SK20694A3 - Recombinate sequence of dna - Google Patents

Description

Gén súvisiaci s hypersenzitivitou

Oblasť techniky

Vynález sa týka rodiny génov h s r (súvisiacich a ich jednotlivých komponentov vrátane regulačných produktov;

z i t i v i t o u ) rov a ich genómových promótorovej oblasti, a ich modifikácií;

ných rastlín, ktoré obsahujú s hypersenich promótooblastí, ich kódujúcich oblastí a ich ich modifikácií; použitia tohto génu, regulačnej oblasti a kódujúcej oblasti a DNA-konštruktov, vektorov a transformovatento gén alebo jeho časť.

Doterajší stav techniky

Hypersenzitívna reakcia (HR) vyšších rastlín je miestne indukovateľná odpoveď súvisiaca s rezistenciou voči chorobe spôsobovanej patogénom. Táto odpoveď je charakterizovaná rýchlou a lokalizovanou nekrózou tkanív napadnutých nekompatibilným (aruvilentným alebo nehostíteľským) patogénom, ktorá zabraňuje ďalšiemu šíreniu mikroorganizmu, ktorý napadol rastlinu. Niektoré obranné gény, ktorých produkty sa môžu zúčastniť odpovede rastliny, sa rozsiahle skúmali. Patria medzi ne enzýmy fenylpropanoidovej dráhy, ktorá sa zúčastňuje syntézy a n t i mikrobiálnych fytoalexínov, enzýmy s hydrolytickou aktivitou, toxické zlúčeniny a proteíny bunkovej steny. V infikovaných rastlinách sú tieto gény indukované v okolí n e k r ó z y potom, čo sa táto nekróza vytvorí, t. j. v neskorých fázach hypersenzitívnej reakcie. Okrem toho je väčšina z nich tiež silne exprimovaná počas kompatibilnej interakcie, ktorá vedie ku vzniku choroby rastliny, a niektoré z nich počas normálneho vývoja rastliny. Nedostatok špecificity týchto obranných génov, rovnako ako ich aktivácia v neskorých fázach hypersenzitívnej reakcie svedčí o tom, že sami nemôžu vysvetľovať vytvorenie kom p 1 e x n e j indukováte ľnej odpovede, ktorou je hypersenzitívna reakcia, ale skôr môžu túto reakciu sprevádzať. V súčasnosti nie sú známe molekulárne mechanizmy, ktoré vedú od rozpoznania kontaktu rastlina - patogén ku rozvinutiu hypersenzitívnej reakcie. Podľa hypotézy gén pre gén zahŕňa počiatočný krok rozpoznania kontaktu rastlina - patogén, ktorý vedie k rezistencii, predpokladanú interakciu medzi produktami génu rezistencie rastliny a zodpovedajúceho avi r u 1entného génu patogénu. Genetické výskumy skutočne svedčia o tom, že výsledok mnohých interakcií rastlina - patogén je určovaný jedinými dominantnými génmi v oboch partneroch. Zistila sa tiež súvislosť niektorých rýchlych fyziologických zmien, ako je unikanie elektrolytu, zmeny v rýchlosti respirácie a v súčasnej dobe oxidatívne zasietenie proteínov bunkovej steny, s hypersenzitívnau reakciou. V žiadnom prípade nebol však nepopísaný rastlinný gén, ktorého a k. t i v á c i a je špecifická alebo aspoň prednostná počas rezistentnej reakcie, a ktorý predchádza vzniku hypersenzitívnej reakc i e.

Podstata vynálezu

Je z náme , i e vna

Pseudomonas so lancearum spôsobuje rastlín z etá 1 rodu ne vädnutie

So 1 anaceae.

rôznych

Pri tejto odpovede druhov bak tér rastlín i sa z i , vrátane s t i zhluk génou hypersenzitívnej ako schopnosť vyvolať hypersenzitívnu títeľských rastlín, tak i spôsobiť ských rastlín.

Mutanti Pseudomonas reakc chorobu o , že riadi nehostovaní v géne zitívnu reakci najmä strácajú rastiinách tabaku že gén

E r w i vilo, togénu, senzitívnej dôležitú rol hr pN n i a zo zhluku génov kóduje patogenity v prípade prípade hostiteľsolanacerum, ktorí sú z m uschopnosť vyvolať . V súčasnej dobe hr p i ného bakter proteínový elic Toto zistenie hypersensa stanoá 1 neho paitor hyperpotvrdzuje amy1ovora, reakcie, nazývaný harpí u génov hrp pri vyvolaní hypersenzitívnej reakcie.

Po infiltrácii listov tabaku nekompatibilným izolátom, ktorý spôsobuje hypersenzitívnu reakciu, sa charakterizovalo šesť od 1 i šných génových rodín, ktoré sa aktivujú v skorej fáze interakcie, skôr, ako sa zistila akákoľvek nekróza listu, ľíeto gény, ktoré neboli indukované po infiltrácii hr p-i zo 1átom, sa líšia v úrovniach akumulácie ich transkr ipčných produktov počas nekompatibilnej interakcie v porovnaní s kompatibilnou interakciou: gény str (súvisiace so senzitivitou) sú exprimované v podobnom rozsahu v prípade oboch typov interakcií, zatiaľ čo gény hsr sa aktivujú prednostne počas hypersenzitívnej reakcie.

Vy ná1 e

Z i i n y génov (hj’Jy

0 3 j) ktorého č .__1j Predpokladaný proteín ktorý je produktom génu podstatnú homológiu so

i. promótorova oblasť štruktúrneho a z a n ú na sa ktorú reprezentuje gén, tu ďalej o.z na čujovaný (hsr v_SE„Q-I-D SEQ ID vôbec ty , v génu

2) nejakú, ktorých h s r 2 0 3 J oper ab využívajúci rastlinách, svedč s í toch ch dočasnú je sa sek ve n c i_a _ j e znázornená (znázornený v , vykazuje ma známymi p r o t e í nami. Tesexpres i u o tom, s rozvojom hypersenzitivity: počas hypersenzitívnej reakcie objaví obmedzená reportérový gén p r génu génu promóter sa niekoľko a v transgen h s r 2 0 3 J úzko c k ý ch nekróza, na bunky z hľadiska špecificky ak predtým jeho akt bakteriálnym hodín ako nokulované nekompatibi e je

Iným i zo 1 átom.

V y n á 1 oblasť, ktorú č. 1 alebo popisuje tvorí nukleotidová sekvencia znázornená v SEQ ID rekombinantú sekvenc iu DNA obsahujúcu ktorú tvorí jej funkčný ekvivalent časti hore uvedenej , a rekombinatnú sekvenciu, alebo hore uvedeného oblasti ekvivalentu ľermín funkčný ekvivalent, ktorý sa používa v texte, pokiaľ sa týka oblasti sekvenciie DNA kódujúcej proteín, označuje túto oblasť, v ktorej jeden alebo viac kodónov sa nahradilo ich synonymami, t.j. kodónmi, ktoré špecifikujú zodpovedajúcu aminokyselinu alebo zodpovedajúci signál ukončujúci transkripciu.

funkčný regulujúcich transkripci nuk1eot

Pokiaľ sa používaný termín 1 a s t í sekvencie lasť, v ktorej jeden odlišnými nukleotidami viac nukleotidov sa pr že si takto vytvorené gulačnú akt alebo je j koncu od vyššie časťou , alebo viac , alebo/a i da1 o alebo oblasť , od s t r á n ekvivalenty vykazujú ktorá uvedenej u, označuje i dov bolo v ktorej i 1 o s tou ekvivalent týka o b túto obnahradených jeden alebo podm i enkou , zachovávajú transkripčne repodstatnú homológiu s oblasťou, sa nachádza v polohe smerom oblasti kódujúcej proteín.

Termín podstatne homológny, ktorý sa tu používa, označuje sekvencíu DNA, ktorá pri bežných hybridizačných podmienkach hybridizuje s referenčnou sekvenciou. Tieto hybridizačné podmienky výhodne označujú hybridizáciu, pri ktorej je hodnota polovičnej teploty denaturácie (T M) medzi 35 a 45 ’C. Najvýhodnejšie termín podstatne homológny označuje sekvencíu DNA, ktorá hybridizuje s referenčnou sekvenciou pri prísnych podmienkach (ako sa definujú vyššie).

Termín r egu lačná oblasť ktorý sa tu po u i va , označuje nukleotidovú oblasť v sek vene ktorá sa nachádza i znázornenej v polohe smerom k 5 ' -k o n c u ako od

SEQ ID ob1ast i sekv e n c i e kódujúcej proteín.

Termín regulačná oblasť tak zahŕňa promótor génu hsr203J a funkčné komponenty promótor a, ktoré ovplyvňujú transkripciu.

Me dz také funkčné komponenty patrí deletovaný promótor a z o s labovače tr ans k r i pc i e.

Deletovaný promótor je v kontexte vynálezu ľubovolný promótor odvodený od hsr203J, ktorý je v porovnaní s natívnym promótorom deletovaný, a ktorý si stále zachováva promótorovú aktivitu. Táto promótorová aktivita môže byť v porovnaní s na tívnym promótorom zosilnená alebo v podstate rovnaká. Odborní5 kovi je zrejmý spôsob, akým sa môže pri deletovaných promótoroch testovať zachovanie ich promótorovej aktivity.

De1etované promótory podľa vynálezu sú indukovateľné, okrem iného, rast linnými patogénami, a môžu sa použiť v konštruktoch obsahujú cich štruktúrne gény poskytujúce zlepšenú rezistenciu voči chorobám.

Pokiaľ sa používa termín funkčný ekvivalent v spojení s proteínom, ktorého sekvencia je určovaná aspoň časťou sekvencie DNA znázornenej v SEQ ID č. 1, označuje proteín, ktorý má podobnú funkciu a podobnú alebo zlepšenú špecifickú aktivitu , a podobnú am inokyse1 i novú sekvenciu.

Vynález tiež popisuje čisté proteíny, ktoré majú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá sa aspoň na 60 % podobá sekvencii proteínu znázorneného v SEQ ID

č. 2 alebo jeho časti (viď nižšie).

Stupeň podobnosti činí výhodne aspoň 60 %, výhodnejšie činí stupeň podobnosti aspoň 70 % a ešte výhodnejšie činí stupeň podobnosti aspoň 80 %.

V kontexte vynálezu sú dve sekvencie aminokyselín, ktoré sa aspoň na 60 % definujú tak, že majú pri optimálnom porovnaní aspoň 70 % identických alebo podobných am inokyse1 i nových zvyškov v rovnakej polohe, s tým, že sa pripúšťajú až 4 delécie alebo až 10 adícií.

Pre účely vynálezu platí, že:

alanín, serín a treonín sa podobajú, kyselina glutámová a kyselina asparágová sa podobajú, asparagín a r g i n í n a i z o 1 e u c í n , fenylalanín, a glutamín sa podobajú lyží n sa podobajú, leucín, metionín a tyrozín a tryptofán val í n sa podobajú, a sa podobajú.

Termín časť , ak sa používa v proteínu, označuje peptid obsiahnutý v SEQ ID č. 2 , ktorý má aspoň 5 súvislosti so sekvenciou v sekvencii znázornenej aminokyselín. Výhodnejšie má peptid aspoň 20 aminokyselín a ešte výhodnejšie má peptid as poň 40 aminokyselín.

Termín časť, ak sa používa v súvislosti s nukleotidovou sekvenciou, označuje nukleotidovú sekvenciu obsiahnutú v sekvencii znázornenej v SEQ ID č. 1, ktorá má aspoň 15 nukleotídov. Výhodnejšie má táto časť aspoň 25 nukleotidov a ešte výhodnejšie má táto časť aspoň 40 nukleotidov.

