JP2000078992A - 組換えヒト胎盤性リボヌクレア―ゼインヒビタ―およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 RNAの分解を触媒する酵素リボヌクレアーゼ
(RNase)を特異的に阻害するヒト胎盤から単離されるた
んぱく質であるPRIを得る方法を提供すること。 【解決手段】 活性形態ヒト胎盤リボヌクレアーゼイン
ヒビターをコードするcDNAの細胞内での発現により細胞
内に産生された不溶性混入体を可溶化及び再生して、活
性形態ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターにする方
法であって、以下の工程を含む方法： (a)不溶性の不活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビ
ターを、該細胞から、第１緩衝液を用いて単離する工
程； (b) 不活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを可
溶化する工程であって、不溶性の不活性ヒト胎盤リボヌ
クレアーゼインヒビターを、約４Ｍ以上の濃度の尿素を
含む第２緩衝液と合わせることを含む工程；及び (c) ヒトリボヌクレアーゼインヒビターを、第３緩衝液
により希釈することにより活性化する工程。

Description

【発明の詳細な説明】

【発明の属する技術分野】本発明は組換えDNA技術に関
する。特に組換えヒト胎盤性リボヌクレアーゼインヒビ
ターをコードするcDNA遺伝子配列、この遺伝子を含むベ
クターおよび該cDNA遺伝子を含む宿主の作成に関する。

【０００２】

【従来の技術】組換えDNA技術の発展を通じて基本的に
どの生物由来のDNA配列も異種宿主において増殖するた
めのプラスミドまたはウイルスベクターに簡単にクロー
ン化できるようになった。この形状にして該DNAの配
列、構造、コード容量またはその他の性質を研究し得
る。またこれはサンプル中の相補配列の検出、修正型の
遺伝子産物の生成、新しい生物への挿入による生物機能
の調節など種々の用途に使用し得る。組換えDNA（rDN
A）技術の出現は抗体プローブを用いた相補DNA（cDNA）
のコード配列の単離も可能にした。ヤング(Young)、R.
A. およびR. W. デービス(Davis)、Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A., 80., 1194-1198(1983)。このシステムはど
の生物のDNA由来のポリペプチド上の抗原決定基（エピ
トープ）でも最も良く検出し得る特性を有する。このシ
ステムを用いてゲノムまたはcDNA配列をうまく単離する
にはcDNAライブラリーおよび適当な性質をもつ抗体プロ
ーブの両方が必要である。ミエレンドルフ(Mierendor
f)、ロバート(Robert) C. 等、“抗体による〔ラムダ〕
gt11ライブラリーのスクリーニングによる遺伝子の単
離”分子クローニング技術ガイド(Guide to Molecular
Cloning Techniques), 152, 458-469(1987)。 この技術
を使用して特定のたんぱく質をコードする遺伝子を単離
し、これに対する抗体を作る。しかし、この技術を用い
た遺伝子の単離は決して保証されない。たとえば、求め
られている構築物が宿主細胞、一般には大腸菌を殺して
しまうことが分る場合がある。また特に大腸菌内で合成
されるときたんぱく質に炭水化物が付加している場合、
主に目的たんぱく質の炭水化物部分に対する抗体が生成
することによりその遺伝子の単離が困難になる場合もあ
る。このような場合、この抗体は検出に使用できない。
さらに複雑なことにはイムノスクリーニングフィルター
上の弱い陽性体の出現がある。この弱陽性体は免疫たん
ぱく質調製物中の混入物に対する抗体により認識される
たんぱく質である。この弱陽性体は目的のたんぱく質と
免疫原性を共有する別のたんぱく質であることもある。

【０００３】目的たんぱく質がクローン化されたという
確信は大腸菌内で合成された組換えたんぱく質の活性に
依存する。しかし、これは多くの真核性たんぱく質が大
腸菌中では不正な折りたたみ型、不溶型および不活性型
として合成されることから不可能なことがよくある。ヘ
ス(Hoess), A. 等、“イオン交換樹脂を用いた全細菌溶
菌物からの可溶性で生物学的活性のある組換えたんぱく
質の回収”、Biotechnology, 6, 1214-1217 (1988)。不
活性不溶性たんぱく質は可溶化され、かつ活性な形に再
生され得る場合がある。しかし活性型たんぱく質の効率
的回収に必要な条件の決定には再生プロセスに影響し得
る多くのパラメーターを至適化する実験が必要である。
マーストン(Marston), F. A. O.“大腸菌内で発現され
る真核性ポリペプチドの精製”、DNAクローニング、第I
II巻、実際的方法、第４章、D. M. グローバー(Glover)
編、IRLプレス版、1987およびここに引用されている参
考文献参照。このように特定のたんぱく質をコードする
クローン化遺伝子のテストは実験を始めるまでは予測で
きない多くの因子に依存する。

【０００４】一般にcDNAクローン、すなわちたんぱく質
に対するRNAの情報に相当する二本鎖DNAの単離は第１に
目的たんぱく質の十分な精製およびウサギのような適当
な動物での該たんぱく質に対する抗体の発現に関すると
考えられている。次のステップはその抗体を免疫プロー
ブとして使用しそのようなたんぱく質が発現されている
組織のcDNAライブラリーをスクリーニングすることであ
る。cDNAライブラリーは通常バクテリオファージラムダ
ベクターで構築され、特に抗体プローブがスクリーニン
グに使用可能な時はバクテリオファージベクターラムダ
gt11で構築される。これはラムダgt11が発現ベクターで
あるためで、融合たんぱく質が大腸菌ベータガラクトシ
ダーゼ、天然の大腸菌酵素およびcDNA挿入物由来のたん
ぱく質の間で形成されることを意味する。ジェンドリサ
ク(Jendrisak)、ジエリー(Jerry)等(1987) “〔ラムダ〕
gt10および〔ラムダ〕gt11へのcDNAのクローニング”、
「分子クローニング技術ガイド」(Guide to Molecular
Cloning Techniques), 152, 359-371(1987)。RNAのDNAコ
ピー型として存在する目的たんぱく質の遺伝子もラムダ
gt11中大腸菌プロモーターのコントロール下に存在す
る。

【０００５】目的たんぱく質をコードする組換えバクテ
リオファージを大腸菌に感染したとき、いくらかの組換
え融合たんぱく質が産生され、そのバクテリオファージ
のプラーク中細胞溶解により細胞から放出される。この
たんぱく質をニトロセルロースフィルターに取り上げ、
目的たんぱく質に対する抗体でそのたんぱく質を検出す
る。このスクリーニング操作を外来遺伝子をもつ均一な
ファージプラークが得られるまで反復する。それからこ
の遺伝子をゲノム中のDNAとは独立に複製し得る小さな
環状DNAであるプラスミドにサブクローニングし発現さ
せる。この方法をヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビタ
ー（PRI）に応用した。ブラックバーン(Blackburn)、ピ
ーター(Peter)等、“ヒト胎盤由来のリボヌクレアーゼ
インヒビター”、The Journal of Biological Chemistr
y, 252/16, 5904-5910(1977)。 ブラックバーン(Blackb
urn)等は可溶性PRIの調製法を公開した。ここではイオ
ン交換およびアフィニティークロマトグラフィーを組合
せて4000倍に精製された。PRIは分子量約50,000の酸性
たんぱく質であることが分った。

