JPH06502763A - 細胞外タンパク質の沈澱方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞外タンパク質の沈澱方法 本発明は、発酵ブイヨンから細胞外タンパク質を精製および分離する方法に関す る。本発明はとりわけ、着色および有臭物質を除去して、酵素を固体形態で分離 する方法に関する。

多くの酵素、特に加水分解酵素、例えばプロテアーゼ、アミラーゼまたはリパー ゼは、微生物による発酵によって製造される。適当な微生物および製造方法は、 例えば以下の特許および特許出願に記載されている：　ドイツ連邦共和国特許第 １８００５０８号、ドイツ連邦共和国特許第２２２４７７７号、ドイツ連邦共和 国特許第２５５１７４２号、米国特許第３８２７９３８号、国際特許出願公開８ ８１０１２９３号、ドイツ連邦共和国特許第１８０７１８５号、米国特許第３７ ４０３１８号、ドイツ連邦共和国特許第２３３４４６３号、ドイツ連邦共和国特 許第２０２６０９２号、欧州特許第０２３２１６９号、欧州特許第０２２０９２ １号、欧州特許第０２４７６４７号および欧州特許第０２４６６７８号。

酵素溶液の多くの適用において、例えば酵素溶液を液体洗剤中で使用する場合に 、濃色の不純物、または臭気の強い不純物は許容できない。従って、酵素の工業 的製造において、不純物は沈澱法により除去される傾向にある。しかし、既知の 沈澱法は、良好な色を達成するためには、多量の収量の損失を容認しなければな らないという欠点を有する。そのような問題を克服するために、ドイツ連邦共和 国特許出願Ｐ３９１１０９９．０号には、発酵により製造した酵素溶液にマスキ ング剤を加えた後、相互に沈澱を形成する２種の水溶性イオン性化合物を任意の 順序で加え、要すれば他の吸着剤（例えば活性炭）も加えて沈澱を形成すること から成る沈澱方法が記載されている。

ドイツ連邦共和国特許出願ＤＥ３８２１１５１号によると、臭気を弱め、色を改 良するための添加剤を、発酵ブイヨンおよび／または酵素溶液に入れる。

同様の方法はドイツ連邦共和国特許出願Ｐ３９３０２８４．９号にも記載されて おり、それによると、選択的な吸着剤として、真菌、植物および／または細菌の 細胞、またはそのような生物体の細胞壁片を発酵ブイヨンに加える。ドイツ連邦 共和国特許出願Ｐ３９１５２７７．４号にも同様の方法が記載されており、それ によると、アルミニウム塩の酸性水溶液および要すれば他の沈澱剤を、酵素溶液 にｐＨ５〜１１で加え、水溶性成分を分離し、マスキング剤（例えばホウ素の酸 など）は沈澱後に加える。

上記方法はいずれも、望ましくない成分を吸着剤表面に結合させるか、またはそ の場で生成する吸着剤の沈澱と共に沈澱させることによって、純度の改良された 酵素溶液を得るという考えに基づいている。それらの方法によると、非常に純度 の高い酵素溶液を得ることができるが、投入量が多ければ酵素収率は自から低下 し、良好な品質と量との間の妥協が常に必要である。

一方、不都合な不純物よりもタンパク質そのものの沈澱によって、発酵液からタ ンパク質を分離し得ることが既に知られている。しかし、通常の沈澱剤を通常の 濃度で使用すると、不純物が共に沈澱するので、所望の純度を達成することはで きない。

本発明は、発酵ブイヨン中に明らかに遍在し、濃縮沈澱を妨害するある種の物質 を、吸着剤で予め処理して除去すれば、タンパク質（特に加水分解酵素）の濃縮 沈澱が可能であるという驚（べき知見に基づく。

従って、本発明は、濾過した発酵ブイヨンから、微生物の細胞外タンパク質を分 離する方法であって、最初の工程において、タンパク質の沈澱を妨害する物質を 固体吸着剤によって除去し、得られた溶液を濃縮して、タンパク質含量を約３０ 〜４０重量％とし、その後、タンパク質をｐＨ６〜１０で沈澱させ、分離するこ とを含んで成り、要すれば、タンパク質沈澱剤を加えて沈澱を促進する方法に関 する。

