JPH0650989B2 - 抗癌性または抗腫瘍性蛋白質の産生法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は溶血性連鎖球菌(S.pyogenes)由来の抗癌性また
は抗腫瘍性蛋白質（以下ＳＡＧＰと略す）の遺伝子工学
的手法による新規な産生法に関する。さらに詳しくは、
ＳＡＧＰをコードする遺伝子ＤＮＡが宿主微生物内に於
いて発現可能な発現ベクターおよび、該発現ベクターに
よる形質転換微生物をＳＡＧＰが発現し得るような条件
下に培養してＳＡＧＰを産生させることによるＳＡＧＰ
の産生法に関する。

ＳＡＧＰは本来S.pyogenesにより産生される抗癌性また
は抗腫瘍性蛋白質である。S.pyogenesはグラム陽性の連
鎖球菌であり、丹毒、敗血症、産褥熱等の病原菌として
知られている。一方、S.pyogenesの一部菌株が抗癌性ま
たは抗腫瘍性蛋白質を産生することは古くから知られて
おり、今日臨床的にも抗癌剤として用いられている。

ＳＡＧＰは吉村によりS.pyogenes Su株の菌体よりin vi
tro細胞増殖抑制活性を指標として抽出精製された物質
であり、in vivoにおいても抗癌活性を有することが動
物実験により示されている（特開昭５８−２２２０２６
号）。

ＳＡＧＰの遺伝子ＤＮＡは本発明者らによりクローン化
されＤＮＡ塩基配列が明らかにされ、またＤＮＡ塩基配
列から予測することによりＳＡＧＰのアミノ酸配列も明
らかにされている（特願昭６０−２９８０１４号）。そ
の結果によればＳＡＧＰは第１図で示したアミノ酸配列
からＮ末端のメチオニン(Met)を除く４１０個のアミノ
酸配列で構成され、推定分子量は約４万７千である。Ｓ
ＡＧＰ遺伝子のＤＮＡ塩基配列は第１Ａ図および第１Ｂ
図に示したように、ＳＡＧＰ蛋白質のアミノ酸配列をコ
ードする１２３０塩基とその５′端にアミノ酸への翻訳
開始シグナルとなるメチオニン(Met)をコードするＡＴ
Ｇの塩基配列が付加し、３′端に翻訳終了のシグナルを
コードするＴＡＡの塩基配列が付加した配列で表され
る。

本発明は、前記ＳＡＧＰ遺伝子配列を含み、該遺伝子が
宿主微生物内に於いて発現可能な発現ベクターを作製
し、該発現ベクターにより宿主微生物を形質転換し、Ｓ
ＡＧＰ遺伝子が発現可能な条件下に前記形質転換微生物
を培養し、該培養微生物によりＳＡＧＰが産生されるこ
とを確認することにより完成したものである。本発明に
より従来の方法に比してより大量のＳＡＧＰを生産する
ことが可能となり、また病原となり得る危険をはらんだ
微生物を培養することなく安全にＳＡＧＰを生産するこ
とが可能となつた。

本発明者らが使用したＳＡＧＰ遺伝子ＤＮＡは、S.pyog
enes Su株の染色体よりクローン化したいわば天然のＤ
ＮＡ塩基配列を有しているが、よく知られているように
多くのアミノ酸についてはそれをコードするＤＮＡ塩基
配列は複数存在する。従つてＳＡＧＰ遺伝子を発現さ
せ、ＳＡＧＰを産生させるには必ずしも天然のＳＡＧＰ
遺伝子である必要はない。

本発明に使用する発現ベクターはＳＡＧＰ遺伝子ＤＮＡ
配列を含み、ＳＡＧＰ遺伝子ＤＮＡ配列の上流に宿主微
生物内においてＳＡＧＰ遺伝子の発現を制御するＤＮＡ
配列を有し、かつ宿主微生物内において複製可能である
必要がある。より具体的にはＳＡＧＰ遺伝子の上流にプ
ロモーターと呼ばれるＤＮＡ配列領域が必要であり、か
つ複製起点またはオリジンと呼ばれる、宿主微生物内に
おけるベクターの複製を制御するＤＮＡ配列領域が必須
である。プロモーターとしては、例えば大腸菌を宿主微
生物とした場合には、ラクトース分解系遺伝子のプロモ
ーター（lacプロモーター）、トリプトフアン合成系遺
伝子のプロモーター（trpプロモーター）、リポプロテ
イン合成系遺伝子のプロモーター（lppプロモーター）
などのうち１つもしくは複数のプロモーターを組合せて
使用することが可能であるが、これらに限定されるもの
ではない。また本発明に使用する発現ベクターは、該ベ
クターを有する宿主微生物を選択的に生育させることを
容易ならしめるために、薬剤耐性遺伝子をも含んでいる
ことが望ましい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば大腸
菌を宿主微生物とした場合には、アンピシリン耐性遺伝
子、テトラサイクリン耐性遺伝子などが使用可能であ
る。

