CN117024532A - 共负载CpG、MPLA双佐剂和EB病毒糖蛋白的纳米疫苗的制备和应用 - Google Patents

共负载CpG、MPLA双佐剂和EB病毒糖蛋白的纳米疫苗的制备和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117024532A
CN117024532A CN202310912664.4A CN202310912664A CN117024532A CN 117024532 A CN117024532 A CN 117024532A CN 202310912664 A CN202310912664 A CN 202310912664A CN 117024532 A CN117024532 A CN 117024532A
Authority
CN
China
Prior art keywords
vaccine
recombinant protein
seq
amino acid
nanoparticle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310912664.4A
Other languages
English (en)
Inventor
张晓�
曾益新
钟玲
徐淼
陈永明
刘立新
刘鸿
张琬琳
冯启胜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sun Yat Sen University Cancer Center
Original Assignee
Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sun Yat Sen University Cancer Center filed Critical Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority to CN202310912664.4A priority Critical patent/CN117024532A/zh
Publication of CN117024532A publication Critical patent/CN117024532A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了共负载CpG、MPLA双佐剂和EB病毒糖蛋白的纳米疫苗的制备和应用，具体公开了一种重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列包含a1)～a3)中任意一种：a1)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11所示；a2)a1)所示氨基酸序列经一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；a3)与a1)或a2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上或者90％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。本发明以改造过的EB病毒重组蛋白作为抗原来制备纳米颗粒疫苗，其免疫原性好，且无生物安全风险等问题。

Description

共负载CpG、MPLA双佐剂和EB病毒糖蛋白的纳米疫苗的制备和 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及共负载CpG、MPLA双佐剂和EB病毒糖蛋白的纳米疫苗的制备和应用。
背景技术
EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)属于人类疱疹病毒4型，在全球人群中广泛感染，据报道约有90％的成年人感染过EBV。在青少年时期感染EBV容易引发单核细胞增多症，一般可以自愈；感染过EBV的人群一般为病毒终身携带者。EBV是第一种被证实感染后可诱发肿瘤的病毒，越来越多的证据表明EBV与多种淋巴肿瘤(包括霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤等)和上皮肿瘤(包括鼻咽癌、胃癌等)的发生发展有着密切的关系。此外，EBV感染与自身免疫病，如多发性硬化症等密切相关。但是截至目前针对EBV所诱发的癌症等疾病尚未有特效的治疗手段，而且市面上也没有有效的针对EB病毒感染的预防性疫苗可用，因此研发预防EBV感染的疫苗尤为重要。
gB是EBV表达的膜融合糖蛋白，属于III型膜融合蛋白，以同源三聚体形式存在于病毒包膜表面，在EBV入胞复合物与多种细胞受体识别结合后，级联触发gB的膜融合功能，最终通过构象变化完成病毒包膜和细胞膜的融合，成功实现病毒的感染入胞过程。
gHgL蛋白是一种位于EBV包膜的异源二聚体，其中gH为单次跨膜蛋白，gL为分泌蛋白，gHgL参与EBV感染B细胞和上皮细胞的过程，与上皮细胞受体整合素或EphA2结合。
gp42同样是单次跨膜蛋白，其N末端位于胞内，C端位于胞外，与受体HLA-II结合参与EBV感染B细胞的过程，在此过程中与gHgL蛋白形成异源三聚体发挥作用。
EBV gB、gHgL与gp42蛋白是EBV参与B细胞或上皮细胞感染的主要糖蛋白，也是目前功能研究最多的几种EBV膜表面糖蛋白。在天然感染过程中，能够刺激机体在血清免疫水平和细胞免疫水平产生针对EBV的特异免疫应答，目前己被应用于多种EBV预防性疫苗的研究中，在临床前实验中效果良好。
传统的灭活或者减活疫苗的安全性以及其引起的全身性免疫风暴在很多疫苗体系中无法避免。亚单位疫苗具有比减毒活疫苗更高的安全性，但亚单位疫苗普遍免疫原性较低，不能够有效地刺激免疫应答。而利用纳米颗粒递送系统可以很好的提高亚单位疫苗的免疫原性，利用纳米疫苗的尺寸优势以及淋巴结靶向的特点，同时空共递送抗原及佐剂将会更有效的激活T细胞和B细胞，增强免疫效果。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种重组蛋白。