本発明の方法によると、微生物による発酵によって製造し、および発酵ブイヨン 中に細胞外タンパク質として存在する多くのタンパク質を精製することが可能で ある。例えば、特に酵素の製造（例えばプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ 、キシラナーゼ、ペントサナーゼまたはリパーゼの製造）のために本発明の方法 を用いることができる。本発明の方法は、プロテアーゼ、特にアルカリ性プロテ アーゼ、例えばセリンプロテアーゼの製造のために特に適当である。

本発明の方法に適当な発酵液は、微生物（例えば細菌または真菌）の培養、とり わけバチルス株、例えばバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌ ｉｓ）、バシラス・リヘニフォルミス（Ｂ　、　１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒ＋＊ｉｓ ）、バシラス・レンッス（Ｂ、　１ｅｎｔｕｓ）などの株の培養によって得たも のであることが好ましい。

本発明によると、発酵ブイヨンをまず吸着剤で処理する。この目的のために、吸 着剤を通例、タンパク質溶液に対して０．５〜１０重量％の量で加える。適当な 吸着剤の例は、シリケート含有吸着剤、例えば層状シリケート、特にベントナイ トである。ベントナイトの中では、酸活性化ベントナイトが特に適当である。

すなわち、モンモリロナイト指数が７０であり、粉末度が９３％〈１００μであ る酸活性化ベントナイトを、特に好ましいベントナイトとして使用し得る。

ベントナイトの代わりに、またはベントナイトに加えて、酸化アルミニウム水和 物、または通例、中性付近のｐＨのタンパク質溶液中で分離し得る沈澱を形成す るアルミニウム塩を、沈澱剤として使用してもよい。アルミニウム塩としては、 アルミニウムヒドロキシクロリドを使用することが好ましい。本発明において、 アルミニウムヒドロキシクロリドとは、アルミニウムのクロロヒドロキシ化合物 、例えば結晶水２〜３モルを有するＡｌｔ（ＯＨ）ｓｃｒであると理解される。

好ましい材料は、例えば水の精製に使用するような工業用のものである。ｐＨ値 を中性範囲に上昇すると水酸化アルミニウムの沈澱を生成する他の水溶性アルミ ニウム塩も適当である。本発明に従って使用するアルミニウム塩は、酸性水溶液 の形態で酵素溶液に加える。そのような酸性溶液のｐＨは３〜４、濃度は１０〜 ５０重量％である。濃度約２０重量％の溶液が好ましいということもわかった。

更に、アルミニウムヒドロキシクロリドは、粉末の形態で酵素溶液に直接混ぜ込 んでもよいが、好ましさは劣る。

この沈澱工程中、酵素溶液のｐＨ値は５〜１１、好ましくは５〜８の範囲とすべ きである。なぜなら、そのようなｐＨ範囲外では、酵素の安定性に悪影響が及び 得ることに加えて、沈澱が部分的に再度溶解し得るからである。従って、沈澱剤 の添加時に、ｐＨが確実に５未満とならないようにすることが重要である。その ために例えば、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムのようなアルカリ性溶液 を加え得る。緩衝液を加えてもよいが、それは沈澱剤に適合するものであるべき である。

アルミニウム塩の使用量は、達成しようとする精製の程度に応じて決定する。

多くの工業的用途のためには、１〜５重量％の量が好ましいと考えられるが、よ り少ない量、例えば０．５重量％未満でも精製効果は得られる。より多い量、例 えば１０重量％までの量で使用してもよいが、しばしば経済的理由から好ましく ない。

本発明の他の一態様においては、沈澱のために不溶性カルシウム塩を使用しても よい。リン酸カルシウムをタンパク質溶液中にその場で生成することが好ましい 。

カルシウムとリンとのモル比が１．７〜２．５＋１となるようにカルシウム塩と リン酸塩との比を選択することが好ましい。主に無定形の構造で、表面積の広い リン酸カルシウム（沈澱させる着色不純物のための好ましい吸着剤）がそのよう な条件下に生成することがわかった。沈澱剤の量は、酵素溶液に対して通例０． ５〜２０重量％である。

