CN110638787A - 一种防治鼻咽癌的亚单位纳米疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种防治鼻咽癌的亚单位纳米疫苗及其制备方法。具体公开了一种纳米颗粒，其包含EBNA1△GA蛋白、免疫佐剂、泊洛沙姆和多酚物质，所述EBNA1△GA蛋白为删除了EBNA1蛋白中的甘氨酸‑丙氨酸重复序列得到的重组蛋白。本发明还公开了制备所述纳米颗粒的方法；本发明制备得到的纳米颗粒形态规则、外形圆整、表面光滑、分散性好，无明显粘连、破损、坍塌等现象；纳米颗粒中EBNA1△GA蛋白和免疫佐剂具有较高的包封率；所述纳米颗粒施用于动物后，能产生较强的体液免疫，使细胞免疫明显增强，在小鼠皮下肿瘤模型的预防和治疗效果优于游离形式的抗原/佐剂混合注射以及现有的含铝佐剂的疫苗，具有较大的应用前景。

Description

一种防治鼻咽癌的亚单位纳米疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种防治鼻咽癌的亚单位纳米疫苗，其包含EBV核抗原EBNA1蛋白、免疫佐剂、药用辅料聚合物和多酚类，所述免疫佐剂选自CpG或IFN-α。本发明还涉及鼠源化的稳定表达特异性抗原鼻咽癌细胞的构建方法，制备所述纳米疫苗的方法，所述纳米疫苗用于预防或治疗在小鼠体小鼠模型对纳米疫苗的免疫应答。
背景技术
EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)属于人类γ疱疹病毒，它在人类广泛传播，大约95％的成人终生携带EBV。EB病毒的隐性感染与人类多种恶性肿瘤密切相关，如非洲儿童Burkitt's淋巴瘤(BL)、鼻咽癌(NPC)、何杰金氏病(HD)以及各种免疫抑制病人和移植病人的淋巴细胞增生紊乱引起的淋巴瘤(PTLD)等。其中鼻咽癌是一种在我国广东及东南亚地区常见的恶性肿瘤，鼻咽癌患者临床主要表现为鼻塞、涕中带血、听力下降、耳闷、复视及头痛等。临床主要治疗方法有传统的放射治疗，化学药物治疗，化学药物和放射联合治疗，手术治疗，以干扰素为主的免疫治疗。EBV侵染人体主要分为两个时期：1、溶解性感染期；2、潜伏感染期。其中溶解感染期主要表达早期抗原(EA)，衣壳抗原(VCA)，膜抗原(MA)。潜伏感染期主要表达核抗原、潜伏膜抗原，其中核抗原主要有EBNA1，EBNA2，EBNA-LP，EBNA-3A，EBNA-3B，EBNA-3C。潜伏膜抗原主要有LMP-1，LMP-2A，LMP-2B。临床检测发现EBV初次感染病人体内VCA IgG滴度在4个月内逐渐升高并后期趋于平稳并持续表达，另外EBNA1 IgG会在60天开始出现并于6个月后出现持续平稳表达。
自然情况下肿瘤的发生及相关免疫主要是通过肿瘤抗原释放后被抗原递呈细胞(antigen-presenting cells，APCs)呈递给T细胞并激活T细胞，激活的T细胞继而通过迁移、浸润到肿瘤部位进行特异性杀伤肿瘤细胞。但自然过程中肿瘤的爆发式生长及免疫系统激活的效率低，而通过纳米递送系统有效地，同时递送抗原和佐剂将会大大提高特异性免疫，增强对肿瘤细胞的杀伤效率。
传统的灭活或者减活疫苗的安全以及其引起的全身性免疫风暴在很多疫苗体系中无法避免。但随着现代分子生物学及生物化学的发展，亚单位蛋白疫苗及多肽疫苗的优势及应用得到广泛肯定。利用纳米疫苗的尺寸优势以及淋巴靶向的特点，共递送抗原及佐剂将会更有效的激活T细胞和B细胞，增强免疫效果。
EBV在宿主细胞进入潜伏感染后将会持续表达EB病毒核抗原1(EBNA1，Epstein-Barr Nuclear Antigen 1)，针对EBNA1的抗肿瘤疫苗是当前研究领域的热点，专利CN201310676489.X、CN201310588797.7和CN201410817936.3等均公开了包含EB病毒EBNA1蛋白的疫苗，但是，天然EBNA1蛋白其免疫原性较弱，单独使用往往不能引起有效的免疫效果，而且EBNA1中的甘氨酸-丙氨酸(GA)重复序列会抑制抗原的泛素化过程，从而抑制抗原的呈递。因此，设计针对EBNA1蛋白新抗原表位，且能够同时引起体液免疫和细胞免疫的新型EBV纳米疫苗势在必行。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种纳米颗粒。
本发明的另一目的在于提供所述纳米颗粒的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述的纳米颗粒的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种纳米颗粒，包含EBNA1△GA蛋白、免疫佐剂、泊洛沙姆和多酚物质；所述EBNA1△GA蛋白为删除了EBNA1蛋白中的甘氨酸-丙氨酸重复序列得到的重组蛋白。
EB病毒侵染人宿主细胞进入潜伏期后，EBNA1蛋白是主要的表达抗原，但是，其免疫原性较弱，单独使用往往不能引起有效的免疫效果，而且EBNA1中的甘氨酸-丙氨酸(GA)重复序列会抑制抗原的泛素化过程，从而抑制抗原的呈递。本发明通过删除EBNA1全长片段中甘氨酸-丙氨酸(GA：92～327aa)重复序列进行体外重组表达得到的蛋白EBNA1△GA，设计得到EBNA1蛋白新抗原表位，以EBNA1△GA蛋白作为疫苗的抗原。本发明通过多酚物质和泊洛沙姆氢键络和作用，对EBNA1△GA蛋白和特定的免疫佐剂进行包裹，形成含有EBNA1△GA蛋白和特定免疫佐剂的纳米颗粒，相比于单独的EBNA1△GA蛋白及天然的EBNA1蛋白，本发明的纳米颗粒能够产生更优的免疫效果。
