JPH06506667A - カプセル化したｖｐ６の薬物送達 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 カプセル化したＶＰ６の薬物送達 技術の分野 本発明は、一般に、新規な薬物標的化および送達の方法に関する。特に、本発明 はロタウィルスＶＰ６球を薬物送達に適用することに関する。

背景 バイオテクノロジーの最近の進歩により、治療用または診断用物質を調製および 送達するための新規な方法の開発が可能になった。薬物の選択性を改善しそして 毒性を低減するために、担体システムを用いて薬物および他の物質を組織、細胞 、または非細胞の小器官に標的させる能力が、特に重要である。現在用いられて いるシステムでは、この目的を成し遂げるために高分子、合成ポリマーおよび粒 子を使用している。

しかしながら、大部分のシステムは、複合体中に組み込まれ得る薬物の量および 範囲によって制限される。そしてそのシステムはその薬物を所定の細胞に標的と し、作用させる能力が欠如していることにより制限される。さらに、その担体は しばしば毒性成分を含み、薬物−担体複合物の調製では技術的な問題に遭遇し得 る。

治療用の物質を送達する１つの方法は、免疫結合体を形成するために細胞−特異 的な抗体に結合した薬物または細胞障害性物質を使用することを含有する。該結 合体は、該抗体が指向する表面抗原を有する細胞に結合する。しかしながら、こ れらの送達システムはいくつかの欠点を有する。多くの場合は、所望の応答を成 し遂げるためには、大量の薬物を標的細胞に送達しなければならない。そのよう な大きな量は、細胞表面の抗原数および与えられた抗体かに結合され得る薬物分 子の数が限られるために、しばしば得られない。さらに、免疫結合体の細胞障害 活性は、多くの場合標的細胞によるその複合体の取り込みおよび内在化に依存す る。しかしながら、はとんどの免疫結合体は内在化されず、そしてもし内在化さ れたとしても、薬物または細胞障害性物質はその細胞のリゾソームによってしば しば分解される。結局は、例えば腫瘍細胞のような細胞は、抗原発現に関して多 くの場合異質性を有しており、そして抗原−陽性の細胞は抗原−陰性の子孫を産 生じ得る。従って、与えられた腫瘍細胞の集合体中には、特定の免疫結合体に特 異的な抗原を欠乏した、かなりの数の細胞が存在する。

タンパク質の微小球体もまた、薬物投与に用いられてきた。

これらの微小球体は、特定の治療用物質を担体タンパク質と結合させ、そしてそ の複合体を油と混合してミセルを形成することによって形成される。これらのミ セルは化学的な架橋化剤を用いて安定化される。しかしながら、最終的な安定化 工程は該薬物を不活化し得る。

これらの問題を克服するために、リポソームが使用されてきた。リポソームは、 リン脂質などの天然の脂質成分から形成された極微小なベシクルである。薬理活 性物質は、その後の送達のためにリポソ−ム技術導入され得る。リポソーム技術 の一般的な総説としては、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、　Ｇ、、巳且戯旦鱈エバ吐 肚旦釘（ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｒｏｃａ　Ｂａｔｏｎ、　ＦＬＡ、　１９８４） 　；　Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏ　（１９８５）　ｉ：２３５を参照のこと。

数人の研究者が、抗腫瘍剤および抗ウィルス剤の送達のためのリポソームの使用 を示唆している。例えば、Ｆｔｄｌｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃ　（ １９８２）　４２：４９６−５０１は、カプセル化されたムラミルジペプチド（ ＭＤＰ）のリンホカインを使用して、順次、肺およびリンパ節の転移を破壊する 宿主マクロファージを活性化することを記載している。

Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８Ｂ）４ ８：５２３７−５２４５は、リポソームにカプセル化されたメトトレキサートー σ−アス、ｆルテートおよび５−フルオロオロテート（５−ｆ　１ｕｏｒｏｏｒ ｏｔａｔｅ）のヒト卵巣癌細胞系に対する細胞障害性をインビトロで試験して、 これらの薬物をリポソーム中にカプセル化することにより該薬物を細胞内に細胞 内送達することを開示している。

Ｋｏｆ　ｆら、崩工ｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｌ＋ｕｕｎｉｔ　（１９８３）　４ ２：１０６７−１０７２は、■５Ｖ−２感染細胞に対するマクロファージを活性 化するための、マクロファージ活性化因子をカプセル化したリポソームの使用を 記載している。

英国特許出願第ＧＢ　２，１４６，５２５　Ａ号は、最外層に結合したポルフィ リンを有するリポソームの使用を記載している。これらのリポソームは抗癌剤お よびマクロファージ活性化因子を送達する。

最後に、米国特許第４．６５０．６７４号は、インターフェロンおよび腫瘍壊死 因子を含む共力作用的な組成物を記載し、腫瘍内に直接注入するために該組成物 をリポソーム中にカプセル化し得ることを開示している。

薬物送達システムとしてのリポソームの使用が上記問題のいくつかを軽減するに もかかわらず、この薬物送達技術はいくつかの欠点を有する。特に、薬物作用が 要求される部位にリポソームを標的化する有効な手段が欠如している。さらに、 リポソームは貯蔵中および使用中の安定性が劣るので、大量生産および工業生産 するには問題がある。これらの問題を解決するために、研究者らはウィルス性の 粒子を用いて物質を送達した。例えば、１９９１年５月１６日発行のＮｏ　９１ １０６６５８号は、腫瘍壊死因子であるインターロイキン−２および多数の薬物 抵抗性タンパク質をコードするＲＮＡ配列を有するレトロウィルスベクターの使 用を記載している。

ロタウィルスの内部キャブジッドは、ｖＰｌ、ＶＦ６およびＶＦ６で表される、 少なくとも３種のタンパク質を含む。４５ｋＤのタンパク質であるＶＦ６は、本 明細書では重要である。ＶＦ６は、その表面に結合したハプテンまたは抗原のた めの有効な担体タンパク質である。本明細書に参考文献として援用する米国特許 第５．０７１，６５１号の全文を参照のこと。タンパク質、ペプチドおよび炭水 化物の抗原は、ペプチド結合または化学反応によってＶＰ６タンパク質の表面に 結合し得る。ＶＰ６担体は、抗原を免疫系に送達させて抗体応答を誘導するため の抗原授与システムとして使用され得る。

しかしながら、抗原送達物は、結合された物質の大きさによって制限され得る。

そしてＶＰ６球体の表面上にいくつかの分子を配置することは、それに対するレ セプターを有するすべての細胞を標的とし得るので好ましくない。従って、所望 の物質をカプセル化することにより、この選択性の欠如を克服し得る。本発明は 細胞、細胞小器官、および臓器へのより効果的な送達を成すために、ＶＰ６球体 中に治療用物質をカプセル化する手段を提供する。

ｌ訴旦！１ 本発明は、ＶＦ６が速やかに標的化し、結合し、そして単核細胞およびマクロフ ァージによって取り込まれるという知見に基づく。Ｒｅｄｍｏｎｄ、　Ｍ、Ｊ、 ら、Ｍｏ１．１ｍ＋ａｕｎｏｌ　（１９９０）　（印刷中）。

本発明はまた、ロタウィルスのＶＦ６の内部キャプシドタンパク質が治療用物質 をカプセル化するために用いられ得るという知見に基づく。従って、標的細胞に 送達される物質は、ＶＰ６球体中にカプセル化され、細胞に送達される物質の濃 度を増加し得る。さらに、他の標的化物質を’／Ｐ６球体に結合し、その球体を 他の組織および細胞型に指向させ、それによって球体中にカプセル化された生物 活性物質は局所的に作用し得る。

従って、一つの実施態様では、本発明は生物活性物質を目的物に送達し得る組成 物を提示する。該組成物は、ＶＰ６タンパク質中にカプセル化された生物活性物 質を含有する。標的化物質は球体の表面に存在し、該組成物を特定の細胞型に指 向させ得る。

他の実施態様では、本発明は生物活性物質をＶＰ６タンパク質球体中にカプセル 化するための、以下の工程を包含する方法を提示する： （ａ）未集成のＶＰ６タンパク質を該生物活性物質と混合する工程；および （ｂ）ＶＰ６タンパク質球体の集成形成を成し、それによって該生物活性物質を カプセル化する工程。

さらに他の実施態様では、本発明は生物活性物質を細胞混合物中の所定の細胞に 送達する方法に関する。その方法は、細胞混合物を上記組成物と組み合わせる工 程を包含する。

本発明のこれらの実施態様および他の実施態様は、当業者が本明細書の開示を考 慮することにより容易に想起され得る。

１皿仄説皿 本発明の実施に際しては、特に指示しない限り、当該分野の免疫学、タンパク質 化学、分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術の従来技術を用いる。そ のような技術は、文献に詳述されている。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｆ　Ｅｘ 　ｅｒｉｗ＋ｅｎｔａｌ　Ｉｎｖ■立ｌ■、Ｉ−ＩＶ巻、（Ｄ、Ｍ、Ｗｅｉｒお よびＣ，Ｃ，Ｂｌａｅｋｗｅｌｌ編、１９８６年、Ｂｌａｅｋｗｅｌｌ　５ｃｉ ｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）　；　Ｍｅｔ　ｏｄｓ　ｉ　Ｅυ 劇旦■（Ｓ、　Ｃｏ１ｏｖｉｃｋおよびＮ、　Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉ ｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｉｎｃ、）；　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｆｔ５ｃｈ　＆　Ｍａｎｆａｔｆｓ、、 Ｍ　ｅｃｕ　ａｒ　Ｃ１ｏ　ｆｎ：　Ａ　ａｂｏ　ａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、第 ２版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅ ｓｓ、１９０年）；Ｏ’　ｕｃ　ｏｔ　Ｓ　ｔ　ｓｓ、（Ｍ、Ｊ。