本发明第二方面的目的，在于提供编码本发明第一方面的重组蛋白的核酸分子。
本发明第三方面的目的，在于提供与本发明第二方面的核酸分子相关的生物材料。
本发明第四方面的目的，在于提供一种纳米颗粒疫苗。
本发明第五方面的目的，在于提供本发明第四方面的纳米颗粒疫苗的制备方法。
本发明第六方面的目的，在于提供本发明第一方面的重组蛋白、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的生物材料、本发明第四方面的纳米颗粒疫苗在制备产品中的应用。
本发明第七方面的目的，在于提供一种产品。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明第一个方面，在于提供一种重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列包含a1)～a3)中任意一种：
a1)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11所示；
a2)a1)所示氨基酸序列经一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；
a3)与a1)或a2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上或者90％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
本发明第二个方面，在于提供编码本发明第一方面的重组蛋白的核酸分子。
本发明第三个方面，在于提供与本发明第二方面的核酸分子相关的生物材料，所述生物材料包含b1)～b3)中的至少一种：
b1)表达盒，含有本发明第二方面的核酸分子；
b2)重组载体，含有本发明第二方面的核酸分子或b1)中表达盒；
b3)重组细胞，含有本发明第二方面的核酸分子、b1)中表达盒或b2)中重组载体。
优选地，所述重组载体为质粒载体、病毒载体或细胞载体。
优选地，所述质粒载体可以是任选的质粒，所述病毒载体可以任选的病毒，所述细胞载体不包括繁殖材料。
优选地，所述细胞为昆虫细胞和/或哺乳动物细胞。
进一步优选地，所述哺乳动物细胞为HEK293细胞。
本发明提供的纳米颗粒疫苗的形态规则、外形圆整、表面光滑、分散性好，无明显粘连、破损、坍塌等现象，EBV重组蛋白和免疫佐剂具有较高的包封率。且该纳米颗粒疫苗具有靶向淋巴结的功能，提高了疫苗在淋巴结内的富集以及抗原提呈细胞的摄取。
本发明第四个方面，在于提供一种纳米颗粒疫苗，所述疫苗包括氨基酸序列如SEQID NO:1、SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:11所示的重组蛋白。
优选地，所述纳米颗粒疫苗还包括免疫佐剂。
优选地，所述免疫佐剂包括CpG和MPLA。
优选地，所述纳米疫苗还包括载体。
优选地，所述载体包括阳离子脂质、疏水聚合物和两亲性聚合物。
优选地，所述阳离子脂质包括但不限于含有阳离子头以及疏水的烷基尾的胺盐、季铵盐、鎓盐的永久阳离子和可电离阳离子脂质；和/或，所述疏水聚合物包括但不限于PLGA、PCL、PLLA、PLA、PGA、P(Glu)、PHB、PPO、PS、P(Asp)、PMMA、PEMA、PDMS、PBd、P4VP及其共聚衍生物中的至少一种；和/或，所述两亲性聚合物包括但不限于基于PEG的DSPE-PEG、Pluronic、DMG-PEG、PCL-PEG、PLA-PEG、硬脂酸-PEG，基于上述的亲水和疏水聚合物得到的两嵌段或者多嵌段聚合物的P(MMA-COO-MAA)、PEMA-PEI、PCL-PEI、PLGA-PEI、PCL-PEO、PEG-PCL-PDMAEMA中的至少一种。
优选地，所述阳离子脂质包括但不限于DOTAP、DOTAP、DOTMA、DOEPC、DC-Chol、DDAB、DODMA、DOSPA、DTAB、TTAB、CTAB、DORI、DPRIE、DSRIE、DOGS、DOSC、LPLL、SA、ALC-0315、SM-102、D-Lin-MC3及其衍生物中的至少一种。
优选地，所述纳米颗粒为近似球形。
优选地，所述纳米颗粒的粒径为80～90nm。
优选地，所述纳米颗粒的Zeta电位为+0至+5mV。
优选地，所述纳米颗粒中所述重组蛋白的包封率为80％～100％。
优选地，所述纳米颗粒中所述免疫佐剂的包封率为99％～100％。
本发明第五个方面，在于提供本发明第四方面的纳米颗粒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)将含有重组蛋白的溶液和含有CpG的溶液混合，得到溶液A；将含有阳离子脂质的溶液和含有MPLA的溶液混合，得到溶液B；
(2)将溶液A滴加至溶液B，搅拌，继续滴加含有疏水聚合物的溶液，搅拌得到溶液C；
(3)将溶液C滴加至含有两亲性聚合物的溶液中，搅拌，即可。
优选地，所述重组蛋白、CpG、阳离子脂质、MPLA、疏水聚合物和两亲性聚合物的溶液的溶剂分别为Hepes缓冲溶液、水、乙醇、乙醇、DMSO和水。
优选地，所述溶液A中所述重组蛋白和CpG的浓度分别为5～10mg/mL和10～20mg/mL。
优选地，所述溶液B中所述阳离子脂质和MPLA的浓度分别为0.9～1.5mg/mL和0.5～1mg/mL
优选地，所述含有疏水聚合物的溶液中所述疏水聚合物的浓度为3～10mg/mL；进一步为5～8mg/mL；更进一步为5mg/mL。
优选地，所述含有两亲性聚合物的溶液中所述两亲性聚合物的浓度为0.5～2mg/mL；进一步为1～1.5mg/mL；更进一步为1mg/mL。
优选地，所述溶液A:溶液B:含有疏水聚合物的溶液:含有两亲性聚合物的溶液的体积比为1:(15～20):(15～20):(110～130)；进一步为1:(15～18):(15～18):(110～120)；更进一步为1:18:18:120。
优选地，所述Hepes缓冲溶液的pH值7.0～11.0。