所述“包裹”并不限于将EBNA1△GA蛋白和免疫佐剂完全置于纳米颗粒的内部。本发明的纳米颗粒中，EBNA1△GA蛋白和免疫佐剂可以全部位于纳米颗粒内部，也可以部分位于纳米颗粒表面。
优选地，所述纳米颗粒为核壳结构，核为EBNA1△GA蛋白和免疫佐剂，壳为包裹在核上的泊洛沙姆和多酚物质。
优选地，所述免疫佐剂选自IFN-α、CpG、咪喹莫特和poly(I:C)中的一种或多种。本发明的纳米颗粒能够在动物体内产生较强的体液免疫和细胞免疫明显增强，并能引起一定的局部粘膜免疫，免疫效果优于常规的含铝佐剂的疫苗。
优选地，所述EBNA1△GA蛋白是EBV(B95-8)的EBNA1△GA蛋白。
优选地，所述EBNA1△GA蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
优选地，所述免疫佐剂为IFN-α或CpG。
优选地，所述CpG为CpG-ODN。
优选地，所述CpG-ODN具有如SEQ ID NO:2所示的核酸序列。
优选地，优选地，所述的泊洛沙姆选泊洛沙姆407、泊洛沙姆124、泊洛沙姆338，泊洛沙姆188中的一种或多种。
优选地，所述泊洛沙姆泊洛沙姆407(PF-127)。
优选地，所述多酚物质选自单宁酸(TA)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、儿茶酸中的一种或多种。
更优选地，所述的多酚物质是单宁酸(TA)。
本发明所述纳米颗粒为近似球形；优选地，所述纳米颗粒的粒径为50～200nm，例如50～80nm、80～100nm、100～150nm或150～200nm。
优选地，所述纳米颗粒的Zeta电位为(-25)～(-10)mV，例如(-25)～(-20)mV、(-20)～(-15)mV、(-15)～(-10)mV。
优选地，所述纳米颗粒中，EBNA1△GA蛋白的包封率为90％-100％，例如90％～95％或95％～100％。
优选地，所述纳米颗粒中，免疫佐剂的包封率为90％～100％，例如90％～95％或95％～100％。
优选地，所述EBNA1△GA蛋白：免疫佐剂：泊洛沙姆：多酚物质的质量比10～11：4～5：42～48：28～32。
优选地，当佐剂为CpG时，EBNA1△GA蛋白：免疫佐剂：泊洛沙姆：多酚的质量比为5:2:21:14；当佐剂为IFN-α时，和EBNA1△GA蛋白：免疫佐剂：泊洛沙姆：多酚的质量比为11:5:48:32。
本发明还提供上述纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
S1.提供包含泊洛沙姆的溶液、包含多酚物质的溶液、包含EBNA1△GA蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液；
S2.将包含泊洛沙姆的溶液、包含多酚物质的溶液、包含EBNA1△GA蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液分别通过第一通道、第二通道、第三通道和第四通道到达混合区域中，进行混合，得到纳米颗粒溶液。
优选地，当佐剂为IFN-α时，包含泊洛沙姆的溶液与包含IFN-α以及EBNA1△GA蛋白的溶液混合通过第一通道、多酚的溶液单独通道第二通道、纯水通过第三和第四通道，且各通道流速相同。
优选地，当佐剂为CpG时，包含泊洛沙姆的溶液与包含IEBNA1△GA蛋白的溶液混合后通过第一通道，多酚的溶液通过第二通道，CpG溶液经过第三通道，纯水通过第四通道，且各通道中的流速相同。
优选地，所述各通道的流速相同，为1～20mL/min。
更优选地，包含泊洛沙姆的溶液与包含IFN-α以及EBNA1△GA蛋白的溶液、包含多酚的溶液、包含CpG溶液和纯水在通道中的流速均为10mL/min。
优选地，所述包含EBNA1△GA蛋白的溶液的pH＝4.1。
优选地，所述方法还包括步骤S3：对包含纳米颗粒的溶液进行冻干浓缩，例如通过添加冻干保护剂进行冻干浓缩。
优选地，包含泊洛沙姆的溶液、包含多酚的溶液、包含EBNA1△GA蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液的浓度比为0.1～1mg/mL：0.1～0.6mg/mL：0.1～0.5mg/mL：50～100μg/mL。
优选地，所述步骤S1中，包含泊洛沙姆的溶液为水溶液。
优选地，所述步骤S1中，包含多酚的溶液为水溶液。
优选地，所述步骤S1中，包含EBNA1△GA蛋白的溶液为水溶液。
优选地，所述步骤S1中，包含免疫佐剂的溶液为水溶液。
优选地，包含EBNA1△GA蛋白的溶液可能使用盐酸调整pH。
再一方面，本发明还提供构建用于评价本发明的纳米颗粒的稳定表达EBNA1鼠源上皮细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
S1.利用EcoRI和BamHI位点构建包含EBNA1全长序列的载体质粒pBABE-Puro-EBNA1；