Ｇａ１ｔ！ｉｉ、１９８４年）；および吐Ｌ」ユ旺皿、１巻およびＨ巻、（Ｄ。

Ｎ、　Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）を参照のこと。

本明細書に記載の上記または下記のすべての特許、特許出願、および刊行物を、 本明細書に参考文献として援用する。

Ａ、ｕ 本発明の記載においては以下の用語を使用し、それらの用語を下記のように定義 する。

用語ｒＶＰ６タンパク質」は、当該分野で認識されているレオウィルス科（Ｒｅ ｏｖｊｒｉｄａｅ）ファミリーのいずれかの種または株由来の内部キャブジッド の主要なウィルスタンパク質、もしくは下記に定義されるような、それらのウィ ルスタンパク質に対する機能的等個物または実質的に相同なタンパク質を意味す る。例えば、Ｋａｐｉｋｊａｎら著、ｕ工は」「（Ｂ、　Ｎ、Ｆｉｅｌｄｓら編 、１９８８年）を参照のこと。ＶＰ５タンパク質を単離し、本発明に用いられ得 るロタウィルス株の例としては、５１ｍ１ａｎ　５ＡＩＩ、ヒトＤロタウィルス 、ウシＵＫロタウィルス、ヒトＷａまたは胃ロタウィルス、ヒト３２０タウイル ス、アカゲザルロタウイルス、ｒＯＪ物質、ウシＮＣＤＶロタウィルス、ヒト３ ２０タウイルス、ヒト３２０タウイルス、ヒト３９０ロタウイルス、ヒトＰロタ ウィルス、ヒトＭロタウィルス、ヒトＷａｌｋ　５７／１４０タウイルス、ヒト Ｍｏロタウィルス、ヒト３２０タウイルス、ヒトＮｅｍｏｔｏロタウィルス、ヒ ト３２０タウイルス、ヒト３９０ロタウイルス、アヵゲザルＭＭ０１８００６０ タウィルス、イヌＣＵＩロタウィルス、ネコＴａｋａロタウィルス、ウマＨ２０ タウィルス、ヒトＳｔ、　Ｔｈｏｗ＋ａｓ第３および第４０タウイルス、ヒトＨ ｏｓｏｋａｗａロタウィルス、ヒト■０（ｈｉｏタウィルス、ブタ５８２０タウ イルス、ブタＧｏｔ　ｔｆｒ　ｉｅｄ　。

タウイルス、ブタ５ＢＩＡロタウイルス、ブタＯＳ［Ｊロタウィルス、ウマＨ１ ０タウィルス、ニワトリｃｈ、　ｚ　ロタウィルス、シチメンチョウＴｙ、　１ ０タウイルス、ウシｃ４８６０タウィルス、およびそれら由来の株を含むが、こ れに限定されない。従って、本発明で用いられるＶＰ６タンパク質は、いずれか のロタウィルス株から得られたＶＦ６、あるいはサブグループｌ、サブグループ 目、またはまだ同定されていないサブグループから得られたＶＦ６、もしくは血 清型１−７、およびまだ同定されていない血清型から得られたＶＦ６を含む。本 発明で用いられるＶＰ６タンパク質をこれらの単離されたタンパク質の配列に基 づいて組換えにより生産し得ることが、理解されるべきである。

ＶＦ６をコードするヌクレオチド配列およびＶＦ６のアミノ酸配列は、ロタウィ ルスのいくつかの異なる株に関して公知である。株間には広範囲の相同性が存在 する。

少なくとも約８５％（好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少 なくとも９５％）のヌクレオチドまたはアミノ酸が、その分子の定義された長さ にわたって合致する時、２種のＤＮＡまたはタンパク質配列は、「実質的に相同 （ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）Ｊである。

用語［機能的等価物（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ　ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）Ｊと は、生物活性物質をカプセル化し得、そして該物質を所望の標的細胞型に天然の 配列と同様に送達し得るタンパク質を産生ずる鎖を規定する、’／Ｐ６タンパク 質の類似物の配列を指す。そのような機能的等価物を決定するためのアッセイは 本明細書に記載され、そして当該分野で公知である。従って、本明細書で利用し たＶＰ６タンパク質は、天然のタンパク質と同一のアミノ酸配列を有する必要は ない。

用語［所定の細胞の群に作用を与える（ｅｘｅｒｔｉｎｇ　ａｎ　ｅｆｆｅｃｔ 　ｏｎ　ａ　５ｅｌｅｃｔｅｄ　ｇｒｏｕｐ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓ）Ｊは、特異的 な細胞を活性化または不活化する工程、細胞の増殖または分化を阻害または停止 する工程、特定の細胞もしくは細胞内の細菌、ウィルス、真菌または寄生虫を積 極的に殺す工程、または細胞内の遺伝子物質を変異させる工程、もしくは上記す べての工程を含む。効果は、存在する生物活性物質および標的とされた細胞に依 り変化する。例えば、ＶＰ６球体にサイトカインがカプセル化された場合、ＶＦ ６の本来の標的である単核球およびマクロファージは活性化され、素置細胞機能 は増強される。従って、本発明の組成物を投与された被験者では免疫系が刺激さ れる。

この組成物は次に、ウィルス性、細菌性、寄生虫性、および真菌性の感染を攻撃 し得るとともに、腫瘍細胞の増殖を阻害または停止するか、それとも免疫機構を 変更し得る。例えば腫瘍細胞表面に見い出される抗原と反応し得る抗体のような 他の標的化物質がＶＰ６球体上に存在し、ＶＰ６球体中に細胞障害性物質がカプ セル化されるとき、その細胞障害性物質は癌性の細胞に直接送達され得る。意図 された効果は、腫瘍細胞の増殖を阻止するがまたは低減する、細胞障害性効果で ある。

この他に、特異的な組織型または細胞型、例えば肝臓、肺臓、心臓、腎臓、肺、 腸細胞など、赤血球、または造血−免疫系の池の細胞（例えばＴ細胞、Ｂ細胞、 骨髄および他の前駆細胞、単核球、マクロファージ（＋ｍａｅｒｏｐｈａｇｅｓ ）、ナチュラルキラー細胞または好中球など）が選択され得、そしてこれらの細 胞に移動することが知られているウィルスタンパク質などの結合物質によって、 ＶＦ６上に標的化され得る。そのような標的化の一つの効果は、局所免疫系を発 動して特定の細胞部位での感染を低減することである。他の局所応答もまた、上 述のように期待される。

上記議論から、用語「所定の細胞の群（ａ　５ｅｌｅｃｔｅｄ　ｇｒｏｕｐｏｆ 　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ）Ｊまたは用語［標的Ｄａｒｇｅｔ）Ｊが、造血−免疫系 の細胞（例えば単核球、マクロファージ、Ｔ細胞、および好中球）、ならびに腫 瘍細胞または他の特異的な臓器、細胞型または組織、（例えば肝細胞または腸粘 膜細胞）を含むいくつかの細胞型を含むことは、明らかである。さらに、「所定 の細胞の群」がカプセル化された物質と組み合され、そして混合された細胞集合 体においてインビトロまたはインビボのいずれでも作用し得る。

用語［生物活性物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ａｇｅｎｔ） Ｊは、上記効果を与え得る物質を意味する。

用語「標的物への送達（ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｔｏ　ａ　ｔａｒｇｅｔ）Ｊは、カ プセル化された物質を、該物質が局所的に作用し得る、上述の標的細胞あるいは 組織へ送達することを意味する。治療用物質および／またはＶＰ６球体に結合し た標的化部分の性質に依存して、該物質は細胞表面のレセプターと直接反応する かもしくは標的細胞または組織によって内在化される。

用語［カプセル化された（ｅｎｃａｐｓｕ　ｌａ　ｔｅｄ）Ｊは、ＶＦ６内に生 物活性物質を導入することを意味する。特に、球状の粒子が所望の物質の周囲に 形成される。ＶＦ６を用いて表面抗原を送達する従来の担体システムとは異なり 、本発明は、ＶＰ６分子上のレセプターに活性物質を「引っかける（ｈｏｏｋ） Ｊための結合配列あるいはタンパク質−タンパク質相互作用に依存しない。従っ て、用語「カプセル化された」は、活性物質がＶＰ６タンパク質レセプターにこ れらのメカニズムを介して結合する系を意味しない。

用語「ポリペプチド」および用語「タンパク質」は、本明細書では互換的に用い られ、そしてそれらの最も広い意味で用いられる。すなわち、ペプチド結合によ って結合されたアミノ酸の何らかのポリマー（ジペプチドまたはそれより大きい ）を表記する場合などである。従って、この用語はオリゴペプチド、タンパク質 フラグメント、それらの類似物、変異体、融合タンパクなどを含む。

「天然の（Ｎａｔｉｖｅ）Ｊタンパク質またはポリペプチドとは、ロタウィルス またはロタウィルスに感染した細胞から回収されたタンパク質またはポリペプチ ドのことである。従って、この用語は、自然に発生するａタウイルスタンバク質 およびそのフラグメントを含む。「天然でない（Ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ）Ｊポリ ペプチドは、組換えＤＮＡ法または直接的合成によって生産されたポリペプチド のことである。「組換え（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）Ｊポリペプチドは組換えＤ ＮＡ技術によって産生されたポリペプチドを指す；すなわち、所望のポリペプチ ドをコードする外因性のＤＮＡ構築物によって形質転換された細胞から生産され たポリペプチド。

組成物中のＡ＋８全体に対して少なくとも約８５１ｉｊＨがＡであるとき、Ａを 含有する組成物は、Ｂを「実質的に含有しない（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ　 ｆｒｅｅ　ｏｆ）Ｊ。好ましくは、Ａは組成物中のＡ＋８全体に対して少なくと も約９０重１％を含有し、より好ましくは、少なくとも約９５重１％、またはさ らに９９重！％を含有する。

