JPH06508757A - 新規な突然変異誘発法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な突然変異誘発法および組成物 主尻公宜景 １、光里■公団 本発明は、一般に、核酸のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ）に関する。

オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発は、ＤＮＡの機能およびタンパク質の構 造および機能の研究のために価値ある道具であり、前以て決定した構造の変化を ＤＮＡの中に導入するために選択される方法となった。このような操作はＤＮＡ 配列お変更してその機能の決定を可能とするか、あるいは商業的または医学的意 味をもつ試薬の生産を可能とする。ある数の異なる方法が報告されてきている。

なかでも次の文献を参照のこと：概観についてＭ、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ａｎｎ、　 Ｒｅｖ。

Ｇｅｎｅｔ、　（１９８５）　１９　：　４２３　；および節■および章１７〜 ２１．　Ｍｅｔｈ。

植Ｕ鯰しく１９８７）　１５４　：　３２９−４１４．これらの両者を引用によ ってここに加える。

オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発は、一本ＭＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に合成 オリゴヌクレオチド（これは要求される変化（点突然変異、多重突然変異（ｍｕ ｌｔｉｐｌｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ）、挿入または欠失）を指令する内部の不一致 を除外した、−末鎖鋳型に対して相補的である）をアニーリングし、突然変異体 −野生型へテロ二本鎖を形成することによって達成される。この基本的な概念の いくつかの適応が存在してきている。はとんどの方法において、−末鎖標的ＤＮ Ａとのハイブリダイゼーション後、このオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラー ゼで伸長して二本鎖の構造体をつくる。「ギヤンブド二本鎖（ｇａｐｐｅｄｄｕ ｐｌｅｘ）　Ｊのアプローチにおいて、ポリメラーゼを使用する伸長に先行する ことが可能である（Ｗ、　ＫｒａｍｅｒおよびＨ，−Ｊ、　Ｆｒ１ｔｚ、　Ｍｅ ｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５４　：　３５０　（１９８７）　、これを引用によって ここに加える）。

いずれの場合においても、二本鎖ＤＮＡを次いで大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）宿主 の中に形質転換する。

理論的には、この手順を使用する突然変異体の収率はＤＮＡの複製から作られた 生保存的モードのために５０％であるべきである。すなわち、二本鎖のへテロ二 本鎖ｔ）ＮＡで形質転換した細胞は鎖の各々を複製するので、それらの子孫の１ ／２は理論的に野生型または突然変異したＤＮＡを含有するであろう。しかしな がら、実際には、突然変異体の収率は非常にいっそう低く、しばしばわずかに数 ％以下である。これは、例えば、不完全なｉｎ　ｖｉｔｒｏ重合、フィルイン反 応において使用するＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの置換、およびメチル 化されていない新しく乾燥されたＤＮＡ鎖の修復を好むｉｎ　ｖｉｖ。

宿主特異的不一致の修復メカニズムのような因子のためであるを思われる（Ｂ、 　Ｋｒａｍｅｒ　ら、Ｃｅ１ｌ　３８　：　８７９　（１９８４））　、野生型 ＤＮＡ　（例えば、Ｔ、　Ｋｕｎｋｅｌ　、米国特許第４，８７３．１９２号） 、これを引用によってここに加える）に対して、あるいは突然変異した［ｌＮＡ 　（例えば、「Ａｌｔｅｒｅｄ　５ｉｔｅｓ　（ＴＭ）　Ｔｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｍ ｕｔａｇｅｎｓｉｓＳｙｓｔｅｍ　ＴｅｃｈｎｉｃａｌＭａｎｕａｌ　Ｊ　、Ｐ ｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　、これを引用によってここに加える） について選択する、所望の突然変異体を得る可能性を増加するいくつかの方法が 記載されてきている。ポリメラーゼ■部位特異的突然変異誘発のための商業的キ ットは、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　、ラジコ乞カリフォルニア 州、から商標ＭＵＴＡＴＯＲ”（カタログＮｏ、　２００５００）で商業的に入 手可能である。

突然変異体のスクリーニングのための最も一般的方法は、二本鎖の突然変異誘発 生産物で形質転換した細胞からのＤＮＡを５′標識化突然変異誘発オリゴヌクレ オチドとハイブリダイゼーションすることによる（Ｒ，Ｗａｌｌａｃｅら、５ｃ ｉｅｎｃｅ　２０９　：　１３９６　（１９８０）　、これを引用によってここ に加える）。非ストリンジェントの条件（例えば、室温の洗浄）下に。プローブ をそれが完全に合致する突然変異ＤＮＡおよびまたそれが不一致である野生型Ｄ ＮＡの両者にハイブリダイゼーションする。洗浄のストリンジエンシーを増加す る（例えば、温度を上昇させる）ことによって、突然変異誘発オリゴヌクレオチ ドを野生型ＤＮＡから選択的に解離し、それを突然変異ＤＮＡに結合したままに してお（ことができる。次いでＤＮＡを調製し、そして配列決定して突然変異を 評価する。突然変異ＤＮＡを有する形質転換された細胞の高い比率を生ずるオリ ゴヌクレオチド特異的突然変異誘発法を使用する場合、突然変異のスクリーンと して配列決定それ自体をしばしば使用することができる。

オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発は生物学的者の手において価値ある道具 となったが、とくに同一鋳型上の多数の突然変異または多重突然変異を必要とす るとき、実施が時間を消費しかつ高価である。例えば、タンパク質の構造−機能 の研究において、あるタンパク質の中の１つまたはいくつかのアミノ酸をすべて の他のアミノ酸と置換してそのアミノ酸のタンパク質の機能に対する重要性を決 定するか、あるいは所望の機能（例えば、結合の増加または減少、安定性の増加 など）を提供するアミノ酸の置換を探すことが必要であろう。普通のオリゴヌク レオチド特異的突然変異誘発は、はとんどの場合において、ハイブリダイゼーシ ョンおよび／または配列決定により突然変異体の評価を必要とする。さらに、前 以て突然変異誘発された鋳型の中に配列の変更を導入するために、前以て突然変 異誘発した鋳型を新しいヘクター配列の中にサブクローニングすることが必要で あろう。

したがって、突然変異体を同定するためのスクリーニングを促進しかつとくにサ ブクローニングを必要としないで核酸内の単一の部位の多重突然変異またはＩ＠ 次の突然変異誘発の発生を可能とする、核酸のオリゴヌクレオチド特異的突然変 異誘発の方法および組成物を提供することが望ましい。好ましくは、これらの方 法はハイブリダイゼーションまたは配列決定を含まないで突然変異体のスクリー ニングを可能とするであろう。ことに多数の部位特異的突然変異体の発生を必要 とする用途について、従来記載された方法より時間、努力および経費を非常に少 なくするオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発法は必要となれる。

主里生要豹 本発明は、従来記載されたオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発の努力を越え た改良を提供し、これらおよび他の必要性を取り扱い、標的核酸を急速にかつ容 易に部位特異的に修飾する方法およびキットを提供し、標的核酸上の１つまたは いくつかの位置に多重突然変異を導入するためにことによく適する方法を提供す る。

これらの方法の各々は、ヌクレオチドの１換であるか、あるいは１または２以上 のヌクレオチドの挿入または欠失であるかどうかにかかかわらず、所望の変化を 導入することができる１または２以上の突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを使 用する。同時に、各突然変異誘発性オリゴヌクレオチドは、また、他の位置にお いて制限部位を導入するか、あるいはそれほど普通ではないが前記部位を除去し て、制限分析によりｌまたは２以上の突然変異についてスクリーニングすること を可能とする。同一オリゴヌクレオチドは所望の突然変異を導入しかつ制限パタ ーンを変更するので、ハイブリダイゼーションおよび／または配列決定により所 望の突然変異の存在を評価する必要がない。

本発明の１つの態様は、−末鎖形態の核酸構成体にオリゴヌクレオチドをアニー リングする工程からなる、標的配列を有する核酸構成体を部位特異的に修飾する 方法であり、ここでオリゴヌクレオチドは核酸構成体の一部分に対して実質的に 相補的でありかつ標的配列内の１つの位置におけるヌクレオチドを変化すること ができ、そしてまた核酸構成体の異なる位置において制限部位を導入または除去 することができる。このアニーリングの生成物を使用して宿主を形質転換する。

所望の突然変異を存する形質転換された宿主細胞の子孫は、制限分析により容易 に同定される。

本発明の他の態様において、核酸構成体が、標的配列に加えて、スクリーニング 可能な、好ましくは選択可能なマーカーをエンコードする配列を有する方法が提 供される。このような方法において、標的配列の中に所望の突然変異を導入する ことができるオリゴヌクレオチドに加えて、第２オリゴヌクレオチドはマーカー の配列の中に変化を導入し、こうして検出可能な方法でその活性を変更するこ　 ゛とができる。この変更されたマーカーの活性を表示する形質転換された細胞を スクリーニングまたは選択させることによって（例えば、抗生物質耐性細胞につ いて選択させることによって）、小さい数のこのような細胞を制限分析によりア ニーリングした後、の１または２以上の所望の突然変異をもつ標的配列を有する 細胞を見いだす高層に高い可能性が得られる。

他のＢ様は「二重マーカー系」であり、ここで核酸構成体は、標的配列に加えて 、異なるマーカーの活性をエンコードする２つの配列を有する。このような系は 、標的配列の１または２以上のヌクレオチドの順次の突然変異誘発を実行するこ とに強力な手段を提供する。第１ラウンドにおいて、標的配列および両者マーカ ーの配列および活性を前述したように突然変異させる。第２ラウンドにおＵ＝て 、さらに標的配列を突然変異させ、そしてもとのマーカーの配列および活性を回 復させる。標的配列の中の所望の変化を実行するために必要なラウンド数を連続 することができる。１例として、抗生物質Ａに対する耐性を与える第１配列およ び突然変異するが、「野生型配列」に回復したとき、抗生物質Ｂに対する耐性を 与える第２配列をマーカーとして使用する。第１ラウンドにおいて、細胞をＢに 対する耐性について選択する（そしてＡに対する選択性についてスクリーニング する）。第２ラウンドにおいて、この位置を逆転させる。

引き続くラウンドを抗生物質の耐性の２つのパターンの間を前後にサイクルハッ クする。重要なことには、各突然変異誘発のラウンドについて標的配列をサブク ローニングする必要がない。

本発明のこれらのａｍにおいて、標的配列がポリペプチドをエンコードする場合 、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドは所望の変化、典型的には１または２以上 のアミノ酸の置換、挿入または欠失を導入するが、同時に、好ましくはポリペプ チドのアミノ酸を変化しないで、制限部位を導入または除去する。ポリペプチド をエンコードする標的配列は、発現ヘクターにおけるように、プロモーターに操 作的に連鎖することができる。

これらの方法は、必要に応して、１または２以上のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ ポリメラーゼで伸長しおよび／またはＤＮＡ　リカ゛−ゼを付加する工程を含む ことがある。

本発明は、また、前述の方法の任意の方法によりオリゴヌクレオチド特異的突然 変異誘発を実行するためのキットを提供し、このキットは、 （ａ）複製起点、標的配列を挿入するための制限部位、第１マーカーの活性をエ ンコードする第１マーカーの配列、および第２マーカーの活性をエンコードする 第２マーカーの配列からなる核酸構成体、および （ｂ）核酸構成体の一部分に対して実質的に相補的でありかつ第１および第２の マーカーの配列の中に変化を導入し、こうしてマーカーの活性の活性を有意に変 更することができるオリゴヌクレオチド、 からなる。

これらのキットは、さらに、 （ａ）前述したように、第１および第２のマーカーの配列および活性を回復する ことができる、追加のオリゴヌクレオチド、および／または （ｂ　）　ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド、およびＤＮＡポリ メラーゼの活性に適当な緩衝液、からなる。

さらに、本発明の方法とともに使用するために適当な突然変異誘発／選択ベクタ ーを提供し、そして前述のキットとともに包含することができる。

Ｕ狡説朋− 第１図は、本発明により記載される酸化耐性ＴＭ類イ以体をつくるために使用す る部位特異的突然変異誘発法を概略的に示す。

第２図は、バキュロウィルスの転移ヘクターｐＴＭＨＹ１０１および部位特異的 突然変異誘発反応において使用のための一本鎖ＤＮＡを作るためのヘクターｐＴ ＨＲ１４を描写する。

第３図は、天然ヒトトロンホモプリン（ｔｈｒｏ＠ｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）の６つ のＥＧＦ　様ドメイン領域を示す天然ヒトトロンホモプリンのヌクレオチドおよ びアミノ酸配列の列挙である。

第４図は、実験の節に記載する制限部位の部位特異的導入およびアミノ酸の置換 のために使用するプライマーのためのヌクレオチド配列を含む。

第５図は、クローニング／突然変異誘発ベクターｐＢＢＳ１０４の領域の概略的 地図（一定の比例で描かれていない）であり、これは次のものを包含する：β− ガラクトシダーゼ遺伝子（「ヘーターｇａｌ　ｌ　）を中断するポリリンカー、 複製のＣａｔＲ１起点（ｒＯＲＩ　Ｊ　）および複製のファージｆ１起点（’Ｆ ｌｏｒｉ　Ｊ　）および２つの抗生物質耐性マーカー、クロランフェニコールア セチルトランスフェラーゼ遺伝子、これはクロランフェニコールに対する耐性を 提供する）　（ＣａｔＲ）およびアンピシリン耐性遺伝子（これは部位特異的突 然変異誘発により容易に修復することができる突然変異のために非機械的（すな わち、感受性）である（ＡｗｐＳ）。転写または複製の向きは矢印により示され ている。これらの特徴は関係するベクターｐＢＢｓ９２．　ｐＢＢＳ９９゜ｐＢ Ｂｓｌｏｏ、　ｐＢＢｓｌｏｌおよびＰＢＳ１２２により共有される。

第５図は、また、突然変異誘発／選択において有用な４つのオリゴヌクレオチド を記載する：　Ｃ０Ｄ２４６１　、これはＡｍｐＳをＡｍｐＲに（すなわち、ア ンピシリン感受性をアンピシリン耐性に）変化しそしてＦｓｐ１部位をつくる。

Ｃ０Ｄ１９４１　、これはＣａ　ｔＲをＣａ　ｔｓに（すなわち、クロランフェ ニコール耐性をクロランフェニコール感受性に）変化しそしてＢｓｐＨ［部位を つくる。　Ｃ０Ｄ１６３２　、これはＡｍｐＲをＡｍｐＳに変化しそしてＸｃｍ 　Ｉ部位をつくる；およびＣ０Ｄ１９４０　、これはＣａ　ｔｓをＣａｔｌｌに 変化しそしてＡｖａ、　１部位をつくる。

第６図は、突然変異誘発／選択ヘクターｐＢＢｓ８９の概略的地図である。その 特徴は次のものを包含する：β−ガラクトンダーゼ遺伝子（「ヘーターｇａｌ　 ｌ　）を中断するポリリンカー、複製のＣａｔＲ１起点（ｒｏｌｌＩ　Ｊ　）お よび複製のファージｒ１起点（’Ｆｌｏｒｉ　」）および２つの抗生物質耐性マ ーカー、アンピンリン耐性遺伝子（ＡＩＩ＋ｐＲ）　、およびクロランフェニコ ールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、これはクロランフェニコールに対する 耐性を提供するが、部位特異的突然変異誘発により容易に修復することができる 突然変異のために非機能的（すなわち、感受性）である（ＡｍｐＳ）。転写また は複製の向きは矢印により示されている。

第７図は、突然変異誘発／選択ヘクターｐＢＢｓ９５および９７の一部分の概略 的地図であり、これらのベクターは哺乳動物細胞の中のクローニングしたポリペ プチドをエンコードする標的配列の一時的発現のために有用である。それらの特 徴は次のものを包含する：複製のＣａｔＲ１起点（ｒＯＲＩ　Ｊ　）および複製 のファージＦ１起点（’Ｆｌｏｒｉ　Ｊ　）および２つの抗生物質耐性マーカー 、アンピシリン耐性遺伝子（’ＡｍｐＪ　）　、およびクロランフェニコールア セチルトランスフェラーゼ遺伝子、これはクロランフェニコールに対する耐性を 提供するが、部位特異的突然変異誘発により容易に修復することができる突然変 異のために非機能的（すなわち、感受性）である（ＡｍｐＳ）。

それらは、また、次のものを包含する：　ＥｃｏＲＩおよび旧ｎｄｌ［Ｉのクロ ーニング部位（ｐＢＢｓ９７）またはＭＰＳＶプロモーター（’ＭＰＳＶ　ｐｒ ｏ」）により推進されるクローニングしたポリペプチドをエンコードする標的配 列の転写を可能とするように位置するポリリカー（ｐＢＢｓ９５）　；ＳＶ４０ 後期ポ後期ポリ配付加配列ｓＶ４０後期ポリＡ」）、サイトメガロウィルスのエ ンハンサ−（’ＣＭＶｅｎＪ　）　、および複製のＳＶ４０ウィルス起点（’５ Ｖ４０ｏｒｉ　Ｊ　）　、　ベクターｐＢＢＳ９７は、また、プロマイシン耐性 を与えるプロマイシン−Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子（ｒＰａｃ　 Ｊ　）を含む。転写または複製の向きは矢印により示されている。　５Ｖ４０ｏ ｒｉ配列が反対の向きである以外、ｐＢＢｓ９６はｐＢＢＳ９５と同一であり、 そしてＰａｃ遺伝子および５Ｖ４０ｏｒｉが反対の向きである以外、ｐＢ８Ｓ９ ８はｐＢＢＳ９７と同一であることに注意すべきである。