进一步优选地，所述Hepes缓冲溶液的pH＝7.2～7.4(gHgL和gB)或pH＝10.0～10.5(gp42)。
优选地，所述搅拌的条件为1000rpm，5min。
优选地，所述制备方法还包括纯化步骤。
优选地，所述纯化步骤包括透析有机溶剂和超滤浓缩。
本发明第六个方面，在于提供本发明第一方面的重组蛋白、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的生物材料、本发明第四方面的纳米颗粒疫苗在制备产品中的应用。
优选地，所述产品的功能为c1)～c6)中的任一种：
c1)制备预防或治疗EB病毒感染相关疾病的药物；
c2)预防或治疗EB病毒感染相关疾病；
c3)预防或治疗肿瘤；
c4)抑制肿瘤生长；
c5)引发或增强机体免疫反应；
c6)制备EB病毒抗体。
优选地，所述产品包括药物、试剂和试剂盒，所述药物包括疫苗。
优选地，所述EB病毒感染相关的疾病为传染性单核细胞增多症。
优选地，所述c5)中所述机体包括哺乳动物，例如人、牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物的机体。
本发明第七个方面，在于提供包含本发明第一方面的重组蛋白、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的生物材料和/或本发明第四方面的纳米颗粒疫苗的产品。
优选地，所述产品还包含药学上可接受的辅料。
优选地，所述辅料包括载体、稀释剂、赋形剂、防腐剂、抗菌剂和/或免疫佐剂。
优选地，所述免疫佐剂包括TLR受体激动剂(如CpG和MPLA)。
优选地，所述载体包括阳离子脂质、疏水聚合物和两亲性聚合物。
优选地，所述阳离子脂质包括但不限于含有阳离子头以及疏水的烷基尾的胺盐、季铵盐、鎓盐的永久阳离子和可电离阳离子脂质；和/或，所述疏水聚合物包括但不限于PLGA、PCL、PLLA、PLA、PGA、P(Glu)、PHB、PPO、PS、P(Asp)、PMMA、PEMA、PDMS、PBd、P4VP及其共聚衍生物中的至少一种；和/或，所述两亲性聚合物包括但不限于基于PEG的DSPE-PEG、Pluronic、DMG-PEG、PCL-PEG、PLA-PEG、硬脂酸-PEG，基于上述的亲水和疏水聚合物得到的两嵌段或者多嵌段聚合物的P(MMA-COO-MAA)、PEMA-PEI、PCL-PEI、PLGA-PEI、PCL-PEO、PEG-PCL-PDMAEMA中的至少一种。
优选地，所述阳离子脂质包括但不限于DOTAP、DOTAP、DOTMA、DOEPC、DC-Chol、DDAB、DODMA、DOSPA、DTAB、TTAB、CTAB、DORI、DPRIE、DSRIE、DOGS、DOSC、LPLL、SA、ALC-0315、SM-102、D-Lin-MC3及其衍生物中的至少一种。
本发明的有益效果是：
本发明以改造过的EBV重组蛋白作为抗原来制备疫苗，其免疫原性好，且无生物安全风险等问题。
本发明首次发现，当将EB病毒膜表面糖蛋白与多个佐剂分子共负载形成纳米颗粒后，可以通过纳米颗粒递送系统显著地提高相应糖蛋白的免疫原性，其在小鼠体内的免疫原性获得了显著性提高，并且免疫小鼠后产生的血清的总抗体滴度、血清中特异性中和抗体滴度以及T细胞应答水平均显著高于用作对照的非颗粒化可溶性糖蛋白及佐剂，三种纳米颗粒疫苗联合免疫可以介导产生更高的中和抗体滴度，并可以保护人源化小鼠完全抵抗EB病毒感染。本发明提供了此种纳米颗粒疫苗作为EB病毒预防性疫苗免疫原的有效性证据，对于预防EB病毒相关疾病具有重要的现实与理论意义和应用潜力。
将本发明提供的纳米颗粒疫苗施用于动物后，能产生较强的体液免疫及细胞免疫应答，免疫效果优于游离形式的抗原/佐剂混合注射以及现有的含铝佐剂的疫苗。
本发明提供的纳米颗粒疫苗制备方法简单，得到纳米颗粒疫苗品质稳定，易于产业化生产。
附图说明
图1为本发明纳米颗粒疫苗的制备过程示意图。
图2为实施例1所制备得到的纳米颗粒疫苗的形态表征结果。
图3为实施例1所制备得到的纳米颗粒疫苗的粒径、zeta电位。
图4为实施例1所制备得到的纳米颗粒疫苗的包封率。
图5为纳米颗粒疫苗靶向淋巴结递送效率的情况。
图6为单一纳米颗粒疫苗及其对照疫苗激活小鼠体液免疫应答情况；其中，A～C分别为免疫后小鼠血清中抗gHgL、抗gB和抗gp42的IgG结合滴度检测结果；D为上皮细胞中和结果；E为B细胞中和结果；图中*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.005，****代表P＜0.001。
图7为单一纳米颗粒疫苗激活小鼠细胞免疫应答情况；其中，A为免疫NP-gHgL后T细胞免疫应答情况；B为免疫NP-gB后细胞免疫应答情况；C为免疫NP-gp42后细胞免疫应答情况。
图8为组合纳米颗粒疫苗及其对照疫苗激活小鼠体液免疫应答情况；其中，A～C分别为免疫后小鼠血清中抗gHgL、抗gB和抗gp42的IgG结合滴度检测结果；D为上皮细胞中和结果；E为B细胞中和结果；图中，ns表示没有显著性差异，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.005，****代表P＜0.001。
图9为组合纳米颗粒疫苗及其对照疫苗激活小鼠细胞免疫应答情况。
图10为单一、组合纳米颗粒疫苗及对照疫苗激活新西兰大白兔免疫应答情况；其中，A～C分别为免疫后小鼠血清中抗gHgL、抗gB和抗gp42的IgG结合滴度检测结果；D为上皮细胞中和结果；E为B细胞中和结果；图中，ns表示没有显著性差异，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.005，****代表P＜0.001。
图11为不同疫苗形式疫苗免疫后新西兰大白兔血清IgG在人源化小鼠中的被动保护效果；其中，A为攻毒后小鼠体重变化情况；B为小鼠生存曲线；C～D为小鼠外周血EBV拷贝数情况；E为小鼠肿瘤发生情况；F为H&E、EBER及hCD20染色结果；图中，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.005，****代表P＜0.001。
