JPH06506220A

JPH06506220A - Ｎ↑６−（ヒドラジノイミノメチル）リジン及び生体における一酸化窒素形成の阻止法

Info

Publication number: JPH06506220A
Application number: JP4509062A
Authority: JP
Inventors: グリフィス、オーウェン・ダブリュ
Original assignee: コーネル・リサーチ・ファウンデーション・インコーポレイテッド
Priority date: 1991-03-22
Filing date: 1992-03-13
Publication date: 1994-07-14
Anticipated expiration: 2016-08-13
Also published as: JP3199265B2; AU1683292A; NZ242029A; DE69227512D1; US5132453A; DE69227512T2; ATE173013T1; ES2122996T3; WO1992016666A1; EP0582630A1; EP0582630B1; EP0582630A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ｎ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジン及び生体における一酸化窒素形成の阻止法本発明はナショナル・インスティテユート・オフ・ヘルス交付番号ＤＫ３７１１６の下に少なくとも一部政府支援によりなされた。政府は本発明に確かな権利を有する。

技術分野本発明は生物学的−酸化窒素形成の新しいインヒビター等に向けられる。

発明の背景数十年間、ニトログリセリンが心血管疾患の処置において血管拡張剤としてヒトに投与されて来た。最近、このように投与されたニトログリセリンが、体内で、薬理学的に活性な代謝物である一酸化窒素に変換することが判った。さらにより最近になって、−酸化窒素は、内皮誘導弛緩因子類（ＥＤＲＦｓ）の重要な成分である正常代謝物としてアルギニンから触媒的に形成されることを示した。ＥＤＲＦｓは血流及び血管抵抗の調整に関係しているとして、最近徹底的に研究されている。血管内皮に加えてマクロファージ類も細胞傷害及び／又は細胞増殖抑制作用の成分である一酸化窒素を生体中で生産することを示した（イエンガー、アール、等、プロン−ディンゲス・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ、ニーニスエイ、８４巻、６３６９−６３７３頁、９／８７）。

さらに最近、アルギニンから一酸化窒素を形成する酵素、即ち一酸化窒素合成酵素が二つの異なるイソ型、即ち構成イソ型及び誘導性イソ型で生じることが確立された。構成イソ型は正常内皮細胞類、ニューロン類及び幾らかの他の組織類に存在する。内皮細胞類における構成イソ型による一酸化窒素の形成は、正常な血圧調節で役割を演じると考えられる。誘導性イソ型の一酸化窒素合成酵素は活性化マクロファージ類から分離され、内皮細胞類又は血管平滑筋細胞類での種々のサイトカイン類又はサイトカイン類の組合せにより誘導される。敗血症又はサイトカイン誘導ショックにおいて、観察された生命脅迫低血圧症は誘導性イソ型の一酸化窒素合成酵素による一酸化窒素の過剰生産を主として、又は全て負うと考えられる。確実な特異組織（複数もあり）はまだ知られていないが内皮及び血管平滑筋を含むよってある。

上述の生理的重要性から、体内での一酸化窒素生成を阻止する化合物についての研究がなされて来た。この効果を得るための使用が発見された最初の化合物はＮ６−メチル−Ｌ−アルギニン（本明細書ではＮＭＭＡと称する）である（パーマ −、アール・エム・ンエイ等、ネイチャー（ロンドン）、３３３．６６４−６６６頁、１９８８　＋バーマー、アール・エム・ンエイ等、バイオケミカル・アンド・パイオフイノカル・リサーチ・コミュニケイションズ　１５３．１２５１− １２５６頁、１９８８）。モルモット及びウサギへのＮＭＭＡの投与は血圧を上昇させることを示した（アイサカ、ケイ　等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケインヨンズ　１６０．２号、８８１−８８６頁、４／２８／８９：リース、ディー・ディー等、プロン−ディンゲス・オフ・ナショナル・アカデミイ・オフ・サイエンス・ニーニスエイ　８６巻、３３７５ −３３７８．５／８９）。この効果を得るための使用が発見された第二の化合物はＮ’−二トローＬ−アルギニン（本明細書ではＮＮＡと称する）である。本化合物は、そのより可溶性のメチルエステルとしてしばしば用いられ、−酸化窒素合成酵素の構成型の良好なインヒビターであるが誘導性のイソ型のインヒビターとしてＮＭＭＡよりも効力が低い（ニス・ニス・グロス等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケインヨンズ１７０．９６−１０３頁（１９９０））。さらに別のインヒビターはＮ６−アミノ−し−アルギニン（ＮＡＡと称する）である。本化合物及びそのインヒビターとしての用途はグリフイス、米国特許出願番号、０７／４０６．８９７に記載される。ＮＡＡは構成及び誘導性イソ型の一酸化窒素合成酵素の優れたインヒビターであり、イヌでの内毒素ショック及びサイトカイン誘導ショックで観察される重症低血圧を完全に変えることを示した。しかしながらＮＡＡは、これらの条件の低血圧を十分に調節するのに必要な時間にわたって投与したとき、幾らか毒性を示す。