第８図は、突然変異誘発／選択ヘクターｐＢＢｓ８２および８３の一部分の概略 的地図であり、これらのベクターは哺乳動物細胞の中のクローニングしたポリペ プチドをエンコードする標的配列の発現のために有用である。それらの特徴は次 のものを包含する：複製のＣａｔＲ１起点（ｒＯＲＩ　、　）および復製のファ ージＦ１起点（’Ｆｌｏｒｉ　Ｊ　）および２つの抗生物質耐性マーカー、クロ ランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、これはクロランフェニコ ールに対する耐性を提供する（ＣａｔＲ）およびアンビンリン耐性遺伝子、これ は部位特異的突然変異誘発により容易に修復することができる突然変異のために 非機能的（すなわち、感受性）である（ＡｍｐＳ）。それらは、また、次のもの を包含する：　ＭＰＳＶプロモーター（’ＭＰＳＶ　ｐｒｏ」）により推進され るクローニングしたポリペプチドをエンコードする標的配列の転写を可能とする ように位置するポリリンカー；　ＳＶ４０後期ポ後期ポリ配付加配列ｓＶ４０後 期ポリＡ」）、サイトメガロウィルスのエンハンサ−（ＣＭＶｅｎＪ　）　、お よび複製のＳＶ４０ウィルス起点（’５Ｖ４０ｏｒｉ　Ｊ　）。また、前記ベク ターを含有する哺乳動物細胞の選択のための追加のマーカーは次のものが包含さ れる：プロマイシン耐性を与えるプロマイシン−Ｎ−アセチル−トランスフェラ ーゼ遺伝子（’Ｐａｃ」）；ヒゲ０フインシＢ耐性遺伝子（ｒＨｙｇＢ」）、お よびメトトレキセート耐性を与える増幅可能なマーカージヒドロ葉酸リダクター ゼ（ｒＤＨＦＲＪ　）。転写の向きは矢印により示されている。

第９図は、哺乳動物細胞の中のクローニングしたポリペプチドをエンコードする 標的配列の安定な発現のためにを用である突然変異誘発／選択ヘクターｐＢＢＳ ８２゜ｐＢＢＳ８３．　ｐＢＢｓ１２１　、およびｐＢＢｓ１０６の一部分の概 略的地図である。それるの特徴は次のものを包含する：復製のＣａｔＲ１起点（ ｒＯＲＩ　Ｊ　）および複製のファージＦ１起点（’Ｆｌｏｒｉ　Ｊ　）および ２つの抗生物質耐性マーカー、クロランフェニコールアセチルトランスフェラー ゼ遺伝子、これはクロランフェニコールに対する耐性を提供する（ＣａｔＲ）お よびアンピシリン耐性遺伝子、これは部位特異的突然変異誘発により容易に修復 することができる突然変異のために非機能的（すなわち、感受性）である（Ａｍ ｐＳ）。それらは、また、次のものを包含する：呻乳動吻のプロモーターおよび 介在する配列（ＩＶＳ）およびＳＶ４０ポリＡ付加配列（ｒｓＶ４０後期ポリＡ Ｊ）の間に位置するクローニング部位（図示せず）、こうしてＭＰＳＶプロモー ター（ｒＭＰＳＶ　ｐｒｏ」）　（ｐＢＢｓ８２およびｐＢＢｓ８３）　、ＳＶ ４０前記プロモーター（ｒｓＶ４０前記Ｐｒｏ）　（ｐＢＢｓ１２１）またはヒ トメクロチオ名インＵａプロモーター（「ヒトＭＴＩ［ａＰｒｏ　Ｊ　）（ｐＢ Ｂｓ１０６）により推進されるクローニングしたポリペプチドをエンコードする 標的配列の転写を可能とする。さらに、それらはサイトメガロウィルスのエンハ ンサ−（ＣＭＶｅｎｈ」）　、および複製のＳＶ４０ウィルス起点（「５Ｖ４０ ｏｒｉ　Ｊ　）を含む。また、前記ベクターを含有する哺乳動物細胞の選択のた めの追加のマーカーは次のものが包含される：プロマイシン耐性を与えるプロマ イシン−Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子（’Ｐａｃ」）；ヒゲ０フイ ンシＢ耐性遺伝子（「ＨｙｇＢ」）　、およびメトトレキセート耐性を与える増 幅可能なマーカージヒドロ葉酸リダクターゼ（ｒＤＨＦＲ」）　、その発現はＳ Ｖ４０後期（７）フＯモー９−　（ｐＢＢｓ８２オヨびｐＢＢｓ１２１）または ＳＶ４０前記プロモーター（ｐＢＢＳ８３およびｐＢＢｓ１０６）により推進さ れる。転写の向きは矢印により示されている。

第１０図は、昆虫細胞の中のクローニングしたポリペプチドをエンコードする標 的配列の安定な発現のために有用である突然変異誘発／選択ヘクターｐ８Ｂｓ１ ２４およびｐＢＢＳ１２５の一部分の概略的地図である。それらの特徴は次のも のを包含する：復製のＣｏ１Ｅ１起点（ｒＯＲｌ　Ｊ　）および複製のファージ Ｆｌ起点（’Ｆｌｏｒｉ　Ｊ　）および２つの抗生物質耐性マーカー、クロラン フェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、これはクロランフェニコール に対する耐性を提供する（ＣａｔＲ）およびアンピシリン耐性遺伝子、これは部 位特異的突然変異誘発により容易に修復することができる突然変異のために非機 能的（すなわち、感受性）である（ＡｍｐＳ）。それらは、また、次のものを包 含する：クローニングしたポリペプチドをエンコードする標的配列の転写を可能 とするように、バキュロウィルスのポリへドリンプロモーターおよびポリＡ付加 配列（「ポリＡＪ）の間に位置するポリリンカーを含む。転写ポリＡ付加（およ びクローニングした標的配列の転写）および複製の向きは矢印により示されてい る。

第１１図および第１２図は、第５図〜第１０図に示す突然変異誘発／選択ヘクタ ーを誘導化した方法の線図である。

死１旦公１（少■員屋翌旦 本発明は、突然変異すべき標的配列を有する核酸構成体のオリゴヌクレオチド特 異的突然変異誘発を急速にかつ容易に実施する方法を提供する。多重突然変異は 単一の標的配列上で同時におよび／または順次に実施することができ、そして１ より多いこのような標的配列を単一の構成体の中に含めることができる。核酸構 成体は、適当な宿主の中で維持することができる、自己複製する、好ましくは染 色体外要素からなるか、あるいはその中に組み込むために適当であろう。構成体 は、通常、突然変異した標的配列を含有する宿主細胞の容易な同定または選択を 可能とするように、１または２以上のマーカーの配列を含有するであろう。クロ ーニングした標的配列は、通常、タンパク質コーディング配列であるが、また後 述するように非コーディング配列を含むことができる。

抜鼓盈底体 本発明の実施において有用な核酸構成体は、標的配列のクローニング、すなわち 、使用可能な量の核酸の生産を促進しそして、通常、標的配列によりコードされ たポリペプチドの発現を指令するであろう。核酸構成体は、それらが実行する機 能ならびにそれらを導入する宿主に依存して異なる成分を含有するであろう。

普通に、核酸構成体はＯＮ八へ現ヘクターであり、単細胞の宿主、例えば、細菌 または可能ならば酵母の中の復製に適当なペプチドをエンコードする標的配列組 み込んでいる。

あるいは、それらは培養した哺乳動物または植物または他の真核生物の細胞の中 に導入するために意図することができる。このようなベクターは、通常、宿主に より認識された複製系、例えば、複製起点または自律的に複製する配列（ＡＲ３ ）、ポリペプチド生産物をエンコードする１または２以上の配列、およびポリペ プチドをエンコードする配列に作用可能に連鎖する転写および翻訳の開始ｉｊ１ 節配列配列むであろう。転写ｌ１節配列は、異種エンハンサ−および／またはプ ロモーターおよび必要な処理情報部位、例えば、リポソーム結合部位、ＲＮＡス プライス部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネータ−配列およびｍＲＮＡ安 定化配列、それらのすべては宿主により認識される、を含むことができる。この ような発現ベクターは、また、同一種または異なる種の分泌されたポリペプチド からの分泌シグナルを含むことができ、これらのシグナルはタンパク質を細胞膜 を横切らせかつその中に止まらせ、こうしてその機能的トポロジーを獲得する。

このような発現ベクターは自律的に複製することができるが、それらは、別の方 法で、宿主細胞のゲノムの中に挿入されることによって、この分野においてよく 知られている方法により複製することができる。

よく理解されるように、このような核酸構成体内の標的配列はペプチドをエンコ ードする配列以外のであることができる。例えば、転写または翻訳をコントロー ルする配列あるいは核酸またはタンパク質の処理を、複製起点上で、変更するか 、あるいはペプチドをエンコードする配列からイントロンを除去することが望ま しいことがある。

適当なプロモーターの分泌は宿主に依存するが、細菌の宿主について、細菌のプ ロモーター、例えば、ｔｒｐ、　ｌａｃおよびファージのプロモーター、ｔＲＮ Ａプロモーターおよびグリコール分解酵素のプロモーターは知られており、そし て普通に使用されている。参照、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ ｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｖｏ ｌ、１〜３、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８９）　、 これを引用によってここに加える。有用な酵母プロモーターは次のもののための プロモーター領域を包含する：メタロチオ不イン；３−ホスホグリセレートキナ ーゼまたは他のグリコール分解酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド −３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ；フル１−−スおよびガラクトースの利用 に関係する酵素など。酵母の発現における使用に適当なベクターおよびプロモー ターは、さらに、Ｒ，Ｈ１ｔｚｅ信ａｎら、欧州特許（Ｅｌ’）第７３．６５７ Ａ号（これを引用によってここに加える）に記載されている。

適当な天然以外の＠乳動物のプロモーターは、なかでも、次のものを包含するで あろう：　ＳＶ４０の前期および後期のプロモーター、あるいはマウス乳がんウ ィルス、鳥類肉腫ウィルス、アデノウィルス■、ウシ乳頭腫ウィルスまたはポリ オーマウィルスから誘導化されたプロモーター。細胞系および発現ベクターの有 効な組み合わせの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されている；ま た、！Ｉｅｔｚｇｅｒ　ら、Ｎａｔｕｒｅ３３４　：　３１　（１９８９）　（ これを引用によってここに加える）を参照のこと。

核酸を他の核酸配列と機能的関係に配置すると、それは作用可能に連鎖される。

例えば、プロモーターまたはエンハンサ−がペプチドをエンコードする配列に影 響を与える場合、それは操作的に連鎖されている。−船に、作用可能に連鎖され たは、連鎖されているＤＮＡ配列が隣接していることおよび、２つのタンパク質 コーディング領域を接合することが必要である場合、隣接しかつリーディングフ レームの中にあることを意味する。ペプチドをエンコードする核酸配列をベクタ ーの中にサブクローニングすることおよび核酸の操作の他の技術は、一般に、５ ａａｒｂｒｏｏｋら、小組μ辺Ｌ■」■犯ｕ工り上」工只崩二佳虹Ｌｊμ旦■第 ２版）　、Ｖｏｌ、　１〜３、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ− （１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌ ａｒ　Ｂｉｏｌｏ　Ｆ、　Ａｕ５ｕｂｅｌ　ら、編、グリーネ・パブリッシング ・アンド・ウィリイーインターサイエンス、ニューヨーク（１９８７）（これら を引用によってここに加える）に記載されている。

二久叉二 ペプチドをエンコードする配列をクローニングしかつ本発明の突然変異誘発法を 実施するために好ましいベクターは、前述した２つの抗生物質のマーカー、およ び、次のものを包含する追加の特徴を含有するであろう： （１）原核生物細胞、好ましくは　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、例え ば、Ｃｏ１Ｅ１　ｏｒｉ　の中のベクターの増殖に適当な復製起点（紅。

高いコピー数のベクター、例えば、コピー数を低下させるＣｏ１Ｅ１　レプリコ ンからの配列を欠如する、ｐ［ｌｃに基づくものは好ましい。なぜなら、それら のＤＮＡはいっそう豊富であり、こうして宿主細胞からいっそう容易に精製され るからである。高いベクターのコピー数は、また、ベクターの中に挿入された配 列によりコードされたタンパク質の対応して高いレベルの発現を可能とする。

（２）−末鎖の形態のベクター配列、例えば、Ｍ１３またはｆｌのような一本鎖 ＤＮＡから得られた旦シーの便利な生産を可能とする複製起点。

（３）ベクターの中に種々の制限部位を挿入するためのポリリンカー。ポリリン カーは好ましくは圏４遺伝子内に位置して、ポリリンカーの中への挿入について の青／白色のスクリーニングを可能とする。すべての３つのリーディングフレー ムの中におよびｎ■遺伝子に関して両方の向きでポリリンカーを有する１系列の ベクターは、最大のクローニングの融通性を提供する。

追加の望ましい特徴は、次のものを包含する：ポリリン力−をフランキングしく 例えば、ＳＦ３またはＴ７プロモーター）そして挿入された標的配列からなるＲ ＮＡ転写体のｉｎ　ｖｉｔｒｏ生産を指令することができる二重の反対のファー ジプロモーター配列；連鎖終結方法により挿入された標的配列の便利な配列決定 のためのポリリンカーをフランキングするオリゴヌクレオチド配列決定プライマ ー（例えば、ｐＬｌｃ／Ｍ１３の前方および／または逆配列決定プライマー）の ための便利な結合部位；または他の特徴は当業者にとって明らかであろう。

ｐＳＥＬＥＣＴ　（ＴＭ）　−１ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ、）はこ れらのｖＦ＠の多くを存し、そして本発明の突然変異誘発法のために有用である 。われわれは第５図〜第１０図に示すベクターを構成し、ここでｐＳＥＬＥＣＴ （ＴＭ）　１のアンピシリン耐性遺伝子の中のそれと異なる突然変異により怒受 性としたアンピノリン耐性遺伝子を使用して、測定可能に高いコピー数を生産し た。これらのベクターにおいて、ｐＳＥＬＥＣＴ　（ＴＭ）１上に存在するテト ラサイタリン耐性遺伝子以外の抗生物質マーカー、例えば、クロランフェニコー ルアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をまた使用する。なぜなら、いくつか の望ましい大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｔ）宿主株（例えば、ＢＨＭｍｕｔＳ）は既にテトラサイクリン耐性から である。

また、標的配列の突然変異誘発および本発明の突然変異誘発法により提供される 突然変異した配列についてのスクリーニングまたは選択を可能とするばかりでな （、かつまた突然変異した配列によりコードされるタンパク質の真核生物の細胞 の中の発現を可能とするベクターは、本発明の方法のために有用である。このよ うなベクターの使用はある場合においてかなりの時間を節約し、突然変異したタ ンパク質のコーディング配列の発現を可能とし、そして突然変異誘発ベクターか らの突然変異した標的配列の単離および発現ベクターの中への配列のサブクロー ニングを必要としないで、突然変異体の表現型の直接のスクリーニングまたは選 択を可能とする。

真核生物の発現ベクターは、また、このようなベクターが、後述するように、導 入された真核生物の細胞の選択に適当なマーカーを含むであろう。例えば、哺乳 動物の突然変異誘発／発現ベクターは、クローニングした標的配列の発現を推進 するために、骨髄増殖性肉腫ウィルス（ＭＰＳＶ）プロモーター、ＳＶ４０前期 プロモーター、またはヒトメタロチオネイン■プロモーターを使用することがで きる。哺乳動物細胞の中のベクターの選択に適当なマーカーは、プロマイシン− Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼ（Ｐａｃ）、これはプロマイシン耐性を与え る；ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＰＲ）　、これはメトトレキセート耐性を 与える；またはヒグロマイシンＢ耐性遺伝子（ｈｙｇ　Ｂ）を包含する。このよ うなベクターは、クローニングした標的配列の一時的または安定な発現のために 使用するようにデザインすることができる。一時的発現のために、このようなベ クターは、好ましくは、例えば、問題の宿主細胞の中で機能する複製起点（例え ば、哺乳動物細胞の中の安定なＳＶ４０復製起点）を含む。安定な発現のために 、選択可能でありそして、好ましくは、増幅可能なマーカー（例えば、ジヒドロ 葉酸リダクターゼ、ＤＨＦＲ）が要求されるであろう。

また、バキュロウィルスの突然変異誘発／発現のベクターは有用である。このよ うなベクターにおいて、ポリへドリンプロモーターは、例えば、ポリリンカーの 中でクローニングした標的配列の昆虫細胞の中の発現を推進することができる。

アンピシリンおよびクロランフェニコール耐性遺伝子は、二重選択可能なマーカ ーとして使用することができる。

当業者にとって容易に明らかなように、この分野においてよく知られている他の プロモーターおよびマーカーは種々の真核生物（例えば、酵母、昆虫、水陸両生 動物、鳥類、哺乳動物）の細胞の中の発現および選択のために有用である。さら に、部位特異的突然変異誘発またはこの出願に記載するベクターのクローニング 部位を変更する他のよく知られている技術を使用して、標的配列をその中にクロ ーニングするクローニング部位をすべての３つのリーディングフレームで設けて 、ペプチドをエンコードする標的配列の発現を促進することは、当業者にとって 明らかである。