Vynález júcu oblasť, zahŕňa tiež ktorú tvoria ako SEQ ID znázornenej a rekombinantnú sekvenciu tohto génu novy rekombinantnú sekvenciiu nuk1eot i dy

č. 1 alebo obsahujúcu ekvivalentu. Nukleotídy s r 2 0 3 j kódujúcej prote

1413 a ktorá

13 jej až 2417 funkčný

17 je produkt hrá funkčnú rol rasti poskytovaní rezistencie voc

DNA obsahuzo sekvencie ekvivalent .

tejto ob 1 ast zodpovedajú užitočná nách r eg i alebo oblasti gélebo chorobám. Proteí sek venciu, alebo jej časť teľným promótorom, ako génu hsr203J možno fúz o v ať n d ukováWUN alebo PR sú promótor y tak, že po regulujúce expres u proteIným patogénom sa indukuje štruktúrny gén hsr203J hypersenzitívnej odpovede pomocou proteínu

Následná i nfi kovaných rastlinných bunkách zábráni ďalšiemu šírení patogénu.

Vynález oblasť, zahŕňa tiež ktorú tvor júcu znázornenej a rekombinantnú sekvenci ako SEQ 10 rekombinantnú sek venci ia nukleotídy

č. 1 alebo až 1341 jej časť u obsahujúcu tohto ekvivalentu. Nukleotídy 1 až nekódujúcej proteín, ktorá sa nachádza k 5'-koncu od hore uvedenej oblasti kódujúcej

134 1

DNA obsahuzo sekvencie funkčný tejto ob1as zodpovedajú polohe ekvivalent, i alebo oblasti smerom proteín

Oblasť vyššie uvedenej sekvenciie DNA, ktorá obsahuje nukleotídy 1 až 1341, obsahuje transkripčne regulačnú oblasť génu hsr203J, vrátane promótora (väzobného miesta pre RNA-polymerázu) a z oslabovačov a zosilovačov transkripcie.

Zoslabovačie a	zosilňujúce elementy majú ten význam, že
umožňujú modulovať	úroveň expresie štruktúrneho génu pod ich

kontrolou.

Vynález ďalej zahŕňa rekombinantnú sekvenci

DNA, ktorá obsahuje oblasť tvorenú nuk1eot i dam i až 651 zo sekvencie znázornenej ako

SEQ ID

1, alebo jej funkčný ek v i va a rekomb i nantnú sekvenci obsahujúcu časť tejto ob 1 ast alebo tohto ekvivalentu.

Oblasť , ktorú tvor nuk1eot i dy

L·

1, obsahuje zoslabovač transkripcie.

Vynález ďalej zahŕňa rekombinantnú sekvenci

DNA ktorá obsahuje oblasť tvorenú nukleotidami až 1341 zo sekvencie znázornenej ako

SEQ ID

č. 1 alebo jej funkčný ekvivalent, a rekombinantnú sekvenci u obsahujúcu tejto oblasť alebo tohto ekvivalentu. Oblasť, ktorú tvoria nuk1eot i dy

652 až

1341, obsahuje zosilňovač transkri pc i e promótor é miesto RNA-polymerázy) génu hsr203J

Vynález ďalej popisuje použitie promótorovej sekvencie hsr203J ako afinitného substrátu pre identifikáciu a následnú p u r i f i k á c i u proteínov, ktoré sa viažu na promótor hsr203J ( h s r 2 0 3 J promoter binding proteins, hsr-PBP's) a p r o t e í n y konštitutívne prítomné a môžu sa viazať na promótorové spojené s týmito hsr-PBP's. Také proteíny hsr-PBP's boli čiastočne charakterizované, sú pravdepodobne prítomné konštitutívne a môžu sa viazať na promótorové sekvencie hsr203J pri nekompatibilnej reakcii hostiteľskej rastliny, ku ktorej dochádza napríklad, ak sa tabak Nicotiana tabacum L. inokuluje špecifickým kmeňom Pseudomonas so 1anacearum.

Vynález ďalej zahŕňa rekombinatnú sekvenci obsahuje oblasť tvorenú nuk1eot i dam i

195 až 1341

DNA, ktorá zo sekvencie znázornenej ako

SEQ ID

č. 1 alebo jej funkčný ekvivalent, a rekombinantnú sekvenci u obsahujúcu tohto ekvivalentu. Oblasť, časť tejto oblasti alebo ktorú tvoria nukleotidy 1195 až

1341, obsahuje element, ktorým rastlina zodpovedá na prítomnosť baktérií (bacterial response element), schopného viazať sa na špecifické proteíny, ktorú vytvárajú patogény počas infekcie tkaniva, a ktoré podmieňujú rozvinutie hypersenzitívnej odpovede (viď vyššie).

ďalej zahŕňa rekombinatnú obsahuje oblasť znázornenej ako a rekombinantnú

Vynález tvorenú nukleotídami

SEQ ID

č. 1 alebo sekvenciu

195 až 1268

DNA , ktorá zo sekvencie funkčný tejto ekvivalent, oblasti alebo jej časť u obsahujúcu oblasť presnejš ktorým rastlina zodpovedá na prítomnosť sek vene i tohto ekvivalentu. Táto vyme b aktér dzu je e

1eme nt,

Vynález ďalej zahŕňa rekombinatnú sekvenciu DNA, ako sa popisuje vyššie, v ktorej je hore uvedená oblasť, jej časť alebo jej ekvivalent, umiestnená smerom k 5'-koncu od, a je operabilne naviazaná ku sekvencii kódujúcej p r o t e í n heterologného génu alebo sekvencii obsahujúcej nukleotidy 1413 až 2417 zo sekvencie znázornenej ako SEQ ID č.

či jej funkčnému ekvivalentu. Výhodné je predovšetkým, ak je prítomná sekvencia zosilňujúca transláciu v polohe smerom k ' -kone i medzi touto oblasťou, jej časťou alebo ekvivalentom a oblasťou kódujúcou proteín sekvencie DNA.

Heterológnym gén, vrátane markéra, dávanie, génom môže byť ktorý sa génu, ktorého produkt ciu alebo toleranciu voči vhodný výber a hrňujúcej hmyz, herbidídy ho génu pre použitie pri proti požer ku.

Promótorové alebo/a štruktúrny lebo v y h ľ aľ u b o v o 1 n ý používa pre p o s k y t o v a položiek je aspoň huby predpovedi schopný jednej z baktérie výskytu t rez ny zaregulačné oblasti skúpi markérovérusy , choroby a génov génu hsr 203J sa môžu fúzovať so štruktúrnym génom, ktorý kóduje nedi fuzi b i 1 ný cytotoxický génový produkt, ako je r i bo n u k 1 eáza , proteáza, lipáza alebo glukanáza. Indukcia e x p r e s i e takých štruktúrnych génov spôsobuje rýchlu a lokalizovanú odpoveď na infekciu spôsobenú patogénmi, a môže byť užitočná pri poskytovaní rezistencie alebo zlepšenej tolerancie rastliny voči patogénom.

Okrem toho sa môžu regulačné oblasti génu hsr203J použiť pri tvorbe detektorových rastlín, ktoré umožňujú včasnú detekciu výskytu choroby. Promótor hsr203J, alebo/a jeho regulačné oblasti, sa môžu fúzovať nukleotidovou sekvenciou spôsobujúcou vizuálnu zmenu fenotypu hostiteľskej rastliny pri aktivácii promótora infekciou. Medzi takéto nukleotidové sekvencie patrí v anti-senze orientácii gén kódujúci malú p o d j e d notku r ibu1óza-B-fosfo-karboxy 1ázy (SS-RUBISCO), ktorá spôsobuje lokalizované odfarbenie zelených tkanív. Tieto sekvencie môžu tiež kódovať gén, ktorý kóduje kľúčový enzým v biosyntéze pigmentu, ako je chalkón-syntáza.

Vynález tiež zahŕňa rekombinantnú

DNA podľa vynálezu modifikovanú tak, že sú použité k odo n y, ktoré preferuje organizmus, do ktorého sa má rekombinantná

DNA inzertovať, takže sa expres iou takto modifikovanej

DNA v hore uvedenom organizme získa v podstate podobný proteín ako expresiou nemodifikovanej rekombinantnej DNA v organizme, v ktorom sú komponenty rekombinantnej DNA, ktoré kódujú proteín, endogénne.

Vynález ďalej zahŕňa sekvenciu DNA, ktorá je komplementárna ku sekvencii, ktorá pri prísnych podmienkach hybridizuje s ľ u bovo 1 no u z vyššie popísaných rekombinantných sekvencii

Termín prísne hybridizačné podmienky označuje podmienky, keď sa hybridizácia uskutočňuje pri teplote medzi 50 a 60 '0 v 2X citrátovom pufri s chloridom sodným (SCC) obsahujúcom 0,1 % dodecylsulfátu sodného (S D S) s následným niekoľkonásobným premytím pri rovnakej teplote, ale v pufri so zníženou koncentráciou SCC neovplyvňujúcou hybridizáciu, ktorá prebehla. Takou zníženou koncentráciou pufru je (a) 1 x SCC, 0,1 %

SDS, alebo (b) 0,5 x SCC, 0,1 % SDS, respektíve (c) 0,1 x SCC, 0,1 % SDS.

Vynález ďalej zahŕňa DNA-vektor obsahujúci rekombinantnú sekvenciu DNA podľa vynálezu, alebo sekvenciu DNA, ktorá je komplementárna ku sekvencii, ktorá s ňou pri prísnych podmienkach hybr i d i zuje.

Použitie vektora podľa vynálezu je výhodné pre transformáciu eukaryotického hostiteľa, s výhodou rastlinného pôvodu. Do úvahy treba vziať, že týmto vektorom sa môžu transformovať vhodné mikroorganizmy, a také mikroorganizmy tvoria ďalšie uskutočnenie vynálezu.

Termín rastlina sa tu používa v širokom zmysle slova, a označuje diferencované rastliny, rovnako ako nediferencovaný rastlinný materiál, ako sú protoplasty, rastlinné bunky, semená, k lícne rastliny a t ď. , z ktorého sa pri vhodných podmienkach môžu vyvinúť maturované rastliny, a ďalej ich potomstvo a ich časti, ako sú rezky a plody takých rastlín.

samoz r ejme rasti i ne.

Výhodné vektory sa vybranej hostiteľskej môže zaviesť do protoplastu plastom vo vhodnom médiu a spôsobujú, že protoplast je použiť vektor vo forme mefaciens, ktorý infikuje Jednoklične rastliny sa jektáže, e 1ekt roporáci e j e k t i 1 o v (micro-projecti t i ckej techn i ky . tory a postupy v bo protoplasty a transformované bom.

odlišujú v závislosti na

Pri dvojklíčnych sa vektor pomocou kontaktu vektora s protopri vhodných podmienkach, ktoré schopný prijať DNA; môže sa tiež ľi-plazmidu Agrobacterium t ubunky alebo protoplasty.

transformujú pomocou mikroinpomocou vstreľovania mikropropoužití takzvanej balíšvhodné transformačné v e k Transformované bunky a 1 e vhodnom kultivačnom médiu, o sebe známym spôsostabilne začlení do g e der i vátu rastlinné výhodne alebo e gun) pri V každom prípade sú odbore dobre známe, sa kultivujú vo rastliny sa regenerujú

I n t r od u k ovan ý jadrový materiál sa

1 nómu regenerovaných transformovaných rastlín, ktoré v súlade s tým exprimujú požadované gény.