S2.使用步骤1中构建载体质粒pBABE-Puro-EBNA1和pBABE-Puro-EBNA1-EGFP，配合包装质粒pVSVG，phit60。pBABE-Puro-EBNA1或pBABE-Puro-EBNA1-EGFP：pVSVG：phit60的质量比为1:1:1，2:2:3或者3:2:2。借助转染试剂lipo2000，瞬时转染293T细胞转染48小时进行病毒包装，并于36h，48h或者72h小时收集慢病毒。
S3.使用收集的慢病毒侵染小鼠肺上皮细胞(TC1)，并于48小时后更换含有2μg/mL，4μg/mL，6μg/mL，8μg/mL的嘌呤霉素进行加压筛选一个月，挑取成功存活的单克隆细胞群(EBNA1-TC1)。
S4.搜集EBNA1-TC1，并应用western blotting或者PCR鉴定EBNA1的表达情况。
优选地，构建pBABE-Puro-EBNA1的同时也构建了融合表达EGFP的质粒pBABE-Puro-EBNA1-EGFP。
优选地，pBABE-Puro-EBNA1或pBABE-Puro-EBNA1-EGFP：pVSVG：phit60的质量比为2:2:3.
优选地，收集病毒时间为48小时。
优选地，嘌呤霉素的筛选浓度为4μg/mL。
本发明的纳米颗粒能够引起免疫应答，因此，本发明请求保护所述的纳米颗粒在在制备与EBV感染相关的疾病的免疫原性组合物中的应用。
优选地，所述与EBV感染相关的疾为传染性单核细胞增多症，Burkitt淋巴瘤，Hodgkin’s淋巴瘤，鼻咽癌或胃癌中的一种或多种。
本发明还提供一种免疫原性组合物，所述组合物包含本发明的纳米颗粒。
优选地，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的辅料，例如赋形剂、防腐剂、抗菌剂和/或额外的免疫佐剂。
优选地，所述免疫原性组合物为疫苗。
优选地，所述免疫原性组合物还包含第二免疫原性物质。例如，所述免疫原性组合物还包含除EBNA1△GA蛋白以外的EBV的其他潜伏蛋白。例如，所述免疫原性组合物还包含灭活和减活EBV。例如，所述免疫原性组合物还包含EBV以外的其他致病微生物(包括活的、灭活的或减毒的)。例如，所述免疫原性组合物还包含EBV以外的其他致病微生物的部分。
优选地，所述免疫原性组合物还包含现有已知用于治疗与EBV感染相关的疾病的物质。例如：anti-PD-L1。
另一个方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗受试者中与EBV感染相关的疾病的方法，包括给受试者施用本发明的纳米颗粒或免疫原性组合物(例如疫苗)。
优选地，所述与EBV感染相关的疾病为鼻咽癌。
优选地，所述受试者为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，所述受试者C57BL/6小鼠。
在一个方面，本发明还提供所述纳米颗粒或免疫原性组合物(例如疫苗)用于引发或增强受试者对EBNA1阳性皮下瘤细胞抑制的用途。
优选地，所述受试者为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，所述受试者为C57BL/6小鼠。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明以改造过的EBNA1△GA蛋白病毒亚单位蛋白为疫苗抗原来制备纳米疫苗，制备得到的纳米颗粒形态规则、外形圆整、表面光滑、分散性好，无明显粘连、破损、坍塌等现象；
(2)本发明的纳米颗粒中，EBNA1△GA蛋白和免疫佐剂具有较高的包封率；
(3)本发明的纳米颗粒施用于动物后，能产生较强的体液免疫，使细胞免疫明显增强，在小鼠皮下肿瘤模型的预防和治疗效果优于游离形式的抗原/佐剂混合注射以及现有的含铝佐剂的疫苗；
(4)本发明的纳米颗粒能够通过简单的方法连续制备，品质稳定，易于产业化生产。
附图说明
图1为实施例1制备纳米颗粒的方法中的步骤2的示例性描述。
图2为实施例1制得的纳米颗粒的形态。A为包裹EBNA1△GA蛋白和CpG的PF-127-单宁酸纳米颗粒在透射电镜下的形态；B为包裹EBNA1△GA蛋白和IFN-α的PF-127-单宁酸纳米颗粒在透射电镜下的形态。如图所示，两种纳米颗粒形态规则、外形圆整、表面光滑、分散性好，无明显粘连、破损、坍塌等现象。
图3为实施例1的粒径测试结果。A为包裹EBNA1△GA蛋白和CpG的PF-127-单宁酸纳米颗粒的粒径分布图；B为包裹EBNA1△GA蛋白和IFN-α的PF-127-单宁酸纳米颗粒的粒径分布图。如图所示，两种纳米颗粒均具有较窄的粒径分布，粒径分布对称。
图4为实施例3鼠源化的稳定表达EBNA1抗原鼻咽癌细胞的构建步骤。A为使用载体质粒pBABE-Puro-EBNA1携载EBNA1和EBNA1-EGFP；B为荧光显微镜观察显示pBABE-Puro-EBNA1-EGFP可以成功表达目的蛋白；C为单克隆E2细胞群的mRNA水平；D为单克隆E2细胞群的western blotting实验，显示构建的EBNA1-TC1成功表达EBNA1蛋白。
图5为实施例4中对小鼠进行第一次免疫后的第28天各组小鼠血清中IgG的滴度(图5A)、IgG1的滴度(图5B)、IgG2c的滴度(图5C)、IgG2c/IgG1的比例(图5D)。