【０００６】天然のPRIはRNAの分解を触媒する酵素リボ
ヌクレアーゼ(RNase)を特異的に阻害するヒト胎盤から
単離されるたんぱく質である。それは巾広いRNaseにし
っかりと結合することにより機能し、RNAの保護に強いR
Nase阻害が必要とされる場所で非常に有効である。PRI
は研究での応用やその他の用途に非常に期待されるたん
ぱく質である。このたんぱく質の生理学的役割はまた明
確ではないが最近のデータはこのたんぱく質の生体内で
の役割は血管発育の調節であるらしいことを示してい
る。シャピロ(Shapiro)、ロバート(Robert)およびバー
ト(Bert) L. バリー(Vallee)、”ヒト胎盤リボヌクレア
ーゼインヒビターはアンギオゲニンのアンギオゲニン活
性およびリボヌクレアーゼ活性の両方を阻害する”Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2238-2241(1987)。 シャ
ピロ(Shapiro)およびバリー(Vallee）はPRIとアンギオ
ゲニンの関係を明らかにした。彼等の実験結果はPRIお
よび関連するインヒビターがHT-29ヒト：アデノカルシ
ノーマ細胞由来の血管誘導たんぱく質アンギオゲニンの
生体内調節に関与していることを示している。ヒトPRI
はアンギオゲニンの生物学的および酵素活性の両方を阻
害することが分った。したがってアンギオゲニン／PRI
の相互作用が機能的に有意であることが確認された。腫
瘍転移、糖尿病性網膜症(diabetic retinopathy)および
リューマチ関節炎を含む多くの病気で起こる病理学的血
管形成状態を作る上でのアンギオゲニンの関与のためPR
Iとの強い相互作用およびPRIによるアンギオゲニンの阻
害は潜在的にこれらの病気を治療する有効な方法となり
得るであろう。したがってPRIは重要な機械学的、生理
学的、医薬的および、または治療に適した特性を有して
いる。またこのたんぱく質の別の機能も発見されてくる
であろう。

【０００７】動物における該たんぱく質PRIの役割を研
究するためにはヒト胎盤源由来の調製物中に存在する不
純物を含まない純粋なPRIを必要とする。これらの不純
物は哺乳類たんぱく質、おそらくプリオン(prions)およ
び哺乳類DNAであり、またその一部はHIVおよび肝炎ウィ
ルスなどウィルス由来のものである。残念なことに自然
界から十分量の精製たんぱく質を抽出するには比較的に
高いコストがかかる。したがって基本的に不純物を含ま
ない大量で廉価なヒトPRI源が必要である。

【０００８】

【発明の内容】本発明に従うと不純物を含まないヒトPR
Iのクローン化活性遺伝子産物を有用量得ることができ
る。この操作にはヒトPRIサンプルから開始するヒトPRI
をコードする天然遺伝子の単離、クローン化遺伝子に関
するDNAライブラリーのスクリーニング、ヒトPRIプラス
ミド構築物の形成、宿主細胞へのプラスミド構築物の導
入および細胞溶解と遠心によるヒトPRIたんぱく質の単
離のステップを含む。また本発明は単離したPRIの精
製、可溶化および再生法にも関しており、これらには上
述の方法で得た粗PRIの遠心によるヒトPRIの精製、化学
試薬によるヒトPRIの可溶化および可溶化PRIと十分量の
バッファとの混合によるヒトPRIの再生が含まれる。ま
た本発明にはヒトPRIをコードする挿入DNA遺伝子配列を
含むベクター、ヒトPRIをコードする挿入DNA遺伝子配列
を含むベクターに適合しこれを含む宿主、および分子量
約51,000ダルトンの実質的に純粋な組換えヒトPRIたん
ぱく質が含まれる。このベクターにはたとえばヒトPRI
をコードする外来遺伝子配列を含むプラスミドDNA鎖が
含まれる。さらに本発明には宿主細胞、プロモーター、
および該プロモーターのコントロール下にあるヒトPRI
をコードする外来遺伝子配列を含むヒトPRIを発現し得
る組換え宿主細胞が含まれる。さらに本発明に従い組換
えヒトPRIをコードする遺伝子配列が決定された。さら
に本発明の目的、特徴および利点は以下の詳細な説明お
よび図式から明らかとなるであろう。

【０００９】本発明はヒトPRIをコードする遺伝子を得
る方法、該遺伝子産物の発現方法および組換えヒトPRI
の精製および再生方法に関する。PRIはPRIたんぱく質を
コードする遺伝子を含むプラスミドを有する宿主細胞か
ら得られる。またヒトPRIの遺伝子のDNA配列も示されて
いる。本発明の重要な特徴には不活性組換えPRIの単
離、組換えPRIの可溶化および可溶化組換えPRIの活性化
が含まれる。宿主細胞に組換えPRIをコードする遺伝子
を導入するのに種々のベクターを使用し得る。使用する
ベクターにはpGEM（登録商標）-7Zf(+)、pBR322、PA3、
pBC12B1、pGPD-2およびこれらの誘導体などの種々のプ
ラスミドおよびラムダgt11、T7およびこれらの誘導体な
どのバクテリオファージが含まれる。典型的宿主細胞に
は大腸菌などの原核生物およびイーストなどの真核生物
の両方が含まれる。ベクターおよびそのプロモーターの
コントロール下のPRIをコードする外来遺伝子配列と合
せた宿主細胞はヒトPRIを発現し得る組換え宿主細胞を
形成する。

【００１０】組換えPRIはいくつかの性質で特徴づけら
れる。 ａ）分子量：51,000ダルトン ｂ）阻害型：非競合的 さらに本発明の組換えPRIはいくつかの特徴で天然のPRI
と区別される。たとえば天然のPRIとは異なり組換えPRI
のＮ末端アミノ酸は特定される。さらに天然のPRIとは
異なり組換えPRIは阻害を受けずかつアセチル化される
こともない。さらに組換えPRIをコードする遺伝子には
哺乳類DNA、プリオンおよびHIVなどの潜在的に有害な物
質を含まない。不活性組換えPRIは宿主細胞中封入体と
して存在する。一般的に封入体は密に詰った顆粒状たん
ぱく質である。宿主細胞からPRIを単離するためその細
胞膜を破壊しなければならない。いくつかの細胞溶解技
術が使用し得るが好ましい方法には適当量のリゾチーム
の使用とそれにつづく遠心およびドデシル硫酸ナトリウ
ム(SDS)による二次処理が含まれる。この方法で溶液と
して約0.1％の可溶性活性PRIと99.9％の不溶性不活性PR
Iが生ずる。不溶性たんぱく質は遠心により粗不活性た
んぱく質として除去する。このたんぱく質はさらにバッ
ファサスペンジョン／遠心法で精製する。

