚染されたときの背景 の蛍光を実質的にもたない、 ｂ）ＵＶ吸収は２６０ｎｍにおいて実質的にベースラインである、そして Ｃ）ゾルは透明であり、粗または部分精製のβ−１，３−グルカンから製造した ゾルの曇り特性をなんらもたない。

水性ゲルは米国特許第４．７７４．０９３号の方法によって好都合に製造される 。該米国特許を引用によってここにくみ入れる。要約すれば、ゲルは次の諸工程 によって容易に製造することができる： ｉ）実質的に純粋なβ−１，３−グルカンを蒸留水または脱イオン水中に懸濁さ せ、 ｉｉ）アルカリ金属水酸化物たとえばＮａＯＨまたはＫＯＨの添加によってβ− １，３−グルカンを５５℃以下の温度で溶解させ、１ｉｉ）溶液を５０°Ｃ以上 の然し６０℃より低い温度に保持しながら、溶液のｐＨをたとえば酢酸を使用し て１０．０以下好ましくは７゜０〜９．０に調節し、 ｉｖ）溶液の温度を４０°Ｃ以下に冷却してゲルを生成させる。生成ゲルは熱的 に可逆性である。熱的に不可逆性のゲルは溶液を５０”Ｃ以上たとえば７０〜９ ０°Ｃに加熱するか又は上記のゲルを製造してから７０〜９０℃に加熱すること によって製造することができる。

本発明のβ−１，３−グルカン多糖類の実質的に純粋な水溶性塩は次のプロセス 工程によって製造される。

１−３　始めの３つの工程は実質的に純粋なβ−１，３−グルカンの製造に関し て上記に示す工程１−３と同じである。

４　β−１，３−グルカンの水溶性アルカリ金属塩を含む工程３からの水性アル カリ金属水酸化物溶液を、水混和性有機溶媒たとえばＣ，−Ｃ３アルコール、ま たはアセトンまたはケトン、好ましくはイソプロピルアルコール、の過剰量の添 加によって、凝固させる。

５　凝固物を次いて液体成分から、たとえば濾過または遠心分離によって分離す る。育利には凝固物を次いて追加の有機溶媒で洗浄し、所望ならば次いで乾燥お よび粉砕して、実質的に純粋なβ−■。

３−グルカンの水溶性アルカリ金属塩を得る。

あるいはまた、アルカリ金属塩はアルカリ金属水酸化物溶液中にグルカンをとか し次いて上記の工程４および５を使用して凝固および分離を行うことによって、 実質的に純粋なβ−１，３−グルカンから製造することができる。

β−１，３−グルカンの上記アルカリ金属塩中のアルカリ金属カチオンは工程２ に使用した水性アルカリ金属水酸化物溶液の濃度の増大につれて増大する傾向が あり、それ故該塩中のアルカリ金属カチオン含量は所望の値を生ずるように限界 内に容易に制御しうる、ということも更に発見された。アルカリ金属水酸化物溶 液の０．　ＩＮの濃度において、生成β−１，３−グルカン塩中のアルカリ金属 カチオン含量は一般に約５％である。

β−１，３−グルカンの実質的に純粋なアルカリ金属塩、たとえばカートランの ナトリウム塩、は１重量％以下の不純物含量しがもたない。

上記のβ−１，３−グルカンのアルカリ金属塩の他に、β−１゜３−グルカンの 実質的に純粋なゲル形成性誘導体も製造された。これらの誘導体はヒドロキシア ルキル基が２〜４個の炭素原子を含むモノヒドロキシアルキル基であるか３〜４ 個の炭素原子をジヒドロキンアルキルであるヒドロキシアルキル化β−１，３− グルカンである。このような誘導体はグイゼリーらの米国特許第３，９５６゜２ ７３号に記載の方法に類似の方法によって製造することができる（ただしアガロ ースの代わりにβ−１，３−グルカンを使用するようなものを除く）。好ましい 誘導体はＣ１−Ｃ，ヒドロキシアルキル化カードラン、とくにヒドロキシエチル ・カードラン、およびグリセリル・カートランである。これらのβ−１，３−グ ルカンの誘導体は０．０１〜０．１０の置換度（Ｄ、Ｓ、）をもつ、すなわちβ −１，３−グルカン中のヒドロキシ基の１〜ｌＯ％が置換されたものである。上 記の置換度をもつβ−１，３−グルカンの上記のヒドロキシ含有誘導体たとえば ヒドロキシエチル・カードランおよびグリセリル・カードランは、熱水可溶の熱 的に可逆性のゲル形成性化合物である、ということが発見された。

β−１，３−グルカンの上記誘導体のゲルの製造は、実質的に純粋なβ−１，３ −グルカンについて上述したのと同様に行うことができる。

β−１，３−グルカンのグリセリル誘導体はシャイノフの米国特許第４．２７５ ．１９６号の実施例１に記載された方法によっても製造することかできる。該特 許を引用によってここに（み入れる。

すなわちβ−１，３−グルカンとグリシドールとの反応によって製造される。然 しグリシドールの量は０．０１〜０．１０の範囲のり。

Ｓ　を保つために、シャイノフ特許に使用されている量よりも少ない量が使用さ れる。あるいはまた、グリセリル誘導体は前述の米国特許第３，９５６，２７３ 号に記載の方法によりβ−１，３−グルカンを１−クロロ−２，３−ジヒドロキ シプロパンと反応させることによっても製造することができる。

上記の実質的に純粋なβ−１，３−グルカンは水性炭酸ナトリウム溶液好ましく はｐＨ８，５の１％溶液；水性尿素、好ましくは１％溶液：または１％の炭酸ナ トリウムと１％の尿素を含むｐＨ８゜５の水溶液のいずれかで洗浄して物質中に なお存在するかも知れない背景蛍光を除去することができる。

β−１，３−グルカンおよびそれらの誘導体は所望程度の解重合かえられるまで ガンマ照射によって任意に照射することができる。

解重合程度の増大はゲルの強度と粘度の比例的減少をもたらす。それ故、照射の 使用はゲルの強度と粘度の調製を可能にする。ガンマ照射は２００Ｋｒａｄ〜８ ００Ｋｒａｄの範囲の照射量でコバルト６０に露出させることによって好都合に 達成される。

本発明の混合組成物は　ａ）１０〜９０重量部の好ましくは５０〜９０重量部の 実質的に純粋なβ−１，３−グルカン、実質的に純粋なヒドロキシアルキル化β −１，３−グルカン、部分的に解重合した実質的に純粋なβ−１，３−グルカン またはそれらのヒドロキシアルキル化誘導体、または上記の２種以上の任意の割 合の混合物のいずれかと　ｂ）９０〜ｌＯ重量部の好ましくは５０〜１０重量部 の別のヒドロコロイドとからなる。上記の他のヒドロコロイドはアガロースまた はそれらの誘導体たとえば米国特許第３，９５６゜２７３号に開示され分類され ているローカスト・ビーン・ガム、アルギン酸ナトリウム、デンプンなどであり うる。えられる混合組成物は変性した性質をもつ水性ゲルを生成させる。実質的 に純粋なカートランと透明なローカスト・ビーン・ガムとの等しい部数の混合物 は中性であり熱したときにさえ完全に熱可逆性である水性ゲルを生成する。この 水性ゲルは０．５〜ｌＯ重量％の好ましくは１〜４重量％の上記混合組成物を含 む。実質的に純粋な照射した又は照射していないβ−１，３−グルカンならびに それらのヒドロキシアルキル化誘導体および混合物（以下これらを個々に及びま とめて“β−１，３−グルカン化合物”と呼ぶ）の水性ゲルの生成はカオトロピ ン剤の存在下でも実施されうる。力オトロビン剤は水素結合を破壊することが知 られている化合物であり、たとえば尿素、沃化リチウム、臭化リチウム、および グアニジニウム・イソチオシアネートである。水性ゲルの生成は次のように行わ れる：β−１．３−グルカン化合物を少なくとも１種の力オトロピン剤の水溶液 中に懸濁させ、所望ならばこの懸濁液をβ−１，３−グルカン化合物が溶解する まで攪拌しながら（たとえば２０〜１００°Ｃの範囲の温度に）加熱し、そして 生成溶液を冷却して水性熱可逆性ゲルを生成させる。カオトロビン剤の水溶液は 水中に２０〜８０重量％の好ましくは４０〜５５重量％のカオトロビン剤を含む 。水溶液の重量を基準にして一般に０．５〜ｌＯ重量％の好ましくは１〜４重量 ％のβ−１，３−グルカン化合物をこの溶液中に懸濁させる。

力オトロピン剤は水性ゲル中に残すことができ、あるいは水によるゲルのくりか えし洗浄によって除去することができる。カオトロピン剤を含む又は含まないこ れらの水性ゲルは増加したゲル強度を示し、力オトロピン剤の除去により、力オ トロピン剤の不在下で製造したβ−１，３−グルカン化合物を含むゲルに比べて より大きな開放孔構造を示す。

従来技術はヒドロコロイドについての力オトロピン剤の使用の開示を含んでいる けれとも、本発明のゲルについての開示は従来技術には存在しない。たとえば、 本発明のゲルは実質的に純粋なβ−１゜３−グルカン化合物を用いて生成され； このゲルはカオトロピン剤の水溶液中のβ−１，３−グルカン化合物の溶液から 生成されるか：カオトロビン剤を除去したゲルは従来は開示されなかった。米国 特許第４，７７４，０９３号のゲル生成におけるカオトロピン剤の使用は、カオ トロビン剤の添加前に水酸化ナトリウム溶液中のβ−１，３−グルカンの可溶化 を必要する。この方法は製造しうるゲルの濃度を限定すると共に所望のゲル成分 ではない大量の塩化ナトリウムを含むゲルを生成する。本発明のゲルは無機塩を 含まない。

Ｔｈｅ　Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、の報文（Ｖｏｌ、３１．Ｎｏ、１０．ｐ 、１１８４−１１８８．１９６７）はβ−１，３−グルカンの溶液ではなくて懸 濁液への尿素の添加を開示しており、従って本発明の均質ゲルはえられない。

本発明に開示されたゲルのすべては電気泳動に、特にＤＮＡ、ＲＮＡ、および上 記のものからの核酸断片の電気泳動に使用することができる。本発明のゲル形成 性ゾルは透明であり、そこから生成するゲルは臭化エチジウムで汚染されたとき 背景蛍光を実質的に示さないからである。

本発明のゲルは、規則的な又はパルス付きのフィールドを使用して、アガロース ゲルよりも電気泳動中のＤＮＡおよびＲＮＡの著しく速い移動を与える。たとえ ば、ｐＢＲ３２２Ｍｓｐ　ＩおよびφＸ１７４　Ｈａｅ　ＩＩＩ　ＤＮＡは、８ ．５Ｍの尿素水溶液に溶解することによって製造した実質的に純粋なカードラン の４％ゲル中で消化し、次いで水沈することによってＤＮＡ断片のすぐれた分離 と分割をもたらした。

また、本発明のゲルは米国特許第４，７７４，０９３号に示される用途のすべて について使用することができる。該特許を引用によってここにくみ入れる。すな わち、血清用電気泳動ゲル媒質として、変性溶媒電気泳動に使用するための、等 電位フォーカスのための、免疫沈殿ゲル媒質として、生物学的薬品用のキャリヤ ーとして、医薬品の目標とする放出コーティングまたはキャリヤー媒質として、 食用ゲルとして、ハミガキに使用するための、および使い捨てコンタクトレンズ として、米国特許第４，７７４，０９３号第６〜９欄に示されるのと同様にいて 使用することができる。

本発明を次の実施例によって具体的に説明する。

Ａ、ＩＯｇの粗カードラン（ロット＃　ＲＦＯ８、日本国東京の武田化学工業） を１％（Ｗ／Ｖ）炭酸ナトリウム（無水顆粒、ロット＃　ｌ０８Ｆ−００６５、 米国ミズリー州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー）の６２５ｍ１中 に懸濁させ、１．０ＭのＨＣＩでｐＨ８，５に調節し、６０分間加熱した。懸濁 液をポリエステル布を通して真空濾過してカードランを回収した。収集したケー キを追加の３２５ｍ１の洗浄液で洗ってから濾布からとり出し、６２５ｍ１の蒸 留水に移し、６０分間攪拌した。６０分の攪拌後に、カードラン懸濁液を再びポ リエステル布を通して真空濾過した。３５０ｍ１の追加の水で洗った後に、カー ドランを５６２ｍ１の蒸留水に懸濁させた。これに１．ＯＮのＮａＯＨの６２ｍ １を加えてカードランをとかし、次いで８０ｇのハイフロ・スーパー・セル濾過 助剤を加えて攪拌した。このスラリを次いで１２の圧力フィルター・ボンベに入 れた。このボンベは１６ｇのフィルター助剤で予めコードンた＃５４のつオツト マン濾紙（オレゴン州ヒルスポロのウオソトマン・ラブセールス）の１片を含ん でいた。ビーカーを７５ｍ１の０．’ＩＮのＮａＯＨで洗い、フィルター・ボン ベに入れた。２０ｐｓｉ（約１．４ｋｇ／ｃｍ”）を加え、濾液を集めた。完了 したとき、濾液を再びフィルター・ボンベに入れて３５ｐｓｉ（約２゜５ｋｇ／ ｃｍ’）で再び濾過した。この濾過を４５および５０ｐｓｉ　（約３．２および ３．５ｋｇ／ｃｍ’）の圧力を使用して追加の２回くりかえした。フィルター助 剤ケーキを洗うために、１５０ｍ１のＯ，ＩＮのＮａＯＨをボンベに入れた。こ の濾液を予め濾過したカードラン溶液と混合した。温度をマイクロウェブ・オー ブン中で５０〜５５°Ｃに上げた。次いで溶液をこの温度範囲に保持しながら５ Ｍの酢酸で、ｐＨメーターが示すように、約ｐＨ７に調節した。

中和したカードラン溶液を次いでその容量の２倍（１４００ｍｌ）の９９％イソ プロピルアルコール（マサチューセッツ州メトフォードのフィッシャー・サイエ ンティフィック）中で凝固させた。凝固物を７５０Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離 することによって回収した。

上澄み液を捨て、カードラン・ペレットを２倍容量（１４００ｍｌ）の６０％イ ソプロピルアルコールに移して崩壊させた。３０分後に、凝固物を真空濾過によ ってポリエステル布の上に回収した。

過剰のアルコールをしぼって除去した。残渣を２倍容量の水中で　−（３０分間 ）洗い、上記のように再び回収し、その後に２倍容量の９９％イソプロピルアル コール中で硬化させた。凝固物を再び濾過し、しぼって過剰のイソプロピルアル コールを除き、次いで５５°Ｃの強制熱風オーブン中で一夜（１６時間）乾燥し た。乾燥したら、試料を秤量して収率をめた。５．６９ｇ（５６，９％収率）が 回収され、次いでこれを４０メツシユふるいを通して粉砕した。この方法からえ られた生成物から製造した１％溶液は臭化エチジウムで汚れた背景をごく僅かし か示さなかった。これに対して粗カードランの１％溶液は過度の汚れを示した。

また、３２０と２２０ｎｍの間の吸収は上記の方法からのカードラン生成物につ いて著しく低かった。

Ｂ、上記Ａに示す方法をくりかえした。ただしフィルター・ボンベからの濾液を 加熱せず中和した。その代わりに、それを２倍容量の酸性化した９９％イソプロ ピルアルコール（２３ｍｌの５Ｍ酢酸または１２ｍ１の９．８Ｍ酢酸を含む１４ ００ｍ１のイソプロピルアルコール）中で凝固させた。この方法で精製したカー ドランの１％溶液は上記へで得られたカードランに匹敵する３２０と２２０ｎｍ の間の吸収の減少を示した。また、この特質で作ったゲル・プラグは上記の方法 Ａからのカードランと均等な水準の背景臭化エチジウム汚染をもっていた。

Ｃ１上記Ａに示す方法をくりかえした。ただしカードランはただ一度だけフィル ター・ボンベを通して濾過した。えられたカードラン生成物は上記の方法Ａを使 用してえられたものと実質的に等しかった。

Ｄ、上記の方法Ａをくりかえした。ただしカードラン溶液を２回再濾過した。こ の物質の臭化エチジウム汚染およびＵＶ吸収の水準は方法Ａのカードラン生成物 からえられたものと密接に一致していた。