本発明の要約広い局面では、本発明は構成イソ型の一酸化窒素合成酵素以上に誘導性イソ型の一酸化窒素合成酵素を優先的に阻止する試薬を、−酸化窒素合成阻止量、患者に投与することにより、かかる阻止の必要な磨者での一酸化窒素合成を阻止することに向けられる。

ここでは、生理的に活性なＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジン及びその製薬上許容しうる酸付加塩が体内での一酸化窒素合成のすぐれたインヒビターを構成し、構成イソ型の一酸化窒素合成酵素以上に誘導性イソ型の一酸化窒素合成酵素を阻止することにおいてＮＭＭＡＸＮＮＡ及びＮＡＡよりも選択的であり、そしてＮＮＡ及びその酸付加塩よりも実質的に低毒性であることを発見した。用語、Ｎ６−　（ヒドラジノイミノメチル）リジンは遊離塩基形でのＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジンを意味する。用語、生理的に活性なＮ’−（ヒドラジノイミノメチル）リジンはそのＬ−鏡像体を含んでいるＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジンを意味する：言いかえればＬ−鏡像体部分は生理的に活性である。

好ましくは生理的に活性なＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジンは５０％から１００％のし一鏡像体と残りがＤ−鏡像体である形で、例えば５０％Ｌ−鏡像体及び５０％Ｄ−鏡像体、ごく好ましくは１００％Ｌ−鏡像体で構成される。用語、製薬上許容しうる酸付加塩は、製薬の目的に許容されうるこれらの酸付加塩を意味する。

以下に述べる用途については生理的に活性なＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジン及びその製薬上許容しつる酸付加塩からなる群から選ばれた試薬の９９重量％（無水基準で）以上を含んでいる組成物が好ましい。

本明細書て、阻止を必要とする患者における一酸化窒素合成を阻止する方法は、生理的に活性なＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジン及びその製薬上許容しうる酸付加塩からなる群から選ばれた試薬の一酸化窒素合成阻止量を患者に投与することを含む。この方法の適用において、該試薬は、誘導性イソ型の一酸化窒素合成酵素により一酸化窒素の合成が増加したか増加する恐れのある患者に投与され、又、構成イソ型の一酸化窒素合成酵素以上に誘導性イソ型の一酸化窒素合成酵素を優先的に阻止する。

一酸化窒素の生合成、代謝又は生理的役割を明らかにするか調節するため、分離された器管、無傷の細胞、細胞ホモジネート及び組織ホモジネートによる研究を含むインビトロ研究でのアルギニンから一酸化窒素形成を阻止する本明細書での方法は、薬理的に活性なＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジン及びその製薬上許容しうる酸付加塩を、該器管、細胞又はホモジネートを含む媒体に、−酸化窒素形成を阻止するのに十分な濃度に加えることを含む。

用語、「患者」はアルギニンから一酸化窒素形成が起きるヒトを含む全ての動物を意味するよう本明細書で用いられる。本明細書での患者への使用方法は、現在の状態の治療での予防使用及び治療使用を意図する。

図面の簡単な説明図１は、実施例■の結果を示すイヌの血圧トレーソングを示す。

図２は、インヒヒタ〜濃度の機能として亜硝酸塩の形成により測定して誘導性酵素イソ型による一酸化窒素合成の阻止の程度を示し、そして実施例■の結果を描く。

図３は、インヒヒター濃度の機能として構成酵素イソ型による一酸化窒素形成の阻止の程度を示し、そして実施例■の結果を描く。

詳細な説明既に述べたように、本明細書において発明組成物はＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジン又はその製薬上許容しうる酸付加塩を含む。