【００１１】不活性PRIたんぱく質を単離精製した後こ
れを可溶化、すなわち溶液に入れた。可溶化はまず好ま
しくは溶液中でポリヌクレオチド鎖を互いに分離させる
ような化学試薬を含むバッファ液中で開始する。有用な
化学試薬には尿素、塩酸グアニジンおよびSDSが含まれ
るが尿が好ましい。使用前、この尿素溶液は遠心して望
ましくない細胞分解物を除去することが好ましい。この
可溶化ステップは比較的短かい時間、すなわちせいぜい
30分間で行うべきである。不活性PRIと化学試薬を合せ
る時間と活性PRIの最終収量の間には逆比例関係がある
ことが分った。活性化ステップにはPRIを含む溶液をバ
ッファ溶液で希釈し活性状態を再生するのに十分な時間
維持することが含まれる。活性化状態にはいくつかの因
子が重要である。たとえば希釈ステップは比較的素速
く、すなわち２分以内、好ましくは30秒以内で行うべき
である。このバッファ溶液のpHは約6.5〜約8.5の範囲内
でなければならず約7.5であることが好ましい。またバ
ッファ溶液にはグリセリンまたはスクロースのような活
性剤を含めることが有効である。バッファ溶液中に十分
量の活性剤を存在させるとPRIたんぱく質再生能を増加
させ得ることが発見された。また約100部のバッファ溶
液に対してPRI溶液約１部の希釈率がPRI再生を助ける上
で最適であることが分った。溶液希釈後約10℃〜25℃の
温度に少なくとも８時間、好ましくは８〜18時間静置し
なければならない。この条件下でPRIたんぱく質が再生
されPRI分子の約７％が活性となる。以下の実施例はヒ
トPRIをコードするクローン化遺伝子の生成法および活
性組換えヒトPRIの生成法の説明のために示されてい
る。

【００１２】

【実施例】実施例１ヒトPRIの遺伝子を含むラムダgt11クローンの単離 ヒトPRIの遺伝子をクローン化する前に実質的に純粋な
天然のヒトPRIたんぱく質を入手しなければならない。
このヒトPRIたんぱく質は精製法の説明のため参考とし
て本明細書で引用しているブラックバーン(Blackburn)
等（上述）の方法に従って調製する。簡単に云うとヒト
胎盤からの可溶性リボヌクレアーゼインヒビターはブラ
ックバーン(Blackburn)等（上述）により示されたイオ
ン交換およびアフィニティークロマトグラフィーの組合
せにより4,000倍に精製し得る。天然源からのPRIたんぱ
く質を、ブラックバーンら（上述）に記載の方法により
見掛け上均一性を示すまで精製した。このたんぱく質は
さらにDEAEセファロースCL-6Bへの結合と勾配溶出によ
り精製され、ゲル分析では明確に現れない機能性混入物
が除去される。実験動物のニュージランド白ウサギを精
製PRIたんぱく質１mgで免疫化し、つづいて二次免疫化
を行った後10週間飼育した。バクテリオファージラムダ
gt11中のヒト胎盤の市販cDNAライブラリー（クロンテク
社、パロアルト、カリホルニア）をプロトブロットイム
／スクリーニングマニュアル（プロメガ社、1987）（参
考として本明細書で引用している）にリストしてある方
法に従ってスクリーニングした。簡単に云うとこのライ
ブラリーをプレート当り50,000プラークの密度で大腸菌
Ｙ1090（ｒマイナス）株上にプレーティングし、その10
枚のプレート計500,000個のプラークをスクリーニング
した。強い陽性を示すプラークを固定した。

【００１３】このプレートに予めイソプロピル−ベータ
ーＤ−チオガラクトピラノシド(IPIG)に浸したニトロセ
ルロースフィルターを乗せた。フィルターへのたんぱく
質の吸着につづいてそのフィルターを持ち上げ、フィル
ター上のたんぱく質結合部位の残りを１％v/vウシ血清
アルブミンを含むバッファ中でインキュベーションする
ことによりブロックした。次に、このフィルターをウサ
ギの抗体のバッファによる1000倍希釈物に浸し、約30分
間室温で緩やかに振盪した。このフィルターをバッファ
で３回洗浄し市販のヤギ抗ウサギIgGアルカリホスファ
ターゼ結合体（プロメガ社）の1:7500希釈物に浸した。
この“二次抗体”はフィルター上のPRI融合たんぱく質
に結合した一次抗体の存在を検出する。二次抗体存在下
での室温30分間のインキュベーションの後、フィルター
をバッファで３回洗浄した。アルカリホスファターゼの
基質溶液を加え発色させた。強い陽性を示すプラーク１
個が50,000個のプラークのスクリーニングから観測され
た。強い陽性のプラークを特定のファージが純粋となる
までプラークの切り出しとプレーティングを行うことに
より均一となるまで精製した。推定上のPRI遺伝子をも
つ組換えラムダファージ由来のDNAを市販のファージア
ブソーベント（ラムダソーブ、プロメガ社）を用いた免
疫沈殿法により精製した。ファージDNAの制限分析は単
一の1.6キロベース(kb)挿入物の存在を示した。この挿
入物は酵素EcoRIによる消化でファージDNAから除去し得
た。PRIたんぱく質はそれをコードするのに1.4bpの遺伝
子を必要とするのでこの挿入物は全PRI遺伝子を担うの
に適した大きさである。一般に真核生物のメッセンジャ
ーRNAはたんぱく質コード配列に必要な大きさよりも長
いが、これは５′非翻訳領域、３′非翻訳領域およびポ
リＡ領域により増加していることによる。

【００１４】実施例２PRI挿入物を含む遺伝子のプラスミドへのサブクローニ
ング 実施例１で、PRI遺伝子を単一のEcoRIフラグメントとし
てラムダgt11から取り出した。それゆえこのフラグメン
トを直接プラスミドpGEM（登録商標）-7Zf(+)（プロメ
ガ社）にサブクローニングすることにした。図１にはプ
ラスミドpGEM（登録商標）-7Zf(+)を示した。このフラ
グメントをpGEM（登録商標）-7Zf(+)プラスミドにサブ
クローニングすることにより、この挿入物の正しい読み
枠の発現ができた。pGEM（登録商標）-7Zf(+)プラスミ
ドのEcoRI部位における読み枠はバクテリオファージラ
ムダgt11のEcoRI部位のものと同じである。したがっ
て、もしcDNAのコード配列がラムダgt11で発現されるな
らば、pGEM（登録商標）-7Zf(+)プラスミド中でも発現
されるであろう。このフラグメントを正しい方向でベク
ター中に挿入したとき、このプラスミド上のプロモータ
ー、すなわちlacプロモーターはPRI挿入物の発現を誘導
する。PRIたんぱく質に付いているのはベータガラクト
シダーゼの最初のアミノ酸数残基、pGEM（登録商標）-7
Zf(+)プラスミド中の多重クローニング領域およびPRIた
んぱく質のATGの前にある挿入物中の５′非コード領域
によってコードされる余分のアミノ酸である。EcoRI PR
I挿入物をもつバクテリオファージラムダgt11をEcoRIで
消化し、マニアチス(Maniatis)等、（分子クローニン
グ、ラボラトリーマニュアル、（1982）、コールドスプ
リングハーバー、ラボラトリープレス版、コールドスプ
リングハーバー、ニューヨーク）の標準クローニング法
に従いpGEM（登録商標）-7Zf(+)プラスミドにサブクロ
ーニングした。この組換えプラスミドの地図として図２
を示す。

