CN112516070A - 蛋白质类抗原的单次注射疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种蛋白质类抗原的单次注射疫苗及其制备方法，该疫苗由表面涂覆有不同厚度单宁酸‑高分子聚合物可侵蚀涂层的蛋白质类抗原载体组成，其特征在于，蛋白质类抗原载体表面的可侵蚀涂层以恒速解离，通过多次脉冲形式释放蛋白质类抗原，实现单次注射达到常规疫苗多次注射的免疫效果。

Description

蛋白质类抗原的单次注射疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及蛋白质类抗原的单次注射疫苗及其制备方法。
背景技术
基于蛋白质类抗原的亚单位疫苗因其安全性高而被广泛应用到疫苗免疫接种计划中，但是因为蛋白质类抗原低免疫原性和半衰期短的特点，需要疫苗佐剂和多次免疫注射才可以获得理想的免疫效果。尽管在过去的四十年中，全球疫苗覆盖率大幅增长，但是由于疫苗分配和管理不充分，可疫苗预防的传染病仍然每年夺走约150万儿童的生命。在这些儿童中，有相当数量的人由于有限的医疗保健途径或其他社会经济因素只接受了一剂疫苗。不幸的是，单次推注给药通常不足以确保强大而持久的免疫力。在过去的35年中，研究人员致力于创建能够实现抗原脉冲释放的递送系统，仅需一次注射即可提供完全免疫力。
封装有蛋白质类抗原的可降解聚合物微球可以实现抗原的缓慢释放，这主要归因于不同尺寸的微球降解速度的不同，然而这种免疫方法无法给出具体的抗原释放时间，由于高分子聚合物的降解机理非常复杂，受多种因素的综合影响，因此无法准确按照接种计划来实现免疫。同时，制备过程中使用了有机溶剂会对蛋白质类抗原产生不良影响。更为重要的是，脉冲式抗原释放模式的免疫效果要好于缓慢释放抗原的递送模式。专利(申请号KR：20160160247)将灭活微生物细胞封装在聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球中，以补偿现有福尔马林微生物灭活疫苗的缺点。与现有的福尔马林微生物灭活疫苗相比，该发明的疫苗组合物具有显着改善的免疫能力和免疫持续时间，并且可以更有效地改善对其施用疫苗的个体的免疫力。该方案适用于抗原免疫效果的增强，却无法实现疫苗单次注射即可获得完全免疫力。因此，开发出一种同时满足制备简单、精确脉冲释放、无安全风险等要求的单次注射疫苗依然是一个需要解决的难题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供蛋白质类抗原的单次注射疫苗及其制备方法，能够实现单次注射即获得理想免疫效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了蛋白质类抗原的单次注射疫苗，由表面涂覆有不同厚度单宁酸-高分子聚合物可侵蚀涂层的蛋白质类抗原载体组成，其特征在于，蛋白质类抗原载体表面的可侵蚀涂层以恒速解离，通过多次脉冲形式释放蛋白质类抗原，实现单次注射达到常规疫苗多次注射的免疫效果。
优选地，所述蛋白质类抗原包括卵清蛋白(OVA)、新型冠状病毒棘突蛋白(His-Tag)、乙肝表面抗原(HBsAg)、人白喉抗原(Diphtheria-Ag)、破伤风类毒素、脊髓灰质炎病毒抗原。
优选地，所述载体的材料包括碳酸钙、介孔二氧化硅、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳酸和聚乳酸-羟基乙酸共聚物的一种或几种。
优选地，所述高分子聚合物包括聚聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷共聚物(PEO-PPO-PEO)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)和羟甲基纤维素(CMC)的一种或几种。