图6为用抗原刺激各组小鼠免疫后的CD4+和CD8+淋巴T细胞内IFN-γ和TNF-α的表达量。结果显示，F组(施予PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒)的IFN-γ和TNF-α的表达量与G组(施予PBS的阴性对照)相比有显著差异。实验结果表明，本发明的纳米颗粒(施予PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒)对小鼠免疫后，能够增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ和TNF-α的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
图7为本发明纳米疫苗对肿瘤预防评估，注射各组疫苗后接种肿瘤细胞的小鼠肿瘤生长情况。结果显示，F组(施予PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒)的小鼠有7只肿瘤完全被抑制。其次是D组(施予PF-127+EBNA1△GA+IFN-α+TA纳米颗粒)组有三只肿瘤完全抑制的小鼠。
图8为本发明纳米疫苗对肿瘤免疫联合治疗评估结果。与A组相比，施予anti-PD-L1和PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒联合治疗效果最好，同时与C组也有显著差异。其次是B组也显示了很好的肿瘤抑制效果。C组PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒与A组相比也显示了很好的肿瘤抑制特性。实验结果表明，本发明的纳米颗粒联合使用anti-PD-L1抗体显示了很好的肿瘤抑制特性。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 EBNA1△GA蛋白的制备
参照人伽玛疱疹病毒4株B95-8野生型EBNA1核抗原蛋白的氨基酸序列(NCBI数据库登录号：YP_401677.1)；
(1)合成截去全长EBNA1的92～327位序列的目的基因片段，C-段融合6x组氨酸标签和终止密码子。
(2)将合成的基因片段以Ndel和Hind III为位点亚克隆到为原核表达载体pET30a上，并转化至BL21(DE3)菌种。
(3)含卡那霉素的TB培养基中，37℃摇床培养，当OD600达到1.2左右，加入IPTG，37℃继续刺激培养4小时。
(4)离心收菌，加入溶解缓冲液和超声辅助破菌，离心留上清，加入盐酸胍使目标蛋白变性。
(5)镍亲和层析法分离目标蛋白，0.22μm过滤，储存。Western blotting鉴定表达准确性。结果显示，成功获得了删除EBNA1全长片段中甘氨酸-丙氨酸(GA：92-327aa)重复序列的EBNA1△GA蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例2纳米颗粒的制备
一、纳米颗粒制备
1、试剂：EBNA1△GA蛋白由大肠杆菌表达系统表达产生，再经过溶解和复性而获得，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
CpG ODN1826为商购，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
其他试剂均为商购。
2、制备过程：
(1)将PF-127(平均分子量12.6KDa)溶解于超纯水中，在磁力搅拌下溶解得到PF-127为0.3mg/mL。
(2)将单宁酸(TA)分散于超纯水中，磁力搅拌下得到TA浓度为0.2mg/mL。
(3)将EBNA1△GA蛋白溶解于超纯水中，用1M的盐酸调节pH为4.1，得到EBNA1△GA蛋白的浓度为71.43μg/mL。
(4)将CpG ODN1826溶解于超纯水中，磁力搅拌下得到CpG溶液，CpG浓度为31.37μg/mL。
(5)将PF-127+EBNA1△GA蛋白溶液、TA溶液和CpG溶液，超纯水分别装入四支注射器中，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器分别通过1～4通道。各个通道内的溶液的体积均为12mL(上述操作示意图如图1右图所示)。
(5)开启高压泵，使PF-127+EBNA1△GA蛋白溶液、TA溶液、CpG溶液和超纯水同时以10mL/min的流速经1～4通道得到溶液纳米粒子悬浮液A。
(6)将获得的纳米粒子悬浮液，加入6％海藻糖，真空冻干48小时，获得包裹EBNA1△GA蛋白和CpG的PF-127-TA纳米颗粒的溶液(命名为PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒溶液)。
3、将IFN-α溶解于超纯水中，磁力搅拌下得到IFN-α溶液，IFN-α的浓度为28.57μg/mL。大概按照步骤(1)～(6)的操作和参数，将CpG溶液换为IFN-α溶液，不同的是将PF-127、EBNA1△GA和IFN-α混合通过同一通道，第二通道为TA，第三、第四通道为超纯水制备得到包裹EBNA1△GA和IFN-α的PF-127-TA纳米颗粒的溶液(命名为PF-127+EBNA1△GA+IFN-α+TA纳米颗粒溶液)(上述操作示意图如图1左图所示)。
4、参照步骤(1)～(6)的操作和参数，仅使用PF-127和TA溶液，制备不含抗原和免疫佐剂的PF-127-TA纳米颗粒的溶液(命名为PF-127+TA纳米颗粒溶液)，用于对照实验。