Ｅ、上記の方法Ａをくりかえした。ただし炭酸ナトリウム溶液をｐＨ７，５に調 節した。えられるカードラン生成物は方法Ａからの生成物と実質的に同じであっ た。

Ｆ、上記の方法へをくりかえした。ただし炭酸ナトリウム溶液をｐＨ９，５に調 節した。えられるカードラン生成物は方法Ａからえられたものと実質的に同じで あった。

Ｇ、方法Ａをくりかえした。ただしカードランは異なるｐＨをもつ炭酸ナトリウ ム中で３回洗浄した（順次にｐＨ７，５，８，５および９．５）。えられるカー ドラン生成物はｐＨ８，５でのみ洗浄したカードランよりも僅かに低いＵＶ吸収 をもっていた。背景汚染は匹敵するものであった。

Ｈ９方法Ａをくりかえした。ただし濾液を中和するための酸として酢酸の代わり にリン酸を使用した。えられる生成物のＵＶ吸収および背景汚染は上記の方法Ａ からの生成物に比べて実質的に同しであった。然しＨ，ＰＯ，の使用は増大した 灰分含量（平均ｌＯ〜１３％）によって示されるように精製された生成物中の過 剰な塩生成を導いた。この方法で生成したカードランは生成物中の低い実際のガ ム含量のために低いゲル強度（＝５５ｇ／ｃｍ”　）をもっていた。

１、上記への方法をくりかえした。ただし５Ｎ酢酸を使用して炭酸ナトリウム溶 液のｐＨを調節した。えられるカードランと方法Ａで製造されたものとの間に相 違は観察されなかった。

Ｊ、上記の方法へをくりかえした。ただし９．８Ｍ酢酸を使用して炭酸ナトリウ ム溶液のｐＨを調節した。カードラン生成物は方法へからのものと実質的に同じ であった。

Ｋ、方法Ａをくりかえした。ただしフィルター助剤としてハイフロ・スーパー・ セルの代わりにセラトム・ジアドマイトを使用した。

この特定品位のフィルター助剤は方法へからのカードラン生成物よりもやや高い 吸収スペクトルおよび背景汚染をもつカードランをもたらした。

Ｌ、方法Ａをくりかえした。ただし粗カードランをＮａＯＨ溶液中に直接とかし た。ゲル形体のえられるカードラン生成物は方法Ａのカードラン生成物に比べて ２６０ｎｍ吸収ピークの２５％減少をもっていた。

Ｍ、方法へをパイロットプラントでくりかえした。ただしａ）炭酸ナトリウム溶 液をＨＣＩの代わりに５Ｍ酢酸を用いてｐＨ８，５に調節し、ｂ）ＮａＣＯｓ中 での及び水中での、最初の２つの洗浄の後に、カードラン粉末をよくあったフィ ルターパッドの１片（マサチューセッツ州ノース・キンシーのエム　ダブリュー 　エム・カンパニーのクツ・ゼタ・プラス・フィルターパッド）を通しての圧力 濾過によって回収し、１１のフィルター・ボンベ中で１０ｐｓｉ（約０．７ｋｇ ／ｃｍ２）で側面を調整し、Ｃ）カードラン溶液を１回だけナイロン濾布の層（ シンシナティ州ハムデンのフィルトラ・スペック）を通してフィルター・ボンベ （クツ・フィルター・バットによって支持）中で圧力濾過し、そしてｄ）加熱ま たは中和しなかった濾液の７００ｍ　ｌを、２３ｍ１の５Ｍ酢酸で予め酸性化し た９９％イソプロピルアルコール１４００ｍ１中で凝固させた。収率は６．６７ ８ｇまたは６６．８％であり、カードラン生成物の試験結果（ＵＶ吸収、背景汚 染およびゲル強度）はすべて方法Ａで製造したカードランに匹敵するものであっ た。

粗カードラン２８８５ｇを使用して方法Ｍをくりかえした。実質的に純粋なカー ドラン２２００ｇ（７８％収率）かえられた。

Ｎ、上記の方法はＭによって製造した実質的に純粋なカードランを高濃度ゲルに するとき、臭化エチジウムで汚染されたときの背景蛍光か所望よりもやや大きい ということが見出された。従って、高濃度ゲルを望むときは、実質的に純粋なカ ードランの精製が次の方法の１つを使用して好ましくは行われる。

ａ）方法Ｍを使用して製造したカードランのｌＯｇを尿素の１％溶液６２５ｍ１ に懸濁させた。尿素洗浄を室温で一夜行った。カートランを次にポリエステル布 を通す濾過によって回収し、その後に追加の３５０ｍ１の尿素溶液で洗う。次い で粉末を６２５ｍ１の水に移し、１時間洗浄する。試料を方法Ｍのように濾過に よって回収し、追加の３２５ｍ１の水で洗う。次いでカードランを５６２ｍ１の 水に懸濁し６２ｍ１の１．ＯＮ　ＮａＯＨを加えることによって溶解させる。こ の溶液を１回濾過する。濾液を方法Ｍで述へたように加熱し、中和し、凝固させ 、洗浄し、回収して乾燥する。乾燥したカードラン（５，７５ｇ）を４０メツシ ユ（４２０ミクロン）のふるいを通して粉砕する。１％溶液を製造してＵＶ分析 に供し、後に強度測定のために使用する。

ｂ）方法Ｍを使用して製造したカードランの１０ｇを上記の方法Ａに従って試験 した。ただし１回の濾過のみを行った。５．９０ｇの収量をえたが、これも１％ 溶液にしてＵＶ分析およびゲル強度の測定に供した。

Ｃ）上記ｂ）の方法を行った。ただし炭酸ナトリウム溶液も１％尿素を含んでい た。６．１１ｇの収量をえた。１％溶液を製造してＵＶ分析およびゲル強度測定 に供した。

上記の方法に従って更に精製した実質的に純粋なカードランは臭化エチジウムで 汚染されたとき高いゲル濃度においてさえ非常に低い水準の背景蛍光を生した。

ＵＶ分析およびゲル強度の結果を下記の表１に示す。

方法　Ｍ　、＋２０４　．３１２１　．８０５７　１０４（１０６）本方法　Ｎ 　ａ）　、１４０８　．２７４８　．９１１４　７６（１２２）方法　Ｎ　ｂ） 　、２７０４　．３３５２　１．２６８５　７８（１０４）方法　Ｎ　Ｃ）　、 ＋６１５　．３０９４　１．０６２８　６４（１００）本（）中の値はｇ／ｃｍ ”で表した熱硬化ゲルのゲル強度を示し、初めの値は冷間硬化ゲルの値である。

０、多数の方法を実施した。これらにおいて方法Ａをくりかえしたが、ただし炭 酸ナトリウムの代わりに次の洗浄液を使用した。

１％　ＮａＣ］ ０．０ＩＮ　酢酸 ０．００１ＭのＮａＯＨ 上記の方法のそれぞれからの生成カードラン生成物は許容しえないものであった 。２６０ｎｍ吸収ピークがあまりにも高すぎたからである。

Ｐ、方法Ａを行った。ただし粗カードランを直接に水酸化ナトリウムにとかし、 少量ずつを濾過工程以前に活性炭、活性粘土、またはチトサンで別々に処理した 。２６０ｎｍの吸収ピークの若干の減少がそれぞれの処理からえられたけれども 、許容しつる生成物を生じたものはなかった。

カンの冷間硬化および熱間硬化の両方のゲルを製造した。それぞれの特定の実施 例を下記に示す。

冷間硬化　１％のカードランゲルの１００ｍ１容量を作るために、前記実施例Ｉ Ａの方法によって製造した実質的に純粋なカードランのｉ、ｏｇを９０ｍ１の蒸 留水に攪拌しながら徐々に加えた。これを十分に分散させた後に、１０ｍ１のＩ Ｍ−ＮａＯＨを加え、カードランか完全にとけるまで攪拌を続けた。この溶液を マイクロウェーブ・オーブン中で簡単に加熱して温度を５５℃に上昇させた。溶 液の温度を５０〜５５°Ｃに保持しながら、５Ｍ酢酸の２ｍｌを使用して中和を 行った。この溶液を鋳型に迅速にあけてゲルにさせた。

熱間硬化　熱間硬化ゲルの１００ｍ１を作るために、冷間硬化ゲルについてと同 じ方法を行って中和溶液を製造した。２つの方法を使用して熱間硬化カードラン ゲルを製造した。（１）液体をできるだけ５５°Ｃに近い温度に保つ予め加温し た鋳型に注入し、次いで７０〜８０°Ｃの熱水浴中で３０分間加熱する、および （２）冷間硬化ゲルを製造し、次いで加熱処理する。

ＵＶ吸収分析 カードラン溶液の紫外（ＵＶ）吸収スペクトルの決定はＤＮＡ、タンパクおよび 細胞断片のような夾雑物の存在を示す。この精製法の効率はこの分析によって一 部をモニタすることができる。カードランの１％溶液を０．１ＭのＮａＯＨを使 用して製造した。試験溶液を１０ｍｍのＵＶセル（ヴイダブリューアール・サイ エンティフイック）に移した。粗カードラン（東京の武田化学工業株式会社のロ ット＃　ＲＦＯ８）および方法ＩＡからの実質的に純粋なカードランの双方を分 析した。ベックマンＤＵ７の分光光度計を使用してスペクトルを得た。次のパラ メーターを使用した：温度２ｏ″Ｃ；波長３２０ｎｍ〜２２０ｎｍ；走査モード （３００ｎｍ／分）。背景を蒸留水でブランクにし、Ｏ，ＩＮのＮａＯＨを対照 標準として使用した。走査トレース使用してえらばれた波長（３２ｏ、２６０お よび２２０　ｎｍ）での正確な吸収値をえた。

粗カードラｙ　０．２７７５　０．８１９２　２．２４８２方法ＩＡ（７）ｈ− ドラ７　０．　０　７　２　５　０．　１　４　３　４　０．５　９　６　７ゲ ル・プラグ検査 １％カードランゲルの臭化エチジウム背景汚染の相対量を肉眼で検査するために この方法を考案した。１％（Ｗ／Ｖ）カードラン溶液を作るために、０．２５ｇ の実質的に純粋なカードランを２２゜５ｍｌの蒸留水に懸濁させた。２．５ｍｌ の１．ＯＮのＮａＯＨを加えてカードランをとかした（最終のＮａＯＨ濃度は０ ．ＩＮであった）。このカードラン溶液を熱板上で５５°Ｃに加熱し、攪拌しな から０．５ｍｌの５Ｍ酢酸を加えた。１ｍｌの中和カードラン溶液をライニン・ ピペットマン（Ｐ　Ｉ　０００）を使用してｌｏｍｌのパイレックス・ビーカー にピペットで入れ、冷却によってゲルを生成させた。ゲル・プラグをスバチェラ を使用して除き、次いで臭化エチジウム溶液（１ｍｌ当り１マイクログラムの濃 度）中に入れた。

３０分の汚染後にこのゲルを蒸留水中で同じ時間脱汚染させた。これらのゲル・ プラグを次いで紫外光（ホトダイン・モデル　３−４４００）を使用して照射し た。ホトグラフをポラロイドＭＰ−４ランドカメラおよびタイプ５７４Ｘ５ラン ドフイルムを用いてＦ４゜５で１／２秒間とった。現像時間は２０秒であった。

肉眼での比較を行゛った。粗カードランは許容しえない高い消費蛍光をもってい たが、実質的に純粋なカードランは実質的に背景蛍光を示さなかった。

水分および灰分の分析 次いで水分および灰分の決定を行う。水分は７５℃で一夜の真空オーブン中の試 料の重量損失によって決定した。灰分は水分決定からの試料をそれらが白色にな るまで白金ルツボ中で７５０°Ｃに加熱してから残渣の重量を測定することによ って決定した。

試　料　水分　％　灰分　％ 粗カードラン　７．４０　３．０５ 実質的に純粋なカードラン　４．４４　０．３８実施例ＩＡに述べた精製法を、 次の少しの変化を伴って使用して、ウェスタン・リサーチ・センター（カナダ国 オンタリオ州）からのβ−１，３−グルカン試料を精製した。僅か４ｇの粗材材 を使用したか、小容量の試剤（Ｎａ、ＣＯｓ　、水、およびイソプロピルアルコ ール）をこれに残した。また、１次凝固物を回収するための遠心分離は必要では なく、回収はポリエステル布を通す真空濾過によって行った。回収した量は２． ２７７ｇまたは５６．９％であった。

部分解重合した粗カードラン（ロット＃　２Ｔ−２７）（２００Ｋｒａｄおよび ６００Ｋｒａｄの照射による）に応用した精製法は下記の点を除いて実施例ＩＡ で述べたものと実質的に同じであった。

２００Ｋｒａｄ照射粗カードランの１５ｇを実施例ＩＡで述べた割合および時間 を使用してＮａ　１　ＣＯ２と水により洗浄した。洗浄カードランを５６２ｍ１ の蒸留水に移し、次いで６２ｍ１のｌＮ−ＮａＯＨを加えた。数分間攪拌した後 に、生成溶液に更に濾過処理し、濾液を５５°Ｃで中和してから９９％イソプロ ピルアルコール（ＩＰＡ）中で凝固させた。凝固物を３倍容量の９９％イソプロ ピルアルコール中に放置し、次いで大きなブフナーロートを使用して密に織った ナイロン布を通す真空濾過によって集めた。別の９９％イソプロピルアルコール 洗浄液（３倍容量）を使用して凝固物を硬化させた。乾燥生成物の収率は８．６ ６９ｇまたは５７．８％であった。

実施例ＩＡと同様にして、より高度に照射（６００Ｋｒａｄ）粗カードランを精 製した。加熱中和の代わりに、カードランを酸性化したアルコール（９９％ＩＰ Ａ　６００ｍ１中５Ｍ酢酸１０ｍ１）中で直接に凝固させた。収率は７，４５０ ｇまたは４９．７％であった。

６Ｍ尿素を含む１％カートランゲルの製造は次のとおりてあった。

１０３ｇの尿素（ミズリー州セントルイスのシグマ・ケミカルからのロット＃　 ４８Ｆ−０２３５）を５０ｍ１の蒸留水に加熱および激しい攪拌を用いて溶解す ることによって１２Ｍ尿素溶液を製造した。この尿素溶液を蒸留水を使用して１ ５０ｍ［、てから十分に混合した。２％精製カードランを、３ｇの実施例ＩＡの 方法によって製造した実質的に純粋なカードランを１２０ｍ１の蒸留水に加える ことによって製造した。カードランをとかすために、３０ｍ１のｌ。

ＯＮのＮａＯＨを攪拌しながら加えた。１２Ｍ尿素溶液１５０ｍ１を２％精製カ ードラン溶液１５０ｍ１に加えた。次いでこの溶液を温和に加熱しながら数分間 加熱した。マイクロウェーブ・オーブンを使用して、この溶液を５５°Ｃの温度 にし、次いで絶えず攪拌しながら５Ｍ酢酸で中和（ｐＨ７，０）　した。この中 和溶液を次いで２枚の小さいパイレックス３１５０の５０Ｘ７０ｃｍのガラス結 晶器（それぞれ１５０ｍ１）に入れた。この溶液を室温でゲルにした。

ゲルを４°Ｃで２時間急冷した後にゲル強度を測定した。エフ・エム・シー・マ リン・コロイド・ゲル・テスター・モデル　ＧＴ−２（ペンシルバニア州フィラ デルフィアのエフ・ツム・シー・コーポレーション）をエーエヌディからのデジ タル・スケール・モデルＥＷ−３０００Ａと組合せて使用して、４つのプラグの 平均をゲル強度値として記録した。

カオトロビン剤を直接に使用して１％精製カードラン溶液を作るとき、ゲルが次 の方法によって生成する。ＩＭのグアニジン・イソチオシアネートゲルを含む１ ％の実質的に純粋なカードランを、８８．６５ｇのグアニジン・イソチオシアネ ート（ミズリー州セントルイスのシグマ・ケミカルのロット＃　１０９Ｆ−００ ５０）を５００ｍ１の蒸留水にとかすことによって、製造した。容量を蒸留水で ６７５ｍ１にしてから数分間攪拌する。実質的に純粋なカードラン （７，５ｇ）を激しく攪拌しながら加える。次いで、７５ｍ１のｌ。

ＯＮのＮａＯＨを攪拌しながら簡単に加熱してカードランを完全にとかす。マイ クロウェーブ・オーブンを使用して、この溶液を５５°Ｃの温度に加熱し、次い て攪拌しながら５Ｍの酢酸で中和した。この溶液を直ちに５枚の小さい結晶器に 入れ、急冷し、ゲルに変えてゲル強度を測定した。同様にして、次のカオトロピ ン剤を使用してゲルを製造した。これらのカオトロピン剤のすべてはミズリー州 セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニーからのＬｉＣ１（ロツト＃　８８ Ｆ−００４８）、ＬｉＢｒ　（Ｏット＃　４８Ｆ−３４４２）、ＬｉＴ（ロット ＃　７８Ｆ−３５１７）、カリウム・チオンアネート（ロフト＃　ｌ０Ｆ−０５ ０７）、およびグアニジン塩酸塩（ロット＃　４０Ｆ−００４０）である。