具体实施方式
现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
如本文中使用的，术语“颗粒”是指在一尺寸范围内具有特定形状的几何体，以离散颗粒、丸粒、珠粒或团粒存在为特征的物质状态，而不管其大小、形状或形态如何。
如本文中使用的，术语“纳米颗粒”是指在尺寸(即颗粒的最长维度中的直径)一个维度上小于100纳米的颗粒。
如本文中使用的，术语“粒径”即“等效粒径”，是指当被测颗粒的某种物理特性或物理行为与某一直径的同质球体(或组合)最相近时，就把该球体的直径(或组合)作为被测颗粒的等效粒径(或粒度分布)。
如本文中使用的，术语“平均粒径”是指对于一个由大小和形状不相同的粒子组成的实际粒子群，与一个由均一的球形粒子组成的假想粒子群相比，如果两者的粒径全长相同，则称此球形粒子的直径为实际粒子群的平均粒径。平均粒径的测量方法是本领域技术人员已知的，例如光散射法；平均粒径的测量仪器包括但不限于马尔文粒径仪。
如本文中使用的，术语“室温”是指25±5℃。
如本文中使用的，术语“免疫佐剂”是指同抗原一起或预先施用于机体内，能增强免疫原性或改变免疫反应类型的物质。免疫佐剂本身可以具有免疫原性(例如卡介苗)，或不具有免疫原性(例如氢氧化铝佐剂)。
如本文中使用的，术语“抗原”或“免疫原”是指能够诱导宿主体内的特异性免疫应答的物质。抗原可以包括整个生物体(例如灭活的、减毒的或活的生物体)；生物体的亚单位或部分；含有具有免疫原性的插入物的重组载体；在呈递给宿主后能够诱导免疫应答的DNA部分或片段；蛋白、糖蛋白、脂蛋白、多肽、肽、抗原表位、半抗原、毒素、抗毒素或其任何组合。
EBV gB、gHgL、gp42蛋白均参与EBV感染B细胞或/和上皮细胞的过程，其具有很强的免疫原性，能够刺激机体在血清免疫水平和细胞免疫水平产生针对EBV的特异性免疫应答，目前已被成功应用于多种EBV预防性疫苗的研究中，在临床前研究中果良好。本发明通过阳离子脂质DOTAP与EBV多种糖蛋白发生静电相互作用，以疏水聚合物PLGA进一步稳定纳米颗粒核心结构，最后用DSPE-PEG2000形成亲水性的颗粒，并在此过程中对特定的免疫佐剂进行包裹，形成含有EBV糖蛋白和特定免疫佐剂的纳米颗粒，相比于游离形式的EBV糖蛋白疫苗，本发明的纳米颗粒疫苗能够产生更优的免疫效果。
所述“包裹”并不限于将EBV糖蛋白和免疫佐剂完全置于纳米颗粒的内部。本发明的纳米颗粒中，EBV糖蛋白和免疫佐剂可以全部位于纳米颗粒内部，也可以部分位于纳米颗粒表面。
所述EBV糖蛋白是EBV糖蛋白的胞外域。
实施例1纳米颗粒疫苗的制备
1.抗原：EBV重组蛋白均由悬浮293F细胞表达系统表达产生。
gHgL蛋白：参考EB病毒M81毒株全基因序列(KF373730.1)将gL蛋白膜外区序列(24～137AA，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)C端通过柔性氨基酸序列(GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO:4))连接gH蛋白膜外区序列(19～678AA，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)，gL蛋白的N端连接上信号肽编码序列(MPMGSLQPLATLYLLGMLVASCLG(SEQ ID NO:6))，gH蛋白的C端连接上便于亲和层析纯化的标签蛋白(多聚组氨酸多肽，6×His，HHHHHH(SEQ ID NO:5))，将以上序列构建到真核表达载体pCDNA3.1(+)，把构建成功的重组质粒转染至293F细胞表达并进行纯化，最终获得gLgH蛋白，gLgH蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
gB蛋白：将EBV M81毒株(KF373730.1)gB蛋白氨基酸序列中WY112–113、WLIW193–196分别替换成HSV-1gB蛋白氨基酸序列中的HR177–178、RVEA258–261，替换后的gB蛋白胞外域氨基酸序列(24～683AA)如SEQ ID NO:7所示，将其N端连接上信号肽编码序列(SEQ IDNO:6)，C端连接上便于亲和层析纯化的多聚组氨酸多肽(6×His；SEQ ID NO:5)，将以上序列构建到真核表达载体pCDNA3.1(+)，把构建成功的重组质粒转染至293F细胞表达并进行纯化，最终获得gB蛋白，gB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
gp42蛋白：将EBV M81毒株(KF373730.1)gp42蛋白胞外域序列(34～223AA；SEQ IDNO:9)的N端连接上信号肽编码序列(MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSQEIHARFRRGAR(SEQ ID NO:10))，C端连接上便于亲和层析纯化的多聚组氨酸多肽(6×His；SEQ ID NO:5)，将以上序列构建到合适的真核表达载体pVRC8400，把构建成功的重组质粒转染至293F细胞表达并进行纯化，最终获得gp42蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
2.其他常规试剂均为商购。
3.纳米颗粒疫苗的制备过程
一种纳米颗粒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)将阳离子脂质(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(DOTAP)溶解于无水乙醇中，疏水聚合物聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶解于DMSO中，两亲性聚合物二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)溶解于水中，免疫佐剂CpG溶解于水中，免疫佐剂MPLA溶解于无水乙醇中，溶解得到DOTAP浓度为1mg/mL，PLGA浓度为5mg/mL，DSPE-PEG2000浓度为1mg/mL，CpG浓度为20mg/mL，MPLA浓度为5mg/mL。