【００１５】実施例３pGEM（登録商標）-7ZF(+)プラスミド中のPRI挿入物の発
現 pGEM（登録商標）-7Zf(+)プラスミドに移したとき、こ
の挿入物は発現の読み枠の状態にある。すなわち、この
プラスミドのEcoRI部位における発現読み枠はラムダgt1
1中のEcoRI部位の発現読み枠と同じである。それゆえ、
このPRI融合たんぱく質は直接大腸菌中で産生され得
る。pGEM（登録商標）-7Zf(+)プラスミドのlacプロモー
ターの誘導による発現の誘導につづいて約60,000ダルト
ンの見かけの分子量をもつ融合たんぱく質をプローブと
して天然のPRIに対するウサギ一次抗体を用いたウェス
タンブロット分析（トービン(Towbin), H, 等、Proc. N
atl. Acad, Sci. U. S. A. 76, 4350(1979)）により検
出した。生成する融合たんぱく質は天然のPRIよりもい
くぶん大きいことが期待される。事実、この場合もこの
ことが観察され、PRIの全コード領域がこのEcoRI挿入物
中に存在しているという仮定と一致した。

【００１６】実施例４ウチギ網状赤血球溶解物におけるPRIたんぱく質の生産 PRI挿入物のpGEM（登録商標）-7Zf(+)へのクローニング
の後、このベクターはベクター上のSP6プロモーターを
用いたインビトロでの挿入物からのRNAの合成に使用可
能である。RNAはこのプロモーターから合成され、ウサ
ギ網状赤血球溶解物のプログラムに使用される。天然の
PRIたんぱく質の大きさをもつ51,000ダルトンのたんぱ
く質が合成された。再びこの結果は全PRIコード配列が
このクローン上に含まれていることを示している。

【００１７】実施例５pGEM（登録商標）-7Zf(+)プラスミド中の挿入物のシー
ケンシング PRI遺伝子挿入物の５′および３′末端の最初のシーケ
ンシングはpGEM（登録商標）-7Zf(+)プラスミド中のク
ローンで行った。このシーケンシングデータは、EcoRI
クローニング部位の数ヌクレオチド下流のATGコドンの
存在およびクローニングされた遺伝子の３′末端にある
長さ36残基のポリＡテールの存在を示した。実施例４に
従って産生された融合たんぱく質の大きさから、PRIた
んぱく質コード配列の論理的開始点はシーケンシングク
ローン中に見い出される最初のATGコドンであると結論
し得る。さらにシーケンシングデータは市販の欠失シス
テム（イレーズ・ア・ベース（Erase-a Base（登録商
標）システム、プロメガ社）を用いたpGEM（登録商標）
-7Zf(+)クローンの連続的エキソヌクレアーゼIII欠失に
より得られた。エクソヌクレアーゼIIIは５′突出端ま
たは平滑端からDNAを特異的に消化し、一方３′側は４
塩基突出のまま残すのに用いられる。この酵素の消化速
度一定性はその反応物から部分標本を取り出すことによ
り所定の間隔で欠失を生じさせ得る。この戦術で実質的
にクローン化挿入物の全ヌクレオチド配列を生成させ
た。このようにして得たヒトPRIのクローン化遺伝子の
ヌクレオチド配列を図３−図３Ｃに示す。ここには誘導
されたそのたんぱく質のアミノ酸配列を含めた。もしヒ
トPRIのクローン化遺伝子のヌクレオチド配列が与えら
れれば、cDNAライブラリーのハイブリダイゼーションに
よるPRI遺伝子の単離を可能にするハイブリダイゼーシ
ョンプローブを構築するのは本発明の範囲内となる。

【００１８】実施例６天然の配列のたんぱく質を発現する遺伝子の作成 遺伝子産物に結合した融合部分をもたない天然配列のた
んぱく質を合成するため、クローンのシーケンシングで
見つかった最初のATGコドンは天然の翻訳開始コドンで
あると仮定した。原核性リボゾーム結合部位をATG開始
部位から６〜８塩基の場所に挿入しその開始部位が大腸
菌内で機能するようにした。他の構築物のデータから８
個の余分なアミノ末端アミノ酸をもつPRIキメラたんぱ
く質は調節可能な大腸菌プロモーターから発現するとき
致死的であるようだ。したがってスタジア(Studier) F.
ウィリアム(William)およびバーバラ(Barbara) A. モ
ファット(Moffatt)（クローン化遺伝子を選択的レベル
で発現させるためのパクテリオファージT7RNAポリメラ
ーゼの使用”、J. Mol. Biol. 189, 113-130 (1986))
が述べているようにT7プロモーターを有するPRI遺伝子
を誘導することにした。この構築物の完成後これをT7RN
Aポリメラーゼを欠く大腸菌宿主内で増巾した。したが
って、この遺伝子はそのRNAポリメラーゼを発現する宿
主に移されるまで発現しない。このような発現システム
が提案されてきており（スタジア(Studier)等、上述お
よびローゼンベルグ(Rosenberg)、アラン(Alan), H.
等、“T7RNAポリメラーゼによるクローン化DNAの選択的
発現のためのベクター”Gene, 56, 125-135 (1987)また
基本的に本章で行なわれている。

【００１９】好ましい構築物ではリボゾーム結合部位お
よびATGコドンの前の領域およびシャインダルガルノ配
列の前につづく非翻訳リーダー配列はバクテリオファー
ジT7遺伝子10、リーダーおよびリボゾーム結合部位に由
来している。さらにT7プロモーターがこのRNAを生産す
るために存在する。ラムダgt11由来のPRI遺伝子のpGEM
（登録商標）-7Zf(+)プラスミドへの移行は、この遺伝
子がこのプラスミド中の多重クローニング制限酵素部位
に隣接していることから巾広いクローニング戦術を切り
開いた。PRI遺伝子をBamHI-AatIIフラグメントとして切
り出しプラスミドベクターpBR322のこれら２つの部位の
間に入れた。ローゼンベルグ(Rosenberg)等（上述）に
よって示されかつ合成オリゴヌクレオチドとして合成さ
れた配列のT7ターミネーターをその遺伝子の後のＸbaＩ
およびＡatII部位の間に挿入した。ＸbaＩ部位は、BamH
I-AatIIフラグメントのPRI遺伝子の移行の際にpGEM（登
録商標）-7Zf(+)リンカーから誘導されたものである。
合成オリゴヌクレオチドはT7プロモーターおよび遺伝子
105'非翻訳配列および遺伝子10シャイン・ダルガルノ配
列を含むものを合成した。このヌクレオチドをクローン
のBamHIおよびBstXI部位の間のPRI遺伝子の始めに挿入
した。PRI挿入物の始めの配列分析で仮定される遺伝子
配列の第３番目のコドンの後にBstXI部位が存在するこ
とが明らかになった。BstXIはコード配列を切り出すの
でこれらのアミノ酸を置換するよう設計した。最終的構
築物を図４に示した。これは大腸菌で発現するように作
製されたプラスミドpBR322中のPRI遺伝子を含んでい
る。