Ｎ６−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジンは遊離塩基形で、構造式％式％Ｎ６−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｄ、Ｌ−リジンは遊離塩基形で、５０％Ｎ６−　（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジン及び構造式を有する５０％　Ｎ６−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｄ−リジンから成る。

製薬上許容しつる酸付加塩はより高いｐＫａにより窒素で最初に形成され、例えば塩酸、硫酸、酢酸、グルコン酸、リン酸、コハク酸、マレイン酸、クエン酸、付加塩を含む。これらはこの分野でよく知られた方法により作られる。

Ｎ６−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジンの酸付加塩は、以下の段階を含む方法により容易に製造される。

（ａ）水性溶液中、Ｎ’−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジンを形成する穏やかなアルカリｐＨでＬ−リジンとＳ−メチルイソチオセミカルバジドを反応させること、（ｂ）Ｎ’−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジンの不溶性フラビアン酸塩を形成させることにより未反応の出発物質からＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）−し−リジンを分離すること及び鎖環を単離すること、（Ｃ）水中、Ｎ６−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジンフラビアナートの懸濁液を強塩基イオン交換樹脂（水酸化物形）と撹拌することによりフラビアナートを除去して遊離塩基を形成させること及び樹脂を含んでいるフラビアナートを分離すること、（ｄ）得られるＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジンの溶液に製薬上許容しうる酸を加えてｐＨ中性の酸付加塩を形成させること、（ｅ）鎖環を水性アルコールから結晶化させること、そして鎖環を回収すること。

Ｄ、Ｌ形はり、Ｌ−リジンで出発する場合を除き上述のように容易に造られる。

５０％より大で１００％より小の種々のパーセントの鏡像体のＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジンは、適当なパーセントでＬ−形とり、Ｌ−形を混合することにより容易に製造される。

我々はより詳しく製造の各段階に目を向ける。

まず段階（ａ）に目を向ける。Ｌ−リジン及びり、Ｌ−リジン共に市販品から容易に入手しうる。Ｓ−メチルイソチオセミカルバジドは、チオセミカルバジド（市販品として入手しつる）とヨウ化メチルとを反応させることにより容易に製造される。一般的方法は、トムクツキク、エイ、ニス　、ケミカル・アブストラクツ、７２　：　９０１１３Ｃに記載されている。段階（ａ）の適当な反応溶媒は水である。

反応は、２５℃ないし１００℃で１ないし５０時間に及ぶ時間で、８−１０に及ぶｐＨて容易に実施される。段階（ａ）の生成物はＮ’−（ヒドラジノイミノメチル）す／ン及び未反応のリジンの水性溶液である。

段階（ｂ）において、ｐＨを約７に減するまで無機酸を添加し、元のリジンの等モル量、フラビアン酸を加えることにより、水に不溶で分離するＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジンフラビアナートを形成させて未反応のリジン及び無機塩からＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジンを分離する。分離された物質は要すれば、メタノールと共に粉砕し、水から再結晶することにより容易に精製される。

段階（Ｃ）において、樹脂は、水酸化物をフラビアナートと交換し、フラビアナートは樹脂に強固に結合する。水酸化物は、プロトン化Ｎ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジンからプロトンを除き水を形成しＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジンを遊離塩基形とする。樹脂の分離後、遊離塩基形でのＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジンの水溶液が残り、これは適当な緩衝化システムで、本明細書での方法に用いることができる。

段階（ｄ）において、酸付加塩を造るのに必要とされる製薬上許容しうる酸は、ｐＨ７まで加える。酸付加塩を必要とする場合、段階（Ｃ）および（ｄ）は、共に、ｐＨが９をこえない方法でそれらを加えることにより実施される。

段階（ｅ）の実際的達成には、段階（ｄ）の生成物は好ましくは、まず減圧で回転蒸発により濃縮する。

段階（ｅ）は、濃縮した、段階（ｄ）の生成物に、エタノール又はメタノール− エタノール混合物を混合することによって容易に実施され、これによりＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジンの酸塩が結晶し、濾過により容易に回収される。