(2)将分别将EBV重组蛋白分散于pH＝7.2的Hepes缓冲溶液(gHgL蛋白和gB蛋白)中或pH＝10.0的Hepes缓冲溶液(gp42蛋白)中，得到各EBV重组蛋白浓度为10mg/mL。
(3)分别将包含EBV重组蛋白及CpG的溶液按体积比1:1混合后滴加到包含阳离子脂质及MPLA的混合溶液(阳离子脂质溶液和MPLA溶液按体积比8:1混合)中，磁力搅拌器搅拌混合(1000rpm，5min)，滴加包含疏水聚合物PLGA的溶液，磁力搅拌器搅拌混合(1000rpm，5min)，将混合物滴加入包含两亲性聚合物DSPE-PEG2000的溶液，磁力搅拌器搅拌混合(1000rpm，5min)，得到纳米颗粒溶液，其中EBV重组蛋白+CpG的混合溶液：MPLA+阳离子脂质DOTAP的混合溶液：疏水聚合物PLGA溶液：两亲性聚合物DSPE-PEG2000溶液的体积比为1:18:18:120。
(5)透析有机溶剂，得到包裹EBV重组蛋白和免疫佐剂CpG、MPLA的纳米颗粒的水溶液，对包含纳米颗粒的水溶液进行超滤浓缩，得到纳米可以疫苗，分别记为NP-gHgL、NP-gB和NP-gp42。
上述纳米颗粒疫苗制备过程如图1所示。
实施例2纳米颗粒表征
对实施例1所制备得到的纳米颗粒进行表征，具体如下：
1.形态表征
使用透射电镜观察分别包裹EBV gB、gHgL、gp42重组蛋白以及双免疫佐剂CpG和MPLA的纳米颗粒疫苗的形态。
结果如图2所示，三种纳米颗粒疫苗的形态规则、外形圆整、表面光滑、分散性好，近似球形，无明显粘连、破损、坍塌等现象。
2.粒径测试和Zeta电位测试
利用马尔文粒径仪(带有动态光散射检测器)对分别包裹EBV gB、gHgL、gp42重组蛋白以及双免疫佐剂CpG和MPLA的纳米颗粒疫苗的平均粒径和Zeta电位进行测试。
结果如图3所示，三种纳米颗粒疫苗均具有较窄的粒径分布(粒径为80～90nm)，粒径分布对称，且均带正电(Zeta电位为+0至+5mV)。
实施例3纳米颗粒疫苗中EBV重组蛋白及佐剂的包封率的测定
对实施例1制备得到的纳米颗粒疫苗中各EBV重组蛋白及佐剂的包封率进行测定，具体测定过程如下：
取3.5mL纳米颗粒溶液在4℃、40000x g条件下离心1hr，取上清，采用Micro BCA蛋白检测试剂盒检测上清中EBV重组蛋白的含量，采用鲎试剂盒检测上清中MPLA的含量，采用picogreen试剂盒检测上清中CpG的含量，并按照如下公式计算纳米颗粒中EBV重组蛋白或佐剂的包封率。
EBV重组蛋白或佐剂的包封率＝(W0-W1)/W0×100％，其中W0为加入的EBV重组蛋白或佐剂的总量；W1为上清中游离的EBV重组蛋白或佐剂的总量。
结果如图4所示，实施例1所制备得到的三种纳米颗粒疫苗的CpG及MPLA的包封率均达到99％以上，gB重组蛋白的包封率在80％以上，gHgL重组蛋白及gp42重组蛋白的包封率在90％以上，表明三种EBV重组蛋白及佐剂均可有效包封到纳米颗粒中，具有较高的包封率。
实施例4纳米颗粒疫苗靶向淋巴结递送效果评价
将三种抗原gHgL重组蛋白、gB重组蛋白及gp42重组蛋白用Cy5标记后分别按照实施例1的制备方法制备纳米颗粒疫苗，并将上述抗原与佐剂简单混合制备得到对照游离形式疫苗(记为Free)。
将上述疫苗分别经尾根部皮下免疫C57BL/6小鼠(注射量为100μL，其中EBV重组蛋白的含量为5μg，CpG的含量为10μg，MPLA的含量为10μg)6hr后，取小鼠的腹股沟及腋窝淋巴结，通过活体成像仪检测淋巴结中的Cy5荧光强度，从而评价疫苗的淋巴结递送效率。
结果如图5所示，相较于对照游离形式的疫苗，三种纳米颗粒均可更为有效地递送到腹股沟及腋窝淋巴结。
实施例5单一纳米颗粒疫苗及其对照疫苗在小鼠体内激活免疫系统评价
1.免疫方式
将5～8周雌性C57BL/6小鼠分为A～J十组，每组5只。采用尾根部皮下注射方式，按照表1中的免疫方案对小鼠进行免疫，并在第一次免疫后第2周、4周进行加强免疫，共计免疫3次。其中，纳米颗粒疫苗的制备方法同实施例1，游离形式疫苗由EBV重组蛋白和佐剂简单混合制得，铝佐剂配伍疫苗为将EBV重组蛋白与铝佐剂简单混合得到。
表1免疫方案
2.血清总抗结合滴度检测
在第三次免疫后的第7天进行眼眶采血，分离血清，采用ELISA方法检测血清中IgG结合滴度，检测过程具体如下：
1)将100ng/孔的EBV重组蛋白抗原包被在96孔板中，每孔100μL，4℃过夜包被。
2)过夜包被的板，用PBST洗1次，用封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)在37℃封闭2hr。
3)免疫血清或阴性对照血清首孔1:100稀释，再依次倍比稀释，加入到包被抗原的孔中，37℃孵育1hr。
4)清洗5次，加入100μLHRP标记的羊抗鼠二抗，37℃孵育30min。
5)清洗5次，每孔加100μL TMB底物，避光孵育15min，用50μL 2M H2SO4终止反应，450nm及630nm处检测OD值。
各组小鼠血清总抗结合滴度检测结果如图6中A～C所示，三种纳米颗粒疫苗免疫后介导产生的针对各蛋白的血清总抗滴度均高于游离形式疫苗及铝佐剂配伍疫苗，表明纳米颗粒疫苗在介导体液免疫应答方面的优势性。
3.血清中和滴度检测
1)EBV的上皮细胞中和模型：采用10％ FBS RPMI 1640培养基将HNE1细胞按照160μL体积，5000细胞每孔标准铺板到96孔板中，置于37℃培养箱培养24hr，待细胞贴壁后，以RPMI 1640无血清培养基稀释血清，首孔1:4，2倍梯度稀释，共稀释12个梯度；吸取20μL不同浓度的稀释血清(对照组加入等量1640无血清培养基)与20μLAKATA细胞生产的EBV-GFP病毒悬液，充分混合，37℃孵育2hr，得到混合液；弃去HNE1细胞培养基，将混合液加入铺有HNE1细胞的96孔板中，置于37℃培养箱中培养3hr，而后弃去混合液，加入200μL新鲜培养基，48hr后，消化96孔板中的HNE1细胞，使用BD公司的流式细胞仪LSRFortessaX-20检测表达GFP绿色荧光蛋白的HNE1细胞比例，与感染对照组相比血清处理组的GFP阳性细胞数量减少比例，计算血清在上皮细胞感染模型的抑制率(％)，并根据抑制率及血清稀释倍数作图，拟合得到半数抑制稀释倍数ID50，即为血清在上皮细胞模型的中和滴度。