本发明还提供了上述技术方案所述蛋白质类抗原的单次注射疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)将蛋白质类抗原封装到载体中，获得抗原载体；
2)将步骤1)中获得的抗原载体在单宁酸和高分子聚合物的溶液中交替浸泡，使抗原载体表面形成单宁酸-高分子聚合物可侵蚀涂层，通过控制浸泡次数来控制可侵蚀涂层厚度。
3)混合步骤2)获得的不同厚度可侵蚀涂层涂覆的抗原载体，获得蛋白质类抗原的单次注射疫苗。
所述单宁酸-高分子聚合物可侵蚀涂层注射到皮下后，可以恒定速率解离。
优选地，所述单宁酸与高分子聚合物溶液的pH＜6。
优选地，所述单宁酸与高分子聚合物的溶液浓度应为10μg/mL-1g/mL。
优选地，所述浸泡的温度为1-37℃，单次浸泡时间为1min～60min。
优选地，所述交替浸泡次数为1-200次。
本发明具有如下的有益效果：
本发明提供的蛋白质类抗原的单次注射疫苗注射到皮下后，由于不同厚度单宁酸-高分子聚合物可侵蚀涂层均以恒速解离，使被封装的蛋白质类抗原在不同时间点实现精准脉冲释放。
本发明提供的蛋白质类抗原的单次注射疫苗注射到皮下后，产生的免疫效果与多次注射抗原载体疫苗相当。
本发明提供的蛋白质类抗原的单次注射疫苗，注射一次，即可达到抗原载体疫苗多次注射的免疫效果，改善了需要免疫人群的依从性。
本发明提供的单次注射疫苗的制备方法，没有使用有机溶剂，避免了蛋白质类药物的变性和失活。
利用本发明制备的蛋白质类抗原的单次注射疫苗皮下注射免疫后，免疫效果明显优于普通皮下注射抗原的免疫方式。
附图说明
图1为本发明制备的蛋白质类抗原的单次注射疫苗的示意图。图1中的A是在酸性环境下，单宁酸与高分子聚合物通过氢键相互作用，在蛋白质类抗原载体表面上形成可侵蚀涂层；图1中的B是蛋白质类抗原的单次注射疫苗注射到皮下后，不同厚度的可侵蚀涂层以恒定速率在不同时间点完全解离，使蛋白质类抗原在对应时间点准确释放，实现多次脉冲释放。
图2为蛋白质类抗原载体与表面涂覆有可侵蚀涂层(“单宁酸/聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷共聚物”可侵蚀涂层)的蛋白质类抗原载体在扫描电镜观察下的形态差异。图2中的A是蛋白质类抗原载体5000倍放大后的表面形态；图2中的B是蛋白质类抗原载体15000倍放大后的表面形态；图2中的C是涂覆有可侵蚀涂层的蛋白质类抗原载体5000倍放大后的表面形态；图2中的D是涂覆有可侵蚀涂层的蛋白质类抗原载体15000倍放大后的表面形态。
图3.以卵清蛋白为抗原模型的单次注射疫苗体外释放抗原卵清蛋白的累计释放曲线。
图4.以卵清蛋白为抗原模型的单次注射疫苗和多次注射抗原载体疫苗皮下注射到C57/BL/6小鼠体内后，小鼠血清抗体浓度的变化曲线对比图。以未负载蛋白质类抗原的单次注射疫苗和无佐剂抗原疫苗作为对照。
图5.新型冠状病毒的单次注射疫苗和多次注射抗原载体疫苗皮下注射到C57/BL/6小鼠体内后，小鼠血清抗体浓度的变化曲线对比图。以未负载蛋白质类抗原的单次注射疫苗和无佐剂抗原疫苗作为对照。
具体实施方式
本发明提供了一种蛋白质类抗原的单次注射疫苗，由表面涂覆有不同厚度单宁酸-高分子聚合物可侵蚀涂层的蛋白质类抗原载体组成，其特征在于，表面可侵蚀涂层以恒速解离，通过多次脉冲形式释放蛋白质类抗原，实现单次注射达到常规疫苗多次注射的免疫效果。
在本发明中，所述蛋白质类抗原包括卵清蛋白(OVA)、新型冠状病毒棘突蛋白(His-Tag)、乙肝表面抗原(HBsAg)、人白喉抗原(Diphtheria-Ag)、破伤风类毒素、脊髓灰质炎病毒抗原。
在本发明中，所述载体的材料包括碳酸钙、介孔二氧化硅、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳酸和聚乳酸-羟基乙酸共聚物的一种或几种。