現在の遺伝子工学技術の分野においては、宿主微生物と
して大腸菌(E.coli)が遺伝的解析が最も進んでおり、ま
た安全性が高いこともあつて最もよく採用されている。
ＳＡＧＰの産生に関しても、大量にかつ速やかに宿主微
生物を増殖させ得ること、また遺伝子発現制御の機構が
比較的よく解析されているためＳＡＧＰ遺伝子の発現制
御が行いやすいこと等の観点から、宿主微生物として一
般的に大腸菌を採用することが望ましいが、宿主微生物
としては種々のバクテリアや酵母等がそれぞれの微生物
内で複製可能な発現ベクターとの組み合わせにより使用
することが可能である。

発明の具体的説明 本発明におけるＳＡＧＰの産生は概略以下の工程により
行なわれる。

（１）ＳＡＧＰ遺伝子ＤＮＡ配列を含んだＤＮＡ断片の
取得 （２）プロモーター配列を有し宿主大腸菌内で複製可能
なプラスミドベクターの、プロモーター配列下流への前
記ＤＮＡ断片の組込み。

（３）前記組換えベクターによる宿主大腸菌の形質転
換。

（４）形質転換大腸菌の培養およびＳＡＧＰ遺伝子発現
の誘導。

次に以上の各工程をさらに詳しく述べる。

（１）ＳＡＧＰ遺伝子ＤＮＡ配列を含んだＤＮＡ断片の
取得 ＳＡＧＰ遺伝子ＤＮＡ配列を有するプラスミドベクター
ｐＳＰ１を制限酵素ＥcoＲＩで分解し、この分解混合物
をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画して、Ｓ
ＡＧＰ遺伝子を含む約２１００の塩基対のＤＮＡ断片を
このゲルより抽出・精製する。

（２）発現ベクターの作製 発現ベクターへＳＡＧＰ遺伝子を組み込む。例えば、市
販のプラスミドｐＫＫ２２３−３または、ｐＩＮIIIＡ
１を制限酵素ＥcoＲＩにより、プロモーターの下流で切
断し、前記のＳＡＧＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片と混合し
て、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼにより結合する。

（３）宿主大腸菌の形質転換 前記ＤＮＡリガーゼ反応物を形質転換法により大腸菌に
導入する。これによつて得られた多数の形質転換体か
ら、プラスミドＤＮＡを調整し、各種制限酵素による分
解パターンを解析して目的とする発現ベクターを有する
形質転換体を選別する。

（４）形質転換大腸菌の培養とＳＡＧＰ遺伝子発現の誘
導 前記発現ベクターにより形質転換した大腸菌を適当な栄
養素及び薬剤を含んだ液体培地に接種し、振盪しながら
培養を行う。培養液の濁度を測定することで、菌の増殖
を監視し、適度に増殖した時点で、ＩＰＴＧ（Isopropy
l-β-D-thiogalactoside）の添加等により、ＳＡＧＰ遺
伝子の発現を誘導する。誘導開始後更に数時間培養を継
続する。

（５）培養菌体の集菌、菌体破砕及びＳＡＧＰの産生 前記培養液から遠心分離により菌体を分離して集め、次
いで卵白リゾチーム及び、界面活性剤又は超音波等によ
り大腸菌を溶菌せしめる。この溶菌物よりオクタロニー
法、ウエスタンブロツテイング法等によりＳＡＧＰの産
生を確認する。