ゲルからカオトロープを除くための洗浄プロトコール６Ｍ尿素を含む１％精製カ ードランゲルから尿素を除くために、ゲルを結晶皿から除き、４Ｉ！容量のビー カー中の蒸留水２１に注意深く入れた。ゲルを温和に攪拌しながら２４時間洗浄 した。この強力な洗浄後に、ゲルを小さい結晶皿に入れて、ゲル強度を上記のよ うに測定した。表２に示す他のカオトロビン剤を含む精製カードラン１％ゲルも 熱硬化の前および後に洗浄した。これらの洗浄したゲルからのゲル強度データを 表２に示す。

熱硬化の方法 上記のようにして製造した、６Ｍ尿素を含む精製カードランゲル（１％）を、ゲ ルを含む結晶皿を沸とう水浴中に２０〜３０分間入れることによって、熱硬化さ せた。浴中の水のレベルをゲルと同じレベルに保った。ゲルを熱硬化させた後に 、これを冷却してゲル強度を上記のようにして測定した。表２に示す他のカオト ロピン剤を含む精製カードランゲル（１％）を、洗浄によるカオトロビン剤の除 去の前および後に、熱硬化させた。これらの硬化ゲルからのゲル強度データを表 ２に示す。

洗浄した冷間硬化ゲルの回収 ０．２５ＭのＬｉＩを使用して始めに製造した、強力に洗浄した１％精製カート ランゲルを３００ｍ　ｌの０．ｌＮ−ＮａＯＨにとかしてカードランを回収し、 増大したゲル強度がゲル構造に固有のものであったのか又はカードランの若干の 塩基の変化が起こったのかを試験した。ゲルを塩基中に完全に溶解させた後に、 溶液をマイクロウェーブ・オーブン中で５５°Ｃに加熱し、次いで５Ｍ酢酸で中 和した。この中和溶液を２倍容量の９９％イソプロピルアルコール（９００ｍ１ ）中で凝固させた。凝固物を７５０Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離してから６０％ イソプロピルアルコール中で３０分間洗浄し、次いで蒸留水中で、そして最後に ９９％イソプロピルアルコール中で洗浄した。それぞれの洗浄の容量は９００ｍ １であった。

凝固物をそれぞれの洗浄の間にポリエステル布を通す真空濾過によって回収した 。９９％イソプロピルアルコール洗浄の後に、凝固カードランを５５℃で一夜乾 燥した。回収したカードラン０．３１９ｇを４０メツシユ（４２０ミクロン）ふ るいを通すトーマス・ワイリイ・ミル中で粉砕した。回収カードランを使用して １％ゲルを製造し、ゲル強度を測定した。結果を表２に示す。他のカオトロピン 剤を使用して製造した他のゲルについても同じ回収法を使用した。

ゲル強度の結果を表２に示す。

表　２ １％カーＦう７（文１ｆそｕＦｆり　１０６　７４　６４　１５５　１８６　１ ５５３ＭＬｉＣ１８５１７６６９１４９５５９４０，５ＭＬｉＢｒ　３０５３４ １−−２０８１９２２１８１．５ＭＬｉＢｒ　２９９２０８８１１７６１５５１ ７４３ＭＬｉＢｒ　２０２２００９６２２７２４８２２４０、ＩＭＬｉｌ　２４ ４２４７８３１５２１５８２３５０．２５ＭＬｉＴ　３６０３６６１１８１７８ ２１７４１３０．５ＭＬｉ１　４５４４０６８５２１６２１６２５４１．５ＭＬ ｉ１　３４６３４５−−２３０３３０１９５３ＭＬｉｒ　２１０２３３６４４２ ０４２１２６９３ＭＫＳＣＮ　３５８３６１１００３３１３７５３１０３Ｍ尿素 　２４２　３５７−４２４　４７１　４２３６Ｍ尿素　２１８　５２３−１６８ 　３９４　８１２９Ｍ尿素　９５　３８２　８４　１５２　４５８　４４６１Ｍ 　グアニジン　れ匡＾餐む匡　２０５　３１４　−−　２４０　２０８　２３５ ０、１Ｍ　グア二ノンＨ３Ｏリ　２４４　２７６　’−−１９４２４７１９８０ ，２５Ｍ　グアニジン　ＩＳＣＮ　３１３　３４２　−−　２２６　３２０　２ ７５０、５Ｍ　グアニジン　１−ＩＳＣＮ　１８６　３５９　−−　３５９　３ １０　３１５１Ｍ　グアニジン　）１３ｃＮ　１３７　１８５　−−　７２　１ ９６　７６４２Ｍ　グアニジン　１（Ｓ（Ｎ　４７　１４４　−−　５８２　１ １８　４０１＊塩基基準のゲル強度値（ｇ／ｃｍ”）上記の処方物の若干は熱硬 化した熱不可逆性ゲルを形成せず、その代わりに加熱したとき溶融し、それから 冷却したときにゲルに再硬化される、０．５ＭのＬｉＢｒ　（熱硬化／洗浄）、 ＩＭ　グアニジン　ＨＣＩ（洗浄／熱硬化）、６Ｍ　尿素（熱硬化）、および２ Ｍ　グアニジン　ＩＳＣＮ　（熱硬化／洗浄）の中で製造されたものが特にそう である。また、尿素またはリチウム塩の存在で生成されたものは完全に熱不可逆 性ゲルを形成しなかった。融点は冷間「熱硬化Ｊゲルを再加熱するときには完全 ではなかったが、それらは再び冷却すると再ゲル化した。

カオトロピン剤を含む１％粗カードランゲルを、洗浄、熱硬化、および洗浄した 冷間硬化ゲルを伴って又は伴わないで、上記のように製造した。１％粗カードラ ンゲルのゲル強度データを表３に示す。

１％粗　１０２　１０３９１　１２０　１１０　１３３０．５ＭＬｉ１　３４６ 　４１６　９７　３２６　３９２　１８９６Ｍ　尿素　１７３　４９１　１７　 ２２９　５２２　２６７１Ｍ　グアニジン　ＩＳＣＮ　１８６　２６８　７１　 ２３２　２７０　２２５実質的に純粋なカードランゲルの電気泳動媒質としての 諸性質を試験するために、冷間硬化ゲルをアガロース・フレーミングゲル中で製 造した。まず、シーケムＬＥアガロース（ペンシルバニア州フィラデルフィアの エフ・エム・シー・コーポレーション）の１％（ｗ／ｖ）溶液を、０．２５ｇの アガロースを２５ｍ１の０．５×のＴＢＥバッフ−ｒ　−（４２，５ｍＭのトリ ス塩基、４９．５ｍＭのホウ酸、ＩｍＭのＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）　）にとか すことによッテ製造した。これを使用して３ｍｍの厚さのゲルをミニ・サブマリ ン・ゲル電気泳動室にューヨーク州アクエボーグのアクエボーグ・マシン・ショ ップ、モデル＃　７５０）中でキャストした。ゲルか固化した後に、３つの中間 レーンを切断によって除いた。この空間を満たすために、１％（Ｗ／Ｖ）カード ラン溶液を、０．２５ｇの実質的に純粋なカードラン（実施例ＩＡ）を２２．５ ｍｌの蒸留水に懸濁させることによって、製造した。この試料を２．５ｍｌのｌ 。

０Ｎ−ＮａＯＨの添加によってとかした。この溶液を熱板上で５５℃に加熱し、 次いで０．５ｍｌの５Ｍ酢酸で中和した。次いでこの溶液をアガロース・フレー ミング・ゲルし、冷却して固化させた。

ゲルを操作バッファーと均衡させるため、これを０，５×のＴＢＥバッファーで カバーした。バッファーを２回変えて均衡を一夜続けた。ＤＮＡ試料を入れる前 に、バッファーを再び変えた。次いでウェルに、ブロムフェノールブルーをトラ ッキング染料として含むバインドＩＩＩラムダＤＮＡ消化物の熱処理試料の５マ イクロ・リットルを入れた。６０ポルト（５Ｖ／ｃｍ）で８２分間電気泳動を行 った。染料がアガロース中に４．５ｃｍ移動した後に、ゲルを除いて臭化エチジ ウム溶液（１マイクロｇ／ｍｌ）中で３５分間汚染させ、次いで蒸留水で同し時 間脱汚染させた。実施例２（ゲル・プラグ法）で述べたようにＵＶ光源下で試験 を行いホトグラフにとった。

強力な背景蛍光が分離核酸断片を妨害する粗カードランから従来製造されていた 類似のゲルとは対照的に、ＤＮＡ！はすぐに容易にみることができた。また、Ｄ ＮＡの移動はアガロース・フレーミング・ゲル中よりも本発明のカードラン中で かなり速かった。

２３．１　１０．７　２０．０ ９．４　１１．８　２４．５ ６．６　１３．２　２７．６ ４．３　１４．５　３１．３ ２．３　１９．５　３８．６ ２．０　２１．３　３９．９ ０．５６　４０．４　５４．４ 粗一対一精製 第２の１％アガロースゲルを上記のようにして製造した。この実施例において、 それぞれが２レーンからなる２つの区域を切断した。

これらのカット・アウトの１つに上記のように製造した精製カードラン（１％） の中和溶液をみたした。他方のカットアウトには中和した１％粗カードラン溶液 （ロット＃　ＲＦＯ８）をみたした。全体のゲルを上記のように０．５ＸのＴＢ Ｅバッファー中で均衡させた。電気泳動と検出をすべて前記のように行った。た だし変性はやや短かった（７５分）。ＤＮＡ５Ｆはアガロースおよび精製カード ランのゲルの両者において容易にみることができたが、通常の背景のために、粗 カードランを満たしたレーンにみられるそのような帯は存在しなかった。

変性 １、第２のゲルを上記のようにして実質的に純粋なカードランから製造した。唯 一の変化は０．５ＸＩ−リスアセテ−）　ＥＤＴＡバッファー（２０ｍＭのトリ ス塩基、２０ｍＭのアセテートおよび０．５ｍＭのＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）） を０．５×のＴＢＥバッファーの代わりに使用したことがあった。０．５×のＴ ＢＥ中の操作に比べてこのバッファー系を使用するＤＮＡ断片の帯または移動に 目立った相違はなかった。

２、下記に示すこと以外は上記と同じ条件を使用して、第３のＤＮＡの電気泳動 分離を行った。この実施例において、１．５％カードランゲルを使用した。好適 な移動およびＤＮＡ％Ｆかえられたが、結果はこの濃度におけるカードラン中の ＤＮＡ移動が１％アガロースゲルの場合よりもやや速かったことを示した。

３、パルス付きのフィールド勾配の電気泳動０．５ＸＴＡＥバツフアー（２０ｍ Ｍのトリス塩基、２０ｍＭのアセテート、１ｍＭのＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）） 中の１％シーケムＬＥアガロース（ロット＃　６２６７７）溶液の１００ｍ１を 製造して、１３．２ｃｍの回転ゲル装置にューヨーク州アクエボーグのザ・アク エボーグ・マシン・ショップによって建てられたカスタム）中でゲルをキャスト するのに使用した。中心レーンの３つをカットして、これに６ＮのＨ，ＰＯ，で 中和した精製カードランの１％溶液を満たした。全体のゲルを０．５ＸＴＡＥバ ツフアーでフラッディングさせて均衡化を一夜（１６ｈｒｓ）行った。バッファ ーを変えた後に、ウェルにシゾサッ力ロマイセス　ポームベ　ゲルプラグ（ペン シルバニア州フィラデルフィアのエフ・エム・シーコーボレーソヨン）のスライ スを入れ、次いで小容量の溶融アガロースで封をした。次の条件で２０時間電気 泳動を行った：パルス時間を２５分から３５分に上げた；角度は１０５°であっ た：電圧は１５アンペアにおいて１．１５Ｖ／ｃｍであった：初期のバッファ一 温度および圧力はそれぞれ１５．５℃および８．３であった。ＬＫＢ２３０１マ クロドライブ　１　にュージャージー州ビス力タウエイのファーマシア・エルケ ービー・バイオテクノロジー・エイビー）によって電力を供給し、コモドア６４ コンピユータによってカスタムプログラムを行った。ゲルを上記のように汚染、 脱汚染および可視化した。結果は、このような実質的に純粋なカードランゲルが パルス付きのフィールド電気泳動に好適であることを示した。３つのＳ、ボムベ 染色体がハツキリとみえるのに対して、アガロースはこれらの条件下で３つの染 色体のうちの２つのみが解像されたにすぎなかった。また、染色体はアガロース ・フレーミングゲルにおけるよりもカードランにおいて遠くへ移動した。

０．５ＸＴＢＥ／＜ッファー中で製造した１％シーケムＬＥアガロース（ペンシ ルバニア州フィラデルフィアのエフ・エム・シー・コーポレーション）の溶液を プラスチック鋳型にそそいでゲルにさせた。この鋳型はレディキャスト・ゲル（ カルホルニア州パロアルトのチバ・コーニング・ダイアブノスチックス・コーポ レーション）からえられたものである。中心の４レーンを切断して除いた。次い でこの空間に実施例ＩＡのようにして製造した１％カードランの中和溶液を満た した。カードランを冷却してゲルにした。ゲルの露出面を薄いプラスチックシー トでカバーしてその縁にフタを付けて締着させた。全体のユニットを７５°Ｃの 水浴に３０分間浸漬した。このユニットを浴から除いて冷却させた。冷却後に、 ゲルを除いて０゜５ＸＴＢＥバツフアーに入れ、−夜（１６ｈｒｓ）均衡化して から、小室に入れ、新鮮なバッファーでフラッディングさせた。実施例６て述べ たようにしてウェルにＤＮＡ試料を入れた。分離が６０ポル）（５Ｖ／ｃｍ）で ８０分間行われた。汚染、脱汚染、および検出を実施例６で述べたようにして行 った。ＤＮＡ断片の移動と分離が熱硬化カードラン挿入子で観察された。然しな から、この熱硬化カードラン処方物中のＤＮＡの移動性は冷間硬化カードランゲ ルよりもかなり遅く、アガロース・フレーミングゲル中で起こったより遅くはな いとしてもそれと均等であった。また、カードラン中に観察された情はやや拡散 した。カードラン中に目立った背景汚染は観察されなかった。背景蛍光のレベル は僅かに識別できたが、はとんどアガロースゲル中で観察された程度に低かった 。

６Ｍ尿素中で製造したカードランゲルは尿素が浸出または洗浄によって除去され るにつれて収縮する。これらの変化を評価するために、０．４．０．６．０．８ ．１．　０および１．　２％（ｗ／ｖ）の初期濃度の注意深く製造した一連のゲ ルを秤量し、洗浄し次いで再秤量した。たとえば、１６ｇの蒸留水、０．２５ｇ の実質的に純粋なカードラン（実施例ＩＡ）、１．７８ｍ１の１．０Ｎ−ＮａＯ Ｈ１９，０１ｇの尿素、および３５６マイクロリツトルの５Ｍ酢酸を混合するこ とによって、１％溶液を製造した。依然として液体であるときに、この２０．０ ７ｇを透明なビーカーに入れた。冷却後に、ゲルを取り出して重量が１９．６０ ｇであることがわかった。このゲルを２１の蒸留水中でおだやかに攪拌しながら 一夜（１６ｈｒ）洗浄した。水をかえてこの方法を更に２時間続けた。このゲル を取り出し、おだやかにふいて過剰の水を除き、そして再秤量した。重量は７． ８０ｇに低下し、減少な１２．２７ｇであった。はじめのゲル中のカードランの 量を計算して０．１８３ｇ（２０，０７／２７．３９６（ＵＲ製溶液の実際の量 ））Ｘｏ、２５ｇであることがわかった。すなわち、新重量は０．１８３／７． ８０＝２．３５％によって計算することができる。ゲル片を次いで完了に乾燥し て実際の（無水）ガム含量を証明した。この方法を他の濃度について（りかえし 、結果を表４に示した。