Ｎ６−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジン及びその酸付加塩も、Ｌ−ホモアルキニン（商業的に入手できる）から、ニトロ化によりＮ’−ニトロ−Ｌ−ホモアルギニンを形成し、この化合物をＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）〜Ｌ− リジンへ部分還元する段階によって製造できる。ニトロ化は（グリーンシュタイン、ジエイ・ピー等、ケミストリイ・オフ・アミノ・アシッド　３巻、１８５２頁。

ノヨーン・ウイリイ・アンド・ソング・インコーホレイテッド　１９６１によりＬ−アルギニノについて既に記載されるように）発煙硝酸と発煙硫酸の混合物を用いて容易に実施される。部分還元は、溶液中の形成したＮ６−ニトロ−し−ホモアルギニンを適当な還元触媒（例えば木炭上ｐｔ、ｐｔｏ、木炭上Ｐｄ、及び還元分野でよく知られた他のもの）上、過剰の水素ガスにより還元することにより容易に実施される。適当な溶媒は水性酸、例えば１５％の酢酸水である。還元反応は室温で容易に実施されるが、例えば０℃から１００℃に及ぶ温度又はそれより高温を適用できる。還元反応は４Ｑｐｓｉの圧力で容易に進行するが、１から２０００ｐｓｉに及ぶ圧力で実施できる。生成物はイオン交換クロマトグラフィにより容易に分離する。

我々は今やここでインビボ方法に目を向け、それは、−酸化窒素合成阻止量の、生理的に活性なＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジン及びその付加塩から選ばれる試薬を、かかる阻止の必要な患者に投与することを含む。

患者の一群は病理学上低血圧の者を含む。

本グループの一クラスは特発性低血圧症の者である。

本グループ内の他のクラスは、薬剤誘発低血圧症、例えば抗腫瘍有効用量のサイトカイン、例えば腫瘍壊死因子及びインターロイキン−１の投与により誘発された低血圧症の者である。この場合、本明細書での方法に伴う共同投与は、さもなければ受け入れられない副作用を有する薬物の使用を可能にする。

本グループ内のさらに他のクラスは（敗血症性ショックを含む）ショックにかかっている者である。

１９８９年９月１３日に出願された「生物学性応答修飾物により起きた全身性低血圧の阻止」と題するロバート・ノー・キルボーン、ステイーブン・ニス・グロス・オーワエン・ダブリュ・グリフイス及びロハート・レビの特許出願第０７／４０６．９０９号を引用する。キルボーン等の出願は、本明細書で請求するものを含む化合物を、全身性低血圧を阻止するのに使用することを含む。

磨者の他のグループは、−酸化窒素形成の調節低下が強い免疫疾患、例えば自己免疫疾病又は移植目的用の治療免疫抑制の者を含む。

投与量に目を向けると、それは、所望する効果と個々の患者の反応性に依る。

例えば血圧を上げるには、血圧有効上昇量を投与する。免疫抑制を要する疾患には免疫抑制有効量を投与する。一般に、Ｌ−化合物についての投与量は、体重のＫｇ当り１０ｇｇから１００ｍｇ／ｋｇ体重に及び、好ましくは１ないし１０ｍｇ／ｋｇ体重が有用である。Ｄ、Ｌ−化合物については、投与量はＬ−化合物のそれの２倍である。

投与は、連続的に、或は単−又は多投与量で実施しうる。

投与は、例えば経口又は非経口（例えば静脈内に）経路により容易に実施される。

生理的に活性なＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジン及びその製薬上許容しうる酸付加塩は典型的な充填剤、調味料等と組合せて容易に投与される。

我々は、今やここてインビトロ方法に目を向ける。典型的には、培地は、心臓潅流培地、組織培養培地、細胞又は組織ホモジネート又は精製蛋白と用いられるインキュベーション培地を含む。処理された血管は典型的には血管、肺又は腎臓である。無傷の細胞は内皮血管又はマクロファーンを含む。ホモジネートは、例えば、心臓、血管、神経又は他の組織及び細胞からであることができる。生理的に活性なＮ’−（ヒドラジノイミノメチル）リジン又はその塩は、１ナノモルから３００ミリモルに及ぶａ変で培地に加える。