実施例 以下の実施例は本発明の代表例として示すものであり、
本発明のＳＡＧＰ産生法はこれに限定されるものではな
い。

１）ＳＡＧＰ遺伝子配列を含んだＤＮＡ断片の取得 ＳＡＧＰ遺伝子ＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＳＰ１
（本発明者らの発明に係る特願昭６０−２９８０１４号
明細書に記載の方法で取得した）12.5μｇに制限酵素Ｅ
coＲＩ（宝酒造製）５０unitを加えて３７℃で２時間反
応させ、ｐＳＰ１を分解した。この分解物を５％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により分画し、約２１０００
塩基対のＤＮＡ断片を含む部分のポリアクリルアミドゲ
ルを切り出した。このゲル片をすりつぶし、トリス−Ｅ
ＤＴＡ緩衝液に浸漬してＤＮＡを抽出した。抽出物をフ
エノール洗浄、エタノール沈殿により精製し、ＳＡＧＰ
遺伝子を含む２１０００塩基対のＤＮＡ断片を得た。

２）発現ベクターの作製（第２図にその概要を示す。） trpおよびlacプロモーター（tacプロモーター）を有
し、かつアンピシリン耐性遺伝子を有する発現ベクター
作製用プラスミドＤＮＡ、ｐＫＫ２２３−３（フアルマ
シア−ＰＬ社製）２μｇに制限酵素ＥcoＲＩ ６unitを
加えて、３７℃一晩反応させて切断した後、アルカリフ
オスフアターゼと３７℃３０分間反応せしめて５′端の
リン酸基を除去した。反応混合物をフエノールで洗浄後
エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。

一方、同様の方法でlppおよびlacプロモーターを有し、
かつアンピシリン耐性遺伝子を有している別の発現ベク
ター作製用プラスミドＤＮＡ ｐＩＮIIIＡ１（Inouye
ら、EMBO Journal,1,771(1982)）をＥCOＲＩで切断し、
アルカリフオスフアターゼにより５′端のリン酸基を除
去した。

前記のように調製したＳＡＧＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片
と上記ベクターＤＮＡを、それぞれ混合し、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造製）を加えて、４℃一晩反応させる
ことにより結合して形質発現ベクターを作製した。

３）宿主大腸菌の形質転換 上記のＤＮＡリガーゼ反応混合物（形質発現ベクターを
含む）により文献記載の方法（T.Maniatisら、Molecula
r Cloning,p250,Cold Spring Harbor Laboratory(198
2)）により大腸菌ＪＭ１０３株を形質転換した。

得られた多数の形質転換体のうち、それぞれ２０−３０
クローンを培養して文献記載の方法（T.Maniatisら、Mo
lecular Cloning,p86,Cold Spring Harbor Laborator
y）によりプラスミドＤＮＡを調製し、各種制限酵素に
より切断して、その切断パターンをアガロースゲル電気
泳動により解析することにより、目的とする発現ベクタ
ーptacＳＰ、ｐＩＮIIIＳＰを保持する形質転換体大腸
菌(Escherichia coli)ＪＭ１０３（ptacＳＰ）及びＪＭ
１０３（ｐＩＮIIIＳＰ）のクローンをそれぞれ選択し
た。

４）形質転換大腸菌の培養とＳＡＧＰ遺伝子発現の誘導 上記発現ベクターを保持する形質転換大腸菌をそれぞれ
ＬＢ培地（T.Maniatisら、Molecular Cloning,p440,Col
d Spring Harbor Laboratory）１００mlに植菌し、３７
℃で振盪培養を行った。菌の増殖過程を波長５５０nmの
濁度を測定することにより監視し、濁度がおよそ0.2に
達した時点で終濃度0.1mMのＩＰＴＧ（Isopropyl-β-D-
thiogalactoside）を添加することによりＳＡＧＰ遺伝
子の発現を誘導し、さらに培養を継続した。誘導開始後
経時的に培地をサンプリングし、後にＳＡＧＰの産生を
調べた。

この時、対照としてｐＫＫ２２３−３およびｐＩＮIII
Ａ１を保持する大腸菌も同時にそれぞれ培養、ＩＰＴＧ
添加を行い、同様にサンプリングした。

５）ＳＡＧＰ産生の確認 上記のようにサンプリングした培地を遠心分離して菌体
を集め、これに２mg／mlの卵白リゾチーム（生化学工業
製）を加えて０℃３０分間反応後、１％Ｔrinton-Ｘ１
００（和光純薬製）を加えて、菌体を溶菌せしめた。