０．４％　２０．０３３　０．０７４　７．７８８　０．９５％０．６％　２０ ．０１２　０．１１０　８．１１５　１．３６％０．８％　２０．０６０　０． １４７　８．０００　１．８４％１．０％　２０．０７０　０．１８３　７．８ ００　２．３５％１．２％　２０．０６０　０．２１９　８．１８０　２．６８ ％このグラフの勾配をとって、６Ｍ尿素中で製造したカードランゲルの最終濃度 を計算するための次の方程式をえた；ｙ＝Ｑ、１９５＋２．０９３ｘ、Ｒ＝０． ９９３゜ カオトロープ−変性ゲルによる電気泳動カードランゲル（０，４％の初期濃度、 １．０３％の最終濃度）を製造して電気泳動媒質として使用した。Ｏ，１ｇの実 質的に純粋なカードランを１６．１ｍｌの蒸留水に懸濁させた。１．７８ｍ１の １．０Ｎ−ＮａＯＨを加えてこの試料をとかした。９．０１ｇの尿素（ミズリー 州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー、ロフト＃　４８Ｆ−０２３５ ）を加えて完全に溶解させた。この溶液を熱板上で５５°Ｃに加熱し、３５６μ ｌの５Ｍ酢酸を加えて溶液を中和した。このゲルをミニ・サブマリン電気泳動室 中で３ｍｍ厚さのゲルにキャストした。ゲルが形成された後に、これを取り出し て２１！の蒸留水中に入れて尿素を浸出させた。この方法を約６０時間の週末に かけて続けた。水を２１の新しい水にとりかえて更に６時間放置した。この洗浄 水を捨てて０．５ＸＴＢＥバツフアーにとりかえ、ゲルを一夜均衡化した。均衡 化ゲルを半分に切断して、半分をミニ室に入れた。０．５ＸＴＢＥ中の１％スー ケムＬＥアガロース溶液を製造して、カードランゲルに隣接するミニ室中でキャ ストした。アガロースがゲル化したら、この室を新鮮なバッファーでフラッディ ングさせた。このゲルに実施例６で述べたようにＤＮＡをのせ、電流を加え、試 料を６０ボルト（５Ｖ／ｃｍ）で４５分間電気泳動処理した。汚染、脱汚染、検 出および写真作成を前述のように行った。ＤＮＡ断片の可動性および移動は尿素 変性カードランにおいて非常に加促された。解像は良好であったが、帯はアガロ ースにみえられる鮮明さを欠いていた。

２３．１　６．５　１９．５ ９、　４　７．　５　２５．　０ ６．６　８．０　２８．０ ４、　３　８．　９　３０．　０ ２．３　１２．５　３２．５ ２．０　１３．５　３３．５ ０．５６　２３．５　３８．０ 変性 １．６Ｍ尿素を含む０．７５％（初期濃度、１．７７％の最終濃度）カートラン ゲルを上記のように製造した。バインドＩＩＩラムダ消化の電気泳動を、０．５ ＸＴＢＥバツフアー中でのカオトロープおよび均衡の浸出後に、このゲル中で行 った。操業時間は５Ｖ／ｃｍで３０分であり、過度であることがわかった。最小 の断片がミニ・ゲルから飛び出したからである。移動速度は非常に迅速であり、 実際のＤＮＡ’Ｐはむしろブロードであった。然し、これらは個々の帯の解像を 干渉しない。

２、上記のようにして製造した第２のゲル（０，７５％／１．７７％）を２５分 間電気泳動処理した。７つのバインドＩＩＩ　λＤＮＡ消化物の帯はそれぞれが 可視であり、強固な帯に解像された。個々の帯の分離は１つの例外を除いて良好 であった。２．０および２゜３キロベース対の断片は識別はできたが良くは解像 されなかった。

３．１％精製カードラン１０．５Ｍ沃化リチウムのゲルを上記と同様に精製し、 洗浄し、均衡化し、そして電気泳動処理した。ＤＮＡ断片を分離し、やや狭い帯 に解像した。この変性カードランゲル中の移動は１％アガロース・フレーミング ・ゲル中におけるよりも僅かに速かった。

３０ｇの実質的に純粋なカードランを１１の０．ｌＮ−ＮａＯＨにとかした。こ の物質をマイクロウェーブ・オーブン中で５５℃に加熱し、そして２Ｉ！の９９ ％イソプロピルアルコール中で直接に凝固させた。中和は省略した。凝固物をポ リエステル布を通す真空濾過によって回収した。過剰の流体はしぼって除いた。

この凝固物を次いで２１の８０％イソプロピルアルコール中で３０分間洗浄した 。　−凝固物を回収して９９％イソプロピルアルコール中で硬化させた。

回収後に、凝固物を強制熱風オーブン中で５５°Ｃで一夜乾燥した。

２８．８２４ｇの乾燥物質を回収した（９６％収率）。これを＃６０メツシュ（ ２５０ミクロン）のふるいを通して粉砕した。この物質１ｇをｌ００ｍ１の蒸留 水に懸濁させた。少しのかたまりか発見されたが、加熱すると溶液になった。１ ％フェノールフタレイン（５０％エタノール中）の数滴を加え、既に５５°Ｃに 加熱された溶液を５Ｍ酢酸で滴定した。０．６ｍｌの上記酢酸の添加後に、色の 損失によって示される終点に到達した。この中和溶液を７０Ｘ５０ｍｍの結晶皿 に入れてゲル化させた。ゲルを４℃で２時間冷凍した。

ゲル強度を上述のように分析した。３０．５ｇ／ｃｍ”の平均値をえたが、これ は中和後にえられる実質的に純粋なカードランよりもやや低い。これは低いガム 含量によって考慮されうる。

変性 １、ＮａＯＨ中の実質的に純粋なカードランの溶液の１％溶液を、加熱なしに、 ２倍容量（３００ｍｌ）の９９％イソプロピルアルコール中で凝固させた。洗浄 および乾燥（上述のように）後に、この方法からえられた生成物は室温の水にも 可溶であった。この物質（１％）のゲル強度は３９ｇ／ｃｍ”であることがわか った。

２、実質的に純粋なカードランの１％溶液の４種を次の濃度のＮａＯＨ中で生成 させた：０．ＯＩＮ、０．０５Ｎ、０．ＩＮおよび０．５Ｎ、これらの４種のカ ードラン溶液を５５゛Ｃに加熱し、２倍容量（８００ｍｌ）の９９％イソプロピ ルアルコール中で凝固させた。洗浄および乾燥（上記のとおり）の後にこの方法 からえられた生成物は室温の水にも可溶であった。凝固前のカードラン溶液のｐ Ｈも、水中で生成した１％の回収カードラン塩のｐＨ値と同様に、記録した。ま た水分％、灰分含量％、およびＮａイオン含量も記録した。カチオン含量は４種 のカードラン塩（下記に示す結果）について可視であったが、狭い範囲内で一定 であった。

３、精製カードランの１％溶液の４種を次のＫＯＨ濃度について上記のように生 成させた：Ｏ，ＯＩＮ、０．０５Ｎ、０．ＩＮおよび０．５Ｎ、えられたカード ラン塩は室温の水に可溶であった。これらの１％溶液についてｐＨ値、ならびに 水分％、灰分％、Ｋイオン含量、およびゲル強度を記録した。これら４種のカー ドラン塩生成物のカチオン含量は可視であったが、狭い範囲で相対的に一致して いることがわかった。

カードラン塩生成物の分析 ＊　水分補正 実質的に純粋なカードランの１％溶液を、実施例９で述べたように製造した。こ の非中和試料を３ミリの深さまでミニ室に入れた。

全体の室を大きな結晶皿（カルホルニア州すンフランシスコのヴイダブリューア ール・サイエンティフィックのキイマックス＃２３００．１９０ｘｌＯＯｍｍ） 中に入れた。ゲルを米国特許第４．Ｏ１２，３３３号に記載のトウル法により熱 硬化させた。トウル法（よ多糖類の塩基性溶液をガス状の酸無水物の雰囲気にさ らすこと（こよってβ−１，３−グルカンからゲルを製造する方法である。それ ぞれが約５０ｍ１の試薬級氷酢酸（カルホルニア州すンフランシスコのヴイダブ リュー・サイエンティフィック）を含む２つの１００ｍ１ビーカーを結晶皿に入 れ、次いでプラスチ・ツク・ラップで密封した。

これを室温で２４時間放置した。氷酢酸を除き、生成した今や氷酢酸で飽和した ゲルを水でフラッディングした。このゲルを次し）で実施例６のように０．５Ｘ ＴＢＥでフラ・ツデイングし、多くのノくツフア−を変えて１８時間にわたって 均衡させた。新鮮なバッファーを加え、バインドＩＩＩ　λＤＮＡ消化物を実施 例９、変性ｌに述べたように製造して入れた。電気泳動を５Ｖ／ｃｍで７０分間 行った。汚染、脱汚染、検出および写真を実施例６に示すように行った。７つ′ の断片の分離と移動が、実施例で述べた冷間硬化ゲル中で起こったように観察さ れた。然し、ＤＮＡの全体の可動性は低いようにみえた。

変性 実施例８のようにして１％の実質的に純粋なカードラン／６Ｍ尿素溶液を製造し た。この溶液を使用してミニ・ゲルを、トウルおよび上記の方法によって、製造 した。ゲル化、洗浄および均衡化の後に、０．５ＸＴＢＥバツフアー中の１％シ ーケムＬＥアガロースゲルを、カードランゲルに隣接するミニ室中でキャスティ ングした。

このゲルにＤＮＡ試料をのせ、変性カードランゲル中で行ったような電気泳動処 理を行った。ＤＮＡの可動性はアガロース・フレーミング・ゲル中にみられたも のと同等であり、カードラン・レーンの若干に帯の汚れが観察された。これは多 分、尿素または酢酸の不完全除去、またはバッファーによる不十分な均衡による ものであろう。

２５ｇの実質的に純粋なカードランを４０５ｇの蒸留水に室温で加えた。４５ｍ １のｌＮ−ＮａＯＨを加えて試料をとかした。この溶液を熱水浴に７６°Ｃでお だやかに加えた。１ＭのＮａＯＨ中の４゜４ＭのＮ　ａ　Ｂ　Ｈ４を含む溶液５ ｍｌを加えオーバーヘッドミキサーで１５分間攪拌した。１７ｇの固体ＮａＯＨ にュージャージー州フィリップスバーグのゲーカー・インコーホレーテッド、ロ ット＃２２０１８９）を含む溶液５０ｍ１を加え、次いで５０ｍ１の蒸留水と１ ０ｍ１の２−クロロエタノール（ロット＃　８１７Ｂ、ニューシャーシー州ロチ ェスターのイーストマン・コダック・カンパニー）を含む混合物を１０分間かけ て徐々に加えた。溶液の温度を８４℃に上げ、攪拌なしにこの温度を７０分間保 った。１３０ｍ１の室温蒸留水を加え、温度を８４℃に下げた。８滴の消泡剤（ １−オクタノール）を加えて泡を減少させた。３Ｍ酢酸を徐々に加えることによ って反応混合物の中和を始めた。１２０ｍ１の必要容量を加えた後に、大容量割 合のゲル化溶液を捨てた。約３００ｍ１の残存容量のアルカリ性物質を２１の９ ９％イソプロピルアルコール中に直接に凝固させた。この凝固物をポリエステル 布を通す濾過によって回収し、絞って過剰の液を除き、次いで１１の８０％イソ プロピルアルコール中で３０分間洗浄した。凝固物を同様に回収してＩｆの９９ ％イソプロピルアルコールに２０分間移した。回収後に、試料を５５°Ｃで数時 間乾燥した。試料（５，１８ｇ）を回収し、４０メツシユ（４２０ミクロン）ふ るいを通して粉砕した。乾燥試料は水中によく澄け、約ｌＯのｐＨをもつアルカ リ性溶液を５５°Ｃに加熱し、次いで中和したとき、冷却の際にゲルを生成した 。この挙動は実施例９の可溶性の場合と平行であった。ヒドロキシエチル化の効 果を正確に決定するために、１．５ｇを１３５ｍ１の蒸留水にとかし、５５℃に 加熱し、次いで５Ｍの酢酸で中和した。中和した試料を３００ｍ１の９９％イソ プロピルアルコール中で凝固させた。

微細な沈殿が生成したが、これを遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分）によって ペレットとして回収した。このペレットを移して５００ｍ１のイソプロピルアル コール中で粉砕した。試料を上述のように遠心分離によって回収し、５５°Ｃで 乾燥した。６９％（１，０４ｇ）の物質を回収した。この試料の１／２ｇを４５ ｍ１の蒸留水中で沸とうさせ、大部をとかした。中性ｐＨをもつこの溶液を氷浴 中て約１７°Ｃに冷却させて熱可逆性ゲルを生成させた。この物質は、そのゲル が８．５Ｍ尿素の溶液（それが溶解した）に対して安定ではなく、加熱の際に熱 硬化、熱不可逆性ゲルを生成しなかったという点で、非誘導化カードランとは異 なっていた。また、誘導体を用いて生成したゲルは例外的に透明であったのに対 して、非誘導体化カードランゲルは通常はやや不透明であった。このカードラン 誘導体の溶液ならびにその後の溶液中には非誘導体化カードランに比べて、著し い粘度の減少があった。これは８％濃度までのゲルの容易な製造を可能にした。

これに対して、カードランの４％ゲルの製造はむしろ困難であった。

変性 １．２５ｇの実質的に純粋なカードランを４７０ｇの２３℃の蒸留水に加えた。

１２ＭのＮａＯＨ４ｍ１を加え、溶液を熱水浴上で７９°Ｃに徐々に加熱した。

１０滴の消泡剤を加え、次いで１２．５ｍｌの１２ＭのＮａＯＨを加えた。２０ ｍ１の２−クロロエタノールを５０ｍ１の蒸留水に加え、次いで反応混合物の渦 中に２５分間にわたって滴下状に加えた。攪拌と加熱を６０分間続けた（最終の 溶液濃度は８４°Ｃであった）。１２０ｍ１の冷蒸留水（８°Ｃ）を加え、溶液 温度を６４℃に冷却した。このアルカリ性溶液を、３Ｍ酢酸１５９ｍ１で酸性化 した９９％イソプロピルアルコール１４００ｍ１中で凝固させた。凝固物をポリ エステル布を通す真空濾過によって回収し、絞って乾燥し、次いで１４００ｍ１ の７０％イソプロピルアルコール中で３０分間洗浄した。凝固物を同様に乾燥し 、５５°Ｃで１８時間乾燥した。生成物を回収しく２３．４５ｇ、９３゜８％収 率）、４０メツシユふるいを通して粉砕した。この生成物の１　／　２　ｇを５ ０ｍ１の蒸留沸とう水中で沸とうさせ、十分に溶解させた。溶媒のｐＨは中性で あった。冷却すると、非常に弾力のある熱可逆性ゲルが生成した。誘導体（変性 ジーゼル法）は５．３３％の置換度（Ｃ，Ｈ，Ｏ）を示した。ゲル化温度は５４ ．５℃であった。融点は１．５％ガム濃度で９１”Ｃであると決定された。

２、他の水準の２−クロロエタノールの使用は、同様に水溶性カードラン誘導体 をもたらしたが、これは若干の特性、主としてゲル化温度において異なっていた 。

追加の実験に使用した方法は上記の第１の変性に述べた方法であった。たとえば 、２５ｇの精製カードランと、４７５ｍ１の水と、４ｍｌの１４Ｍ−ＮａＯＨ中 の４．４ＭのＮ　ａ　Ｂ　Ｈ４と、３３．７５ｍ１の１２Ｍ−ＮａＯＨとの混合 物に、１５ｍ１の２−クロロエタノール（５０ｍｌ水中）を加え、８０℃の温度 で６０分間反応させた。凝固および回収は上記の変性１で述べたのと同じであっ た。

乾燥物質（２３，７６ｇ、９５％収率）を回収し、粉砕した。この物質は沸とう 水に容易に且つ十分にとけ、そして冷却すると可逆的ゲルを形成した。ゲル化温 度は６７℃であると決定され、融点は８３℃であった。

３．１０ｍ１のクロロエタノールを使用して、変性ｌで述べた変化（すなわち酸 性化アルコールの使用）をくりかえして実験をくりかえした。この第２の１０ｍ １誘導化でえられた物質は沸とう水に十分には可溶性ではなかった。１２５°Ｃ で２５分間オートクレーブ処理したときに十分に溶解した。

４、同様にして（１２ＭのＮａＯＨの必要容量の必要な調節を行った後に）、２ ５ｇの同じカードランを１２．５ｍｌの２−クロロエタノールを使用して誘導体 化した。２３ｇ（９２，０％収率）を回収し、４０メツシユ（４２０ミクロン） ふるいを通して粉砕した。