5、参照步骤(1)～(6)的操作和参数，使用PF-127和TA溶液和EBNA1△GA蛋白溶液，制备包裹EBNA1△GA蛋白、不含免疫佐剂的PF-127-TA纳米颗粒的溶液(命名为PF-127+EBNA1△GA+TA纳米颗粒溶液)，用于对照实验。
二、纳米颗粒的形态表征、粒径测试和电位测试
1、形态表征
使用透射电镜观察包裹EBNA1△GA蛋白和CpG的PF-127-TA纳米颗粒，以及包裹EBNA1△GA蛋白和IFN-α的PF-127-TA纳米颗粒，两种纳米颗粒的形态分别如图3A和3B所示。
如图所示，两种纳米颗粒形态规则、外形圆整、表面光滑、分散性好，无明显粘连、破损、坍塌等现象。
2、粒径测试和Zeta电位测试：
利用马尔文粒径仪(带有动态光散射检测器)对包裹EBNA1△GA蛋白和CpG的PF-127-TA米颗粒，以及包裹EBNA1△GA蛋白和IFN-α的PF-127-TA纳米颗粒的平均粒径和Zeta电位进行测试，结果如表2所示。
表2
测试样品 平均粒径 Zeta电位
PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒溶液 98nm -22.2mV
PF-127+EBNA1△GA+IFN-α+TA纳米颗粒溶液 89nm -21.2mV
图4A和4B分别为包裹EBNA1△GA蛋白和CpG的PF-127-TA纳米颗粒，以及包裹EBNA1△GA蛋白和IFN-α的PF-127-TA纳米颗粒的粒径分布图。如图所示，两种纳米颗粒均具有较窄的粒径分布，粒径分布对称。
三、纳米颗粒中EBNA1△GA蛋白和免疫佐剂的包封率的计算
1、取5mL PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒溶液到300k的超滤管中，在4℃、3000rpm条件下离心30min，取下面滤出液，采用Bradford蛋白检测试剂盒，检测下面滤出液中游离EBNA1△GA蛋白的含量，按照如下公式计算纳米颗粒中EBNA1△GA蛋白的包封率。
EBNA1△GA蛋白的包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的EBNA1△GA蛋白的总量；w1为下面滤出液中游离的EBNA1△GA蛋白的总量。
2、取PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒溶液，在4℃、3000rpm条件下离心30min，取下面滤出液，采用Quant-iTTMOliGreenTMssDNA检测试剂盒，检测下面滤出液中游离CPG的含量CpG的含量，按照如下公式计算纳米颗粒中CpG的包封率：
CpG的包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的CpG的总量；w1为下面滤出液中游离的CpG的总量。
3、首先将EBNA1△GA用荧光染料RITC标记，IFN-α用荧光染料FITC标记，然后按照相同方法制备PF-127+EBNA1△GA+IFN-α+TA纳米颗粒，取PF-127+EBNA1△GA+IFN-α+TA纳米颗粒溶液，在4℃、3000rpm条件下离心30min，取下面滤出液，采用荧光分光光度计检测下面滤出液中游离EBNA1△GA蛋白的含量，按照如下公式计算纳米颗粒中EBNA1△GA蛋白的包封率：
EBNA1△GA蛋白的包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的EBNA1△GA蛋白的总量；w1为上清中游离的EBNA1△GA蛋白的总量。
4、参照步骤3，采用荧光分光光度计检测下面滤出液中游离IFN-α的含量，按照如下公式计算纳米颗粒中IFN-α蛋白的包封率：
IFN-α的包封率＝w0-w1/w0×100％，其中w0为加入的IFN-α的总量；w1为上清中游离的IFN-α的总量。
包封率的测定结果如表3所示。
表3
Figure BDA0002151428520000111
从表3的结果可以看出，本发明的上述两种纳米颗粒中，EBNA1△GA蛋白的包封率和免疫佐剂的包封率均较高，有利于纳米颗粒引起强的免疫效果。
实施例3鼠源化的稳定表达EBNA1抗原鼻咽癌细胞的构建
1、试剂：载体质粒pBABE-Puro，包装质粒pVSVG,phit60为实验室原有。转染试剂lipo2000，嘌呤霉素均为商购。
2、构建过程：
(1)利用EcoRI和BamHI位点构建包含EBNA1全长序列的载体质粒pBABE-Puro-EBNA1和EBAN1融合了绿色荧光蛋白的载体质粒pBABE-Puro-EBNA1-EGFP。
(2)使用pBABE-Puro-EBNA1-EGFP质粒，用lipo2000瞬时转染293T细胞，24小时后荧光显微镜观察显示EGFP表达情况。
(3)使用步骤1中构建载体质粒pBABE-Puro-EBNA1，配合包装质粒pVSVG,phit60。pBABE-Puro-EBNA1或pBABE-Puro-EBNA1-EGFP：pVSVG：phit60的质量比为1:1:1，2:2:3或者3:2:2。借助转染试剂lipo2000，瞬时转染293T细胞转染48小时进行病毒包装，并于36h，48h或者72h小时收集慢病毒。
(4)使用收集的慢病毒侵染小鼠肺上皮细胞(TC1)，并于48小时后更换含有2μg/mL,4μg/mL,6μg/mL,8μg/mL的嘌呤霉素进行加压筛选一个月，挑取成功存活的单克隆细胞群(EBNA1-TC1)。