在本发明中，所述高分子聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷共聚物(PEO-PPO-PEO)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)和羟甲基纤维素(CMC)的一种或几种。
本发明还提供了上述技术方案所述蛋白质类抗原的单次注射疫苗的制备方法，包括：1)将蛋白质类抗原封装到载体中，获得抗原载体；2)将步骤1)中获得的抗原载体在单宁酸和高分子聚合物的溶液交替浸泡，使抗原载体表面形成单宁酸-高分子聚合物可侵蚀涂层，通过控制浸泡次数调节可侵蚀涂层厚度。3)混合步骤2)获得的不同厚度可侵蚀涂层涂覆的抗原载体，即可获得蛋白质类抗原的单次注射疫苗。
在本发明中，所述单宁酸与高分子聚合物的溶液优选pH＜6；所述单宁酸-高分子聚合物可侵蚀涂层优选注射到皮下后，可以恒定速率解离；所述蛋白质类药物与高分子聚合物的溶液浓度优选为10μg/mL-1g/mL；所述浸泡的温度优选为1～37℃；单次浸泡时间优选为1min～60min；所述交替浸泡次数优选为1-200次。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不应视为限定本发明的范围。
实施例1制备以卵清蛋白为抗原模型的单次注射疫苗
具体制备步骤为：将卵清蛋白溶解到氯化钙溶液中，浓度为1mg/mL，加入等体积碳酸钠溶液，搅拌形成负载有卵清蛋白的碳酸钙载体，离心收集蛋白质类抗原载体。将单宁酸与聚乙二醇分别溶于磷酸盐缓冲液中(pH＝6)，浓度均为1mg/mL。将负载有卵清蛋白的碳酸钙载体在单宁酸和聚乙二醇溶液中交替浸泡，每次浸泡时间为1min，一个循环为一层。控制系统温度为37℃。重复循环20或40次得到涂覆有不同厚度可侵蚀涂层的抗原载体，与没有可侵蚀涂层的抗原载体混合，干燥即得卵清蛋白抗原的单次注射疫苗。
实施例2制备新型冠状病毒的单次注射疫苗
具体制备步骤为：将9.8g十六烷基三甲基溴化铵和5g硅酸钠溶于175mL超纯水中混合搅拌，加入17.5mL的乙酸乙酯，在室温下静置5h。经过90℃水浴中48h老化，离心收集产物。最后，将产物在空气气氛中550℃煅烧10h得到介孔二氧化硅球。将新型冠状病毒棘突蛋白(His-Tag)溶于磷酸缓冲液中(pH＝5)，浓度为2mg/mL，然后加入8mg介孔二氧化硅球，超声处理至分散，离心分离得到负载有新型冠状病毒特征蛋白的介孔二氧化硅球载体。将单宁酸和聚环氧乙烷-局环氧丙烷-聚环氧乙烷共聚物(PEO-PPO-PEO)分别溶于盐酸溶液中(pH＝3)，浓度均为10mg/mL。将负载有新型冠状病毒特征蛋白的介孔二氧化硅球载体在上述两种溶液中交替浸泡，每次浸泡时间为15min，，一个循环为一层。控制系统温度为25℃。重复循环10或20次得到涂覆有不同厚度可侵蚀涂层的抗原载体，与没有可侵蚀涂层的抗原载体混合，干燥即得新型冠状病毒抗原的单次注射疫苗。
实施例3制备乙肝表面抗原的单次注射疫苗
具体制备步骤为：将乙肝表面抗原溶解到1％浓度的聚乙烯醇水溶液中作为水相，抗原浓度为0.5mg/mL。将聚乳酸溶于二氯甲烷中获得浓度为8％的溶液作为油相。将10mL的油相逐滴滴入到100mL水相中，同时进行搅拌形成乳液。将乳液导入膜乳化器中过膜得到最终的乳液。将所制备出的乳液通风固化5小时，离心收集得到负载有乙肝表面抗原的聚乳酸微球载体。将单宁酸和聚乙烯吡咯烷酮分别溶于盐酸溶液中(pH＝2)，浓度均为5mg/mL。将负载有乙肝表面抗原的聚乳酸微球载体在两种溶液中交替浸泡，每次浸泡时间为30min，一个循环为一层。控制系统温度为5℃。重复循环5或10次得到涂覆有不同厚度可侵蚀涂层的抗原载体，与没有可侵蚀涂层的抗原载体混合，干燥即得乙肝表面抗原的单次注射疫苗。
实施例4制备人白喉抗原的单次注射疫苗