この物質は水溶性であったが、十分にとかすためには更に広い沸とうが必要であ った。ゲル化温度および融点はそれぞれ７５°Ｃおよび８９℃であるとそれぞれ 決定された。

５、同様にして、１２ＭのＮａＯＨを再び調節して、２５ｇのカードランを３０ ｍ１の２−クロロエタノール試剤を使用して誘導体化した。回収後に、２２．３ ５ｇ　（８９，４％収率）のヒドロキシエチル物質を粉砕した。この物質も沸と う水に可溶であった。２％溶液は３°Ｃに冷却しこの温度に一夜保ったとき直ち にゲル化はしなかった。融点は８１．５℃であると決定された。この物質の５％ 溶液は室温に冷却するとやや強いゲルを生成した。

０、１４９モル　２６０　ｇ／ｃが　５１　８８℃０．１４９３ｋ　ＮＡ　８３ 　９０ ０、１８６　２２８　７５　８９ ０．２２４　２３４　６７　８３ ０、２９８　２５３　５４．５　９１ ０．２９８＊　ＮＡ　７２　８８ 注） ゲル強度、２％においてとった。

ゲル化温度および融点は１．５％で決定した。

＊ナトリウム塩形体、溶解、中和および回収後。

６、ヒドロキシエチル誘導体の製造 上記変性２に述べた方法を使用して、５０ｇのカードランを３０ｍ１の２−クロ ロエタノール（０，４４８モル）を使用してヒドロキシエチル化した。生成物の 水分（６，９７％）および灰分含量（１，５１％）ならびにゲル化温度（６０〜 ７０°Ｃ）および融点（９０〜９６°Ｃ）を分析した。

７、ヒドロキシエチル誘導体の製造 上記の変性１に述べた方法を使用して、５０ｇのカードランを４０ｍ１の２−ク ロロエタノール（０，５９６モル）を使用してヒドロキシエチル化した。この生 成物の水分（８，６８％）、および灰分含量（１，１４％）ならびにゲル化温度 （６１，５〜７５℃）および融点（９１〜９９℃）も分析した。

８、グリセリル誘導体の製造 上記の変性２の方法を使用して、５０ｇのカードランを５０ｍ１のグリシドール （０，７５４モル）を使用して誘導体化した。このグリセリル誘導体の水分（７ ，０２％）および灰分含量（１，２８％）ならびにゲル化温度（４４，５℃）お よび融点（８８，５℃）を分析した。

９、照射カードランのヒドロキシエチル化照射（３００キロラド）した実質的に 純粋なカードランを９５ｍ１の蒸留水に懸濁させた。これに０．８ｍｌの４．４ Ｍ−ＮａＢＨ，（１４Ｍ−ＮａＯＨ）を加えた。次いで７分後に３ｍｌの１２Ｍ −ＮａＯＨおよび４滴の１−オクタツール（消泡剤）を加えた。

この混合物を７５°Ｃの水浴中で３０分間加熱した。更に２０μ！のＮ　ａ　Ｂ 　Ｈａ溶液を加え、次いで更に３．７５ｍ１の１２Ｍ−ＮａＯＨを加えた。３ｍ ｌの２−クロロエタノールおよび１０ｍ１の水を６分間にわたって滴下状に加え た。容器にカバーをして６０分間攪拌を続けた。最終の温度は７８℃であった。

２５ｍ１の９°Ｃの水を加えて溶液の温度を６５°Ｃに下げ、試料を３１．８ｍ ｌの３Ｍ酢酸を含む２Ｘ容量の９９％ＩＰＡ中で凝固させた。凝固物を真空濾過 によって回収し、２×容量の７０％ＩＰＡに３０分間移した。凝固物を再び回収 し、絞って過剰の水を除き、次いで５５℃で一夜乾燥した。乾燥物質（４，４１ ｇ、または８８．２％収率）を４０メツシユ（４２０ミクロン）ふるいを通して 粉砕した。試料は、０．５ＸＴＢＥとＩＸＴＡＥの双方のバッファーに可溶であ るが、ゲル化点は過度に高かった。ローリングボール中でのみ溶液にとどまって いる流体は熱源から除かれた時に直ちにゲル化し始めた。

グリセリル １．４ｍｌの４．４Ｍ−ＮａＢＨ，（１４ＭのＮａＯＨ中）を、４４０ｍ１の蒸 留水中の２５ｇの実質的に純粋なカードランに加えた。１５６ｍ１の１．２Ｍ− ＮａＯＨを加え、次いでｌＯ漬の消泡剤を加えた。この溶液を７４°Ｃに加熱し 、３０分間保った。１５ｍ１の蒸留水中の１２．５ｍｌ無水グリセトール（ミズ リー州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニーの＃　２４Ｆ−３４３７） の混合物を反応溶液の渦の中に６分間にわたって滴下状に加えた。

反応容器にカバーをして溶液を７０分間攪拌した。最終温度は７６℃であった。

この溶液は水浴中５６℃に加熱し、次いで３×容量の９９％イソプロピルアルコ ール中で凝固させた。このアルコールは９４ｍ１の５Ｍ酢酸で予め酸化したもの である。凝固物をポリエステル布を通す真空濾過によって回収し、次いで絞って 過剰の液を除いた。凝固物を３×容量の８８％イソプロピルアルコールに３０分 間移した。凝固物を上記のように回収し、次いで５５°Ｃで２０時間乾燥して２ ３．２２ｇ　（９２，９％収率）を得た。これを４０メツシユ（４２０ミクロン ）ふるいを通して粉砕した。この物質１ｇを９０ｍ１の蒸留水に入れ、始めに加 熱なしに攪拌し、次いで強く加熱した。水溶解は明らかでなかった。それ故１． ０Ｎ−ＮａＯＨを加えた。試料の大部分は、小さい白色の多数の粒子を除いてと けた。

この物質を５５°Ｃに加熱し、５Ｍ酢酸で中和した。非常に弱い、粘着性のゲル （測定しうるゲル強度なし）が冷却の際に生成し、これは加熱の際に可逆的であ ることを実証した。乾燥生成物は８．５Ｍ尿素を室温で容易にとかした。

２、実質的に純粋なカードランを使用して、および２５ｍ１のグリシドール試剤 （３０ｍｌの蒸留水中）を使用して上記の変性をくりかえした。別の変化は、グ リシドール試剤（前ＮａＢＨ，容量は４ｍｌであった）の添加前に追加の１ｍｌ のＮａ　Ｂ　Ｈ４溶液を加えることであった。反応時間および反応温度は同じで あった。乾燥物質（２５，６１ｇ、１０２．４％収率）を回収し、４０メツシユ （４２０ミクロン）ふるいを通して粉砕した。５０ｍ１蒸留水中のこの物質０． ５ｇの懸濁液を加熱して沸とうさせた。十分にとかした物質を水浴中で冷却する と透明な弱い粘稠ゲルを生成した。このゲルは加熱すると溶融するので熱可逆性 であった。このゲル片を６Ｍ尿素中に入れると十分に溶解した。また、乾燥試料 は室温で８．５Ｍ尿素中に容易にとけた。

グリセロール、エチレングリコール、ブタンジオール１．２５ｇの実質的に純粋 なカードランを４４０ｍ１の蒸留水中に懸濁させた。１４ＭのＮａＯＨ中にＬ　 ５ｍｌの４．４Ｍ−ＮａＢＨ，を加えた。７．５ｇ　ＮａＯＨを含む溶液１５６ ｍ１を加え、ビーカーにカバーをして、混合物を攪拌しながら熱水浴中で７５° Ｃに加熱した。溶液温度が８０°Ｃに達したら、カバーを除いて該物質を７１″ Ｃに冷却する。ボロハイドライドのはじめの添加から６０分後に、１２．５ｍｌ のグリセロール（ロット＃　６２７６、ニューシャーシー州チェリヒルのイーエ ム・サイエンス）を１５ｍ１の蒸留水にとかしたものを滴下状に加えた。ビーカ ーにカバーをつけて攪拌しながら加温した。最終温度は７８℃であった。溶液を 水浴中で６０°Ｃに冷却し、１５６ｍ１の３Ｍ酢酸で予め酸性化した３×容量（ １９５０ｍｌ）の９９％イソプロピルアルコール中で凝固させた。凝固物をポリ エステル布上の濾過によって回収し、３×容量の８０％イソプロピルアルコール に２０分間移した。凝固物を濾過によって回収し、過剰の液体を絞り出し、次い で試料を強制熱風オーブン中で１８時間５５°Ｃで乾燥した。乾燥生成物（２２ ，０７ｇ、８８．２７％収率）を回収し、４０メツシユ（４２０ミクロン）ふる いを通して粉砕した。この物質は室温で、または沸点で水にとけなかった。この 物質は母体カードランとは異なった性質を示した。

処理物質は、少量の白色小粒がとけなかったので、０．ｌＮ−ＮａＯＨ中に十分 には可溶でなかった。２２．５ｍｌの１．０Ｎ−ＮａＯＨ中に０．５ｇをとかす ことによって２％溶液を製造した。溶液を５５°Ｃに加熱し、２．５ｍｌの９． ８Ｍ酢酸で中和し、次いで水浴中で冷却することによってゲルを製造した。この ゲルは母体カードランから製造したゲルよりももっと不透明でもっと白色であっ た。

またこのゲルは担体ゲルよりももっと脆くて弾力がもつと小さかった。この試料 のゲル強度は、母体物質から製造した２％ゲルについての２３０ｇ／ｃｍ”の値 に比べて１２１ｇ／ｃｍ”であった。１％のゲル強度は２８ｇ／ｃｍ”であった 。このゲルの小片を８．５Ｍの尿素に入れてカオトロピン剤の安定性をチェック した。また、０．０５ｇの粉末を８．５Ｍ尿素の５ｍｌ中に入れたとき試料が溶 解した。冷却すると、試料は透明な弱いゲルを生成した。対照標準実験を上記の 条件をくりかえして行った。唯一の相違は反応混合物にグリセロールを加えなか ったことである。このゲルから製造した１％ゲルは弱かった（２４ｇ／ｃｍ’） 。乾燥試料は８．５Ｍ尿素にはとけたが、６Ｍ尿素にはとけなかった。

２、上記の変性ｌと同様にして、グリセロールの代わりに１．　２−ブタンジオ ールをグリセロールの代わりに使用した。２５ｍ】の蒸留水中の２５ｍ１　（０ ，２７９モル）の１．　２−ブタンジオール（ウイスコンンー州ミルウオークの アルドリッチ・ケミカル・カンパニー、ロット＃　６１１７ＫＨ）の混合物を、 ３０分間のアルカリ性活性化の後に、カードラン溶液に加え、次に６０分間加熱 した。

試料を前述のように凝固させ、回収し、乾燥した。この方法で２３゜８２ｇをえ たか、これは９５．３％の収率を表す。この物質は水中（室温の、及び沸とうす る）に不溶であった。この物質は塩基中にとけず、ゲルはノルマル法によって製 造してからゲル強度の試験を行った。１％ゲルについて５２ｇ／ｃｍ”のゲル強 度かえられた。

同じゲルを試験してゲルが熱可逆性であるか、あるいは高温に加熱したとき熱硬 化ゲルを生成するかを決定した。このゲルは、８０°Ｃの水浴に入れたとき、溶 融せずに熱硬化ゲルを形成した。このゲルのゲル強度を試験して、それが８７ｇ ／ｃｍ”であると決定された。

この物質（乾燥粉末）はまた僅かに加熱したときに８．５Ｍ尿素に完全に溶解す ることがわかった。室温に冷却したら、９６ｇ／ａｍ２の破壊強度をもつ不透明 ゲルを生成した。６Ｍ尿素中で試験したとき、それは加熱にもかかわらず、室温 に冷却の際に依然として弱いゲルを生成した。双方のゲルは熱水に加熱したとき 熱可逆性であった。

３、上記変性１に述べた方法を１つの変化を用いてくりかえした。

すなわち、１５ｍ　ｌ　（０，２６９モル）のエチレングリコールにュージャー ジー州フィリップスパークのジェイ・ティ・ベーカー・ケミカル・カンパニー、 ロット＃　６３７６１０）を含む２５ｍ１の蒸留水の混合物を、アルカリ活性化 の後に、加えた。乾燥物質（２３，８２ｇ、９５．３％収率）は水不溶性であっ たか、中和アルカリ性溶液から生成した１％ゲルは、６０ｇ／Ｃｍ”のゲル強度 をもっていた。それは１０１ｇ／ｃｍ”のゲル強度をもつ熱硬化ゲルを生成した 。粉末も加熱時に８．５Ｍ尿素に十分に可溶であった。

それは室温でゲルを生成しないが、冷凍すると迅速にゲルを生成した。加熱にも かかわらず、この物質は６Ｍ尿素に僅かに部分的にのみ可溶であった。それは室 温で弱いゲルを生成した。

誘導体化用試剤のモル比 ２−クロロエタノール　８０．５１　１．２０１　６７、０３６グリセロール　 ９２．１０　１．２６１　７３．０３７グリシドール　７４．０８　１．１１　 ？　６６、３２１プロピレングリコール　７６、　ｌ　Ｏ１，０３６７３，４５ ６１，２−ブタンジオール　９０．１２　１．００６　８９．５８３エチレング リコール　６２．０　？　１．１１３　５５．７６８Ａ、ｌ０ｍ１　０．１４９ 　オートクレーブ処理の際に十分に可溶性 Ｂ、１２．５　０．１８６　熱水に可溶Ｃ，Ｉ５　０．２２４　〃 Ｄ、２０　０．２９８　” Ｅ、３０　０．４４８　Ｎ グリセロール Ａ、＋２．５　０．１７１　水溶性でないグリシドール Ａ、１２．５　０．１８８　水溶性でないＢ、２５　０．３７７　熱水に可溶 実施例１２ 電気泳動媒質としてのヒドロキシエチルカードランの使用実施例１１の第１の変 性において述べた方法によってえた物質の３ｇを７５ｍ１の蒸留水にとかすこと によってヒドロキシエチルカードランの４０％溶液を製造した。この溶液をミニ ・サブマリンゲル電気泳動室に入れて冷却した。このゲルを０．５ＸＴＡＥバツ フアー中で９０分間均衡させた。レーンに次の種類および量のＤＮＡをのせた。

２２５０ｎｇのｐＢＲ３２２−Ｍｓｐ−Ｉ　（７サチユーセツツ州ビバリーの二 ニー・イングランド・バイオラボラトリーズ）、Ｉ　１２５ｎｇのｐＨｌＸ１７ ４／ＨＡＥ　ＩＩＩ　（メリーランド・ゲイサースパークのベセスダ・リサーチ ・ラボラトリーズ）および２００ｎｇのλＨｉｎｄ　ＩＩＩ　（メリーランド・ ゲイサースパークのベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）。電気泳動を８０ボ ルト（６，６７Ｖ／ｃｍ）で６０分間行った。ブロモフェノールブルー・トラッ キング染料はゲル中を移動したが、それは非誘導体化カードラン中ではそうでは なかった。この染料の前面は５．３ｃｍにあった。このゲルを汚染および脱汚染 したが、脱汚染の時間は２倍であった。３４〜１０７８塩基対の範囲の寸法のＤ ＮＡ破片が解像された。この範囲外の断片はこれらの条件下では検出しえないか あるいは解像されなかった。

次の実験に使用する物質を、実施例１１の方法を使用してえたナトリウム塩形体 のカードランから誘導した。２５ｇのカードランを２０ｍ１の２−クロロエタノ ールで変性し次いで非酸性化アルコール中で凝固させた。この塩の１０ｇを９０ ０ｍ　ｌの蒸留水にとがし、５５°Ｃに加熱し、９．８Ｍ酢酸で中和し、次いで ２×容量の９９％イソプロピルアルコール中で凝固させた。この物質を遠心分離 によって回収し、２×容量の７０％イソプロパツール中で洗浄し、前のように回 収し、２Ｘ容量の９９％イソプロパツール中で脱水し、回収して６０°Ｃで１８ 時間乾燥して、６．８２６ｇ（６８，３％）をえた。この物質を次の実験に使用 した。