二二ノな１ＱＥＩＬ 本発明による発現およびクローニングのベクターは、１または２以上のスクリー ニング可能なおよび／または選択可能なマーカーの配列を含存するであろう。ス クリーニング可能なマーカーは容易に検出される活性をもつタンパク質をエンコ ードして、このようなマーカーを発現する細胞の同定を容易にする。このような マーカーは、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびルシ フェラーゼを包含する。選択可能なマーカーは、ベクターで形質転換された宿主 細胞の生き残りまたは成長に必要なタンパク質をエンコードする遺伝子である。

この遺伝子の存在は、インサートを発現する宿主細胞のみの成長を保証する。典 型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒性物質、例えば、アンピンリ ン、ネオマイシン、メトトレキセートなどに対する耐性を与える；　（ｂ）両栄 養性の欠如を補足する；または（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養を供給 するタンパク質をエンコードし、例えば１．伍汗」ソ源仄（ｈ虹旦亘のためのＤ −アラニンラエアーゼをエンコードする遺伝子である。適切な選択可能なマーカ ーの選択は宿主細胞に依存し、そして異なる宿主のために適当なスクリーニング 可能なかつ選択可能なマーカーはこの分野においてよく知られている。

本発明の好ましい態様は２つの抗生物質のマーカー系である。第１の選択可能な 抗生物質のマーカーはマーカーの配列の中の単一の部位における挿入、欠失また は置換のために作用不可能である；第２の選択可能な抗生物質のマーカーは作用 的である。ペプチドをエンコードする配列の突然変異誘発の間に、その突然変異 に関係するオリゴヌクレオチドに加えて、また、第１マーカーを突然変異させて それを作用可能とする（すなわち、その野生型配列および活性を回復する）オリ ゴヌクレオチドおよび第２マーカーをエンコードする核酸配列の１または２以上 のヌクレオチドを置換、挿入または欠失することによって第２マーカーを作用不 能にする他のオリゴヌクレオチドを使用する。第１マーカーが細胞に耐性を与え る抗生物質の存在下に成長させることによって、突然変異した鎖から生ずる核酸 を有する形質転換された細胞について選択することができる。そのペプチドをエ ンコードする配列をさらに突然変異させようとする場合、また、第１マーカーを 突然変異させてそれを作用不能とし、そして第２マーカーを突然変異させてそれ を作用可能とし、こうしてペプチドをエンコードする配列を新しいヘクターの中 にサブクローニングすることを必要としないで、各マーカーのためのもとの配列 に「サイクリング・ハック」する。このような系は同一のペプチドをエンコード する配列の順次の突然変異を非常に容易にしかつよオリゴヌクレオチドは、典型 的には合成手段により調製された、一本積ＤＮＡである。本発明において使用す るオリゴヌクレオチドは長さが好ましくは１０〜１００、より好ましくは１６〜 ４０であるが、異なる長さのオリゴヌクレオチドが適当であることがある。例え ば、あるペプチドの中の１より多いアミノ酸を突然変異させるために、突然変異 すべき一本鎖の形態の標的核酸へのオリゴヌクレオチドの適切なアニーリングを 確実するために、より長い相補性領域を維持するために、より長いオリゴヌクレ オチド′が要求されることがある。

「ギャップド二本鎖ＤＮＡ　Ｊのアプローチを実行しようとする場合、より長い オリゴヌクレオチドがまた適当であろう（ＫｒａｍｅｒおよびＦｒ１ｔｚ、　Ｍ ｅｔｈ、　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、　（＋９８７）　１５４　：　３５０−３６７、こ れを引用によってここに加える〕。

適当なオリゴヌクレオチドは、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ。

Ｔｅｔｒａ、　Ｌｅｔｔ、　２２　：　１８５９−１８６２　（１９８１）に記 載されているホスホルアミダイト法によるか、あるいはＭａｔｔｅｕｃｃｉ　ら 、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ。

１０３　：　３１８５　（１９８１）　（両者を引用によってここに加える）に 従うトリエステル法によるか、あるいは他の方法、例えば、商業的な自動化され たオリゴヌクレオチドの合成装置により調製することができる。

本発明の方法は、１つのＢ様において、核酸構成体の一部分に対して実質的に相 補的であり（こうして鋳型へのオリゴヌクレオチドのアニーリングを可能とする ）がっ（ｂ）！ｌ的配列内のヌクレオチドを変化しかつ核酸構成体上のどこがの 制限部位を導入または除去することができる配列を有するオリゴヌクレオチド（ 「突然変異誘発性オリゴヌクレオチド」）を使用する。

特定の態様において、標的配列はポリペプチドをエンコードする。

この場合において、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドによる制限部位の導入ま たは除去は、そのペプチドをエンコードする配列のアミノ酸を変化しないで達成 される。すべての場合において、これらの突然変異誘発性オリゴヌクレオチドの 配列は究極的に突然変異した核酸の中に組み込まれる。

突然変異誘発性オリゴヌクレオチドは、核酸構成体内の正確なｌまたは２以上の 位置におけるｌまたは２以上のヌクレオチドを変化させることができる、すなわ ち、核酸配列の中の１または２以上の不一致から生ずる１または２以上の部位特 異的修飾を導入することができるであろう。標的配列があるペプチドをエンコー ドする場合、その配列への突然変異誘発性オリゴヌクレオチドの組み込みは、通 常、アミノ酸の置換または１または２以上の挿入または欠失を生ずるであろう。

当業者は容易に理解することができるように、核酸の中の１つのヌクレオチド塩 基の変化はそれをエンコードするアミノ酸配列の中に所望の変化を与えるために 十分なことがあるが、１より多いこのような塩基の変化が必要なことがある。さ らに、各オリゴヌクレオチドを使用して１より多いアミノ酸を変化するが、ある いは終止コドンの導入によりポリペプチドを切頭することができる。

それらの同一の突然変異誘発性オリゴヌクレオチドは、前記ポリペプチドのアミ ノ酸配列を変化させないで、核酸構成体から制限部位を導入または除去すること ができる。この制限部位の変化は、前述の所望のポリペプチドの変化の存在につ いての信鎖性ある診断を提供し、配列決定によるこのポリペプチドの配列の変化 の存在を評価するための必要性を排除する。制限部位は標的配列の内部に位置す ることができるか、あるいは通常さに劣るが、標的配列の外側に位置することが できる。突然変異誘発生成物の診断的制限消化により、１つまたはいくつかの核 酸構成体の中の多数のこのような変化について急速にかつ容易にスクリーニング することができる。当業者はこのタイプのオリゴヌクレオチドをデザインするこ とができるであろうが、遺伝暗号、コドンの頻度の情報、および有用な制限部位 の配列における同義性のような原理の組み込みにおいて、例えば、シーンワーク ス（ＧｅｎｅＷｏｒｋｓ）　（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｐａ１ｏ　 Ａｌｔｏ）のようなコンピュータープログラムからの助けを利用することができ る。

これらのオリゴヌクレオチドに加えて、本発明の方法において、必要に応して、 前述したように１または２以上のマーカーの配列の一部分に対して実質的に相補 的であり、かつマーカーの活性（例えば、抗生物質耐性）を有意に変更する変化 をマーカーの配列の中に導入することができるオリゴヌクレオチドを使用する。

ヌクレオチドの置換、普通Ｃごアミノ酸配列をエンコードするもの置換または切 頭マーカーのタンパク質；挿入；または欠失をマーカーの配列の中に本発明の方 法により導入することができる。本発明の好ましい態様は、ことに、二重マーカ ー系の使用であり、２つの抗生物質耐性マーカー、第１の作用可能な（すなわち 、野生型、抗生物質耐性）マーカーおよび第２の作用不能な（すなわち、突然変 異体、抗往吻質感受性）マーカーを含むが、これらに限定されない。このような 系は、単一の標的上で多数のラウンドの突然変異誘発を実ｊテするとき、ことに 有用である。第１ラウンドにおいて、１つのオリゴヌクレオチドを第１マーカー を抗性物質感受性に突然変異することに関係する；他のオリゴヌクレオチドは第 ２マーカーを抗生物質耐性に突然変異する。次のラウンドはこのプロセスを逆転 し、マーカーを突然変異させてそれらのもとの状態に回復させる。このサイクル を所望の頻度で反復することができる。各突然変異誘発のラウンドにおいて、抗 生物質耐性を与えるように突然変異したマーカーを発現する細胞についてスクリ ーニングしあるいは、好ましくは、選択し、そしてそのように選択された細胞の 他のマーカーに対する感受性について試験することができる。このような細胞の 中の標的ＤＮＡは、多分、前述したように得られた、ポリペプチドをエンコード する領域の中に所望の突然変異をまた含をする。この所望の突然変異の存在は診 断的制限消化により容易にスクリーニングされ、ここで診断的制限消化は所望の 突然変異の存在を信鎖性をもって示す。なぜなら、変更された制限部位および所 望の突然変異は同一の突然変異誘発性オリゴヌクレオチドにより発生するからで ある。

オリゴヌクレオチドは後述するように決定された条件下に核酸構成体上の単一の 所望の位置にのみアニールするとき、そのオリゴヌクレオチドは核酸構成体の一 部分または領域に対して実質的に相補的である。このようなオリゴヌクレオチド は８またはそれ以上の連続するヌクレオチドの好ましくは１つの、より好ましく は１より多い領域を含存し、そして完全な相補性表示するオリゴヌクレオチドの ３′末端に１または２以上のヌクレオチド（すなわち、標的核酸の一本ｔＪＩ　 Ｍ域と対になった塩基）を有するが、より長いオリゴヌクレオチド（例えば、２ ｏヌクレオチドより多い）は完全な相補性をもつ連続するヌクレオチドのこのよ うなっＩ域と所望の特異性をもってアニールすることができない。適切なアニー リング条件は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、塩基の組成物、および不一 致の数およびオリゴヌクレオチド上のそれらの位置に依存し、そしてしばしば実 験的に決定しなくてはならない。オリゴヌクレオチドのデザインおよびアニーリ ング条件の論考は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎ ｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ（第２版）、νｏ１．１〜３ 、コールド・スプリング・バーバー・ラボラトリ−（１９８９）またはＣｕｒｒ ｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　、Ｆ、　 Ａｕ５ｕｂｅｌら、曙、グリーネ・パブリッシング・アンド・ウィリイーインタ ーサイエンス、ニューヨーク（１９８７）　（これらを引用によってここに加え る）を参照のこと。

容易に理解されるように、多重突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを使用して、 標的核酸によりコードされるポリペプチド上のい（つかの部位を突然変異させる ことができる。この場合において、多数の所望の突然変異を得ることができるが 、単一の突然変異誘発ラウンドにおいてすべての所望の突然変異を得ることはで きない。突然変異すべき標的核酸をサブクローニングしないで、例えば、前述の 二重マーカー系を使用することによって、同一鋳型の順次の突然変異により残り の突然変異を容易に得ることができる。標的核酸において多重突然変異を発生さ せるために要求される時間および努力は、本発明の方法の使用により、劇的に簡 素化される。

オリゴヌクレオチドを一本鎖の形態の核酸構成体にアニーリングした後、オリゴ ヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼにより伸長することができる。Ｔ４ＤＮＡポ リメラーゼはこの目的にＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー断片より好ましい。な ぜなら、それは鎖を置換せず、したがってオリゴヌクレオチドを置換しないから である（Ｙ、　Ｍａｓａ＋ｏｕｎｅおよびＣ，Ｒ４ｃｈａｒｄｓｏｎ、　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（１９７１）　２４６　：　２６９２　；　Ｊ。

Ｎｏ５ｓａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（１９７４）　２４９　：　 ５６６８　；両者を引用によってここに加える）。リン酸化オリゴヌクレオチド を使用することによって、突然変異体の数を増加することができるが、便宜上、 この工程を省略することができる。外注はいくつかの売上がら入手することがで きるか、あるいはＳａｍｂｒｏｏｋら、助」二カ頭工ｕｒ」Ｌ二虹Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ（第２版）　、Ｖｏｌ、　１〜３、コールド・スプリング ・バーバー・ラボラトリ−（１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏ ｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　８ｉｏ１ｏ　、　Ｆ、　Ａｕ５ｕｂｅｌ　ら、 編、グリー不・パブリッシング・アンド・ウィリイーインターサイエンス、ニュ ーヨーク（１９８７）（これらを引用によってここに加える）に記載されている プロ）・フルにより作ることができる。伸長後桟る二ンクをＤＮＡ　リガーゼで シールすることができるが、この工程は任意である。

しばしば起こるように、修飾しようとする核酸構成体は、それらの生活環の少な くとも一部分の間、例えば、ＭＩ３またはｆｌに似た一本１ＸＤＮＡファージの 場合において真実であるように、当然一本積の形態を取る。複製のＭ１３または ｆ１起点における使用に適当な、ある数のプラスミドベクター（しばしば「ファ ージミド（ｐｈａｇｅｎ＋ｉｄ）　Ｊベクター）が存在する。例えば、複製の１ ３起点を有するプラスミドを含有する適当な宿主細胞（例えば、ＪＭ１０９）を 野生型Ｍ１３ファージで感染させるとき、プラスミドの一本鎖の形態が発生する 。あるいは、突然変異すべきペプチドをエンコードする領域を含有する二本鎖プ ラスミドを当業者によく知られている種々の手段、例えば、アルカリまたは沸騰 により変性により変性して、オリゴヌクレオチドをアニールすることができる標 的ＤＮＡの一本鎖の形態を生成するコトカできル（Ｓａｉｂｒｏｏｋら、聾劫品 ｆａｒ工国旺旺二」」刃二。孟ユバ肚虹（第２版）　、Ｖｏｗ、　１〜３、コー ルド・スプリング・バーバー・ラボラトリ−（１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ 　ＰｒｏｔｏｃｏＩｓ　１ｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ旦ユ」ＬＦ、　Ａｕ５ｕｂｅ ｌ　ら、編、グリーネ・パブリッシング・アンド・ウィリイーインターサイエン ス、ニューヨーク（１９８７）　（これらを引用によってここに加える）。

オリゴヌクレオチドが一本鎖の形態の標的核酸にアニーリングされるとき、部分 的に二本鎖の核酸が形成する。標的核酸の５０％より多く、より好ましくは９０ ％より多く、最も好ましくは９５％またはそれ以上が１または２以上のオリゴヌ クレオチドおよび／またはポリメラーゼを使用するそれらの伸長生成物（突然変 異誘発の結果として欠失されるであろう領域を含まない）にアニーリングされる とき、実質的に二本Ｍ核酸が存在する。

６−の　ンバク　をエンコード　る　ｊ上の　の。亡の′″炊・誘光 対応する数の突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを使用してペプチドをエンコー ドする配列上の多数の部位を突然変異誘発するために、本発明の方法を使用する ことができることが理解される。突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを置換しな いＴ４ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、オリゴヌクレオチドの伸長を望む、 このような突然変異誘発において使用されるであろう。本発明の方法は、単一の ポリペプチドの中の９程度に多くの部位を同時に突然変異するために首尾よく使 用された。それはこのような多数の部位の突然変異を多数のオリゴヌクレオチド を使用して試み、そしてすべてではないが、い（つかの所望の位置における突然 変異を得る場合であろう。容易に明らかなように、診断的制限消化後、それらの 部位は突然変異すべき状態のままである。次いで、適当な突然変異誘発性オリゴ ヌクレオチド、すなちわ、前述の二重マーカー系により簡素化された物−質を使 用して、残りの部位の二次の突然変異誘発を単に実施することができる。

宣庄ｍυ駐【１奥 ＤＮＡポリメラーゼにより伸長することができる、前述のオリゴヌクレオチドを 標的核酸にアニーリングした後生成した、部分的または実質的に二本鎖の核酸は 、よく知られている方法により宿主細胞の中に直接導入することができ、これら の方法は細胞の宿主のタイプに依存して変化し、次のものを包含する：エレクト ロポレインヨン；塩化セシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ −デキストラン、または他の物質を使用するトランスフェクション；微小投射体 の衝撃７リボフエクシゴン；感染（ベクターが感染因子、例えば、ライノウィル スのゲノムである場合）：マイクロインジェクションなどの方法。一般に、Ｓａ ｍｂｒｏｏｋら（１９８９）およびＦ、　Ａｕ５ｕｂｅｌら（曙）　（１９８７ ）　、両者を引用によってここに加える、を参照のこと。前述の核酸が導入され た細胞は、また、このような細胞の子孫を含むことを意味する。

形質転換のために好ましい宿主細胞は修復マイナス大ＩＩＪｉ請（Ｅ。

ｃｏｌｉ）　株（例、ｉば、ｍｕ　ｔｓ株、例ｘば、ＢＭＷ　７１−１８　ｍｕ ｔ　Ｓ）　テあり、これはｉｎ　ｖｉｖｏ不一致の修復を抑制しくＢ、　Ｋｒａ ｍｅｒら、釦旦（１９８４）３８　：　８７９　；　Ｒ，ＺｅｌｌおよびＨ，Ｆ ｒ１ｔｚ、　ＥＭＢＯＪ、　（１９８７）　６　：　１８０９　；両者を引用に よってここに加える）、こうして標的核酸とのオリゴヌクレオチドの不一致が修 復される機会を減少する。また、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株ＤＨ５αは好まし い。

本発明は以下の実施例を参照することによっていっそうよく理解されるであろう 。これらの実施例は本発明の実施のために現在知られている最良のモードを単に 例示するが、本発明はそれらに限定されると考えられない。