Príklady geneticky modifikovaných rastlín podľa vynález u zahŕňajú: ovocné plodiny, vrátane paradajky, piepora, mangovníka, broskyne, jablone, hrušky, jahody, banánovníka a dyne, poľné plodiny ako je repka a repica typu canola, slnečnica, tabak, cukrová repa, drobnozrnné obilniny ako je pšenica, jačmeň a ryža, kukurica a bavlník, a zeleniny ako je zemiak, mrkva, šalát, Brassica o 1 e r a c e a , ako je kapusta, a cibuľa. Výhodné rastliny sú predovšetkým cukrová repa a kukurica.

Vynález ďalej zahŕňa a semená a potomstvo tohto potomstvo a semená takých rastlín, potomstva.

Vynález ďalej zahŕňa proteín, rekombinantnej DNA podľa vynálezu, í n, ktorý má sekvenciu aminokyselín alebo jeho časť alebo funkčný ekvivalent hore uvedenej sekvencie alebo časti.

ktorý sa získal e x p r e s i o u a najmä e x pr i m o v a n ý pr o tesná z o r n e n ú v SEQ I D č. 2,

Vynález ďalej ilustrujú nasledovné príklady, a pripojené obrázky a sekvencie.

Poois obrázkov /Obrázok 1,znázorňuje chimerický konštrukt, ktorý sa používa pri testoch e x p r e s i e génu v protoplastoch tabaku a pri transformácii rastlín tabaku pomocou Agrobacterium t u m e f a c i e n s . /obr á z o k (aT] zobrazuje reštrikčnú mapu chimerického génu beta-g 1 ukuronidázy v pHG21 (alebo HG21A). Tento gén sa tvorí translačnou fúziou medzí 5' lemovacou sekvenciou s veľkosťou 1,4 kb z génu hsr203J a kódujúcou oblasťou génu uidA naviazanou na po 1yadeny1ačný signál génu nopa 1 ín-syntázy (nos T). Symbol p označuje promótor génu hsr203J, symbol g označuje gén

2 beta-glukuronidázy. 'Obrázok (B)!znázorňuje sekvenciu (SEQ ID č. 2).miesta spojenia translačnej fúzie pHG21. Sekvencia génu jh s r 2 0 3 J j je zapísaná tučným písmom a sekvencia uidA je zapísaná obyčajným písmom. Orientácia je od 5'-konca ku 3'-koncu, šípka v obrázku označuje polohu fúzie medzi sekvenciami.

znázorňuje účinok

GMI 1000) Pseudomonas 203J v transformovaných k protoplastom pridávala respektíve infekcie rôznymi izolátmi solanacearum na aktivitu protoplastoch tabaku. Ako voda. Plazmidy pBI201 pozitívne kontrolné plazmiObrázok (hrp, K 60 a promótor a hsr kontrola sa a p BI2 21 sú negatívne, d y ; pHG21 predstavuje fúziu vitý G U S sa uskutočnilo 24 predstavujú priemer z troch

génov	hsr	203J-uidA.	Meranie	a k t i -
hodín	po	i n k u b á c i i .	Uvedené	údaje
odde1ených	pokusov.	Symbol A	ozná-

čuje aktivitu

GUS v pmol / min / mg proteinu.

Obrázok	3 znázorňuje časový priebeh a k t i v á c i e promótora
hsr2O3J génu	GUS v listoch transgenického tabaku infiltrova-
n.ých rôznymi	izolátmi (hrp, K 60 a GMI 1000) Pseudomonas sóla-

nacearum. Aktivita GUS sa merala v extraktoch zo štyroch listov z dvoch rastlín transformovaných pHG21-14A. Symbol A označuje relatívnu aktivitu GUS a symbol t čas po inokulácii v hodinách.

Obrázok 4 zná zor ňu je kvantitatívnu analýzu akti vitý

GUS v transgenických rastlinách tabaku lokál ne infikovaných b a k t é r i am i .

Obrázok (A) zobrazuje aktivity beta-g 1 úkor on idázy v inokul a nižších neinokulovaných li treťom a vo vyšších stoch .

Obrázok (B) znázorňuje i ndukcíu aktivity beta-glukuronidázy ínokulovanom treťom liste. Skúmali okolí 1 é z i e na sa nasledovné vzorky tkanív: lézía (v obrázku označené symbolom 1), ktorá označuje nekrotické tkanivo vznikuté ako dôsledok poranenia alebo/a bakteriálnej infekcie, 0 - 3 mm označuje očividne zdravé tkanivo vo vzdialenosti až 3 mm od lézie, a 3 - 6 mm očividne zdravé tkanivo obklopujúce léziu vo vzdialenosti 3 až 6 m.

3

Inokulácia sa uskutočňovala na rastlinách transformovaných pHG21-14A. Malé perforácie listov sa prekryli kvapôčkou bakteriálnej suspenzie (3 zul, koncentrácie 10^e c.f.u. (živých bakteriálnych buniek) / ml) alebo vody, ako sa uvádza v obrázku.

Vzorky tkanív sa odobrali 18 načuje aktivitu GUS v pmol / mená inokulovaný list, symbol listy.

hodín po min /mg vyššie inokulácii. Symbol A ozproteínu, symbol 1 i sty a symbo1 n z nai žš i e

Obrázok 5 motora hsr203J hrp-mutantov na aktiváci rastlinách tabaku vaných pHG21 hrp-mutácii v hrp. Obrázok v listoch 18 hodín znázorňue vplyv v transgen i ckých (14 A) ) . Obrázok (A) znázorňuje odlišných transkripčných jednotkách (B) pr o(transformolokalizáciu

1000 či vodou, a zhluku génov aktivity GUS a 1ebo GMI zobrazuje výsledky mera n po inokulácii izolátmi hrp lebo hrp-mutantmi uvedenými

Inokulácia sa uskutočnila ako sa popisuje v pop Symbol s znamená zhluk hrp, symbol A predstavuje t i v i tu GUS.

obrázku (A).

obrázku 4.

latívnu ak Obrázok 6 schématicky znázorňuje konštrukciu plazmidov pHGD, ktoré majú deletované niektoré časti z pH G21. Symbol p označuje promótor génu hsr203J.

Obrázok 7 znázorňuje e x p r e s i u génu GUS v transgenických rastlinách tabaku transformovaných pomocou konštruktov, ktoré sa získali deletovaním promótora v pHG21 od 5'-konca (podľa schémy uvedenej na obrázku 5). Rastliny boli transformované 5 /ug DNA, a hodnota 100 udáva aktivitu GUS, ktorá sa dosiahla pri transformácii pomocou konštruktu p H G 21. Obrázok znázorňuje zvýšenie aktivity génu GUS (po 18 hodinách), ako dôsledku infiltrácie transformovaných rastlín bakteriálnymi kmeňmi Delta 3, K 6 0 a GMI 1000. Kontrolné rastliny boli infiltrované .vodou. Symbol P znamená promótor (bp) a symbol A predstavuje relatívnu aktivitu GUS (v % v porovanani s promótorom plnej dĺžky pri infiltrácii kmeňa GMI 1000).

Popis s e k v e n c i í

Sekvencia SEQ ID č. 1 zobrazuje nukleotidovú sekvenciu génu hsr203J, vrátane oblasti kódujúcej proteín a ich promótorových elementov a elementov regulácie transkripcie, ktorý bol izolovaný z tabaku. Oblasť génu kódujúca proteín v sekvencii, ktorú tvoria nukleotidy 1413 lačné signály sú prítomné v lasti génu kódujúcej proteín až 2417. Predpokladané polyadeny polohe smerom ku 3'-koncu od ob a sekvencia zodpovedajúca za hy persenzitívnu reakciu sa nachádza v 5'-nekódujúcej oblasti génu veľkosti 1,4 kg. Sekvencia v podstate obsahuje:

vedúcu sekvenciu m R N A veľkosti 72 bp, ktorá je umiestnená v nukleotidovej polohe 1341 až 1412 vráb ') tane , konvenčné sekvencie CAAT a TATA, ktoré sú umiestnené v nukleotidovej polohe 1282 až 1286, respektíve

1313 až 1316,

c) kodón miesta začiatku translácie umiestnený v n u k 1 e otídovej polohe 1413 až 1415,

d) sekvenciu deletovaného promótora umiestnenú v n u kleotídovej polohe 1 až 1341 vrátane, ktorá je v podstate zodpovedná za promótorovú aktivitu,

e) sekvenciu umiestnenú v nuk1eoti deve j polohe 1195 až 1268, ktorá má zosilňujúci účinok na promótorovú aktivitu,

f) sekvenciu umiestnenú v nukleotidovej polohe 1 až 651, ktorá má zoslabujúci účinok na promótorovú aktivitu.

Sekvencia SEQ ID č. 2 znázorňuje translačný produkt štruktúrneho génu hsr203J, ktorý je kódovaný nukleotidami 1413 až 2417 v sekvencii SEQ ID č. 1.

5

Sekvencía SEQ ID č. 3 zobrazuje oblasť linkera chimerického génu, ktorý obsahuje 5'-lemovaciu oblasť štruktúrneho génu hsr203J a kódujúcu oblasť reportérového génu uidA. Počiatočný kodón štruktúrneho génu hsr203J je umiestnený v polohe 10 až 12 v sekvencii, a nukleotidy 13 až 64 kódujú N-koncovú sekvencíu produktu génu hsr2O3J.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Bakteriálne kmene a rastlinný materiál

Zdroj používaných kmeňov Pseudomonas solanacearum sa

uvádza v tabuľke	1 . ľ a b u ľ k a 1
Používané	kmene divokého typu a mutantné kmene.
Pseudomonas	solanacearum, a ich schopnosť indukovať symptómy na tabak u

Kmene Zdroj alebo odkaz Izolované z Odpoveď tabaku

Divoký typ

GMI 1000 Boucher a kol. (1) paradajky HR

K60

Lozano a kol. (17) paradajky choroba

6 pokračovanie tabuľky 1

Mutanti odvodení od GMI 1000 (delécia zhluku génov hrp)

Boucher a ko1., žiadne symptómy nepub 1 i kované

Mutanti v zhluku génu hrp odvodení od GMI

1000 (mutagenéza

Tn5-B20 )

Kmene	Zdroj alebo odkaz Izolované z	Odpoveď tabaku
GMI	1 462 ,
1475	, 1494,	A r 1 a t	S	ko 1 .	(18)	žiadne symptómy
1492	, 1487
GMI	1 42 3 ,	Ar 1 at	a	ko 1 .	(18)	čiastočná ale-
1425						bo/a oneskore-
						ná HR
Mutanti v	zhluku	génu hrp	odvodení od GMI	1000 (mutagenéza
Tn5-	B20 vnútri zhluku	génov	hrp)
GMI	1485	Ar 1 at	a	kol .	(18)	HR

Legenda k tabu ľ kel: ‘ (1) Boucher, C. A., Barberis, P. A., Trigalet, A. P. a Demery, D. A. (1985) J. Gen. Microbiol. 131, 2449 - 2457 (17) Lozano, J. C. a Sequeira, L. ( 1 9 70 ) Phytopatho 1 . 60 , 833 1 93

7

Izoláty GMI 1000 a K60 sú kmene Pseudornonas solanacearum divokého typu, z ktorých prv zmienený indukuje na listoch tabaku vytvorenie hypersenzitívnej reakcie počas 24 hodín po infiltrácii, a neskôr zmienený spôsobuje typické letálne vädnutie. Derivát izolátu GMI1000, nazývaný -hrp, v ktorom je deletovaný zhluk génov hrp, nevyvoláva na inoku 1 ovaných listoch žiadne symptómy. Osem mutantných kmeňov odvodených od GMI1000 pomocou mutagenézy využívajúcej transpozón Tn5-B20 sa použije podľa nižšie uvedeného popisu. Každý z kmeňov GMI1462, 1475, 1494, 1485, 1423 a 1425 je zmutovaný v jednej zo šiestich predpokladaných transkripčných jednotiek zhluku génov hrp. Všetky tieto kmene stratili schopnosť vyvolávať v tabaku h y persenzitívnu reakciu, s výnimkou kmeňov GMI1423 a 1425, ktoré sú zmutované na pravom konci zhluku génov hrp, a indukujú v tabaku len čiastočnú alebo/a oneskorenú hypersenzitívnu re akciu, a kmeňa GMI1485, ktorý je zmutovaný vnútri zhluku génov hrp a vyvoláva v tabaku normálnu hypersenzitívnu reakciu a konštitutívne exprimuje štruktúrny gén beta-galaktozidázy. Všetky tieto kmene sa pestujú pri teplote 28 C v médiu B alebo BGT (Boucher, C. A., Barberis, P. A., Trigalet, A. P. a Deme r y, D. A. (1985) J. Gen. M i c r o b i o 1. 131, 2449 - 2457). Používané kultivary tabaku Nicotiana tabacum L., Bottom Special a Samsun, vykazujú po inokulácii baktériami podobné odpovede. Semenáčiky sa pestujú in vitro na médiu Murashige a Skoog, F. (1962, 9 Physiol. Plánt 15, 473 - 497) po dobu 4 až 5 týždňov (pri teplote 25 'C, fotoperióde 16 hodín, 15 Watt / m²) a potom sa prenesú do pôdy v rastovej komore (pri teplote 25 ’C, fotoperióde 16 hodín, 30 W a 11 / m²).