具体制备步骤为：将人白喉抗原蛋白溶解到氯化钙溶液中，浓度为1mg/mL，加入等体积碳酸钠溶液，搅拌形成负载有人白喉抗原蛋白的碳酸钙载体，离心收集人白喉抗原蛋白载体。将单宁酸与聚乙二醇分别溶于磷酸盐缓冲液中(pH＝5.5)，浓度均为7mg/mL。将负载有人白喉抗原的碳酸钙载体在两种溶液中交替浸泡，每次浸泡时间为8min，，一个循环为一层。控制系统温度为10℃。重复循环15或30次得到涂覆有不同厚度可侵蚀涂层的抗原载体，与没有可侵蚀涂层的抗原载体混合，干燥即得人白喉抗原的单次注射疫苗。
实施例5制备脊髓灰质炎病毒抗原的单次注射疫苗
具体制备步骤为：将脊髓灰质炎病毒抗原蛋白溶解到氯化钙溶液中，浓度为0.5mg/mL，加入等体积碳酸钠溶液，搅拌形成负载有脊髓灰质炎病毒抗原蛋白的碳酸钙载体，离心弃上清收集。将单宁酸与羟甲基纤维素分别溶于磷酸盐缓冲液中(pH＝3.5)，浓度均为8mg/mL。将负载有脊髓灰质炎病毒抗原蛋白的碳酸钙载体在两种溶液中交替浸泡，每次浸泡时间为20min，一个循环为一层。控制系统温度为15℃。重复循环10或20次得到涂覆有不同厚度可侵蚀涂层的抗原载体，与没有可侵蚀涂层的抗原载体混合，干燥即得脊髓灰质炎病毒抗原的单次注射疫苗。
实施例6以卵清蛋白为抗原模型的单次注射疫苗形态表征
采用实施例1相同的方法，制备负载了以卵清蛋白为抗原模型的单次注射疫苗。将抗原疫苗微粒干燥后喷金进行扫描电镜观察，可见如图2所示的疫苗微粒表面形态，涂覆了可侵蚀涂层的微粒表面出现膜的形态，说明可侵蚀涂层已经成功涂敷在卵清蛋白抗原载体的表面。
实施例7新型冠状病毒的单次注射疫苗体外释放抗原
新型冠状病毒的单次注射疫苗(采用实施例2相同的方法制备)在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中浸泡指定的时间后，以高效液相色谱检测释放介质中新型冠状病毒抗原的含量。新型冠状病毒抗原的累计释放量如图3所示，在固定的时间点，抗原可以定时从载体中脉冲释放多次，模拟了疫苗接种计划的时间点。
实施例8以卵清蛋白为抗原模型的单次注射疫苗体内免疫防护评估
采用实施例1相同的方法，制备了卵清蛋白的单次注射疫苗。使用C57/BL/6小鼠作为动物模型评估以卵清蛋白为抗原模型的单次注射疫苗的免疫效果。24只小鼠随机分为四组，分别进行以下免疫接种计划：
1)实验组为以卵清蛋白为抗原模型的单次注射疫苗，仅在第0天皮下注射一次，简称为OVA@CaCO3/(TA/PEG)n。
2)空白组为没有负载抗原卵清蛋白的单次注射疫苗，其制备方法与实施例1方法基本相同，唯一不同点是没有负载卵清蛋白，仅在第0天皮下注射一次，简称为CaCO3/(TA/PEG)n。
3)对照组1为以卵清蛋白为抗原模型的载体疫苗制备方法与实例1方法基本相同，唯一不同点是抗原载体表面没有可侵蚀涂层，分别在第0天，14天，28天皮下注射三次，简称为OVA@CaCO3*3。
4)对照组2为卵清蛋白的抗原疫苗，通过配制卵清蛋白的生理盐水溶液获得，抗原蛋白浓度为0.5mg/ml，分别在在第0天，14天，28天皮下注射三次，记为OVA*3。
总抗原免疫量为30μg/只，注射免疫以后，每周取小鼠眼眶静脉血～70μL，血样品3000rpm离心10min后，取上层血清样品，以酶联免疫吸附法检测血清中抗原抗体的浓度。接种后小鼠血清抗体浓度变化如图4所示，单次皮下注射卵清蛋白的单次注射疫苗的抗体含量与分三次皮下注射卵清蛋白载体疫苗的抗体含量没有明显差异，说明单次注射疫苗的免疫效果与多次注射抗原载体疫苗相当，减少了注射次数，提高了人群的依从性。而与注射抗原疫苗相比，单次注射疫苗的抗体含量远高于抗原疫苗，说明单次注射疫苗的免疫效果明显优于普通皮下注射抗原疫苗的免疫方式。
实施例9新型冠状病毒的单次注射疫苗的体内免疫防护评估
采用实施例2相同的方法，制备了新型冠状病毒的单次注射疫苗。采用实施例8相同的方法，对新型冠状病毒单次注射疫苗进行免疫防护评估。四种免疫接种计划被实施：
1)实验组为新型冠状病毒的单次注射疫苗，仅在第0天皮下注射一次，简称为His-tag@SiO2/(TA/PEG)n。