実Ｊ１舅 １．１、ロンポモヅリンのメチオニン２９１および３８８の。亡　・ス。

九斐且誘光 天然のヒトトロンポモヅリンの６ＥＧＦ様ドメイン領域は２つのメチオニン残基 を有し、１つは位置２９１に存在しそして１つは位置３８８に存在する。（第３ 図参照）。オリゴヌクレオチド特異的ｉｎ　ｖｉｔｒ。

突然変異誘発を使用して、これらのＭｅｔのいずれかまたは両者または他のアミ ノ酸を変換した。

ａ、プラノ］」９刀伏Ｈ Ａｓｅ　Ｉ　−５ｃａ　Ｉ断片上に含有される複製のｆ１起点を、前取てＮｄｅ ＩおよびＳｅａ　Ｉで消化した、昆虫細胞の転移ベクターｐＴ）ＩＨＹＩＯＩの 中に結合することによって、一本領ＤＮＡのコピーを作るためのプラスミドを構 成した。プラスミドルＴ門ＨＹＩＯＩは、トロンポモヅリンの６ＥＧＦ様ドメイ ン、アミノ酸２２７−４６２に相当するランフぐり譬を生産する遺伝子配列を含 有する。数２２７−４６２は天然トロンボモヅリン配列に相当するアミノ酸を意 味する（第３図）。アミノ酸２２７−４６２は５ＥＧＦ様ドメインからなる。ｐ ＴＭＨＹｌｏｌは同時係属米国特許出願第３４５．３７２号に完全に記載されて おり、そして第２図に線図的に示されて（する。

ｂ２皿位立ｉ的突然変異 特定の突然変異誘発性オリゴヌクレオチドのプライマーを合成し、そしてＭＩＩ ＴＡＴＯＲ”−ＤＮＡポリメラーゼ■部位特異的突然変異誘発キット（カタログ Ｎｏ、　２００５００．　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラジョラ、カリフォルニア州 ）とともに使用したが、特記しない限り、第２鎖の合成をブライミングし、そし てメチオニンの一方または両者が非酸化性アミノ酸に変化したトロンポモヅリン 類似体遺伝子をつくった。好ましし）アミノ酸、ロイシン、グルタミンまたはア ラニンへの変換を指令するプライマーは第４図に示されている。また、これらの プライマーには、首尾よい突然変異誘発についての診断として有用な独特制限酵 素部位を付加するヌクレオチド配列の中に置換が含まれるが、これは対応するア ミノ酸配列を必ずしも変化させない。ヌクレオチドの置換は第４図に示すプライ マーに下線に引かれている。例えば、プラスミドｐＴＨＲ２８において、天然ト ロンポモヅリンタンパク質の中の位置３８８におけるメチオニンはロイシンで置 換されており、そしてこの方法において、独特Ｐｖｕ　ＩＩ部位が導入された。

理解されるように、他の置換した非酸化性アミノ酸は本発明において等しく有用 であろう。

精製した一本１ｊＤＮＡ鋳型をバイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）　（ＭｕｔａＧ ｅｎｅＰｈａｇｅｍｉｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ、　１ｎｓ ｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ　カタログ６ＮＯ１１７０−３５７６、ｐ、　 ３３−３４）により記載された手順により調製したが、この分野において知られ ている他の手順も等しく適当であろう。

アニーリング緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣ１ｐＨ７，５、８ｍＭ　Ｍｇ Ｃ１ｚおよび４０ｍＭ　ＮａＣ１）の中に：２＋Ｍ　ｒＡＴＰ、　０．４０／　 ｕ　Ｉ　ポリヌクレオチドキナーゼを含有する溶液の中で０．５ｎｇ／μｌのプ ライマーを３７°Ｃにおいて３０分間インキユヘーションすることによって、各 突然変異誘発プライマーの５′末端をリン酸化した。１００　ｎＨの鋳型および ２．５ｎｇのプライマーを２５μｌのアニーリング緩衝液の中で６５°Ｃに５分 間加熱し、次いでこの混合物を冷却し、そして室温において１０分間アニールす ることによって、リン酸化プライマーを一本鎖鋳型にアニーリングした。Ｔｓｕ ｒｕｓｈｉｔ、　Ｎ、ら（１９８８）　Ｇｅｎｅ　６２　：　１３５−１３９お よび０’Ｄｏｎｎｅｌｌ、　Ｍ、　Ｅ、ら（１９８５）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｎ、　２６０　：　１２８７５−１２８８３に本質的に記載されているよう なプライマー伸長により、二本鎖ＤＮＡを作った。簡単に述べると、鋳型／プラ イマーの混合物を１０％アニーリング緩衝液＋８０μｇ／ｍｌウン血清アルブミ ン、２．５１１Ｍジチオスレイトール、０．２５ｍＭ混合ｄＮＴＰ、２ｍＭ　ｒ ＡＴＰおよび１％グリセロ−１し＋１μｇの一本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質で希 釈（１，：１）ｆ、た。この反応を室温において５分間インキユヘーションして 、結合性タンパク質が一本鎖ＤＮＡ鋳型を被覆するようにした。ＤＮＡポリメラ ーゼ■ホ０酵素（大１１ＪＫ菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）、１．７　ｕ　ｌ　ノ５０Ｕ ？＄ｅ、）を添加し、そしてこの反応を３０°Ｃにおいて３０分間インキユヘー ションした。

Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼを添加しく０．５μｌ、２ウニイス（Ｗｅｉｓｓ）単位） そしてこの反応を３０°Ｃにおいてさらに５分間インキエヘーンヨンした。

この混合物を使用して大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）を突然変異させ、そして適切に 突然変異したクローンを制限消化のパターンにより選択した。

本発明の突然変異誘発法に有用ないくつかの新しい高いコピーの突然変異誘発ベ クターを開発しまた。

１系列のプラスミドベクターは、クロランフェニコール耐性を提供する抗生物質 耐性マーカーおよびそれをアンピシリン怒受性とする突然変異を含有するアンピ シリン耐性遺伝子を含有する。それらは複製のｆｌおよびＣｏ１Ｅｌ起点、およ びβ−ガラクトソダーゼ遺伝子の中に挿入されたポリリンカーを含有する。この 系列はｐＢＢｓ９２゜ｐＢＢｓ９９．　ｐＢＢｓｌｏｏ　、　ｐＢＢｓｌｏｌお よびｐＢＢＳ１２２（すべては第５図に示されている）、およびｐＢＢＳ８９　 （第６図に示されている）を包含する。

真核生物の発現／′突突然変異誘発ダクター、また、提供される。

これらは、同様に、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）宿主の中のｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然 変異誘発および選択が容易であるように、複製のｆｌおよびＣｏ１Ｅｌ起点、ア ンピノリンおよびクロランフェニコール耐性マーカーを含有する。

それらは、また、ポリリンカーを含有し、このポリリンカーは種々ノ補乳動吻ノ ー７’ｔｆｆ−Ｅ−９−１例えば、ＭＰＳＶ　（ｐＢＢｓ８２．　ｐＢＢＳ８３ ）、ＳＶ４０前期プロモーター（ｐＢＢｓ１２１）、あるいはポリリンカーの中 にりローニングされたペプチドをエンコードする標的配列の哺乳動物細胞の中の 発現のためのヒトメタロチオ翠インＩＩ　ａ　（ｐＢＢｓ１０６）プロモーター により推進するクローニングされた標的配列の発現を提供するように位置する。

すべては、また、ＳＶ４０後期ポリＡ付加配列およびサイトメガロウィルス（Ｃ ＩＶ）のエンハンサ−を含有する。これらは第７図〜第９圀に示されている。ベ クターｐＢＢＳ８２およびｐＢＢｓ１２１において、ＤＩＩＦＲの発現は弱いＳ Ｖ４０後期プロモーターによりコントロールされて、内因性ＤＨＦＲ活性を欠如 する細胞系（例えば、ＣＨＯＤＸＩＩ）の中の増幅の増加を可能とする。　ＤＩ ＩＰＲの発現はｐＢＢｓ８３およびｐＢＢｓ１０６において強いＳＶ４０前期プ ロモーターによりコントロールされて、内因性ＤＨＦＲ活性を事実含有する細胞 系の中の増幅を可能とする。

バキュロウィルスの突然変異誘発／発現ヘクターが、また、提供される（第１０ 図）、これらのベクターは、同様に、復製のＣｏ１Ｅｌおよびｆ１起点、アンピ シリンおよびクロランフェニコール耐性マーカー、ポリリンカーを含有し、この ポリリンカーはポリへドリンプロモーターにより推進されるクローニングされた 標的配列の発現を提供するように位置する。

第５図〜第１０図に示すベクターの任意の中でアンピシリンおよびクロランフェ ニコール耐性遺伝子を感受性から耐性に変化させるか、あるいはその逆に変化さ せるために使用できるオリゴヌクレオチドは、第５図に示されている。

第５図〜第１０図に示す突然変異誘発ベクターの構成を、それらの構成において 使用したプラスミド、ファージ、ライブラリーなどと一緒に、下に詳述する。突 然変異誘発ベクターの構成についての概略は、第１２図および第１３図に記載さ れている。それらの構成に関する追加の情報は、次の米国特許または同時係属米 国特許出１ｔｌ（これろを引用によってここに加える）に記載されている。

米国特許第４．８７０，００６号 米国特許第４，９６０．７０２号 米国特許第５，０１７，４７８号 米国特許第５，０４３，３４１号 米国特許第５．０８２，７７５号 米国特許出願第７８９７８７号、１９９１年１１月８日提出米国特許出願第７０ ００２８号、１９９１年５月１４日提出米国特許出願第８５９６３３号、１９９ ２年３月２０日提出米国特許出願第３４５３７２号、１９８９年４月２８日提出 米国特許出願第７３０９７５号、１９９１年７月２９日提出米国特許出願第４０ ６９４１号、１９８９年９月１３日提出米国特許出願第５０６３２５号、１９９ ０年４月９日提出米匡特許出願第５６８４５６号、１９９０年８月１５８捷出米 国特許出願第７２４３２７号、１９９１年７月１日提出当業者にとって容易に明 らかなように、発表された配列から、商業的売上から、または他の源からである かどうかにかかわらず、複製起点、マーカーの配列、ポリＡ付加配列、エンハン サ−、ポリリンカーまたは広くかつ容易に入手可能な他の特徴を使用して、ある 数の方法でこれらのベクターあるいは機能的に同一または類似のベクターを構成 することができる。

″′然゛　逢　ブースミドの　において　するプラスミドおよびファージ■Ｅ員 社２：すべてのＣＯＤ表示は下に列挙するオリゴヌクレオチドを意味する。

下に列挙しかつ特記しないすべてのプラスミド、ライブラリーおよびファージま たはウィルスのＤＩｉＡ　は、この分野においてよく知られており、そして、例 えば、売上、例えば、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ストラタジーン（ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　、−Ｚニー　・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｉ ＩＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）などから広く入手可能である。

一ム゛　ローン　πｖｘ、　４１４を使用する組換えにより単離された組織プラ スミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）のゲノムのシグナル配列を含有するマニア チス（門ａｎｉａｔｉｓ）　ヒトゲノムライブラリー。

−、ｔｈ久旦虹」［ラムダファージンヤロン（Ｃｈａｒｏｎ）　２７のＢａｍＨ ｉ部位の中に挿入された成！！ｔｐＡのためのコーディング配列を含有するボウ ウェス（Ｂｏｗｅｓ）　黒色腫細胞系（ＣＨＬ−１）から作られたｃＤＮＡから のＢｇｌ　ＩＩｌ断片 ｇ　ｐＵｃ９のＰｓｔ　１部位の中に挿入された成ｐ　ｔｐａのアミノ酸７−１ ４５のためのコーディング配列を含有するボウウェス黒色腫細胞系（ＣＨＬ−１ ）から作られたｃＤＮＡからのＰｓｔ　ｌ断片、　ｔｐａのコーディング配列は Ｌａｃプロモーターと同一方向に向いている。

１［ｌｐ３１−Ｂｇｌ　ＩＩのＢｇｌ　１１部位の中に挿入された成熟ｔｐ＾の ためのコーディング配列を含有するｐＷＨＡ７２のＸｈｏ　Ｕ断片。ｔＰＡのコ ーディング配列は、コーディング配列の中のＮａｒ　ｎ部位がベクターの中のＢ ａｍＨＴから約２３００ｂｐに存在するような向きをもつ。

飢り蔓ｐ３１−Ｂｇｌ　ＩＩのＢａｍＨｒ　−Ｂｇｌ　１１部位の中に挿入され た成熟ｔＰＡのためのコーディング配列を含有するｐＷＨＡ７２のＸｈｏ　１１ 断片。ｔｐへのコーディング配列は、生ずる独特Ｂｇｉ　ｎ部位が成Ｆ！　ｔＰ ＡのＮ末端に存在するような向きをもつ。

カ功月匝二Ｉ工ｐＵｃ１８のＨｉｎｄ［［ｌ　−Ｐｓｔ　１部位の中に挿入され たＳＶ４０プロモーターを含有するｐＬｌ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）からのＨｉ ｎｄｌ［［−Ｐｓｔ　ｌ断片。

６上　Ｎｔｕｒｅ　２４２　二６８４に記載されているように修飾したｐＣＤ２ ゜修飾はｐＣＤ２のＰｓｔ　ｌ　−ＢａｍＨ１部位の中へのポリリンカー５’　 −ｔｇｃａｇｔｃｔａｇａｃｃｃｇｇｇａａｔｔｃｇｇｇｃｃｃｇｇａｔｃ　− ３’の付加である（Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　？　：　２７４５を参照のこと）。

Ｊ　Ｃ０Ｄ２１６８およびＣ０Ｄ２１６９を使用すルｐＭＰｓＶ−ＥＨ−Ｃ！’ ＩＶ　ｆ７）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）からのＢｇｌ　Ｕ　−Ａｐａ　ｌ 断片であり、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ｌｌ５Ｋ＋　（Ｓｔｒａｔａｇｅ ｎｅ）のＢａｍＨ［−Ａｐａ　１部位の中に挿入されたＣＭＶエンハンサ−を通 してＭＰＳＶプロモーターを含有する。

これはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの中にＭＰＳＶ−ポリリンカー−ＳＶ４０ポリＡ 　ＣＭＶＥＨ−ＣＭＶを含有するｐＢＢｓ３２からＳｓｐ　Ｉ　−Ｒｓｒ　ＩＩ ｌ断片これは、安定なりローンのためのベクターとして使用できる、ＭＰＳＶプ ロモーター、ＳＶ４０ポリＡおよびＣＭＶエンハンサ−を含有するプラスミドを つくる。

姐鯰共　ｐｓＬ１１１３０のＡｆｔ　ｆＪ−リｃｏ　１部位の中に挿入され１こ 、複製のＳＶ４０起点（ｏｒｉ）、エンハンサ−およびＳＶ４０後期プロモータ ーを含をするｐＴＨＲ４７０からのＡｆｌ　ＩＩ　−Ｎｅｏ　ｌ断片。

匹閃釘ＭＰＳＶプロモーターおよび訪Ｖエンハンサ−を使用しかつＳＶ４０後期 プロモーターにより推進されるＤＩ（Ｆｉｔ発現を存する哺乳動物の発現ベクタ ーを作るように、ｐＢＢＳ３３のＰｖｕ　ＩＩ　−ＢｓｔＸ　Ｉの中に挿入され たＳＶ４０後期プロモーターを含有するｐＢＢＳ３６からのＭｓｃ　ｒ　−Ｂｓ ｔｘ■断片。このプラスミドは、また、ヒグロマイシンＢ遺伝子を含有する。

閃閃ＵｐＵｃ１９のＳｅａ　Ｔ　ＥｃｏＲＩ部位の中に挿入されたｆｌ　ｏｒｉ を含有するｐＷＨＡ１８７からのＳｃａ　Ｉ　−ＥｃｏＲｌ断片。

姐腔皿ｐＢＢｓ５７の５ｎａＢ　１部位の中に挿入されたクロランフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（Ｃ，ＩＴ）遺伝子の大部分を含有する１４ＨＡ１ ３のＢｓａＡＩ　Ｓｃａ　ｌ断片。ＣＡＴ遺伝子は、アンピンリン耐性（Ａｍｐ ）遺伝子と反対の方向に同いている。扛メこれはｐＢＢ５５８の反対の向きであ り、そしてｐＢＢｓ５８は２〜３倍低いコピー数を有する。

用腔並ｐＷＨＡ１４８のＳｔｕ　ｌ−ＢａｍＨ１部位の中に挿入されたプロマイ シン耐性耐性遺伝子を含有するｐＢＳｐａｃｄｐのＰｖｕ　Ｕ　−ＢａｍＨ［断 片。

Ｊ　β−ガラクトシダーゼプロモーターおよびアルファ相補性コーディング配列 を欠失するためのｐＢＢｓ５９のＰｖｕ　ＩＩ　（部分的）−Ｆｓｐ　Ｔ　（部 分的）の欠失。これは、ｆｌ　ｏｒｉ、　ＣＡＴ遺伝子、Ａｍｐ遺伝子およびＣ ｏ１Ｅ１　ｏｒｉを含有するプラスミドを残す。

皿且皿ＭＰＳＶプロモーターを使用し、３つの選択可能なマーカー（ＰＡＣ，Ｄ ＨＦＲおよびＨｙｇＢ）を有し、ＤＨＦＲ遺伝子を発現するＳＶ４０後期プロモ ーターを有し、５Ｖ４０ｏｒｉ、　ＣＡＴおよびＡｍｐの遺伝子、およびｆｌｏ ｒｉを存する、哺乳動物の発現ベクターを作るために、ＰＴＨＲ５５１のＫｐｎ 　Ｉ　−５ｐｅ　ｎ部位の中に挿入されたＭＰＳＶプロモーターを含有する、ｐ ＢＢｓ３２のＫｐｎ　Ｉ　Ｓｐｅ　ｌ断片。ｔｌ：ＡｐａＴ部位の制限地図は独 特χｃＩＩ＋１部位に接近する。