Ｂ・−二１１だＬが広 種々の物質がロタウィルスＶＰ６球体中にカプセル化され得ることの発見が本発 明の中心となる。カプセル化は、簡単な反応で成され、はとんど時間を要さない し、ＶＰ６タンパク質中に広範囲の物質が組み込まれ得る。本発明は、治療用物 質がｖＰ６表面のレセプターに結合するのではなく実際に球体内部にカプセル化 されているので、結合物質またはタンパク質−タンパク質相互作用の使用を必要 としない。この方法により、より多くの種類の物質がＶＰ６球体を使用して効果 的に送達され得る。

生物活性物質はＶＰ６球体中にカプセル化され得るが、そのような生物活性物質 は、インターフェロン（ＩＦＮ）アルファ、ベータ、およびガンマなどのサイト カイン；顆粒球−マクロファージＣ３Ｆ　（ＣＳＰ−ＧＭ）、マクｃｆｆファー ジＣＳＦ　（ＣＳＦ−Ｍ）、好中顆粒球Ｃ５Ｆ（ＣＳＦ−Ｇ）、ＢＰＡ、　フル チーＣＳＦ、　ＨＣＧＦＳＭＣＧＦ、およびＰＳＦ　（例えば、Ｍｅｔｃａｌｆ 　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）２２９：１６を参照のこと）、始原細胞コロニ ー刺激因子（ＣＳＦ−ＰＣ）、マクロファージ炎症因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ ）などの、コロニー刺激因子；おヨヒ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ− ４、ＩＬ−５、Ｉ　Ｌ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ −１１などのインターロイキン（例えばＡｎｎ、ｅｖ、１ｍ＋ｗｕｎｏ１．．１ −８巻、を参照のこと）に限定されるものではない。本発明は、組換え生産され たサイトカインのような難溶性の分子の送達に対して特に有用である。これらの 物質をＶＰＳ中にカプセル化することで、この問題は克服される。

ＶＰ６タンパク質中にカプセル化されて用いられる他の多くの分子が、当該分野 で知られている。通常は高分子であるそのような分子の種類は、例えばポリペプ チド、炭水化物、ヌクレオチドおよびヌクレオシドの類似物を含む核酸である。

タンパク質、糖タンパク質およびペプチドとしては、ホルモン、グルカゴン、イ ンスリン様成長因子、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、プロラクチン、イン ヒビン、セクレチン、ニューロテンシン、コレシストキニンまたはそのフラグメ ント、カルシトニン、ソマトスタチン、胸腺ホルモン、神経伝達物質および遮断 物質、ペプチド放出因子（例えばエンケファリンなど）、成長ホルモン放出因子 、ならびに例えば、カルモジュリンのようなタンパク質のフラグメント、Ｅ、　 ｃｏｌｉ熱安定性オヨヒ熱不安定性エンテロトキシン、コレラトキシン；および ラウス肉腫ウィルスのプロティンキナーゼなどの酵素を含み得る。他の物質は、 例えば、テストステロンのようなステロイドホルモン、エストラジオール、アル ドステロン、エンドロステンジオン、またはそのフラグメントなどを含む。

ヌクレオチドとしては、例えば、ポリヌクレオチドのフラグメント、制限酵素部 位、およびサイクリックヌクレオチド（例えば、サイクリックアデノシンモノボ スフェート）を含む。

炭水化物および炭水化物複合体としては、例えば、細菌性カプセルまたはエクソ ボリサ・２カライド（例えば、インフルエンザＢｌｌから得られる）、コア抗原 に関連する細菌性リビッドＡ（シュードモナス種から得られる）、血液型抗原（ 例えば、ＡＢＯ抗原など）、および糖脂質を含む。脂質としては、例えば、脂肪 酸、グリセロール誘導体、プロスタグランジン（例えば、プロスタグランジンＥ ２など）、およびリボペプチド（例えば、ロイコトリエン（ｌｅｕｋｏｔｅ　１ ｅｎｅ）　ＢＪなど）を含む。重要な分子としては、例えば、ヴインドリン（ｖ ｉｎｄｏｌｉｎｅ）、セルペンチン（ｓｅｒｐｅｎｔ　１ｎｅ）、カタランチン （ｃａｔｈａｒａｎｔｈｉｎｅ）などのようなアルカロイド、ならびに−ＯＨ， ＮＨ，５ＨＳＣ［（ＯまたはＣ００）＋１７）官能基を有するビタミンを含む。

細胞障害性物質、変異原、抗細菌性、抗ウイルス性、抗真菌性および抗寄生虫性 物質を含む、広範囲の種類の治療用物質もまた本発明に用いられ得、リジン、シ クロスポリンＡ、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、アフラトキシンビン クリスチン、ドキソルビシン、プロプラノロール、ポルフィリン、アシクロビル およびＡＺτを含むがこれに限定されない。

ＶＰ６球体中に有効にカプセル化され得る物質の量および種類は、一部はＶＰ６ 球体の大きさによって、一部はＶＰ６球体の物理的および化学的構造によって、 そして一部はＶＰ６球体中にカプセル化される物質の性質によって決定される。

特に、ＶＰ６粒子の直径は約７０μ量であり、最大容量は１．８Ｘ　１０−２２ ＋＊’である。この球体の表面には、直径４０−６５オングストロームの、１３ ２のチャンネルが穿孔されている（Ｊｅａｇｅｒら、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｔｏｌ 、（１９９０）　１１０：２１３３−２１４４）　ｏ　それゆえ、約２０オング ストロームより小さい横断面を有する分子が球体から漏出し得るとともに、種々 の分子が種々の速さで漏出する。従って、有効な送達のために充分な量で保持さ れた低分子が、本発明に用いられ得る。さらに、ある種のより小さな分子もまた 、その分子と穿孔された表面との間の疎水性の相互作用に従って球体中に保持さ れ得る。従って、一般に、少なくとも約２００ダルトン、好ましくは約５００ダ ルトン、そして最も好ましくは約ｔｏ、ｏｏｏダルトンの分子集団を有する物質 が、本発明で用いられ得る。しかしながら、これらの基準から外れた他の物質も また、疎水性の特性があるならばカプセル化可能である。その代わりに、低分子 は重合または複合化されて例えばＢＳＡなどのより高分子型の分子となり、それ らのＶＰ６球体中の保持を維持し得る。本明細書の実施例を考慮すれば、当業者 は特定の物質が有効にカプセル化され得るかどうかを容易に決定し得る。

本発明に用いるＶＰ６タンパク質は、数種の任意の方法により調製され得る。第 一に、ＶＰ６タンパク質は、常法により塩化カルシウム（ＣａＣ１２）または塩 化リチウム（ＬｉＣ１）処理によってインビトロで誘導された単膜ウィルス粒子 から単離され得る。例えば、Ａｌｍｅｉｄａら、Ｊ　Ｍｅｄ二［Ｌ壮（１９７９ ）　４：２６９−２７７；　Ｂｉｃａｎら、Ｌｉ１Ｌ９ｉ（１９８２）　４３＋ １１１３−１１１７；　Ｇｏｒｚｉｇｌｆａら、Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖ工■１（１９８ ５）　６６：１８８９−１９００ｓ　Ｒｅａｄｙら、Ｌｌ旦ｈ■よ（１９８７） 　１５ユニ１８９−１９８を、参照のこと。この他に、ＶＰ６タンパク質は、文 献に詳述されている組換えＤＮＡ技術によって生産され得る。例えば、Ｓａｍｂ ｒｏｏｋら、同上；および吐り立匝直瓜、同上、を参照のこと。

ＶＰ６ポリペプチドをコードするＤＮＡコード配列は、ＶＦ６のｍＲＮＡから誘 導され得る。例えば、Ｅｓｔｅｓら、同上ＨＢｏｔｈら、ＪＶｉ。

ｒｏｌ　（１９８４）５１：９７−１０１；　Ｃｏｈｅｎら、Ｌｕ旦す万は　（ １９８４）ｌｉ：１７ａ−１８２を参照のこと。他には、ＶＰ６タンパク質をコ ードするＤＮＡ配列を、クローン化するのではなく合成して調製し得る。このＤ ＮＡ配列は、ウィルスタンパク質のアミノ酸配列に対する適切なコドンを用いて 設計され得る。一般に、その配列が発現に用いられるならば、目的とする宿主に 対する好ましいコドンが選択される。完全な配列は、常法により調製されたオリ ゴヌクレオチドを重畳して集成され、完全なコード配列として集成される。例え ば、Ｅｄｇｅ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１）　２９２ニア５６；　Ｎａｍｂａ ｉｒら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８４）　２２３：１２９９；　Ｊａｙら、Ｊ　 Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅ　（１９８４）±：６３１１を参照のこと。

ウィルスタンパク質のコード配列が調製または単離されると同時に、その配列は いずれかの適切なベクターまたはレプリコンにクローンされ得る。多数のクロー ニングベクターが当業者に公知であり、適切なりローニングベクターの選択は、 好みの問題である。クローニングのための組換えＤＮＡベクター、およびそれら が形質転換し得る宿主細胞（かっこ内）としては例えば、バタテリオファージラ ムダ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）、ｐＢＲ３２２（Ｅ。

ｃｏｌｉ）、ｐＡｃＹｃ１？？　（Ｅ、　ｃｏｌｉ）、ｐＫＴ２３０　（グラム 陰性細菌）、ｐＧＶ１１０６　（グラム陰性細菌）、ｐＬＡＦＲｌ　（グラム陰 性細菌）、ｐＭＥ２９０　（非−［：、　ｃｏｌｉグラム陰性細菌）、ｐＨＶ１ ４　（Ｅ、　ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、ｐＢＤ９ 　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ｐ！Ｊ６１　（Ｓｔｒｅｐｔ。