前記吸着剤に加えて、またはその代わりに使用し得る他の吸着剤は、活性炭であ る。

本発明の他の態様においては、沈澱前または沈澱後に酵素溶液にマスキング剤を 加え得る。マスキング剤を沈澱前に加えると、酵素活性の損失が少ないので好ま しい。

マスキング剤としては、ホウ素の酸および亜硫酸並びにそれらのアルカリ金属塩 を加え得る。その添加量は酵素溶液に対して０．５〜５重量％、好ましくは１〜 ３重量％であり、より多くの量は、主として経済的な理由により不適当である。

適当なホウ素の酸は、ホウ酸、メタホウ酸および／または五ホウ酸である。従っ て、特に適当なアルカリ金属塩は、ホウ酸ナトリウム、メタホウ酸ナトリウム、 ホウ砂または五ホウ酸ナトリウムである。亜硫酸ナトリウムも適当である。

前記マスキング剤と共に、またはその代わりに使用し得る他の適当なマスキング 剤は、炭素原子３〜１０個を有するジカルボン酸および／またはヒドロキシカル ボン酸である。ヒドロキシジカルボン酸、特にクエン酸、酒石酸およびそれらの 異性体が好ましい。添加量は１〜５重量％である。この場合も、より多量の添加 は、工業的効果が減刑するからではなく、主に経済的理由により不適当である。

吸着剤で処理した後、酵素溶液を濃縮する。タンパク質含量を４０〜５０重量％ に調節することが好ましい。ｐＨは、中性付近にすべきである。ｐＨを７．５〜 ９に調節することが好ましい。このことは、とりわけ加水分解酵素、特にプロテ アーゼに対して当てはまる。

濃縮した酵素溶液の調製のためには、種々の方法が当業者に知られている。すな わち、マイクロ濾過および／または限外濾過を行うことができ、その前または後 に（例えば薄層蒸発器内で）減圧下に水を蒸発させることによって、得られる酵 素溶液の濃度を更に高めることができる。特に好ましい一方法においては、酵素 溶液をマイクロ濾過および限外濾過によってまず前精製し、次いで沈澱させ、最 後に蒸発により濃縮する。この方法においては、とりわけドイツ連邦共和国特許 出願ＤＥ３７３０８６８号に記載のように、マイクロ濾過および限外濾過を行う 。

この特許出願には、タンデムに配置した少なくとも２個のモジュールの各段階に 多孔買膜を取り付けたものを用いて十字流マイクロ濾過および／または限外濾過 を行うことによって、発酵ブイヨンから、生物工学的に製造した有用材料を分離 する方法であって、各モジュールの透過液側に、大気圧よりも高い異なる圧力を 適用する方法が記載されている。この方法を実施するためには、マイクロ濾過に おける十字流速は４翼／秒を越えることが好ましく、膜材料としては、担体に担 持した酸化アルミニウム、炭化ケイ素または二酸化ジルコニウムのような無機物 質を使用することが好ましい。

本発明の方法の前記工程において調製した濃縮タンパク質溶液を、最後に沈澱工 程に付す。この目的のために、溶液をその凝固点程度に冷却し、および／または 溶液を静置することによって、タンパク質を、他の物賀の不存在下に沈澱させる 。すなわち、多（の場合、溶液を＋５℃に冷却し、単に一晩静置すれば充分であ る。

濃縮したタンパク質溶液にタンパク質沈澱剤を加え、次いでタンノくり質を沈澱 させるということも、当然可能である。しかし、この方法が特に好ましいという わけではない。適当なタンパク質沈澱剤は、例えば、可溶性アルカリ金属塩（１ 〜５重量％の量で使用し得る）、水混和性有機溶媒（５〜２０重量％の量で使用 し得る）または水溶性ポリマー（０，１〜５重量％の量で使用し得る）である。

好ましい可溶性アルカリ金属塩は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カル シウムなどで゛ある。適当な水混和性溶媒は、−価および二価のアルコール、例 えばエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはメタノール、エタノ ール、またはアセトンである。適当な水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコー ルまたはポリアクリルアミドである。