匹嬰皿ＭＰＳＶプロモーターを使用し、３つの選択可能なマーカー（ＰＡＣ，Ｄ ＨＰＲ，ＨｙｇＢ）を有し、Ｉ））ＩＦＩ？遺伝子の発現を推進するＳＶ４０前 記プロモーターを有し、２つの５Ｖ４０ｏｒｉ　を有し、ＣＡＴおよびＡｍｐの 遺伝子を含有し、そしてｆｌ　ｏｒｉを有する、哺乳動物の発現ベクターを作る ために、ｐＢＢｓ６９ｔ７）ＢｓｔＸ　ｒ　−Ｋｐｎ　１部位の中に挿入された ＳＶ４０前期プロモーターおよびＤＨＦＲ遺伝子のＮ末端を含有するｐＴＨＲ５ ２７がらのＢｓｔＸ　Ｉ　−Ｋｐｎ　ｌ断片。

飢且ユＡｍｐ″およびＣＡＴ遺伝子を含有する新規な「高いコピー数の」突然変 異誘発ベクターを作るために、ｐＢＢｓ５９の”　ＩＩ　ＡＩｗＮ■部位の中に 挿入されたＡｍｐ’遺伝子を含有するｐＴｌ（Ｒ８７のＡａｔＩＩ−ＡＩｗＮ　 ｌ断片。

姐並録Ｃ０Ｄ１６３２をｉｎνｉ　ｔｒｏ突然変異誘発において使用して、ｐＢ ＢＳ６９の中でＡｍｐ’をＡｍｐ”に変換し、またＸｃｍ　１部位をつくった・ このプラスミドは現在哺乳動物の突然変異誘発／発現ヘクターであり、このベク ターはＭＰＳＶプロモーターを使用し、３つの選択可能なマーカー（ＰＡＣ，Ｄ ＨＦＲ，）ｌｙｇＢ）を有し、ＤＨＦＲ遺伝子の発現を推進するＳＶ４０後期プ ロモーターおよび５Ｖ４０ｏｒｉ　を有し、ＣＡＴおよびＡｍｐ’の遺伝子、お よびｆｌ　ｏｒｉを有する。注：Ａｐａ１部位の制限地図は独特Ｘｃａ　１部位 に接近する。

関閃顕Ｃ０Ｄ１６３２をｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発において使用して、ｐＢ Ｂｓ７０の中でＡｍｐゝをＡｍｐ’に変換し、またＸｃ曹　■部位をつくった。

このプラスミドは現在哺乳動物の突然変異誘発／発現ヘクターであり、このベク ターはＭＰＳＶプロモーターを使用し、３つの選択可能なマーカー（ＰＡＣ，Ｄ ＨＦＩ？、　ＨｙｇＢ）を有し、ＤＨＰＲ遺伝子の発現を推進するＳＶ４０後期 プロモーターおよび５Ｖ４０ｏｒｉ　を存し、ＣＡＴおよびＡｍｐ’の遺伝子、 およびｆｌ　ｏｒｉを有する。注：Ａｐａ１部位の制限地図は独特Ｘｃｍ　１部 位に接近する。

餅閃皿Ｃ０Ｄ１９４１を使用してＣＡＴ遺伝子の中のＥｃｏＲ１部位を破壊し、 そしてｐＢＢｓ７２のｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発によりクロランフェニコー ル耐性を感受性に（すなわち、Ｃｌ１ｌをＣｌ１１１に）変換した。これは、ま た、Ｆｓｐ　１部位をつくった。

匹閃仮Ｃ０Ｄ１９４０を使用してｐＢＢＳ８９のｉｎ　ｖｉｔｒｏによりＣｎ” をＣ１１″に変換した。これは、また、Ａｖａ　１部位をつくった。また、Ｃ０ Ｄ１６３２を使用してＡ＋ａｐ’をＡｍｐ”に変換した。これはＸｃｍ　１部位 をつくった。

ｌ■錬３　ＭＰＳＶプロモーターおよびＣＭＶエンハンサ−を含有するｐＢＢｓ ３２からのＰｖｕ　ｌ断片をｐＢＢｓ９８のＰｖｕ　Ｉ部位の中に挿入して、哺 乳動物の発現／突然変異誘発プラスミドを作った。

飢竪氾５Ｖ４０ｏｒｉを含有するｐＢＢｓ　１のＳｐｈ　Ｉ　Ｘｈｏ　Ｔ断片を 、ｐＷｌ（Ａ１４８のＳｐｈ　Ｉ　Ｓａｌ　Ｉの中に挿入した。

■可剥５Ｖ４０ｏｒｉを含有するｐＢＢｓ９４のＢａｍＨＩ　−Ｂｇｌ　ｌ断片 を、ｐＢＢＳ９３のＢｇｌ　Ｕ部位の中に挿入した。この断片は、Ｂｓ５ＨＩＩ で消化したとき、２４４４．１６１５．１１０３．５７８および５１ｂｐの断片 が得られるような向きをもつ。これはｐＢＢＳ９６の反対の向きである。このプ ラスミドは、ＭＰＳＶプロモー　９−９−１ＣＩ　７ハ７サー、５Ｖ４０ｏｒｉ 　、Ｃｍ”およびＡｍｐ”の遺伝子、およびｆｌ　ｏｒｉを含有する哺乳動物の 発現／突然変異誘発ベクターである。

ｕ郵９６　ｐＢＢＳ９３　（７）　Ｂｇ　Ｉ　ＩＴ　（７）中に挿入された５Ｖ ４０ｏｒｉを含有するｐＢＢＳ９４からのＢａｍＨ［−Ｂｇｌ　Ｉ［断片。この 断片は、ａｓｓ）Ｉ　ＩＩで消化したとき、２６７５．　］、３８４．１１０３ ．５７８および５１ｂｐの断片が得られるような向きをもつ。これはｐＢＢＳ９ ５の反対の向きである。

飢ハｙｐＢＢＳ９３のＢｇｌ　１１部位の中に挿入されたＰＡＣ遺伝子を含有す るｐＢＢｓ６０のＢａＩＩＨＴ　−Ｂｇｌ　ＩＩｌ断片この断片は、ＰＡＣ遺伝 子力＜ＭＰＳＶ−ＬＴＲと反対の向きであるような向きをもつ。これはｐＢＢ５ ９８の反対の向きである。このプラスミドは、ＭＰＳジブロモ−ター、ＣＭＶエ ンハンサ−１ＰＡＣ遺伝子、５Ｖ４０ｏｒｉ　、Ｃｍ”およびＡｍｐ’の遺伝子 、およびｆｌ　ｏｒｉを含有する哺乳動物の発現／突然変異誘発ベクターである 。

Ｊ　ｐＢＢＳ９３のＢｇｌ　Ｕ部位の中に挿入されたＰＡＣ遺伝子を含有するｐ ｓｓｓｓｏのＢａ＋ｍＨＩ　−Ｂｇｌ　ＩＩｌ断片コノ断片は、ＰＡＣ遺伝子力 ＜ｎｐｓｖ−ＬＴＲと同一の向きであるような向きをもつ。これはｐＢＢＳ９７ の反対の向きである。

ｐＢＢＳ９９　Ｃａｔ’遺伝子、ｆｌ　ｏｒｉ、八ａ　ｐ　ｌ遺伝子、およびｐ Ｕｃ８ポリリンカーを含むｐＵｃ８からのβ−ガラクトシダーゼのアルファ相補 性基を含有する新規な突然変異誘発ベクターを作るために、Ｃａｔ’遺伝子、ｆ ｌ　ｏｒｉ、およびｐＬＩｃ８のＦｓｐ　１部位の中に挿入されたＡ鋼ｐ３遺伝 子の部分を含有するｐＢＢＳ９２からのＦｓｐ　ｌ断片。このプラスミドはｐＵ ｃ８と置換すべきである。

飢肢ｕＬＣａｔ’遺伝子、ｆｌ　ｏｒｉ、Ａｍｐ’遺伝子、およびｐＵＣ９ポリ リンカーを含むｐＵｃ９からのβ−ガラクトシダーゼのアルファ相補性基を含有 する新規な突然変異誘発ベクターを作るために、Ｃａｔゝ遺伝子、ｆｌ　ｏｒｉ 、およびｐＵＣ９のＦｓｐ　１部位の中に挿入されたＡｍｐ’遺伝子の部分を含 有するｐＢＢｓ９２からのＦｓｐ　ｌ断片。このプラスミドはρＵＣ９と置換す べきである。

姐閃則［Ｃａｔ’遺伝子、ｆｌ　ｏｒｉ、Ａｍｐ’遺伝子、およびｐｌＪｃ１８ ポリリンカーを含むｐＵｃｌＢからのβ−ガラクトシダーゼのアルファ相補性基 を含有する新規な突然変異誘発ベクターを作るために、Ｃａ　ｔ’遺伝子、ｆｌ 　ｏｒｉ、およびｐＵｃｌＢのＦｓｐ　１部位の中に挿入されたＡｎ＋ｐ’遺伝 子の部分を含有するｐＢＢｓ９２からのＦｓｐ　Ｔ断片。このプラスミドはｐ［ Ｉｃ１８と置換すべきである。注：　ｐＢＢｓ９２が既にｐＵｃ１９のための代 替物であるので、ｐ［Ｉｃ１９との置換を行わなかった。

戸猥５月榎−Ｃａｔ’遺伝子、ｆｌ　ｏｒｉ、Ａｍｐ’遺伝子、およびｐＢＩｕ ｅｓｃｒｉｐｔ　［Ｉ　ＳＫ＋ポリリンカーを含むｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｉ Ｉ　ＳＫ＋からのβ−ガラクトシダーゼのアルファ相補性基を含有する新規な突 然変異誘発ベクターを作るために、Ｃａｔ’遺伝子、ｆｌ　ｏｒｉ、およびｐＢ Ｉｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ±（Ｓ　ｔｒａ　ｔａｇｅｎｅ）のＦｓｐ　Ｔ 部位の中に挿入されたＡｍｐ’遺伝子の部分を含有するｐＢＢＳ９２からのＦｓ ｐ　Ｔ断片。このプラスミドはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋と置換す べきである。

餅ｕ廷ＬＸｈｏ　１部位を欠失するためのｐＢＢｓ１０３のＰｍｌ　Ｉ欠失はポ リリンカーの外側である。

飢閃斥ＬｐＢＢｓ８２ノＢｓｔＸＩ　−Ｘｈｏ　１部位の中に挿入されたＳＶ４ ０前期７’　Ｏモー　９−を含有するｐＴＨＲ５００から（７）ＢｓｔＸ　Ｉ　 −Ｘｈｏ　ｌ断片。

飢ハ肥ＬＣＩＩ＋”遺伝子、ｆｌ　ｏｒｉ、Ａｍｐ’遺伝子、およびｐＷＨＡ１ ４８ポリリンカーを含むｐＷＨＡ１４８からのβ−ガラクトシダーゼのアルファ 相補性基を含有する新規な突然変異誘発ベクターを作るために、ＣＩＷＲ遺伝子 、ｆｌ　ｏｒｉ、およびｐＷＨＡ１４８のＢｇｌ　１部位の中に挿入されたＡｍ ｐ’遺伝子の部分を含有するｐＢＢＳ９２からのＢｇｌ　Ｔ断片。

飢ｕ■Ｌｐ　Ｖ　Ｌ　１３９２　（７）　Ｂ　ｇ　Ｉ　１部位の中に挿入すした Ａｍｐ”　遺伝子、ＣＩｏ＊遺伝子およびｆｌ　ｏｒｉを含有するｐＢＢｓ９２ からのＢｇｌ　ｌ断片。これはバキュロウィルスの突然変異誘発ベクターをつく る。

ｐＢＢｓ１２５　バキュロウィルスの突然変異誘発ベクターをつくるために、Ａ ｌ１ｐ’遺伝子、ＣＩｍ″遺伝子、およびｐＶＬ１３９２のＢｇｌ　１部位の中 に挿入されたｆｌ　ｏｒｉを含有するｐＢＢｓ９２からのＢｇｌ　ｌ断片。

匹並１３５　Ｃ０Ｄ２５８８をｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発において使用して 、ｐＢＢｓｌｏｏのポリリンカーの中の１塩基の挿入をつくって、異なるリーデ ィングフレームを生成した。また、Ｃ０Ｄ１９４］　を使用してＣｍ”をＣｍ” に変換した。これはＢｓｐＨＴ部位をつくった。また、ＣＯ［１１６３３を使用 してＡｍｐ”をＡｍｐ’に変換した。これはＦｓｐ　１部位をつくった。

匹且旦ＬＣＯＤ２６０６を使用して、ｐＢＢＳ８２のｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異 誘発により、Ａ■ｐ遺伝子とＰＡＣ遺伝子の間のポリリンカーを欠失した。

これはＥｃｏＲ１部位を破壊した。また、Ｃ０Ｄ２６０７を使用して第１ポリリ ンカーを欠失させた。これは旧ｎｄＩ［Ｉ部位およびＰｓｔ　Ｉ部位を破壊した 。また、Ｃ０Ｄ２６０９を使用してＰＡＣ遺伝子の中のＳａｔ　１部位を破壊し た。また、Ｃ０Ｄ２６１０を使用してＤＨＰＲ遺伝子から上流の旧ｎｄ１１１部 位を破壊した。また、Ｃ０Ｄ１９４１を使用してＣＩＩＲをＣｔａ”に変換した 。

これはＢｓｐＨＩ部位をつくった。また、Ｃ０Ｄ２４６１を使用してＡｍｐ’を Ａｌｌ１ｐ’に変換した。これはＦｓｐ　１部位をつくった。

ｑ　Ｃ０Ｄ２６０６を使用して、ｐＢＢｓ８２のｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発 により、Ａｓｐ遺伝子とＰＡＣ遺伝子の間のポリリンカーを欠失した。

これはＥｃｏＲ１部位を破壊した。また、Ｃ０Ｄ２６０７を使用して第１ポリリ ンカーを欠失した。これはＨｉｎｄｎ１部位およびＰｓｔ　１部位を破壊した。

また、Ｃ０Ｄ２６０９を使用してＰＡＣ遺伝子の中のＳａｌ　１部位を破壊した 。また、Ｃ０Ｄ２６１０を使用してＤ）ＩＦＲ遺伝子から上流の旧ｎｄＩ１１部 位を破壊した。また、Ｃ０Ｄ１９４１を使用してＣｍ”をＣ１１′に変換した。

これはＢｓｐＨ１部位をつ（った、また、Ｃ０Ｄ２４６１を使用してＡｍｐ″を Ａｍｐ’に変換した。これはＦｓｐ　１部位をつくった。

■釦匹並　このプラスミドはプロマイシン耐性遺伝子を含有し、そしてＧｅｎｅ 　６２　：　１２１−１２６に記載されている。

匹■Ｌ　「後期」の向きにＢＫＶエンハンサ−を含有するｐＪＡＭｌからのＸｈ ｏ　Ｉ　Ｓａｌ　ｌ断片を、「後期」の配列がアデノウィルス２の主要な後期の プロモーターと同一の向きにあるように、ｐ９１０２３　（Ｂ　）のＸｈｏ　１ 部位の中に挿入した。

劇グヱυ、７　ＳＶ４０プロモーターを含有するｐ３Ｍ１０５−４８からの旧ｎ ｄＩ［［−Ｋｐｎ　ｌ断片を、ｐｃＤＶＩ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の旧ｎｄｍ −Ｋｐｎ　１部位の中に挿入した。

旺理旦８　ＧＯ［）１１２０およびＣ０Ｄ１１２Ｌをアニーリングし、そしてｐ ＥＸＰ１１７のＸｂａ　１部位の中に挿入した。オリゴの向きは、再びつくられ たＸｂａ　１部位がＫｐｎ　Ｉ及びＢｇｌ　１１部位よりＳＶ４０プロモーター に近いような向きである。これはＳＶ４０プロモーターを使用する哺乳動物の発 現ヘクターをつくる。

匹旦ｔＰＡのゲノムのシグナル配列を含有するラムダクローン１６からのＢｇｌ 　Ｉ［を、ｐ３１−６３のＢｇｌ　Ｉｎ部位の中に挿入した。シグナル配列の向 きは、それがｔＰＡの分泌を指令するような向きである。

Ｐ几　Ｃ０Ｄ１１９８およびＣ０Ｄ１］、９９をアニーリングし、そしてｐＵｃ １９のＢａＩＩＨＩ　−Ｋｐｎ　１部位の中に挿入して、合成）１ｙｐｏＡ　シ グナル配列を含有するプラスミドを作った。

餅ＹＩＯＩ　６ＥＧＦを含有するｐＵｃ１９ｐｃｒＴＭ　−７からの３ａｍＨｌ 断片をｐＨＹｌのＢｇｌ　ｎ部位の中に挿入して、ＨｙｐｏＡ　シグナルおよび ６ＥＧＦを含有するｆｕｓｉｏコーディング配列を作った。