＋ｍｙｅｅｓ）、ｐＵＣ６（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ＹＩｐ５　（Ｓａｃ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ｙｃｐ１９　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）および ウシ乳頭腫ウィルス（哺乳動物細胞）を含む。一般的には、ＤＮＡ　ＣＩｏｎｉ ｎ　：　ＩおよびＩ＋、同上；および５ａＩＩｌｂｒｏｏｋら、同上、を参照の こと。

ＶＰ６タンパク質のフード配列は、プロモーター、リポソーム結合部位（細菌性 発現のための）および、任意に、オペレーター（本明細書では集合名詞的に、［ 制御（ｃｏｎｔｒｏｌ）Ｊ因子に関する）の制御下に配置され得、このＶＰ６タ ンパク質をコードするＤＮＡ配列はこの発現構築物を含有する宿主細胞のＲＮＡ 中に転写される。このコード配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含 有し得るかまたは含有し得ない。細菌においては、例えば、ウィルスタンパク質 は、リーダー配列を含有するフード配列の発現によって作られることが好ましい 。そのリーダー配列は翻訳後プロセシングにより細菌性宿主に除去される。例え ば、米国特許第４．４３１．７３９号；第４．４２５．４３７号；第４．３３８ ．３９７号を参照のこと。

発現ベクターは、特定のコード配列が適切な制御配列を有するベクター中に配置 されるように構築され、制御配列に関するそのコード配列の配置および配向は、 コード配列が制御配列の［制御（ｃｏｎｔｒｏｌ）Ｊの下に転写される（例えば 、ＤＮＡ分子に制御配列で結合するＲＮＡポリメラーゼは、コード配列を転写す る）ように設定される。制御配列は、例えば上記のクローニングベクターなどの ベクター中へ挿入される前にコード配列に連結され得る。他に、コード配列は、 制御配列および適切な制限部位をすでに含有している発現ベクターの中に直接ク ローン化され得る。

多数の原核性発現ベクターが、当該分野で公知である。例えば、米国特許第４， ４４０．８５９号；　４．４３６．８１５号；　４．４３１．７４０号；４．４ ３１．７３９号；４．４２８，９４１号；　４．４２５．４３７号；４．４１８ ．１４９号；４．４１１．９９４号；　４．３６５．２４６号；　４．３４２． ８３２号を参照のこと；また、英国特許出願第ＧＢ　２．１２１．０５４号；　 ＧＢ　２，００８，１２３号；　Ｃ８２，００７，６７５号；および欧州特許出 願第１０３，３９５号を参照のこと。酵母発現ベクターもまた、当該分野で公知 である。例えば、米国特許第４．４４６．２３５号；　４．４４３，５３９号； ４．４３０，４２８号を参照のこと。

また、欧州特許出願第１０３，４０９号；　１００．５６１号：および９６，４ ９１号を参照のこと。

本発明のＶＰ６タンパク質の発現のために特に有用であるのは、昆虫細胞および これらの細胞での使用に適切なベクターである。このような系は当該分野で公知 であり、例えば、バキュロウィルス科のＡｕｔｏ紅並崩ｃａｌｉｆｏｒｎ　ｃａ 核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）から構築された昆虫の発現転換ベクターを含 む。そのような発現ベクターは、一般に、強力なウィルス性多面体（ｐｏｌｙｈ ｅｄｒｉｎ）遺伝子プロモーターを用いて異種遺伝子の発現を制御する。バキュ ロウィルスの所望の部位中に異種ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で公知であ る。　（例えば、Ｓｍ１ｔｈら、Ｍｏ１　ａｎｄ　Ｃｅ　Ｉ　Ｂｉｏｌ　（１９ ８３）　３：２１５６−２１６５：　ＬｕｃｋｏｖおよびＳｕｍｎｅｒｓ、買上 ｌ立旺（１９８９）　１７：３１；　Ｅｓｔｅｓら、Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　（１９８ ７）　６Ｊ：１４８８−１４９４、ならびに欧州特許出願第２７３．３６６号を 参照のこと。

挿入は、例えば多面体遺伝子などの遺伝子中に、同種組換えによって行われ得る 。挿入はまた、所望のバキュロウィルス遺伝子中に組み込まれた、制限酵素部位 の中に行われ得る。

シグナルペプチドをコードする配列もまた、これらの発現系において用いられ得 るこれらのペプチドが昆虫細胞によって認識され、そして発現された生産物を発 現媒体中に分泌させるからである。

発現系および選択された宿主に依存して、ウィルスタン７＜り質は、該タンパク 質が発現される条件下で上記の発現ベクターによって形質転換された、宿主細胞 を増殖させることによって生産される。タンパク質は、次に宿主細胞から単離さ れ、精製される。発現系がこのタンパク質を増殖培地中に分泌しているときは、 このタンパク質は細胞を含まない培地から直接精製され得る。このタンパク質が 分泌されない場合は、該タンパク質は細胞溶解物から単離される。適切な増殖条 件の選択および回収の方法は、当業者に公知である。

精製されたＶＰ６タンパク質は、構造多形を示す。特に、６量体および小さな６ 方品が、多（の試料中に存在する。管状の粒子は、約ｐＨ５，０と約ｐＨ９，ｏ との間で形成され、温度およびイオン強度の変化には、はぼ安定である。これら の粒子の形成は、完全に可逆的である。単膜化ウィルス（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｈｅ ｌｌｅｄ　ｖｉｒｕＳ）を再集成する球状粒子は、約ｐＨ４，０で形成され得る 。小孔格子で構成されたシート状の新規な構造は、約ｐＨ６，０から約ｐＨ４， ０に変化させる試料において形成される。これらの結果は、ロタウィルスの集成 にタンパク質−タンパク質相互作用が重要であることを証明する。

そのようなタンパク質−タンパク質相互作用は、ある腫のペプチドがモノマー形 のＶＦ６、またはインビトロで集成された管体および球体などのＶＰ６モノマー から形成された種々のオリゴマー構造のＶＦ６と結合し得るという、観察された 現象に関する。結合は、ＶＦ６中の特異的な結合部位または複数の部位によって 仲介される。

ＶＰ６タンパク質が単離、合成、もしくは組換え生産された後、未集成のタンパ ク質は所望の治療用物質と簡単な反応で組み合わされ、その物質の周囲に球状の 粒子を形成する。二般に、この反応は、球状粒子が形成されるｐＨ範囲外のｐＨ で治療用物質をＶＰ６１ｉ製物と混合する工程を含む。単膜化ウィルスに相似す る粒子を、約ｐＨ４，０またはそれ以上で形成し得る。従って、カプセル化され る物質を、約ｐ）１４．０と等しいかまたはそれ以下のｐＨでｖｐｔｇ製物に加 え得る。溶液のｐＨを次に、緩衝液交換または透析などの何らかの適切な手段を 用いて、約ｐＨ４，０かまたはそれ以上に変更する。球体外に残った物質は、い ずれも遠心分離または限外濾過などの簡単な精製技術によって球体から分離され 得る。除去された物質は、次のカプセル化操作で用いられ得る。

カプセル化された物質を特定の細胞型に送達するために、特異的な標的化物質を ＶＰ６表面に結合し得る。例えば、腫瘍細胞表面の抗原と反応し得る抗体は、Ｖ Ｐ６球体に容易に付着して、細胞障害性物質を腫瘍細胞へ直接送達し得る。さら に、ある腫のウィルス性粒子および他のタン１＜り質は、特定の細胞型および組 織形を標的とすることが知られており、そしてこれらの標的化物質はまた、ＶＰ ’６球体と結合し得る。

標的化物質は、治療用物質のカプセル化の前また（ま後１こ、化学的カップリン グの常法により、ＶＰ６球体に結合され得る。

しかしながら、ＶＰ６タン１＜り質の特別な利点は、この余力９タンパク質−タ ンパク質相互作用を用いて最小限の操作で分子の結合を促進することである。例 えば、重要な標的化物質１こ対応する合成ペプチドは、ＶＦ６に該物質を結合さ せ伺こ必要なアミノ酸配列（結合ペプチド）をもまた含有するような方法で、化 学的に合成され得る。標的化物質はまた、組換えＤＮＡ技術を使用して上記のよ うに生産され得る。その場合は、結合ペプチドに対応するヌクレオチド配列が付 加され得、得られた生産物は標的化物質と結合ペプチドとの組合せ物（融合タン パク質）である。そして、ＶＰ６担体への分子の結合は、２種の物質を混合する ことによって、さらに操作することなく、簡単に成し遂げられる。

ＶＦ６に結合するいくつかのペプチドが、発見または設計されている。その中の ２種のアミノ酸配列は：（１）ペプチドＡ（２２個のアミノ酸）　：　Ｃｙｓ− Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａ　１ａ−Ｔｙｒ−Ｌｙ　５−Ｖａ 　Ｉ−Ｇ　１ｕ−Ｔｈ　ｒ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙ　５−Ａｒ　ｇ−Ｐ　ｈｅ− Ｈｉ　ｓ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｙ−５ｅｒ−、および（２）ペプチドＢ（２５個 のアミノ酸）　：　Ｃｙｓ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｐｒ。

−Ａ　１ａ−Ｓｅｒ−１１ｅ−Ｖａ　１−Ｓｅ　ｒ−Ａ　ｒｇ−Ａｓｎ−１１ｅ −Ｖａ　ｌ　−Ｔｙ　ｒ−Ｔｈ　ｒ−Ａ　ｒｇ−Ａ　１ａ−f Ｉｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ａｌａである。

ＡおよびＢのペプチドは、いずれもロタウィルスのウィルスタンパク質４（ＶＦ ６）の一部として自然に発生し、トリプシン感受性である。これらのペプチドを トリプシンで開裂することにより、それらのＶＦ６への結合は阻止される。明ら かに、本明細書に示された配列はいずれも実施例の方法によってのみ得られる。