Izolácia génu hsr203J a analýza nukleotidovej sekvencie cDNA-klonom pNt203 (Marco, Y. J., Ragueh, F., Godiard,

L., a Froissard, D. (1990) Plánt Mol. Biol. 15, 145 - 154) sa uskutoční screening genómovej knižnice tabaku (Nicotiana tabacum L. kultivar NK326) skonštruovanej v bakteriofágu

8

1ambda-Emb13 (Clontech). Inzert pSTI z pNt203 sa označí pomocou náhodných primárov (random primer technique) (Feinberg, A. P. a Vogelstein, B. (1983) Anál. Biochem. 132, 6 - 13). Nitrocelulózové filtre genómovej knižnice sa ošetria a hybridizujú podľa pokynov výrobcu (Amersham). Izolujú sa štyri odlišné genómové klony vrátene hsr203J. Pomocou exonukleázy III sa uskutočnia delécie na oboch koncoch inzertov DNA subk1onovaných do fágm i d u

Gene 28 ; 35 1 využívajúceho (dideoxy cha a Coulson, R.

pKS (Stratagene) podľa Heinkoffa (Heinkoff, S.

359 ) , a obe vlákna sa dideoxyrobonukleotidov n termination m e t h o d) (1977) Pnas. (USA) 74, s e k v e n u j ú ako t e r m (Sanger ,

5453 (1984) quenasy (US i

B i och em i ca1 sa ušku

4* b

očňujú pou

z.

Corp. ) .

i t i m softwaru un

Sk úman i e pomocou nátorov postupu reakcie

F . , Nicklen, S.

4 6 7 J použitím S eKompilácie a analýzy sekvenr

V/

G e n e t 'i c s o m p u t e r Group , H a e b e r 1 i , cons i n of W i

Un i ver s i ty s, 0. (1984) Nucl homo1óg i e a Swissprot (verzia ity th i •u

387 použitím , 0) sa

O L·.

FASTA (Pearson, W. R

2448. Proteínové

2444 kytu potenc i á 1nych ktoré prechádzajú PC/Gene Programme sity of Geneva, určí databáz a L i pman, sekvencie

N-koncových membránou (Department

Š v a j č ar s k o ) .

5 ) .

(verzia 71 uskutočňuje porno

D . J . ( 1 988 ) PNAS.

h ľad cou alaor ( USA) ,0) tmu pr o f sa analyzujú z g n á 1 n y c h sekven použití

Medical Biochemi verzie v ý s a domén, programu

U n i ve r pomocou postupu extrahovanej z 1 b i 1ným i zo 1átom (nukleotidy 1413 stov p r i m e r tabaku s t r y

Miesto počiatku transkripcie sa použitím i noku 1 ác i i extension hodín po p o 1 y A + R M A nekompat i igonukleotidu umiestneného až 1415 v sekvencií SEQ

ID č.

kodóne AľG

Konštrukty reportérových génov

Fragment B g 111 dĺžky 2,2 kilobází (k b) , ktorý obsahuje 1,3 kb 5'-nekódujúcej oblasti génu hsr203J tabaku a 390 párov báz í (bp) nukleotidovej sekvencie downstream od miesta počiatku transkripcie sa klonuje do miesta BamHI fágmidu pKS, čím sa

9 získa p K J uskutoční iniciácie

2,2. ľento plazmid sa rozštiepi pomocou BstBI jedno štiepenie 55 bp smerom k 3'-koncu do translácie hsr203J, konce vytvorené BstBI sa fragmentu DNA-polymerázy a potom sa ktorá kodónu otupia pomocou K 1 enow rozštiepenie

B s t BI veľkosti 1,5 kb b i nárneho a 1 i gujú uskutoční pomocou Sali. Tento sa klonuje do miesta fragment Sa 1I Sali - SrnaI exvektora presívneho beta-g 1 u k u r o n ídázu (Jefferson, R. A.

M. W. ( 1 987 ) EMBO J. 6, 390 1 expr imujúceho fúzia hsr203Jz pHG21A,

EcoR I , i gu je čím sa získa expres sahujú vene i u génu (obrázok

5'-nekódujúcu veľkosti 72 ľ . A . a Bevan, dos i ahne génová pHG21A. Fragment DNA HindlII-EcoRI veľkosti obsahujúci promótor hsr203J a kódujúci sekdo vektora pUCl9 rozštiepeného HindlII testov dočasnej pHG21A teda obbp, vedúcu s e kbp, prvých 55 bp kódujúcej sekvencie rovnakom čítacom rámci so sekvenciou k ó , Kavanagh

3907), čím sa pHG21, pre uskutočnenie ) . Konštrukty pHG2 1 a sekvene i u veľkosti 134 1 hsr203J dujúcou (nos ) .

f ú z o v a n ý c h v

GUS, a po 1 yadeny1ačný

Vznik translačnej sekvenovania oboch

G U S (Jefferson, R. - 405 ) . Dva d’al š bez promótora, (CaMV) 35S a gén p U C 1 9 (C o n t e c h) .

signál génu nopalín-syntázy fúzie sa potvrdí pomocou priameho vlákien použitím priméru špecifického pre Plánt Mol. B i o 1 . Reportér 5, 387 pBI201 a pBI221 obsahujú gén uidA promótor vírusu mozaiky karfiolu

A . ( 1 9 S 7 ) p 1 a zm i d y , respektíve uidA, upstream od terminátora nos, vo vektore

Izolácia protoplastu a testy dočasnej expresie

Listy 4 až 5 týždňov starých rastlín tabaku, kultivaru Samsun N N, pestovaných in vitro, sa použijú na izoláciu p r o toplastov pomocou inkubácie častí listov v médiu ľO (Chupeau, Z., Bourgin, J. P., Missonier, C., Dorion, N. a Morel, G. (1974) Compte-rendu á l'Academie des Sciences Paris 278, 1565 - 1568) obsahujúcom 1 g / 1 c e 1 u 1 á z y R 10 Onozuka, 200 mg / 1 macerozýmu Onozuka (Yakult Honsha, Nishinomiya, Japonsko) a 500 mg / 1 pektolyázy Y23 (Seinshin Pharmaceutica1 Ind.) po dobu 15 hodín pri teplote 22 C v temne. Protoplasty sa oddelia od porušených buniek použitím nylonovej tkaniny s veľkosťou ôk 85 _zum a následnou centri fugáciou pri 50 g po dobu 5 minút nad top 1 asty , médiom TO

1,5 x 10^e ml 19 % roztoku (hmotnosť / objem) sacharózy. Prov kvapalnej fáze sa raz premyjú ch hustota sa upraví na hodnotu Transformácia sa uskutočňuje p o (vzorky s objemom 320 zu 1 ) pri po rýchlom ochladení na teplotu ktoré sa nachádzajú spočítajú sa, a i protoplastov / ml.

mocou inkubácie teplote 45 miestnosti,

C po pr i s-HC 1 protoplastov dobu 5 minút pridaní , pH 8)

0,4 M manitolu,

J plazmidovej DNA (50 _zug na vzorku a 160 /ul roztoku po 1yety 1 éng 1 yko 1 u mM chloridu horečnatého, (M e s ) , pH 5,8). P r o t o(PEG ) (40 %

0,1 % morfolinoetánsulfónovej kyseliny (M e s ) , pH 5,8).

plasty sa mierne miešajú po dobu 10 minút pri teplote miestnosti. Potom sa oddelia pomocou centrifugácie a znovu sa r o zpracujú do suspenzie v 500 zul média TO. Potom sa pridá b ak. t βίο baktérií popísaného

Y. (1989) na protop 1 ast)

3 - 33 ) . Po teplote 28 “C 10X pufra GUS, skúma akt i v i ta riálna suspenzia ( vila podľa vyššie

Roby, D . a Marco, nkubácii pomocou pridania po sa protoplasty lyžujú pomocou sa uskutoční’ centrifugácia a GUS (Jefferson

Reportér 5, 387 - 405).

R. A. (1987)

Transgenické rastliny tabaku pHG2A

DH5alfa do pBI121 a pBI10 1 kmeňa Agrobacteri um Nucleic Acids Res.

W . (1984) transgenické rastliny i a 1) pomocou postupu

B . , F r a 1 e y , Hoffmann, N.

tabaku ktorý spôsobu (Ragueh P h y s i o 1 . Mol.

ktorá sa p r i p r a-

F- ,	Lescure,	N . ,
Plánt	P a t h o 1 .	35 ,
dobu	24 hodín	p r i
pridania 50	zul

v supernatante sa

Plánt Mol. B i o 1 .

Escherichia coli vytvor i a sa

Bottom Spesa prenesú z tumefaciens L B A 4404 (B e v a n, M.

2, 8711 - 8721) a (Nicotiana tabacum, využíva listové terčíky (Horsch, S. G., Sanders, P. R., Lloyd, A.

Uskutočni sa

R. T. ,

L. (1984) Science 223, 496 - 498).

Rogers , selekcia transformovaných rastlín na médiu MS agar Difco (0,8 %), kanamycín v a karbeni c i 1 1 i n v koncentrácii 500 koncentrácií rastlinách sa uskutočni samoopelen zug /ml.

i e a zožnú ktoré obsahuje

100 /ug / ml transgenických sa semená. Ich génotypy klíčenia sa stanovia použitím analýzy potomstva (T2), pomocou na médiu MS, ktoré obsahuje kanamycín (500 zug / ml).

Inok u 1ác i a transgenických rastlín bakteriálnymi i z o 1 á t m i

Všetky pokusy s inokuláciou

T2, ktoré sú rez i

nami rovnakého e vyhľadávaní listy tabaku r u j ú sa vo ebo vodou, sa uskutočňujú na istentné voči kanamycínu, s génotypu na každé t r a n s f o r m o v a n y c h oddelia z rástli vákuu b a k t e r i á 1 n o u

Marco , aspoň konkrétne rasti í n starých rastiinách dvom i rasti ne t nky pokusu, c k é pokusy osem

O⁷ d ňo v rasti ako popísali R a g u e h (19 o 9 ) P h y s i o 1 . Mol.

r ác s u s p e n zíe , M.