上皮细胞中和滴结果如图6中D所示，含gp42重组蛋白的疫苗免疫后产生的血清均无法中和上皮细胞感染，NP-gHgL和NP-gB介导产生的中和抗体滴度高于游离形式疫苗及铝佐剂配伍疫苗。
2)EBV的B细胞中和模型：将血清用RPMI 1640无血清培养基稀释，首孔1:4，2倍梯度稀释，共稀释12个梯度；取20μL稀释后的抗体于96孔细胞板中，加入20μLCNE2细胞生产的EBV-GFP病毒悬液，混合均匀，放置在37℃培养箱中孵育2hr。用16mL 10％ FBS RPMI1640培养基重悬1x10^6个AKATA细胞，在所述病毒与血清混合液中加入160μL的细胞悬液，放置在37℃培养箱中孵育48hr，使用BD公司的流式细胞仪LSRFortessaX-20检测AKATA细胞的病毒感染率，计算出与感染对照组相比，血清处理组的GFP阳性细胞数量减少比例，计算血清在B细胞感染模型的抑制率(％)，并根据抑制率及血清稀释倍数作图，拟合得到半数抑制稀释倍数ID50，即为血清在B细胞模型的中和滴度。
B细胞中和结果如图6中E所示，与游离形式疫苗及铝佐剂配伍疫苗相比，NP-gHgL，NP-gB及NP-gp42均介导产生了较高的B细胞中和滴度。
4.T细胞应答检测
T细胞应答检测具体如下：
1)在第三次免疫后第七天取小鼠脾脏，研磨为细胞悬液。
2)每孔取5x10^6细胞用对应抗原刺激(2μg)，在刺激第12hr时加入抑制剂monensin和brefeldin A，在刺激第16hr收集细胞，PBS洗三次，anti-Fc 4℃封闭30min。
3)表面marker染色：anti-mouse APC/Cy7-CD45，anti-mouse FITC-CD3，anti-mouse AF700-CD4，anti-mouse APC-CD8，live and death，4℃孵育30min，PBS洗三次。
3)用破膜固定试剂盒对细胞进行通透处理后，胞内marker染色：anti-mouseBV421-TNF-α，anti-mouse PC7-IFN-γ，anti-mouse PE-IL-2，室温孵育30min，洗涤三次，流式检测。
结果如图7中A～C所示，三种纳米颗粒疫苗免疫后能够在小鼠体内显著激活T细胞免疫应答。
以上结果表明三种纳米颗粒疫苗单独免疫均可在小鼠体内可引起高效的体液及细胞免疫应答。
实施例6组合纳米颗粒疫苗及其对照疫苗免疫在小鼠体内激活免疫系统评价
1.免疫程序
将5～8周雌性C57BL/6小鼠分为A～D四组，每组5只。采用尾根部皮下注射方式，按照表2中的免疫方案对小鼠进行免疫，并在第一次免疫后第2周、4周进行加强免疫，共计免疫3次。其中，Free-cocktail由EBV gB、gHgL和gp42重组蛋白与佐剂(CpG和MPLA)简单混合得到；NP-cocktail中的三种组分采用实施例1的方法制备得到(其中，三种纳米颗粒疫苗的抗原：CpG：MPLA＝3:1:1，将三种纳米颗粒疫苗按体积比1:1:1混合后制备)；Al-cocktail由EBV gB、gHgL和gp42重组蛋白与铝佐剂简单混合得到。
表2免疫方案
2.血清总抗结合滴度检测
检测方法同实施例5。
结果如图8中A～C所示，组合后三种抗原不产生相互干扰，纳米颗粒疫苗组合NP-cocktail相对于Free-cocktail及Al-cocktail，能够介导产生更高的针对三种蛋白的结合抗体滴度。
3.血清中和滴度检测
检测方法同实施例5。
结果如图8中D～E所示，与单一纳米颗粒(图6中D～E)及Free-cocktail，Al-cocktail相比较，纳米颗粒疫苗组合NP-cocktail介导产生了最高的上皮细胞及B细胞中和抗体滴度。
4.T细胞应答检测
检测方法同实施例5。
结果如图9所示，纳米颗粒疫苗组合NP-cocktail能够显著激活抗原特异性T细胞免疫应答。
以上结果表明NP-cocktail疫苗在小鼠体内可引起高效的体液及细胞免疫应答，且其介导产生的中和抗体滴度高于单一纳米颗粒疫苗。
实施例7单一、组合纳米颗粒疫苗及对照疫苗激活新西兰大白兔免疫系统评价
1.免疫程序
将新西兰大白兔分为A～F六组，每组3只。采用肌肉注射免疫方式，按照表3中的免疫方案对新西兰大白兔进行免疫，并在第一次免疫后第2周、4周进行加强免疫，共计免疫3次。
表3免疫方案
2.血清总抗结合滴度检测
检测过程同实施例5。
结果如图10中A～C所示，组合疫苗NP-cocktail介导了与各单一纳米颗粒疫苗相当水平的总抗滴度，且均高于Free-cocktail。
3.血清中和滴度检测
检测过程同实施例5。
结果如图10中D～E所示，组合疫苗NP-cocktail介导产生了最高滴度的中和B细胞及上皮细胞感染的抗体。
以上结果表明NP-cocktail疫苗在新西兰大白兔体内也可引起高效的体液免疫应答。
实施例8组合及单一纳米颗粒免疫新西兰大白兔产生的抗体在人源化小鼠模型中的保护效果评价
1.血清IgG纯化
将实施例7中各组免疫之后的兔子进行安乐死，并采集全血，离心后得到血清，用protein G介质纯化得到血清中总IgG。
2.人源化小鼠被动保护
将上述纯化得到的IgG(NP-gHgL，NP-gB，NP-gp42，NP-cocktail，Free-cocktail，PBS)按照1mg/mouse的剂量腹腔注射以SCID-Beige为背景的人源化小鼠，每组设置8只小鼠，不注射IgG及不攻毒阴性对照组(mock)设置五只小鼠，在IgG注射后24hr，通过腹腔注射100μL的25000GRU剂量的AKATA来源EB病毒，每周采集小鼠眼眶血，并监测体重。病毒注射后8周对小鼠进行安乐死处理，并观察小鼠是否出现癌变组织。使用EB病毒BALF5基因特异性引物(上游引物：5’-GGTCACAATCTCCACGCTGA-3’(SEQ ID NO:12)；下游引物：5’-CAACGAGGCTGACCTGATCC-3’(SEQ ID NO:13))进行实时荧光定量PCR鉴定采集的小鼠外周血中的EB病毒DNA拷贝数；使用商品化试剂盒对小鼠肿瘤组织切片进行EBER原位杂交检测，鉴定肿瘤细胞是否为EBV阳性。