また、結合配列または制限された保存的アミノ酸変化が導入された配列に関連す る他の組成物も、明らかに本発明に用いられ得る。さらに他の結合ペプチドが、 本発明の開示を考慮して当業者により設計され得る。例えば、ペプチドがシステ ィンおよび正の荷電を有したアミノ酸を含み、その場合にそのようなペプチドの ３次元構造がＶＦ６に結合し得る構造である限り、ペプチドＢから得られた異な るペプチドもまた、用いられ得る。そのようなペプチドは、１９９０年３月２日 提出の同時係属出願の米国特許出願第０７／４８９．７９０号においてさらに議 論されている。

このようにして形成された、生物活性物質を含有するＶＰ６球体は、種々に用い られ得る。特に、ＶＰ６球体内にカプセル化された物質の効果および動態はイン ビトロで検討され得、治療用の使用のための系はこれらの知見に基づいて開発さ れ得る。

他の用法としては、種々の障害および疾病の治療を含む。

上述のように、サイトカインをＶＰ６球体中にカプセル化すれば、単核球および マクロファージを活性化し、免疫系を刺激し、そして細菌性、ウィルス性、寄生 虫性、および真菌性の感染を攻撃し得る。さらに、活性化されたマクロファージ はまた、腫瘍細胞の増殖を阻止し得る。この他に、細胞障害性物質をＶＰ６球体 中にカプセル化し、そして腫瘍細胞表面の抗原に指向する標的化抗体がＶＰ６球 体上に存在すれば、特定の腫瘍細胞を標的にされ得、ＶＰ６球体中に存在する細 胞障害性物質が作用し得る。さらに、上記のように、他の標的化物質を、ＶＰ６ 球体に結合し、特定の薬物を特定の細胞または組織型へ送達させ、局所的応答を 誘導し得る。

生物活性物質を含有するＶＰ６球体を、単独または組合せて処方し、薬学的組成 物を所望の宿主に送達し得る。以下の投与方式は、治療用物質を細胞混合物中の 所定の細胞群への送達、およびそれらの細胞群との組み合わせを可能にする。そ のような組成物の調製法は、当該分野で公知である。一般的に、本発明で用いら れる薬学的組成物は、注射剤として、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調 製される。調製物はまた、乳化され得る。物質をカプセル化したＶＦ６は、薬学 的に受容可能な、そして活性成分に適合する賦形剤と、混合され得る。

適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エ タノールなど、およびそれらの混合物である。この他に、必要ならば、この薬学 的組成物としては、例えば湿潤剤または乳化剤もしくはｐＨ緩衝剤のような小量 の補助的な物質を含有し得る。薬学的組成物は常法により、例えば静脈内、皮下 、筋肉内などの注射により、非経口的に投与される。注射用製剤の処方は活性成 分の有効量を含有し、正確な用量は当業者により容易に決定される。この活性成 分は注射剤組成物の約０．０１％から約９５％（ｖ／ｖ）、もしくは適切である ならばより高いかまたは低い範囲で処方され得る。

放出制御型または放出持続型の処方は当該分野で公知であり、また、本発明でも 用いられる。そのような処方は、例えば、Ｒｅｍ１ｎ　ｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍ ａｃｅｕｔ土ｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃ ｏｍｐａｎｙＳＥａｓｔｏｎ、　ＰＡ　（１９８５）に記載されている。カプセ ル化された治療用物質を有するＶＦ６は、特定の放出持続型処方と組み合わせ得 る。他の場合には、送達される治療用物質を放出制御型処方と組み合わせた後Ｖ Ｐ６球体中にカプセル化し得る。

他の投与方式として適切な他の製剤としては、半割、経口製剤および点鼻エアゾ ール剤を含む。半割としては、薬学的組成物は、ポリアルカリングリコールまた はトリグリセリドなどの、従来の結合剤および担体を含む。そのような半割は、 活性成分を約０．５％から約１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約１％から約２％の 範囲で含有する混合物から形成され得る。経口製剤は、例えば、医薬用品質のマ ンニトール、乳糖、澱粉、マグネシウム、ステアレート、サッカリンセルロース ナトリウム、炭酸マグネシウムなどの、通常使用される賦形剤を含む。これらの 経口組成物は溶液、懸濁液、錠剤、火剤、カプセル剤、持続型放出製剤、または 散剤として形成され得、約１０％から約９５％、好ましくは約２５％から約７０ ％の活性成分を含有し得る。哺乳動物を対象とする鼻内用製剤は、通常、鼻粘膜 に刺激を与えず、そして繊毛機能を破壊しない賦形剤を含む。水、生理食塩水、 または他の公知の物質のような希釈剤が、本発明に用いられ得る。鼻内用製剤は また、クロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムなどの保存剤を含有し得る が、これに限定されない。界面活性剤が、本発明のタンノくり質の鼻粘膜による 吸収を増強するために存在し得る。

さらに、ＶＦ６にカプセル化された物質は、遊離形または塩の形のいずれかで薬 学的組成物の中に処方され得る。塩が用いられる場合、最終的な調製物は一般に ０．１５Ｍより少ない量の塩を含有する。薬学的に受容可能な塩としては、酸付 加塩（活性ポリペプチドの遊離アミノ基により形成される）を含有し、そしてそ れらの塩は、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、もしくは酢酸、蓚酸、酒 石酸、マンデル酸などの有機酸を含む。遊離のカルボキシル基から形成される塩 はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、ま たは水酸化鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、 ２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロ力インなどの、有機塩基を含む 。

本発明の製剤は、投与用処方に適合した方法、および治療有効量で投与され得る 。薬学的組成物の「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ　ｅｆｆｅｃ ｔｉｖｅ　ａｍｏｕｎｔ）Ｊは、その組成物が投与される対象での特定の細胞型 においてその組成物が所望の効果を成し遂げるに充分な用量である。これらの効 果を成し遂げるに必要な用量は、本発明の開示を考慮して適切に制御された常軌 の試験を行うことにより、当業者によって決定され得る。

適切な治療群を対照群と比較することにより、特定の用量が有効であるかどうか が示される。一般に、有効な用量は投与方式に依存する。例えば筋肉内注射の場 合は、一般にｏ、　ｏｏｉμｇ／ｋｇから１０Ｍｇ／ｋｇが、本発明において有 効で有り得る。

以下は、本発明を行うための特定の実施態様の例である。

これらの実施例は、例証の目的でのみ提供され、いずれの場合にも本発明の範囲 を制限するものではない。

日の　′−において　−落着４と１圧 以下の株の生物学的に純粋な培養物を、Ａｗ＋ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ 、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤに寄託した。提示された受託番号は、良好な生存試 験の後に付され、必要な料金が支、払われた。　米国特許法施行規則第１．１４ 条および米国特許法第１２２条に基づいて特許局長により権利を付与された者は 、特許出願の係属の間中、該培養物を入手し得る。該培養物の入手における一般 公共に対するすべての制限は、本出願に基づく特許が許可されたときに変更され ずに取り除かれる。さらに、命名された寄託物はζ寄託の日付から３０年間、ま たは本寄託物に対する最後の請求の後５年間；もし。

くは米国特許権の実施可能な期間の、いずれか長い方の期間中保存される。該培 養物が死滅するかまたは不注意により破壊されたとき、または、プラスミド含有 株の場合にそのプラスミドを失ったときは、同一の分類学上の記載を有する生存 培養物と置き換えられ得る。

抹　寄１　訂旦１号 ｐＡｃ３７３ＢＲＶ６　１９８７年８月３１日　４０３６２（Ｌ並置中） Ｃ８夷豆 佳社友人話方広 酵素は市販のものを購入し、製造者の指示に従って使用した。た。放射性ヌクレ オチドおよびニトロセルロース膜もまた、市販のものを購入した。

ＤＮＡフラグメントのクローニングにおいては、特に記載しなければ、すべての ＤＮＡの操作を常法に従って行った。Ｓａｍｂｒｏ。

ｋら、前出、を参照のこと。制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｌ９ｏ１ｉ、ＤＮ Ａホ’）　）ラーセ１．Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、および他ノ生物学的試薬を 市販の供給者より購入し、製造者の指示に従って使用した。二本鎖ＤＮＡフラグ メントは、アガロースゲルによって分離した。

およびウィルス： ＭＡ１０４細胞（アフリカミドリザル）を１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を追 加したイーグルの最少必須培地（ＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔ　’ｏ ｒｉｅｓ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）中で培養した。ウシロタウィ ルス単離物Ｃ４８６は、下痢子ウシ便から従来技術に記載の方法（Ｂａｂｉｕｋ 、　Ｌ、Ａ、ら、Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　（１９７７）旦：６１０ −６１７）により培養した。ロタウィルスｃ４８６はＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌ ｌｅ、　ＭＤから、公的に入手し得る（受託番号ＶＲ−９１７）。

このウィルスを、ＦＢＳを含有しない、１ｍｌ当り１μｇのトリプシン（Ｄｉｆ ｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｌ）を含有する条件 下、集密的ＭＡ１０４細胞中で増殖した。細胞および上清をともに回収し、５０ ０ｇで２０分間遠心分離して細胞を除去した。澄明な上清液から、４０％のスク ロース−クッションを介して１００，０００ｇで１５℃で２，５時間ペレット化 することによってウィルスを濃縮しまた。ウィルスベレットを２倍量の蒸留水に 再懸濁し、ウィルスタンパク質の量を従来技術に記載のように分光光度計によっ て評価した（Ｉｊａｚ、　Ｍ、　Ｋ、ら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｒｅｓ　（１９ ８７）　ｉ＋２８３−２９８）。再懸濁したウィルスを、マイナス７０　’Ｃで 保存した。ＶＰ６キヤブシドタンパク質を、以下の実施例に述べるようにして、 この組成物から単離した。