１、ＩＸＴＢＥバッファー中の４％ＮｕＳｉｅｖｅ　３：１　アガロースゲル（ ペンシルバニア州フィラデルフィアのエフエムシー・コーポレーション）を水平 電気泳動室にューヨーク州アクエボーグのアクエボーグ・マシン・ショップ、モ デル＃８５０）中にキャストした。３レーンの２枚のストリップを切断し、ウェ ルは手つかずのまま残した。テーパ付ビーカーに含まれる２５ｍ１のＩＸＴＢＥ バッファー中で上記の物質１．５ｇおよび２．０ｇを沸とうさせることによって ６％および８％濃度のヒドロキシエチルカードランゲルの溶液を製造した。完全 に溶解した後に、これらの再秤量し、失われた量の蒸留水を加えた。これらの溶 液を使用してカットしたレーンを満たし、冷却した。ゲルを追加のバッファーで フラッディングし、それぞれのゲル型の３レーンに次のＤＮＡマーカーをつけた 。１５００ｎｇおよび２１００ｎｇの荷重水準のｐＢＲ３２２−ＭｓｐＴ、およ び２００ｎｇのｐＨｌＸ１７４／ＨＡＥ　ｌ１ｌａ１２０ボルト（３，５Ｖ／ｃ ｍ）を２３０分間加えた。個々のゲル中の染料前面は次のとおりであった。１１ ．５ｃｍ（６％カードラン）、１０．３ｃｍ（８％カードラン）および１２．３ ｃｍ（４％アガロース）。ゲルを３０分間汚染し、−覆膜汚染した。移動パタ゛ −ンは３種のすべてにおいて同様であったが、可動性は４％アガロースにおいて 最も速く、８％ヒドロキシエチルカードランにおいて最も遅かった。帯の拡散は （−夜の脱汚染のために）すべてのゲルにおいて明らかであったが、２つのカー ドランゲルにおいてがなり少なく、それらは依然として鮮明な帯をもっていた。

高濃度にもがかわらず、８％カードランゲルはロールして管にするに十分な柔軟 性があった。これに対してアガロースゲルは僅かに曲げただけで割れた。

２、カードラン誘導体の電気泳動比較 ２％　ＬＥアガロース・フレーミングゲル（水平サブマリン室（モデル８５０、 にューヨーク州アクエボーグのアクエボーグ・マシン・ショップ）中で０．５Ｘ ＴＢＥ中でキャストした）を９レーンスロツトホーマーを使用して実験した。種 々のカードラン誘導体の試料は３％濃度で０．５ＸＴＢＥバツフアー中で製造し た。試料は次のとおりであった。

試　料　試剤モル／２５ｇ　ｈ−Ｆうｙ　実施例参照Ｎｏ、　”ヒドロキシエチ ル　０，１８６　Ｅｘ、１１−４ヒドロキシエチル　０．２２４　Ｅｘ、１１− ６ヒドロキシエチル　０．　２９８　Ｅｘ、１１−７ヒドロキシエチル　０．４ ４８　Ｅｘ、１１−５グリセリル　０．３７７　Ｅｘ、１１−８０ヒドロキシエ チル・ヘッディング下でのすべてスロット・ホーマーをフレーミング・ゲルから 除き、レーンに上記の試料を満たした。残りの３レーンには３％ＬＥアガロース 溶液を満たした。ゲル化の後に、ゲルを０．５ＸＴＢＥバツフアーでフラッディ ングさせ、それぞれのレーンに４μｍのφｘ１７４ＨＡＥＩｆ　（１５０ｎｇ／ ｕ　Ｉ）をのせた。電圧を５Ｖ／ｃｍ（１７２ボルト）で１１０分間加えた。ゲ ルを臭化エチジウムで汚染させ、次いで水中で脱汚染を行った。結果は、グリセ リル誘導体かふるい分けにおいてアガロース対照標準と均等であることを示した 。最初の３つのヒドロキシエチル誘導体のふるい分は能力は置換水準の増大につ れて増大し、すべてアガロース対照標準よりもより多くふるい分けした。然し、 最後のそして最も高度に置換されたヒドロキシエチル誘導体はふるい分けが最も 少なく、アガロースよりもふるい分けが少なかった。

３．１Ｌ気泳動媒質としてのグリセリルカードランＩ　ＸＴＡＥバッファー中の ４％ＮｕＳｉｅｖｅ　３：１ゲルをモデル８５０の水平サブマリン室にューヨー ク州アクエボーグのアクエボーグ・マシン・ショップ）中でキャストした。ゲル 化の後に、６レーンをカットし、グリセリル　カードラン（Ｅｘ、１ｌ−８）の ３．５％溶液を満たした。この室をバッファーでフラッディングし、ウェルに１ ．２および３μｍ容量のｐＢＲ３２２Ｍｓｐ　１消化物（２５０ｎ　ｇ／ｉｔ　 １）をのせた。試料を４時間３．５Ｖ／ｃｍで電気泳動させた。上記かられかる ように、グリセリルカードランのふるい分は能力はアガロース対照標準と非常に 類似しており、それぞれのマトリックス中の帯の可動性もほとんど同じであった 。

また、カードランゲルは２３８／２４２％？の対を解像することができた。これ に対して、アガロースゲルはそうすることができなかった。

溶解カオトロープを含むアルカリ性カードラン溶液は、中和および冷却をしたと きにゲルを生成するということが実施例５に示された。またカードランはアルカ リ性溶液（＝ｐＨ１０，７以上）または極性有機溶媒たとえばジメチルスルホキ サイド（ＤＭＳＯ）にのみとけるということも示された。また、水溶性カードラ ンはアルカリ性カードラン溶液（実施例９）をアルコール中で凝固させることに よって単離しつるか、またはカードランが好適に誘導化される（実施例ＩＩ）な らば単離しうろことも示された。

尿素は変性タンパクおよび単一ストランドＤＮＡへの電気泳動に常用されている ので、尿素に直接にカードランをとかすのが好ましい。問題は尿素が熱に不安定 で、アンモニアを発生し、これがカードランゾルをアルカリ性にしてゾルを永久 にゲル化させることである。この問題の解決は温度を低く保つことである。

カードランを尿素にとかすために、そしてかたまりを避けるために、（ａ）添加 速度（すなわち、カードランの溶解）および（ｂ）添加中の溶液の熱の増加速度 と最終温度の双方）、および（ｃ）攪拌を伴う溶解（好ましくはかきまぜによる ）を制御すべきである。

カオトロープ中の溶解度とゲル化 予めグリセロールと反応させたカードラン（実施例１１）の小試料（０，０５ｇ ）を５ｍｌの８．５Ｍ尿素中に懸濁させ、温和に加熱した。試料は究極的に完全 に溶解する。更に、弱いゲルが冷却の際に生成する。これをくりかえす努力にお いて、０．６ｇの同じ物質を６Ｍの尿素２０ｍ１に入れて加熱する。長い間の沸 とうにもかかわらず、溶液は曇りにとどまった。追加の乾燥尿素を加えて加熱を 続けた。カートランは完全にとけたが、過剰の尿素のために、溶液は冷却すると 結晶化した。

炙−ユ １、一連の実験を行って、種々のカードランの６Ｍおよび８，５Ｍ尿素中の試料 の溶解度を決定した。それぞれの場合に、ｏ、２５ｇのカードランを２５ｍ１の 溶解カオトロープ中に懸濁させた。試料を室温で３０〜４５分間攪拌して、カー ドランがこの温度でとけるか否かを決定した。この時間の後に不溶粒子が残って いれば、試料を徐々に且つ温和に加熱し、次いで溶解が完全でなければ更に激し く加熱した。溶解（または部分溶解）した粒子を室温で冷却し、そして数時間と どめる。ゲル化が起こらなければ、試料を一夜冷凍してゲル化を再チェックした 。ゲルのゲル強度（好適に生成していた場合）、可逆性、および熱硬化性を検査 した。これらの結果の要約は下記の表５に見出すことができるが、若干の観察を ここに述べる。９個の試料のそれぞれは８．５Ｍ尿素に可溶であったが、はとん どは加熱を必要とした。次いですべての試料をゲル化した。ただ　・し水溶性で あったもの（すなわちヒドロキシエチル化カードラン）およびグリシドールと反 応させたものを除いた。６Ｍおよび８．５Ｍの尿素中で生成したすべてのゲルは 可逆性であり、熱硬化ゲルを生成しなかった。３種の試料のみが８．５Ｍ尿素中 で強固なゲルを生成した。それらは粗、精製、およびエチレングリコールと反応 したカートランである。他のゲルは全く弱かった。粗カードランは６Ｍ尿素中で 強固なゲルを生成する唯一の試料であった。４種の試料のみが６Ｍ尿素中に溶解 したが、他のものは種々の程度に溶解した。

１つの注目すべき例外を除いて、すべてのゲルは不透明であった。

上記の例外とは実質的に純粋なカードランが明らかな透明ゲルを生成したことで ある。カードランは、尿素溶液が始め室温にあり、次いで（必要があれば）加熱 された場合にのみ可溶であった。カードランの添加前に尿素溶液を加熱（８０° Ｃ）するとき、試料はとけない。更に、それは溶解に（及びゲル化に）使用した 加熱（およびありうる冷却）の速度、および／または程度、および／または長さ が、ゲルの強度にあたかも影響しているかのようにみえる。

表　５ グリシドール　訂（６）−１５１室温　なし　なしグリシドール　Ｉｌ″７００ ３−１４１　”　な　し　な　しグリセロール　「（６）−１３７加熱　な　し 　あ　リ　弱、不透明俯ｊ＋！０−ル狽　１７００３−１４８　加熱　なし　あ り　職不躬ブタンノオール　Ｅ７１４２−２　殆確温　あ　リ　−９６ｇ／ａｎ ’精製　ＰＰ０４１７　加熱　なし　あり　粘稠、躬〃ＰＰ０４０４　加熱　な し　あり　１８１ｇ／ａｎ２＃ｊＥ性粗　ＲＦＯ８加熱　あり　−２３５ｖａｎ ”ヒドロキシエチル　Ｅｒ２Ｏ３−１２６室　温　な　し　な　しエチレングリ コール　Ｅ７１４２−３　加　熱　な　し　あり、速い　８５ｇ／ａｎ２９００ に一７ド　Ｅｒ２Ｏ３−１８加熱　なし　あり　詠不馴ナトリウム塩　Ｅｒ２Ｏ ３−１６室温　な　し　な　し　中和後ゲル化グリシドール　室　温　な　し　 な　しグリシドール　室温　なし　なし グリセロール　低、加熱　あ　リ、徐　弱、不透明月セロール′Ｈ，鍬論　なし 　なし ブタンジオール　部分的、加熱　あ　リ、徐　弱、不透可融りｌ讃　部頒り、聰 　あり　宇ａ　Ｉｆ’Ａ粗　加　熱　あり　１７３ｇ／ｃｍ” ヒト０キノエチル　室　温　な　し　な　しエチレングリコール　音夕号伯り、 加熱　あ　リ　！　不馴２、他のカオトロープ中のカードランの溶解度およびゲ ル生成能力を検査するために、０．２５ｇの粗カードランおよび実質的に純粋な カードラン試料を２５ｍ１の４Ｍグアニジンイソチオシアネート（ロット＃ｌ、 １０９ＦＯＯ５０）（ミズリー州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー ）中に室温で懸濁させた。３０分後に、温和な加熱をこの時点で加え、試料を十 分にとかした。室温に冷却すると、両方の溶液が弱い全く透明なゲルを生成した 。それらはいずれも可逆性であり、熱硬化しなかった。

３、グアニジンイソチオシアネートの濃度を０，５Ｍにへらしたとき、カートラ ンは溶解するようには見えなかった。膨潤粒子を濾過して除くと、濾液は９９％ イソプロピルアルコール中に凝固物を作らなかった。

４．１ｇの実質的に純粋なカードランをｐＨ１０，３の３Ｍ沃化リチウム１００ ｍ１に懸濁させた。これを沸点に加熱するとそれは十分にとけた。一部（５０ｍ ｌ）を５５℃で中和した。冷却すると強固なゲルが迅速に生成し、ゲル強度は２ ３４ｇ／ｃｍ２であった。

このゲルも可逆性であることがわかった。この冷間硬化ゲルの一部を実施例５の ように熱硬化したとき、ゲルは溶融し、これを再度冷却したときゲルを再び生成 した。ゲル強度は２８０　ｇ／ｃｍ’であった。この冷間硬化ゲルの別の部分を 実施例５のように洗浄すると１５９ｇ／ｃｍ”のゲル強度をもつゲルかえられた 。

５、実質的に純粋なカードランを照射（９００にラド照射量）によって分解した ものの溶解度も検査した。加熱後に、試料は８．５Ｍ尿素には十分に溶解しなか ったが、６Ｍ溶液には溶解しなかった。

溶解試料を５５℃で中和したがゲルは生成しなかった。この溶液を透析管に入れ 、２１の蒸留水中に入れたが、数時間後にゲル化した。

第２の試料を８．５Ｍ尿素にとかしたが中和はしなかった。それは急冷の際に弱 い不透明ゲルを生成した。このゲルは加熱すると溶融し次に急冷後にゲル化する ので可逆性であることがわかった。

６、実質的に純粋なカードランの水溶性ナトリウム塩を８．５Ｍ尿素中で溶解度 とゲル化の双方について試験した。０．２５ｇの試料を２５ｍ１のカオトロープ に入れると室温で容易にとけた。溶液のｐＨはｐＨ試験紙で示すようにｐＨ＝１ ０であった。試料は室温でも又は冷凍にしてもゲル化しなかった。試料を５５℃ に加熱し数滴の５Ｍ酢酸で中和した。急冷するとかなり透明なゲルを生成しゲル 強度は５２ｇ／ｃｍ’であった。このゲルは加熱すると十分に溶解した。

７、このような物質中にとけた及び生成したゲルからカオトロープを除去する効 果（存在する場合）を検査するために、６Ｍおよび８．５Ｍの尿素溶液に０．２ ５ｇの粗カードランをとかすことによって２種のゲルを製造した。ビーカーから ゲルを除き、それぞれを４１！の蒸留水中で２４時間洗浄した。好適な急冷の後 に、ゲルのゲル強度を試験した。６Ｍ尿素のゲルは７９８ｇ／ｃｍ″のゲル強度 をもっていたが、８．５Ｍのゲルは９２２ｇ／ｃｍ”のゲル強度をもっていた。

ゲルの熱安定性を決定するために、これらのゲルを沸とう水浴に３０分間入れた 。これらのゲルは熱的に安定であり、溶融しなかった。このような試剤を配合し て溶解および生成させたゲルからグアニジンイソチオシアネートを除去する効果 を決定するために、０．２５ｇの実質的に純粋なカードランを、４Ｍのグアニジ ンイソチオシアネート溶液（２５ｍｌ）にとかすことによって、ゲルを生成させ た。このゲルは透明で非常に粘稠性であった、それ故、２Ｉ！の蒸留水中で２４ 時間洗浄したときにビーカー中にゲルが残った。蒸留水を３〜４回とりかえた。

ビーカーに残ったゲルを２０時間洗浄した後に、ゲルをビーカーから取り出して 更に４時間洗浄した。好適な急冷後に、ゲル強度は３０９　ｇ／ｃｍ”と測定さ れた。

このゲルを沸とう水浴中で２０分間熱硬化させたとき、ゲルは熱硬化の前に完全 に溶融した。

８、若干の条件下に、たとえばカオトロープ中での懸濁の後に懸濁液を直接に且 つ迅速に加熱するとき、恐らくこの物質の若干を熱間硬化に導く条件下に、８Ｍ および８．５Ｍの尿素溶液中での実質的に純粋なカードランの部分溶解度が観察 された。この事実は、尿素溶解度にもとづく粗分離を可能にした。５１．０５ｇ の尿素（ミズリー州セントルイスのシグマ・ケミカルからのロット＃　４８Ｆ− ０２３５）を７５ｍ１の蒸留水にとかすことによって、次いで溶液の容量を蒸留 水により１００ｍ１にすることによって８．５Ｍの最終モル濃度を与えて、８． ５Ｍ尿素溶液を製造した。ｐＨは８゜３であった。ＩＯｇの実質的に純粋なカー ドランをこの８．５Ｍ尿素溶液に加えて一定に攪拌しながら熱板上で加熱した。

ポリエステル布を使用して不溶性カードランを真空吸引により濾過して取り出し 、溶解部分を５００ｍ１のフラスコに集めた。尿素可溶性カードランを２００ｍ １の９９％イソプロピルアルコール中で凝固させた。

凝固したカートランを７５０Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離し、９９％イソプロピ ルアルコール中で３０分間洗浄した。凝固物をポリエステル布を通す真空濾過に よって回収し、過剰のアルコールを絞り出した。回収後に、このカードランを５ ５°Ｃで一夜乾燥した。回収カードラン０．６５６ｇを、４０メツシユ（４２０ ミクロン）ふるいを通してトーマス・ワイリイ・ミル中で粉砕した。この回収カ ードランを使用して１％塩基性水溶液を製造した。この溶液を５５°Ｃで中和し 、冷却させた。然しなから、これを冷凍したときゲルは生成しなかった。この溶 液を蒸留水（２１）に対して６時間透析したとき、弱いゲルが生成した。