【００２０】この合成構築物中のPRI遺伝子を発現する
ため図４に示したプラスミドをT7RNAポリメラーゼを産
生する大腸菌株の中に入れた。この株はスタジア(Studi
er)等（上述）およびローゼンブルグ(Rosenburg)等（上
述）の方法に従って構築した。大腸菌JM109株を野生型
ファージラムダで溶原化した。この株をラムダベクター
のBamHI部位に挿入したT7RNAポリメラーゼの遺伝子をも
つ組換えラムダファージ（ラムダD69-T7）感染のための
宿主として用いた。T7RNAポリメラーゼの遺伝子を大腸
菌JM109-DE3株の染色体に挿入した。このクローンを199
0年2月21日アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（12301パークローンドライブ、ロックビル、メリ
ーランド20850）に受理番号68230号として登録された。
この培養物を光学濃度１となるまで増殖させ、IPTGで誘
導した。産生されたPRIたんぱく質は細菌たんぱく質の
ポリアクリルアミド電気泳動(PAGE)でモニターし（レム
リ(Laemmli), U. K. Nature（ロンドン）、227, 680(19
70)、つづいてウェスタンブロッティング（トウービン
(Towbin), H.等、上述）およびPRIたんぱく質に対する
ウサギ一次抗体による検出を行った。この分析でIPTGに
よるPRI培養物の誘導および４時間培養後、培養物１リ
ットル当り約40mgのPRIが合成されたことが示された。

【００２１】実施例７大腸菌JM109における活性PRIの産生 実施例６で述べたPRIプラスミドをもつ大腸菌JN109-DE3
は特定のレベルの活性PRIたんぱく質を産生し得る。ほ
とんどのたんぱく質は不活性でかつ不溶性の形で合成さ
れるけれども、全PRIたんぱく質の約0.1％は可溶性であ
り、かつ活性である。活性PRIたんぱく質は結合したRNa
seを含むアフィニティーマトリクスへのバッチ吸着を用
い遠心したフレンチプレス化溶解物から精製する（スコ
ープス(Scopes),ロバート(Robert) K.“たんぱく質の精
製原則と実際”２版、27、1987）。この方法で回収した
PRIはゲルによる分子量が天然のPRI、ブラックバーン(B
lackburn)等（上述）およびブラックバーン（上述）に
より報告されている非グリコシル化たんぱく質と同じで
あり、かつ精製した天然産物とほぼ同じ非活性を有して
いる。大腸菌中で産生されるPRIたんぱく質のほとんど
は不溶型として合成されるので活性組換えPRIたんぱく
質を生産する経済的方法を見つけるためまず不溶性物質
を可溶化し活性型に再生しなければならない。

【００２２】実施例８大腸菌Tacプロモーター制御下におけるPRIたんぱく質の
産生 pTTQベクター中の強力な宿主プロモーターpTacの制御下
（スターク(Stark), J. J. R., Gene, 51, pp255-267,
1987)大腸菌中で天然のPRIたんぱく質が産生された。PR
I挿入物をSphI-EcoRIフラグメントとしてpBR322から取
り出した。このフラグメントはPRI遺伝子の前に秀れた
リボゾーム結合部位を含んでおり、ベクターpTTQ19（ア
マーシャム）中のSphIおよびEcoRI部位の間にクローン
化された。この構築物はビシストロンメッセージ上のTa
cプロモーターによりPRI遺伝子が発現するよう設計され
ている。１つのリボゾーム結合部位はpTTQベクターに由
来し、もう１つはPRI挿入物に由来する。内部リボゾー
ム結合部位は大腸菌中でよく機能するので、融合たんぱ
く質ではなく天然のPRIたんぱく質はこの構築物内に合
成される。もっとも高いレベルの可溶性でかつ活性のあ
るたんぱく質を与える宿主をさがすため、この構築物を
いくつかの様々な大腸菌に入れた。テストした宿主には
大腸菌C6000、JM109、NM522、BSJ72、B121およびHB101
が含まれる。少なくともいくつかの可溶性で活性のある
PRIがテストした各宿主で産生された。

【００２３】実施例９大腸菌におけるPRIたんぱく質の分泌 PRIたんぱく質は天然たんぱく質のアミノ酸分析により
分子当り３２個のシステインをもつことから多くのジス
ルフィド結合を有するであろう。これらの結合は細胞質
の還元的環境下では正しく形成されていない可能性が高
い。それゆえ、より酸化的条件下でジスルフィド結合が
起こるように細菌の細胞周辺腔にこのたんぱく質を分泌
させるよう設計した。PRI遺伝子の開始部位の前にある
大腸菌のompＡたんぱく質のシグナル配列をコードする
合成オリゴヌクレオチド（モバ(Movva), N. R. 等, J.
Mol. Biol. 143 pp. 317-238, 1980)を付加することに
よりpBR322-PRIを修正した。これらのリーダアミノ酸は
たんぱく質を分泌させるためのものであり、このたんぱ
く質が細胞から分泌される際に大腸菌のシグナルペプチ
ターゼにより切断される。この構築物においてＴ７プロ
モーターはpBR322-PRIにおけるのと同様にPRI遺伝子の
転写のために働きつづけるが、ompAシグナル配列が最初
に作られる。結果的にPRIが正しくプロセシング（シグ
ナル配列の除去）を受け、細胞から分泌されることが示
された。分泌したPRIたんぱく質は活性がないことが分
った。さらにたんぱく質レベルも細胞内で産生されるも
のの約10分の１で培養物１リットル当りわずか約４mgで
あった。

【００２４】実施例１０大腸菌に対して致死的なPRI構築物の例 ヒト組換えPRIに有用な発現ベクターを構築する際これ
らの構築物が宿主細胞に対して致死的に働くことでPRI
たんぱく質の発現が不可能となる状態がいくつかあっ
た。１つはベクターpTTQ９中12個の余分なアミノ末端ア
ミノ酸をもつPRI融合物の構築を企てた場合であり、も
う１つは分泌発現ベクターPI NIII ompＡ（マスイ(Masu
i), Y.等,“大腸菌における多目的発現クローニングベ
ヒクル”、遺伝子発現の実験操作、M.イノウエ(Inouye)
編、アカデミックプレス版、1983）中のPRIの発現の場
合である。前者の場合、まずpTTQ９をPstＩで切断し末
端をクレノーで平滑化したのち、このベクターを再びラ
イゲーションした。PGEM（登録商標）-7Zf(+)-PRIのPRI
挿入物をBamHI-SphIフラグメントとして取り出し、PstI
部位を平滑化したpTTQ９ベクターのBamHIおよびEcoRI部
位の間にクローン化した。Sal IおよびKpnＩによる切断
とこれらの粘着末端のクレノー処理およびライゲーショ
ンでベクター上の強力なTacプロモーターからの融合た
んぱく質の発現の読み枠に適合する場合にPRI遺伝子を
位置させ得るであろう。

【００２５】しかし最終構築物が得られなかったことか
らこの発現システムは非誘導条件下でさえ致死量のPRI
融合たんぱく質を生成していると結論される。後になっ
てこれと同じ融合たんぱく質は基本的にpBR322-PRIと同
じ構築物においてT7プロモーターの制御下生産し得る
が、この場合はそのアミノ末端に余分の12個のアミノ酸
を組込むよう作製したクローンを用いていることが示さ
れた。発現システムにおける融合たんぱく質生産能の差
はおそらく非誘導条件下の＋、＆システムのより強い抑
制によるものであろう。分泌ベクターpIN III ompAへの
PRI挿入物のクローン化においても致死が観察された。
このPRI挿入物をBstX1-EcoRIフラグメントとしてpGEM
（登録商標）-7Zf(+)-PRIから切り出しEcoRI切断しリン
酸化したpIN III ompAにクローン化した。このPRIフラ
グメントは２つの方向に挿入され、その結果ベクターの
Tacプロモーターに関しPRI遺伝子が前後に位置するよう
になる。しかし、唯一観察される構築物はPRI挿入物が
このプロモーターの後に位置するもので、従って、この
遺伝子の発現は起こらなかった。先に述べた理由で前置
きの構築物は致死的であるようだ。