Roby iou pomocou injekčnej striekačky starých osem (10® c . f.u.

uskutočpomocou i n f i 11 r á c i e b aktePokusy s ň u j ú na r i á 1 ne j ných listov použitím injekčnej rých pokusoch sa týždňov pestovaných na médiu MS. Každá po (Hamilton) s objemom uskutočňuje v miskách str nok u 1ác i ov i ca 1 /U 1 a

Magenta stu sa s e nanesie

0,4

O/ /0 kvapôčka bakteriálnej agare Difco) objemu 3 /u 1 ma zu

Pr týždne v kontakte do malej oblasti neporušee k a č k y bez ihly. V niektoa rastlín starých päť (Magenta s ť k poranené suspenz i e lokalizovanej inokuláci hydroponicky pestujú na s médiom MS, noku 1 u jú sa cez zranenie meter od vrcholu dárny koreň. Pri cubes, Sigma) át perforuje ihlou okamžite mies ta sa / ml koreňov rasti sa n y plávajúcich podložkách ktoré obsahuje 0 álnej s u s p e n z i vo vzdialeno staré °/ 'O agar

CSigD i fco, kvapôčkou bakter spôsobené ihlou koreňa a 1ebo v m s objemom 3 jeden cent i objavuje s e k u n sa celá rastlina ešte, kde sa celkovej inokulácie koreňov opatrne vyberie z plávajúcej p o d 1 o ž.k y tak, aby sa predišlo poraneniu, a koreňový systém sa ponorí do 7 ml bakteriálnej suspenzie (10^e c.f.u. / ml).

Inokulované rastliny sa pestujú pri teplote 28 ’C a po inkubačnej dobe sa analyzujú buď priamo alebo sa skladujú pri - 80 ' C .

Testy použitím GUS

Rasti i nné tkanivo sa rozmeli v kvapalnom dusíku, h o m o g e minút pri 10 ako sa popiB i dd 1 e, P. , 1007).

pufri GUS, centrifúg u je po dobu 5 supernatante sa stanoví (Roby, D., Broglie, K.

I. a Broglie, R. (1990) Plánt stanoví aktivita GUS, , C r e s s m a n, R.

Ce 1 n í z u j e

000 g a pri salo vyššie

C h e t ,

Koncentrácia proteínu sa farbiaceho činidla. Aktivita

GUS sa , 9 9 9 použitím v y j a d r í

Bradfordovho

4-mety1umbe11 í ferónu za minútu ako píkomoly na mg proteínu. Alternatívne sa uskutočnia histochemické testy na čerstvom tkanive použitím X-gluc (5-bróm-4-chlór-3-indolyl-beta-D-gluk.uronid, C 1 ontech ) alebo Magenta-gluc (Biosynth AG) ako substrátu (Jefferson, R. A. (1987) Plánt Mol. Biol. Reportér 5, 387 - 405). Pre niektoré pokusy sa vzorky fixujú v zmesi 0,3 % formaldehydu s 50 mM nátriumfosfátového pufra, pH 7, potom sa vyceria varom v etanole a skladujú v 70 % etanole.

Testy použitím beta-galaktozidázy

Po histochemickom ekvilibrujú s p u f r o m Franck, M. , Uot i 1 a, J. M. a Herrera-Estrella teste použitím GUS

Z ' sa niektoré vzorky Lehvaslaiho, H., T., Van Montagu, , 833 - 838 ) (Teeri, T. H.,

P. , Pa1va , E .

Phytopatho 1 .

pH 7,4, 10mM chlorid draselno , (1970) pufer pri fixujú

He

J (100mM nátriumfosfátový ný, 1 m M síran horečnatý), v 1,25 % glutaraldehydu po

	o ς u O
dobu 1 hodiny	kvôli inaktivácii endogénnych rastlinných

beta-galaktozidáz, premyjú a sfarbia pri teplote 28 C 0,8 mg / ml činidla Magenta-Gal (Biosynth Ag) alebo X-gal v pufri ľ obsahujúcom 5 mM hexakyanože1ezi tanú draselného a 5 mM hexakyanože1eznatanu draselného, potom sa vyčeria varom v etanole a mikroskopicky pozorujú.

Charaktér izáci a génu hrs203J

Gén hrs203J sa izoluje pomocou screeningu genómovej knižnice tabaku cDNA-klonom p N12 0 3 . Patrí do malej multigénovej rodiny pozostávajúcej minimálne zo 4 génov (viď Marco, Y. J., Ragueh, F., Godiard, L., a Froissard, D. (1990) Plánt Mol. B i o 1. 15, 145 - 154) a aspoň dva gény tejto rodiny zodpovedajúce dvom odlišným cD N A -k. lonom ( p N12 0 3 a p N12 3 9 ) sa ex pri mu j ú počas hypersenzitívnej reakcie.

Analýzou sekvencie oblasti DNA h s r 2 0 3 J veľkosti 2,7 k b (SEQ ID č. 1) sa našiel jediný otvorený č i tac i rámec (0 R F) bez i n t r ó n u s potenciálnou kódujúcou kapacitou 355 aminokyselín.

Nukleotídová sekvencia tejto oblasti veľkosti 2,7 kb je iden tická s cDNA-klonom pNt239 s výnimkou dvoch substituovaných párov zásad (neuvádza sa). Tieto miesta, kde je porušená h o m ológia, sú prítomné pravdepodobne vďaka izolácii genómového klonu a cDNA-klonu z odlišných kultivarov tabaku: genómový kloň sa izoluej z kultivaru N K 3 2 6 , zatiaľ čo cDNA-klon pNt239 sa získa z kultivaru Bottom Special. Predpovedaný štruktúrny proteín hsr203J (SEQ ID č. 2) má molekulovú hmotnosť 37,5 k D a a teoretický izoe 1 ektrický bod 5,17.

Miesto počiatku transkripcie sa zmapuje pomocou postupu primer extension do polohy 72 bp upstream od predpokladaného kodónu iniciácie translácie. Promótorová a 5'-neprek 1 adaná oblasť nevykazujú zrejmú homológiu sekvencie s c is-e1ementami , ktoré sa už skôr popísali v obranných génoch.

Dočasná expresia fúzie génov hsr203J-uidA v protoplastoch tabaku

Plazmid pHG21 sa skladá z translačnej fúzie medzi

5'-lemovacou sekvenciou z génu hsr203J veľkosti 1,4 k b a kódujúcou oblasťou reportérového génu uidA, naviazaného na

3'-neprekladané oblasti génu nopalín-syntázy (obrázok 2). Pri testoch dočasnej expresie sa používajú plazmidy pBI201 a p B12 21 ako negatívnej, respektíve pozitívnej kontroly.

to v

Počiatočné pokusy ukazujú, že kvantifikovaná pomocou nemení pri pri stanovení podstatne životaschopnosť protoplaspoužitím Evansovej modrej baktérií v množstve 10 až

100 pokusy sa

Pri tejto torom h s r na protoplast k u t o č ň u j ú s stote baktérii je J ako odpoveď na na kontroly (inokulácia vodou alebo a kompat i b i 1 ným údaje sa množ stvom e x p r e s i i z o 1át ako odpoveď

3) .

Pre vedie ak t i i ty v pr

CaMV neuvádzajú). Nasledovné baktérii na protoplast.

GM 11000 šesťkrát porovnan i e , dvojnásobnému zvýšeniu porovnať páde protop1astov

35S-uidA (pBI221) aktivity enzýmu s promovyššia (obrázok hr p)

1átom, K60, eto hodnoty s hodnotami, ktoré transformovahých pomocou génovej fúz , ktoré vykazujú vysokú a takmer sa nameral tut i v n u hodnotu pri rôznych inokuláciách (obrázok 3).

Výsledky testov dočasnej expresie teda jasne svedčia o tom, že promótor hsr203J obsahuje všetky elementy nutné pre jeho prednostnú aktiváciu pomocou bakteriálneho izolátu, ktorý indukuje hypersenzitivnu reakciu, a že tento systém expresie výborne nabodobňuje interakciu rastlina - patogén.

Expresia génovej fúzie hsr203J-uid A v transgenickom tabaku

Pre stanovenie charakteru expresie promótora hsr203J v rastlinách z priestorového a časového hľadiska sa prenesie génová fúzia ktorá využíva va jú rastliny vaných rastlín hsr203J-uidA do listové terčíky

T2 rez i stentné rez istentných tabaku pomocou transformácie, všetkých pokusoch sa použikanamycínu.

kanamycí nu rasti í n

Vo voči voči

Z 23 transformoich 20 exprimuje vykazuje rovnaký zistí po deväťdea všetkých 20 charakter expresie:

GMI1000, keď je stimuláci porovnaní s kontrol nf i 1trác i i fúziu génovú celkový i nf i 11 rác i i s i atnásobná a pri i hodín po týchto maximálna aktivita

GUS sa a dvojnásobná n ým až i nf i 1trác i am (vodou alebo - h r p)

25-násobná, sú porovnateľné dočasnou expres hodnoty kusoch s hodnotami i ou po

K60

J i noku 1 ác i i je je ktoré indukcia zobrazené) sa získali

Tieto pr

GMI 1000 alebo i poNa základe tejto analýzy sa vyberie transformovaná rastlina (pHG21-14A), ktorá vykazuje deväťdesiat násob r> ú stimuláciu aktivity GUS po nekompatibilnej inokulácii v porovnaní s kontrolnými infiltráciami, a obsahuje jednu inzertovanú génovú fúziu na haploidný genóm. Prítomnosť natívnej génovej fúzie sa preverí pomocou Southernovej analýzy genómovej DNA (neuvádza sa).

Pre monitorovanie aktivity promótora hsr203J v rôznych orgánoch počas vývoja rastliny a ako odpovede na bakteriálnu í n o k u 1 á c i u sa použil test extrahovateľnej aktivity GUS a test h i stochem i ckej pHG21 - 14A , ktoré lokál boli zác i e staré , 7 alebo žiadna aktivita úplne vyvinutých

GUS , rastlín zdravých (údaje sa svedči a o tom, že promótor po i nf i 11 r ác i i v semenáčikoch dni, i stoch , neuvádzajú) hsr203J sa listoch inokulovaných je hypersenzitívnu reakciu, GMI1000 ne z tabaku istila v kvetoch eto údaje silne aktivuje i z o 1 á t o m, ktorý ako ukazuje hodín nd u k u skúmanie všetkých získaných transformovaných rastlín. Na transformova ných rastlinách pHG21-14A sa rázok 3), ktorá ukazuje, GMI1000 aktivita GUS zvyšuje dvanásťnásobku kontrolnej uskutočnila kinetická štúdia (obže sa v listoch infiltrovaných 6 hodín po inokulácii na hodnotu hodnoty, dosahuje maxima

200-násobnej stimulácie po 9 hodinách a znižuje sa na strednú hodnotu (osemdesiatnásobná indukcia) po dlhšej inkubácii. Po infiltrácii K60 sa namerali oveľa nižšie hodnoty, a v listoch infiltrovaných vodou alebo izolátom -hrp sa po akejkoľvek inkubačnej dobe nezistila detekovateľná úroveň aktivity GUS.

transformované konštruktom pHI vykazujú bezvýznamnú úroveň aktivity GUS rastliny transformované pBI121, ktorý obsahuje CaMV 35S-uid A, vykazujú podobnú úroveň aktivity povahu inokula

0 3 J-u i d A teda vykazuje zvláštny i v á c i e po bakteriálnej tabaku, ktorý vykazuje úzku akumulácie transkriptov hsr2 ku (obrázok 3). Tieto výsledky motor hsr203J včas a špecificky rastlina - patogén, keďže bakteriálny izolát, v ktorom je schopný aktivovať promótor h s r 2 0

Rasti i ny huje promótor toho

101, ktorý neobsaOkrem génovú fúz bez ohľadu na akt ί nok u 1ác i i podobnosť n f i

03J interakcie génoch hrp, ny hr p, nie

Lokálizácia enzýmu (neuvádza sa). Génová fúzia a špecifický charakter transgenidckých rastlín charakterom s in v i v o i ez akt ltrovancýh 1 svedčia o tom , ze sa í v u j e počas nekompatibi že jeho i n d k u c i aktivácie hsr203J-uidA pri odpovedi sa ·> o p r οΙ nej a záv i s de 1 etujú na géna bakteriálnu i noku 1ác i u

Na transformovaných rastlinách

PHG21-14A sa uskutočňujú rôzne inokulačné testy kvôli stanoveniu presnej lokalizácie aktivácie promótora hsr203J pri odpovedi na bakteriálnu inokuláciu. Tieto testy sa uskutočňujú, po prvé, na listoch tabaku, kvôli skúmaniu indukcie promótora počas typickej hypersenzitívnej reakcie, a po druhé, na koreňoch, čo sú orgány prirodzene infikované baktériami.