(5)搜集EBNA1-TC1，并应用western blotting和RT-qPCR鉴定EBNA1的表达情况。
图2为上述细胞的构建方法步骤，如图2A所示，使用载体质粒pBABE-Puro-EBNA1携载EBNA1和EBNA1-EGFP。荧光显微镜观察显示pBABE-Puro-EBNA1-EGFP可以成功表达目的蛋白(图2B)；单克隆E2细胞群的mRNA水平最高(图2C)；单克隆E2细胞群的western blotting实验显示构建的EBNA1-TC1成功表达EBNA1蛋白(图2D)。
实施例4纳米颗粒在C57BL/6小鼠体内的免疫效果评价
1、免疫方式
将5～8周雌性C57BL/6小鼠分为A、B、C、D、E、F六组，每组9只。采用尾根部皮下注射方式，按照表4中的免疫方案对小鼠进行免疫，并两周加强免疫一次，再间隔一周再次加强免疫一次，共免疫3次。
表4
Figure BDA0002151428520000121
Figure BDA0002151428520000131
2、免疫效果评价
(1)小鼠血清中IgG检测
分别在第一次免疫后的第7、14、28、42天进行眼眶采血，分离血清，Elisa检测血清中IgG的滴度。
检测过程：
1)将5μg/mL的EBNA1△GA抗原包被在96孔板中，每孔100μL，4℃过夜包被。
2)过夜包被的板，用PBST洗3次，每次200μL，用3％BSA在37℃封闭2h。
3)取2μL免疫血清或阴性对照血清，稀释至200μL，再依次倍比稀释，加入到包被抗原的孔中，室温下孵育2h。
4)清洗5次，加工作浓度的IgG-HRP，每孔100μL，室温孵育2h。
5)清洗5次，每孔加100μL TMB底物，黑暗下孵育20min，用200μL 2M H2S04终止反应，450nm处检测OD值。
6)计算滴度，若标本孔的平均吸收值(P)与阴性对照(A组)平均吸收值(N)的比值(即P/N)大于2.1，则判定标本孔为阳性。
检测结果如图5A～5D所示。
图5A显示了第一次免疫后的第28天，各组小鼠的血清中IgG的滴度。结果显示，F组(施予PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒)小鼠的血清IgG滴度高于E组，对应D组(施予PF-127+EBNA1△GA+IFN-α+TA纳米颗粒)高于E组并且具有显著性差异(P＜0.05)。
图5B显示了第二次免疫后的第28天，各组小鼠的血清中IgG1的滴度。结果显示，D组(施予PF-127+EBNA1△GA+IFN-α+TA纳米颗粒)小鼠的血清IgG滴度均高于F组(施予PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒)。并且具有极显著差异(P＜0.01)。
图5C显示了第三次免疫后的第28天，各组小鼠的血清中IgG2c的滴度。结果显示，F组(施予PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒)小鼠的血清IgG2c滴度明显高于D组(施予PF-127+EBNA1△GA+IFN-α+TA纳米颗粒)，并且均有极显著差异(P<0.001)。
图5D显示了第三次免疫后的第28天，各组小鼠的血清中IgG2c/IgG1的滴度。结果显示，结果显示，F组(施予PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒)小鼠的血清IgG2c滴度明显高于D组(施予PF-127+EBNA1△GA+IFN-α+TA纳米颗粒)，并且均有极显著差异(P<0.001)。
实验结果表明，本发明的包含EBNA1△GA和特定免疫佐剂(例如CpG或IFN-α)的纳米颗粒对小鼠进行免疫后，与游离的抗原和佐剂混合物相比，能够增强体液免疫，提高抗体的滴度。本发明PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒能够很好的激发Th1型免疫，PF-127+EBNA1△GA+IFN-α+TA纳米颗粒能够激活Th2型免疫。
同时，以天然的EBNA1作为疫苗抗原，按照实施例2所述方法制备得到PF-127+EBNA1+CpG+TA纳米颗粒和PF-127+EBNA1+IFN-α+TA纳米颗粒并按照上述方法将两种纳米颗粒免疫小鼠，结果显示以EBNA1作为疫苗抗原制备得到的纳米颗粒免疫效果显著低于本发明PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒和PF-127+EBNA1△GA+IFN-α+TA纳米颗粒。
3、小鼠外周血C84+，CD8+T细胞胞内因子检测
检测过程：第一次免疫后的第36天，取各组小鼠外周血，100ul/只，通过红细胞裂解液去除红细胞。通过表面抗体标记CD3，CD4，CD8。然后胞内染色IFN-γ，TNF-α。流失细胞仪检测并分析。
检测结果如图6A，6B所示。如图所示，F组(施予PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒)的IFN-γ和TNF-α的表达量与G组(施予PBS的阴性对照)相比有显著差异。实验结果表明，本发明的纳米颗粒(施予PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒)对小鼠免疫后，能够增加CD4+和CD8+淋巴T细胞IFN-γ和TNF-α的表达量，从而增强T细胞介导的细胞免疫效果。