９　変性ゲル電気泳動 ２５ｍ１のｌ　ＸＴＡＥ／７Ｍ尿素バッファー中に０．５ｇの実質的に純粋なカ ードランを懸濁させることによって変性カードランゲルを製造した。このカード ランを室温で１０〜２０分間攪拌してから、まず温和に徐々に、究極は溶液を沸 とうさせるまで、加熱した。

溶液をミニ・サブマリン室中でキャストして冷却させた。ゲル化したら、これを バッファーでフラッディングして冷凍室中に一夜貯蔵した。翌朝バッファーをと りかえ、ゲルを室温に加温した。λＨＩＮＤ　ＩＩ＋の溶液をトラッキング染料 を加えたＩ　ＸＴＡＥ／７Ｍ尿素中で製造した。ウェルに５μｍの又は２００ｎ ｇのＤＮＡをのせ、４Ｖ／ｃｍを２時間加えた。汚染および脱汚染の後に、ＤＮ Ａの移動がごく僅かあったことが観察された。３つの最小の！？（０，５６，２ ，０および２．３ｋｂ）が非常に明瞭で鮮明な情としてみられた。

１０、ホルムアミド／尿素溶液中での変性カードランゲルの製造カードランを変 性勾配電気泳動中のマトリックスとして使用することの可能性を検査するために 、７Ｍ尿素／４０％ホルムアミド溶液中での第１カードランのゲル形成能力を検 査することが必要であった。それ故、４．２０ｇの尿素を＝３ｍｌの脱イオン水 にとかした。容量を４ｍｌに調節し、４ｍｌのホルムアミドを加えて容量を１０ ｍ１とし、尿素の濃度を７Ｍに、ホルムアミドを４０％にした。

この溶液に、０．１ｇの実質的に純粋なカードランを攪拌しながら加え、十分に とけるまでおだやかに加熱した。試料を冷凍した。その際に非常に透明で弱いゲ ルが生成した。広い範囲の変性濃度中でのカードランのゲル化濃度を更に試験す るために、０．２ｇの実質的に純粋なカードランを３．５Ｍ尿素／２０％ホルム アミド溶液２０ｍ１に懸濁させ、とけるまでおだやかに加熱した。室温に冷却す ると不透明ゲルか生成した。また０、０５ｇの同じカードランを５ｍｌの１００ ％ホルムアミド中に懸濁させ、おだやかに加熱した。

試料は十分に溶解し、室温に冷却すると透明ゲルを生成した。

１１、尿素中のカードランの融点とゲル化温度の決定直接の溶解および７Ｍ尿素 中でのゲル化によって製造した１％カ−トランゲルの融点を決定した。実質的に 純粋なカードランの０゜２５ｇ試料を２５ｍ１の７Ｍ尿素にとかし、徐々におだ やかに加熱することによって溶解させた。この試料を試験管に移し、温度計を挿 入した。この試料を冷凍室でゲル化させてから水浴に入れておだやかに加熱した 。融点は１９°Ｃであると決定された。別の実験において、臨界温度中和（ＣＴ Ｎ）法によってゲル化させた７Ｍ尿素中の１．５％カードランゲルのゲル化温度 と融点も測定した。２２ｍ１の７Ｍ尿素溶液に、０．３７５ｇの実質的に純粋な カードラン、および２．５ｍｌの１．０Ｎ−ＮａＯＨを加えた。溶解したら、試 料を５５°Ｃに加熱し、０．５ｍｌの５Ｍ酢酸で中和した。試料を試験管に入れ 、ゲル化するまで冷凍した。ゲルを水浴に入れておだやかにかきまぜた。十分に 溶融したら、試料を冷却してゲル化温度を照射した実質的に純粋なカードラン（ ６００にラド）のＩｇを２５ｍ１の８．５Ｍ尿素中に懸濁させ、１０分間かきま ぜた。次いでビーカーを水浴に入れ、試料が十分にとけるまでおだやかな熱を加 えた。この溶液を脱ガスして気泡を除き、次いでこれをサブマリン小室中でゲル を厚さ４ｍｍにキャストするのに使用した。全体のユニットを１時間冷凍した。

このとき試料は強固なゲルを生成した。

この小室とゲルを２１！の蒸留水に浸漬し、尿素を１５時間洗い落とした。水を 変えてゲルを更に２時間洗浄した。８レーンのゲルを半分に切り、そのうちの１ つを小室に入れた。ｌ　ＸＴＢＥバッファー中の４％ＮｕＳｉｅｖｅ　アガロー スゲル（３／ｌのブレンド）をカードラン挿入のまわりに注入した。次いてこの ゲルを１ｘＴＢＥバツフアーでフラッディングさせ、２時間均衡させた。カード ラン・レーンにｐＢＲ３２２鼠且２Ｉ　消化物およびｐＨＴＸ１７４Ｈａｅ　Ｉ ＩＩ　ＤＮＡ消化物の４５０ｎｇ試料および６００ｎｇ試料をのせた。これらの 試料を６０ボルト（４，２８Ｖ／ｃｍ）で８０分間電気泳動した。アガロース中 のトラッキング染料の前面は５゜２ｃｍであった。それはカードラン中では移動 しなかった。ゲルを臭化エチジウム（ｌμｇ／ｍｌ）中で１５分間汚染させ、水 で洗い、次いて１５分間脱汚染した。ゲルをＵＶ光のもとで検査し、写真にとっ た。写真の分析は、ｌＯ塩基対だけ異なるＤＮＡ断片の良好な分離と解像を示し た。移動速度を含めて全体の結果はアガロース・ゲルに匹敵した。

２００にラド照射物質についての１％および５％における部分解重合粗カードラ ンゲルの製造は、０．５Ｍ−ＮａＯＨを使用して照射粗カードランをとかした以 外は、実施例２と実質的に同じであった。５５°Ｃでカードラン溶液を中和する のに使用する５Ｍ酢酸を５５°Ｃに予熱した。２００にラドで処理した粗カード ランは、５％濃度において、中和後直ちにゲル化が起こる。ゲル強度は照射カー ドランの濃度の増大につれて増大し、１％照射粗カードランにおいて５７ｇ／ｃ ｍ”、５％照射粗カードランにおいて６１４ｇ／ｃｍ２１　粗カードランを６０ ０にラドの放射で処理した以外は上記と同じである。解重合の増大（６００にラ ド）の増大につれて、ゲル強度は減少する。６００にラドで処理した粗カードラ ンを使用して作った１％ゲルについて、ゲル強度は１２ｇ／ｃｍ’であり、５％ ゲルでは３４６ｇ／ｃｍ”であった。

２．２００にラドおよび６００にラドの放射によって処理した粗カードランを実 施例４のように精製した以外は上記と同じである。

ゲルを１％〜４％で生成させ下記に示すゲル強度をえた。

２　＋９６　５３ 照射ヒドロキシエチル化カードランを用いる電気泳動実施例１１−６で製造した ヒドロキシエチル化カードランを６００にラド水準で照射した。ＩＸＴＢＥ中の ４％　ＮｕＳｉｅｖｅ３：ｌゲルを小室中でキャストした。３つの中心レーンを 除いてこれに照射ヒドロキシエチル化カードランの６％溶液を満たした。溶液の 粘度は低く、ゲル化温度は依然として高い（２７２°Ｃ）けれども実施例１１− ９のヒドロキシエチル化照射物質よりもずっと良好であった。カードラン・ウェ ルには６００．９００および１２００ｎｇ量のｐＢＲ３２２Ｍｓｐ　Ｉをのせた が、アガロース・ウェルには９００ｎｇをのせた。６０ボルトを１３５分間加え ることによって試料を電気泳動処理した。汚染および脱汚染の後に、ゲルを検査 した。ＤＮＡ可動性はアガロース中よりもカードランゲルにおいて顕著に遅れた 。解像は良好で、帯の鮮明さは、特に大きな断片（＞１４０ｂｐ）について、良 好であった。カードランゲルはまた取扱い特性において非常にすぐれていた。

天然カートランのふるい分けに及ぼす照射水準の効果２％ＬＥアガロース・フレ ーミングゲル（０，５ＸＴＡＥ中の）をモデル８５０の水平サブマリン室に入れ た。スロットホーマーを使用して９レーンを作った。これらのレーンに２％カー ドランの中和溶液を満たした。それぞれは異なった水準の照射（５０〜９００に ラド）を受けた。追加のレーンに天然カードランおよび２％ＬＥアガロースを満 たした。次いでゲルをバッファーでフラッディングし、ウェルに１５０ｎｇ／μ ｌのＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ　λ　ＤＮＡの３μｌを入れ、最後に１４０ボルトで ２時間電気泳動処理した。ゲルを前述のように汚染および脱汚染した。断片の可 動性をゲルのそれぞれについて測定した。

＃ｆｊ！文す　５０Ｋｒａｄ　１００Ｋｒａｄ　２００ｋｒａｄ　３００Ｋｒａ ｄ　６００Ｋｒａｄ　了ガ叶ス２３、Ｉｋｂ　Ｏ，５４０，６００，６６０，７ ５０，６６０，６６０，４８９，４０，６３０，７２０，７８０，８４０，８１ ０，８１０，５４６，６０，６９０，７８０，８７０，９６０，９００，９００ ，５７４，３０，７５０，９００，９９１，１１１，０２０，９９０，６０２， ３１，０２１，＋７　１．３２　１．４４　１．３５　１．３２　０．７８２． ０　１．１１　＋、２６　１．４４　１．５６　１．４７　１．４４　０．８４ ０．５６Ｚ２８Ｚ４０ｎｄｎｄｎｄｎｄｎｄｋｂ＝キロ塩基対。　ｎｄ＝断片は 検出されなかった。

９００にラド照射カードランゲル中の帯は汚れていて測定できなかった。

３、ゲルを実施例５のように熱硬化した以外は上記の変性２と同し。これらのゲ ルのゲル強度はゲルを熱硬化させることによって増大した。下記の結果を参照さ れたい。

％　ｈ　二Ｆ　５　：／　２００　Ｋｒａｄ　（ｇ／ｃｍ”　）　６００　Ｋｒ ａｄ　（ｇ／ｃａ＋”　）４、ゲルが実施例５のようにカオトロビン剤を含んで いた以外は上記の変性２と同じ。これらのゲルのゲル強度は更なる処理のある又 はないカオトロビン剤の添加により増大する。下記の結果を参照されたい。

照射カードランのゲル強度 （粗および実質的に純粋）ｇ／ｃｍ” ５、ガンマ照射量を変えて処理した実質的に純粋なカードランについて１％冷間 硬化ゲルを実施例２のようにして製造した。中和前の０．ｌＮ−ＮａＯＨ中の１ ％溶液の粘度をブルータフイールド・デジタル粘度計を使用して２５０ｍ１容量 のビーカー中で測定した。

粘度を記録した後に、塩基性カードラン溶液を次いで中和して冷間硬化ゲルを実 施例２のように製造した。センチボイズ（ｃｐｓ）で測定した粘度、および照射 した実質的に純粋なカードランのゲル強度は、下記の結果にみられるように照射 水準の増大につれて減少した。センチポイズ（ｃｐｓ）はミレパスカル（ｍＰａ ｓ）にほぼ等しい。

照射した実質的に純粋なカードランの粘度およびゲル強度照射水準　粘　度（ｃ ｐｓ）　ゲル強度（ｇ／ｃｍ″）５０　Ｋｒａｄ　５０．８　１１１ １００　Ｋｒａｄ　３８．４　９２ ２００　Ｋｒａｄ　２１．２　７３ ３００　Ｋｒａｄ　１０．９　３８ ６００　Ｋｒａｄ　７．３　１７ ９００　Ｋｒａｄ　５．４　１０ 照射カードランゲルを用いる電気泳動 実施例４て述べたように精製した照射量カードランの電気泳動性を検査するため に、１％アガロースゲルを０．５ＸＴＡＥ中で製造し、３レーンを実施例６のよ うに除いた。この空間に２００にラドで処理した粗カードランの１％溶液（Ｗ／ Ｖ）を満たし、次いで精製し、０．２ｇをｌ０ｍ１の蒸留水に懸濁させることに よってゾルを生成させ、１０ｍ１の１．０Ｎ−ＮａＯＨを加えることによってゾ ルをとかし、この溶液を熱板上で５５°Ｃに加熱し、その後に１ｍｌの５Ｍ酢酸 で中和した。この溶液をアガロース・フレーミングゲルに迅速に入れて冷却し固 化させた。このゲルを、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩλ　ＤＮＡ消化物およびトラッキング 染料としてのブロモフェノールブルーの試料で均衡化し接種した。その後に実施 例６のようにして電気泳動を行った。電気泳動は６０ボルト（５Ｖ／　ｃ　ｍ） で７０分間行った。照射カードラン中のＤＮＡの移動はアガロース・フレーミン グゲルにおいてよりもカードラン中においてかなり速かった。

２３．１　１３．０　２７．０ ９．４　＋５．５　３６．０ ６．６　１７．５　４０．０ ４．３　−　２０．５　４３．０ ２．３　２７．５　５２．０ ２．０　３０．０　ゲルから流出 ０．５６　６０．０　ゲルから流出 酸加水分解 ０．５ｍｌの５Ｍ−ＨＣｌを４９．５ｍｌの蒸留水に加えることによって０．０ ５ＭのＨＣＩ溶液を製造した。これに、２．５ｇの実質的に純粋なカードランを 加えた。この溶液を５０°Ｃの水浴中で加熱しながらオーバーヘッド攪拌器でか きまぜた。８ｇの試料をこのカードラン・スラリから、０．３０．６０．９０分 、および６時間において除いた。カードラン・スラリのそれぞれ８ｇの試料に、 ４５ｍ１の蒸留水を加え、次いで５ｍｌの１．０Ｎ−ＮａＯＨを加えてカートラ ンをとかした。塩基のカードラン溶液の８ｍｌを取り出して、ブルータフイール ド・デジタル粘度計（マサチューセッツ州スタフトンのブルータフイールド・エ ンジニアリング・ラボラトリーズ）の小試料アダプターを使用して粘度を測定し た。残存カードラン溶液を５５°Ｃに加熱し、５Ｍ酢酸で中和した。粘度および ゲル強度を下記に示す。対照標準は、０．２５ｇの実質的に純粋なカードランを ２２．５ｍｌの蒸留水にとかしこれに２．５ｍｌのｌ。

０Ｎ−ＮａＯＨを加えることによって製造した。この溶液も中和して冷却時にゲ ルを生成させた。熱間硬化ゲルは沸とう水浴中に２０分間入れることによって製 造した。

対照標準　６１．１　１０３　１６７ ０分　２１．２　３９　７６ ３０分　４５．８　５５　１１５ ６０分　１３９．０　８１　１０９ ９０分　２３９．０　７４　１９２ ６時間　溶解せず 全く予想外なことに、粘度は減少するよりもむしろ増大する、ということに注目 するのは興味あることである。このことは分解よりもむしろ可能な重合を示すも のである。上記の実験を沸とう水浴中で行ったとき、すべての生成物は不溶性で あった。

蒸留水中の１％炭酸塩溶液（Ｉｇ／１００ｍ１）を製造した。１２ＮおよびＩＮ の塩酸の添加によってこの溶液をｐＨを１０．３に調節した。この溶液に、１． ０の実質的に純粋なカードランを加えた。絶えずかきまぜながら熱板上でおだや かに攪拌したとき、カードランは完全にとけた。この熱カードラン溶液のｐＨは １０．７であった。次いでこの溶液を５５°Ｃに冷却し、５Ｍ酢酸で中和した。

室温で徐々に冷却したときゲルが生成した。次いでこのゲルを冷凍室に２時間入 れた。ゲルは弾力のある構造をもっており９３ｇ／ｃｍ”のゲル強度があった。

このゲルを実施例５におけるように熱硬化させたとき、このゲルは加熱硬化前に 溶融しなかった。

変性 １．１％炭酸ナトリウム溶液を上記のように製造し、ｐＨを１０゜０に調節した 。上記カードランの１ｇは一定の熱を加えて２時間攪拌した後に完全にはとけな かった。

２．１％炭酸ナトリウム溶液を上記のように製造し、ｐＨを１０゜５に調節した 。上記カードランのＩｇはおだやかな加熱と攪拌によりとけた。このカードラン 溶液を５５℃に加熱し上記のように中和した。ゲルは弾力性があり、１１８　ｇ ／ｃｍ”のゲル強度をもっていた。このゲルは熱硬化したとき完全には溶融せず 、１４８ｇ／ｃｍ２のゲル強度をもっていた。