ＺＶＸ工４１４　ｔＰＡのためのコーディング配列を含有するｐ２Ｇ５からのＰ ｓｔ　ｌ断片を、πνＸのＰｓｔ　１部位の中に挿入した。

且門Ｌ　野生型ＢＫエンハンサ−を含有するｐＢＫＬ４４Ｘ１８６がらのＸｈ。

ｒ　−ＢａｍＨｌ断片（Ｓｕｒｅｓｈ　５ｕｂｒａｎ＋ａｎｉ研究所〜ラジヨラ ・カリフォルニア州、から入手した）を、ｐＷＨＡ１４８のＸｈｏ　Ｉ　−Ｂｇ ｌ　ＩＩの中に挿入した。

ＭＰＳＶ−ＥＨ−ＣＭＶ　Ｓｃｈｅｒｉｎｇ　ＡＧ（ヘルリン）のＨａｒａｌｄ 　Ｄｉｎｔｅｒがら入手した。Ｐｅｔｒａ　Ａｒｔｅｌｔの学位論文（’　１９ ８８）　（Ｈａｎｓｊｏｒｇ　Ｈａｕｓｅｒ研究所、細胞生物学および遺伝学課 、ＧＢＦ−Ｇｅｓｅｌｌｓｈａｆｔ　ｆｕｒＢｒｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃｓｈ ｅ　Ｆｏｒｓｃｈｎｇ　ｍｂＨ，Ｄ−３０００ブアウンシユベイグ、ドイツ国） に記載されている。親プラスミドｐＭＰｓＶ−ＥＨ（ＣＭＶを含まない）エンハ ンサ−は、Ｇｅｎｅ　６８　：　２１３−２１９に記載されている。

堕並邸ｔＰＡの発現が三重ＬＴＲプロモーターにより推進されるように、ｐＮＥ Ｏ５のＢｇｌ　１７の中に挿入されたゲノムｔＰＡ　シグナルおよび成熟ｔＰＡ のｃＤＮＡコーディング配列を含有するｐＶＡｃ１２がらのＢｃｌ　Ｉ−Ｂｇｌ 　Ｉｆｌ断片 此旦０２　ｐＰＡＯＯ３をＢｃｌ　ＩおよびＸｈｏ　Ｉで切断し、クレノーでフ ィルインし、そして再結合した。

吐１皿　ゲノムｔＰＡ　シグナル配列を含有するρＰＡＯＯ３がらのＣ１ａ　Ｉ −Ｂｇｌ　ＩＩｌ断片、ｔＰＡシグナル配列の発現がＳν４ｏプロモーターから 発現されかつそのプロモーターとシグナルとの間にｐｃＤイン、トロンを含有す るように、ρＥＸＰ１１８のＡｓｕ　Ｉ［−Ｂｇｌ　Ｉｎ部位の中に挿入した。

ｆ社超Ｃ０Ｄ１３５４およびＣ０Ｄ１３５５をアニーリングし、Ｒａｎｔ目およ びＢｇｌ　ＩＩで断片し、そしてｐＰＡ１２９のＢｇｌ　［部位の中に挿入した 。この断片の向きは、独特の再構成されたＢｇｌ　ｍ部位がＳＶ４０プロモータ ーの中にクローニングされるような向きである。

Ｊ　ｐＨＭｌ＋２７２を旧ｎｄＩ［［で切断し、クレノーでフィルインし、Ｂａ ｍ１（Ｉリンカ−に結合し、次いでＢａｍＨＩで切断した。ヒグロマインンＢ遺 伝子を含有する３ａｎ＋Ｈｌ断片を、ｐＰＡ１０２のＢａｍＨ１部位の中に結合 した。ヒグコマイ／ンＢ遺伝子のコーディング配列の向きは、ｔＰＡコーディン グ配列の向きと反対である。

１劉５０９　ＤＨＦＲ発現カセットを含有するｐＳＣ６６２からのＣ１ａ　ｌ断 片を、ｐＰＡ５０２の非メチル化Ｃ１ａ　１部位の中に挿入した。ＤＨＦＲ遺伝 子のコーディング配列の向きは、ｔＰＡ遺伝子に対して反対であった。

ｐＰＡ５１０　ＤＨＰＲ発現カノセトを含有するｐＰＡ５０９からのＣ１ａ　ｌ 断片を、ｐＰＡ５０９の非メチル化Ｃ１ａ　１部位の中に挿入し戻した。ＤＨＦ Ｒ遺伝子の向きはｔＰＡ遺伝子の向きと同一である。

ｐｓｃ６１４　ＳＶ４０プロモーターを含有するＳＶ４０の）Ｉｐａ　ＩＩ　− ＨｌｎｄＩ［ｌ断片をｐｓＶ２００−ｄｈｆｒのＣ１ａ　ｌ　Ｈｉｎｄｌ［１部 位の中に挿入して、ＩＩＨＦＲ遺伝子の発現がＳＶ４０前期プロモーターにより 推進されかつＳシイ０ポリＡ配列を使用する哺乳動物の発現プラスミドを作った 。注：このプラスミドは従来ｐｓＶ２０１−ｄｈｆｒと呼ばれた。

閃並旦　Ｃｏｔ）３３９およびＣ０Ｄ３４０をアニーリングし、そしてｐＵｃ１ ８のＢａＩＩＩＨＩの中に挿入した。向きは新しいＣ１ａ　１部位が新しいポリ リンカーのＥｃｏＲｎ部位とＢａｍ８１部位との間に位置するような向きである 。

凹考　Ｃ０Ｄ３３９およびＣＯ［１３４０をアニーリングし、そしてｐＵｃ１８ のＢａｍＨ［の中に挿入した。向きは新しいＣ１ａ　ｎ部位が新しいポリリンカ ーの旧ｎｄｌ［ｎ部位とＢａｍｔ１１部位との間に位置するような向きである。

関並旦ＳＶ４０プロモーター、ＤＩ（ＰＲココ−ィング配列およびＳｔ／４０ポ リＡ配列を含有するｐｓｃ６１４のＰｖｕ　ＩＩ　ＢａｍＨＩ断片を、ｐＢＲ３ ２７のＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨ１部位の中に挿入した。

閃並録ＳＶ４０プロモーター、ＤＨＦＲコーディング配列およびＳＶ４０ポリＡ 配列を含有するｐｓｃ６６１のＥｃｏＲＩ　−８ａｍ）ｌ　ｌ断片をｐＳＣ６５ ２のＥｃｏＲｌ−ＢａｌｌＨｌ部位の中に挿入して、Ｃ１ａ　ｌ断片上にＤＨＦ Ｒ発現カッセトを含有するプラスミドを作った。

関虹皿　Ｃ０Ｄ１３５４およびｃｏＤ１３５５をアニーリングし、そしてｐｓｃ ６５１のＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄ　ｍ部位の中に挿入した。

ハ旺■ｐＶＬ１３９３をＢｇｌ　Ｈで切断し、フィルインし、そして再結合して Ｃ１ａ　１部位をつくった。

関市■ｈＶｐ０Ａ　シグナル配列を含有するｐＨＹｌがらのＢａＩＩＨＩ　Ｅｃ ｏＲｌ　１１ＺＰｓｃ７１４のＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲ１部位の中に挿入して、 ポリへドロンプロモーターおよびｈｙｐｏＡ　シグナル配列を使用するバキュロ ウィルスの発現プラスミドを作った。

戚買皿並す　プロモーターを含まないＤ　ＨＰ　Ｒコーディング配列を含有する ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ　（Ｐａｕｌ　Ｂｅｒｇがら入手した）からの旧ｎｄ　Ｉ［ ［−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＢＲ３２８のＨ４ｎｄｌｌｌ　−ＢａＩＩＨ１部位の 中に挿入した。

旺旺ＬｔＰＡ　シグナル配列を含有するｐＰＡ１３３（７）Ｘｈｏ　Ｉ　−Ｎｏ ｔ　ｒ　ｔＦｒ片ヲ、ｐＣＤＭ８のＸｈｏ　Ｉ　Ｎｏｔ　１部位の中に挿入した 。このプラスミドはｔＰＡシグナル配列を含有し、そして一時的トランスフェク ションのために適当である。

旺肥し　合成０連鎖ドメインを結合してをもつトロンボモヅリンの６ＥＧＦ領域 を含有するＰＣＲ１２７断片のＢａｍＨＩ　／　Ｎｏｔ　Ｉ消化物を、ｐＢｌｕ ｅｓｃｒｉｐｔ　ＵＳＫ＋　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍ１ｌ　Ｉ　−Ｎ ｏｔ　１部位の中に挿入した。ＰＣＲ断片をまずＣ０Ｄ１０３４およびＣＯ［１ １５０５を使用して獲得し、そしてｐＴＭｌ、５およびｐＴＭ３０１をＡｐａ　 ■で消化し、次いで結合することによって、鋳型１１ＮＡを調製した。注：　Ｔ ＴＧＣＧＣＧＣＣＡであったであろうＢｓ５）Ｉ　１１部位の配列は実際にはＴ ＴＧＣｇｃＧＣＧＣＣＡである。こうして、第６ＥＧＦの最後の部分＋０連鎮Ｆ ′メインはリーディングフレームの外の存在する。

虹廿ｎ’）ロンポモヅリンの６ＥＧＦ（＋）を含有するｐＴＴａ２０５Ｂａ舗Ｈ Ｉ−ＢｇｌＩＩ断片を、ｐＴＨＲ５のＢｇｌ　１１部位の中に挿入した。このプ ラスミドは、一時的および安定なトランスフェクションのために適当なプラスミ ドの中に、ｔＰＡ　シグナル配列、次いでトロンボモヅリンの６ＥＧＦを含有す る。

ｄ胆貝ｆｌ　ｏｒｉを含有するｐｃ２１−２．３　ｋｂのＡｓｅ　Ｉ　−３ｃａ 　Ｉ（ｐＥ？ＩＢＬ８＋の中にＴＧＦｂｅｔａ２を含有するプラスミド）を、ｐ ＴＭＨＹｌｏｌのＮｄｅ　Ｉ　−３ｃａ　１部位の中に挿入して、６ＥＧＦを発 現するｆｌｏｒｉを含有するバキュロウィルスの発現プラスミドを作った。

肛■ｎｐｓｃ７１６（７）Ｂｇｌ　Ｉｆ　−Ｎｏｔ　１部位の中に挿入されり６ ＥＧＦを含有するｐＴＩＩＲ９のＢａｄ　Ｉ　−Ｎｏｔ　ｌ断片＋０連鎖ドメイ ン、注二二のプラスミドは、０連鎖ドメインをリーディングフレームの中から外 に出すＢ５５８２部位の中に挿入された余分のＧＣを存する。

ｄ旺旺Ｃ０Ｄ１５７３をｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発のために使用して、ｐＴ ＨＲ１４の中のトロンポモヅリンの−ｅｔ３８Ｂを変換した。

ｆｉ？１製のｆ１起点および両者のＡｍｐ’遺伝子およびＴｅｔ”遺伝子を含有 するバキュロウィルスの発現プラスミドを作るために、ｐＴＨＲ１４のＮｄｅ　 Ｉ　−５ｃａ　１部位の中に挿入されたＴｅｔ”遺伝子およびＡｍｐ’遺伝子の 一部分を含有するｐｌＪｃ９ｔｅｔからのＡｓｅ　Ｉ　Ｓｃａ　ｌ断片。

ｉ肱刊　ｐＴＨＲ２３をＮｄｅ　ＩおよびＦ３ｓｓＨＩ［で切断し、そして再結 合した。これはｐＴ）ｌＲ２３の０連鎖領域を６ＥＧＦをもつフレームの中から 外に出すＢｇｌ　■部位内のＧＣを欠失し、こうしてリーディングフレームを補 正した。

Ｊ？ＵＬ！！ｕｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発のおいてＧＯＤ１６３２を使用し て、ｐＴＩＩＩ１７７のＡｓｐ遺伝子の中でフレームシフトの突然変異を引き起 こし、そしてシグナル切断部位のｎ−１位置をプロリンに変化させた。これは新 規な突然変異誘発ベクターをつくった。このベクターはＧＯＤ１６３３を他のプ ライマーと組み合わせて使用するとき、陽性の選択（アンピシリン耐性）を有す る。

ｆｉ　６ＥＧＦをＡｍｐ　シグナル配列のコントロール下にするために、ｐＫＴ ２７９のＡｓｎ　［Ｐｓｔ　１部位の中に挿入された６ＥＧＦのすべてを含有す る９７Ｍ３０１からのＮｄｅ　ｌ　−Ｐｓｔ　Ｉ　（部分的）断片。

且韮販Ｌａ＋ｅＬ２８８→Ｉｅｕの突然変異をもつ６ＥＧＦ　−Ｑ連鎖バキュロ ウィルスの発現プラスミドを作るために、ｐＴＨＲ７８のＢａｍＨＩ　−Ｎｈｅ 　Ｉ部位の中に挿入されたＭｅｔ３８８→Ｌｅｕの突然変異を含有するｐＴＨＲ ２８のＢａｍＨＩ　−Ｎｈｅ　ｌ断片。

１川ｕ虹ｎ　ｅ　ｔ　２８８−１　ｅ　ｕの突然変異を含有するｐｕｃの中で６ ＥＧＦ断片を作るために、ｐＴ）１１１３０１のＭｌｕ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩ部 位の中に挿入されたｓ＋ｅｔ３８Ｅｌ→ｌｅｕの突然変異を含有するｐＴＨＲ２ ８のＭｌｕ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩｌ断片姐用用Ｌｉ　ｎ　ｖ　ｉ　ｔ　ｒ　ｏ突 然変異誘発のために使用することができる大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）６ＥＧＦ発 現プラスミドを作るために、ｐｓＥＬＥｃＴｌ　（ＴＭ）のＥｃｏＲＶ−Ｂａｍ Ｈ１部位の中に挿入された６ＥＧＦを含有するｐＴＦＩＲ１２１からのＥｃｏＲ Ｖ−Ｂｇｌ　ＩＩｌ断片 ｉ用■ＬｐＴＨＲ１６１のＳｃａ　Ｉ　−５ａｃ　１部位の中に挿入された複製 のｆ１起点を含有するｐＧＥＭ３ｚｆ−からのＳａｃ　Ｉ　−３ｃａ　ｌ断片。

これはｐＴＨＲ１６１と反対の鎖を使用する新規な突然変異誘発ベクターである 。

パル２１９　６ＥＧＦ−０連鎖を発現しかつｉｎνｉ　ｔｒｏ突然変異誘発にお いて使用することができる大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）の発現ベクターを作るため に、ｐＴ）ｌＲ１６１のＭｌｕ　Ｉ　−Ｎｏｔ　Ｉ部位の中に挿入されたＯ連鎖 領域およびｍｅｔ３８８”ｌｅｕ突然変異を含有するｐＴｌｌＲ１２７からの旧 ｕｌ−Ｎｏｔｌ。

ヒ用翌ＬｐＴＨＲ２１９におけるのと反対の向きでｆｌ　ｏｒｉを含有するｐＴ ）１１＋２１１のＭｌｕ　Ｉ　Ｎｏｔ　１部位の中に挿入された６ＥＧＦ−０連 鎖を含有するｐＴＨＩｉ２１９のＭｌｕ　Ｉ　−Ｎｏｔ　ｌ断片。この新規なプ ラスミドは、トロンボモヅリンの０連鎖および６ＥＧＦｉＪ域のｉｎ　ｖｉｔｒ ｏ突然変異誘発のためのものである。

姐ｕ邦Ｌｐｔｌｃ１９の）ｆｉｎｄ　Ｉ１１部位の中にクローニングされた約６ ．８ｋｂのＨｉｎｄ　ｌＩ［断片。この断片はヒト染色体２０フアージラムダラ イブラリー（ＡＴＣＣ５７７１２）から得られ、そして全長の７Ｍ遺伝子を含有 する。

この断片は本来ラムダファージ７Ａ−１の中で検出された。この断片をｐＴｌｌ Ｒ２８３と反対の向きにクローニングする。配列決定シこおし１て、トロンホモ プリン遺伝子の向きはβ−ガラクトンダーゼ遺伝子と反対の向きであることが示 された。

止ＵＲ釘す−ｐｓＥＬＥｃＴｌ　（ＴＭ）のＨｉｎｄＩＩ［部位の中にクローニ ングされた全長のトロンホモプリン遺伝子を含有するｐＴＨＲ２８２のＨｉｎｄ ｌｎ断片。

この断片は、トロンホモプリン遺伝子がβ−ガラクトシダーゼ遺イ云子と反対の 向きであるような向きをもつ。

ｇ　ＤＮＦＬトロンボモヅリンを発現する）＼キュロウイルレスの発現プラスミ ドを作るために、ｐＴＨＲ１２７のＢａｔｍＨＴ　−Ｎｈｅ　１部位の中に挿入 されたトロンホモプリン遺伝子のアミン末端領域を含有するｐＴ）ｌＲ２９３か らのＢａｍＨＩ　−Ｎｈｅ　ｌ断片。

ΣｒＨＲη３−トロンポモヅリンｍｅ　ｔ３８８→ｌｅｕを発現するＣ０５Ｉ発 現フ。

ラスミドを作るために、ｐＴＨＩ１１３のＮａｒ　Ｉ　−Ｎｏｔ　Ｉ部位の中Ｇ こ挿入さレタトロンホモプリンを含有するｐＴ）ｌＲ１３０のＮａｒ　Ｉ　−Ｎ ｏｔ　Ｉｓ１目退」Ｊ−ｐｓＥＬＥｃＴｌ　（ＴＭ）のＢａｍ８１部位の中に挿 入された組織プラスミノゲンアクチヘータ−（ｔＰＡ）を含有するρＰＡ５１０ からのＢａｍＨｌ断片。このｔＰＡ遺伝子はＡｍｐ’遺伝子と反対の向きに向（ Ｘでし）る。