4、纳米疫苗对肿瘤预防评估
实验过程：
1)第一次免疫后的第30天，C57BL/6小鼠通过右后部皮下接种1x105/只TC1-EBNA1细胞，接种后10天起，每隔两天测量一次肿瘤，肿瘤体积计算公式：0.5×长×宽2，结束测量直到对应组别的小鼠平均肿瘤体积达到2000mm3，或者小鼠个体肿瘤体积超过3000mm3。
2)统计肿瘤生长曲线。
图7显示了示了注射各组疫苗后接种肿瘤细胞的小鼠肿瘤生长情况。结果显示，F组(施予PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒)的小鼠有7只肿瘤完全被抑制。其次是D组(施予PF-127+EBNA1△GA+IFN-α+TA纳米颗粒)组有三只肿瘤完全抑制的小鼠。
另外的试验也表明，PF-127+EBNA1+CpG+TA纳米颗粒和PF-127+EBNA1+IFN-α+TA纳米颗粒的抗原特异性CD8+T缺失或者太少，不足以对肿瘤细胞起到杀伤作用。
5、纳米疫苗对肿瘤免疫联合治疗评估
实验过程：
1)C57BL/6小鼠通过右后部皮下接种6x104/只TC1-EBNA1细胞，接种后第7天，C57BL/6小鼠首次注射PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒，并每隔一周加强免疫一次，共免疫三次。首次免疫后两周内，腹腔注射PD-L1抗体，共计四次。接种后13天起，测量肿瘤，每周三次，肿瘤体积计算公式：0.5×长×宽2，结束测量直到对应组别的小鼠平均肿瘤体积达到2000mm3，或者小鼠个体肿瘤体积超过3000mm3。
2)统计肿瘤生长曲线。
3)接种后的第32天和第36天取小鼠外周血和脾脏细胞进行免疫细胞评价，主要是髓系来源抑制性细胞(MDSC)和调节性T细胞(Treg)的评估。
图8显示了与A组相比，施予anti-PD-L1和PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒联合治疗效果最好，同时与C组也有显著差异。其次是B组也显示了很好的肿瘤抑制效果。C组PF-127+EBNA1△GA+CpG+TA纳米颗粒与A组相比也显示了很好的肿瘤抑制特性。实验结果表明，本发明的纳米颗粒显示了很好的肿瘤抑制特性，当与anti-PD-L1抗体联合使用时，显示了更好的肿瘤抑制特性。
序列表
<110> 中山大学
<120> 一种防治鼻咽癌的亚单位纳米疫苗及其制备方法
<141> 2019-07-31
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 406
<212> PRT
<213> EB病毒(Epstein-Barr virus)
<400> 1
Met Ser Asp Glu Gly Pro Gly Thr Gly Pro Gly Asn Gly Leu Gly Glu
1 5 10 15
Lys Gly Asp Thr Ser Gly Pro Glu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Pro Gln
20 25 30
Arg Arg Gly Gly Asp Asn His Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly
35 40 45
Arg Gly Gly Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro
50 55 60
Arg His Arg Asp Gly Val Arg Arg Pro Gln Lys Arg Pro Ser Cys Ile
65 70 75 80
Gly Cys Lys Gly Thr His Gly Gly Thr Gly Ala Gly Gly Arg Gly Arg
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly Arg Gly Arg
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Arg Arg Gly Arg Gly Arg Glu Arg Ala Arg Gly
115 120 125
Gly Ser Arg Glu Arg Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Glu Lys
130 135 140
Arg Pro Arg Ser Pro Ser Ser Gln Ser Ser Ser Ser Gly Ser Pro Pro
145 150 155 160
Arg Arg Pro Pro Pro Gly Arg Arg Pro Phe Phe His Pro Val Gly Glu
165 170 175
Ala Asp Tyr Phe Glu Tyr His Gln Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro
180 185 190
Asp Val Pro Pro Gly Ala Ile Glu Gln Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly
195 200 205
Glu Gly Pro Ser Thr Gly Pro Arg Gly Gln Gly Asp Gly Gly Arg Arg
210 215 220
Lys Lys Gly Gly Trp Phe Gly Lys His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn
225 230 235 240
Pro Lys Phe Glu Asn Ile Ala Glu Gly Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg
245 250 255
Ser His Val Glu Arg Thr Thr Asp Glu Gly Thr Trp Val Ala Gly Val
260 265 270
Phe Val Tyr Gly Gly Ser Lys Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg Gly
275 280 285
Thr Ala Leu Ala Ile Pro Gln Cys Arg Leu Thr Pro Leu Ser Arg Leu
290 295 300
Pro Phe Gly Met Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Leu Arg
305 310 315 320
Glu Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met Val Phe Leu Gln Thr His Ile Phe
325 330 335
Ala Glu Val Leu Lys Asp Ala Ile Lys Asp Leu Val Met Thr Lys Pro
340 345 350
Ala Pro Thr Cys Asn Ile Arg Val Thr Val Cys Ser Phe Asp Asp Gly
355 360 365
Val Asp Leu Pro Pro Trp Phe Pro Pro Met Val Glu Gly Ala Ala Ala
370 375 380
Glu Gly Asp Asp Gly Asp Asp Gly Asp Glu Gly Gly Asp Gly Asp Glu
385 390 395 400
Gly Glu Glu Gly Gln Glu
405
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> EB病毒(Epstein-Barr virus)
<400> 2
tccatgacgt tcctgacgtt 20

Claims (10)

1.一种纳米颗粒，其特征在于，包含EBNA1△GA蛋白、免疫佐剂、泊洛沙姆和多酚物质；所述EBNA1△GA蛋白为删除了EBNA1蛋白中的甘氨酸-丙氨酸重复序列得到的重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒为核壳结构，核为EBNA1△GA蛋白和免疫佐剂，壳为包裹在核上的泊洛沙姆和多酚物质。
3.根据权利要求1或2所述的纳米颗粒，其特征在于，所述EBNA1△GA蛋白具有如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1或2所述的纳米颗粒，其特征在于，所述免疫佐剂为IFN-α或CpG。
5.根据权利要求1或4所述的纳米颗粒，其特征在于，所述EBNA1△GA蛋白：免疫佐剂：泊洛沙姆：多酚物质的质量比10～11：4～5：42～48：28～32。
6.权利要求1～5任一所述的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.提供包含泊洛沙姆的溶液、包含多酚物质的溶液、包含EBNA1△GA蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液；
S2.将包含泊洛沙姆的溶液、包含多酚物质的溶液、包含EBNA1△GA蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液分别通过第一通道、第二通道、第三通道和第四通道到达混合区域中，进行混合，得到纳米颗粒溶液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包含泊洛沙姆的溶液、包含多酚的溶液、包含EBNA1△GA蛋白的溶液和包含免疫佐剂的溶液的浓度比为0.1～1mg/mL：0.1～0.6mg/mL：0.1～0.5mg/mL：50～100μg/mL。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述四个通道的流速相同，为1～20mL/min。
9.权利要求1～5任一所述的纳米颗粒在制备与EBV感染相关的疾病的免疫原性组合物中的应用。
10.一种免疫原性组合物，其特征在于，包含权利要求1～5任一所述的纳米颗粒及其药学上可接受的辅料。
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