プラークアッセイ： 感染性ロタウィルスを定量するためのプラークアッセイを、従来技術に記載の方 法に従って行った（Ａｈａ、　Ｐ、　Ｍ、および５ａｂａｒａ、　Ｍ、　１．、 Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　（１９９０）　２８＋２５−３２）。簡単に は、ＭＡ１０４細胞の集密的単層を含む１２ウエルの組織培養ブレー）　（ＮＵ ＮＣ）を、ＭＥＭ　（ＦＢＳを含まない）で２回洗浄した。それぞれのロタウィ ルス単離物の連続１ｏ回希釈液をトリプシン（Ｄｉｆｃ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｌ）を含有するＭＥＭ中で 調製し、最終濃度を１０μｇ７／ａ　ｌとした。このウィルスを３７℃で１時間 吸着した後、接種物を吸引し、細胞をＭＥＭで洗浄し、４％５ｅｐｈａｄｅｘ　 Ｇ−７５ビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含有するダルベツコの修正イーグル培 地（ＤＭＥＭ）を上にかけた。このプレートを３７℃で２日間インキコベートし 、上層を吸引し、プレートを０．５％クリスタルバイオレット／８０％メタ／− ル／　ＰＢＳで染色し、洗浄し、そしてプラークを計数した。

ウィルスタンパク質を還元性および非−還元性の両方の条件下で、１．ａｅｍｍ ｌｉによって記載された方法に従って５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した（Ｌａｅ ｗｍｌｉ、　Ｕ、に、、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７０）　２２７：６８０−６８５ ）。

ウィルス試料を、非還元性条件下で泳動するためには電気泳動試料用緩衝液（０ ，３３７Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ６，８，６％ＳＤＳ、３０％’ｌすＪｒｔ　。

−ル、０．０３％ブロモフェノールブルー）に再懸濁し、還元性条件のためには ３．７５％のメルカプトエタノール（ＢＭＥ）を加えた。

これらの試料を５から１ｏ分間煮沸し、次に、３％の積層ゲルを有する１０％の ポリアクリルアミド分析ゲル上で電気泳動して分析した。

ロ　ウィルス　ンバク　のウェス　ンブロッティング：タンパク質−特異性抗体 を、Ｔｏｖｂｉｎらによって記載されたウェスタンプｏ　’ｙティング法（Ｔｏ ｖｂｉｎ、　Ｈ，ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｅａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳＡ　（１９７ ９）　７６：４３５０−４３５４＞ｉ：よッテ検出した。１０％ポリアクリルア ミドゲル上で分離したウィルスタンパク質を、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−１９０ｍ Ｍグリシン−２０％メタノールを含有する緩衝液中テ１００ホルトで１時間の電 気プロッティングによりニトロセルロース紙（０，４５μｍ）　（ＢｉｏＲａｄ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に転移した。複製のニトロセルロース細片をアミ ドブラックで染色し、タンパク質転移の効率を測定した。

転移の後、ウィルスタンパク質と血清試料との反応を従来技術に記載のように測 定した（Ｂｒａｕｎ、　Ｄ、に、ら、ＬＬ工は（１９８３）■：１０３−１１２ ）。非−特異的反応を、３％のウシ血清アルブミ７　（ＢＳＡ）　ノＯ，ＯＩＭ 　ＴＢＳ溶液で阻止した。ＴＢＳＴＴ洗浄した後、反応液をプロティンＡ金（Ｂ ｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて１時間発色させた。発色の後 、タンパク質のバンドを銀増強剤（Ｊａｎｓｓａｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｎ、Ｖ 、、　Ｂｅｌｇｉｕｍ）で強化した。

（以下余白） 実１１１１ 天１■影匡す１限 ＶＰ６ウイルスタンパク質を、以下のように、精製ウィルスのＥＤＴＡおよびＣ ａＣｌ２あるいはＬｉＣ１いずれかによる連続的な破壊により、精製ウィルス懸 濁液（上記）から単離した。外殻キャプシドタンパク質を、５０　ｍＭ　ＥＤＴ Ａ、０．ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、、ｐＨ７，４中で、４℃にて３０分間、ウ ィルス（３■ｇ／■ｌ）をインキュベートして除去した。残りのウィルス粒子を 、超遠心分離（１００゜０００　ｘｇ、２−３時間、４℃）により回収し、０． ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，４、あるいは、０．ＯＩＭホウ酸ナトリ ウム、ｐＨ９，０中に再懸濁した。次に、それらを、０．ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ ＣＩ、　ｐＨ７，４を含む１゜５Ｍ　ＣａＣｌ２で、２０℃において２０−３０ 分間処理するか、あるいは、２Ｍ　ＬｉＣ１，０，ＯＩＭホウ酸ナトリウム、ｐ Ｈ９，０中で、−７０℃にて４日間凍結する。コアおよび非破壊粒子を、超遠心 分離により、溶解タンパク質から分離した。ＥＤＴＡおよび塩類を、他に表示が なければ、４°Ｃにて、０．０１Ｍ　Ｔｒｊｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，４に対して 十分に透析して除去した。試料の純度は、上記のように、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動（ＰＡＧＥ）により確認した。

実ＪＬ区」− 区挟人」１へＬ生 ウシロタウィルス（ＢＲＶ）からの遺伝子６個を含む、組換えＡｕｔｏｇｒａｐ ｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多面性ウィルス症ウィルス（つＡｃＮＰＶ）の 構築および５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　（ＳＦ９）細胞感染 後のＶＰ６粒子の集成は、以前に記載されている（　Ｒｅｄ＋＊ｏｎｄ、　Ｍ、 　Ｊ、ら、Ｍｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、印刷中）。簡単には、精製ウシロタウィル ス株Ｃ４８６から抽出したゲノムＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡを産生じた。この ｃＤＮＡをｐＢＲ３２２のＰｓｔ　１部位に連結し、Ｌ刈ｕ株ＤＨＩを形質転換 するのに使用した。得られたコロニーを、精製ゲノムＲＮＡセグメント６個を鋳 型として調製した、放射標識ｃＤＮＡを用いてプローブした。

遺伝子６個のＲＮＡの完全なコピーを含むクローンｐＲ６−４２を、Ａｈａ　Ｉ ＩＩで部分的に消化し、７個の５°非コーデイングヌクレオチド、および、ｃＤ ＮＡのクローニング中に加えられたオリゴ−ｄＣテールを除いた。次に、Ｂａｇ 旧リンカ−を加えた。

３°オリゴ−ｄＣテールおよび非コーディング領域を、Ａｃｅ　Ｉｆこよる消化 で除去し、ＶＰ５遺伝子から５６個の非コーディングヌクレオチドを除去する。

次に、Ｂａｍ旧リンカ−を付番す加えた。

次に、遺伝子６個のｃＤＮＡを、ノずキ二ロウイルストランスフフ・−ベクター ｐＡｃ３７３のＢａ■旧部位に連結した。このベクターを、ｐＡｃ３７３ＢＲＶ ６　（ＡＴＣＣ番号４０３Ｂ２）と命名した。次（こ、ロタウィルス遺伝子のΔ 、　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａのゲノムへの組み込みを、ＳｕＩｌｍｅｒｓ、Ｍ、 ＤおよびＳｍ１ｔｈ、　Ｇ、Ｅ、、　Ｔｅｘａｓ　Ａ　ｒｉｃｕ　ｔｕｒａｌ　 ５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　１５５５：２６−２７に概説されているよ うに、Ｓ＝、　江郷山１虹ｄａ　（ＳＦ９）細胞で相同組換えにより実施した。

組換え体を、上記のように、精製ゲノムＲＮＡセグメント６個から調製した放射 標ｍｃＤＮＡを用いたブラークツ＼イブリダイゼーションにより同定した０組換 え体をプラーク精製し、上記方法を用しＸた５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびウェス タンプロ・ノテイングにより、組換え遺伝子６個から産生されたタンパク質の発 現について分析した。

遺伝子６個を含む組換えウィルスを、ＳＦ９細胞を感染するのに使用した。２７ Ｃで７２時間インキュベートした後、細胞を、０．０５％　トリトンＸ−１００ および１ｍｌあたり０．２ユニツトのトリプシンインヒビターを含む、２　ｍｌ 　ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ７，５）中で溶解した。細胞破片をｌ５００ｇの遠 心分離により除去した。上清を０、１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３，０）に対して ２４時間透析した。このことによって、ＶＦ６の凝集体をモノマーに解離させる 。透析溶液を、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，０）に交換し、透析を２４ 時間継続した。この間に、ＶＦ６の球体が形成された。この透析緩衝液を、０． ０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，０）に交換した。次に、４°Ｃにて一夜、透析 を継続した。非凝集物質を、分子量３ｏｏ、　ｏｏｏダルトン排除フィルターを 用いた超遠心分離により、除去した。この方法により生産されたＶＰ６球体の性 質を、電子顕微鏡により決定し、そして５ＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を確証した 。

支血五１ Ａ、　ｌ々な　の　ンバク　のＶＦ６　へのカプセルｂＶＰ６粒子を、以下の改 変を伴って、実施例２に記載のように生産した。ＶＦ６　（１ｍｇ／＋ａｌ）を 含む試料１　ｍｌに対して、最終濃度０．５％ウシ血清アルブミンを含む溶液中 の、２００μｍの［”Ｃ］メチル化タンパク質分子量マーカーを、グリシンｐＨ ３，０緩衝液をクエン酸ｐＨ４，０緩衝液と交換する直前にＶＰ６調製調製物用 え、そして、プロセッシンングを継続した。ＶＦ６　（１ｍｇ／ｍｌ）ヲ含ム、 もう一つの試料１ｍｌに対して、２００μｌの［”Ｃｌメチル化タンパク質を、 ０．０１Ｍクエン酸ｐＨ４，０緩衝液中のＶＰ６調製物に加え、プロセッシング を継続した。両試料を、４０％スクロース濃度勾配の遠心分離（１００，０００ ｇ、　２時間）により精製した。’／Ｐ６粒子を含むベレットをｄｄ　８２０に 再懸濁させた。