３、上記カートランの２ｇを１９９ｍ１の蒸留水に懸濁させ、１ｍｌの１．０Ｎ −ＮａＯＨを加えて、たえず攪拌しながらおだやかに加熱してこのカードランを とかすことによって０．００５Ｎ−ＮａＯＨ中の１％カードラン溶液を製造した 。カードランは１５分以内にとけ、溶液は１１．０１のｐＨをもっていた。次い でこの溶液を５５°Ｃに加熱し、５Ｍ酢酸で中和した。冷却すると９１ｇ／ｃｍ ２のゲル強度をもつゲルが生成した。

透明化されたローカスト・ビーンガム（ＣＬＢＧ）とカードランとの１１溶液を 、ＣＬＢＧと実質的に純粋なカートランとの２％溶液（２００ｍｌ）を使用して 、４００ｍ１の最終容量中にそれぞれ１％の最終ガム含量を与えるようにして製 造した。２％ＣＬＢＧ溶液は、沸とうまで加熱した蒸留水が２００ｍ１中に４ｇ のＣＬＢＧ（ロット＃　Ｂ２１５４）をとかすことによって製造した。２％カー ドラン溶液も４ｇの実質的に純粋なカードランを１８０ｍ１の蒸留水に懸濁させ 、２０ｍ１の１．０Ｎ−ＮａＯＨを加え、加熱してこのカードランをとかすこと によって製造した。上記の２つの溶液を混合して５５°Ｃに冷却させた。この混 合物から、２００ｍ１をとって５Ｍ酢酸で中和した。冷却すると、４９ｇ／ｃｍ ”のゲル強度をもつゲルが生成した。このゲルを沸とう水浴中で２０分間熱硬化 したとき、ゲルは熱硬化前に溶融しなかった。ＣＬＢＧとカードラン混合物の残 った２００ｍ１のうちの１００ｍ１部分を５５°Ｃに加熱し、２００ｍ１の９９ ％イソプロピルアルコール中で直接に凝固させた。凝固物を真空濾過によってポ リエステル布上に回収し、２００ｍ１の８０％イソプロピルアルコール中で洗い 、２００ｍ１の９９％イソプロピルアルコール中で硬化させ、再び凝固物を真空 濾過による洗浄間に回収した。回収凝固物を絞って過剰アルコールを除き、そし て５５°Ｃで一夜乾燥した。回収した乾燥生成物（１゜４６３ｇ）を４０メツシ ユ（４２０ミクロン）ふるいを通して粉砕した。この共処理した生成物を１００ ｍ１の蒸留水中で加熱沸とうによりとかした。この溶液のｐＨはｌ０１７であっ た。５５°Ｃで５Ｍ酢酸により中和してから冷却した後にゲルが生成した。この ゲルのゲル強度は非常に弱＜９ｇ／ｃｍ”であった。このゲルを上記のように熱 硬化させたとき、ゲルは熱硬化前には溶融せず、ゲル強度は１３ｇ／ｃｍ’であ った。残りの１００ｍ１のＣＬＢＧ−カードラン混合物を９９％イソプロピルア ルコール中での凝固前に５５°Ｃで中和した。凝固物を上記のように５５°Ｃで 洗浄および乾燥した。

回収した共処理物質の重量は１．８３６ｇであった。この共処理した物質の１％ 溶液は加熱してさえ蒸留水またはｌＮ−ＮａＯＨにとアルギン酸ナトリウムおよ びカードランを使用してｌ：１のアルギン酸ナトリウムとカードランの溶液を製 造して１％の最終ガム含量および４００ｍ１の全容量をえた。４ｇのアルギン酸 ナトリウム（ロット＃　１４０４３０）を２００ｍ１の蒸留水にとかし、次いで 加熱沸とうさせることによって２％アルギン酸塩溶液を製造した。

２％カードラン溶液も４ｇの実質的に純粋なカードランを１８０ｍ１の蒸留水に 懸濁させ、２０ｍ１の１．０Ｎ−ＮａＯＨを加え、次いで加熱してカードランを とかすことによって製造した。これら２つの溶液を迅速にかきまぜながら混合し た。この混合物（２００ｍ１）の一部をとって５５°Ｃに冷却してから５Ｍ酢酸 で中和した。室温で冷却するとゲルが生成した。冷凍室で２時間急冷後に、ゲル 強度を測定して５５ｇ／ｃｍ”であることがわかった。このゲルを沸とう水浴中 で２０分間熱硬化させたところ、ゲルの溶融と再生成かえられた。冷却したとき 、１３４ｇ／ｃｍ″のゲル強度が観察された。アルギネートとカードランの混合 物の残存する２００ｍ１部分を５５°Ｃに冷却し、４００ｍ１の９９％イソプロ ピルアルコール（２×容量）中で凝固させた。凝固物を７５０　Ｏｒ　ｐｍで１ ０分間の遠心分離によって回収した。上澄み液を回収し、ペレットを２×容量の ８０％イソプロピルアルコール（４００ｍｌ）中で４５分間洗った。凝固物を真 空濾過によりポリエステル布上に回収した。過剰のアルコールを絞りによって除 いた。凝固物を２×容量の９９％イソプロピルアルコール中で硬化させ上記のよ うに回収し、絞って過剰アルコールを除き、５５℃で一夜乾燥した。回収した乾 燥生成物（３，５５ｇ）を４０メツシユ（４２０ミクロン）のふるいを通して粉 砕した。このアルギネートとカードランの共処理物質を２２゜５ｍｌに懸濁させ たところ、加熱後でさえ水に不溶であることがわかった。この懸濁液に２．５ｍ ｌの１．０Ｎ−ＮａＯＨを加えた後に、たえず攪拌しながら加熱しても依然とし て溶解しなかった。

共処理した組成物にはいくつかの利点がある。共処理は（ａ）（ゾルの）粘度； 　（ｂ）（ゲルの）強度；および（ゾルとゲル双方の）レオロジーを変える。こ れらの変化は共処理したゾルまたはゲルを、β−１，３−グルカン多糖類それ自 体を使用することによっては遭遇しえない特定ユーザーの要件に適合させる。

上記の実施例は本発明の実質的に純粋なカードランの製造を説明するものである 。このカードランの透明な１重量％水性ゾルは、臭化エチジウムで汚染されたと きに背景蛍光を実質的に示さず、それは２６０１ｍにおいて実質的に基線ＵＶ吸 収をもつ。このカードランは０．５〜４．０重量％のカードランを含みうる水性 ゲルの形体にありうる。純粋なカードランを含む水性ゲルは任意に少なくとも１ 種のカオトロピン剤をゲル中に含むことができ、このカオトロピン剤はゲルの生 成中に存在させることができ、そして実質的に除去される。該カオトロピン剤は 尿素、臭化リチウム、沃化リチウム、またはグアニジニウム　イソチオシアネー トの少なくとも１つである。

手続補正書 平成６年４月２０日

Claims (54)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に純粋なβ−１，３−グルカン多糖類。
2. ２．実質的に純粋なカードランである請求項１の多糖類。
3. ３．その１重量％水性ゾルが透明であり、そのゲルが臭化エチジウムで汚染され たとき背景蛍光を実質的に示さず、そしてそれが２６０ｎｍにおいて実質的に基 線ＵＶ吸収をもつことを特徴とする請求項１または２の多糖類。
4. ４．水性ゲルの形体の請求項１または２の実質的に純粋なβ−１，３−グルカン 多糖類。
5. ５．０．５〜４重量％のカードランがその中に存在することを特徴とする請求項 ４の水性ゲル。
6. ６．次の連続工程すなわち、 ａ）固体の粗β−１，３−グルカン多糖類を、該多糖類に存在する夾雑物と反応 させるに十分な然し固体の多糖類をとかさない十分な低さのｐＨをもつアルカリ 金属炭酸塩水溶液の有効量と接触させることによって固体の粗β−１，３−グル カン多糖類を部分的に精製し、そしてこの部分精製した固体の多糖類を取り出し 、 ｂ）この部分精製した固体の多糖類を、固体−多糖類−溶解−有効量のアルカリ 水酸化物水溶液にとかすことによってこれを更に精製し、そして残存する固体夾 雑物を多糖類溶液から除去し、ｃ）この更に精製した溶解多糖類を、 （ｉ）該溶液を５０〜６０℃に加熱し、（ｉｉ）この加熱した溶液を３〜１０の ｐＨに中和し、（ｉｉｉ）凝固・有効量の水混和性有機溶媒を加えることによっ て溶液からβ−１，３−グルカンを凝固させ、そして（ｉｖ）この凝固した実質 的に純粋なβ−１，３−グルカンを流体から取り出す、 ことによって実質的に精製する、 連続工程を特徴とする請求項１の多糖類の製造方法。
7. ７．β−１，３−グルカン多糖類がカードランであることを特徴とする請求項６ の方法。
8. ８．水性アルカリ金属炭酸塩が約１〜１０重量％の溶液であることを特徴とする 請求項６の方法。
9. ９．アルカリ金属炭酸塩が炭酸ナトリウムであることを特徴とする請求項８の方 法。
10. １０．アルカリ金属炭酸塩の水溶液を７．０〜９．５のｐＨに保つことを特徴と する請求項６の方法。
11. １１．ｐＨが約７であることを特徴とする請求項１０の方法。
12. １２．アルカリ金属水酸化物が水酸化ナトリウムであることを特徴とする請求項 ６の方法。
13. １３．アルカリ金属水酸化物が水酸化ナトリウムであることを特徴とする請求項 ８の方法。
14. １４．アルカリ金属水酸化物が０．０１Ｎ〜１．０Ｎの水溶液であることを特徴 とする請求項１１の方法。
15. １５．水混和性有機溶媒がイソプロピルアルコールであることを特徴とする請求 項６の方法。
16. １６．β−１，３−グルカンがカードランであり、部分精製工程においてアルカ リ金属炭酸塩が１．０〜１０重量％水溶液であって７．０〜９．５のｐＨにあり 、更なる精製工程においてアルカリ金属水酸化物が０．０１Ｎ〜１．０Ｎの水溶 液であり、そして実質的な精製工程においてｐＨが７．０であり水混和性有機溶 媒がイソプロピルアルコールであることを特徴とする請求項６の方法。
17. １７．実質的に純粋なβ−１，３−グルカン多糖類の水溶性アルカリ金属塩。
18. １８．β−１，３−グルカン多糖類がカードランであることを特徴とする請求項 １７の塩。
19. １９．アルカリ金属塩がナトリウム塩であることを特徴とする請求項１７または １８の塩。
20. ２０．その置換度が０．０１〜０．１０であり、そしてそのヒドロキシアルキル 部分がＣ２−４モノヒドロキシアルキルまたはＣ３−４ジヒドロキシアルキルで あることを特徴とする実質的に純粋なヒドロキシアルキル化β−１，３−グルカ ン多糖類。
21. ２１．β−１，３−グルカン多糖類がカードラシであることを特徴とする請求項 ２０の組成物。
22. ２２．それがヒドロキシエチルカードランであることを特徴とする請求項２０の ヒドロキシアルキル化多糖類。
23. ２３．それがグリセリルカードランであることを特徴とする請求項２０のヒドロ キシアルキル化多糖類。
24. ２４．それが約０．５〜１０重量％の多糖類を含む水性ゲルの形体にあることを 特徴とする請求項２０の実質的に純粋なヒドロキシアルキル化β−１，３−グル カン多糖類。
25. ２５．それが水性ゲルの形体にあることを特徴とする請求項２１のヒドロキシア ルキル化カードラン。
26. ２６．部分的に解重合した実質的に純粋なβ−１，３−グルカン多糖類。
27. ２７．β−１，３−グルカン多糖類がカードランであることを特徴とする請求項 ２６の組成物。
28. ２８．部分的に解重合した実質的に純粋なヒドロキシアルキル化β−１，３−グ ルカン多糖類。
29. ２９．β−１，３−グルカン多糖類がカードランであることを特徴とする請求項 ２８の組成物。
30. ３０．ヒドロキシアルキル部分がグリセリルであることを特徴とする請求項２９ のヒドロキシアルキル化カードラン。
31. ３１．それがａ）１０〜９０重量部の、実質的に純粋なβ−１，３−グルカン、 実質的に純粋なヒドロキシアルキル化β−１，３−グルカン、部分的に解重合し た実質的に純粋なβ−１，３−グルカン、またはそれらのヒドロキシアルキル化 誘導体、の少なくとも１種、およびｂ）１００重量部への残りの、少なくとも１ 種の上記以外のヒドロコロイド、から成ることを特徴とする共処理されたヒドロ コロイド組成物。
32. ３２．成分ａ）の５０〜９０重量部が存在することを特徴とする請求項３１の組 成物。
33. ３３．成分ｂ）がアガロース、アガロース誘導体、透明にされたローカスト・ビ ーン・ガム、アルギン酸ナトリウム、またはデンプンであることを特徴とする請 求項３１または３２の組成物。
34. ３４．成分ａ）が実質的に純粋なカードランであることを特徴とする請求項３３ の組成物。
35. ３５．それが０．５〜１０重量％の請求項３１の組成物を含むことを特徴とする 水性ゲル。
36. ３６．成分ｂ）が透明にされたローカスト・ビーン・ガムであることを特徴とす る請求項３５の水性ゲル。
37. ３７．（ａ）カオトロピン塩の２０〜８０重量％水溶液を少なくとも１種のβ− １，３−グルカン多糖類の０．５〜１０重量％水性ゾルと混合し； （ｂ）この混合物を均一なゲルが生成するまで加熱し；そして（ｃ）この加熱混 合物を冷却してゲルを生成させる；ことを特徴とするβ−１，３−グルカン多糖 類を含む水性ゲルを製造する方法。
38. ３８．水でくりかえし洗うことによってゲルからカオトロピン剤を除去すること を更に特徴とする請求項３７の方法。
39. ３９．β−１，３−グルカン多糖類が実質的に純粋であり照射した又は照射して いないもの；０．０１〜１０の置換度をもつそのヒドロキシル化誘導体；または 上記のいずれかと少なくとも１種の他のヒドロコロイドとの共処理混合物である ことを特徴とする請求項３７または３８の方法。
40. ４０．β−１，３−グルカン多糖類化合物がカードランであることを特徴とする 請求項３７の方法。
41. ４１．カオトロピン剤が尿素、臭化リチウム、沃化リチウム、またはグアニジニ ウムイソチオシアネートであることを特徴とする請求項３７、３８または４０の 方法。
42. ４２．請求項３７の方法によって製造した水性ゲル。
43. ４３．ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの断片のゲル電気泳動分離の方法であって 、ゲルが照射したまたは照射していない実質的に純粋なβ−１，３−グルカン多 糖類またはそのヒドロキシアルキル化誘導体、または上記の１つと別の異なった ヒドロコロイドとの共処理組成物であり、そしてゲルが任意にカオトロピン剤を 含むか又はカオトロピン剤の存在下に製造されこのカオトロピン剤がその後にゲ ルから除去されたものであることを特徴とする方法。
44. ４４．β−１，３−グルカン多糖類が実質的に純粋なカードランから成ることを 特徴とする請求項４３の方法。
45. ４５．その１重量％水性ゾルが透明であり、そのゲルが臭化エチジウムで汚染さ れたとき背景蛍光を実質的に示さず、そしてそれが２６０ｎｍにおいて実質的に 基線ＵＶ吸収をもつ、ことを特徴とする実質的に純粋なカードラン。
46. ４６．水性ゲルの形体にある請求項４５のカードラン。
47. ４７．０．５〜４．０重量％のカードランが存在する請求項４６の水性ゲル。
48. ４８．少なくとも１種のカオトロピン剤がゲル中に存在することを更に特徴とす る請求項４６の水性ゲル。
49. ４９．少なくとも１種のカオトロピン剤がゲル生成中に存在し、そしてその後に 実質的に除去されることを更に特徴とする請求項４６の水性ゲル。
50. ５０．カオトロピン剤が尿素、臭化リチウム、沃化リチウム、またはグアニジニ ウムイソチオシアネートのうちの少なくとも１つであることを特徴とする請求項 ４８または４９の水性ゲル。
51. ５１．請求項３８の方法の生成物である水性ゲル。
52. ５２．請求項３９の方法の生成物である水性ゲル。
53. ５３．請求項４０の方法の生成物である水性ゲル。
54. ５４．請求項４１の方法の生成物である水性ゲル。