【００２６】実施例１１大腸菌で生産される不溶性PRIの単離および回収 PRI生産を誘導された大腸菌内で生成した不溶性PRIは以
下のように回収し得る。 １．不活性PRIの生産を誘導された細胞を緩衝液に懸濁
する。適当な緩衝液は50mMトリスHCl(pH7.5)、5mM EDTA
および5MMDTTを含むTESDTTバッファである。サスペンジ
ョンは400mlのバッファ溶液中、一般には凍結状態の細
胞約20グラムを含むのが適当である。このプロセスのス
ケールを変える事は本発明の範囲内にある。しかし、1:
20の比（細胞グラム数／バッファ容積ml）を維持するこ
とが好ましい。 ２．このサスペンジョンを氷中約10分間激しく攪拌す
る。 ３．細胞溶解により細胞膜を破壊する。1mg／mlの濃度
で粉末リゾチームを加え（シグマ、VI級）氷中で30分間
攪拌する細胞溶解法が好ましい。攪拌後、約4mlの10％
(v/v)ドデシル硫酸ナトリウムを加え、再び氷中で30分
間攪拌する。 ４．このサスペンジョンを約４℃で約20分間、約17,000
×ｇで遠心する。灰色の堅固な下層と半透明で高粘性層
および上清からなる二相ペレット状態が得られる。 ５．上清をペレットから注意深くデカンテーションで分
離しペレットだけを残す。このペレットは粗PRIたんぱ
く質である。

【００２７】実施例１２PRI の精製 １．実施例１１の条件下バッファに実施例１１で
得た粗PRIペレットを再懸濁する。 ２．このサスペンジョンを約４℃、約20分間および17,0
00×ｇで遠心する。遠心後高粘性層ができる。 ３．遠心混合物から上清をデカンテーションする。 ４．ペレットを攪拌しながらバッファに再懸濁する。こ
のバッファ溶液はペレット20グラム当り400mlのTE5DTT
であることが望ましい。このサフペンジョンを氷中約30
分間激しく攪拌する。 ５．このサスペンジョンを約４℃、約20分間、およそ1
7,000×ｇで遠心する。残ったペレットはうすい灰色を
している。

【００２８】実施例１３PRIの可溶化 ペレットは以下のように懸濁し可溶化した。 １．最終ペレットを好ましくは200mlのTE5DTTバッファ
に懸濁し氷中で約120分間攪拌する。乳白色のサスペン
ジョンが得られる。 ２．可溶化は好ましくは４Ｍほどの濃度で尿素を含むバ
ッファ溶液中で開始する。バッファ溶液としてはTE5DTT
が適当である。尿素溶液は360ｇの尿素を含む800mlのTE
5DTTであることが望ましい。 ３．可溶化したPRIは素速く攪拌しながら約10℃から25
℃の温度で800mlのバッファ溶液に対し約200mlの割合で
希釈する。この溶液を約３〜５分攪拌するといくつかの
細胞破片を含むほぼ透明な溶液となる。 ４．使用前この尿素溶液は遠心して不溶性物質を除去す
るのが好ましい。遠心は約４℃で約15分間、6,000×ｇ
で行う。上清は無色透明となる。この上清が可溶化PRI
を含んでいる。

【００２９】実施例１４PRIの活性化 この上清を100リットルのバッファ溶液に素速く希釈
し、十分な時間維持してPRIを活性状態に再生させる。
このバッファ溶液は水活性剤10％(v/v) を含むTE5DTTで
あることが望ましい。スクロースも使用できるが水活性
剤としてはグリセリンが望ましい。バッファ溶液のpHは
約6.5〜約8.5の範囲にあり、7.5であることが好まし
い。この溶液を室温に約８〜18時間放置した後、PRIた
んぱく質が再生し、この分子の約７％が活性となる。

【００３０】実施例１５再生および不活性PRIの分離 100リットル中の再生PRIはジエチルアミノエチル(DEAE)
カラムリアクターで濃縮し得る。DEAEカラムは再生PRI
を濃縮するだけでなくPRIたんぱく質の再生プロセスを
助ける点で有利であり、このことは本発明の利点となっ
ている。代表的カラムには流速30リットル／時間で使用
するクノ(Cuno（登録商標）)3200DEAEカートリッジがあ
る。以下に操作を示す。 １．再生したPRIをポンプでカートリッジに送り、0.5M
NaClを含むTE5DTTで溶出する。 ２．カラムからの溶出液を少なくとも１mg／mlの濃度で
共有結合したRNaseを含むアフィニティ・樹脂に通し
た。活性PRIはRNaseに吸着し、一方不活性で不正に再生
した物質はこのアフィニティーカラムを素抜けしてしま
う。 ３．このアフィニティー樹脂から5mM DTTを含む0.05M
酢酸ナトリウムバッファ(pH5.0)＋3M NaCl 溶液で活性P
RIを溶出する。この段階でPRIは基本的に純粋であり、P
AGEで均一である。 ４．RNase混入が問題ならDEAEセファロースCL-6Bへの結
合と濃度勾配溶出によりさらにPRIたんぱく質から機能
性不純物を除去できる。再生および精製ステップによる
細胞20グラムからのPRIの収量は約３百万ユニットであ
る。組換えたんぱく質は、その非保護のアミノ末端の存
在で天然のたんぱく質と区別し得る。天然のPRIはその
アミノ末端がおそらくアセチル化で保護されていること
からそのアミノ末端から配列決定することができない。
組換えたんぱく質のたんぱく質配列決定で組換え体の非
保護アミノ末端の存在が明らかになり、さらにＮ末端の
メチオニンが大腸菌中で除去されたことが示された。本
発明は代表例として本明細書に示されている特定の態に
制限されるのではなく以下の請求の範囲内で修正形を包
含すると理解すべきである。