タンパク質分析を、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジ オグラフィーにより実施した。この分析の結果は、［”ＣＩメチル化タンパク質 分子量マーカーが、球体の形成の前、すなわち、ｐＦＩ４．０透析工程で加えら れると、ＶＰ６球体内にカプセル化されることを示した。球体の形成後、すなわ ち、ｐＦＩ５．０のときにタンパク質が加えられると、［Ｉ４ｃ］メチル化タン パク質分子量マーカーの取り込みは、極ゎずがあるいは全（認められなかった。

表１ “ンバク　の　および ンバク　の。　児女よＪＩ番五皿 ミオシン　２００．０００ ホスホリラーゼ６　９７，４００ ウシ血清アルブミン　６９．０００ オボアルブミン　４６，０００ カルボニツクアンヒドラーゼ　３０．０００ゾゾチーム　１４．３００ Ｂ、　Ｌ工区１１且Ｕ 以前に記載のように、取り込み効率を、０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４，０透析 の前に、１μＣＬの［＋４ｃｌメチル化タンパク質を加え、続いて球体を形成し て、モニターした。スクロースによる遠心分離を完了し、ＶＰ６球体を含むベレ ットをｄｄ　１２０に再懸濁し、３つの同じ試料を、液体シンチレーシ薗ンカウ ンターによる放射活性量の測定にかけた。もとの試料緩衝液とスクロースとを含 む上清の一部もまた、この方法により検定した。

この結果を表２に示す。

試料　放射活性（μＣｉ）　取り込み（％）ＶＰ６粒子　０．６４　６４ スクロース および上清　０．０２　２ 示されているように、ＶＰ６粒子は、試験したタンパク質の取り込みの効率がよ かった。

支直匠土 Ａ、　えヒトガンマインターフェロンのカプセル実施例２に記載のように、ＶＰ ６球体の調製をまず行った。カプセル化のために、ｐＨ４，０緩衝液に対する透 析を、１時間後に中断し、１０６ユニットの組換えヒトガンマインターフェロン （ｒｈｕ　ＩＦＮ）　（Ｂｏｅｈｒｉ、ｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｔｍ　Ｃｏｒｐ 、）をＶＰ６調製物に加えた。次に、透析を再開し、ｐＨ４，０クエン酸緩衝液 を３回取り換え、４℃にて一夜、続けた。透析緩衝液をＯ，ＩＭクエン酸ｐｌ（ ５，０に交換し、次に、２４時間、３回緩衝液を取り換えて続ｒｈｕ　ＩＦＮを 含むＶＰ６粒子を、不連続のスクロース濃度勾配による遠心分離（４０％、６０ ％ステップ；　１００，０００ｇ、　２時間）によって、遊離のサイトカインか ら分離した。ＶＰ６粒子を含むベレットを、Ｏ，ＩＭクエン酸緩衝液ｐｌ？５． ０に再懸濁し、使用するまで−７０で凍結保存した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析では 、粒子中にｒｈｕ　ＩＦＮが示され、スクロース濃度勾配中には示されなかった 。

実１訓」− カプセル　ｒｈｕ　ＩＦＮの′および　−能ｊ１注Ａ、　ＰＢＭＬの１ ヒトＰＢＭＬを、３人の健常人ドナー、ＭＣ，ＭＲ，およびＯＨから得た。３人 のドナーからの血液を、ヘパリン含有容器に採取し、６００　Ｘ　ｇで３０分間 遠心分離して重層を得た。重層の細胞を、ハンクスの平衡塩類溶Ｈ（Ｉ（ＢＳＳ ）で１：３に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） に、濃度１．０７７　ｇ／ｃｍ３で重層して、そのチューブをａｏｏ　ｘ　ｇで ４５分間遠心分離した。界面から回収した細胞をＨＢＳＳで２回洗浄し、トリパ ンブルーで計数した。回収細胞は、９８−１００％が単核細胞であり、９７−９ ９％が生存していた。

Ｂ、　ｒｈｕ　ＩＦＮおよびＶＦ６−ｒｈｕ　ＩＦＮガンマ・　１　を゛つたＰ ＢＭＬの（１組夫グ孟ｍ化 実験を通して使用した培養培地は、１０％ＦＢＳ、　５ａｇのゲンタマイシン／ ｍｌ、および２　ｄ　Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ　１６４０テあツタ。

１つの実験では、ＰＢＭＬを、３　Ｘ　１０６細胞／ｍｌテ培養培地に懸濁した 。この細胞の２ｍｌ懸濁液を、１２ウエルの組纜培養プレートの各ウェルに分配 した。ＶＰ６カプセル化ｒｈｕ　［ＦＮガンマの活性化特性を検定するために、 精製ＶＰ６、ｒｈｕ　ＩＦＮガンマ、あるいはｒｈｕ　ＩＦＮガンマを含むＶＦ ６を、表３に示した濃度で別個のウェルに加えた。これらの培養物を、９５％空 気および５％　ＣＯ２の加湿雰囲気中で、３７℃において１８時間インキュベー トした。インキュベーション後、付着していない細胞を除去し、付着細胞をリド カイン処理（ｏ、７％リドカインで１ａ分間）により回収した。非付着および付 着細胞群をプールし、フローサイトメトリー分析用に染色して、細胞傷害性検定 に使用した。他の実験で、細胞を、別の活性化プロトコルにより、９６ウールプ レート中、濃度５　Ｘ　１０５細胞／ウールで細胞傷害性検定、ならびに、ｌ　 Ｘ　１０６細胞／ウエルでフローサイトメトリーを行った。

Ｃ０紐ｍ孜一定 マイクロ細胞傷害性検定を、９６ウエル丸底マイクロタイタープレートで３回実 施した。付着しない腫瘍標的細胞［５６２（ＡＴＣＣＣＣＬ　２４３）およびＰ ８１５　（ＡＴＣＣＴＩＢ６４）を、１０％ＦＢＳおよび１００μＣｉのＮａ２ ”Ｃｒ０ａを含む１　ｍｌのＲＰＭｉ　１６４０により、３７℃で２時間、懸濁 して標識した。両標的細胞を、ＨＢＳＳ中で３回洗浄し、２　Ｘ　ＨＢＳＳ　１ ０５細胞／ｍｌで再懸濁した。５０μｌの細胞懸濁液を、エフェクター細胞を入 れた各ウェル、および培地のみに３％トリトンＸ−１００を入れたウェルに、加 えた。培地のみを入れたウェルを、自然放出のコントロールとして使用し、界面 活性剤を入れたウェルを、放出可能な総５１Ｃｒを計算するために使用した。こ の方法で調製したマイクロタイタープレートを、９５％空気および５％ＣＯ２の 加湿雰囲気中で、３７℃において１８時間インキュベートした。インキュベーシ ョン後、上清液をＴｉｔｅｒｔｅｋ回収システム（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｓ　Ｉｎｃ 、）を用いて収集し、放出された５　１　Ｃｒを、ガンマカウンター（Ｂｅｃｋ ｍａｎｎ）で計数した。

細胞傷害性パーセントを、エフェクター細胞が存在する標的細胞（ＰＢＭＬ）に 対する溶菌量からエフェクター細胞が存在しない標的細胞に対する溶菌量を差し 引いたものと定義し、以下のように、放出された”Ｃｒ！に基づいて計算した： ％細胞傷害性＝（平均ＣＰＭ実験値−平均ＣＰＭ自然放出値）／（平均ＣＰＭ総 放出値−平均ＣＰＭ自然放出値）。従って、細胞傷害性パーセントは、試験され るリンホカインＩこよるエフェクター細胞の活性化の程度である。次に、活性化 エフェクター細胞は、試験される標的細胞を傷害する。非活性化エフェクター細 胞は、試験される標的細胞を傷害する能力を欠く。

この検定の結果は、表３および４に見られ得る。

（以下余白） 表３ □ 組ｍ ル　６　ヒ８１互 コントロール　１２．２　４．１ １Ｌ−２１０ユニットｂ１９．５　８．７ＶＰ６１：１０Ｑ　１１．４　０．８ ＶＰ６１：１０００　９．９　２．７ ＶＰ６１：１００００　１１Ｊ　２．９ＶＰ６−ｒｈｕｌＦＮ　１：１００　１ ７．７　１３．８１：１０００　１６．２　７．８ １：１００００　１０．４　８．７ ｒｈｕｌＦＮ１０００ユ＝’ｙト１７．４１２．８１００ユニツト　１３．５　 ７．２ １０ユニット１０．４７．８ ａ　細胞傷害性パーセントは、実施例５Ｃに記載のように評価した。この実験の 、エフェクター二標的細胞の比は、１゜：１であった。

ｂ　組換えヒ）ＩＬ−２を、細胞傷害性促進の正のコントロールとして使用した 。

表　４ ビ止Ｌ」 Ｏｖｓ、Ｐ８１５　” 一光−Ｊ＝−ドナーＭＲ上ｌ：ヨ■ コントロール　１．８　４．２ ＨｕｌＬ−２４７，８３０，４ ＶＰ６　５．７　３．８ ＶＰ６−ｒｈｕｌＦＮ　２８．６　１０．７ｒｈｕ　！ＦＮ　２３．６　８．６ ａ　細胞傷害性を上記のように評価した。この実験の、エフェクター：標的細胞 の比は、５０：１であった。ドナーＭＲおよびＯＲは、ヒト被検者であ７た。

示されているように、カプセル化リンホカインは、試験される標的細胞を順に傷 害するエフェクター細胞を活性化するのに有効であった。

Ｄ、　ＭＨＣクラスＩ＋　の 細胞活性化の評価および試験されるリンホカインの効果的な送達の池の方法は、 ＭＨＣクラスＩＩ表面抗原の発現を測定することによる。なぜなら、活性化細胞 は、この抗原の発現の増加を示すからである。