肛ｕ井シｐＷＨＡ１４８のＢｓ５ＨＵ　−Ｃ１ａ　Ｉ部位の中に挿入されたｐＴ ＨＲ３０５からの５′−非翻訳の１５塩基をもつ全体のＤＮＦＬコープインク″ 配列を含有するＣ１ａ　ｌ　−ＢｓｓＨＩｌ　（部分的）断片。

Ｆ聞ユ刀じ−ｐＷＨＡ１４ＢのＢｓ５ｆｌ　ＩＩ　−Ａｃｃ　Ｉ部位の中に挿入 されたｐＴＩＩＲ３０５からの５′−非翻訳の１５塩基をもつ全体のＤＮＦＬコ ープインク゛配列を含有するＣ１ａ　Ｉ　−ＢｓｓＨ■（部分的）断片。

ｑ　Ｃ０５Ｉ細胞の中のＤＮＦＬの発現のためのｐｌｉｃｃＭＶのＨ４ｎｄｌ［ ［−Ｎｏｔ　１部位の中に挿入された［１ＮＦＬ　トロンホモプリン遺伝子を含 有するｐＴＨＲ３２２からの旧ｎｄｌ［［−Ｎｏｔ　ｌ断片。

姐用刹ＬｐｓＥＬＥｃＴ１　（門）のＢａｄ１部位の中に挿入されたｔＰＡ遺伝 子を含有するｐＰＡ５１０からのＢａｗｌ　Ｔ断片。このｔＰＡ遺伝子はＡａ＋ ｐ’遺伝子と同一の向きをもつ。

１Ｕ沢↓υ−ｐＴＩ（Ｒ３２４のＢａｍ４７　［１１−Ｎｏｔ　１部位の中に挿 入された６ＥＧＦ−〇連鎖およびｍｅｔ３Ｅｉ８→ｌｅｕ突然変異を含有するｐ Ｔ）ｌＲ２３５からのＢａｍ４７　ｍ　−Ｎｏｔ　ｌ断片。これにより、ｍｅ　 ｔ３８Ｂ−１ｅｕ突然変異をもつＤＮＦＬを含有するＣ０５Ｉ発現ヘクターが得 られる。

ヒ用ｕシρＷＨＡ１８７の旧ｎｃＩ［部位の中に挿入されたｔＰＡ遺伝子を含有 するｐＴ）ｌＲＥ３１６からの旧ｎｃＩＩ断片。Ｈ４ｎｃ　ＩＩｌ断片向きは、 Ａｍｐ遺伝子が活性であるような向きである。

東ヒ且アシ−ｐＴＨＲ３３０のＥｃｏＲＩの欠失。

ｄ用旦ｇ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発においてＣ０Ｄ１７９５を使用して、 ｐＴＨＲ３３３の中のｔＰＡ遺伝子のＣ末端から下流のＮｏｔ　１部位をつくっ た。注：　ｐＴＨＲ３３３（およびｐＴＨ１１３４８）は全体ｔＰＡ遺伝子を含 有しない。

また、Ｃ０Ｄ１７７２を使用してＴｅｔ″をＴｅ−に変換した。これはＢａ謡Ｈ １部位をつくった。

虹■並ＬｐＴＨＲ３２５のＳｔｕ　［−Ｘｈｏ　１部位の中に挿入されたｔＰＡ のＣ末端の後に、Ｎｏｔ　Ｉ部位を含有するｐＴＨＩ１３４ＢからのＳｔｕ　Ｉ −Ｘｈｏ　ｌ断片。

飢肚用ＬｔＰＡ遺伝子の直ぐ下流に１ｏｏｔ　Ｔ部位を有するｐＰＡ５０９の同 等体を作るために、ｐＰＡ５０９のＳｐｅ　Ｉ　−Ｘｈｏ　１部位の中に挿入さ れたＮｏｔ　Ｉ部位を含有するｐＴＩＩＲ３５０からのＳｐｅ　Ｉ　−Ｘｈｏ　 ｌ断片。

旺■■Ｌ　Ｏ連鎖領域を含有するｐＴＨＲ２３５からの）ｊａｒ　Ｉ　−Ｎｏｔ 　１断片を、ｐＴＨＲ３１２のＮａｒ　Ｉ　−Ｎｏｔ　Ｉベクター断片に結合し た。次いで結合反応物をＳｐｅ　Ｉ　−Ｎｏｔ　Ｉで切断し、そしてＯ連鎖領域 を含有する断片をｐＴＨ１ｉ３５３のＳｐｅ　Ｉ　−Ｎｏｔ　１部位の中に結合 して、三重ｌｔｒプロモーターにより６２ＧＦ　−０連鎖を発現する哺乳動物の 発現ベクターを作った。

且ｕ亜Ｌ　ＣＭＶプロモーターによりＤＮＦＬ遺伝子を発現する哺乳動物の発現 ベクターを作るために、ｐＴＨＲ３５３のＰｖｕ　ＩＩ　Ｎｏｔ　１部位の中に 挿入されたＤＮＦＬ遺伝子およびＣＭＶプロモーターを含有するｐＴＨＲ３２９ （Ｃｏｓｔ発現プラスミド）のＮｒｕ　Ｉ　Ｎｏｔ　ｌ断片。

ｉ工邦刀＝ｐＴＨＲ３２２のＥｃｏＲシーＡａｔ　ＩＩの中へのＥｃｏＲＩ部位 を含有するｐＵｃ９のＳｗａ　Ｉ　−Ａａｔ　ＩＩｌ断片これはＥｃｏＲＩカノ セト上にＤＮＦＬ遺伝子をもつプラスミドをつくる。

ｇ　全体の）ＩｙｇＢ遺伝子および複製起点を含有するｐＴＨＲ３５９の断片の 中に挿入された三重１ｔｒを含有するｐＰＡ５０９のＰｖｕ　ｌ断片。

これは、三重ＬＴＲプロモーターおよびトロンボモヅリンシグナル配列によりＤ 　Ｎ　Ｆ　Ｌを発現する新規なプラスミドを作る。二のベクターは、安定なりロ ーンを作るために、そしてＣＯ３細胞の中の一時的発現のために使用することが できる。

虹肚ｒＬｐＥＸＰ６　（７）ＥｃｏＲ１部位の中ニＤＮＦＬ遺伝子を含有すルｐ ＴＨＲ３７１からのＥｃｏＲｌ断片。ＤＮＦＬ遺伝子は、その発現がアデノウィ ルス２の主要な後期プロモーターにより推進されるような向きを有する。

ト旺刹［主要な後期プロモーター、ＢＫＶエンハンサ−５３部分のリーダー、お よび両者のＶＡＩおよびＶＡＩＴをもつＤＮＦＬ遺伝子を発現する哺乳動物の発 現ベクターを作るために、ｐＴＩＩＲ３５８のｐｖｕ　ＩＩ−にｐｎ　１部位の 中に挿入されたアデノウィルス２の主要な後期プロモーターおよびＤＮＦＬ遺伝 子を含有するＩ）ＴＨ１？３７７のεｃｏＲシーＫｐｎ　ｌ断片。

−Ｌを含むｐＴｌ（１１３２９からのＳｍａ　Ｉ　−Ｋｐｎ　ｌフラグメント。

ｉ…邦ＬｐＴＨＲ３２１のＥｃｏＲＩ　−Ｎｈｅ　１部位の中に挿入されたＤＮ ＦＬＯ前端を含有するｐＴＨＲ３９９からのＥｃｏＲＩ　−Ｎｈｅ　ｌ断片。次 いで混合したプラスミドの集団をＥｃｏＲｌ−Ｈｌｎｄｎ［で切断し、そして［ ］ＮＦＬを含有する断片をｐＭＰＳＶ−εＨ−ＣＭＶ　（Ｈａｒａｌｄ　Ｄｉｎ ｔｅｒ、シエリング、から入手した）のＥｃｏＲＩ　−ｔｌｉｎｄ　ｍ部位の中 に挿入した。

正帥且り辺−ｐＴＨＲ３７５のＰｖｕ　ＩＩの欠失、３ＬＴＩｌそれは６ＥＧＦ の大部分の切断、第６ＥＧＦおよび０連鎖領域を残した。

ＮＭｉ！ＬＤＮＦＬ遺伝子の発現がＳＶ４０前期プロモーターにより推進されか つＤＦＩＦＩ？の発現がＳＶ４０後期プロモーターにより推進される発現プラス ミドを作るために、ｐＴ）ｌＲ３５９の旧ｎｄＩ［［部位の中に挿入されたＳＶ ４０プロモーターを含有するｐＴＨＲ３５９からの）ＩｉｎｄＩ［ｌ断片。

旺韮弧ＬｐＢＢＳ３２の旧ｎｄ　ｍ　ＥｃｏＲ１部位の中に挿入されたＤＮＦＬ を含有するｐＴＨＲ４３８からのＨｉｎｄ　［［［ＥｃｏＲＩ。これはｐＢＩｕ ｅｓｃｒｉｐＬ　Ｕ　ＳＫ＋の中ニＭＰＳＶ−ＥＨ−ＣＭＶおよびＤＮＦＬカノ セトをつくる。

姐■邦ＬｐＴＨＲ４６９のＰｖｕ　Ｉｆ　−ＰｐｕＭ　１部位の中に挿入された 一ｐｓｖ−ＥＨ−Ｃ１ＩＶおよびＤＮＦＬカッセトを含有するｐＴＨ１？４８２ のＳｓｐ　Ｉ　−Ｒｓｒ　ＩＩｌ断片これは哺乳動物細胞の中のＤＮＦＬの安定 な発現のためのプラスミドをつくる。

姐■ｕＬＣＯＤ２２１８を使用して、ベクターｐＴＨＲ２３５の中の１ｎｖｉけ ０突然変異誘発により、ａｒｇ４５６をｇｌｙにそしてｈｉｓ４５７をｇｌｎに 変換した。これはＭｓｃ　１部位をつくった。また、Ｃ０Ｄ１８８６を使用して ５ｅｒ４７４をａｌｓに変換して、０連鎖ドメインの中の潜在的ＧＡＧ部位を排 除した。これはＮａｒ　Ｉ部位をつくった。また、Ｃ０Ｄ１６８９を使用してＡ ｍｐ’をＡｍｐ’に変換した。これはＰｓｔ　１部位をつくった。これはＣＨＯ 細胞の中の切断されないであろうＤＮＦＬ分子をつくる。

４μ３８　ＭＰＳＶプロモーター−ＣＭＶエンハンサ−を使用してＤＮＦＬを発 現しかつＳＶ４０後期プロモーターを発現したＤＨＦｌｉ’を有する哺乳動物の 発現プラスミドを作るために、ｐＢＢＳ３７のＸｂａ　Ｉ　−５ａｌ　１部位の 中に挿入されたｐＮＦＬ遺伝子を含有するｐ　Ｔ　＋１　ＩｔからのＸｂａ　Ｉ 　−５ａｌ　ｌ断片。このプラスミドは、また、ヒグロマインンＢ遺伝子を含有 する。

ｉ胆ハ四ｐＴ）ｌＲ４７０のＡｇｅ　Ｉ　−Ｅｓｐ　１部位の中に挿入されたＤ ＮＦＬおよびＣＭＶエンハンサ−領域の一部分を含有するｐＴＨＲ４８３のＡｇ ｅ　１−Ｅｓｐ　ｌ断片。これは、ＤＮＦＬ領域の発現がＳＶ４０前期プロモー ターにより推進され、（、ＩＶエンハンサ−領域がＤＮＦＩ、コーディング領域 の後に位置するプラスミドをつくる。

旺ｕ娃Ｌｐ　ＬＩ　Ｃ１８ｏ　ｒ　ｉを含有する以外、ｐＴＩＩＲ４８３と同一 である哺乳動物の発現プラスミドを作るために、ｐＨｃ１８のＦｓｐ　Ｉ　−Ｐ ｖｕ　１１部位の中に挿入されたＤＮＦＬ遺伝子を含有するｐＴ）ｌＲ４８３か らのＦｓｐ　ｌ断片。これは大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）の中のより高いプラスミ ドのコピー数を生ずるであろう。

ｐ、Ｔｌ１Ｒ５５０ｐＢＢｓ６１の５ｎａＢ　Ｉ　−Ｆｓｐ　１部位の中にＤＮ ＦＬ遺伝子を含有するｐＴＨＲ４９ＢからのＦｓｐ　ｌ断片。この断片はＡｍｐ 遺伝子が完全であるような向きをもつ。このプラスミドはアンピシリン耐性、ク ロランフェニコール耐性であり、そしてｆｌｏｒｉを含有する。

唾５ｉｐＴ）ｌＲ５５０のＢａｍＨ１部位の中に挿入されたＰＡＣ遺伝子を含有 するｐＢＢｓ６０からのＢａｍＨｆ　−Ｂｇｌ　ＩＩｌ断片ＰＡＣ遺伝子はＤＨ ＰＲ遺伝子と同一・の方向の向きをもつ。Ａｐａ　［部位の制限地図は独特Ｘｃ ｍ　１部位に近接する。

亡＋１４　ＣＯ［１１１２７，Ｃ０Ｄ１１２８．　Ｃ０Ｄ１１２９．　Ｃ０Ｄ１ １３０．　Ｃ０Ｄ１１３１をアニーリングし、そしてｐｔＪｃ１８のＥｃｏＲＩ 　−Ｈｉｎｄ　ｎ１部位の中に挿入した。

註肚、２　ｃＯＤ１２４６およびＣ０ｒ１１２４７をアニーリングし、そしてｐ Ｈｃ１８の旧ｎｄ　ｍ　−ＥｃｏＲ１部位の中に挿入し７た。

ヒ１１．４　ｐＴＭｌ、２のＢｓ５ＨＩｆ　−５ａｃ　１１部位の中に挿入され たトロンホモプリンコーディング配列を含有するｐＴＭｌ、　１からのＢｓ５Ｈ ＩＩ　−５ａｃ　ＩＩｌ断片 ｉ坦」ｐＴｌｌ、４のＢｓ５ＨＩＩ−旧ｎｄＩ［［部位の中に挿入されたトロン ホモプリンコーディング配列を含有する９７Ｍ３．０−１．９からのＢｓ５ＨＩ Ｉ　−）１ｉｎｄ　ｌＩ［断片。注：配列の分析において、Ｂｓ５Ｈ［１部位が 余分のｇｃを含有し、その配列をｇｃｇｃｇｃｇｃとするこが示された。

酊１Ｌ史１１．９　Ｃ０Ｄ１１６９．　Ｃ０Ｄ１１７０．　Ｃ０Ｄ１１７１．　 Ｃ０Ｄ１１７２．　Ｃ０Ｄ１１７３をアニーリングし、そしてｐＵｃ１８のＥｃ ｏＲＩ　−Ｈｌｎｄｌ［［部位の中に挿入した。

〆す１卯、ＰＣＲプライマーとしてＣ０Ｄ１０３４およびＣ０Ｄ１４１１を使用 して発生させ、ｐｓｃ７０９のＢａｍＨＴ　−Ｎｏｔ　Ｉ部位の中に挿入された ６６ＧＦを含有するＰＣＲ生成物のＢａｍＨＩ　−Ｎｏｔ　ｌ断片。

ト憇■用６ＥＧＦを発現するバキュロウィルスの発現プラスミドを作るために、 ｐＶＬ１３９３　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｓ＋ＨＩ　−ＥｃｏＲＴ部位 の中に挿入された６ＥＧＦに融合したｈｙｐｏＡ　シグナル配列を含有するｐＨ ＹｌｏｌからのＢａｗｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲｌ断片。

１μ度匹コ１−７　プライマーとしてＣ０１１１０３３およびＣ０Ｄ１０３４お よび鋳型としてＣ）（１、−１ゲノムＤＮＡを使用して発生させ、ｐｔｌｃ１９ のＳ層ａ１部位の中に平滑末端クローニングした６ＥＧＦを含有するＰＣＩＩ断 片。

６ＥＧＦコーディング配列は、β−ガラクトシダーゼのプロモーターと反対の向 きである。

ｐＵＣ９ｔｅｔ　ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から入手した。

ＥＶＡＣ１２１）３１−２のＮａｒ　Ｉ部位の中に挿入されたｔＰＡのゲノムの シグナル配列を含有するｐ３１−６３−４４からのＮａｒ　ｌ断片。シグナル配 列はｔＰＡの分泌を指令するような向きをもつ。注：このプラスミドはＢｃＨ− Ｂｇｌ　ＩＩ　（部分的）カノセト上にシグナルおよび成熟配列を含をする。

ｙ（Ａ７０　１１ＬＩＣ１９の旧ｎｄＩ［ｌ　−Ｋｐｎ　１部位の中に挿入され た成熟ｔＰＡのためのコーディング配列を含有するラムダＴＰＡ、１４からの旧 ｎｄＩ［−Ｋｐｎ　Ｉ断片。ｔＰＡからのコーディング配列は、β−ガラクトシ ダーゼのプロモーターと同一の方向の向きをもつ。

ｐＭＡ１２．　ｐＬＩｃ８のＢａｍＨ１部位の中に挿入されたコーディング配列 の成Ｐ　ｔＰＡを含有するｐＷＨＡ７０からのＸｈｏ　ＩＩ断片。ｔＰＡのだめ のコーディング配列は、β−ガラクトシダーゼのプロモーターと反対の方向の向 きをもつ。