本発明を以下の実施例に示す。

実施例■ ３６．５ｇ（０，２モル）のし−リジンモノ塩酸を４００ｍｌのＩＭＮａＯＨに溶解した。その清浄溶液に４６．６ｇ（０，２モル）のＳ−メチルインチオセミカルバジドモノ塩酸を加えた。得られる溶液、ｐＨ約１０を撹拌しながら７時間７０℃で過熱した。その時点で反応混合物は、約５７％のＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジン、４１％Ｌ−リジン及び以下に示すようにＨＰＬＣにより認められる二つの少しの副生成物を含有した。次いで、反応混合物を、濃ＨＣＩの添加（約１３〜１５Ｉ１１１）によりｐＨ７まで中和し、０℃に冷却した。その冷却、撹拌溶液に、フラビアン酸の溶液（１００ｍｌの温水中、６２．８ｇ、０．２０モル）を数回で加えた。暗褐色のゴム状物質が形成し分離した。上積溶液をデカントし、残渣を１５０＋ａｌのメタノールに懸濁した。撹拌後、赤みがかったオレンジ色の固体が沈澱し、濾過により捕集した。固体をメタノール（３Ｘ　５０ｍ１）　、エタノール（２Ｘ　５０Ｉｌｌ）及びエチルエーテル（２Ｘ　５０ｍ１）て洗浄した。高真空下、数日乾燥後、粗Ｎ８−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジンフラビアナート（第一収穫物）は４２．３ｇ　（０，０８２モル、収率４１％）であった。元のゴム状固体からデカントした水性溶液を０℃に冷却することにより１．７．５ｇの結晶性物質の第二収穫物（０，０３４モル、収率１７％）を得た。

第一収穫物物質を３００ｍ１の沸騰メタノール中、５分間撹拌し、次いで熱濾過した。固体を熱メタノール（３ｘ　５０＋＋＋１）　、室温メタノール（２Ｘ　５０＋ａｌ）及びエーテル（２Ｘ　５０Ｉ！ｌ）で洗浄し、高真空下に乾燥した（重量＝２１．８３ｇ）。

次いで固体を２００ｆｆｉｌの水に懸濁し、ｌＱＭＮａＯＨの添加によりｐＨを７．５に上げた。固体は溶解して濃いオレンジ色の溶液となった。次いで濃ＨＣＩの添加によりｐＨを２５に下げ、混合物を０℃に冷却することによりＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジンフラビアナートが結晶化した。８時間後、結晶を濾過により集め、メタノール（３Ｘ５０ｍｌ）、エタノール（２Ｘ　５０＋＊ｌ）及びエーテル（２Ｘ５０ｍｌ）で洗浄した。高真空下の乾燥後、収量は１６ｇのＮ’−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リシンフラヒアナート（０，０３１モル、全収率１６％）であった。

フラヒアン酸を除去し、製薬上許容しうるＮ６−　（ヒドラジノイミノメチル） −Ｌ−リジンモノ塩酸塩を形成させるため、１６ｇの上記生成物を１５０ｍ１の水に懸濁し、約４２ｇの空気乾燥ダウエックス−１（２００−４００メツシユ、強塩基イオン交換樹脂ＯＨ形）を少量づつ静かに加えた。ｐＨを注意深くモニターして、添加の速度をｐＨが８．５以下を維持するよう調節した。中和が完了に近づいたとき、ｐＨを７と８５の間に維持するのに必要とする場合濃ＨＣＩを添加した。全てのイオン交換樹脂を添加したのち、＃ＨＣ１でｐＨを７，０に調節した。

次いて溶液を濾過して樹脂（それは中和されフラビアン酸を結合する）を除き、明褐色濾液を５ｇの酸洗浄脱色木炭で処理した。セライト（けい藻土フィルター物質）を通す濾過により木炭を除去し、無色の濾液を減圧での回転蒸発により約ｌＱｍｌまで減少させた。得られる清澄溶液に、６０１１のメタノール、４０ｍ１のエタノール及び２ｍｌの水を含む溶液１００ｆｆｌｌを加えた。得られる溶液を減圧でゆるやかに蒸発させて（浴温、約１０℃）　、Ｎ’−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジンモノ塩酸の結晶が自然に形成した。結晶を冷エタノール（３Ｘ２５＋ｌｌ）及びエーテルで洗浄した。Ｐ２Ｏ５上、高真空上乾燥後、７．０ｇ　（２９１１モル、全収率１５％）の重さて第一収穫物から収率３６％であった。