【００３１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Promega Corporation <120> HUMAN RECOMBINANT PLACENTAL RIBONUCLEASE INHIBITOR AND METHOD OF P RODUCTION <130> X1G-1080 <140> PCT/US90/02122 <141> 1990-04-18 <150> US 342,362 <151> 1989-04-24 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1614 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (16)..(1398) <400> 1 gaattcgggt ccacc atg agc ctg gac atc cag agc ctg gac atc cag tgt 51 Met Ser Leu Asp Ile Gln Ser Leu Asp Ile Gln Cys 1 5 10 gag gag ctg agc gac gct aga tgg gcc gag ctc ctc cct ctg ctc cag 99 Glu Glu Leu Ser Asp Ala Arg Trp Ala Glu Leu Leu Pro Leu Leu Gln 15 20 25 cag tgc caa gtg gtc agg ctg gac gac tgt ggc ctc acg gaa gca cgg 147 Gln Cys Gln Val Val Arg Leu Asp Asp Cys Gly Leu Thr Glu Ala Arg 30 35 40 tgc aag gac atc agc tct gca ctt cga gtc aac cct gca ctg gca gag 195 Cys Lys Asp Ile Ser Ser Ala Leu Arg Val Asn Pro Ala Leu Ala Glu 45 50 55 60 ctc aac ctg cgc agc aac gag ctg ggc gat gtc ggc gtg cat tgc gtg 243 Leu Asn Leu Arg Ser Asn Glu Leu Gly Asp Val Gly Val His Cys Val 65 70 75 ctc cag ggc ctg cag acc ccc tcc tgc aag atc cag aag ctg agc ctc 291 Leu Gln Gly Leu Gln Thr Pro Ser Cys Lys Ile Gln Lys Leu Ser Leu 80 85 90 cag aac tgc tgc ctg acg ggg gcc ggc tgc ggg gtc ctg tcc agc aca 339 Gln Asn Cys Cys Leu Thr Gly Ala Gly Cys Gly Val Leu Ser Ser Thr 95 100 105 cta cgc acc ctg ccc acc ctg cag gag ctg cac ctc agc gac aac ctc 387 Leu Arg Thr Leu Pro Thr Leu Gln Glu Leu His Leu Ser Asp Asn Leu 110 115 120 ttg ggg gat gcg ggc ctg cag ctg ctc tgc gaa gga ctc ctg gac ccc 435 Leu Gly Asp Ala Gly Leu Gln Leu Leu Cys Glu Gly Leu Leu Asp Pro 125 130 135 140 cag tgc cgc ctg gaa aag ctg cag ctg gag tat tgc agc ctc tcg gct 483 Gln Cys Arg Leu Glu Lys Leu Gln Leu Glu Tyr Cys Ser Leu Ser Ala 145 150 155 gcc agc tgc gag ccc ctg gcc tcc gtg ctc agg gcc aag ccg gac ttc 531 Ala Ser Cys Glu Pro Leu Ala Ser Val Leu Arg Ala Lys Pro Asp Phe 160 165 170 aag gag ctc acg gtt agc aac aac gac atc aat gag gct ggc gtc cgt 579 Lys Glu Leu Thr Val Ser Asn Asn Asp Ile Asn Glu Ala Gly Val Arg 175 180 185 gtg ctg tgc cag ggc ctg aag gac tcc ccc tgc cag ctg gag gcg ctc 627 Val Leu Cys Gln Gly Leu Lys Asp Ser Pro Cys Gln Leu Glu Ala Leu 190 195 200 aag ctg gag agc tgc ggt gtg aca tca gac aac tgc cgg gac ctg tgc 675 Lys Leu Glu Ser Cys Gly Val Thr Ser Asp Asn Cys Arg Asp Leu Cys 205 210 215 220 ggc att gtg gcc tcc aag gcc tcg ctg cgg gag ctg gcc ctg ggc agc 723 Gly Ile Val Ala Ser Lys Ala Ser Leu Arg Glu Leu Ala Leu Gly Ser 225 230 235 aac aag ctg ggt gat gtg ggc atg gcg gag ctg tgc cca ggg ctg ctc 771 Asn Lys Leu Gly Asp Val Gly Met Ala Glu Leu Cys Pro Gly Leu Leu 240 245 250 cac ccc agc tcc agg ctc agg acc ctg tgg atc tgg gag tgt ggc atc 819 His Pro Ser Ser Arg Leu Arg Thr Leu Trp Ile Trp Glu Cys Gly Ile 255 260 265 act gcc aag ggc tgc ggg gat ctg tgc cgt gtc ctc agg gcc aag gag 867 Thr Ala Lys Gly Cys Gly Asp Leu Cys Arg Val Leu Arg Ala Lys Glu 270 275 280 agc ctg aag gag ctc agc ctg gcc ggc aac gag ctg ggg gat gag ggt 915 Ser Leu Lys Glu Leu Ser Leu Ala Gly Asn Glu Leu Gly Asp Glu Gly 285 290 295 300 ccc cga ctg ctg tgt gag acc ctg ctg gaa cct ggc tgc cag ctg gag 963 Ala Arg Leu Leu Cys Glu Thr Leu Leu Glu Pro Gly Cys Gln Leu Glu 305 310 315 tcg ctg tgg gtg aag tcc tgc agc ttc aca gcc gcc tgc tgc tcc cac 1011 Ser Leu Trp Val Lys Ser Cys Ser Phe Thr Ala Ala Cys Cys Ser His 320 325 330 ttc agc tca gtg ctg gcc cag aac agg ttt ctc ctg gag cta cag ata 1059 Phe Ser Ser Val Leu Ala Gln Asn Arg Phe Leu Leu Glu Leu Gln Ile 335 340 345 agc aac aac agg ctg gag gat gcg ggc gtg cgg gag ctg tgc cag ggc 1107 Ser Asn Asn Arg Leu Glu Asp Ala Gly Val Arg Glu Leu Cys Gln Gly 350 355 360 ctg ggc cag cct ggc tct gtg ctg cgg gtc ctc tgg ttg gcc gac tgc 1155 Leu Gly Gln Pro Gly Ser Val Leu Arg Val Leu Trp Leu Ala Asp Cys 365 370 375 380 gat gtg agt gac agc agc tgc agc agc ctc gcc gca acc ctg ttg gcc 1203 Asp Val Ser Asp Ser Ser Cys Ser Ser Leu Ala Ala Thr Leu Leu Ala 385 390 395 aac cac agc ctg cgt gag ctg gac ctc agc aac aac tgc ctg ggg gac 1251 Asn His Ser Leu Arg Glu Leu Asp Leu Ser Asn Asn Cys Leu Gly Asp 400 405 410 gcc ggc atc ctg cag ctg gtg gag agc gtc cgg cag ccg ggc tgc ctc 1299 Ala Gly Ile Leu Gln Leu Val Glu Ser Val Arg Gln Pro Gly Cys Leu 415 420 425 ctg gag cag ctg gtc ctg tac gac att tac tgg tct gag gag atg gag 1347 Leu Glu Gln Leu Val Leu Tyr Asp Ile Tyr Trp Ser Glu Glu Met Glu 430 435 440 gac cgg ctg cag gcc ctg gag aag gac aag cca tcc ctg agg gtc atc 1395 Asp Arg Leu Gln Ala Leu Glu Lys Asp Lys Pro Ser Leu Arg Val Ile 445 450 455 460 tcc tgaggctctt cctgctgctg ctctccctgg acgaccggcc tcgaggcaac 1448 Ser cctggggccc accagcccct gccatgctct caccctgcat atcctaggtt tgaagagaaa 1508 cgctcagatc cgcttatttc tgccagtata ttttggacac tttataatca ttaaagcact 1568 ttcttggcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1614 <210> 2 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Leu Asp Ile Gln Ser Leu Asp Ile Gln Cys Glu Glu Leu Ser 1 5 10 15 Asp Ala Arg Trp Ala Glu Leu Leu Pro Leu Leu Gln Gln Cys Gln Val 20 25 30 Val Arg Leu Asp Asp Cys Gly Leu Thr Glu Ala Arg Cys Lys Asp Ile 35 40 45 Ser Ser Ala Leu Arg Val Asn Pro Ala Leu Ala Glu Leu Asn Leu Arg 50 55 60 Ser Asn Glu Leu Gly Asp Val Gly Val His Cys Val Leu Gln Gly Leu 65 70 75 80 Gln Thr Pro Ser Cys Lys Ile Gln Lys Leu Ser Leu Gln Asn Cys Cys 85 90 95 Leu Thr Gly Ala Gly Cys Gly Val Leu Ser Ser Thr Leu Arg Thr Leu 100 105 110 Pro Thr Leu Gln Glu Leu His Leu Ser Asp Asn Leu Leu Gly Asp Ala 115 120 125 Gly Leu Gln Leu Leu Cys Glu Gly Leu Leu Asp Pro Gln Cys Arg Leu 130 135 140 Glu Lys Leu Gln Leu Glu Tyr Cys Ser Leu Ser Ala Ala Ser Cys Glu 145 150 155 160 Pro Leu Ala Ser Val Leu Arg Ala Lys Pro Asp Phe Lys Glu Leu Thr 165 170 175 Val Ser Asn Asn Asp Ile Asn Glu Ala Gly Val Arg Val Leu Cys Gln 180 185 190 Gly Leu Lys Asp Ser Pro Cys Gln Leu Glu Ala Leu Lys Leu Glu Ser 195 200 205 Cys Gly Val Thr Ser Asp Asn Cys Arg Asp Leu Cys Gly Ile Val Ala 210 215 220 Ser Lys Ala Ser Leu Arg Glu Leu Ala Leu Gly Ser Asn Lys Leu Gly 225 230 235 240 Asp Val Gly Met Ala Glu Leu Cys Pro Gly Leu Leu His Pro Ser Ser 245 250 255 Arg Leu Arg Thr Leu Trp Ile Trp Glu Cys Gly Ile Thr Ala Lys Gly 260 265 270 Cys Gly Asp Leu Cys Arg Val Leu Arg Ala Lys Glu Ser Leu Lys Glu 275 280 285 Leu Ser Leu Ala Gly Asn Glu Leu Gly Asp Glu Gly Pro Arg Leu Leu 290 295 300 Cys Glu Thr Leu Leu Glu Ala Gly Cys Gln Leu Glu Ser Leu Trp Val 305 310 315 320 Lys Ser Cys Ser Phe Thr Ala Ala Cys Cys Ser His Phe Ser Ser Val 325 330 335 Leu Ala Gln Asn Arg Phe Leu Leu Glu Leu Gln Ile Ser Asn Asn Arg 340 345 350 Leu Glu Asp Ala Gly Val Arg Glu Leu Cys Gln Gly Leu Gly Gln Pro 355 360 365 Gly Ser Val Leu Arg Val Leu Trp Leu Ala Asp Cys Asp Val Ser Asp 370 375 380 Ser Ser Cys Ser Ser Leu Ala Ala Thr Leu Leu Ala Asn His Ser Leu 385 390 395 400 Arg Glu Leu Asp Leu Ser Asn Asn Cys Leu Gly Asp Ala Gly Ile Leu 405 410 415 Gln Leu Val Glu Ser Val Arg Gln Pro Gly Cys Leu Leu Glu Gln Leu 420 425 430 Val Leu Tyr Asp Ile Tyr Trp Ser Glu Glu Met Glu Asp Arg Leu Gln 435 440 445 Ala Leu Glu Lys Asp Lys Pro Ser Leu Arg Val Ile Ser 450 455 460