ＰＢＭＬ’ｉ−１直接蛍光フローサイトメトリーにより、Ｍ）ＩＣクラスＩＩ抗 原発現の表面発現について評価した。蛍光のピークの増加は、ＭＨＣクラス１１ 抗原発現が増加したことを示す。活性化および付着細胞の回収後、ＰＢＭＬを、 ＨＢＳＳで２回洗浄し、０．５トゼラチンおよび０．０２　Ｍ　ＮａＮ３を含む ＰＢＳ中に再懸濁した。ＰＢＭＬを、ＭＨＣクラス１１分子に対するＦＩＴＣ標 識モノクローナル抗体（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の存在下で、水中 で１時間インキュベートした。インキュページノン後、ＰＢＭＬを、ＰＢＳ／ゼ ラチンで３回洗浄し、０．１　Ｍ　ＰＢＳ、　ｐＨ７，１中の０．４％パラホル ムアルデヒド中で、固定した。フローサイトメトリー分析を、Ｃｏｕｌｔｅｒ　 Ｅｌｅｃｔｒｏｎｆｃｓ　Ｌｔｄ、　Ｅｐｉｃｓ　Ｖフローサイトメーターを使 用して、試料あたり５　ｘ　１０３細胞で実施した。データは、１パラメ一ター 分析での対数増幅で収集した。蛍光強度の増加は、ＭＨＣクラスＩ＋発現を促進 する別の処理プロトコルの能力を評価するために使用し、それを、与えられた試 料に対する蛍光ピークが観察されるヒストグラムチャンネルとして表した。ＭＨ ＣクラスＩＩ抗原を発現する細胞の割合は、陽性細胞のパーセントとして示した 。結果は、表５および６に示され得る。

（以下余白） 表５ ■ ＴＣ−−ＤＲいる　゛ 廷１．ｕ庄皿ｎ　ゝビークチ　ンネル コントロール　２３．９　１１０ ＶＰ６１：ＬＯＯ２１，６１２４ ＶＰ６：１　：１０００　１９．４　１０９ＶＰ６１：１００００　２０．４　 １０３ＶＰＳ−ｒｈｕｌＦＮ　１：１００　２３．２　１５７１：１０００　２ ０．９　１４５ １：１００００　１８．５　１３１ ｒｈｕｌＦＮ　１０００　ユニット　２４．８　１２８１００ユニツト　１９． ９　１１８ １０ユニツト　２３．３　１０５ （以下余白） 表６ ＣＨ−い ド＋　−瓜−に一　笈ｌ丘豊］　ｉＪ　ビークチ　ンネルＭＲコントロール　３ ０．６　９３ ＭＲＶＦ６　２９．４　１０４ ＭＲＶＦ６−ｒｈｕｌＦＮ　３２．２　１５１ＭＲｒｈｕｌＦＮ　３１．５　１ ４２ １１Ｂ　コントロール　３２．６　１０６ＨＨＶＦ６　３４．６　１１３ ＯＨＶＦ６−ｒｈｕｌＦＮ　３４．１１５９ＦＩＲｒｈｕｌＦＮ　３２．４　１ ４１表に示されているように、ピークの蛍光は、コントロールあるいはインター フェロンをカプセル化していないＶＦ６に比較して、インターフェロンをカプセ ル化したＶＦ６のグループにおいて増大した。このことは、細胞の活性化および その送達をＶＰ６球体の調製を、実施例２に記載のように行った。カプセル化す るために、ｐＨ４，０緩衝液に対する透析を１時間後に中断し、０．１ｍｇの組 換えウシＩＬ−２（ｒＢｏｌＬ−２）を、各１．０　ｍｇのＶＦ６に加えた。次 に、透析を再開し、４℃において、３回クエン酸緩衝液を交換して、９０分間続 けた。透析を、クエン酸ｐＨ５，０に交換し、緩衝液を３回交換して２４時間続 けた。

次に、　ＶＰ６粒子を、実施例４Ｂに記載のように、スクロースによる遠心分離 によって、遊離のサイトカインと分離した。カプセル化されたｒＢｏｌＬ−２の 量は、ｒＢｏｌＬ−２−ＶＰ６試料および定量されたｒＢｏｌＬ−２に対するウ ェスタンブロッティング、ならびに、ＩＬ−２特異抗血清によるブロービング、 その後のプロティンＡ−金を使用した抗体結合の視覚化により、評価した。次に 、プロットを走査し、カプセル化されたｒＢｏｌＬ−２の量をｒＢｏｌＬ−２標 準と比較して評価した。

実１１列ｊ− えウシＩＬ−２の°°および　。

Ａ、ウシ　゛か゛の　の ウシＰＢＭＬを、正常ウシドナーから得た。血液をヘパリン含有チューブに採取 し、６００　Ｋ　ｇで３０分間遠心分離して、重層を得た。重層細胞を、ハンク スの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で１：３に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕ ｅに、濃度１．０７７　ｇ／ｃｍ３で重層して、そのチューブを８００　Ｘ　ｇ で４５分間遠心分離した。界面から回収した細胞をＨＢＳＳで２回洗浄し、トリ パンブルーで計数した。回収細胞は、典型的には９８−１００％が単核細胞であ り、９７−９９％が生込五註北 実験を通して使用した培養培地は、１０％ＦＢＳ、　５　ｕｇゼラチン／曹ｌ、 および２璽ＭＬ−グルタミンを補充したＲＰＭｌ　１６４０であった。

ＰＢＭＬを、最初の濃度２　ｘ　１０６細胞／１で培地に再懸濁し、その一部１ ００ｕｌを９６ウ工ル組織培養プレートに分配した。次に、細胞を、表７に示す ように、定量されたｒＢｏｌＬ−２ＳＩ／Ｐ６−ｒＢｏｌＬ−Ｚ。

ＶＦ６、あるいは、培地コントロールの存在下に、７２時間インキュベートした 。各試料を３つのウェルに再懸濁した。７２時間後、トリチウム標識チミジンを 全てのウェルに加え、１６時間インキュベーションを続けた。このときに、細胞 を回収し、放射標識の取り込みを評価した。全ての結果は、３つのウェルの平均 であり、以下の式に従った増加指数として表す。

（試験ＣＰＭ）　／　（培地コントロールＣＰＭ）この実験の結果は、ｒＢｏｌ Ｌ−２をカプセル化したＶＦ６が生物学的に活性であるだけではなく、遊離ｒＢ ｏｌＬ−２に一致するインビトロ投与量応答曲線をつくることを示す。

（以下余白） 駄　７ ｒＢｏ工Ｌ−２コシドロー１し　ＣＰＭＬＯＯＯｎｇ　３９２４７ １１１　立６９０１ ０．４６　８８６６ ０．１５　５２８１ ｒＢｏ工ｌ−２−Ｗ６　ＣＰＭ ２０００ｎｇ　２５３２２ ５０　１’１９９ １２．５　９５５２ ６．２５　５２０７ ３．１　３３３０ ０．７８　１７６１ ０．３９　１２６８ ＶＰ６　ｚ＞トｏ−ＩＬ　ＣＰＭ ｌｏｕｌ　１０３５ 培峻　１４９４ ０３Ｂ 従って、ＶＦ６にカプセル化された生物活性物質の生産が、開示されている。本 発明の好ましい実施態様がいくらか詳細に記載されているが、添付の請求項によ り限定される趣旨および意図する範囲から逸脱することなく明白な改変がなされ 得ることは理解される。

国際調査報告 国際調査報告 ＣＡ　９２０００２９ ＳＡ　５５６１２

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．標的物に生物活性物質を送達し得る組成物であって、該組成物が、ＶＰ６タ ンパク質球体中にカプセル化された該生物活性物質を含有する、組成物。
2. ２．前記ＶＰ６球体の表面に標的化物質をさらに含有する、請求項１に記載の組 成物。
3. ３．前記生物活性物質が、少なくとも約２００ダルトンの分子量を有する、請求 項１に記載の組成物。
4. ４．前記生物活性物質が、少なくとも約１０，０００ダルトンの分子量を有する 、請求項３に記載の組成物。
5. ５．前記生物活性物質が、インターフェロンガンマである、請求項４に記載の組 成物。
6. ６．前記生物活性物質が、インターロイキン−２である、請求項４に記載の組成 物。
7. ７．ＶＰ６タンパク質球体中に生物活性物質をカプセル化するための方法であっ て、 （ａ）集成されていないＶＰ６タンパク質を該生物活性物質と混合する、工程； および、 （ｂ）集成されたＶＰ６タンパク質球体を形成することにより、該生物活性物質 をカプセル化する、工程；を包含する、方法。
8. ８．前記生物活性物質が、少なくとも約２００ダルトンの分子量を有する、請求 項７に記載の組成物。
9. ９．前記生物活性物質が、約１０，０００と３００，０００ダルトンとの間の分 子量を有する、請求項８に記載の組成物。
10. １０．前記生物活性物質が、インターフェロンガンマである、請求項９に記載の 組成物。
11. １１．前記生物活性物質が、インターロイキン−２である、請求項９に記載の組 成物。
12. １２．細胞混合物中の所定の細胞群に、生物活性物質を送達する方法であって、 該方法が、該細胞混合物と請求項１に記載の組成物とを組み合わせる工程を包含 する、方法。
13. １３．細胞混合物中の所定の細胞群に、生物活性物質を送達する方法であって、 該方法が、該細胞混合物と請求項２に記載の組成物とを組み合わせる工程を包含 する、方法。
14. １４．前記所定の細胞群が、造血細胞免疫系の細胞である、請求項１２に記載の 方法。
15. １５．前記所定の細胞群が、単核細胞である、請求項１２に記載の方法。
16. １６．前記所定の細胞群が、マクロファージである、請求項１２に記載の方法。
17. １７．前記所定の細胞群が、腫瘍細胞である、請求項１３に記載の方法。