Inokulácia listov: Kvôli stanoveniu, či je expresia hsr203J-gén GUS lokálna alebo týždňov starých transgen i ckých systémová, sa i n o k u 1 u j ú listy kvapôčkami bakteriálrasti í n i nkubác i i po dobu nej suspenzie. Po v polovici inokulovaného hodín sa stanoví aktivita

GUS istú, a rovnako tak vo vyšších c i a akt i ity

GUS v i stoch. Výsledkom inokulovaných listoch, zatiaľ čo je pätnásťnásobná a vyšších

4A). Druhá stoch poloví ca tochem i cký test a 70 hodín hypersenz i t í v n u n i a, ktoré je zistili len veľmi inokulovaného listu

Úzko modro sfarbená nízke hodnoty sa použ i je (obrázok pre h i s — oblasť sa vizualizuje po inokulácii bakteriálnym izolátom indukujúcim reakc i u obmedzené lizované veľm blízko sfarbení i no k u 1 ác i i K60 modré kuje tlín tor a zu je ľáto oblasť obklopuje miesto poranena niekoľko žltnúcich, hodí vykazuje sfarbenie. Inokulácia detekovateľnú expres i u ktoré obsahujú chimér vrstiev buniek pravdepodobne po niekoľko vodou a cký

CaMV 35S má za následok špecifickú povahu i n d u k c i ol

Sfarben gén u i d A , a je 1 okamŕtvych , zvyšuje buniek • h r p ne transgenických atóm buPo abé nduraspod kontrolou p r o m ósfarbenie celého listu, e promótora h s r 2 0 3 J v . Presnejšia lokalizácia tejto aktivácie počas čo dokatejto obinfekcie sa uskutoční pomocou merania aktivity GUS v malých plochách obklopujúcich 1 é z i u 18 hodín po inokulácii (obrázok 4 B). V y s ohodnoty aktivity ezýmu (48-násobná kontrolnými hodnotami) stimulácia v porovnani samých nekrotických léz nezistí detekovateľná akt

Pre stanovenie, vanej oblasti aktivuje, i stoch 8 týždňov

GUS na ne i nf i 1 trovaných

PO nok u 1ác i GMI1000 sa istí len ako skoro

V tkan enzýmu.

ve až 3 mm od lezie sa suspenz iou alebo

GMI1000 , keď ešte sa promótor hs

203 J i n okulosa uskutoční histochem pomocou cká lokalizácia starých t ransgen i c kých injekčnej striekačky bakteriálnou rastlín lokál—

K60. Už i e je v infiltrovaná oblasť zvyšuje 9 hodín po i hodín po inokulácii izolátom d i t e ľ n á nekróza tkaniva, vykazuje listu modré sfarbenie, ktorého i n t e z i t a sa nokulácii. Po dlhšej dobe inkubácie sa ob28 javuje postupujúca žltá joch úzkou modrou plochou rovanej čast i listu.

Tieto dochádza len pokusy jasne v obmedzenej vám buniek, nekróza, ohraničená ktorá je stále na svojich okraumiestnená v infiltdokazujú ob1ast i ktoré boli infikované senzitívnu reakciu, GM11000.

Inokulácia koreňov:

Korene že k expresii hsr203J-GUS zodpovedajúcej presne v r s t zo 1 átom i ndukujúcim hyperhydropon i cky pestovaných transgenických rastlín sa r i á 1 n e j suspenzie. Po 48 tochemická porania hodinách kvapôčkou sa uskutočn b akteruje len lokalizácia aktivity koreňoch infikovaných

GUS

Sfarben

GMI 1 000 , sa e, ktoré sa rozkladá v od pôvodne inokulovaného miesta do v z d i a 1 enosti 2 mm.

oké skúmania svedčia o tom, že aktivác promótora e jme ce nezávisí od typu bunky (neuvádza sa i n o k u 1 á c i a koreňov pomocou ponoren pozokoreni hsr 203 J

Uskutočni sa tiež celého koreňového systému

GUS zistí do bakteriálnej suspenzie. V tomto v obmedzených oblastiach prípade sa a k t i v i koreňov, v mieste ta sekundárnych koreňov, f i ckých mi estach

E .x p r e s i zodpovedá ex a génovej i stene i i fúzie v týchto uprednostňovaných spec miest vstupu baktérií vy sekundárnych miesta svedčí ktorá sa koreňov s fa r b en pre našla okolo miesta p o š V týchto špecifických zistenie aktivity žití bakteriálneho

GUS do hostiteľa, sekundárnych dvojaké a prítomnosti baktérií, sahujúceho beta-galaktoz pri pou i d á z o v ú i zo 1 átu obfúziu, dzi aktiváciou promótora hsr 2 03 J zoroval nizácia a p r a sa tiež povrchová a intercel špičiek koreňov o dobrej korelácii ítomnosťou baktérií.

mePoulárna bakteriálna kolomótora hsr203J v tejto , ktorá mala za časti následok aktivác u prokoreňov.

Génová fúz i

3J-GUS fický charakter aktiváci e v ako odpoveď na bakteriálnu teda vykazuje zvláštny a transgenických rastlinách infekciu, a táto aktivác zodpovedá spôsobu vstupu baktérii do rastliny.

špecitabaku a úzko

Závislosť aktivácie hsr203J-uidA na génoch hrp

	K inokulácii transgeni okých rastlín (pHG21-14A) kvapôčko-
vou	metódou sa použijú rôzne kmene Pseudomonas solanacearum

zmutované génov hrp vyvolávať GMI1425 a v jednej (obrázok v tabaku

GM11423 senzitívnu reakc i vplyv tantov na rovnan aktivitu en GMI (obrázok h s r 2 0 3 J je

5B) . T nutný

Až dosiaľ f i ck ý tohto smrti význam i gná 1 u bunky pr mechan zo šiestich transkripčných jednotiek zhluku

5). Tieto mutantné kmene hypersenzitívnu reakciu, spôsobujú čiastočnú alebo hodín po inkubácii

GUS pri šiestich zo

1423 tou eto sa do stratí 1 i schopnosť i keď dva oneskorenú sa nezisti spôsobuje zvýšení pri použití kmeňa údaje svedčia o takmer celý funkčný z nich, hyperžiadny iedmich testovaných m u ak ti v i ty enzýmu v podiv o k é h o typu, G MI10 0 0 tom, že pre aktiváciu , z e pre hluk génov hrp.

neidentifikoval žiadny gén, ktorý má špecirozoznani nekompatibilného patogénu celej bunky (hypersenzitívnej zmus pre ohraničenie , prenosu alebo pri r e a k c i i ) a konečnú el konečnej programovej predstavujúcej účinný i m í nác i u patogénu.

Gén hsr203J (SEQ ID č. 1) je prvým izolovaným génom, súvisiacim s h y per s e n z i t i v i tou, ktorého promótor vykazuje rýchlu, vysoko lokalizovanú a špecifickú aktiváciu ako odpoveď na bakteriálny izolát indukujúci hypersenzitívnu reakciu. Vytváranie delécii od 5'-konca promótorovej oblasti pHG2!

točn i a (1984) p 1 a z m í d

Jednosmerné delécie promótora počnúc

Gene 28 pHG2 1 a Sali a potom rukty postupne bp. Lokalizácia sekvenovaním oblasti od 5'-konca podľa , 351 - 359). Pre (obrázok 1) použitím sa rozštiepi exonukleáz deletované vždy po vz 5'-konca deletovaných a porovnaním s génu hsr203J (viď obrázok 6).

chimér i okého génu sa uškuHenikoffa (Henikoff, S. tento účel sa linearizuje reštrikčných enzýmov Shpl ou III. Vyberú dialenosti pr konštruktov sa konštblížne 200 sa stanoví nuk1eot i dovou sekvenciou

Vplyv delécií na génovú expresiu chimerického génu v transgenických rastlinách tabaku

Do rastlín tabaku sa pomocou transformácie zavedie 50 zug plazmidovej DNA zodpovedajúcej rôznym deléciám (obrázok 5). Aktivita G(JS sa meria 18 hodín po inokulácii.

Obrázok 7 znázorňuje expresiu génu GUS pomocou konštruktov, ktoré sa získali deletovaním promótora v pHG21 od 5'-konca (podľa schémy na obrázku 5). Rastliny boli transformované 5 /ug DNA, a hodnota 100 predstavuje aktivitu GUS, ktorá sa dosiahla pomocou transformácie konštruktom p H G 21. Obrázok znázorňuje zvýšenie aktivity génu GUS po 18 hodinách ako následok infiltrácie transformovaných rastlín bakteriálnymi kmeňmi Delta 3, K60 a GMI 1000. Kontrolné rastliny boli infiltrované vodou. Tieto pokusy svedčia o prítomnosti dvoch hlavných oblastí deletovaného promótora génu h s r 2 0 3 J, ktoré majú regúlačný efekt.

Jeden alebo viac elementov, ktoré

651 v sekvencii SEQ nukleotidov 1 až

ID umiestnené v oblasti ie chimerického ('nukleotidy 652 génu až

č. 1, zodpovedá za elementy umiestnené

J

1268) vykazujú pozitívny hsr 203 J .

zoslabenie expres v druhej oblastí vplyv na aktiváciu promótora génu

Štúdium priestorového a časového charakteru aktivácie promótora v koreňoch a listoch transgenických vaných Pseudomonas solanacearum svedčí o tom, rastlín i n o k u 1 o promótor sa špecificky aktivuje počas hypersenzitívnej reakcie niekoľko hodín predtým, ako sa objavia nekrotické 1 é z i e , lokalizácia jeho aktivácie sa obmedzuje na niekoľko vrstiev buniek v kontakte s baktériami, promótor netvorí odpoveď na rôzne stresové podmienky a je

1 veľmi slabo aktivovaný počas kompatibilnej interakcie, aktivácia promótora silne závisí na génoch hrp (hypersenzitívne odpovede a patogenity) Pseudomonas so 1anacearum.

Tieto gény kontrolujú schopnosť baktérie vyvolávať hypeŕsenzitivnu reakciu rezistentných alebo nehostiteľských rastlín a spôsobovať chorobu hostiteľských rastlín.