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドpGEM（登録商標）-7Zf(+)の部分
的制限部位および機能マップを示している。

【図２】 挿入したPRIコード遺伝子配列を有するプラ
スミドpGEM（登録商標）-7Zf(+)の部分的制限部位およ
び機能マップを示している。

【図３】 ヒトPRIをコードするクローン化遺伝子のヌ
クレオチド配列を示している。

【図３Ａ】 ヒトPRIをコードするクローン化遺伝子の
ヌクレオチド配列を示している。

【図３Ｂ】 ヒトPRIをコードするクローン化遺伝子の
ヌクレオチド配列を示している。

【図３Ｃ】 ヒトPRIをコードするクローン化遺伝子の
ヌクレオチド配列を示している。

【図４】挿入したPRIをコードする遺伝子配列を有し発
現するよう作成されたpBR322プラスミドの部分的制限部
位および機能マップを示している。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/64 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 シュルツ ジョン ウィリアム アメリカ合衆国 ウイスコンシン州 53593 ヴェローナ メロディー レーン 407

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 活性形態ヒト胎盤リボヌクレアーゼイン
   ヒビターをコードするcDNAの細胞内での発現により細胞
   内に産生された不溶性混入体を可溶化及び再生して、活
   性形態ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターにする方
   法であって、以下の工程を含む方法： (a)不溶性の不活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビ
   ターを、該細胞から、第１緩衝液を用いて単離する工
   程； (b) 不活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを可
   溶化する工程であって、不溶性の不活性ヒト胎盤リボヌ
   クレアーゼインヒビターを、約４Ｍ以上の濃度の尿素を
   含む第２緩衝液と合わせることを含む工程； 及び(c) ヒトリボヌクレアーゼインヒビターを、第３緩
   衝液により希釈することにより活性化する工程。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、前記工
   程(a)の単離工程が、以下の段階を含む方法： (i) 不活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターの産
   生のために誘導された細胞を、第１緩衝液に懸濁する段
   階； (ii)細胞溶解によりその細胞膜を破壊する段階； (iii)段階(ii)の溶液からヒト胎盤リボヌクレアーゼイ
   ンヒビターのペレットを遠心により得る段階； 及び(iv)遠心したヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビタ
   ーのペレットから上清をデカンテーションにより除去す
   る段階。
3. 【請求項３】 請求項２に記載の方法であって、第１緩
   衝液が、トリス-HCl、EDTA及びDTTを含み；段階(ii)
   が、更に、リゾチーム及びドデシル硫酸ナトリウムの添
   加を含み；かつ段階(iii)の遠心が、約４℃、約17,000
   ×ｇで行われる方法。
4. 【請求項４】 第２緩衝液が、更に、トリス-HCl、EDTA
   及びDTTを含む請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 可溶化されたヒト胎盤リボヌクレアーゼ
   インヒビターを、第２緩衝液と、約10℃〜25℃の温度で
   合わせる請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 工程(c)の希釈が、可溶化されたヒト胎
   盤リボヌクレアーゼインヒビターを含む尿素含有第２緩
   衝液１部に対し、第３緩衝液少なくとも20部の割合で行
   われる請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 第３緩衝液が、更に、スクロース又はグ
   リセロールを含む請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 細胞が、大腸菌細胞である請求項１に記
   載の方法。
9. 【請求項９】 活性形態ヒト胎盤リボヌクレアーゼイン
   ヒビターをコードするcDNAの細胞内での発現により細胞
   内に産生された不溶性混入体を可溶化及び再生して、活
   性形態ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターにする方
   法であって、以下の工程を含む方法： (a)単離されていない不活性ヒト胎盤リボヌクレアーゼ
   インヒビターを可溶化する工程であって、不溶性の不活
   性ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを、約４Ｍ以
   上の濃度の尿素を含む第１緩衝液と合わせることを含む
   工程； (b)該ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビターを、第２
   緩衝液により希釈することにより活性化する工程。
10. 【請求項１０】 第１緩衝液が、更に、トリスHCl、EDT
    A及びDTTを含む請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 細胞が、大腸菌細胞である請求項９に
    記載の方法。 【０００１】