2)空白组为没有负载新型冠状病毒抗原的单次注射疫苗，其制备方法与实施例2方法基本相同，唯一不同点是没有负载新型冠状病毒抗原蛋白，仅在第0天皮下注射一次，简称为His-tag@SiO2/(TA/PEG)n。
3)对照组1为新型冠状病毒的载体疫苗制备方法与实例2方法基本相同，唯一不同点是抗原载体表面没有可侵蚀涂层，分别在第0天，14天，28天皮下注射三次，简称为His-tag@SiO2*3。
4)对照组2为新冠病毒的抗原疫苗，通过配制新型冠状病毒抗原蛋白的生理盐水溶液获得，抗原蛋白浓度为1mg/mL，分别在在第0天，14天，28天皮下注射三次，记为His-tag*3。
如图5所示，血清中单次皮下注射新型冠状病毒的单次注射疫苗的抗体含量与分三次皮下注射新型冠状病毒载体疫苗的抗体含量没有显著性差异，说明单次注射疫苗的免疫效果与多次注射抗原载体疫苗相当，减少了注射次数，提高了人群的依从性。而与注射抗原疫苗相比，单次注射疫苗的抗体含量远高于抗原疫苗，说明单次注射疫苗的免疫效果明显优于普通皮下注射抗原疫苗的免疫方式。
以上所述仅是本发明的优选实施例方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应该视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种单次注射疫苗，由表面涂覆有不同厚度单宁酸-高分子聚合物可侵蚀涂层的蛋白质类抗原载体组成，其特征在于，蛋白质类抗原载体表面的可侵蚀涂层以恒速解离，通过多次脉冲形式释放蛋白质类抗原，实现单次注射达到常规疫苗多次注射的免疫效果。
2.根据权利要求1所述的单次注射疫苗，其中所述蛋白质类抗原包括卵清蛋白(OVA)、新型冠状病毒棘突蛋白(His-tag)、乙肝表面抗原(HBsAg)、人白喉抗原(Diphtheria-Ag)、破伤风类毒素、脊髓灰质炎病毒抗原。
3.根据权利要求1所述的单次注射疫苗，其中所述载体包括碳酸钙、介孔二氧化硅、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳酸和聚乳酸-羟基乙酸共聚物的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的单次注射疫苗，其中所述高分子聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷共聚物(PEO-PPO-PEO)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)和羟甲基纤维素(CMC)的一种或几种。
5.权利要求1-4任一项所述的单次注射疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)将蛋白质类抗原封装到载体中，获得抗原载体；
2)将步骤1)中获得的抗原载体在单宁酸和高分子聚合物的溶液中交替浸泡，使抗原载体表面形成单宁酸-高分子聚合物可侵蚀涂层，通过控制浸泡次数来调节可侵蚀涂层厚度。
3)混合步骤2)获得的不同厚度可侵蚀涂层涂覆的抗原载体，得到蛋白质类抗原的单次注射疫苗。
6.根据权利要求5所述的单次注射疫苗的制备方法，其特征在于，所述单宁酸和高分子聚合物的溶液pH＜6。
7.根据权利要求5所述的单次注射疫苗的制备方法，其特征在于，所述单宁酸和高分子聚合物的溶液浓度为10μg/mL-1g/mL。
8.根据权利要求5所述的单次注射疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备过程的温度为1-37℃。
9.根据权利要求5所述的单次注射疫苗的制备方法，其特征在于，单次浸泡时间为1min-60min。
10.根根权利要求5所述的单次注射疫苗的制备方法，其特征在于，其中所述交替浸泡次数为1-200次。
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