本発明の方法によって得た沈澱したタンパク質は、通常の方法で更に加工し得る 。すなわち、そのようなタンパク質から、水性または水性−有機性のタンノくり 質溶液、例えば高濃度酵素溶液を調製し得る。また、沈澱したタンノくり質を乾 燥するか、または添加剤と組み合わせることによって、固体生成物、例えば固体 酵素製剤を調製してもよい。

衷臭燃 バシラス・レンツスの細胞外プロテアーゼを産生ずるバシラス・リヘニフオルミ ス株による発酵により、比プロテアーゼ活性３４８５０ＨＰＥ／９の発酵ブイヨ ン２００１を調製し、下記のように更に処理した：マイクロ濾過 装置： 種類：　チューブモジュール パイロットプラント２Ｓ１５１、テツクセプ（ＴＥＣＨ３ＥＰ、フランス）製 フィルター面積＋　２Ｘ３．４．２（タンデムの２個のモジュール）膜材料・　 タイプＭ１４、グラファイトに担持した酸化ジルコニウム分離限界：　０．１４ μ票 操作条件・ 操作温度：　４０℃ 残留液のｐＨ＋　８（３０％ＮａＯＨで調節）残留液の十字流：４．８１／秒（ ＝７５ｍ’／時）残留液の流入：　１００Ｏ１／時 平均経膜圧　０．５バール（各モジュールに対し、透過液圧を調節することによ って調整） 沈澱剤の添加ニ ブロチアーゼ溶液に、アルミニウムオキシドクロリド水和物［ロクロン（ＬＯＣ ＲＯＮ。

商標）を５０９／ｌの量で加えた。水酸化ナトリウムでｐＨ８，０に調節した。

前希釈： 培養液２００Ｉを塩溶液（ＮａＣ１，工業用９０％）１４０Ｉ！で希釈して、固 体含量および粘度を低下した。

塩濃度・１０ｇ／ｌ 希釈γ：０．５９ 透析濾過。

調節した濃度ファクター７０．５９で、残留液に塩溶液（Ｎａ（Ｊ）を全部で８ ５０ａＩえた。

塩濃度：　１０ｇ／ｌ 相対透析濾液体積：４．２５１／１ 透過液流密度＋　２９１／冨２時 濃縮： 最終的に、残留液を１７０１に濃縮した。

濃縮γ：１．２ 結果・ 透析濾過および濃縮後に、全部で１０２０１の酵素含有透過液を得た。

比プロテアーゼ活性：　４５２０ＨＰＥ／９限外濾過 装置： 種類二　ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）スパイラルモジュールフィルター面積 ：５．６．” 膜材料：　ポリスルホン 分離限界＋　１００００ダルトン 操作条件： 操作温度：　２５℃ 残留液の流入：２５０Ｏ１／時 平均経膜圧：　１バール 濃縮： 約３０１になるまで濃縮を続ける。これは、ファクター３４の体積減少に相当し 、最初の培養液量に対しては、濃縮７６．６である。

濃縮中に、透過液流密度は２０１／ｍ”時から５１／菖”に低下する。

結果： ３０１濃縮液 比プロテアーゼ活性：　１１２０００ＨＰＥ／ｇ加熱濃縮 装置： 種類：　α−ラヴアルＣＴＩＢ−２セントリサーム（α−Ｌａｖａｌ　ＣＴＩＢ 　−２Ｃｅｎｔｒｉｔｈｅｒｍ）薄層蒸発器加熱面積・　０．０９ｍ” 蒸発器容量：５０ＪＩ９／時（水） 操作条件： １次スチーム温度・８０℃ ２次スチーム温度・３５℃ ２次スチーム圧力・０．０１バール この装置の容量は１２に９／時（流入）であった。

濃縮： 通常の程度を越えて濃縮を続けた。最初の量に対して４０を越えるファクターの 体積減少を達成した。

この工程での濃縮γ・６ 結果。

４．９４９ＤＳＶ濃縮液 乾燥分＋　４２．４％ プロテアーゼ活性：　７５５０００ＣＰＥ／ｇ薄層蒸発器の不透明な濃縮液を、 ５℃で一晩放置した。吸引漏斗で分離し得る白色沈澱が生成し、これは沈澱した 酵素タンパク質であることを確認した。

ＨＰＥ単位： 標準化したＨＰＥ法において、プロテアーゼを変性カゼインと共に５０℃／ｐＨ ８，５で１５分間インキュベートする。過剰の基質をトリクロロ酢酸によって沈 澱させ、アルカリ性としだ上清の２９０ｎｍにおける吸光度を測定する（可溶性 芳香族ペプチド）。標準的な条件下で、領５吸光単位はｌ０ＨＰＥに相当する。

ＨＰＥ法は、アンソン（Ａｎｓｏｎ）法に匹敵する。

酵素活性単位ＣＰＥ： 試験原理：５０℃で亜硫酸ナトリウム溶液中のＮ、Ｎ−ジメチルカゼインをタン パク質分解し、次いで、遊離したアミノ基と、トリニトロベンゼンスルホン酸と の呈色反応を行う。この有色複合体を４２５ｎｍで光度的に定量し、プロテアー ゼ標準と比較する。

国際調査報告 １＠＋＋　ＰＣＴｌｌＳＡｆｆｌｏ　４１１ｔｌ”Ｉｔ　ｊ噌１１１−陶ｖ１− 一ｗｌｍ　＊ｓｍｎｓｍ　Ｎ６．ＰＣＴ／ＥＰ　９１１０２４７０

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．濾過した発酵ブイヨンから、微生物の細胞外タンパク質を分離する方法であ って、 ・最初の工程において、タンパク質の沈澱を妨害する物質を固体吸着剤によって 除去し、 ・得られた溶液を濃縮して、タンパク質含量を約３０〜４０重量％とし、その後 、タンパク質をｐＨ６｝１０で沈澱させ、分離することを含んで成り、 ・要すれば、タンパク質沈澱剤を加えて沈澱を促進する方法。
2. ２．タンパク質は、酵素、とりわけ加水分解酵素、好ましくはプロテアーゼ、ア ミラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼまたはリパーゼである請求項１記載の方法 。
3. ３．プロテアーゼは、アルカリ性プロテアーゼ、とりわけセリンプロテアーゼで ある請求項１または２記載の方法。
4. ４．吸着剤として、シリケート、例えばベントナイト、リン酸カルシウム、活性 炭および／またはアルミニウム塩を使用する請求項１〜３のいずれかに記載の方 法。
5. ５．可溶性カルシウム塩と可溶性ホスフェートまたはリン酸とから、リン酸カル シウムをその場で生成する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. ６．硫酸アルミニウム水和物または塩化アルミニウム水和物から、酸化アルミニ ウム水和物をその場で生成する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
7. ７．タンパク質含量を４０〜５０重量％に調節する請求項１〜６のいずれかに記 載の方法。
8. ８．ｐＨを７．５〜９に調節する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. ９．加水分解酵素の分離において、酸素安定剤、例えばボレートおよび／または 多塩基性カルボン酸を使用する請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. １０．発酵ブイヨンの濃縮は、マイクロ濾過、限外濾過および／または水の蒸発 によって行う請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. １１．吸着剤の添加前に、発酵ブイヨンをマイクロ濾過去たは限外濾過によって 前精製し、吸着剤の添加およびその分離後に、溶液を減圧下に所望の濃度に濃縮 する請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. １２．最終工程におけるタンパク質沈澱剤として、可溶性アルカリ金属塩を、タ ンパク質溶液に対して１〜５重量％の量で加える請求項１〜１１のいずれかに記 載の方法。
13. １３．最終工程におけるタンパク質沈澱剤として、有機溶媒を、タンパク質に対 して５〜２０重量％の量で加える請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
14. １４．最終工程におけるタンパク質沈澱剤として、水溶性ポリマー、例えばポリ プロピレングリコールを、タンパク質に対して０．１〜５重量％の量で加える請 求項１〜１１のいずれかに記載の方法。