バリ２屹　Ｃ０Ｄ３１６およびＣ０Ｄ３１７をアニーリングし、そしてｐＵｃ１ ８のｔｌｉｎｄＩ［［部位の中に挿入した。この断片の同きは、独特５ｔｕ　１ 部位が独特Ｈ４ｎｄＩ［［部位よりＥｃｏＲ１部位に近いような向きである。

止１に月Ｕ−次のオリゴを使用して突然変異誘発したｐｓＥＬＥｃＴｌ　（ＴＭ ）　：Ａｍｐ遺伝子を耐性に突然変異させそしてＰｓｔ　Ｉ部位をつくるために Ｃ０Ｄ１６９０゜Ｔｅｔ遺伝子を感受性に突然変異させそしてＡｃｃ　１部位を つくるためにＣ０Ｄ１７７１゜Ａｍｐ遺伝子のちょうど上流に多数の制限部位（ Ｂｇｌ　ＩＩ部位を含む）を付加するためにＣ０Ｄ１７７８゜Ｔｅｔ遺伝子のち ょうど下流にＢｃ１１部位を付加するためにＣ０Ｄ１７７９゜オリゴヌク−Ｌｚ ｆ−’ＬＬ ２辺ユ註 ＡＡＴｒＣＴＧＣＡＡＣＣＡＧＡ　ＣＴＧＣＣＴＧＴＣＣＣＧＣＧＧＡＣＴＧＣ ＧＡＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＣＡＧＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＡＧＴＧＣＣＣＴＧｋＡ ＧＧＣＴＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＧＧＴＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＧＧＡＣ ＡＴＣＧＡＣΩ對ΣＪ１旦 ＣＣＣＣＡＣＧＡＧ　ＣＣＣＧ　ＣＡＣＡＧＧＴＧ　ＣＣＡＧ　ＣＴＧＴＴＴＴ Ｇ　ＣＡＡＣＣＡＧＡ　ＣＴＧ　ＣＣＴＧＴＣＣＡＧ　ＣＣf Ωα四Ｊ１ユ ＧＡＣＣＡＣＧＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＴにＧＣＡＡＣΩすΣＪコニ ＣＣＡＣＡＣＣＣ（、ＴＣＣＴＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣ ニル１万臣 ＣＡＴＧＣＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＣＴＣＣＴＣｑ匹２ 区匝 ＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴｒＴＣＧＴＣＴｒＣＧＡＴＣＣＡＧＡ　ＣＡＴＧＡＴＡ ＡＧＡＴＡ　Ｃｑ刀と＝」ユ ＣＡＣＣＧＧＴＣＧＴＧＧＣＧＧＣ（：ＣＡＣＧＧＣＣＴＣＣＡＡＡＡＡＧＣＣ ＴＣＣＴＣＡＣ二辺匹ぼ印旦 ＧＣＴＣＧＡＴＧＴＧＧＣＧＧＴＣＡＧＧＧＴＣＣＡＣＴＧＴＡＴＧＧＣＧＴＧ ＴＴＧＣＡＧＧＧＴＡＧＴＣＧＧＣＧＡＡＣＧ本発明を理解を明瞭とする目的で 上に詳細に説明したが、ある種の変更を添付する請求の範囲内で実施することが できることは明らかである。

ＦＩＧ、　７ ポリヘドリン ＦＩＧ、　２ａ ＦＩＧ、　２ｂ ＡＡ２９１のメチオニンを置換するプライマー天然配列 突然変異のプライマー　１５８０ ＰｖｕＩ工 突然変異のプライマー　１５８１ Ｘａｎ工 突然変異のプライマー　１５８２ Ｆｓｐ工Ｓｐｈ工 突然変異のプライマー　１５７３ ＰｖｕＩ工 突然変異のプライマー　１５８３ 突然変異のプライマー　１５８４ Ｓｔｕ工 ＦＩＧ、　４ 突然変異誘発の選択： ＩＶｓ ＦＩＧ、　７ａ ＩＶｓ Ｖ４０ 後期ポワＡ ＦＩＧ、　７ｂ ＦＩＧ、　Ｂ 後期ポ１ノＡ 後期ポリＡ 後期ポリＡ 後期ポリＡ ポリヘトリンプロモーター ＦＩＧ、　１０ａ ポリへドリンプロモーター ０　■ 〜口 フロントページの続き （７２）発明者　バイランダー、ローラ　アール。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４８０５゜リッチモノド、マクロ−リン　 ストリート

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. １．工程： （ａ）一本鎖形態の核酸構成体にオリゴヌクレオチドをアニーリングし、前記オ リゴヌクレオチドは前記核酸構成体の一部分に対して実質的に相補的でありかつ 標的配列内の第１位置におけるヌクレオチドを変化することができかつ前記核酸 構成体の第２位置において制限部位を導入または除去し、これによりアニーリン グされた生成物を形成することができる配列を有し、（ｂ）宿主細胞を前記アニ ーリングされた生成物で形質転換し、そして （ｃ）前記第２位置において導入または除去された制限部位を有する核酸構成体 を含有する前記宿主細胞の子孫を同定する、からなる標的配列を有する核酸構成 体を部位特異的に修飾する方法。
2. ２．前記標的配列がポリペプチドをエンコードする請求項１に記載の方法。
3. ３．ポリペプチドをエンコードする前記標的配列がプロモーターに作用可能に連 鎖されている請求項２に記載の方法。
4. ４．前記標的配列がポリペプチドをエンコードし、そして前記オリゴヌクレオチ ドが前記ポリペプチドのアミノ酸を変化することができそして前記ポリペプチド のアミノ酸を変化しないで前記核酸構成体から制限部位を導入または除去するこ とができる請求項１に記載の方法。
5. ５．前記オリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼで伸長する工程をさらに含む 請求項１に記載の方法。
6. ６．ＤＮＡリガーゼを添加する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
7. ７．前記核酸構成体が、 （ａ）複製のＣｏｌＥ１起点、 （ｂ）複製のＭ１３またはｆ１ファージ起点、および（ｃ）ｌａｃＺ遺伝子内に 位置するポリリンカー、からなる請求項１に記載の方法。
8. ８．前記標的配列がポリベプチドをエンコードし、そして前記標的配列が真核生 物のプロモーターに作用可能に連鎖されており、そして前記核酸構成体がそれを 導入する真核生物の細胞を選択するためのマーカーをさらに含む、請求項１に記 載の方法。
9. ９．前記核酸構成体が【配列があります】またはｐＢＢＳ１４５である請求項１ に記載の方法。
10. １０．工程： （ａ）一本鎖形態の核酸構成体に第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌク レオチドをアニーリングし、前記第１オリゴヌクレオチドは前記核酸構成体の一 部分に対して実質的に相補的でありかつ標的配列内の第１位置におけるヌクレオ チドを変化することができかつ前記核酸構成体上の第２位直において制限部位を 導入または除去することができる配列を有し、そして前記第２オリゴヌクレオチ ドは前記核酸構成体の一部分に対して実質的に相補的でありかつマーカーの活性 を有意に変更する変化をマーカーの配列の中に導入することができる配列を有し 、これによりアニーリングされた生成物を形成し、（ｂ）宿主細胞を前記アニー リングされた生成物で形質転換し、（ｃ）変更されたマーカーの活性を有する前 記形質転換された宿主細胞の子孫をスクリーニングまたは選択し、そして（ｄ） スクリーニングまたは選択しそして導入または除去された制限部位を有する核酸 構成体を含有する子孫を同定する、からなる、標的配列およびマーカーの活性を エンコードするマーカーの配列を有する核酸構成体を部位特異的に修飾する方法 。
11. １１．前記標的配列がポリペプチドをエソコードする請求項１０に記載の方法。
12. １２．ポリペプチドをエンコードする前記標的配列がプロモーターに作用可能に 連鎖されている請求項１１に記載の方法。
13. １３．前記標的配列がポリペプチドをエンコードし、そして前記オリゴヌクレオ チドが前記ポリペプチドのアミノ酸を変化することができそして前記ポリペプチ ドのアミノ酸を変化しないで前記核酸構成体から制限部位を導入または除去する ことができる請求項１０に記載の方法。
14. １４．前記第１および第２のオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼで伸長す る工程をさらに含む請求項１０に記載の方法。
15. １５．ＤＮＡリガーゼを添加する工程をさらに含む請求項１０に記載の方法。
16. １６．前記核酸構成体が、 （ａ）複製のＣｏｌＥ１起点、 （ｂ）複製のＭ１３またはｆ１ファージ起点、および（ｃ）ＩａｃＺ遺伝子内に 位置するポリリンカー、からなる請求項１０に記載の方法。
17. １７．前記標的配列がポリベプチドをエンコードし、そして前記標的配列が真核 生物のプロモーターに作用可能に連鎖されており、そして前記核酸構成体がそれ を導入する真核生物の細胞を選択するためのマーカーをさらに含む、請求項１０ に記載の方法。
18. １８．前記核酸構成体が 【配列があります】またはｐＢＢＳ１４５である請求項１０に記載の方法。
19. １９．工程： （ａ）一本鎖形態の核酸構成体に第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオ チドおよび第３オリゴヌクレオチドをアニーリングし、 前記第１オリゴヌクレオチドは前記核酸構成体の一部分に対して実質的に相補的 でありかつ標的配列内の第１位置におけるヌクレオチドを変化することができか つ前記核酸構成体上の第２位置において制限部位を導入または除去することがで きる配列を有し、前記第２オリゴヌクレオチドは前記核酸構成体の一部分に対し て実質的に相補的でありかつ第１マーカーの活性を有意に変更する変化（変更さ れた第１マーカーの活性）を第１マーカーの配列の中に導入する（突然変異した 第１マーカーの配列）ことができる配列を有し、そして 前記第３オリゴヌクレオチドは前記核酸構成体の一部分に対して実質的に相補的 でありかつ第２マーカーの活性を有意に変更する変化（変更された第２マーカー の活性〕を第２マーカーの配列の中に導入する（突然変異した第２マーカーの配 列）ことができる配列を有し、 これにより次のアニーリングされた生成物を形成し、（ｂ）宿主細胞を前記一次 のアニーリングされた生成物で形質転換し、 （ｃ）変更された第１マーカーの活性を有する形質転換された宿主細胞の子孫を スクリーニングまたは選択し、（ｄ）スクリーニングまたは選択しそして導入ま たは除去された第１制限部位を有する標的核酸構成体（突然変異した核酸構成体 ）を含有する子孫を同定し、 （ｅ）一本鎖形態の突然変異した核酸構成体に第４オリゴヌクレオチド、第５オ リゴヌクレオチドおよび第６オリゴヌクレオチドをアニーリングし、 前記第４オリゴヌクレオチドは前記突然変異した核酸構成体の一部分に対して実 質的に相補的でありかつ前記標的配列のヌクレオチドを変化することができかつ 前記突然変異した核酸構成体から第２制限部位を導入または除去することができ る配列を有し、前記第５オリゴヌクレオチドは前記突然変異した核酸構成体の一 部分に対して実質的に相補的でありかつ第１マーカーの配列および第１マーカー の活性を回復することができる配列を有し、そして前記第６オリゴヌクレオチド は前記突然変異した核酸構成体の一部分に対して実質的に相補的でありかつ第２ マーカーの配列および第２マーカーの活性を回復することができる配列を有し、 これにより二次のアニーリングされた生成物を形成し、（ｆ）宿主細胞を前記二 次のアニーリングされた生成物で形質転換し、 （ｇ）変更された第２マーカーの活性を有する形質転換された宿主細胞の子孫を スクリーニングまたは選択し、そして（ｈ）スクリーニングまたは選択しそして 導入または除去された第２制限部位を有する標的核酸を含有する子孫を同定する 、からなる、標的配列、第１マーカーの活性をエンコードする第１マーカーの配 列、および第２マーカーの活性をエンコードする第２マーカーの配列からなる核 酸構成体の中で複数の変更を実施する方法。
20. ２０．前記標的配列がポリペプチドをエンコードする請求項１９に記載の方法。
21. ２１．ポリペプチドをエンコードする前記標的配列かプロモーターに作用可能に 連鎖されている請求項２０に記載の方法。
22. ２２．前記標的配列がポリベプチドをエンコードし、そして前記第１および第２ のオリゴヌクレオチドの各々が前記ポリペプチドの第１部分のアミノ酸を変化す ることができそして前記ポリペプチドのアミノ酸を変化しないで前記核酸構成体 の第２位置において制限部位を導入または除去することができる請求項１９に記 載の方法。
23. ２３．前記第１、第２および第３のオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼで 伸長する工程をさらに含む請求項１９に記載の方法。
24. ２４．ＤＮＡリガーゼを添加する工程をさらに含む請求項１９に記載の方法。
25. ２５．前記核酸構成体が、 （ａ）複製のＣｏｌＥ１起点、 （ｂ）複製のＭ１３またはｆ１ファージ起点、および（ｃ）ＩａｃＺ遺伝子内に 位置するポリリンカー、からなる請求項１９に記載の方法。
26. ２６．前記標的配列がポリペプチドをエンコードし、そして前記標的配列が真核 生物のプロモーターに作用可能に連鎖されており、そして前記核酸構成体がそれ を導入する真核生物の細胞を選択するためのマーカーをさらに含む、請求項１９ に記載の方法。
27. ２７．前記核酸構成体が【配列があります】またはｐＢＢＳ１４５である請求項 １９に記載の方法。
28. ２８．（ａ）複製起点、標的配列を挿入する制限部位、第１マーカーの活性をエ ンコードする第１マーカーの配列、および第２マーカーの活性をエンコードする 第２マーカーの配列からなる核酸構成体、（ｂ）第１オリゴヌクレオチド、前記 第１オリゴヌクレオチドは前記核酸構成体の一部分に対して実質的に相補的であ りかつ前記第１マーカーの活性を有意に変更する変化（変更された第１マーカー の活性）を第１マーカーの配列の中に導入する（突然変異した第１マーカーの配 列）ことができる配列を有する、および（ｃ）第２オリゴヌクレオチド、前記第 ２オリゴヌクレオチドは前記核酸構成体の一部分に対して実質的に相補的であり かつ前記第２マーカーの活性を有意に変更する変化（変更された第２マーカーの 活性）を第２マーカーの配列の中に導入する（突然変異した第２マーカーの配列 ）ことができる配列を有する、からなる、標的核酸の中で１または２以上の変更 を実施するためのキット。
29. ２９．さらに、 （ａ）ＤＮＡポリメラーゼ、 （ｂ）デオキシリポヌクレオチド、 （ｃ）前記ＤＮＡポリメラーゼの活性に適当な緩衝液、を含む請求項２８に記載 のキット。
30. ３０．前記核酸構成体の前記複製起点がＣｏｌＥ１であり、前記制限部位かｌａ ｃＺ遺伝子内に位置するポリリンカーであり、そして前記核酸構成体が複製のＭ １３またはｆ１ファージ起点をさらに含む、請求項２８に記載のキット。
31. ３１．前記核酸構成体が【配列があります】またはｐＢＢＳ１４５である請求項 ３０に記載のキット。
32. ３２．さらに、 （ａ）第３オリゴヌクレオチド、前記第３オリゴヌクレオチドは前記核酸構成体 の一部分に対して実質的に相補的でありかつ前記第１マーカーの配列および前記 第１マーカーの活性を回復することができる配列を有する、および （ｂ）第４オリゴヌクレオチド、前記第４オリゴヌクレオチドは前記核酸構成体 の一部分に対して実質的に相補的でありかつ第２マーカーの配列および第２マー カーの活性を回復することができる配列を有する、を含む、請求項２８に記載の キット。
33. ３３．（ａ）複製のＣｏｌＥ１起点、標的配列を挿入するためのｌａｃＺ遺伝子 内のポリリンカー、第１マーカーの活性をエンコードする第１マーカーの配列、 および第２マーカーの活性をエンコードする第２マーカーの配列からなる核酸構 成体、 （ｂ）第１オリゴヌクレオチド、前記第１オリゴヌクレオチドは前記核酸構成体 の一部分に対して実質的に相補的でありかつ前記第１マーカーの活性を有意に変 更する変化（変更された第１マーカーの活性）を第１マーカーの配列の中に導入 する（突然変異した第１マーカーの配列）ことができる配列を有する、（ｃ）第 ２オリゴヌクレオチド、前記第２オリゴヌクレオチドは前記核酸構成体の一部分 に対して実質的に相補的でありかつ前記第２マーカーの活性を有意に変更する変 化（変更された第２マーカーの活性）を第２マーカーの配列の中に導入する（突 然変異した第２マーカーの配列）ことができる配列を有する、（ｄ）第３オリゴ ヌクレオチド、前記第３オリゴヌクレオチドは前記核酸構成体の一部分に対して 実質的に相補的でありかつ前記第１マーカーの配列および前記第１マーカーの活 性を回復することができる配列を有する、 （ｅ〕第４オリゴヌクレオチド、前記第４オリゴヌクレオチドは前記核酸構成体 の一部分に対して実質的に相補的でありかつ第２マーカーの配列および第２マー カーの活性を回復することができる配列を有する、 （ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ、 （ｇ）デオキシリポヌクレオチド、および（ｈ）前記ＤＮＡポリメラーゼの活性 に適当な緩衝液、を含む請求項２８に記載のキット。
34. ３４．前記核酸構成体が【配列があります】またはｐＢＢＳ１４５である請求項 ３３に記載のキット。