Hlavnú úlohu bakteriálnych génov skutočnosť ra génu hsr203J potvrdzuje exprimovaný pri odpovedi na nej

E r w i tor špecifický je nia amylovora. Pri odpoved aktivuje povedajúceho š i e. Ďa 1 š hrp v aktivácii promóto, že promótor h s r 2 0 3 J je e 1 i c i t o r hypersenzitívproduktom jedného na tento polypept aká sa pozoruje v a 1 e reakcie, harpín, ktorý na podobnú úroveň e 1 i c i t o r y ,

Všeobecná

Pi p a t i b i Iných r o v a n á pr i r i n g a e

1ovora pv p

Okrem avirulentného kmeňa, potenciálne n d u k t o r y r e z i a t n o s ť špec i n t e r a k c i í if dochádza k z génov hrp id, sa p r o m ó prípade zodrýchlejab i ot i cké tomu i n d u k t o r y , a stencie, neovplyvňujú jeho i č n o s t i espresie h s r 2 0 3 J počas bakteriálnymi patogénmi bola demonštn ý m i patogénmi,

Pseudomonas syringae pv e x p r e s i u .

n e k omtestoch s i toho sa uskutočnila funkčná ako je t a b a c i a

Pseudomonas syi b i 1 n ý radu analýza c génu hsr20

Táto analýza is-elementov

3J pri o d p o sa zaháod

5'-konca konštruktov zodpovedných za ved i na nekompat la vytvorením analýzou týchto v transgenických nosti distálneho zos 1 abovacieho elementu rastlinách. Výsledkom gulujúcich elementov, z ho nukleotidy 655 - 770 špecifický pre odpoveď nukleotidami 1195 až 1268 ípčnú ak. t i v á c i u bakteriálny kmeň.

konštruktov deletovaných pomocou testu dočasnej bolo zistenie pri toma dvoch pozitívne r e kvantitativny (tvoria ID č. 1), a druhý je sa medzi ktorých jeden je v sekvencií SEQ ) , a nachádza expres i e voči baktériám, sekvencie znázornenej ako SEQ ID č.

Tieto výsledky svedčia o tom, že promótor génu hsr203J vzhľadom na doteraz študované obranné gény rastlín vykazuje nové a originálne charakteristiky aktivácie. Priebeh jeho aktivácie z priestorového a časového hľadiska spolu s jeho špecifickou indukciou počas hypersenzitívnej reakcie zdôrazňuje význam tohto génu ako molekulárneho nástroja pre štúdium vzniku a regulácie hypersenzitívnej reakcie. Okrem toho sa určila sekvencia veľkosti 74 bp, ktorá zodpovedá za indukovateľnosť promótora avirulentným patogénom.

Hoci bol vynález popísaný špecificky pre prípad aktivácie promótora hsr2O3J pri odpovedi na kontakt rastlín tabaku s ne kompatibilným patogénom, do úvahy treba vziať, že tento to r sa môže podobne genických pokiaľ sa ne určitých vírusov aktivovať týka tohto a určitých kontaktom iných rastlín, génu, s inými patogénmi, húb, čo svedči o tom, že p r omóvrátašpec i fická expresia promótora hsr203J je všeobecný jav nekompatiln e j interakcie medzi hostiteľom a patogénom, ktorá vedie ku hypersenzitívnej odpovedi.

Okrem toho sa nukleotidová sekvencia, ktorú tvoria nukleotídy v polohe 1195 až 1268 v sekvencii znázornenej ako SEQ ID č. 1 obsahujúcej element, ktorým rastlina zodpovedá na prítomnosť baktérií (bacterial response element, B R E), viaže na extrakty jadrových proteínov z rôznych zdrojov (zdravých rastlín, rastlín i noku 1 ovaných kompatibilnými, nekompatibilnými a hrp-mutantnými kmeňmi Pseudomonas solanacearum po rôznych inkubačných dobách). ľáto väzba sa môže hodnotiť pomocou retardačnej gólovej analýzy použitím napríklad oblasti s veľkosťou 74 bp a niektorých subfragmentov, čo umožňuje identifikáciu jednotlivých sekvencii v oblasti BRE, ktoré sú použiteľné pri vytváraní genetických konštruktov obsahujúcich indukovate ľ n é gény rezistencie voči chorobám.

Zobrazenie sekvencii

I nformác i e o

SEQ ID č.

(i) charakter istiky sekvencie:

(A) dĺžka: 2778 párov zásad (B) typ: nukleová kyselina (C) počet reťazcov: jednoreťazcová (D) topológia: neznáma typ molekuly: genómová DNA nie je hypotetická ) nie je ant i-senze (vi) pôvodný zdroj (A) organizmus:

tabak Nicotiana t a b a c u m (x i) znázornenie sekvencie SEQ ID č.

GGATCTTAAT	GTTAGT T TAT	CTCTTGTTTT	G ΑΛΤ A. T TTGA.	TCTTAATTAT	AATTTATCCA	60
CCATAAATTT	TATTTTCAAA	GATCAAACTA	TTGATATGAC	ATTTCACTTT	TTTATCTTTA.	120
TGTTTGTAGA	ATCATTAGTG	GTATTGACTC	TTACCAATCA	TTTTT„TTTC	TTTCTCACAC	180
	TTAAATTTTC	TTAGTT.ATTG	TT'T'i AATT	GGGTATTTTT	TAATATTACA	240
CGAAAAATTG	ATTAAAAAAA	TATTATTTGA.	GTAGAAAAAT	AGTTCAAATA	TAATATAAAC	300
	G7GGGAGTAT	TTTTTTCTCA	ATTTCAACTC*	TTTATGCAGT	CCACTTAATA	360
T T AC T T T T A. T		TATTAGACAT	TATGGAGTGG	TAATGTATTG	CCAATACGGC	420
ψ (3A	GAAATTGATT	TTATTAAACC	TTCCTACATT	TTTAATÄATA	ATTTAATAGA	480
CAAAATTTTA	TTAATTTTAA·	ATATTAAATA	TTAAAAATTA	GTAGCATATA	AGGTATTATA	540

GTCCAAAAAA	TAGCTTATTA	CAGTTACGTA	CTCTTCCTAT	GAGTTCTTTC	GTTTAATAAT	600
GTAGGGCTAT	TTTGATATAT	TAATATTGTA	TTTATGCTTT	TATAATAATA	TAGGCTCTCT	660
TTTTTCTATA	TGAATTTGGA	CAATATAATA	CATTTTCAAA	TTAAATTAGT	ATCAAATAAT	720
TGTATTTTTG	CTTTTTTAAT	AATTTATACG	CATGAATTTC	ATAATCCAGC	ATATTATGCT	780
AGAACTTTTC	GTGTTTCAAC	TAAAATAATG	ACTATTTTTC	AATGACGTTA	CAAACACTGA	840
CTAATTTTTG	ATTGCAGTCC	GAAAACTATC	TAGTCTATGC	tattttcact	TTTCTAAACT	900
CCCTGCCACT	GTATGCTTTC	ATTGGATTAA	CCTTTAACCA	CACAAATATT	TTAAAGAGTA.	960
ATGTTTGACA	GCGTAATTTG	AAACATCTAC	TATGCCTCTG	TATAT AATAT	CTAATGTTTG	1020
TTCGTAGACC	AATATTCTAA	TTCCTCTCTT	GTAGACTAAA	CC-GGC-CTC-TA	ACT.AACTAAC	1080
CACCATAGTT	ATCTAAATTA	GTGACCCTAG	CGACCATTGA	T AAT T T G AT A.	CTG.ATCATTG	1140
ACTTCCACCA	AATCTACTTT	CTAAATGTC-G	ACTC-ACTCAT	TATGAATTTG	TGAGGAAAAT	1200
ACTTTCCTAA	TGCTAGTGCT	CTTCCCATTA	TCTAAACTCC	AAAATTTTGT	AAAATTCTTT	1260
GAACCTTCCT	TTAAACTACC	ACAAATTTTC	fľä ^GC^^^C	CTATCTC.-.CC	ΑΤΤΆΤ.ΑΑΑΤΑ.	1320
GCCACGCACA	TGCAAACCAA	AGGTACACAC	TAAA.CAAACT	T Q i ’T Q T 'T Q i	AAT'T’ AC^GA™	1380
TACTCGAAAA	AAACACTTCA	AACTTTGCCA	.AA ATG GTT Mec Val	CAT GAA AAG His Glu Lys	! CAA GTG Gin Val	1433

5

AT A íle

GAG Glu

GAA Glu 10

GTA Val

TCC Ser

GGC Gly

TC-C- Trp

CTT Leu 15

AC-Ä Arg

rp<ri -L -4 Val

TTC ?

GAA Glu

C-AC Aso 20

GGT Gly

TCA Ser

GTA Val

1481

C-AC

CGG

ACT

TGG

ACC

GGT

CCA

CCC

GAA

GTC

AAA

T^C

ATG

GCC

GAG

CCA

1529

Asp

Arg

Thr

Trp

Thr

Gly

Pro

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Meo

Ala

Glu

Pro

25

30

35

C-TC

CCA

CCC

CAT

C-AC

TAC

TTC

AT C

GAC

GC-C

GTT

GCC

GTC

AAA

GAT

GTA

1577

Val

?ro

Pro

His

Asp

Tvr

Phe

íle

Asp

Gly

Val

Ala

Val

Lys

Asp

Val

40

45

50

55

GTC

C-CC

C-AC

C-AA

AAA

TCC

GGC

AGC

CGT

CTC

CGC

AT C

TAC

TTA

CCT

GAA

162 5

Val

Ala

Asp

Glu

Lys

Ser

Gly

Ser

Arg

Leu

Arg

íle

Tvr

Leu

Pro

Glu

60

65

70

CGA

AAC

C-AC

AAT

TCC

GCC

AC-C

AAC-

CTT

CCC

GTC

AT T

CTT

CAC

TTC

CAA

167 3

*

Arg

Asn

Asp

Asn

Ser

Ala

Ser

Lys

Leu

Pro

Val

íle

Leu

His

Phe

Gin

75

80

85

GGC

GGC

TTT

TGT

GTC

AGC

CAT

GCT

GAT

TGG

TTC

AT G

TAC

TAC

ACT

1721

Gly

Gly

C-lv

Phe

Cvs

Val

Ser

His

Ala

Asp

Trp

Phe

Mgr

Tvr

Tyr

Thr

90

95

100

GTC

TAC

ACG

•CGC

CTA

GCG

CGC

C-CG

GCC

AAA

GCT

ATC

GTC

TCC

GTC

1769

Val

Ty 2Γ

Thr

Arg

Leu

Ala

Arg

Ala

Ala

Lys

Ala

íle

Z —S

Val

Ser

Val

105

110

115

TTC

CTC

CCC

CTC

C-CG

CCG

GAG

CAC

CGC

CTC

CCA

GCT

GCC

TC-C

GAT

GCC

1817

Phe

Leu

Pro

Leu

Ala

Pro

Glu

His

Arg

Leu

Pro

Ala

Ala

Cvs

Asp

Ala

120

125

130

135

GGT Gly

TTC Phe

C-CC Ala

GCT Ala

CTC Leu 140

CTC Leu

i Trp

CTC Leu

CGG Arg

GAC Asp 145

CTC Leu

TCC Ser

CGG Arg

CAG Gin

CAA Gin 150

GGA Gly

1865

CAC

GAG

ccc

TC-G

CTC

AAC

C-AT

TAC

GCA

GAT

TTC

AAC

CGA

GTA

TTC

CTC

1913

His

Glu

Pro

Tro

Leu

Asn

Asp

Tyr

Ala

Asp

Phe

Asn

Arg

Val

Phe

Leu

155

160

165

ATC

GGA

GAC

AGC

TCC

GGC

GGG

AAC

AT A

GTC

CAC

CAA

GTT

GCC

GTC

AAA

1961

íle

Gly

Aso

Ser

Ser

Gly

Gly

Asn

íle

Val

His

Gin

Val

Ala

Val

Lys

17 Ô

175

180

GCC

GGC

GAG

GAA

AAC

TTA

TCT

CCA

ATG

CGA

CTG

GCC

GGC

GCA

ATT

CCG

2009

Ala

C-lv

C-lu

Glu

Asn

Leu

Ser

Pro

Met

Arg

Leu

Ala

Gly

Ala

íle

Pro

185

190

195

ATC

CAT

CCA.