最終物質は〉９９％純粋ＨＰＬＣてあった（以下参照）。Ｃ７Ｈ，ａＮ５０２ｃｌ計算値：Ｃ＝３５．０７％、Ｈ＝　７．５８％及びＮ＝２９．２２％。実測値：Ｃ＝３５、４０％、Ｈ＝　７．３０％及びＮ＝２８．７９％。

Ｎ６−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジンの純度は、８＋ｓＭ酢酸第二銅及び１７ｍＭＬ−プロリンを含むキラル溶媒を用いるＣ−１８被覆ンリカの４３ ×２５０ｍｍカラムで、１　ｍｌ／分でポンプ操作した逆相ＨＰＬＣにより測定した（ギル−アブ、イー、ティシュビー、エイ及びヘアー、ピー・イー　（１９８０）ジャーナル・オフ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ１０２．５１１５ −５１１７）。測定は０゜５　ｍｌ／分てポンプにより送ったＯ−フタルアルデヒド溶液によるポスト−カラム誘導体化後インライン蛍光モニターを用いて行った（上記のようにギル−アブ、イー、等）。この系において、Ｌ−リジン及びＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジンはそれぞれ６．３及び２０分に溶出する。

実施例■ Ｎ＠−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジンの毒性を試験するため、３０ｋｇの目覚めているイヌに薬剤の塩酸塩を２０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で単一静脈内（ｉ。

■）ポーラスとして投与した。毒性の徴候及び血圧の上昇はなかった。３０分後、２０ＩＩ１ｇ／ｋｇの追加投与量を与え、時間当りｌＱｍｇ／ｋｇ体重の速度でｉ、■注入を開始した。注入を５時間続けた。イヌは血圧で有意な変化を示さず、態度に変化を示さず、嘔吐又は不安定を示さなかった。２４時間後、イヌはまだ一般的に良好に見えたが、イヌに痛みのないようにみえる、周期的に分けられたミオクロヌスの痙れんを示した。痙れんは２４時間以内に終り（実験開始後４８時間）、イヌは全ての点で正常で良好に見えた。

同様の条件の下に同じ投与量のＮ６−アミノ−し−アルギニンを与えたイヌは大きな発作を経験した。

実施例■ Ｎ６−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジンの長期毒性を試験するために、薬剤の塩酸塩の０．２０９ｉ１の２００■Ｍ溶液（４８ｍｇ／＋１）を３台のアルゼット浸透ポンプ（モデル２００１）の各々に供給し、ポンプを３匹の個々のスイス−ウェブスターマウス（重量３０．７．３４．８及び３３．４　ｇ）の背中に、ベンドパルビタール麻酔下、皮下に移植した。各ポンプは０．９２±００５μｍ／時の速さで１週間、薬剤の溶液を送付した。マウスは毒性の徴候を示さず、４週間より以上生存した。そこで実験を終えた。

実施例■ Ｎ６−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジンの効果を試験するため、２８ｋｇの絶食したイヌをベントハルビタールで麻酔しく　２５ｍｇ／ｋｇＳｉ、　ｖ、　）　、気管に（ｏｒｏｔｒａｃｈｅａｌｌｙ）挿管してバーバードポンプて通気できるようにし、中枢カテーテルを経て動脈血圧をモニターできるように取付けた。一定の正常血圧を約９０分間観察したのち、２ｍｇ／ｋｇ体重のエントドキノン（シグマ・ケミカル・カンパニーから得られるエセリノア・コリリポ多糖体）を含む溶液を静脈内ポーラス注入として与えた。血圧は数分後、速やかに低下し自然に回加した。約１５０分に開始し、続く３５分にわたり続けて、イヌは敗血症（エントドキノンの）ンヨ、ツクの様子、特徴において除々に低血圧症となった。平均動脈血圧が約７ＱｍｍＨｇに減少したとき、２０ｍｇ／ｋｇのＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジンモノ塩酸（ＨＡＡと称す）のポーラス陵内注入を行った。血圧は数分以内に約３０ｎ＋ｍＨｇまで増加し、約４５分間、生理的に許容しうる範囲を維持した。その時点て、イヌに４００ｍｇ／ｋｇのＬ−アルキニン（Ｌ−ＡＲＧと称した）、−酸化窒素合成酵素の基質及びＬ −アルギニン結合部位と競合する一酸化窒素合成酵素の特異的拮抗物質のポーラス陵内注入を行った。し−アルギニンによる逆転によって、Ｎ６−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジンで見られる血圧上昇は一酸化窒素合成酵素の阻止によることが確立した。本実施例の結果は図１に示す。

実施例Ｖ確立したインヒビターに対応するサイトカイン誘発−酸化窒素合成酵素アイソザイムのインヒビターとしてＮ’−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジンの効力を試験するために、培養内皮細胞によるインビトロ研究を実施した。培養マウス脳内皮細胞を、１０００単位／ｍｌのγ−インターフェロンと５０００単位／ｍｌの腫瘍壊死因子の存在で、酵素誘発を起こすために既に示された条件（ｒＬ −アルギニンからの一酸化窒素、生物調節系」　（ニス・モンカダ及びイー・エイ・ヒグス等）６１−６７頁、エルスピア−・サイエンス・バブリッ／ヤー、アムステルダムにおけるアール・キルボーン及びピー・ベロニ（１９９０））で、１８時間生育した。対照細胞用に、培養培地は５０％デュルベツコ修飾イーグル培地、４５％ハムＦ１２培地と５％ウン胎児血清を含んだ。実験グループでは、細胞の培養培地は、上記表示の成分及び種々の濃度のＮ’−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジン（ＨＡＡ）　、Ｎ’−メチル−Ｌ−アルギニン（ＮＭＭＡ）　、又はＮ６−アミノ−Ｌ−アルギニン（ＮＡＡ）を含有した。ＮＭＭＡ及びＮＡＡは、−酸化窒素合成酵素の誘発しうるイソザイムの既述のよく特徴づけられたインヒビターである（グロス、ニス・ニス等（１９９０）バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ　１７０．９６− １０３）。−酸化窒素形成は、培養培地中の硝酸塩の濃度の増加を追跡することによりモニターした。−酸化窒素はインキュベーターの条件下、自然に硝酸塩に酸化する。実験結果は図２に示す。

図２に示すように、ＨＡＡは、これまでに確認された最善の競合インヒビター、ＮＡＡ又はＮＭＭＡよりも酵素の実質的により良好なインヒビターである。図２に示すように、約５０％阻止に必要な投与量（ＥＤ５０％近似）は、ＮＭＭＡについて０．１２５ミリモル、ＮＡＡについて０．０６２５ミリモルそしてＨＡＡについて０．０１５６ミリモルて、ＨＡＡはＮＡＡよりも約４倍有効でＮＭＭＡよりも約８倍有効であることを示す。

実施例■ ラットに動脈環によるインヒドロ研究を実施し、構成イソ型の一酸化窒素合成酵素の既知の他のインヒビターに対応するＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ −リジンの効果を試験した。大動脈環（２−３ｍｍ）を分離し、モルモットからの静脈環について既に記載されるように（オウ・エイ・ヘイズハン等、（１９９０）ジャーナル・オフ・ファーマコロジイ・アンド・エクスペリメンタル・テラビューティクス　２５５．１４３８−１３５３）　、３７℃で９５％０□及び５％ＣＯ２のガスで処理したクレープスーヘンゼイト溶液を含む５ａ＋１カラス容器中に２．ＯＯｇの静止張力（ｒｅｓｔｉｎｇ　ｔｅｎｓｉｏｎ）の下に懸垂した。次いで大動脈環は、浸漬溶液に０．０３μＭフェニルエフリンを添加することにより収縮させ、環の張力を測定した。次に、血管内皮中、構造−酸化窒素合成酵素による一酸化窒素の形成を促進するアゴニスト、アセチルコリンを１μＭの最終濃度まで加えた。アセチルコリンに反応して形成した一酸化窒素力伏動脈環の血管平滑筋を弛緩させ、張力の減少を測定した。−酸化窒素合成酵素のインヒビターは、アセチルコリンがフェニルエフリン収縮大動脈環の弛緩を起こす割合を減じる。この研究で、環はフェニルエフリンにより収縮し、アセチルコリンにより弛緩し、そして大量の投与量のインヒビターを浸漬溶液に加えるとアセチルコリンの効果を無くした。結果は図３に示す。

インヒビターの投与量をＸ軸に示す。「弛緩の阻止（％）」と標識されるＹ軸上で、０％はアセチルコリンにより起きる弛緩の阻止のない状態を示し、１００％はアセチルコリンの弛緩効果が完全に無くなったインヒビターに対応する最大収縮の状態を示す。インヒビターの有効性は典型的には、アセチルコリンにより起きる弛緩の５０％を失なわせるに必要な濃度（ＥＤｓｏ）を基に比較する。図３に示すように、Ｎ６−ニトロ−し−アルギニン（ＮＮＡ）　、Ｎ’−アミノ−Ｌ −アルギニン（ＮＡＡ）　、Ｎ’−メチル−Ｌ−アルギニン（ＮＭＭＡ）及びＮ６−（ヒドラツノイミノメチル）−Ｌ−リジンについてのＥＤ、。を測定し、それぞれ約１゜５ｕ〜１．４．２％Ｍ、１０．２％Ｍ及び１０．３１１Ｍであった。これは、Ｎ８−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジン（ＨＡＡ）がＮＮＡまたはＮＡＮよりも構成イソ型の一酸化窒素合成酵素のより有効でないインヒビターであり、ＮＭＭＡと似ていることを示す。実施例Ｖに示すようにＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジンは誘導イソ型の一酸化窒素合成酵素のインヒビターとしてＮＭＭＡ及びＮＡＡよりもはるかに有効である。名付けた化合物中、ＮＮＡは誘導イソ型の最も有効でないインヒビターである（ニス・ニス・グロス等（１９９０）バイオケミカル・アンド・バイオフィンカル・リサーチ・コミュニケーションズ１７０．９６−１０３）。実施例Ｉにおいて、Ｌ−リジン等モル量のり、Ｌ−リジンで置き換えると、純粋のＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｄ、Ｌ−リジンモノ塩酸が得られる。

実施例■及びＶにおいて、Ｎ６−（ヒドラジノイミノメチル）−Ｌ−リジンを、投与量又は濃度の二倍量Ｎ６−（ヒドラツノイミノメチル）−Ｄ、Ｌ−リジンで置き換えると、血圧上昇及び内皮細胞を誘発することによる硝酸塩形成の阻止の実質的に等しい結果が得られる。

発明の実施態様の多くの変形は当業者にとって明らかである。従って、本発明は請求の範囲により定義する。

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Claims

【特許請求の範囲】

１．生理的に活性なＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジン又はその製薬上許容しうる酸付加塩。
２．Ｎ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジンのモノ塩酸塩酸付加塩である請求項１の化合物。
３．一酸化窒素合成の阻止を必要とする患者の一酸化窒素合成を阻止する方法であって、該方法は、一酸化窒素合成阻止量の生理的に活性なＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジン及びその製薬上許容しうる酸付加塩からなる群から選ばれる薬剤を該患者に投与することを含む。
４．患者が誘導イソ型の一酸化窒素合成酵素により一酸化窒素の合成を増加したか増加させる危険にさらされている、請求項３の方法。
５．該薬剤を投与し、構成イソ型の一酸化窒素合成酵素以上に誘導性イソ型の一酸化窒素合成酸素を優先的に阻止する、請求項４の方法。
６．該薬剤を投与し、構成イソ型の一酸化窒素合成酵素以上に誘導性イソ型の一酸化窒素合成酵素を優先的に阻止する、請求項３の方法。
７．生理的に活性なＮ６−（ヒドラジノイミノメチル）リジン及びその酸付加塩からなる群から選ばれた薬剤を、分離した器官、無傷の細胞、細胞ホモジネート又は組織ホモジネートを一酸化窒素形成を阻止するのに十分な濃度を含む媒体に加えることを含む一酸化窒素の生合成代謝又は生理的役割を明らかにし、又は調節する方法。
８．一酸化窒素合成の阻止を必要とする患者の一酸化窒素合成を阻止する方法であって、該方法は、構成イソ型の一酸化窒素合成酵素以上に誘導型一酸化窒素合成酸素を優先的に阻止する薬剤を、一酸化窒素合成阻止量、該患者に投与することを含む。