结果如图11所示，图11中A为攻毒后小鼠体重变化情况：除PBS-IgG回输组外，其余组小鼠的体重均保持稳定，没有明显下降。
图11中B为小鼠生存曲线：NP-cocktail-IgG，Free-cocktail-IgG，NP-gp42-IgG回输组及mock组小鼠直到实验终点均未发生小鼠死亡
图11中C～D为小鼠外周血EBV拷贝数情况：NP-cocktail-IgG回输组及mock组小鼠外周血中未出现EBV拷贝数上升的情况
图11中E～F为小鼠肿瘤发生情况：1只NP-gHgL-IgG回输组小鼠，2只Free-cocktail-IgG回输组小鼠及5只PBS-IgG回输组小鼠发生了肿瘤，经H&E，EBER及hCD20染色，这些小鼠产生的肿瘤为EBV阳性淋巴瘤。
以上结果表明NP-cocktail疫苗免疫后介导产生的抗体具有最优的体内保护效果。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列包含a1)～a3)中任意一种：a1)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11所示；
a2)a1)所示氨基酸序列经一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；
a3)与a1)或a2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上或者90％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述重组蛋白的核酸分子。
3.与权利要求2所述核酸分子相关的生物材料，所述生物材料包含b1)～b3)中的至少一种：
b1)表达盒，含有权利要求2所述的核酸分子；
b2)重组载体，含有权利要求2所述的核酸分子或b1)中表达盒；
b3)重组细胞，含有权利要求2所述的核酸分子、b1)中表达盒或b2)中重组载体。
4.一种纳米颗粒疫苗，其特征在于，所述疫苗包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:8和/或SEQ ID NO:11所示的重组蛋白；优选地，所述纳米颗粒疫苗还包括免疫佐剂；优选地，所述免疫佐剂包括CpG和MPLA。
5.根据权利要求4所述的纳米颗粒疫苗，其特征在于，所述纳米疫苗还包括载体；优选地，所述载体包括阳离子脂质、疏水聚合物和两亲性聚合物；优选地，所述阳离子脂质包括但不限于含有阳离子头以及疏水的烷基尾的胺盐、季铵盐、鎓盐的永久阳离子和可电离阳离子脂质；和/或，所述疏水聚合物包括但不限于PLGA、PCL、PLLA、PLA、PGA、P(Glu)、PHB、PPO、PS、P(Asp)、PMMA、PEMA、PDMS、PBd、P4VP及其共聚衍生物中的至少一种；和/或，所述两亲性聚合物包括但不限于基于PEG的DSPE-PEG、Pluronic、DMG-PEG、PCL-PEG、PLA-PEG、硬脂酸-PEG，基于上述的亲水和疏水聚合物得到的两嵌段或者多嵌段聚合物的P(MMA-COO-MAA)、PEMA-PEI、PCL-PEI、PLGA-PEI、PCL-PEO、PEG-PCL-PDMAEMA中的至少一种。
6.权利要求5所述纳米颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将含有重组蛋白的溶液和含有CpG的溶液混合，得到溶液A；将含有阳离子脂质的溶液和含有MPLA的溶液混合，得到溶液B；
(2)将溶液A滴加至溶液B，搅拌，继续滴加含有疏水聚合物的溶液，搅拌得到溶液C；
(3)将溶液C滴加至含有两亲性聚合物的溶液中，搅拌，即可。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述重组蛋白、CpG、阳离子脂质、MPLA、疏水聚合物和两亲性聚合物的溶液的溶剂分别为Hepes缓冲溶液、水、乙醇、乙醇、DMSO和水。
8.权利要求1所述的重组蛋白、权利要求2所述核酸分子、权利要求3所述生物材料和/或权利要求4或5所述的纳米颗粒疫苗在制备产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述产品的功能为c1)～c6)中的任一种：c1)制备预防或治疗EB病毒感染相关疾病的药物；
c2)预防或治疗EB病毒感染相关疾病；
c3)预防或治疗肿瘤；
c4)抑制肿瘤生长；
c5)引发或增强机体免疫反应；
c6)制备EB病毒抗体。
10.一种产品，包含权利要求1所述重组蛋白、权利要求2所述核酸分子、权利要求3所述生物材料和/或权利要求4或5所述的纳米颗粒疫苗；优选地，所述产品还包含药学上可接受的辅料；优选地，所述辅料包括赋形剂、防腐剂、抗菌剂和/或免疫佐剂。
CN202310912664.4A 2023-07-24 2023-07-24 共负载CpG、MPLA双佐剂和EB病毒糖蛋白的纳米疫苗的制备和应用 Pending CN117024532A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310912664.4A CN117024532A (zh) 2023-07-24 2023-07-24 共负载CpG、MPLA双佐剂和EB病毒糖蛋白的纳米疫苗的制备和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310912664.4A CN117024532A (zh) 2023-07-24 2023-07-24 共负载CpG、MPLA双佐剂和EB病毒糖蛋白的纳米疫苗的制备和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117024532A true CN117024532A (zh) 2023-11-10