該溶菌液と、抗ＳＡＧＰ家兎抗血清とをオクタロニー法
（．Ouchterlony,Prog.Allergy,6,30(1962)）により
３７℃一晩反応させたところ、ｐＩＮIIIＳＰおよびpta
cＳＰを保持する菌の溶菌液およびS.pyogenesより単離
したＳＡＧＰでは抗源抗体反応による明瞭な沈降線が認
められた。一方、対照としたｐＩＮIIIＡ１、ｐＫＫ２
２３−３を保持する菌の溶菌液では沈降線は認められな
かつた。

また該溶菌液を12.5％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により分画し、ウエスタンブロツテイング法
(W.N.Burnette,Anal.Biochem.,112,195(1981))により蛋
白質をアクリルアミドゲルからニトロセルロースフイル
ター上に移して固定した。次いでこのフイルターを抗Ｓ
ＡＧＰ家兎抗血清を含む緩衝液に３７℃３０分間さらに
４℃一晩浸漬して反応させた。次にこのフイルターを緩
衝液で洗浄して未反応の抗ＳＡＧＰ抗体を除去した後、
アルカリフオスフアターゼー抗家兎ＩＧｇ抗体を含む緩
衝液に３７℃２時間浸漬してフイルター上の抗ＳＡＧＰ
抗体と反応せしめた。さらにこのフイルターを洗浄後、
ＢＣＩＰ(5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate)を含
む緩衝液に浸して発色せしめたところ、ptacＳＰおよび
ｐＩＮIIIＳＰを保持する菌の溶菌液ではS.pyogenesか
ら単離したＳＡＧＰと同一分子量（約４７０００）に相
当する位置に抗原抗体反応によるバンドが認められた。
一方、対照としたｐＫＫ２２３−３およびｐＩＮIIIＡ
１を保持する菌の溶菌液では、そのようなバンドは観察
されなかつた。

以上のようにして、前記発現ベクターを有する大腸菌に
よるＳＡＧＰの産生が確認された。

参考例： １）ＳＡＧＰの部分アミノ酸配列 S.pyogenes Su株（ＡＴＣＣ２１０６０）の培養菌体よ
りＳＡＧＰを公知の方法（吉村、特開昭５８−２２２０
２６号公報）に従つて精製し、得られた精製ＳＡＧＰ１
００μｇを使つて気相プロテインシークエンサー（アプ
ライドバイオシステムズ社製モデル４７０Ａ）によりＮ
末端部分のアミノ酸配列を分析した。

その結果ＳＡＧＰのアミノ酸配列を次のように決定し
た。

Pro（またはThr）-Ala-Glu-Thr-Pro-Ile-Unk-Val-Tyr-U
nk-Unk-Ile-Gly-Lys-Leu-Lys-Lys-Val-Leu-Leu-His-Unk
-Pro-Gly-Lys 上記配列中Unkはアミノ酸種が不明であることを示す。

２）プローブ合成 上記アミノ酸配列決定の結果に基づきその一部分のアミ
ノ酸配列をコードする２種の短鎖ＤＮＡ、Ｐ−３７およ
びＰ−３８を合成した。Ｐ−３７はアミノ酸配列Pro-Al
a-Glu-Thr-Pro-Ileに対応し、配列はCC(T,A)GC(T,A)CAA
AC(A,T)CC(T,A)AT(A,T)Tで表され、Ｐ−３８はアミノ酸
配列Ile-Gly-Lys-Leu-Lys-Lys-Valに対応し、配列はAT
(T,A)GG(T,C)AAATT(A,G)AAAAAAGTで表される。括弧内は
複数のうちどちらかの塩基であることを示す。多くのア
ミノ酸についてはそれをコードするＤＮＡ配列は複数個
存在するため、上記のようにＰ−３７は３２種の、Ｐ−
３８は８種のＤＮＡ配列の混合物である。

合成は全自動ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステム
ズ社製モデル３８０Ａ）を使用して行つた。その結果Ｐ
−３７を約１４６μｇ、Ｐ−３８を約２４４μｇ取得し
た。

