JPH06505255A

JPH06505255A - 皮膚病治療薬の調製へのテトラヒドロ−チエノピリドインドール誘導体の使用

Info

Publication number: JPH06505255A
Application number: JP4505618A
Authority: JP
Inventors: ヘーグマン　ルッツ
Original assignee: ブロカデス　ファルマ　ベスローテン　フェンノートシャップ
Priority date: 1991-02-14
Filing date: 1992-02-14
Publication date: 1994-06-16
Also published as: EP0499337A1; AU1351192A; WO1992014461A1; IE920483A1; IL100959A0; CA2101750A1; ZA921101B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】皮膚病治療薬の調製へのテトラヒドロ−チェノピリドインドール誘導体の使用本発明は、過増殖性（ｔｒｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）および／又は炎症性（ｉｎｆｌａｎｍｔ−ｏｒｙ　）の皮膚病治療のために用いる７、８、９、１０−テトラヒドロ−チェノ−〔３、２−ｅ〕−ピリド−〔４、３−ｂ〕インドール誘導体およびその薬学的に許容しつる酸付加塩を含む製剤に係るものである。

発明の背景な副作用を引き起こすためその適用は制限されて（Ｘる。

欠である長期間の投与をした場合にはそれが著ししＡ０引き起こすことが多いということも証明されている。さらにこの薬は衣服や肌に強いじみを生じさせ、美容上の難点があった（Ｓｈｒｏｏｔ　ｅｔ　ａｌ、（１９７６）　ｉｎ　：Ｐｓｏｒｉ−ａｓｉｓ（Ｆａｒｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ　、ｅｄ）、Ｙｏｒｋｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｏｏｋｓ　、　ＮＹ、　ｐｐ、３２７−３３６：ＭｃＤ盾獅≠撃■ （１９８３）　ｉｎ：　Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　ｏｆ　Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ（Ｂａｄｅｎ、　ｅｄ）　、Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐ窒■唐刀@０ｘ− ｆｏｒｄＳｐ　ｐ、　２０８−２１０］、さらに多くの研究において、アントラリンが動物モデルにおいて発癌性を示すことが証明されている［Ｂｏｃｋ　ａｎｄ　Ｂｕｒｎｓ（１９６３）　、Ｊ、Ｎａｔｌ。

Ｃａｎｃ、　［ｎｓｔ、３０二３９３−３９７；Ｓｅｇａｌ　ｅｔ　ａｌ、（１９７１）　、　Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、１４：１１５２−１P５４］。

局所的に使用する物質としてはコールタールもあるが、アントラリンの場合と同じ欠点を有している。またコールタールも動物において皮膚癌を誘導することが示されている。

乾せんの治療に用いられる薬としては他に皮質ステロイド、ビタミンＤ誘導体、レチノイド、シクロスポリンＡ、メソトレキサートがある。また光化学療法も用いられている。

皮質ステロイドは長期間局所的に用いると皮膚の変質劣化を引き起こす［Ｍｅｙｒ−ｉｃｋ　Ｔｈｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｂｌａｃｋ（１９８５）　ｉｎ：ＩＪｏｄｅｌｓ　ｉｎ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｍａｉｂａｃｈ　ａｎп@Ｌｏｗｅ。

ｅｄ、）　Ｂａ５ｅＬ　ｖｏｌ　２．ｐｐ　３０−３４］。

ビタミンＤ誘導体は局部的にも全身的にも投与されるが、カルシウム代謝に影響を及ぼし、高カルシウム血症や骨の脱灰を引き起こす（ｄｅ　Ｌｕｃａ（１９７６）　Ａｍ、　Ｊ。

ＣＩ　ｉｎ、　Ｎｕｔｒ、、２９：１２５８］。

シクロスポリンＡ、レチノイド、およびメソトレキサートは乾せんの治療にとても有効であるが強い副作用も有している。シクロスポリンＡは元来、移植手術において免疫抑制剤として使用するために開発されてきたものであるが、腎毒性がとても強く、高血圧症を誘発し、また、コレステロール値やトリグリセリド値を上昇させる［Ｂｒ１ｔ、Ｊ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、（１９９０）１２２：３６５；　Ｆｉｆｔｈ　［ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐｓｏｒｉ≠刀| ｉｓ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、　Ｊｕｌｙ　ｔｏ−１４，１９９Ｌ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ］。

メソトレキサートも同様の副作用をもたらし、また免疫抑制性を有し、細胞増殖を非特異的に阻害する［Ｒｏｅｎｉｃｈ　ａｎｄ　Ｍａｉｂａｃｈ（１９９１）：Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ　、ｉｎ：　Ｐｓｏ−ｒｉａｓｉｓ、　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋｌ。

レチノイドは催奇形性を有することが示されているため、妊娠の可能性がある患者の治療には使用できない。さらにこの薬は脱毛を促進し、爪を脆くし、視覚障害や脂質代謝の異常を促進する［上述のＰｓｏｒｉａｓｉｓ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　１９９１］　ｏこれらの強い副作用を除くために、多くの試みが局所的処方を発達させるためになされてきた。しかし、現在のところ、治療効果を示すそのような方法は完成していない。

現在、重い乾せんの治療には全身的光化学療法を用いること多い［ＰＵＶＡ　、　ｉ、ｅ。

ｏｒａｌ　ｐｓｏｒａｌｅｎ　ａｎｄ　ＵＶＡ　ｌｉｇｈｔ］　ａこの治療法は患者の細胞のゲノムの構造に直接の変化を引き起こす危険を持つために、潜在的に変異原性、発癌性を有している。

近年、細胞の情報伝達、すなわち、結果として細胞応答を誘導する膜を通じての細胞外情報伝達に関する分野の研究が進んできた。細胞増殖の調節においてホスフォイノシタイドが重要な役割を果たすということが広く認められている［Ｂｅｒｒｉｄｇｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）、Ｊ、Ｃｅ１１．Ｓｃｉ、５ｕｐｐ１．３：　１８７−１９８］　。イノシタイドカスケードを通じた情報伝達の間に、２種類の２次メツセンジャーすなわちジアシルグリセロールとイノシトール三リン酸が生成し、これらがプロティンキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化する。また、ＰＫＣはホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）のような腫瘍促進性のホルボールエステルに対する細胞の受容体として同定されている。それゆえ、ＰＫＣが細胞増殖の調節において重要な役割を演じていることが強く示唆される［Ｎ１５ｈｉｚｕｋａ　（１９８４）　、Ｎａｔｕｒｅ　３０８：６９３−６９８］。

現在までのところ、ケラチノサイトの増殖の調節についての有用な情報はとても限られている。ホルボールエステルはｉｎ　ｖｉｖｏでマウスの皮膚に投与した場合、上皮の過形成と炎症を誘発することが示されている［Ｍａｒｋｓ（１９８３）、Ｃａｒ−ｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　４：１４６５−１４７０］。上皮細胞の培養系においてＰＭＡは細胞増殖とケラチノサイトの分化を誘導することが分かっている［Ｈａｗｌｅｙ　Ｎｅ１ｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）、Ｅｘｐ、Ｃｅ１１．Ｒｅｓ、１３７：１５５−１６７］、さらにＰＫＣ活性とホルボールエステルの結合がヒトのケラチノサイト細胞で検出されている（Ｓｎｏｅｋ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）、Ｅｘｐ、　Ｃｅ１１．　Ｒｅｓ、　１７２：１４６−１５７）。これよりＰＫＣはケラチノサイトの増殖の調節に関係していると考えられる。

ＰＫＣが炎症応答の鍵となる反応であるヒト白血球からの反応性酸素種の放出に関与しているという証拠もある［Ｗｙｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６２：１２０４８−１２０５３１゜臨床的に乾せんは上皮の過増殖と炎症によって同定されるので、ＰＫＣはこの病気の病態生理学において重要な酵素であると考えられている。ＰＫＣはヒトの表皮に存在し［Ｆｉｓｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）、Ｊ、　［ｎｖｅｓｔ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、８９：４８４−４８８１、さらに乾せんの皮膚と健康な皮膚を比較する最近の研究により、ＰＫＣの活性と分布の相違が示された［Ｈｏｒｎ　ｅｔ　ａｌ（１９８７）　、Ｊ、　［ｎｖｅｓｔ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、８８：２２０−２２２：　［ｎｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）、Ａｒｃｈ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、Ｒｅｓ、２８０：４５４−４５５］。

ＧｕｐｔａらはスフィンゴシンがＰＭＡ誘導性の炎症、過形成、およびマウスの皮膚におけるオルニチンデカルボキシラーゼの誘導とＰＫＣの活性化を阻害することを報告している［Ｊ、　Ｉｎｖｅｓｔ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、　（１９８８）　、９１：４８６−４９１］、これはスフィンゴシンが高濃度（細胞毒性濃度）の場合、ヒト白血球からの反応性酸素種の生成を阻害するという先の報告と一致する［Ｗｉｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２６１：１２６１６−１２６２３］。国際特許出願　ＷＯ８８１０１８６９においても炎症や乾せん、腫瘍の転移の治療にスフィンゴシンやスフィンガニンのような両親媒性長鎖塩基の使用を提唱している。しかしながら、スフィンゴシンは細胞の分化を阻害することが示されているが［Ｍｅｒｒｉｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８の、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａ＋　２６１：１２６１０−１２６１５］、乾せんにおいてはケラチノサイトの増殖は促進し分化は抑制されているので、大きな欠点となってしまう。さらにスフィンゴシンは線維芽細胞の増殖を刺激することが分かっているので［Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９０）　、Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣｈｅＩＬ２６５ニア６−８１１、皮膚疾患の治療に使用できる可能性は小さい。スフィンゴシンは様々な酵素に影響を及ぼすけれどもＰＫＣを阻害することも知られている［Ｈａｎｎｕｎ　ｅｙ　ａｌ。

（１９８６）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１：１２６０４−１２６０９］。

Ｇｕｐｔａら（上述）は乾せんのような炎症性疾患においてＰＫＣ阻害剤の利用可能性を提唱している。しかしスフィンゴシンを調べた結果、この仮説から、ＰＫＣを阻害する化合物なら乾せんの治療薬として適切であるという結論には至らなかった。線維芽細胞の増殖の刺激といった副作用の中にはＰＫＣ非依存性の機構によって仲介されるものがあることがわかっており、またＧｕｐｔａらの仮説を否定するわけではないけれども、乾せんの治療に有用なＰＫＣ阻害剤はまだ同定されていない。

この状況を示す１つの例として、もっとも強力なＰＫＣ阻害剤の１つであるストロスポリンがある［Ｔａｍａｏｋｊ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｏｎｕｎ。

１３５　＋３９７−４０２１０この薬はヒト好中球において炎症反応を阻害することが述べられているが［５ａｋｏ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４８：４６４６−４６５０１、単離されたマウス上皮細胞における細胞増殖のマーカー酵素であるＰＭＡ誘導性オルニチンデカルボキシラーゼ活性を阻害することはできなかった［Ｋｉｙｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｏｎ、　１４８　ニア４０−７４６］、さらにマウスの皮膚の研究においてストロスポリンは腫瘍促進活性を持つことがわかった［Ｙｏｓｈｉｚａｔｖａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９０）　、Ｃａｎ−ｃｅｒ　Ｒｅｓ、５０：４９７４−４９７８］。もちろんこの影響によりストロスポリンを臨床的に使用することはできない。ストロスポリンがこれらのあるいは他の多くの好ましくない効果を示すのは、多くの酵素に共通な結合部位であるＡＴＰ結合部位と相互作用することによってプロティンキナーゼを非選択的に阻害するためであると考えられている（Ｒｕｅｇｇ　ａｎｄ　Ｂｕｒｇｅｓｓ（１９８９）　、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｎｍｅｏｌ、　Ｓｅｔ。１０二２１８−２２０〕。さらにこの薬はケラチノサイト・の増殖を効率よく阻害するけわども［Ｈｅｇｅ−ｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１，９９１）　、Ａｒｃｈ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、Ｒｅｓ、２８３：４５６−４６０１、上皮細胞において形態的変化を引き起こし［ＨｅＨｅｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９９１）、Ｊ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、　９４：５７８Ｌおそらくこれはこの薬剤の腫瘍促進活性と関連のある副作用である。

既知のＰＫＣ阻害剤は好中球におけるケラチノサイトの増殖と炎症反応という効果を有し、乾せんに有効であるにもかかわらず、その臨床的使用を制限したり妨げたりする大きな欠点を有しているように思われる。興味深い、−とに、抗層せん剤。アントラリンがＰＫＣを阻害し、この機構によって臨床的効果を果たしていることが最近分かった［Ｈｅｇｅｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９０）、５ｋｉｎ　Ｐｈａｒｍｃｏｌ、３：１９６］　。しかしよく示されているアントラリンの副作用、すなわち激し、い皮膚炎の生成もまた相対試験シスデｌ、５で測定された。これはこの薬剤がヒト好中球が刺激さｉｌ、、ｆ’いない場合にそごから炎症仲介物質である反応性酸素種を放出させるためである。

σ、８．９、ｌＯ−テトラヒト３−ｂ）インドール誘導体はヨーロッパ特許ＥＰ−Ｂ−００１２３４７とＥＰ− Ｂ・−０１２０４３９に係る物質である。これらの化合物は最初全身治療のための抗抑制剤として開発されｆ：：［ＧＩａｓｅｒ　ａｎｄ　Ｓｅｉｃｊｅｌ（１９８７）、Ｄｒｕｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆｕｔｕｒｅ１２：５６２−５６４］。

後にゲ斗うヒト泊ーヂエノビリドインドール誘導体のグループに属するヂフルカルビン（ｔｉｆｌｕｃａｒｂｉｎｅ）とその構造的アナログが驚くことにカルモジュリンと結合することがわかった［Ｓｃｈｍｉｄｔ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９０）　、Ｅｕｒ．　、１．　Ｐｈａｒｍａｅｏｌ。

１８９：４１１−４１８］．さらにチフルカルビンはｉＨ　Ｖｉｔｒｏの試験でＰＫＣ活性を著しく阻害することがわかった［Ｈｅｇｅｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）、Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ　Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ　３７０：９０８１　。

発明の要約一般式Ｉの７、８、９、■０ーテトラヒドローチェノー〔３、２−ｅ〕−ピリド −　〔４、３−ｂ〕インドールとこの化合物の薬学的に許容される酸付加塩の使用が上皮の過増殖性４６よび／又は炎症性の皮膚疾患の治療薬の調製のために摂供Ｒ１は水素ま／−はＣ，からＣａｉでのアルギル基であり、Ｒ，どＲ，は同一でも異なー）でいてもよく、水素またはハロゲ゛／である１３過増殖性および／又は炎症性皮膚疾患の治療のために上述した一般式■の化合物を含む組成物も提供される，、図の説明図Ｉはケラチノサイト細胞の増殖（ＨａＣａＴｍ胞）の阻害をグラフで表したものである。〔′Ｈ〕ーチミジンと（”Ｃ）−アミノ酸の付着細胞への取り込み量をチフルカルビンの濃度を変えて測定した結果である。

図２はケラチノサイト細胞の増殖（ＨａＣａＴ細胞）の阻害をグラフで表したものである。付着細胞の総タンパク含有量をチフルカルビンの濃度を変えて測定した結果である。

図３はヒト多形核白血球（ＰＭＮＬ）からの反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成の阻害をグラフで表したものである。ルシゲニンで増幅されたケミルミネッセンス（自発的なものとオプソニンで処理したジモサンで処理し活性化したもの）をチフルカルビンの濃度を変えて測定した結果である。

図４はヒト多形核白血球（ＰＭＮＬ）からの反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成の阻害をグラフで表したものである。ルシゲニンで増幅されたケミルミネッセンス（自発的なものとポルポールエステルＰＭＡで処理し活性化したもの）をチフルカルビンの濃度を変えて測定した結果である。

図５はチフルカルビン（ＴＦＣ）とストロスポリンの濃度を変えた場合のヒトケラチノサイトによる角質外皮の自発的な形成におよほす影響をグラフで表したものである。

図６はチフルカルビン（ＴＦＣ）とストロスポリンの濃度を変えた場合のヒトケラチノサイトによるイオノホア誘導性の角質外皮の形成に及ぼす影響をグラフて表したものである。

図７はＨａＣａＴ細胞でのケラチンの発現をコントｌゴール細胞＜ａ）、３０ｎＭのストロスポリン存在下で成長した細胞（Ｃ）、１０μＭのチフルカルビンの存在下で成長した細胞（ｄ）のそれぞれについて２次元ゲル電気泳動で分析したものである。

図８はストロスポリンとチフルカルビンにさらしたＨａＣａＴ細胞におけるケラチンの合成を放射線強度走査法によって測定しグラフで表したものである。

図９はストロスポリン（３０ｎＭ）が培養後４２時間（Ｃ）と７２時間（ｄ）のＨａＣａＴ細胞の形態に及はす影響について培養後４２時間（Ｃ）と７２時間（ｄ）のコントロール細胞と比較して表したものである。

図４０はＢ−５０と５０ｋＤａのタンパク質へのリン酸の取り込みをチフルカルビンの濃度を変えた場合についてグラフで表したものである。

図１１はＢ−５０と５０ｋＤａのタンパク質へのリン酸の取り込みをポリミキシンＢの濃度を変えた場合についてグラフで表したものである。

図］２はチフルカルビンのいくつかの！１度についてラット脳シナブトソームからの（　’Ｈ）−ノルアドレナリンの放出に及ぼす影響をグラフで表したものである。

図１３はシクロスポリンＡ１スフインゴシン、チフルカルビンのいくつかの濃度についてマウスのＴＰＡ誘導性の耳水腫の皮膚層の厚さに及ぼす影響についてグラフで表したものである。

［１１４はシクロスポリンＡ、スフィンゴシン、チフルカルビンのいくつかの濃度についてマウスの皮膚のＴＰＡ誘導性過増殖における皮膚の厚さに及ぼす影響を表したものである。

図１５は何種類かの濃度のチフルカルビンとスフィンゴシンを全身投与した場合、マウスのＴＰＡ誘導性耳水腫における耳の厚さに与える影響についてグラフで表したものである。

発明の詳細な説明まず、チフルカルビンが正常なヒトケラチノサイト、及び形質転換したヒトケラチノサイトのｉｎ　ｖｉｔｒｏての増殖を投薬量に依存して阻害することがわかった（実施例Ｉ、２参照）。さらにチフルカルビンはヒト多形核白血球（ＰＭＮＬ）からの炎症仲介物質、すなわち反応性酸素種の放出を誘導せず（実施例３３参照）、これはアントラリンと対照的であった。

ケラチノサイトの増殖とヒト多形核白血球からの反応性酸素種の生成に対するチフルカルビンの阻害的効果は以下に示すａ、ｂ、ｃからは予測することができない。

ａ、チフルカルビンの化学構造す、抗鎮静剤としての既知の治療活性Ｃ，プロティンキナーゼＣ阻害剤およびカルモジュリン拮抗剤としての最近見出された薬理活性細胞毒性試験においてチフルカルビンは３００μＭ以上の濃度においてのみ毒性を示すことがわかった（実施例４参照）。同じ試験において他のＰＫＣ阻害剤もそれより強い毒性を持つことがわかった。チフルカルビンは効果のある濃度と毒性のある濃度との比率が都合がいいという長所を有している。

他のＰＫＣ阻害剤と比較した場合、チフルカルビンは形質転換したケラチノサイト細胞において形態的変化を誘導せず、またケラチンの発現にも影響を及ぼさなかった（実施例５参照）。

さらにチフルカルビンは中枢神経系からのＰＫＣには影響を及ぼさないこともわかった（実施例８参照）。チフルカルビンによって示されるＰＫＣ阻害活性は皮膚に存在するＰＫＣにかなり特異的である。

動物モデルにおいてチフルカルビンを局所的あるいは全身的に投与した場合、マウス皮膚における１２−０−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）誘導性耳水腫および過増殖を抑制する効果が見られた（実施例８．９参照）。

実施例で示されたようなチフルカルビンの特筆すべき効果のいくつかは、構造的に関連のある化合物にも見られた。

上皮の過増殖性皮膚疾患、炎症性皮膚疾患そして上皮の過増殖性、炎症性物質の存在によって特定される皮膚疾患の治療のために、７．８．９、ｌＯ−テトラヒドロ−チェノ−〔３，２−ｅ〕−ピリド−〔４，３−ｂ〕−インドールおよびその薬学的に許容される酸付加塩を製剤として用いることが有効であることがここでわかった。これらの製剤は上記の皮膚疾患の通常の治療で一般的に見られる副作用を引き起こさない。

７．８．９、ｌＯ−テトラヒドロ−チェノ−〔３，２−ｅ〕−ピリド−〔４，３ −ｂ〕−インドールと、その薬学的に許容される酸付加塩は一般式Ｉで表される。

Ｒｏは水素またはＣ３からＣ４までのアルキル基（直鎖または分岐鎖）であり、メチル、エチル基が好ましく、Ｒｔ及びＲ１は同一でも異なっていてもよく、水素またはハロゲンであり、ハロゲンとしてはフッ素または塩素が好ましい。

一般式Ｉの化合物を含む組成物を製造するために、無機酸ならびに有機酸から調製した薬学的に許容される酸付加塩を使用することもできる。酸の例としては塩酸、マレイン酸、酒石酸、コハク酸、シュウ酸、そして好ましくは乳酸を挙げることができる。

本発明の最も好ましい化合物はチフルカルビンあるいは！−メチルー９−エチルー４−フルオロ−７，８，９、ｌＯ−テトラヒドロ−チェノ−〔３，２−ｅ〕− ピリド−〔４，３−ｂ〕−インドール乳酸である。

７．８．９、ＩＯ−テトラヒドロ−チェノ−〔３，２−ｅ〕−ピリド−〔４，３ −ｂ〕−インドールあるいはその薬学的に許容される酸付加塩を上皮過増殖性および／又は炎症性皮膚疾患の治療に有効に使うための投与形態は製薬および美容上一般的に知られた形態から選べばよい。選ぶべき投与形態は皮膚疾患のタイプおよび望ましい投薬経路によって定まる。錠剤、カプセル、液体で経口投与に使用することができる。非経口投与には溶液、懸濁液、乳剤が可能で、局所的投与にはローション剤、乳剤（Ｗｌｏ及び０／Ｗ）、軟膏が用いられる。しかし適切な投与形態であればすべて使用可能であることはいうまでもない。

上述の投与形態の準備のために、一般式Ｉの化合物あるいはその薬学的に許容される塩を１つかそれ以上の薬学的に許容される結合剤あるいは乳剤や液体のような適当な基剤を用いて混合する。

７．８．９、ＩＯ−テトラヒドロ−チェノ−（３，２−ｅ〕−ピリド−〔４，３ −ｂ〕−インドールあるいはその薬学的に許容される酸付加塩を含む局所用製剤は過増殖性および／又は炎症性皮膚疾患の治療に都合がいい。治療が不可欠なある種の皮膚病では適切な基剤と構成成分の選択が重要な要素である。慢性の乾皮症疾患では、有効成分を含有させる基質として、例えばＥＰ−Ｂ−００６９４２３で述へられているような油性０／Ｗクリーム、軟膏、あるいはＷ１０乳剤の使用が必要である。急性の滲出性皮膚疾患の治療には希薄な乳剤、リニメント剤、水性の懸濁剤が有効成分を含有させるための基質として好ましい。

上記の皮膚疾患の効果的な治療のための組成物中に含まれなければならない７．８．９．１０−テトラヒドロ−チェノ−〔３，２−ｅ〕−ピリド−〔４，３−ｂ〕−インドールおよびその薬学的に許容される酸付加塩の量は投薬経路および治療しなければならない皮膚疾患の種類及び重症度によって変わる。一般に７．８．９、ＩＯ−テトラヒドロ−チェノ−〔３，２−ｅ〕−ピリド−〔４，３−ｂ〕 −インドールおよびその薬学的に許容される酸付加塩の濃度は０．００１から２０重量％の間で取ることができ、これは組成物の総量と活性成分の量から計算されたものである。しかし０．０１から５重量％の間が望ましい範囲である。

何種類かの試験において一般式Ｉの化合物示した薬理活性からみて、本発明の組成物を用いて様々な皮膚疾患を有効に治療することができる。例えば、皮膚への原発性悪性腫瘍、ケラト−シス、魚鱗せん（ｉｃｈｔｙｏｓｉｓ）　、アクネ（ａｃｎｅ）、酒さくｒｏｓａｃｅａ）　、皮膚炎（あらゆる種類の湿疹）に有効である。本発明の特に重要な点は７．８．９、ＩＯ−テトラヒドロ−チェノ−〔３，２−ｅ〕−ピリド−〔４，３−ｂ〕−インドールおよびその薬学的に許容される酸付加塩を乾せんの治療に使用することである。

この明細書に引用する文献と特許出願はすべて参照することによって取り込まれており、それぞれの文献あるいは特許出願は参照することによって具体的かつ個別に引用されているものとする。

本発明を明確に理解できるように例示や実施例によっである程度詳細に記述したが、添付した請求の趣旨や範囲をかえることのない一定の変更や修正が可能であることは、本発明の教示に照らし当業者に明白であろう。

次の実施例は本発明を例示するものである。

実施例略語ＣａＭ　カルモジュリンＣＬ　ケミルミネッセンスＤＭＥＭ　ダルベツコの修正基本培地ＤＭＳＯジメチルスルホキシドＥＤＴＡ　エチレンジアミン四酢酸ＥＧＴＡ　エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）四酢酸ＬＤＨ乳酸デヒドロゲナーゼＮＨＥＫ　正常ヒト上皮ケラチノサイトＰＢＳ　ダルベツコのリン酸緩衝溶液ＰＫＣプロティンキナーゼＣＰＭＡ　ホルボールＩ２−ミリステート１３−酢酸ＰＭＮＬ　多形核白血球ＰＳ　ホスファチジルセリンＲＯ３反応性酸素種Ｗ−７Ｎ−（６−アミノへキシル）−５−クロロ−１−ナフタレンスルフォンアミド概略抗生−抗菌性溶液（Ｐ／Ｓ）　、ウシ胎児血清（ＰＯ３）　、Ｌ−グルタミンはＧｉｂｃｏ社（Ｇｌａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、ＵＳＡ）製のものを用い、ストロスポリン及び細胞培養に用いる他の溶液はすべてＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ −ｈｅｉｍ社（Ｍａｎｎｈｅ　ｉｍ、ＦＲＧ）から入手し、ラジオトレーサーはＮＥＮデュポン（Ｂａｄ　Ｈｏｍｂｕｒｇ、ＦＲＧ）から入手した。

Ｗ−７及びＵＳ液や溶液に用いる他の試薬はＳｉｇｍａ社（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）から入手し、商業的には入手しうる最も純度の高いものを用いた。

Ｉ−（ａ　Ｃａ、　Ｔ細胞は自然に不死化した異数体のピトケラチ、ノサ・ｒト細胞でＪ、Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　（１９８８）、１０６：７６１−７７１　（７）方法に従っ”’Ｃ調製された。しかしＳＶＫ＋ａ細胞［Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔ、　１１：１６X−１８０１あるいは単離されたばかりのヒトケラチノづイト細胞［Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ　ａｎｄ　Ｇｒｅｅｎ（１９７５）、Ｃｅ１ｌ　６：３３１−３４４］でそれらを代用することができる。

ＨａＣａＴ細胞（あるいは他の細胞）は培養フラスコ（Ｔ１７５；Ｐａ１ｅ−ｏｎ　ＬａｂＷａｒｅ、０ｘｕａｒｄ、ＣＡＳＵＳＡ）内で１％抗生抗菌溶液、４ｍＭ　Ｌ−グルタミンおよびｌＯ％ウシ胎児血清を追加したダルベツコの修正基本培地（ＤＭＥＭ）を用いて培養した。増殖試験は後述するように２４穴プレート（Ｇｒｅ　＃ｎｅｒ、Ｓｏｌ　ｉｎｇｅｎ、ＦＲＧ）においてパッセージ（ｐａｓ−ｓａｇｅｓ）　９０から９５　（ＨａＣａＴ細胞）、およびパッセージ（ｐａｓｓａｇｅｓ）　３から６　（ＮＨＥＫ細胞）を用いて行った。培養はすべて３７℃で１０％ＣＯ２を含む及ぼさなかった。

実施例　１ＨａＣａＴ細胞にお（プるチフルカルビンの抗増殖効果ＨａＣａＴ細胞の増殖を３つの異なったパラメーター、すなわちＣ′Ｈ〕−チミジンの取り込み量、（” Ｃ）−アミノ酸の取り込み量、および付着細胞のタンパク含有量の増加量によって分析した。ＨａＣａＴｍ胞は添加物を加えたＤＭＥＭに接種しくｌ大当たり４００００細胞）、２４時間培養した。それから培地を指示された濃度の試験化合物を含む培地に交換した。さらに４８時間培養後、培養プレートをＤＭＥＭで２回洗浄した。それから１穴あたり０５μＣ１の〔２Ｈ〕−チミジンと０．２５μ Ｃｉの（”Ｃ）−アミノ酸を含む５００μｌの純粋なりＭＥＭを加えてパルス標識を行い、２時間培養を続けた。その後、培地を取り除き、細胞をダルベツコのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で１回洗浄してから０２％ＥＤＴＡを含むＰＢＳでもう１回洗浄した。トリプシン−ＥＤＴＡ　（０，０５％、０．０２％：ｌ大当たり０．５ｍ１）を加え、細胞を４５分間培養し、プレートから完全に分離させた。トリプシン処理は０１５ｍ１の氷冷したトリクロロ酢酸（１０％）を加えることによって停止させた。４℃で１２時間培養後、細胞をガラス繊維フィルター（Ｇ　−７＋　Ｗｈａｔｍａｎ　、　Ａｉａｉｄｓｔｏｎｅ　、Ｋｅｒ＋ｔ、　［ＪＫ）て回収した。ソノ後、フィルターを０．５ｍｌのＰＲＯＴＯＳＱＬ　（登録量ｔＳ＞溶液（ＮＥＮ　、　Ｂａｄ　Ｈｏｍｂｕｒｇ　、　ＦＲＧ　）で６０゛Ｃにおいて１時間処理し、放射活性を液体シンチレーンタン測定で評価した。

試験化合物を加えない場合のラジオトレーサー、の総取り込み量を０％の阻害とした。

総タンパク含有量を決定するために、細胞を２回メタノールで洗浄した。それから培養プレートを室温で乾かし、１．．５ｍｌのＮａ０Ｈ（０，２５Ｎ）をそれぞれの穴に加え、パラフィルム（登録商標）−フォイルを注意深くかぶせた。そしてプレートを室温で１６時間振盪した。タンパク質のａ度はウシ血清アルブミンを標準として使用し、分光光度計で測定した。試験化合物を加えない場合の総タンパク質濃度を０％の阻害とみなした。

〔１Ｈ〕−チミジンと（”Ｃ）−アミノ酸の取り込み量、および総タンパク質含有量の増加によって評価されるヒトケラチノサイト細胞の増殖はチフルカルビンの量に依存した様式で阻害された（図］、２参照）。図はそれぞれ４回ずつ行った４つの独立した実験から得られた平均値±ＳＤを表している（誤差の線が抜けているのは図示している記号より小さいことを示す）。測定されたパラメーターはすへてほとんと同じ濃度で阻害されていた（ＩＣｓ。値・１０〜１７μＭ）。

実施例　２ＳＶＫ、、細胞と正常ヒト上皮ケラチノサイト細胞に対してチフルカルビン及びストロスポリンか及はす抗増殖効果正常ヒト成人上皮ケラチノサイト細胞（ＮＨＥＫ）を５％牛脂児血清（ＰＯ８）、ｌμＭヒドロコルチゾン、１ＨＭイソプロテレノール、ｌｏｎｇ／ｍｌのＥＧＦを加えたＤＭＥＭとハムＦＩ２の混合培地（３・Ｉ）中で３Ｔ３支持細胞を用いて培養した（Ｒｈｅｉｍｖａｌｄ　ａｎｄ　Ｇｒｅｅｎ（１９７５）Ｃｅｌｌ　、６　：３３１）　、　ＳＶ　４０で形質転換したケラチノサイト細胞（ＳＶＫＩ４）　［Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｊｍｉｔｒｉｏｕｅｔａｌ、（１９８２）Ｃｅｌｌ　Ｄｊｆｆｅｒ、　、１１：＋６９）はＥＧＦを加えない以外は上と同じ培地で培養した。

どちらの細胞も７．５％ＣＯ２を含む湿気中、３７°Ｃで生育した。

０８目にｉｏｏμｌ中の５０００個の細胞を９６穴クラスターブレーｈ　（Ｇｒｅ−ｉｎｅｒ）の各穴に接種し、培地は上述のもの、あるいは低カルシウム条件のＭＣＤＢ１５３培地（Ｃ１ｏｎｅｔｉｅｓ）を用いた。１日目に濃度を変えた試験化合物を含む１００μｍの培地をそれぞれの穴に加えた。４日目に１穴当たり５０μｌの０．０５％ニュートラルレッド（Ｇｕｒｒ）の０．９％ＮａＣ１溶液を加え、３７°Ｃで３時間再培養した。ＰＢＳで洗浄後５０％エタノールのｏ、ｏ５Ｍ　ＮａＨｔ　ＰＯ４溶液を１穴当たり１００μｌ加えて溶解した。激しく振盪後、吸光度を５５０ｎｍで測定した。吸光度は培養プレートの底に付着している生育細胞の数を表している（Ｂｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄ　ａｎｄ　Ｐｕｅｒｎｅｒ（１９８４Ｍ、　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕｆｔ、Ｍｅｔｈ、、９ニア］、すべての値は８回の実験によって決定した。ＩＣ５ｏ値（ｍ胞数を５０％阻害する濃度）をめた（μＭ）。

表１ケラチノサイト細胞の増殖に及ぼすＰＫＣの阻害効果ＩＣ５＝値（μＭ）表１によりチフルカルビンは正常ヒトケラチノサイト細胞及びＳＶＫ、、細胞の増殖をＨａＣａＴ細胞の場合とほぼ同じ濃度で阻害することがわかる。カルシウムは低濃度（０，０６ｍＭ）あるいは通常の濃度（１，６ｍＭ）でも細胞の成長に違いはなく、これは対照物質であるストロスポリン（とても効力が強い）でも同じであった。

実施例　３ＲＯ３放出に及ぼすチフルカルビンおよび他の化合物の効果採血したばかりの血液（クエン酸ナトリウムで抗凝固処理したもの）をまず１％デキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　、　Ｕｐｐｓａｌａ　、　Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた赤血球沈降遠心し、生じた上溝を低浸透圧で溶解することによって赤血球細胞を除去し、ヒトＰＭＮＬ細胞を単離した。洗浄した細胞はウシ胎児血清（２％：Ｖ／Ｖ）を含むＰＢＳで２Ｘ　Ｉ　Ｏ＠個／ｍｌになるように調整した。ＤＭＳＯに溶解した試験化合物をアッセイ緩衝液でＤＭＳＯの終濃度が０．５％（Ｖ／Ｖ）になるように希釈した。

ヒトＰＭＮＬ　（最終量５００μｌ中に２ＸｌＯ’細胞）からのＲＯ３生成はルシゲニン増幅ケミルミネッセンス（ＣＬ）によって測定した。この方法はＢｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｎａｃｏｌ、（１９８７）、３６：１１２５−１１３２に詳細に述べられている。

ＣＬがピークになるところより、２５μＩの完全にオプソニン処理したチモサン（ＺｙＣ３ｂ　；　０．８ｍｇ／ｍｌ）あるいはＰＭＡ　（２ｘｌ　Ｏ−”Ｍ）の添加１６分後に細胞活性が最大となることが決定された。そこで試験化合物（１００μｌ）を加え、それから１６分後の結果を記録した。ルシゲニンの添加によって開始される試験化合物との３０分の前反応から１６分後の値によって自発性のＣＬを決定した。誘導性ＣＬは同じ試験管に適量の刺激物質を添加した後、２４分間の記録によって決定した。結果は１回の実験においてコントロールの阻害あるいは刺激の割合を％（２回の平均）で表現した。ＩＣ５＝値、信頼の限界（９５％）を回帰分析で計算した。

チフルカルビンは単離したヒトＰＭＮＬからのＲＯ３の放出を阻害した。チフルカルビンのＲＯ３生成阻害効果はオプソニン処理したチモサンあるいはＰＭＡで刺激した細胞と刺激を加えない細胞において差異はなかった（図３、図４）。

それぞれ３回ずつ行った３個の独立した実験結果から得られた平均値±ＳＤを図示した（誤差の線が抜けているのは、それが図示している記号より小さいことを示す）。ＩＣｓ。値は７μＭという効果が得られた。しかしどちらの刺激の場合でも、ピークとなるケミルミネッセンスの５０％阻害は２〜３倍高い濃度で見られた。

表２はオプソニン処理したチモサンで刺激後、いろいろな対照物質を加えることによって得られた結果を示している。

表２実施例　４チフルカルビン及びその他のＰＫＣ阻害剤の細胞毒性ＨａＣａｔ細胞を上述と同じように培養した。

細胞毒性は薬剤添加後４８時間の間に培養培地に放出された細胞内の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性の大きさを測定することによって評価した。ウェル（穴）から培地を回収し遠心（８０ｘｇＳ　１０分）することによって薬剤の誘導によってプレートから離れたＨａＣａＴ細胞を評価した。得られた沈澱を１０μ ｍの培地に懸濁し、血球計量器で細胞数を測定した。

ＰＭＮＬに対する試験化合物の非特異的細胞毒性はトリパンブルーによる色素排除試験によって評価した。

表３表３に示されているように、チフルカルビンは３００μＭ以上の濃度でのみ細胞毒性を示す。他のＰＫＣ阻害剤はそれよりもっと毒性が強かった。

実施例　５ケラチノサイト細胞の分化に及ぼすチフルカルビンとストロスポリンの効果不溶性膜の形成：正常ヒトケラチノサイト細胞を５％ＦＣ３Ｓ　１μＭイソプロテレノール、ｌＯｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下、低カルシウム濃度で密集するまで培養した。それから各濃度の試験化合物で４時間処理し、次に通常の濃度のカルシウム、上記と同じ添加物、試験化合物、〔２Ｈ〕−ロイシン（ｌμＣｉ／ｍｌ）を含む培地で４８時間培養した。その後、自発性およびイオノホア誘導性（ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ）不溶性膜（ＣＥ）の形成を調べた（Ｋｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）Ｅｘｐ、　Ｃｅｌ　１．　Ｒｅｓ、、１６７：２５２］。

チフルカルビンが自発性のＣＥ影形成影響を及ぼさない一方、ストロスポリンは著しい効果を示すことが図５に示されている。試験した薬剤は誘導性ＣＥの形成に全く影響を及ぼさなかった（図６）。

ケラチンの発現：ＨａＣａＴ細胞を標準の条件下で培養した。接種後２４時間後に、（２，５Ｘ１０＠個の細胞）に培地を（”Ｃ１−アミノ酸（０，５μＣｉ／ｍｌ　）と試験化合物を含む培地に交換した。７２時間後、培養が完結してから、ケラチノサイト細胞をラバーポリスマンを用いて回収し、１．５Ｍ　ＫＣＩ、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ　１００．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．４ｍＭのＰＭＳＦ　（フェニルメチルスルホニルフルオライド）を含む１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，２）溶液中でポリトロン細胞粉砕器を用いて均質化した。遠心後（３５００ｘｇ、１０分）、沈澱を５ｍＭのＥＤＴＡと０．４ｍＭのＰＭＳＦを含む１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，２）溶液に再懸濁し、再度遠心（３５０Ｑｘｇ、１０分）をした。生じた沈澱を１次元ゲル電気泳動用のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む６３ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，４）溶液または２次元ゲル電気泳動用の９Ｍ尿素溶液に溶解した。

１次元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は１２％の分離ゲルと３．５％のスタッキングゲルを用いて行った［Ｌｅａｍｍｌ　１（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ、２２７：６８０］。２次元電気泳動は印’Ｆａｒｒｅｌ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）Ｃｅｌｌ　、　１２：１１３３］に示されている通りに行った。ケラチンの分離は１次元においては５ｅｒｖａｌｙｔ　２−１１　（Ｓｅｒｖａ、　）ｌｅｉｄｅｒｂｅｒｇ、　ＦＲのを用いる非平衡ｐＨ勾配電気泳動（ＮＥｐＨＧＥ）で行い、２次元においては１２％５ＤＳ−ＰＡＧＥによって行った。

ゲルはクーマシーブリリアントブルーＲ（Ｂｉｏ　Ｒａｄ　、　Ｍｕｎｃｈｅｎ　、　ＦＲＧ）で染色し、乾燥後、Ｘ線フィルムに一７０℃で７日から１０日間感光させた。オートラジオグラフィーは密度スキャナーを用いて数値をめた。個々のピークの面積を計算し、それぞれのケラチンの分子量との関係をめた。それぞれのケラチンの合成量をケラチンの総合酸量に対する割合（％）で表した。図７に２次元ゲルのパターンを示し、図８にはそれぞれのケラチンの相対量を示した。

実施例　６ケラチノサイト細胞の形態に及はすチフルカルビンとストロスポリンの影響ＨａＣａＴ細胞を通常の条件下で培養した。接種２４時間後（２，５Ｘ１０’細胞）、培地を試験化合物を含む培地に交換した。細胞の形態は７２時間にわたって位相差光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ　ｆＭｒ−２、Ｔｏｋｙｏ　、Ｊａｐａｎ）を使用して観察した。

図９に示したようにストロスポリン（３０ｎＭ）は形態に影響を及ぼし、チフルカルビン（１０μＭ）は（図示していないが）影響を及ぼさなかった。

実施例　７中枢神経系由来ＰＫＣに及はすチフルカルビンとポリミキシンＢの影響特表千６ −５０５２５５　（８）シナブトソーム形質膜（ＳＰＭ）のリン酸化細胞レベル以下の分画およびリン酸化分析はにｒｉｓｔ　ｊａｎｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　０９８２）で述べられている方法でおこなった。リン酸化の反応溶液（最終量２５μｌ）にはｌＯｍＭ）リス塩酸、１０ｍＭ　ＭｇＣ１＊、１０ｍＭ　ＣａＣ１ｔ　、　ｐＨ７，４の溶液中にｌＯμｇのＳＰＭタンパク質、７．５μＭのＡＴＰ、ｌμＣｉの〔γ−” Ｐ）ＡＴＰを含むものを用いた。３０゛Ｃで５分間ブレインキュベートした後、ＡＴＰを加えることによってリン酸化反応を開始させた。反応は１５秒後に停止させた。

試験するべき化合物はすべてブ［ノインキュベーション開始のときから存在させておいた。タンパク質は１１％５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そのリン酸化をゲルのオートラジオグラフィーによって調べ、オートラジオグラムの濃度スキャニングによって定量した。

ＣａＭの添加後にのみリス酸化されるＢ−５０および５０ｋＤａタンパク質のリン酸化を外因性ＣａＭ　（３ユニツト／アツセイ）の存在下で調べ、定量した。

期待に反して、チフルカルビンはＢ−５０のリン酸化は阻害しない一方、５０ｋＤａタンパク質のＣａＭ依存性のリン酸化はチフルカルビンの量に依存して高力価で阻害された（ＩＣｓ。値はｌμＭ以下二図１０参照）。チフルカルビンのＰＫＣへの阻害作用をＣａＭが妨害する可能性を除くために、薬剤効果を反応液にＣａＭを加えずに評価した。この条件下でもチフルカルビンはＢ−５０のリン酸化に対して阻害効果を全く示さなかった。Ｂ−５０のリン酸化のコントロールに対する百分率はチフルカルビン濃度１ｍＭ、１００μＭ１１０μＭ、１μＭのそれぞれに対して９５±１Ｌ９２±９．１１０±１５．８２±１４であった。

コントロールとしてＰＫＣおよびＣａＭの阻害剤であるポリミキシンＢで同じ分析をしてみた。ポリミキシンＢはＣａＭの添加という条件下で、Ｂ−５０および５０ｋＤａタンパク質のリン酸化を量に依存して阻害した（図１１参照）。外来性のＣａＭがない場合、Ｂ−５０のリン酸化の阻害率はポリミキシンＢの濃度が１００、ｌ０１１．０．　１μＭのそれぞれの場合について、コントロールに対して１８±８．８２±１１．１０３±９．９５±８％であった。

透過性（ｐｅｒｍｅａｔｅｄ）ンナブトソームからのノルアトルナリンの放出シナブトソームをＤｕｎｋｌｅｙ　ａｎｄ　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（１９８７）の方法に従って高純度に精製した。それらを３ｍｌの緩衝液Ａ（１２３ｍＭ　ＮａＣ１、５ｍ（ＫＣＩ　、　２ｍシＣａＣ１ｔ、ｍＭ　Ｍ［１Ｃ１ｔ　、１．１５ｍＭ　ＮａＨ＝ＰＯ４，５，槌軸グルコース、２０ｎ＃　Ｐ［ＰＥＳ　ｐＨ６，８、Ｏｔ：ＣＯｔが９５．５のガスで飽和したもの）で希釈し、３７°Ｃで１５分間培養した。それから２．５μＣ１のノルアドレナリン（ＮＡ）を加え、１５分間培養を続け、シナブトソームを６００Ｘｇで２０分間遠心した。生じた沈澱をＣａＣ１ｔを含まない緩衝液Ａで２回洗浄し、再懸濁した（Ｉｍｇタンパク質／ｍｌ）。

ＮＡの放出を測定するためにプレラベルしたシナブトトソームを所定の濃度のＮａｔＡＴＰとＥＧＴＡ緩衝化カルシウムイオンを含む緩衝液Ａ（最終量１２０μ ｌ）中で３７°Ｃで培養した。放出反応は反応液にシナブトソーム（２０μｇのタンパク質）を加えることで開始し、５分後に１１００００Ｘて３０秒遠心することによって終了させた。上溝（９０μｌ）を回収し、Ｐａｃｋａｒｄ　Ｍｏｄｅｌ　２０００ＣＡの液体シンチレーション測定器によって、シンチレーションカクテルとしてピコフロール（Ｐｉｃｏｆｌｕｏｒ　）を使用して測定した。ＮＡの放出は取り込まれた総（’Ｈ）−ＮＡに対する％で表した。ＮＡの総取り込み量は、２０μｇのプレラベルし洗浄したシナブトソームにおける〔３Ｈ〕の取り込みを測ることによって測定した。

図１２に示したように、チフルカルビンは１００μＭから１μＭの濃度において２つの独立した実験系でノルアドレナリンの放出に何の影響も及ぼさなかった。

Ｃａ”が低濃度（１０ｎＭ）でも高濃度（１０μＭ）でも、放出量はコントロール値の範囲のままであった。それとは対照的に１１００ＩＩのポリミキシンＢはこの細胞応答を低Ｃａ”ｆｉ度の条件下では〔３Ｈ〕−ノルアドレナリンの総量に対して１６．５±１．０３％、高Ｃａ’＋濃度の条件下では１９．４％±２．３８％にまで阻害した。

実施例　８マウス皮膚におけるＴＰＡ誘導性水腫および過増殖に対するチフルカルビン、シクロスポリンＡ１スフインゴシンの局所投与の効果無毛マウス（ｈｒ／ｈｒ　：雄）の背にアセトン：水が８０　：　２０の混合液中に０．ＯＩｔ量％の１２− 〇−テトラデカノイルホルボールー１３−アセテート（ＴＰＡ）、さらに試験化合物であるシクロスポリンＡ、スフィンゴシン、チフルカルビンをそれぞれ含む溶液ｌＯμｌを投与した。１頭のマウスあたり４部位に投与した。１部位はＴＰＡのみを投与しくコントロール）、１部位は溶媒のみを投与しくブランク）、残りの２部位を実験用とし、ローテーション形式でおこない、！実験あたり６頭のマウスに投与した。

皮膚層の厚さは投与前（１＝０）と投与後６時間および２４時間に水腫を測定して決定した。７２時間後に水ＩＩ　（１５ｍｍの細切採取）を２Ｍ　ＫＢｒで分離し、過増殖の指標としてタンパク質量を決定するためにＯ，ＩＭ　ＮａＯＨに溶解した。

１回の実験でチフルカルビンをシクロスポリンＡと比較し、２回目の実験ではスフィンゴシンと比較した。

図１３に示したようにチフルカルビンは０．　５、ｌ、２．５％の濃度で水腫を抑制している。また過増殖については１および２．５％でのみ抑制している（図１４参照）。

実施例　９マウスのＴＰＡ誘導誘導木耳水腫するチフルカルビンおよびスフィンゴシンの腹腔内投与の影響マウスの腹腔内に体重１ｋｇ当たり３０．１Ｏ１３，３ｍｇの試験物質、すなわちカルボキシメチルセルロース（０゜５％）中のスフィンゴシンおよび生理的食塩水中のチフルカルビンを体重１ｋｇ当たり１０ｍ１注入した。６０分後、アセトン：水＝８０＋２０の溶液中に１２−０−テトラデカノイルホルボール−１３ −アセテート（ＴＰＡ）を０．０１重量％含む溶液で、マウスの左耳を処理した。処理後、０．３．６．２４時間後に耳の厚さを測った。

図１５に示したように、チフルカルビンは投与３時間後においては３０ｍｇ／ｋｇの濃度で耳水腫を抑制した。スフィンゴシンはこの点もっと効力があった。

実施例　１０チフルカルビンの局所ネイルローション剤（０，５％）ビーカー内で４０ｇのメチルエチルケトン、２０ｇのイソプロパツール、３９゜５ｇの蒸留水を混合する。この混合液にチフルカルビンを透明な溶液になるまで掻き混ぜながら加えた。

実施例　１１チフルカルビンの頭皮ローション剤（０，５％）０．３５ｇのＫＬＵＣＥＬＨＦ　（登録商標）を４９ｇの水に透明な液体になるまでかきまぜながら加えた。０．５ｇのイソプロピルミリステートを５０ｇのイソプロパツールに溶解した。この溶液を最初の溶液と混合した。０．５ｇのチフルカルビンを得られた溶液に掻き混ぜながら加えた。

実施例　１２チフルカルビンの油性クリーム１９０ｇの白ソフトパラフィン、９０ｇの液体パラフィン、３０ｇのセトステアリルアルコール、１４．７５ｇのポリエチレングリコール−＋０００−モノセチルエーテル（ＣＥＴＯＭＡＣＲＯＧＯＬ　１０００　（登録商標））を融解し、７０〜８０°Ｃに達するまで温めた。１ｇのメチルヒドロキシ安息香酸エステルを１５０ｇの脱イオン水に加え、攪拌しながら、適当な軟膏ミキサーの中で７０〜８０℃まで温めた。

この溶液に調製しておいた液体脂質組成物を７０〜８０℃の温度で加えた。激しく攪拌後、減圧下で、穏やかに攪拌し、冷やした。０．２５ｇのＣＥＴＯ＆［ＡＣＲＯＧＯＬ　１０００を２５ｇの水に溶かし、これに、０．０５ｇのチフルカルビンを攪拌しながら加えた。生じた懸濁液を調製しておいたクリームに加え、減圧下で５分間、穏やかに攪拌した。

ＦＩＧ、　１／１５（讃仔旦ω１ｒ−ローｌ／：口）！■ ＦＩＧ、　２／１５（＊仔旦ω１ｒ−ロー４／：口）！■ ＦＩＧ、　３／１５（＊仔旦ω１ｒ−ロー４／″：口）！田ＦＩＧ−４／１５（＊仔旦ω１ｒ−ｏ−４．’：口）！削ＦＩＧ、　５／１５ＦＩＧ、　７／１５代替シートＦＩＧ、　８／１５ＦＩＧ、　９／１５代替シートＦＩＧ、　１０／１５（＊殻旦９工祥ゴ１ｆ−口」乙口）耶醒／：ｎω菖４シを乙６ＦＩＧ、　１１／１５（本６旦’１ＪＬＮｒ１４ｒ−一口＠　／：　１ｍ）　ｑ）ｉｌ、＜　（，０Ｍ４＞ｔζ６ＦＩＧ、　１２／１５（１ｆ旦？Ｊ−赫コ）１稗）田騨ωＶＮ−町ＦＩＧ、　１３／１５ＦＩＧ、　１４／１５ＦＩＧ、　１５／１５国際調査報告国際調査報告ＮＬ　９２０００３３Ｓ＾　５７２３６

Claims

【特許請求の範囲】１、一般式Ｉで示した７、８、９、１０−テトラヒドロ−チエノ−〔３、２−ｅ〕−ピリド−〔４、３−ｂ〕−インドールおよびその薬学的に許容される酸付加塩の上皮過増殖性および／又は炎症性皮膚疾患の治療用の医薬の製造のための使用。 ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＲ３は水素またはＣ１からＣ４のアルキル基であり、Ｒ２とＲ３は同一でも異なっていてもよく、水素またはハロゲンである。２、一般式Ｉで表されるテトラヒドロ−チエノピリドインドール化合物（Ｒ１はメチル基またはエチル基であり、Ｒ２とＲ３は同一でも異なっていてもよく、水素、フッ素、又は塩素である。）およびその薬学的に許容される酸付加塩を使用する請求項１記載の使用。３、１−メチル−９−エチル−４−フルオロ−７、８、９、１０−テトラヒドロ −チエノ−〔３、２−ｅ〕−ピリド−〔４、３−ｂ〕−インドール乳酸エステルを使用する請求項１記載の使用。４、乾せん治療薬の調製のための請求項１〜３のいずれか１項記載の化合物の使用。５、一般式Ｉの化合物およびこの化合物の薬学的に許容しうる酸付加塩を有効成分として含む上皮の過増殖性および／又は炎症性皮膚の治療用組成物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＲ１は水素またはＣ１からＣ４までのアルキル基であり、メチル基またはエチル基が好ましい。Ｒ２とＲ３は同一でも異なっていてもよく、水素またはハロゲン基であり、塩素またはフッ素が好ましい。６、一般式Ｉの化合物およびこの化合物の薬学的に許容しうる酸付加塩を有効成分として含む乾せん治療薬。 ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＲ１は水素義たはＣ１からＣ４までのアルキル基であり、メチル基またはエチル基が好ましい。Ｒ２とＲ３は同一でも異なっていてもよく水素またはハロゲン基であり、塩素またはフッ素が好ましい。７、組成物の質量に対して０．００１〜２０重量％の有効成分を含む請求項５又は６記載の組成物。８、組成物の質量に対して０．０１〜５重量％の有効成分を含む請求項５又は６記載の組成物。９、局所的治療に使用される請求項５〜８のいずれかの項記載の組成物。１０、一般式Ｉの化合物およびこれの薬学的に許容しうる酸付加塩を有効成分として含む組成物の体への投与を含む皮膚の化粧方法および医療方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＲ１は水素またはＣ１からＣ４までのアルキル基であり、メチル基またはエチル基が好ましい。Ｒ２とＲ３は同一でも異なっていてもよく、水素またはハロゲン基であり塩素、フッ素が好ましい。１１、一般式Ｉの化合物およびその薬学的に許容しうる酸付加塩を有効成分ととして含む薬剤を過増殖および／又は炎症を起こしている皮膚領域に局所的に投与することを含む皮膚の化粧方法あるいは治療方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＲ１は水素またはＣ１からＣ４までのアルキル基であり、メチル基またはエチル基が好ましい。Ｒ２とＲ３は同一でも異なっていてもよく、水素またはハロゲン基であり、塩素またはフッ素が好ましい。