Family

ID=88632728

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310912664.4A Pending CN117024532A (zh) 2023-07-24 2023-07-24 共负载CpG、MPLA双佐剂和EB病毒糖蛋白的纳米疫苗的制备和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117024532A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117599209A (zh) * 2024-01-23 2024-02-27 中山大学 自组装纳米蛋白笼及其制备方法和应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117599209A (zh) * 2024-01-23 2024-02-27 中山大学 自组装纳米蛋白笼及其制备方法和应用
CN117599209B (zh) * 2024-01-23 2024-05-03 中山大学 自组装纳米蛋白笼及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111375055B (zh) 一种2019-nCoV亚单位疫苗组合物及其免疫方法
CN105920599B (zh) 以阳离子脂质体dotap为佐剂的疫苗及其制备方法
US9486510B2 (en) Method to enhance an immune response of nucleic acid vaccination
Lo et al. M cell targeting by a Claudin 4 targeting peptide can enhance mucosal IgA responses
KR101342641B1 (ko) 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자를 함유하는 면역보강제 조성물
CN102448491A (zh) 疫苗组合物和其使用方法
CN117024532A (zh) 共负载CpG、MPLA双佐剂和EB病毒糖蛋白的纳米疫苗的制备和应用
Qin et al. H9N2 influenza whole inactivated virus combined with polyethyleneimine strongly enhances mucosal and systemic immunity after intranasal immunization in mice
CN113354740B (zh) 一种猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒、制备方法及应用
US12098167B2 (en) Self-assembled nanoparticle containing gB protein of EB virus and preparation method and use thereof
CN104066444A (zh) 微粒疫苗制剂
CN105749264A (zh) 免疫活性组合物
CN108101966B (zh) 基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽及其在疫苗载体中的应用
JP2014527526A (ja) インフルエンザｈ５ワクチン
US9150619B2 (en) Method of elicting or inducing an immune response
US20230174588A1 (en) A vaccine against sars-cov-2 and preparation thereof
CN110638787B (zh) 一种防治鼻咽癌的亚单位纳米疫苗及其制备方法
CN115960259B (zh) 一种模块化组装双组分纳米颗粒制备方法及其应用
CN110772635B (zh) 流感病毒小体包被的仿生纳米疫苗及其制备方法
Kossovsky et al. Preservation of surface‐dependent properties of viral antigens following immobilization on particulate ceramic delivery vehicles
CN118320111A (zh) 一种eb病毒的纳米颗粒疫苗及其组合的制备和应用
Abera Bioscience A bacterial extracellular vesicle-based intranasal vaccine against SARS-CoV- protects against disease and elicits neutralizing antibodies to wild-type and Delta variants
CN117771361B (zh) 一种聚肌苷酸-聚胞苷酸复合物的脂质纳米佐剂及其制备方法与应用
Kim et al. Mosaic display of stable hemagglutinin monomers induces broad immune responses
WO2024086380A2 (en) Recombinant protein vaccines formulated with enantio-specific cationic lipid r-dotap and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination