JPH06319558A

JPH06319558A - 過敏感性関連遺伝子

Info

Publication number: JPH06319558A
Application number: JP6025205A
Authority: JP
Inventors: Laurence Godiard; ローレンス・ゴディアール; Yves Marco; イヴ・マルコ; Dominique Pontier; ドミニク・ポンティエ; Dominique Roby; ドミニク・ロビー
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 1993-02-24
Filing date: 1994-02-23
Publication date: 1994-11-22
Also published as: HU9400527D0; SK20694A3; IL108728A0; ZA941281B; KR940019860A; PL177329B1; US5550228A; EP0612848A2; AU682674B2; EP0612848A3; US5552527A; HUT69614A; CZ40494A3; PL302320A1; AU5631194A; CA2116202A1

Abstract

(57)【要約】【目的】この発明は、hsr(過敏感性関連)遺伝子群お
よびそのプロモーターおよびその調節領域、その暗号化
領域、その遺伝子産物を含む個々の成分、それに対する
修飾、前記遺伝子、プロモーター領域、調節領域および
暗号化領域の適用およびそれに対する修飾、各々遺伝子
またはその一部分を含むＤＮＡ構築物、ベクターおよび
形質転換植物に関するものである。【構成】配列番号１のhsr２０３Ｊ遺伝子並びにその
プロモーターおよびその調節領域、その暗号化領域、そ
の遺伝子産物を含むその個々の成分、それらに対する修
飾、前記遺伝子、プロモーター領域、調節領域および暗
号化領域の適用およびそれらに対する修飾、各々遺伝子
またはその一部分を含むＤＮＡ構築物、ベクターおよび
形質転換植物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、hsr(過敏感性関連)
遺伝子群およびそのプロモーターおよびその調節領域、
その暗号化領域、その遺伝子産物を含む個々の成分、そ
れに対する修飾、前記遺伝子、プロモーター領域、調節
領域および暗号化領域の適用およびそれに対する修飾、
各々遺伝子またはその一部分を含むＤＮＡ構築物、ベク
ターおよび形質転換植物に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】高等植物の過敏感反応(ＨＲ)は、病原体
に対する病気耐性に付随する局所誘導可能な応答であ
る。この応答は、不和合性(無毒性または非宿主)病原体
により侵された組織の急速かつ局所的な壊死を特徴と
し、侵入微生物のさらなる拡散を阻止するものである。
遺伝子産物がこの植物応答に介在し得る幾つかの防御遺
伝子については充分に研究されている。それらには、抗
微生物性フィトアレキシンの合成に関与するフェニルプ
ロパノイド経路の酵素、加水分解活性をもつ酵素、毒性
化合物および細胞壁タンパクがある。感染植物におい
て、これらの遺伝子は、一旦壊死が生じてしまうと、す
なわちＨＲ中における後期段階で、壊死部分の周囲に誘
導される。さらに、前記遺伝子の大部分はまた、植物の
病気に至る和合的相互作用中に強く発現されるが、植物
の正常な発育中に発現される遺伝子もある。これらの防
御遺伝子には特異性が欠如し、それらがＨＲの後期段階
に活性化されるということは、それらだけで複雑な誘導
性応答、すなわちＨＲの確立は説明され得ないが、それ
らがこの反応に付随し得ることを示唆している。現在ま
でのところ、植物病原体認識からＨＲの発生に至る分子
機構については知られていない。「遺伝子対遺伝子」説で
は、抵抗性に至る植物病原体認識の第１段階は、植物抵
抗性遺伝子の産物および対応する病原体無毒性遺伝子の
産物間の推定的相互作用を必要とする。事実、遺伝子試
験は、多くの植物病原体相互作用の結果が、両相手物質
における単一優性遺伝子を通して決定されることを示し
た。また、ＨＲには幾つかの急速な生理学的変化が伴
い、例えば電解質漏出、呼吸速度の変化およびより新し
くは細胞壁タンパクの酸化的架橋がある。しかしなが
ら、活性化が抵抗反応中に特異的または少なくとも優先
的であり、かつＨＲの発生に先行する植物遺伝子につい
ては全く報告されていない。

【０００３】シュードモナス・ソラナセアルム(Ｐseudo
monas solanacearum)という維管束細菌は、ソラナセア
エ(Ｓolanaceae)を含む様々な植物種の致死的立ち枯れ
を誘発することが知られている。この細菌の場合、過敏
感応答(hrp)および病原性遺伝子クラスター(集団)は、
非宿主植物においてＨＲを誘導し、宿主植物において病
気を誘発するという両能力を制御することが示された。
特に、シュードモナス・ソラナセアルム(Ｐseudomonas
solanacearum)のhrp遺伝子突然変異株は、タバコ植物に
おけるＨＲ誘導能力を失っている。最近、別の細菌性病
原体エルウィニア・アミロボラ(Ｅrwinia amylovora)の
hrp遺伝子クラスターのhrpＮ遺伝子は、ハーピンと呼ば
れるタンパク質性ＨＲエリシターをコードすることが確
立された。この結果から、ＨＲ誘導におけるhrp遺伝子
の重要な役割が確認された。ＨＲ誘導性不和合性単離株
がタバコ葉に浸潤すると、葉の壊死が検出される前に、
相互作用中早期に活性化される６種の相異なる遺伝子群
が特性確認された。hrp単離株による浸潤時に誘導され
ないこれらの遺伝子は、不和合性対和合性相互作用中に
おけるそれらの転写物の蓄積レベルが異なっていた。st
r(過敏感性関連)遺伝子は、両タイプの相互作用におい
て同様の程度まで発現されるが、hsr遺伝子はＨＲ中に
優先的に活性化される。

【０００４】

【発明の構成および定義】本発明は、以後hsr２０３Ｊ
と称する遺伝子(その配列は配列番号１に描かれている)
に代表されるhsr遺伝子群に関するものである。遺伝子
の推定的タンパク生成物(配列番号２)は、既知タンパク
質との実質的相同性があるとしても、それをほとんど呈
することはない。一過性遺伝子発現検定およびトランス
ジェニック植物において特にレポーター遺伝子に機能し
得るように結合されたhsr２０３Ｊ構造遺伝子のプロモ
ーター領域を用いた試験は、hsr２０３Ｊ遺伝子の発現
が過敏感性の発生と密接に関連していることを示してい
る。プロモーターは、ＨＲ中壊死出現の数時間前に特に
活性化され、その活性化の局在性は不和合性細菌単離株
を接種された細胞に限定される。

【０００５】本発明によると、配列番号１に描かれたヌ
クレオチド配列を含む領域もしくはその機能均等配列を
含む組換えＤＮＡ配列、または前記領域もしくは前記均
等配列の一部分を含む組換え配列が提供される。

【０００６】以後、「機能均等(な)」という語がＤＮＡ配
列のタンパク暗号化領域に関して使用されている場合、
この語は、前記領域において１個またはそれ以上のコド
ンがそれらの同義コドン、すなわち対応するアミノ酸ま
たは対応する転写終止シグナルを指定するコドンにより
置き換えられた状態を意味する。

【０００７】「機能均等(な)」という語が配列の転写調節
領域に関して使用されている場合、この語は、前記領域
において１個またはそれ以上のヌクレオチドが異なるヌ
クレオチドにより置き換えられた場合、および／または
前記領域において１個またはそれ以上のヌクレオチドが
付加または除去された場合を意味するが、ただし、こう
して製造された均等配列は、転写調節活性を保持し、前
記タンパク暗号化領域に対して５'である領域またはそ
の一部分との実質的相同性を呈するものとする。

【０００８】本明細書で使用されている「実質的相同性」
という語は、慣用的ハイブリダイゼーション条件下でレ
ファレンス配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列を指
す。好ましくは、ハイブリダイゼーション条件は、ＴＭ
値が３５ないし４５℃であるハイブリダイゼーションを
指す。最も好ましくは、実質的相同性という語は、スト
リンジェントな条件(後記)下でレファレンス配列とハイ
ブリダイズするＤＮＡ配列を指す。

【０００９】本明細書で使用されている「調節領域」とい
う語は、配列中のタンパク暗号化領域に対して５'であ
る配列番号１に描かれた配列におけるヌクレオチド領域
を指す。すなわち、調節領域は、hsr２０３Ｊ遺伝子の
プロモーターおよび転写に影響を及ぼすプロモーターの
機能的成分を含む。前記機能的成分には、「欠失プロモ
ーター」並びに転写「サイレンサー」および「エンハンサ
ー」がある。

【００１０】本発明の明細書に記載されている「欠失プ
ロモーター」は、天然プロモーターに対する欠失を有
し、依然としてプロモーター活性を保持しているhsr２
０３Ｊ由来のプロモーターを包含する。前記プロモータ
ー活性は、天然プロモーターと比べて高いかまたは実質
的に同じであり得る。当技術分野の熟練者にとって、欠
失プロモーターをそれらのプロモーター活性の保持に関
して検定し得る方法は周知のものである。本発明による
欠失プロモーターは、特に植物病原体により誘導され
得、病気に対する抵抗力を改善する構造遺伝子を含む構
築物において有用である。

【００１１】配列が配列番号１に描かれたＤＮＡ配列の
少なくとも一部分により指令されるタンパクに関して
「機能均等(な)」という語が使用されている場合、この語
は、同様の機能および同様または改善された比活性、お
よび類似したアミノ酸配列を有するタンパクを意味す
る。本発明は、配列番号２に描かれたタンパクの配列ま
たはその一部分(後記)に対して少なくとも６０％類似し
ているアミノ酸配列を有する純粋タンパクを含む。好ま
しくは類似性の度合は少なくとも６０％であり、さらに
好ましくは類似性の度合は少なくとも７０％であり、さ
らに好ましくは類似性の度合は少なくとも８０％であ
る。

【００１２】本発明の明細書において、互いに少なくと
も６０％の類似性を有する２つのアミノ酸とは、４以下
の欠失または１０以下の付加の余地を与えて最適な形で
一直線に並べたとき、同じ位置に少なくとも７０％の同
一および類似アミノ酸残基を有するものとして定義され
る。本発明が意図するところでは、アラニン、セリンお
よびトレオニンは類似しており、グルタミン酸およびア
スパラギン酸は類似しており、アスパラギンおよびグル
タミンは類似しており、アルギニンおよびリジンは類似
しており、イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよび
バリンは類似しており、フェニルアラニン、チロシンお
よびトリプトファンは類似している。

【００１３】「一部分」という語がタンパク配列に関して
使用されている場合、この語は、配列番号２に描かれ、
少なくとも５個のアミノ酸を有する配列により構成され
るペプチドを意味する。さらに好ましくは前記ペプチド
は少なくとも２０個のアミノ酸を有し、さらに好ましく
は前記ペプチドは少なくとも４０個のアミノ酸を有す
る。

【００１４】「一部分」という語がヌクレオチド配列に関
して使用されている場合、この語は、配列番号１に描か
れ、少なくとも１５個のヌクレオチドを有する配列によ
り構成されるヌクレオチド配列を意味する。さらに好ま
しくは前記一部分は、少なくとも２５個のヌクレオチド
を有し、さらに好ましくは前記一部分は少なくとも４０
個のヌクレオチドを有する。

【００１５】また本発明は、配列番号１に描かれた配列
のヌクレオチド１４１３〜２４１７を含む領域またはそ
の機能均等配列を含む組換えＤＮＡ配列、または前記領
域もしくは前記均等配列の一部分を含む組換え配列を包
含する。ヌクレオチド１４１３〜２４１７は、遺伝子産
物が植物における耐病性の調節または提供において機能
的役割を有するという点で有用なhsr２０３Ｊ遺伝子の
タンパク暗号化領域に対応する。すなわち、hsr２０３
Ｊ遺伝子のタンパク暗号化配列またはその一部分は、誘
導可能なプロモーター、例えばＷＩＮ、ＷＵＮまたはＰ
Ｒ−タンパクの発現を調節するプロモーターに融合され
得、その結果、和合性病原体に感染すると、hsr２０３
Ｊ構造遺伝子の発現が誘導される。感染植物細胞におけ
るhsr２０３Ｊタンパクによる過敏感応答の後に誘発さ
れる活性化により、それ以上の病原体の拡散が阻止され
る。

【００１６】また本発明は、配列番号１に描かれた配列
のヌクレオチド１〜１３４１を含む領域またはその機能
均等配列を含む組換えＤＮＡ配列、または前記領域また
は前記均等配列の一部分を含む組換え配列を包含する。
ヌクレオチド１〜１３４１は、前記タンパク暗号化領域
に対して５'である配列の非タンパク暗号化領域に対応
する。ヌクレオチド１〜１３４１を含む前記ＤＮＡ配列
の領域は、プロモーター(ＲＮＡポリメラーゼに関する
結合部位)並びに転写サイレンサーおよびエンハンサー
を含むhsr２０３Ｊ遺伝子の転写調節領域を含む。

【００１７】サイレンサーおよびエンハンサー成分は、
それらが、それらの制御下で構造遺伝子の発現レベルの
変調を可能にするという点で有用である。

【００１８】さらに本発明は、配列番号１に描かれた配
列のヌクレオチド１〜６５１を含む領域またはその機能
均等配列を含む組換えＤＮＡ配列、または前記領域もし
くは前記均等配列の一部分を含む組換え配列を包含す
る。

【００１９】さらに本発明は、配列番号１に描かれた配
列のヌクレオチド６５２〜１３４１を含む領域またはそ
の機能均等配列を含む組換えＤＮＡ配列、または前記領
域もしくは前記均等配列の一部分を含む組換え配列を包
含する。ヌクレオチド６５２〜１３４１を含む領域は、
hsr２０３Ｊ遺伝子の転写エンハンサーおよびプロモー
ター(すなわちＲＮＡポリメラーゼ結合部位)を含む。

【００２０】さらに本発明は、hsr２０３Ｊプロモータ
ー結合タンパク(hsr−ＰＢＰ)およびこれらのhsr−ＰＢ
Ｐと会合したタンパクの同定および後続精製に用いられ
るアフィニティー基質としてのhsr２０３Ｊプロモータ
ー配列の用途を提供する。前記hsr−ＰＢＰは、既に部
分的には特性確認されており、恐らくは構造的に存在す
ると思われ、例えばニコチアナ・タバクム・エル(Ｎico
tiana tabacum Ｌ.)にシュードモナス・ソラナセアルム
(Ｐseudomonas solanacearum)の特定株を接種したとき
に行なわれる宿主植物の不和合的反応時に、hsr２０３
Ｊプロモーター配列に結合し得る。

【００２１】さらに本発明は、配列番号１に描かれた配
列のヌクレオチド１１９５〜１３４１を含む領域または
その機能均等配列を含む組換えＤＮＡ配列、または前記
領域もしくは前記均等配列の一部分を含む組換え配列を
包含する。ヌクレオチド１１９５〜１３４１を含む領域
は、病原体によりそれらの組織感染中に製造され、過敏
感応答の発生(上記参照)に関与する特異タンパクに結合
し得る細菌応答成分を含む。

【００２２】さらに本発明は、配列番号１に描かれた配
列のヌクレオチド１１９５〜１２６８を含む領域または
その機能均等配列を含む組換えＤＮＡ配列、または前記
領域もしくは前記均等配列の一部分を含む組換え配列を
包含する。この領域は、より正確には細菌応答成分を定
める。

【００２３】さらに本発明は、前記領域、一部分または
その均等配列が異種遺伝子のタンパク暗号化配列の５'
側に位置し、そして前記配列または配列番号１に描かれ
た配列のヌクレオチド１４１３〜２４１７を含む配列も
しくはその機能均等配列に機能し得るように結合された
上記組換えＤＮＡ配列を包含する。翻訳促進配列は、前
記領域またはその一部分またはその均等配列、およびそ
れに対するＤＮＡ配列３'のタンパク暗号化領域間に存
在するのが特に好ましい。

【００２４】異種遺伝子は、選択可能またはスクリーニ
ング可能なマーカー遺伝子、または遺伝子産物が昆虫、
除草剤、真菌、細菌およびウイルスのうちの少なくとも
１つに抵抗力または不応答性を付与し得るものである遺
伝子、病害発生抑圧予察に使用されるマーカー遺伝子お
よび防害虫遺伝子を含む適当な構造遺伝子であり得る。

【００２５】hsr２０３Ｊ遺伝子のプロモーターおよび
／または調節領域は、非分散性細胞傷害性遺伝子産物、
例えばリボヌクレアーゼ、プロテアーゼ、リパーゼまた
はグルカナーゼをコードする構造遺伝子に融合され得
る。前記構造遺伝子の発現を誘導すると、病原体感染に
対する急速で局在的な応答が得られ、病原体に対する抵
抗力の付与または植物の不応答性の改善に有用となり得
る。

【００２６】さらに、hsr２０３Ｊ遺伝子の調節領域
は、病害発生抑圧の早期発見を可能にする「ディテクタ
ー」植物の作製に使用され得る。hsr２０３Ｊプロモータ
ーおよび／またはその調節領域は、感染によってプロモ
ーターが活性化されると、宿主植物表現型に視覚的変化
を与えるヌクレオチド配列に融合され得る。前記配列
は、緑色組織の局所的漂白を誘発するリブロースＢ−ホ
スホカルボキシラーゼ(ＳＳ−ＲＵＢＩＳＣＯ)のスモー
ルサブユニットをコードする遺伝子のアンチセンス配向
を含む。また、前記配列は、色素生合成における鍵酵
素、例えばカルコンシンターゼをコードする遺伝子をコ
ードし得る。

【００２７】本発明はまた、本発明による組換えＤＮＡ
であって、組換えＤＮＡが挿入される生物体に好まれる
コドンを用いるという修飾が加えられた結果、前記生物
体における前記修飾ＤＮＡの発現により、組換えＤＮＡ
のタンパク暗号化成分が内在性である生物体における非
修飾組換えＤＮＡの発現により得られるタンパクと実質
的に類似したタンパクが得られる組換えＤＮＡを包含す
る。

【００２８】さらに本発明は、ストリンジェントな条件
下で、上記組換えＤＮＡ配列のいずれか１つとハイブリ
ダイズする配列と相補的であるＤＮＡ配列を含む。

【００２９】「ストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件」とは、０.１％ＳＤＳを含有する２×食塩水く
えん酸緩衝液中５０ないし６０℃でハイブリダイゼーシ
ョンが行なわれ、次に同温度ではあるが、行なわれたハ
イブリダイゼーションに影響を及ぼさない低ＳＣＣ濃度
を有する緩衝液中で単に洗浄する場合をいう。前記の低
濃度緩衝液は、各々(a)１×ＳＣＣ、０.１％ＳＤＳ、ま
たは(b)０.５×ＳＣＣ、０.１％ＳＤＳ、または(c)０.
１×ＳＣＣ、０.１％ＳＤＳである。

【００３０】さらに本発明は、本発明による組換えＤＮ
Ａ配列またはストリンジェントな条件下でそれとハイブ
リダイズする配列と相補的であるＤＮＡ配列を含むＤＮ
Ａベクターを包含する。

【００３１】本発明によるベクターは、好ましくは植物
起源の真核生物宿主の形質転換に使用されるのが好まし
い。適当な微生物もかかるベクターにより形質転換され
得、前記微生物は本発明のさらに別の態様を示すものと
する。

【００３２】「植物」という語は、本明細書では広義に使
用されており、分化植物および非分化植物材料、例えば
適当な条件下で成熟植物、その子孫およびその一部分に
生長し得るプロトプラスト、植物細胞、種子、苗木等、
例えば前記植物の挿し木および果実を包含する。

【００３３】勿論、好ましいベクターは選ばれた宿主に
より異なる。双子葉植物の場合、ベクターは、プロトプ
ラストをＤＮＡの取り込みを受容し得るものにする適当
な条件下、適当な培地中でベクターをプロトプラストと
接触させることによりプロトプラストへ導入され得る。
またベクターは、植物細胞またはプロトプラストに感染
するアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Ａgrobact
erium tumefaciens)Ｔiプラスミド誘導体の形態で使用
され得る。単子葉植物は、好ましくは顕微注入、エレク
トロポレーションまたはいわゆる弾道技術を用いるマイ
クロプロジェクティルガンの使用により形質転換され
る。いずれにせよ、適当な形質転換ベクターおよびプロ
トコルは当業界ではよく知られている。形質転換細胞ま
たはプロトプラストは適当な培養培地中で培養され、形
質転換植物は自体公知の方法で再生される。導入された
核物質は、再生された形質転換植物のゲノムへ安定した
状態で組み込まれ、その結果、前記植物は目的遺伝子を
発現するる。

【００３４】本発明による遺伝子修飾植物の例として
は、果実、例えばトマト、コショウ、マンゴー、モモ、
リンゴ、西洋ナシ、イチゴ、バナナおよびメロン、農作
物、例えばキャノーラ、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、
小粒穀類、例えば小麦、大麦および米、トウモロコシお
よび綿、並びに野菜、例えばジャガイモ、ニンジン、レ
タス、ブラッシカ・オレラセア(Ｂrassica oleracea)、
例えばキャベツおよびタマネギがある。特に好ましい植
物は、テンサイおよびトウモロコシである。

【００３５】さらに本発明は、前記植物の子孫または種
子、並びに前記子孫の種子および子孫を包含する。

【００３６】さらに本発明は、本発明による組換えＤＮ
Ａの発現により得られるタンパク、および特に配列番号
２に描かれたアミノ酸配列またはその一部分または前記
配列または一部分の機能均等配列を有する発現されたタ
ンパクを包含する。

【００３７】本発明は、後の記載並びに添付図面および
配列表によりさらに明白なものとなるはずである。

【００３８】

【図面の説明】図１は、タバコプロトプラストにおける
一過性遺伝子発現検定およびアグロバクテリウム・ツメ
ファシエンス(Ａgrobacterium tumefaciens)によるタバ
コ植物の形質転換に使用されるキメラ構築物を示す。図
(Ａ)は、pＨＧ２１(またはpＨＧ２１Ａ)におけるキメラ
β−グルクロニダーゼ遺伝子の制限地図を示す。この遺
伝子は、hsr２０３Ｊ遺伝子からの１.４kbの５'フラン
キング(非翻訳)配列およびノパリンシンターゼ遺伝子ポ
リアデニル化シグナル(nosＴ)に結合されたuidＡ遺伝子
の暗号化領域間の翻訳融合体により構成される。図(Ｂ)
は、pＨＧ２１翻訳融合接合部分の配列(配列番号２)を
示す。hsr２０３Ｊ遺伝子配列はボールド型であり、uid
Ａ配列は標準型である。配向は５'−３'であり、図面中
の矢印は配列間の融合の位置を示す。

【００３９】図２は、形質転換タバコプロトプラストに
おけるhsr２０３Ｊプロモーター活性に対するシュード
モナス・ソラナセアルム(Ｐseudomonas solanacearum)
の相異なる分離株(hrp、Ｋ６０およびＧＭＩ１０００)
による感染の効果を示す。対照として、水をプロトプラ
ストに加えた。プラスミドpＢＩ２０１およびpＢＩ２２
１は各々陰性および陽性対照プラスミドである。pＨＧ
２１はhsr２０３Ｊ−uidＡ遺伝子融合体である。ＧＵＳ
活性検定はインキュベーションの２４時間後に行なわれ
た。示されたデータは、３つの独立実験の平均を表す。

【００４０】図３は、シュードモナス・ソラナセアルム
(Ｐseudomonas solanacearum)の相異なる分離株(hrp、
Ｋ６０およびＧＭＩ１０００)により浸潤されたトラン
スジェニックタバコ葉におけるＧＵＳ遺伝子のhsr２０
３Ｊプロモーター活性化の時間推移を示す。２つのpＨ
Ｇ２１−１４Ａ形質転換体から得られた４枚の葉の抽出
物においてＧＵＳ活性を測定した。

【００４１】図４は、局所細菌感染トランスジェニック
タバコ植物におけるＧＵＳ活性の定量分析を示す。図
(Ａ)は、接種された第３葉並びに上部および下部非接種
葉におけるβ−グルクロニダーゼ活性の誘導を示す。図
(Ｂ)は、接種された第３葉の病変部およびその周囲にお
けるβ−グルクロニダーゼ活性の誘導を示す。次の組織
標本を検定した。すなわち、病変部は、損傷および／ま
たは細菌感染による壊死組織を意味し、０−３mmは、病
変部から３mm以下の見たところ健康な組織を意味し、３
−６mmは、病変部周囲３〜６mmの見たところ健康な組織
を意味する。接種は、pＨＧ２１−１４Ａ形質転換体に
おいて遂行された。図で示されている通り、小葉穿孔
を、１滴の細菌懸濁液(１０⁸c.f.u.／ml含有３マイクロ
リットル)または水により被覆した。組織標本を接種の
１８時間後に採取した。

【００４２】図５は、トランスジェニックpＨＧ２１(１
４Ａ)タバコ植物におけるhsr２０３Ｊプロモーターの活
性化に対するhrp突然変異体の効果を示す。図(Ａ)は、h
rp遺伝子集団の相異なる転写単位におけるhrp突然変異
体の局在性を示す。図(Ｂ)は、hrpＫ６０もしくはＧＭ
Ｉ１０００分離株または水、または図(Ａ)に示されてい
るhrp突然変異体による接種１８時間後の葉におけるＧ
ＵＳ活性の測定結果を示す。接種は、図４に関する記載
と同様にして遂行された。

【００４３】図６は、pＨＧ２１の幾つかの欠失を有す
るプラスミドpＨＧＤの構築を概略的に示す。

【００４４】図７は、トランスジェニックのタバコ植物
における、pＨＧ２１(図５の式による)の５'プロモータ
ー欠失により得られた構築物によるＧＵＳ遺伝子の発現
を示す。植物は５μgのＤＮＡにより形質転換され、１
００という値は、pＨＧ２１構築物による形質転換によ
り得られるＧＵＳ活性に与えられた。この図は、細菌株
デルタ３、Ｋ６０およびＧＭＩ１０００による形質転換
植物の侵入の結果としてのＧＵＳ遺伝子の活性の増加
(１８時間後)を示している。対照として、植物を水で浸
潤させた。

【００４５】配列の説明配列番号１は、タバコから単離された、タンパク暗号化
領域およびそれに関するプロモーターおよび転写調節成
分を含む、hsr２０３Ｊ遺伝子のヌクレオチド配列を示
す。遺伝子のタンパク暗号化領域は、配列中のヌクレオ
チド１４１３〜２４１７により構成される。推定的ポリ
アデニル化シグナルは、遺伝子のタンパク暗号化領域に
対して３'に存在し、ＨＲに関与する配列は遺伝子の５'
非暗号化領域の約１.４kb内である。本質的に、この配
列は、a)ヌクレオチド１３４１〜１４１２(両端を含む)
に位置する７２bpのmＲＮＡ先導配列、b)各々ヌクレオ
チド１２８２−１２８６および１３１３−１３１６位に
位置するＣＡＡＴおよびＴＡＴＡ共通配列、c)ヌクレオ
チド１４１３−１４１５位の翻訳開始部位コドン、d)実
質的にプロモーター活性に関与するヌクレオチド１−１
３４１(両端を含む)に位置する「欠失プロモーター」配
列、e)プロモーター活性に対する増強効果を有するヌク
レオチド１１９５−１２６８位に位置する配列、f)プロ
モーター活性に対するサイレンス効果を有するヌクレオ
チド１−６５１位に位置する配列を含む。

【００４６】配列番号２は、配列番号１のヌクレオチド
１４１３−２４１７によりコードされる、hsr２０３Ｊ
構造遺伝子の翻訳産物を示す。

【００４７】配列番号３は、hsr２０３Ｊ構造遺伝子の
５'フランキング領域およびuidＡレポーター遺伝子の暗
号化領域を含むキメラ遺伝子に対するリンカー領域を示
す。hsr２０３Ｊ構造遺伝子に関する開始コドンは、配
列中のヌクレオチド１０−１２に位置し、ヌクレオチド
１３−６４は、hsr２０３Ｊ遺伝子産物のＮ−末端配列
をコードする。

【００４８】細菌株および植物材料本明細書で使用されているシュードモナス・ソラナセア
ルム(Ｐseudomonas solanacearum)は、表１に示されて
いる。

【表１】この試験で使用されるシュードモナス・ソラナセアルム(Ｐseudomonas solanace arum)野生型および突然変異株、およびタバコにおけるそれらの徴候誘導能力株供給源またはレファレンス分離もとタバコ応答野生型ＧＭＩ1000 ボウチャー等(１) トマトＨＲＫ６０ロザノ等(１７) トマト病気ＧＭＩ１０００から誘導された突然変異体(hrp遺伝子集団の欠失) Δhrp ボウチャー等、未発表徴候無しＧＭＩ１０００から誘導されたhrp遺伝子集団における突然変異体(Ｔn５−Ｂ２０突然変異導入) ＧＭＩ1462、1475、 1494、1492、1487 アーラット等(１８) 徴候無しＧＭＩ1423、1425 アーラット等(１８) 部分的および／または遅延的HR ＧＭＩ１０００から誘導された突然変異体(hrp遺伝子集団の外側でのＴn５−Ｂ２０突然変異導入) ＧＭＩ1485 アーラット等(１８) ＨＲ

【００４９】ＧＭＩ１０００およびＫ６０分離株は野生
型シュードモナス・ソラナセアルム(Ｐ．solanacearum)
株であり、前者は侵入後２４時間以内にタバコ葉におい
てＨＲの発生を誘導し、後者は典型的な致死的立ち枯れ
病を誘発する。hrp遺伝子集団に関して欠失したΔhrpと
呼ばれるＧＭＩ１０００分離株の誘導体は、接種葉にお
いて肉眼的徴候を全く誘発しない。トランスポゾンＴn
５−Ｂ２０突然変異導入によりＧＭＩ１０００から誘導
された８つの突然変異株は、下記要領で使用された。Ｇ
ＭＩ１４６２、１４７５、１４９４、１４８５、１４２
３および１４２５株は、各々hrp遺伝子集団の６つの推
定的転写単位の１つにおいて突然変異している。これら
の株は全て、タバコにおけるＨＲの誘発能力を喪失して
いるが、例外として、ＧＭＩ１４２３および１４２５株
は、hrp遺伝子集団の右側端部が突然変異し、タバコに
おいて部分的および／または遅延したＨＲのみを誘導
し、そしてＧＭＩ１４８５株は、hrp遺伝子集団の外側
で突然変異しており、タバコにおいて正常なＨＲを誘導
し、β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子を構成的に発現
する。これらは全て、ＢまたはＢＧＴ培地(１)において
２８℃で生育される。ここで使用されているニコチアナ
・タバクム・エル(Ｎicotiana tabacum Ｌ.)の品種ボト
ム・スペシャルおよびサムサンは、細菌接種後に似た応
答を呈する。実生を、ムラシゲおよびスクーグ(ＭＳ)培
地(２)において４〜５週間インビトロで生育し(２５
℃、１６時間光周期、１５ワット／m²)、次いで生長チ
ャンバー中の土壌に移す(２５℃、１６時間光周期、３
０ワット／m²)。

【００５０】hsr２０３Ｊ遺伝子の単離およびヌクレオ
チド配列分析バクテリオファージλ−Ｅmb１３(クロンテック)で構築
されたタバコ(ニコチアナ・タバクム・エル品種ＮＫ３
２６)ゲノムライブラリーを、pＮt２０３ cＤＮＡクロ
ーン(３)によりスクリーニングする。pＮt２０３のＰst
Ｉ挿入体を、無作為プライマー技術(４)により標識す
る。製造会社(アマーシャム)が示唆する要領に従い、ゲ
ノムライブラリーの複製ニトロセルロースフィルターを
処理し、ハイブリダイズする。hsr２０３Ｊを含む４つ
の相異なるゲノムクローンが分離される。エキソヌクレ
アーゼIII欠失は、ヘニコフ(５)に従いファージミドpＫ
Ｓ(ストラタジーン)でサブクローン化されたＤＮＡ挿入
体の両端で遂行され、両鎖ともシーケナーゼ(ユー・エ
ス・バイオケミカル、コーポレーション)を用いたジデ
オキシ鎖末端方法(６)により配列決定される。配列編集
および分析は、ユニバーシティー・オブ・ウィスコンシ
ンのジェネティクス・コンピューター・グループ・ソフ
トウェア(７)を用いることにより遂行される。ジーンバ
ンク(レリーズ７１.０)およびスイスプロット(レリーズ
２１.０)データベースによる相同性調査は、ＦＡＳＴＡ
アルゴリズム(８)を用いて行なわれる。タンパク配列
は、ＰＣ／ジーン・プログラム(デパートメント・オブ
・メディカル・バイオケミストリー、ユニバーシティー
・オブ・ジュネーブ、スイス)のレリーズ５.０を用い
て、可能なＮ−末端シグナル配列および膜スパンニング
・ドメインについて分析する。転写開始部位は、不和合
性分離株による接種の９時間後にタバコ葉から抽出され
たポリＡ＋ＲＮＡおよびＡＴＧコドンに位置するオリゴ
ヌクレオチド(配列番号１におけるヌクレオチド１４１
３〜１４１５)を用いたプライマー伸長技術により決定
される。

【００５１】レポーター遺伝子構築物タバコhsr２０３Ｊ遺伝子の１.３キロ塩基(kb)の５'非
暗号化領域および転写開始部位のヌクレオチド配列下流
の８９０塩基対(bp)を含むＢglIIフラグメントを、ファ
ージミドpＫＳのＢamＨＩ部位にクローン化することに
より、pＫＪ２.２が生成される。このプラスミドをＢst
ＢＩで消化すると、hsr２０３Ｊ翻訳開始コドンの５５b
p３'が１回切断され、ＳalＩ消化の前にＢstＢＩ生成端
をＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片により平滑末端ラ
イゲーションした。この１.５kb ＳalＩ−ＢstＢＩフラ
グメントを、β−グルクロニダーゼ(ＧＵＳ)発現バイナ
リーベクターpＢＩ１０１.２(９)のＳalＩ−ＳmaＩ部位
にクローン化することにより、hsr２０３Ｊ−uidＡ遺伝
子融合体pＨＧ２１Ａが生成される。hsr２０３Ｊプロモ
ーターおよびuidＡ暗号化配列を含む、pＨＧ２１Ａの
３.５kb ＨindIII−ＥcoＲＩＤＮＡフラグメントを、
ＨindIII−ＥcoＲＩ消化pＵＣ１９ベクターへライゲー
ションすると、一過性発現遺伝子検定(図１)用のpＨＧ
２１が生成される。従って、pＨＧ２１およびpＨＧ２１
Ａ構築物は、１３４１bp５'非暗号化配列、７２bp先導
配列、ＧＵＳ暗号化配列と枠内で融合したhsr２０３Ｊ
の暗号化配列の最初の５５bp、およびノパリンシンター
ゼ(nos)遺伝子ポリアデニル化シグナルを含む。翻訳融
合は、ＧＵＳ特異的プライマー(１０)による直接２本鎖
配列決定法により確認される。２つの追加プラスミドp
ＢＩ２０１およびpＢＩ２２１は、各々pＵＣ１９ベクタ
ー(クローンテック)におけるnosターミネーター上流
の、プロモーターを欠くuidＡ遺伝子、およびカリフラ
ワーモザイクウイルス(ＣaＭＶ)３５Ｓプロモーター−u
idＡ遺伝子を含む。

【００５２】プロトプラスト単離および一過性発現検定４〜５週令のインビトロ生育タバコ植物、サムスンＮＮ
品種の葉を用いて、暗所中２２℃で１５時間１g／lのセ
ルラーゼＲ１０オノヅカ、２００mg／lのマセロザイム
・オノヅカ(ヤクルト本社、西宮、日本)および５００mg
／lのペクトリヤーゼＹ２３(セイシン・ファーマシュー
ティカル・インダストリー)を含むＴＯ培地(１１)中で
葉片をインキュベーションすることにより、プロトプラ
ストを単離する。プロトプラストを、８５μmナイロン
メッシュによるふるいにかけた後、１９％(w／v)スクロ
ースの１mlクッション上へ５分間５０gで遠心分離する
ことにより、細胞屑から分離する。浮流プロトプラスト
をＴＯ培地で１回洗浄し、計数し、１.５×１０⁶プロト
プラスト／mlの密度に調節する。形質転換は、プロトプ
ラスト(３２０μl試料)を４５℃で５分間インキュベー
ションした後、室温で短時間冷却し、プラスミドＤＮＡ
(１０ミリモルのトリス−ＨＣl(pＨ８)中１検定当たり
５０μg)および１６０μlのＰＥＧ溶液(４０％ＰＥＧ、
０.４モルのマンニトール、３０ミリモルのＭgＣl₂、
０.１％のＭes、pＨ５.８)を加えることにより行なわれ
る。プロトプラストを室温で１０分間静かに混合する。
次いで、それらを遠心分離により集め、５００μlのＴ
Ｏ培地に再懸濁する。次いで、以前に記載された要領
(１２)で製造された細菌懸濁液(１０細菌／プロトプラ
スト)を加える。２８℃で２４時間インキュベーション
後、５０μlの１０×ＧＵＳ緩衝液を加えることにより
プロトプラストを溶解し、遠心分離し、上清をＧＵＳ活
性(１０)について検定する。

【００５３】トランスジェニックのタバコ植物 pＨＧ２Ａ、pＢＩ１２１およびpＢＩ１０１を、エシェ
リヒア・コリ(Ｅscherichia coli)ＤＨ５αからアグロ
バクテリウム・ツメファシエンス(Ａgrobacterium tume
faciens)株ＬＢＡ４４０４(１３)へ移し、トランスジェ
ニックのタバコ植物(ニコチアナ・タバクム(Ｎ．tabacu
m)、ボトム・スペシャル)をリーフディスク方法(１４)
により発生させる。０.８％ディフコ寒天、１００μg／
mlのカナマイシンおよび５００μg／mlのカルベニシリ
ンを含むＭＳ培地において形質転換植物を選択する。ト
ランスジェニック植物を自家受精させ、種子を集める。
子孫(Ｔ２)分析により、カナマイシン含有(５００μg／
ml)ＭＳ培地で発芽させることによって、それらの表現
型を決定する。

【００５４】細菌分離株によるトランスジェニック植物
の接種接種実験は全て、１実験条件当たり同じ表現型の少なく
とも２植物を用い、カナマイシン耐性Ｔ２植物において
遂行する。形質転換体のスクリーニングおよび動力学実
験を行うため、タバコ葉を８週令植物からはずし、参考
文献(１２)の記載に従い細菌懸濁液(１０⁷c.f.u.／ml)
または水により真空内浸潤する。注射器浸潤実験は、針
の無い注射器で細菌懸濁液(１０⁸c.f.u.／ml)を外れて
いない葉の小領域へ浸潤させることにより、８週令植物
において行なわれる。実験によっては、ＭＳ培地上マジ
ェンタ・キューブ(シグマ)中で生育させた５週令植物に
おいて接種を行う場合もあった。葉の各半分を１０μl
−ハミルトン針で６回穿孔し、３μl小滴の細菌懸濁液
(０.４％ディフコ寒天中１０⁸c.f.u.／ml)を損傷部位に
直接滴下する。

【００５５】局所根部接種を行うため、４週令植物を、
０.２％ディフコ寒天含有ＭＳ培地と接触させた状態で
ラフト(シグマ)において生育させ、根の先端から１セン
チメートルの位置または２次根毛状体における針による
創傷部を通して３μl小滴の細菌懸濁液を接種する。広
汎性根部接種の場合、創傷を回避しながら、植物総体を
ラフトから注意深く外し、根系を７mlの細菌懸濁液(１
０⁸c.f.u.／ml)に浸す。

【００５６】接種植物を２８℃で維持し、インキュベー
ション時間後直接または−８０℃で貯蔵して分析する。

【００５７】ＧＵＳ検定植物組織を液体窒素中で粉砕し、１×ＧＵＳ緩衝液中で
ホモジネートし、１００００gで５分間遠心分離し、以
前に記載された要領(１５)で上清をＧＵＳ活性について
検定する。ブラッドフォード色素試薬を用いて、タンパ
ク濃度を測定する。ＧＵＳ活性は、タンパク１mgで１分
間当たりの４−メチルウンベリフェロンのピコモル数と
して表される。別法として、組織化学的検定は、新鮮な
組織で基質としてＸ-グルック(５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、クローンテ
ック)またはマジェンタ-グルック(ビオシント・アクチ
エンゲゼルシャフト)(１０)を用いて行なわれる。実験
によっては、試料を０.３％ホルムアルデヒド／５０ミ
リモルＮaＰＯ₄緩衝液(pＨ７)に固定し、次いでエタノ
ール煮沸により澄明化し、７０％エタノール中で貯蔵す
る場合もある。

【００５８】β−ガラクトシダーゼ検定ＧＵＳ組織化学的検定後、若干の試料を、Ｚ緩衝液(１
６)(１００ミリモルＮaＰＯ₄緩衝液(pＨ７.４)、１０ミ
リモルＫＣl、１ミリモルＭgＳＯ₄)中で平衡状態にし、
１時間１.２５％グルタルアルデヒド中で固定すること
により、内在性植物β−ガラクトシダーゼを不活化し、
洗浄し、２８℃で５ミリモルＫ₃Ｆe(ＣＮ)₆および５ミ
リモルＫ₄Ｆe(ＣＮ)₆含有Ｚ緩衝液中０.８mg／mlのマジ
ェンタ-ガル(ビオシント・アクチエンゲゼルシャフト)
またはＸ-ガルにより染色し、次にエタノール中で煮沸
することにより澄明化し、暗または明視野顕微鏡により
観察する。

【００５９】hsr２０３Ｊ遺伝子の特性検定ゲノムタバコライブラリーをpＮt２０３ cＤＮＡクロー
ンでスクリーニングすることにより、hsr２０３Ｊ遺伝
子を単離する。前記遺伝子は、最少限４遺伝子(参考文
献３参照)から成る小マルチ遺伝子群に属し、２種の異
なるcＤＮＡクローン(pＮt２０３およびpＮt２３９)に
対応するこの群の少なくとも２遺伝子はＨＲ中に発現さ
れる。

【００６０】hsr２０３Ｊ(配列番号１)の２.７kbＤＮＡ
領域の配列分析は、イントロンが存在しない単一転写解
読枠(ＯＲＦ)および３５５アミノ酸の潜在的暗号化能力
を示している。前記２.７kb領域のヌクレオチド配列
は、２置換bp(示されていない)以外はpＮt２３９cＤＮ
Ａクローンと同一である。これらの誤対合は、恐らく異
なるタバコ品種からゲノムおよびcＤＮＡクローンを分
離したためと思われる。ゲノムクローンはＮＫ３２６品
種から分離され、pＮt２３９ cＤＮＡクローンはボトム
・スペシャル品種から得られる。予測されたhsr２０３
Ｊ構造タンパク(配列番号２)は、３７.５キロダルトン
の分子量および５.１７の理論的等電点を有する。

【００６１】転写開始部位は、プライマー伸長により推
定的翻訳開始コドンの７２bp上流位置にマッピングされ
る。プロモーターおよび５'−非翻訳領域は、防御遺伝
子で既に報告されているシス-エレメントとの明白な配
列相同性は呈しなかった。

【００６２】タバコプロトプラストにおけるhsr２０３
Ｊ-uidＡ遺伝子融合の一過性発現。pＨＧ２１プラスミ
ドは、ノパリンシンターゼ遺伝子の３'非翻訳領域に結
合された(図２)、hsr２０３Ｊ遺伝子からの１.４kbのフ
ランキング配列およびuid-Ａレポーター遺伝子の暗号化
領域間の翻訳融合により構成される。プラスミドpＢＩ
２０１およびpＢＩ２２１は、一過性検定において各々
陰性および陽性対照として使用される。

【００６３】初期実験は、エバンス・ブルー排除法によ
り定量されたプロトプラスト生存能力が、１プロトプラ
スト当たり１０〜１００細菌割合の細菌の存在下ではあ
まり改変されないことを示している(データは示さず)。
続いて実験を１プロトプラスト当たり１０細菌により行
なう。この細菌密度において、ＧＭＩ１０００分離株に
応じるhsr２０３Ｊプロモーターに融合されたＧＵＳの
発現は、対照(水またはΔhrp接種)に応じる場合よりも
６倍高い(図３)。比較した場合、和合性分離株Ｋ６０を
接種すると、酵素活性は２倍増加する。これらのＧＵＳ
活性レベルを、様々な接種処理後に高度でほぼ構成的レ
ベルを呈するＣaＭＶ３５Ｓ−uidＡ遺伝子融合体(pＢＩ
２２１)により形質転換されたプロトプラストで測定さ
れたレベルと比較しなければならない(図３)。

【００６４】従って、一過性検定の結果は、hsr２０３
Ｊプロモーターが、ＨＲ誘導性細菌分離株によるその優
先的活性化に必要な成分を全て含むこと、およびこの発
現システムは植物／病原体相互作用を完全に模倣するこ
とを明白に示している。

【００６５】トランスジェニックのタバコにおけるhsr
２０３Ｊ-uidＡ遺伝子融合の発現植物(planta)におけるhsr２０３Ｊプロモーターの発現
の空間的および時間的パターンを決定するために、リー
フディスク形質転換法によりhsr２０３Ｊ-uidＡ遺伝子
融合体をタバコに移す。カナマイシン耐性Ｔ２植物を全
実験で使用する。２３カナマイシン耐性形質転換体のう
ち、２０は遺伝子融合体を発現し、これらは全て同じ全
体的発現パターンを呈する。ＧＵＳ活性は、ＧＭＩ１０
００による浸潤後に最大であり、接種１８時間後には、
対照浸潤物(水またはΔhrp)よりも２〜９０倍刺激性が
高く、Ｋ６０浸潤物よりも２〜２５倍誘導性の高いこと
が見出された(示されていない)。これらのレベルは、Ｇ
ＭＩ１０００またはＫ６０による接種後の一過性実験で
得られたレベルと同等である。

【００６６】この分析に基づき、対照浸潤物と比べて不
和合的接種後にＧＵＳ活性の９０倍高い刺激性を示し、
１ハプロイドゲノム当たり１つの遺伝子融合体の挿入を
含む形質転換体(pＨＧ２１−１４Ａ)を選択する。陰性
遺伝子融合体の存在をゲノムＤＮＡのサザーン分析によ
りチェックする(示されていない)。

【００６７】抽出可能なＧＵＳ活性およびＧＵＳ組織化
学的位置測定の検定を両方用いることにより、植物発生
中および細菌接種に応じた異なる器官でのhsr２０３Ｊ
プロモーターの活性をモニターする。４、７または１５
日令のpＨＧ２１−１４Ａタバコ実生において、異状の
無い葉からも、充分に生長した植物の花からもＧＵＳ活
性は全く検出されなかった(示されていない)。これらの
データは、得られた全形質転換体のスクリーニングによ
って示された通り、hsr２０３Ｊプロモーターが、浸潤
１８時間後、ＨＲ誘導性分離株ＧＭＩ１０００を接種さ
れた葉において強く活性化されることを示す。動力学試
験は形質転換体pＨＧ２１−１４Ａ(図３)で行なわれ、
その試験は、ＧＭＩ１０００により浸潤された葉では、
ＧＵＳ活性が接種６時間後に対照値よりも１２倍高いレ
ベルに増加し、９時間後に刺激性２００倍の最大値に到
達し、長いインキュベーション後に中間レベル(８０倍
誘導性)まで減少することを示している。Ｋ６０浸潤後
にはかなり低レベルが測定され、検出不可能なレベルの
ＧＵＳ活性は、いずれのインキュベーション時点でも水
またはΔhrp分離株により浸潤された葉から見出され
た。

【００６８】プロモーターが存在しない構築物pＨＩ１
０１により形質転換された植物は、ごく僅かのＧＵＳ活
性レベルを示す。さらに、ＣaＭＶ３５Ｓ−uidＡ遺伝子
融合体を含む、pＢＩ１２１により形質転換された植物
は、接種物の性質がいかなるものであっても似たレベル
の酵素活性を示す(示されていない)。すなわち、hsr２
０３Ｊ−uidＡ遺伝子融合体は、浸潤タバコ葉でのhsr２
０３Ｊ転写物の蓄積のインビボパターンと密接に対合す
る、トランスジェニック・タバコ植物の細菌接種後にお
ける明白で特異的な活性化パターンを呈する(３)。ま
た、これらの結果は、hsr２０３Ｊプロモーターが不和
合性植物／病原体相互作用中に早期かつ特異的に活性化
されること、およびhrp遺伝子を欠く細菌分離株はhsr２
０３Ｊプロモーターを活性化し得ないため、その誘導は
hrp遺伝子依存的であることを示している。

【００６９】細菌接種に応じたhsr２０３Ｊ-uidＡ活性
化の位置測定形質転換体pＨＧ２１-１４Ａにおいて異なる接種試験を
行うことにより、第一に、典型的ＨＲ中でのプロモータ
ー誘導を調べるためにタバコ葉において、第二に、細菌
により自然感染した器官である根において、細菌接種に
応じたhsr２０３Ｊプロモーター活性化を正確に位置測
定する。

【００７０】葉接種物: hsr２０３Ｊ−ＧＵＳ遺伝子発
現が局所的であるか全体的であるかを試験するため、５
週令のトランスジェニック植物の葉に、細菌懸濁液の小
滴を接種する。１８および７０時間インキュベーション
後、接種した葉の半分並びに上部および下部葉において
ＧＵＳ活性を測定する。結果は、接種葉におけるこの活
性の１５倍誘導性を示しており、上部および下部葉から
は非常に低レベルが検出される(図４Ａ)。接種葉の他の
半分については、組織化学的ＧＵＳ検定に使用する。狭
い青色染色領域は、ＨＲ誘導性細菌分離株による接種の
１８時間および７０時間後に損傷領域の周囲で視覚化さ
れ、前記領域は、数個の細胞層に限定され、黄色の恐ら
くは死んだ細胞の非常に近くで位置測定される。染色強
度は、接種の７０時間後に増加する。Ｋ６０接種後に
は、僅かの分散細胞しか微青色染色を呈しない。水また
はΔhrp単離株接種物は、検出可能なＧＵＳ発現を誘導
しない。ＣaＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下でキメラu
idＡ遺伝子をもつトランスジェニック植物を染色する
と、病変部周囲が優先的に染色されず葉全体が染色され
ることから、この領域におけるhsr２０３Ｊプロモータ
ーの誘導の特異的性質が立証される。感染中におけるこ
の活性化のより詳細な位置測定は、接種１８時間後、病
変部周囲の小区画でのＧＵＳ活性測定により与えられる
(図４Ｂ)。高レベルの酵素活性(対照値よりも４８倍強
い刺激性)は、ＧＭＩ１０００による接種後に壊死病変
それ自体の範囲内からしか見出されない。検出可能な酵
素活性は、病変部から３mm以下離れた組織からは全く見
出されない。

【００７１】いかに早くhsr２０３Ｊプロモーターが接
種領域で活性化されるかを測定するため、細菌懸濁液ま
たはＫ６０を入れた注射器により局所浸潤させた８週令
のトランスジェニック植物の葉において組織化学的ＧＵ
Ｓ位置測定を行う。ＧＭＩ１０００分離株による接種後
６時間程度の早期では目に見える組織壊死は存在せず、
葉の浸潤領域は青色染色を示し、その強度は接種９時間
後に増加する。後のインキュベーション時点では、黄色
壊死が累進的に現れ、葉の浸潤部分内に依然として位置
する薄い青色領域によるその境界で制限される。

【００７２】これらの種々の実験は、hsr２０３Ｊ−Ｇ
ＵＳ発現が、ＨＲ誘導性分離株、ＧＩ１０００に感染し
た細胞層に正確に対応する制限領域に制限されることを
明白に示している。

【００７３】根接種物: ラフトで生育されたトランス
ジェニック植物の根を傷付け、細菌懸濁液の小滴を接種
する。４８時間インキュベーション後、ＧＵＳ活性の組
織化学的位置測定を遂行する。ＧＭＩ１０００により感
染した根でしか観察されない染色は、根における初期接
種部位から２mm離れた場所まで拡大している。細胞学的
試験は、hsr２０３Ｊプロモーター活性化が細胞タイプ
依存性ではないと思われることを示している(図示され
ていない)。また、広汎的根部接種は、単に根系全体を
細菌懸濁液に浸漬することにより行なわれる。この場
合、ＧＵＳ活性は、根の制限領域、すなわち２次根の起
点から見出される。この特定位置での遺伝子融合体の発
現は、２次根の毛状体鞘に沿って観察された宿主への細
菌侵入の優先部位の存在と相関していなければならな
い。これらの特定部位において、β−ガラクトシダーゼ
融合体を含む細菌分離株を用いることによるＧＵＳ活性
および細菌の二重染色は、hsr２０３Ｊプロモーターの
活性化および細菌の存在間の良好な相関関係を示す。ま
た、根先端の表在的および細胞間細菌コロニー化も観察
されており、根のこの部分ではhsr２０３Ｊプロモータ
ーが強く活性化される。

【００７４】すなわち、hsr２０３Ｊ−ＧＵＳ遺伝子融
合体は、細菌感染に応じたトランスジェニックタバコ植
物での明白かつ特異的な活性化パターンおよび植物への
細菌侵入のパターンと密接に適合するパターンを呈す
る。

【００７５】hrp遺伝子におけるhsr２０３Ｊ-uidＡ活性
化の依存性 hrp遺伝子集団(図５Ａ)の６転写単位の１つが突然変異
した異なるシュードモナス・ソラナセアルム(Ｐ．solan
acearum)株を用いて、飛沫方法によりトランスジェニッ
ク植物(pＨＧ２１-１４Ａ)に接種する。これらの突然変
異株はタバコにおけるＨＲ誘導能力を失っているが、そ
れらのうちの２種、ＧＭＩ１４２５およびＧＭＩ１４２
３は部分的または遅延的ＨＲを誘導する。接種１８時間
後、７試験突然変異株のうちの６からはＧＵＳ活性に対
する効果は全く検出され得ない。ＧＭＩ１４２３のみ、
野生型株ＧＭＩ１０００の場合に匹敵する酵素活性の増
加を誘導する(図５Ｂ)。これらのデータは、hsr２０３
Ｊ活性化がほぼ全体の機能的hrp遺伝子集団を必要とす
ることを示している。

【００７６】現在までのところ、病原体の制限および偶
発的排除に有効な機構を提供する、不和合性病原体の認
知、細胞全体へのそのシグナルの移動または最終的には
プログラム化された細胞死(ＨＲ)に特異的に関与する植
物遺伝子は全く同定されていない。

【００７７】遺伝子hsr２０３Ｊ(配列番号１)は最初に
単離された過敏感性関連遺伝子であり、そのプロモータ
ーは、ＨＲ誘導性細菌分離株に応じた急速で高レベルの
局在的で特異的な活性化を呈する。

【００７８】pＨＧ２１の５'プロモーター領域の欠失体
の構築キメラ遺伝子のプロモーターの１方向性欠失は、ヘニコ
フ(５)に従い５'末端から出発して実現された。その目
的のために、制限酵素ＳhpＩおよびＳalＩを用いてプラ
スミドpＨＧ２１(図１)を線状化し、次いでエキソヌク
レアーゼIIIにより消化する。各々約２００pb間隔をお
いて連続的欠失を有する構築物を選択する。欠失体の
５'末端の位置測定は、その領域の配列決定を行い、hsr
２０３Ｊ遺伝子のヌクレオチド配列と比較することによ
り決定される(図６参照)。

【００７９】トランスジェニックタバコ植物におけるキ
メラ遺伝子の遺伝子発現に対する欠失体の効果異なる欠失体(図６)に対応する５０μgのプラスミドＤ
ＮＡを、タバコ植物へ形質転換により導入する。ＧＵＳ
活性を接種１８時間後に測定する。

【００８０】図７は、pＨＧ２１(図５の概略図による)
の５'プロモーター欠失体により得られた構築物による
ＧＵＳ遺伝子の発現を示す。植物を５μgのＤＮＡによ
り形質転換し、pＨＧ２１構築物による形質転換により
得られるＧＵＳ活性に１００という値を与えた。この図
は、細菌株デルタ３、Ｋ６０およびＧＭＩ１０００によ
る形質転換植物の浸潤の結果としてのＧＵＳ遺伝子の活
性の増加(１８時間後)を示す。対照として、植物を水で
浸潤させた。これらの実験は、hsr２０３Ｊ遺伝子の欠
失プロモーターの調節効果を有する２つの主領域の存在
を示している。

【００８１】配列番号１の１−６５１ヌクレオチド領域
に位置する１つまたはそれ以上の成分は、キメラ遺伝子
の発現の減少に関与し、第２領域(ヌクレオチド６５２
−１２６８)に位置する成分は、hsr２０３Ｊ遺伝子のプ
ロモーターの活性化に対する正の効果を呈する。

【００８２】シュードモナス・ソラナセアルム(Ｐseudo
monas solanacearum)を接種したトランスジェニック植
物の根および葉におけるプロモーター活性化の空間的お
よび時間的パターンの試験は、 −プロモーターが、ＨＲ中において壊死病変出現の数時
間前に特異的に活性化されること、 −その活性化の局在性が細菌と接触した数細胞層に限定
されていること、 −プロモーターが、様々なストレス条件に応答せず、和
合性相互作用中に非常に弱く活性化されること、 −プロモーター活性化が、シュードモナス・ソラナセア
ルム(Ｐseudomonas solanacearum)のhrp(過敏感応答お
よび病原性)遺伝子に強く依存していること、これらの
遺伝子が、細菌のもつ耐性または非宿主植物におけるＨ
Ｒ誘導能力および宿主植物における病気誘発能力を制御
することを示している。

【００８３】hsr２０３プロモーターが、ＨＲ特異的エ
リシター、エルウィニア・アミロボラ(Ｅrwinia amylov
ora)のhrp遺伝子の１つの産物であるハーピンに応答し
て発現されるという事実は、hsr２０３Ｊ遺伝子プロモ
ーターの活性化における細菌hrp遺伝子の主たる役割に
有利である。このポリペプチドに応答して、プロモータ
ーは、対応する無毒性株により観察されるレベルと同様
のレベルではあるが、より急速に活性化される。他の可
能な誘導物質、例えば生物性および無生物性エリシタ
ー、耐性誘導物質がその発現に影響することはない。細
菌病原体との不和合性相互作用中におけるhsr２０３Ｊ
の特異的発現の広汎性は、他の病原体、例えばシュード
モナス・シリンガエ・ピーヴイ・ピシ(Ｐseudomonas sy
ringae pv pisi)／シュードモナス・シリンガエ・ピー
ヴイ・タバシ(pseudomonas syringae pv tabaci)および
エルウィニア・アミロボラ(Ｅrwinia amylovora)を試験
することにより立証されている。

【００８４】さらに、不和合性細菌株に応答したhsr２
０３Ｊ遺伝子の転写活性化に関与するシス-エレメント
の機能分析は、一連の５'欠失体の生成および一過性検
定によるトランスジェニック植物でのこれらの構築物の
分析により開始された。結果は、配列番号１に描かれた
配列のヌクレオチド１１９５および１２６８間におけ
る、１遠位サイレンサー成分および２つの正の調節成分
の存在を示しており、前記２成分の一方は定量的(配列
番号１におけるヌクレオチド６５５−７７０)であっ
て、他方は細菌に対する応答に特異的である。

【００８５】これらの結果は、hsr２０３Ｊ遺伝子プロ
モーターが、これまでに試験された植物防御遺伝子に関
して新規で独特の活性特性を呈することを示している。
ＨＲ中においてその特異的誘導と共存するその空間的お
よび時間的活性化プログラムは、ＨＲの確立および調節
を試験するための分子ツールとしてのこの遺伝子の重要
性を強調している。さらに、７４bp配列成分は、無毒性
病原体によるプロモーターの誘導性に関与するものとし
て特定されている。

【００８６】本発明は、不和合性病原体によるタバコ植
物の攻撃に応答したhsr２０３Ｊプロモーターの活性化
に関して具体的に記載されているが、このプロモーター
は、ある種のウイルスおよびある種の真菌を含む他の病
原体による遺伝子についてトランスジェニックな他の植
物の攻撃によっても同様に活性化され得るものとし、hs
r２０３Ｊプロモーターの特異的発現は、過敏感応答を
誘導する宿主および病原体間における不和合性相互作用
の一般的現象であることを示している。

【００８７】さらに、細菌応答成分を含む配列番号１に
描かれた配列の１１９５〜１２６８位により構成される
ヌクレオチド配列は、様々な供給源(異状の無い植物、
シュードモナス・ソラナセアルム(Ｐseudomonas solana
cearum)株が接種された植物、異なるインキュベーショ
ン時間後の和合性、不和合性およびhrp−突然変異体)か
らの核タンパク抽出物に結合する。上記結合は、例えば
７４bp領域および幾つかのサブフラグメントを用いた遅
延ゲル分析により評価され得、こうして誘導可能な耐病
性遺伝子を含む遺伝子構築物の提供に有用なＢＲＥ領域
内における別々の配列が同定され得る。

【００８８】

【参考文献】

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【００９０】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：2778塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：不明配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源生物名：タバコ(Tobacco) 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1413..2417 配列 GGATCTTAAT GTTAGTTTAT CTCTTGTTTT GAATATTTGA TCTTAATTAT AATTTATCCA 60 CCATAAATTT TATTTTCAAA GATCAAACTA TTGATATGAC ATTTCACTTT TTTATCTTTA 120 TGTTTGTAGA ATCATTAGTG GTATTGACTC TTACCAATCA TTTTTTTTTC TTTCTCACAC 180 ATTTATATTC TTAAATTTTC TTAGTTATTG TTTAATAATT GGGTATTTTT TAATATTACA 240 CGAAAAATTG ATTAAAAAAA TATTATTTGA GTAGAAAAAT AGTTCAAATA TAATATAAAC 300 ATATATTATC GTGGGAGTAT TTTTTTCTCA ATTTCAACTC TTTATGCAGT CCACTTAATA 360 TTACTTTTAT TTTTTCTTGG TATTAGACAT TATGGAGTGG TAATGTATTG CCAATACGGC 420 TGATTCTTAT GAAATTGATT TTATTAAACC TTCCTACATT TTTAATAATA ATTTAATAGA 480 CAAAATTTTA TTAATTTTAA ATATTAAATA TTAAAAATTA GTAGCATATA AGGTATTATA 540 GTCCAAAAAA TAGCTTATTA CAGTTACGTA CTCTTCCTAT GAGTTCTTTC GTTTAATAAT 600 GTAGGGCTAT TTTGATATAT TAATATTGTA TTTATGCTTT TATAATAATA TAGGCTCTCT 660 TTTTTCTATA TGAATTTGGA CAATATAATA CATTTTCAAA TTAAATTAGT ATCAAATAAT 720 TGTATTTTTG CTTTTTTAAT AATTTATACG CATGAATTTC ATAATCCAGC ATATTATGCT 780 AGAACTTTTC GTGTTTCAAC TAAAATAATG ACTATTTTTC AATGACGTTA CAAACACTGA 840 CTAATTTTTG ATTGCAGTCC GAAAACTATC TAGTCTATGC TATTTTCACT TTTCTAAACT 900 CCCTGCCACT GTATGCTTTC ATTGGATTAA CCTTTAACCA CACAAATATT TTAAAGAGTA 960 ATGTTTGACA GCGTAATTTG AAACATCTAC TATGCCTCTG TATATAATAT CTAATGTTTG 1020 TTCGTAGACC AATATTCTAA TTCCTCTCTT GTAGACTAAA CGGGGCTGTA ACTAACTAAC 1080 CACCATAGTT ATCTAAATTA GTGACCCTAG CGACCATTGA TAATTTGATA CTGATCATTG 1140 ACTTCCACCA AATCTACTTT CTAAATGTGG ACTGACTCAT TATGAATTTG TGAGGAAAAT 1200 ACTTTCCTAA TGCTAGTGCT CTTCCCATTA TCTAAACTCC AAAATTTTGT AAAATTCTTT 1260 GAACCTTCCT TTAAACTACC ACAAATTTTC TTATCCTTTC CTATCTCACC ATTATAAATA 1320 GCCACGCACA TGCAAACCAA AGGTACACAC TAAACAAACT TCATTCTTCA AATTACTGAT 1380 TACTCGAAAA AAACACTTCA AACTTTGCCA AA ATG GTT CAT GAA AAG CAA GTG 1433 Met Val His Glu Lys Gln Val 1 5 ATA GAG GAA GTA TCC GGC TGG CTT AGA GTT TTC GAA GAC GGT TCA GTA 1481 Ile Glu Glu Val Ser Gly Trp Leu Arg Val Phe Glu Asp Gly Ser Val 10 15 20 GAC CGG ACT TGG ACC GGT CCA CCC GAA GTC AAA TTC ATG GCC GAG CCA 1529 Asp Arg Thr Trp Thr Gly Pro Pro Glu Val Lys Phe Met Ala Glu Pro 25 30 35 GTC CCA CCC CAT GAC TAC TTC ATC GAC GGC GTT GCC GTC AAA GAT GTA 1577 Val Pro Pro His Asp Tyr Phe Ile Asp Gly Val Ala Val Lys Asp Val 40 45 50 55 GTC GCC GAC GAA AAA TCC GGC AGC CGT CTC CGC ATC TAC TTA CCT GAA 1625 Val Ala Asp Glu Lys Ser Gly Ser Arg Leu Arg Ile Tyr Leu Pro Glu 60 65 70 CGA AAC GAC AAT TCC GCC AGC AAG CTT CCC GTC ATT CTT CAC TTC CAA 1673 Arg Asn Asp Asn Ser Ala Ser Lys Leu Pro Val Ile Leu His Phe Gln 75 80 85 GGC GGC GGC TTT TGT GTC AGC CAT GCT GAT TGG TTC ATG TAC TAC ACT 1721 Gly Gly Gly Phe Cys Val Ser His Ala Asp Trp Phe Met Tyr Tyr Thr 90 95 100 GTC TAC ACG CGC CTA GCG CGC GCG GCC AAA GCT ATC ATT GTC TCC GTC 1769 Val Tyr Thr Arg Leu Ala Arg Ala Ala Lys Ala Ile Ile Val Ser Val 105 110 115 TTC CTC CCC CTC GCG CCG GAG CAC CGC CTC CCA GCT GCC TGC GAT GCC 1817 Phe Leu Pro Leu Ala Pro Glu His Arg Leu Pro Ala Ala Cys Asp Ala 120 125 130 135 GGT TTC GCC GCT CTC CTC TGG CTC CGG GAC CTC TCC CGG CAG CAA GGA 1865 Gly Phe Ala Ala Leu Leu Trp Leu Arg Asp Leu Ser Arg Gln Gln Gly 140 145 150 CAC GAG CCC TGG CTC AAC GAT TAC GCA GAT TTC AAC CGA GTA TTC CTC 1913 His Glu Pro Trp Leu Asn Asp Tyr Ala Asp Phe Asn Arg Val Phe Leu 155 160 165 ATC GGA GAC AGC TCC GGC GGG AAC ATA GTC CAC CAA GTT GCC GTC AAA 1961 Ile Gly Asp Ser Ser Gly Gly Asn Ile Val His Gln Val Ala Val Lys 170 175 180 GCC GGC GAG GAA AAC TTA TCT CCA ATG CGA CTG GCC GGC GCA ATT CCG 2009 Ala Gly Glu Glu Asn Leu Ser Pro Met Arg Leu Ala Gly Ala Ile Pro 185 190 195 ATC CAT CCA GGT TTC GTG CGG TCC TAT CGG AGC AAA TCG GAG CTA GAA 2057 Ile His Pro Gly Phe Val Arg Ser Tyr Arg Ser Lys Ser Glu Leu Glu 200 205 210 215 CAA GAG CAA ACC CCG TTT TTA ACA TTA GAT ATG GTG GAT AAA TTT CTA 2105 Gln Glu Gln Thr Pro Phe Leu Thr Leu Asp Met Val Asp Lys Phe Leu 220 225 230 GGG TTA GCT TTA CCA GTA GGG AGC AAC AAG GAT CAT CAA ATA ACA TGT 2153 Gly Leu Ala Leu Pro Val Gly Ser Asn Lys Asp His Gln Ile Thr Cys 235 240 245 CCG ATG GGA GAG GCG GCG CCG GCA GTG GAG GAG CTT AAA TTA CCG CCT 2201 Pro Met Gly Glu Ala Ala Pro Ala Val Glu Glu Leu Lys Leu Pro Pro 250 255 260 TAT TTG TAC TGT GTG GCG GAG AAA GAT CTG ATA AAG GAC ACT GAA ATG 2249 Tyr Leu Tyr Cys Val Ala Glu Lys Asp Leu Ile Lys Asp Thr Glu Met 265 270 275 GAG TTT TAC GAA GCT ATG AAA AAG GGG GAA AAG GAT GTA GAG CTG TTT 2297 Glu Phe Tyr Glu Ala Met Lys Lys Gly Glu Lys Asp Val Glu Leu Phe 280 285 290 295 ATT AAC AAT GGA GTG GGA CAT AGC TTT TAT CTT AAC AAA ATT GCT GTT 2345 Ile Asn Asn Gly Val Gly His Ser Phe Tyr Leu Asn Lys Ile Ala Val 300 305 310 AGA ATG GAC CCT GTA ACT GGT TCT GAA ACT GAA AAA CTT TAT GAA GCC 2393 Arg Met Asp Pro Val Thr Gly Ser Glu Thr Glu Lys Leu Tyr Glu Ala 315 320 325 GTT GCA GAG TTC ATC AAC AAG CAT TA AAAGGAGAAA ATTTGTGGTT 2439 Val Ala Glu Phe Ile Asn Lys His 330 335 TTGCAGAATA TTTGTTTGTT GCATGCATGT TCAAGATTTT GATGTACCGT CTTGATTGTC 2499 ACGTTCTAAT GGTTTTGTAA TTATAATTAT GAGGAGTAAA TTTCTATTGT TGCGTAGAAA 2559 TGTTTTTTCT TTGGTAGTAA ATGTTTATTT GTAATACTTT AAAAAGTGGA CAAATTTCTT 2619 TTGAGATTCA TGAAATAATA TCTTTAAATT TCGAATGTCA ATAAGTCCAG AAATTGAAAT 2679 GTATCTGTAC CGTCAATGAA GTCTCCTTGA GGCTTTTTTT CACATGATAT CGTCTATACC 2739 ACCAAAAAGT TTGATAAGCT ATACAATATG AGATTCTCG 2778

【００９１】配列番号：２配列の長さ：335アミノ酸配列の型：アミノ酸トポロジー：直線配列の種類：タンパク質配列 Met Val His Glu Lys Gln Val Ile Glu Glu Val Ser Gly Trp Leu Arg 1 5 10 15 Val Phe Glu Asp Gly Ser Val Asp Arg Thr Trp Thr Gly Pro Pro Glu 20 25 30 Val Lys Phe Met Ala Glu Pro Val Pro Pro His Asp Tyr Phe Ile Asp 35 40 45 Gly Val Ala Val Lys Asp Val Val Ala Asp Glu Lys Ser Gly Ser Arg 50 55 60 Leu Arg Ile Tyr Leu Pro Glu Arg Asn Asp Asn Ser Ala Ser Lys Leu 65 70 75 80 Pro Val Ile Leu His Phe Gln Gly Gly Gly Phe Cys Val Ser His Ala 85 90 95 Asp Trp Phe Met Tyr Tyr Thr Val Tyr Thr Arg Leu Ala Arg Ala Ala 100 105 110 Lys Ala Ile Ile Val Ser Val Phe Leu Pro Leu Ala Pro Glu His Arg 115 120 125 Leu Pro Ala Ala Cys Asp Ala Gly Phe Ala Ala Leu Leu Trp Leu Arg 130 135 140 Asp Leu Ser Arg Gln Gln Gly His Glu Pro Trp Leu Asn Asp Tyr Ala 145 150 155 160 Asp Phe Asn Arg Val Phe Leu Ile Gly Asp Ser Ser Gly Gly Asn Ile 165 170 175 Val His Gln Val Ala Val Lys Ala Gly Glu Glu Asn Leu Ser Pro Met 180 185 190 Arg Leu Ala Gly Ala Ile Pro Ile His Pro Gly Phe Val Arg Ser Tyr 195 200 205 Arg Ser Lys Ser Glu Leu Glu Gln Glu Gln Thr Pro Phe Leu Thr Leu 210 215 220 Asp Met Val Asp Lys Phe Leu Gly Leu Ala Leu Pro Val Gly Ser Asn 225 230 235 240 Lys Asp His Gln Ile Thr Cys Pro Met Gly Glu Ala Ala Pro Ala Val 245 250 255 Glu Glu Leu Lys Leu Pro Pro Tyr Leu Tyr Cys Val Ala Glu Lys Asp 260 265 270 Leu Ile Lys Asp Thr Glu Met Glu Phe Tyr Glu Ala Met Lys Lys Gly 275 280 285 Glu Lys Asp Val Glu Leu Phe Ile Asn Asn Gly Val Gly His Ser Phe 290 295 300 Tyr Leu Asn Lys Ile Ala Val Arg Met Asp Pro Val Thr Gly Ser Glu 305 310 315 320 Thr Glu Lys Leu Tyr Glu Ala Val Ala Glu Phe Ile Asn Lys His 325 330 335

【００９２】配列番号：３配列の長さ：93塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：不明配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 配列 TTTGCCAAAA TGGTTCATGA AAAGCAAGTG ATAGAGGAAG TATCCGGCTG GCTTAGAGTT 60 TTCGGGGTAG GTCAGTCCCT TATGTTACGT CCT 93

【図面の簡単な説明】

【図１】図(Ａ)は、pＨＧ２１(またはpＨＧ２１Ａ)に
おけるキメラβ−グルクロニダーゼ遺伝子の制限地図を
示す。図(Ｂ)は、pＨＧ２１翻訳融合接合部分の配列(配
列番号２)を示す。

【図２】形質転換タバコプロトプラストにおけるhsr
２０３Ｊプロモーター活性に対するシュードモナス・ソ
ラナセアルムの相異なる分離株(hrp、Ｋ６０およびＧＭ
Ｉ１０００)による感染の効果を示すグラフである。

【図３】シュードモナス・ソラナセアルムの相異なる
分離株により浸潤されたトランスジェニックタバコ葉に
おけるＧＵＳ遺伝子のhsr２０３Ｊプロモーター活性化
の時間推移を示すグラフである。

【図４】図(Ａ)は、接種された第３葉並びに上部およ
び下部非接種葉におけるβ−グルクロニダーゼ活性の誘
導を示す。図(Ｂ)は、接種された第３葉の病変部および
その周囲におけるβ−グルクロニダーゼ活性の誘導を示
す。

【図５】図(Ａ)は、hrp遺伝子集団の相異なる転写単
位におけるhrp突然変異体の局在性を示す。図(Ｂ)は、h
rpＫ６０もしくはＧＭＩ１０００分離株または水、また
は図(Ａ)に示されているhrp突然変異体による接種１８
時間後の葉におけるＧＵＳ活性の測定結果を示すグラフ
である。

【図６】 pＨＧ２１の幾つかの欠失を有するプラスミ
ドpＨＧＤの構築を概略的に示す。

【図７】トランスジェニックのタバコ植物における、
pＨＧ２１(図５の式による)の５'プロモーター欠失によ
り得られた構築物によるＧＵＳ遺伝子の発現を示すグラ
フである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 5/10 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者イヴ・マルコフランス、エフ−31320カスタネ−トロザン、シュマン・ドゥ・ラ・クラボット２番 (72)発明者ドミニク・ポンティエフランス、エフ−31400トゥールーズ、シュマン・デ・クロタス74番 (72)発明者ドミニク・ロビーフランス、エフ−31400トゥールーズ、アブニュー・デュ・プティ・プランス９番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１に描かれたヌクレオチド配列
を含む領域もしくはその機能均等配列を含む組換えＤＮ
Ａ配列、または前記領域もしくは前記均等配列の一部分
を含む組換え配列。
【請求項２】配列番号１に描かれた配列のヌクレオチ
ド１４１３〜２４１７を含む領域もしくはその機能均等
配列を含む組換えＤＮＡ配列、または前記領域もしくは
前記均等配列の一部分を含む組換え配列。
【請求項３】配列番号１に描かれた配列のヌクレオチ
ド１〜１３４１を含む領域もしくはその機能均等配列を
含む組換えＤＮＡ配列、または前記領域もしくは前記均
等配列の一部分を含む組換え配列。
【請求項４】配列番号１に描かれた配列のヌクレオチ
ド１〜６５１を含む領域もしくはその機能均等配列を含
む組換えＤＮＡ配列、または前記領域もしくは前記均等
配列の一部分を含む組換え配列。
【請求項５】配列番号１に描かれた配列のヌクレオチ
ド６５２〜１３４１を含む領域もしくはその機能均等配
列を含む組換えＤＮＡ配列、または前記領域もしくは前
記均等配列の一部分を含む組換え配列。
【請求項６】配列番号１に描かれた配列のヌクレオチ
ド１１９５〜１３４１を含む領域もしくはその機能均等
配列を含む組換えＤＮＡ配列、または前記領域もしくは
前記均等配列の一部分を含む組換え配列。
【請求項７】配列番号１に描かれた配列のヌクレオチ
ド１１９５〜１２６８を含む領域もしくはその機能均等
配列を含む組換えＤＮＡ配列、または前記領域もしくは
前記均等配列の一部分を含む組換え配列。
【請求項８】請求項３〜７のいずれか１項に記載され
た、少なくとも１つの領域またはその一部分もしくは均
等配列を含み、前記領域または一部分または均等配列
が、異種遺伝子のタンパク暗号化配列の５'側に位置
し、前記暗号化配列または配列番号１に描かれた配列の
ヌクレオチド１４１３〜２４１７を含む配列もしくはそ
の機能均等配列に機能し得るように結合された、組換え
ＤＮＡ配列。
【請求項９】翻訳促進配列が前記領域またはその一部
分もしくは均等配列およびそれに対してＤＮＡ配列３'
のタンパク暗号化領域間に存在する、請求項１〜８のい
ずれか１項記載の組換えＤＮＡ配列。
【請求項１０】異種遺伝子が選択可能またはスクリー
ニング可能なマーカー遺伝子またはその産物が昆虫、除
草剤、真菌、細菌およびウイルスのうちの少なくとも１
つに耐性または不応答性を付与し得る遺伝子である、請
求項８または９のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ配
列。
【請求項１１】１つまたはそれ以上のヌクレオチド
が、その機能またはアミノ酸暗号化能力に実質的に影響
を及ぼすことなく組換え配列に付加されたか、そこから
除去されたか、または置換された、請求項１〜１０のい
ずれか１項記載の組換えＤＮＡ配列。
【請求項１２】組換えＤＮＡが挿入される生物体に好
まれるコドンを用いるという修飾が加えられた組換えＤ
ＮＡ配列であって、前記生物体における前記修飾ＤＮＡ
の発現により、組換えＤＮＡのタンパク暗号化成分が内
在性である生物体における非修飾組換えＤＮＡの発現に
より得られるものと実質的に類似したタンパクが得られ
る、請求項１〜１１のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ
配列。
【請求項１３】ストリンジェントな条件下、請求項１
〜１２のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ配列とハイブ
リダイズする配列に相補的であるＤＮＡ配列。
【請求項１４】請求項１〜１２のいずれか１項記載の
組換えＤＮＡ配列または請求項１３記載のＤＮＡ配列を
含むＤＮＡベクター。
【請求項１５】請求項１〜１３のいずれか１項記載の
ＤＮＡの発現により得られるタンパク。
【請求項１６】配列番号２に描かれたアミノ酸配列ま
たは前記配列の機能均等配列を有するタンパク。
【請求項１７】請求項１〜１１のいずれか１項記載の
組換えＤＮＡ、または請求項１２記載のＤＮＡ配列によ
り形質転換された微生物または植物細胞またはプロトプ
ラスト。
【請求項１８】ゲノムが請求項１４記載のベクターを
含む植物であって、組換えＤＮＡが発現される植物。
【請求項１９】トマト、コショウ、マンゴー、モモ、
リンゴ、西洋ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、キャノー
ラ、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、小麦、大麦、米、ト
ウモロコシ、綿、ジャガイモ、ニンジン、レタス、キャ
ベツおよびタマネギから成る群から選択される請求項１
８記載の植物。
【請求項２０】請求項１８または１９のいずれか１項
記載の植物の子孫または種子、並びに前記子孫の種子お
よび子孫。