これらのプローブＤＮＡは後述するハイブリダイゼーシ
ヨンに使用する直前に放射性同位元素³²Ｐで次のように
標識した。

合成プローブ５pMをＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼお
よび［γ³²Ｐ］−ＡＴＰ３０μＣｉと共に３７℃で３０
分間インキユベートした。反応生成物を少量のＤＥ−５
２に吸着せしめ、0.1M-NaCl溶液で洗浄して未反応の
［γ³²Ｐ］−ＡＴＰを除いた後、ＤＥ−５２から１Ｍ-N
aCl溶液にて３２−Ｐ標識プローブを溶出した。

３）S.pyogenes Su株染色体ＤＮＡの抽出および制限酵
素分解 S.pyogenes Su株（ＡＴＣＣ２１０６０）をＬ培地３０
０mlにて３７℃１５時間培養し、遠心分離により菌体を
集めた。この菌体を0.15Ｍ NaCl-0.1Ｍ EDTA溶液に懸
濁し、リゾチーム、プロナーゼおよびドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）で処理して溶菌せしめた。該溶菌液よ
り文献記載の方法(J.Marmur,J.Mol.Biol.,3,208(1961))
により染色体ＤＮＡを抽出、精製した。

染色体ＤＮＡ５μｇを制限酵素ＥcoＲＩと３７℃１時間
インキユベートして分解し、分解反応生成物を１％アガ
ロース平板ゲルを用いた電気泳動により分画した。この
アガロースゲルを0.2Ｍ NaOH-0.5Ｍ NaCl溶液に浸漬
してＤＮＡを変性せしめ、次いでトリス−アセテート−
ＥＤＴＡ緩衝液で各１０分間３回洗浄した。次にアガロ
ースゲル上のＤＮＡを電気泳動によりZeta-Probeフイル
ター上に移した。電気泳動は３０Ｖで一晩行つた。該フ
イルターを室温３０分間風乾後８０℃３時間加熱処理し
てＤＮＡを固定した。

上記方法によりＤＮＡを固定したZeta-Probeフイルター
を２枚調整しそれぞれを４×ＳＳＣ(Blin et al.,Nucle
ic Acid Research,3,2303(1976))、５０×デンハート(W
ahl et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,76,.3683(1979))、１
％ＳＤＳ１０μｇ／ml超音波処理サケ精子ＤＮＡ溶液で
６０℃３時間プレハイブリダイゼーシヨンを行い、次い
で上記溶液に各々１０００００cpmの標識Ｐ−３７プロ
ーブまたは標識Ｐ−３８プローブを含む溶液で４０℃１
８時間ハイブリダイゼーシヨンした。４×ＳＳＣでフイ
ルターを４０℃１５−３０分間ずつ４回洗浄した後風乾
し、Ｘ線フイルムに４８時間露光した。

その結果、いずれのプローブを用いた場合も約２kbp（k
bp:千塩基対）ＤＮＡの大きさに相当する位置にハイブ
リダイズするバンドが認められた。

４）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの組込みと大腸菌の
形質転換 染色体ＤＮＡ５０μｇを制限酵素ＥcoＲＩと３７℃１時
間インキユベートして分解し、１％アガロースゲルを用
いた電気泳動により分画した。約1.8−2.2kbpの大きさ
に相当する部分のアガロースゲルを切り出し、このゲル
からＤＮＡ断片を抽出した。

ＥcoＲＩで切断したプラスミドベクターｐＵＣ１９（宝
酒造製）と上記染色体ＤＮＡを混合し、Ｔ４−ＤＮＡリ
ガーゼにより１７℃一晩反応した。

リガーゼ反応生成物により大腸菌(E.coli)ＪＭ１０３株
を形質転換(M.Mandel and A.Higa,J.Mol.Biol.,53,159
(1970))し５−ブロモ-4-クロロ-3-インドリル−β-D-ガ
ラクトシド(X-Gal)、イソプロピル−β-D-チオガラクト
シド（ＩＰＴＧ）およびアンピシリンを含んだＬ−寒天
培地にまいた。３７℃で一晩培養して出現したコロニー
のうち白色のコロニーを６４個拾つた。

５）ＳＡＧＰ遺伝子保持形質転換対の選別取得 前記のごとく取得したE.coli JM 103形質転換体６４個
をアンピシリンを含むＬ−寒天培地上においたニトロセ
ルロースフイルター上に植菌し３７℃で６時間培養し
た。次にこのフイルターをアンピシリン、クロラムフエ
ニコールを含むＬ−寒天培地に移し替え３７℃一晩培養
を継続した。培養後フイルターを１０％ＳＤＳで５分
間、０．５Ｍ NaOH-１．５Ｍ NaClで３分間、次いで
１Ｍトリス−塩酸緩衝液で５分間処理してフイルター上
の菌を溶菌し、次に８０℃で３時間加熱することにより
ＤＮＡをフイルター上に固定した。

標識Ｐ−３８プローブを用いて前記と同様にしてハイブ
リダイゼーシヨンを行いＸ線フイルムに露光したとこ
ろ、６４個のうち２個のコロニーがプローブとハイブリ
ダイズした。

６）プラスミドＤＮＡの取得 前記の結果ＳＡＧＰ遺伝子を保持することが示唆された
２種の菌を培養し、文献に記載の方法(T.Maniatis,E.F.
Fritsch,J.Sambrook,Molecular Cloning.p.86,Cold Spr
ing Harbor Laboratory(1982))によりプラスミドＤＮＡ
を調整した。

２種の菌から得られたプラスミドＤＮＡは後述する制限
酵素による分析の結果、同一であることが判明し、この
プラスミドをｐＳＰ１と名付けた。

７）ｐＳＰ１の制限酵素地図の作成 前記のごとく取得したプラスミドｐＳＰ１を各種制限酵
素EcoRI、HindIII、PstI、ClaI、NcoI、AvaII、HpaI、HincII、A
haIII、BanI、HaeII、MluIでそれぞれ単独にまたはこれら
のうち複数の制限酵素を組合せて分解し、ＤＮＡ断片の
大きさをアガロースゲルまたはアクリルアミドゲルで分
画して調べることにより制限酵素地図を作成した。

その結果、ｐＳＰ１はｐＵＣ１９のＥcoＲＩ部位に約２
kbpの外来ＤＮＡ断片が挿入され、第３図に示すような
制限酵素認識部位を持つことが判明した。

８）ＳＡＧＰ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定 前述の制限酵素地図に基づきｐＳＰ１のうち外来ＤＮＡ
部分をさらに制限酵素により断片化したのち、ｐＵＣ１
９にクローニングし、それぞれを文献記載のジデオキシ
法(G.F.Hong,Biosci.Report,2,907(1982))による塩基配
列決定に用いた。塩基配列決定は宝酒造製のシークエン
シングキツトを用いプライマーとしてＭ−４またはＲＶ
（いずれも宝酒造製）を使用して行つた。各小断片の塩
基配列を繋ぎ合わせて最終的にＳＡＧＰ遺伝子を含む２
１５７bpの塩基配列を決定した。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図および第１Ｂ図は、ＳＡＧＰの遺伝子ＤＮＡの
塩基配列及び該ＤＮＡ塩基配列から推定されるＳＡＧＰ
のアミノ酸配列である（第１Ａ図のＤＮＡ配列およびア
ミノ酸配列はそれぞれ第１Ｂ図のＤＮＡ配列およびアミ
ノ酸配列につづいている）。 第２図は、ＳＡＧＰ遺伝子ＤＮＡを含むプラスミドｐＳ
Ｐ１を制限酵素ＥcoＲＩで分解して得られる精製された
ＳＡＧＰ遺伝子のＤＮＡ断片を組込んだ発現ベクターを
作製する本発明方法の工程を示す概略図である。 第３図は、プラスミドｐＳＰＩの制限酵素地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/31 Ｃ１２Ｒ 1:46）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】溶血性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)
   由来の下記のアミノ酸配列 をコードする遺伝子ＤＮＡ配列を宿主微生物において発
   現させ得る発現ベクターを作製し、該発現ベクターによ
   り宿主微生物を形質転換し、前記アミノ酸配列をコード
   している遺伝子を発現させ得る条件下において該形質転
   換微生物を培養して、前記アミノ酸配列を有する抗癌性
   または抗腫瘍性蛋白質を産生せしめることを特徴とす
   る、抗癌性また抗腫瘍性蛋白質の産生法。
2. 【請求項２】遺伝子ＤＮＡ配列が で表されることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の産生法。
3. 【請求項３】発現ベクターがptacＳＰまたはｐＩＮIII
   ＳＰであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の産生法。
4. 【請求項４】宿主微生物が大腸菌(Escherichia coli)菌
   株であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   産生法。