GGT

TTC

GTG

CGG

TCC

Ä 'J

CGG

AGC

AAA

TCG

GAG

CTA

GAA

2057

íle

His

Pro

Gly

Phe

Val

Arg

Ser

Tyr

Arg

Ser

Lys

Ser

Glu

Leu

Glu

200

205

210

215

CAA

C-AG

CAA

ACC

CCG

TTT

TTA

ACA

TTA

GAT

ATG

GTG

GAT

AAA

TTT

CTA

2105

Gin

Glu

Gin

Thr

Pro

P

Leu

Thr

Leu

Asd

Met

Val

Asp

Lys

' Phe

Leu

220

225

230

GGG

TTA

C-CT

TTA.

CCA

GTA

GGG

AGC

AAC

AAG

GAT

CAT

CAA

ATA

ACA

TGT

2153

C-ly

Leu

Ala

Leu

Pro

Val

Gly

Ser

Asn

Lys

Asp

His

Gin

íle

Thr

Cys

235

2 40

245

CCG

ATG

C-GA

C-AG

GCG

GCG

CCG

GCA

GTG

C-AG

GAG

CTT

AAA

TTA

CCG

CCT

2201

Pro

He”

Glv

Glu

Ala

Ala

?ro

Ala

Val

C-lu

C-iu

Leu

Lvs

Leu

Pro

Pro

250

255

260

TAT

TTG

TAC

TGT

GTG

GCG

GAG

AAA

GAT

CTG

AT A

AAG

GAC

ACT

GAA

ATG

2249

Tvr

Leu

Tyr

Cys

Val

Ala

Glu

Lys

Asp

Leu

íle

Lvs

Asp

Thr

Glu

Met

255

270

275

GAG

rprprp

TAC

GAA

GCT

ATG

AAA

AAG

GGG

GAA

AAG

GAT

GTA

GAG

CTG

TTT

2297

Glu

Phe

T VľT

Glu

Ala

Met

Lys

Lys

Gly

C-lu

Lvs

Asp

Val

Glu

Leu

Phe

280

285

290

295

ATT

AAC

AAT

GGA

GTG

GGA

CAT

AGC

TTT

TAT

CTT

AAC

AAA

ATT

GCT

GTT

2345

íle

Asn

Asn

Gly

Val

Gly

His

Ser

Phe

Tyr

Leu

Asn

Lys

íle

Ala

Val

300

305

310

AGA

ATG

GAC

CCT

GTA

ACT

GGT

TCT

GAA

ACT

GAA

AAA

CTT

TAT

GAA

GCC

2393

Arg

Meu

Asp

Pro

Val

Thr

Gly

Ser

Glu

Thr

C-lu

Lys

Leu

Tvr

Glu

Ala

315

320

325

GTT

GCA

GAG

TTC

ATC

AAC

AAG

CAT

TA AAAGGAGAAA ATTTC-T

'GGT T

2439

Val

Ala

Glu

Phe

íle

Asn

Lys

His

330

335

TTC-CÄGAATA	TTTGTTTGTT	C-CATC-CATC-T	TCAAGATTTT	GATGTACCGT	CTTGATTC-TC	2499
ACGTTCTAAT	C-GTTTTGTAA	TTATAATT ^.T	GAGGAGTAAA	TTTCTATTGT	TGCGTAGAAA	2559
f—· m rp	TTGGTAGTAA	ATGTTTATTT	GTAATACTTT	AAAAAGTGGA	CAAATTTCTT	2619
TTC-AC-ATTCA	TC-AAATAATA	TCTTTAAATT	TCGAATGTCA	ATAAGTCCAG	AAATTGAAAT	2679
GTATCTGTAC	CGTCAATGAA	GTCTCCTTGA	GGCTTTTTTT	CACATGATAT	CGTCTATACC	2739

ACCAAAAAGT TTGATAAGCT ATACAATATG AGATTCTCG

2778

Informácie o sek vene i i

SEQ ID č . 2 :

(i) charakteristiky sekvencie:

(A) dĺžka: 335 aminokyselín (B) typ: aminokyselinová (D) topológia: lineárna (i i) typ molekuly: proteín (xi) znázornenie sekvencie SEQ ID č. 2:

Met 1

Val

His

Glu

Lvs ' 5

Gin

Val

íle

Glu

Glu 10

Val

Ser

Gly

Trp

Leu 15

Are

Val

Phe

Glu

ASD

Gly

Ser

Val

Asp

Arg

Thr

Trp

Thr

Gly

Pro

? ro

G? u

20

25

30

Val

Lys

Phe

Met

Ala

Glu

Pro

Val

Pro

Pro

His

Asp

Tvr

Phe

íle

Asp

35

40

45

Gly

Val

Ala

Val

Lys

Asp

Val

Val

Ala

Asp

Glu

Lvs

Ser

Gly

Ser

Aro

50

55

60

Leu

Arg

íle

Tyr

Leu

Pro

Glu

Arg

Asn

Asp

Asn

Ser

Ala

Ser

Lys

Leu

65

70

75

30

Pro

Val

íle

Leu

His

Phe

Gin

Gly

Gly

Glv

P he

Cys

Val

Ser

His

Ala

85

90

95

Asp

Trp

Phe

Met

Tyr

Tyr

Thr

Val

Tv*

Thr

Arg

Leu

Ala

Aro

Ala

Ala

100

1Ô5

11Ó

Lys

Ala

íle

íle

Val

Ser

Val

Phe

Leu

Pro

Leu

Ala

? ro

Glu

His

Arg

115

120

125

Leu

Pro

Ala

Ala

Cys

Asp

Ala

Gly

Phe

Ala

Ala

Leu

Leu

Trp

Leu

Arg

130

135

140

Aso

Leu

Ser

Arg

Gin

Gin

Gly

HiS

Glu

Pro

Trp

Leu

Asn

Asp

Tyr

Ala

145

150

155

160

Asp

Phe

Asn

Arg

Val

Phe

Leu

íle

Gly

Aso

Ser

Ser

Gly

Gly

Asn

íle

165

170

175

Val

His

Gin

Val

Ala

Val

Lys

Ala

Glv

Glu

Glu

Asn

Leu

Ser

Pro

Met

180

135

190

Arg

Leu

Ala

Gly

Ala

íle

Pro

íle

His

P ro

Gly

Phe

Val

Arg

Ser

Tvr

195

200

205

Arg

Ser

Lys

Ser

Glu

Leu

Glu

Gin

Glu

Gin

Thr

Pro

Phe

Leu

Thr

Leu

210

215

220

Aso 225

Met

Val

Asp

Lys

Phe 230

Leu

Gly

Leu

Ala

Leu 235

Pro

Val

Gly

Ser

Asn 240

Lys

Asp

His

Gin

íle 245

Thr

Cys

Pro

Met

Glv 250

Glu

Ala

Ala

Pro

Ala 255

Val

Glu

Glu

Leu

Lvs 260

Leu

P ro

Pro

Tyr

Leu 265

Tyr

Cys

Val

Ala

Glu 270

Lys

Asp

Leu

íle

Lvs 275

Asp

Thr

Glu

Met

Glu 280

Phe

Tyr

Glu

Ala

Met 285

Lys

Lys

Gly

Glu

Lys 290

Asp

Val

Glu

Leu

Phe 295

íle

Asn

Asn

Gly

Val 300

Gly

His

Ser

Phe

Tyr 305

Leu

Asn

Lys

íle

Ala 310

Val

Arg

M.et

Asp

Pro 315

Val

Thr

Gly

Ser

Glu 320

Tb r-

Glu

Lys

Leu

Tvr 325

Glu

Ala

Val

Ala

Glu 330

Phe

íle

Asn

Lys

His 335

Informácie o s e k v e n c i i SEQ ID č. 3:

(i) chara k t e r i s t i k y sekvencie:

(A ) dĺžka: 93 párov zásad (B) typ: nukleová kyselina (C j počet reťazcov: jednoreťazcová (D) topológia: neznáma (íi) typ molekuly: genómová DNA ( i i í ) nie je hypotetická nie je anti-senze (xi ) znázornenie sekvencie SEQ ID Č. 3:

TTTGCCAAAA TGGTTCATGA AAAGCAAGTG ATAGAGGAAG TATCCGGCTG GCTTAGAGTT

Claims (18)

1. Rekombinantná sekvencia DNA obsahujúca oblasť zahrňujúcu nukleotidovú sekvenciu znázornenú v SEQ ID č. 1 alebo jej funkčný ekvivalent, a rekombinantná sekvencia zahrňujúca časť tejto oblasti alebo tohto ekvivalentu.

2. Rekombinantná sekvencia DNA obsahujúca oblasť zahrňujúcu nukleotidy 1413 až 2417 sekvencie znázornenej v SEQ ID č. 1 alebo jej funkčný ekvivalent, a rekombinantná sekvencia zahrňujúca časť tejto oblasti alebo tohto ekvivalentu.

3. Rekombinantná sekvencia DNA obsahujúca oblasť zahrňujúcu nukleotidy 1 až 1341 sekvencie znázornenej v SEQ ID č. 1 alebo jej funkčný ekvivalent, a rekombinantná sekvencia zahrňujúca časť tejto oblasti alebo tohto ekvivalentu.

Rekombinantná sekvencia

DNA obsahujúca ob 1 asť júcu nuk1eot i dy 1 až 651 sek vene ie znázornenej

SEQ

ID č. 1 alebo jej funkčný ňujúca časť tejto ekvivalent, a oblasti a 1ebo rekombinantná sek vene a z ah r tohto ekvivalentu.

5. Rekombinantná sekvencia DNA obsahujúca oblasť zahrňujúcu nukleotidy 652 až

1 34 1 sekvencie znázornenej v SEQ ID č.

1 alebo jej funkčný ekvivalent, a rekombinantná sekvencia zahrňujúca časť tejto oblast i alebo tohto ekvivalentu.

6. Rekombinantná sekvencia DNA obsahujúca oblasť zahrňu39 júcu nukleotidy 1195 až 1341 sekvencie znázornenej v SEQ ID č.

1 alebo jej funkčný ekvivalent, a rekombinantná sekvencia zahrňujúca časť tejto oblasti alebo tohto ekvivalentu.

7. Rekombinantná sekvencia DNA obsahujúca oblasť zahrňujúcu nukleotidy 1195 až 1268 sekvencie znázornenej v SEQ ID č. 1 alebo jej funkčný ekvivalent, a rekombinantná sekvencia zahrňujúca časť tejto oblasti alebo tohto ekvivalentu.

8. Rekombinantná sekvencia DNA, vyznačená tým, že obsahuje aspoň jednu oblasť alebo jej časť alebo jej ekvivalent podľa ľubovolného z nárokov 3 až 7 , pričom je táto oblasť alebo časť alebo ekvivalent umiestnená na 5'-strane od, a je operabilne naviazaná na sekvenciu kódujúcu p rote í n heterológneho génu alebo sekvenciu obsahujúcu nukleotidy 1413 až 2417 sekvencie znázornenej v SEQ ID č. 1 alebo jej funkčného ekvivalentu.

9. Rekombinantná sekvencia DNA podľa nároku 8, v y značená tým, že je v nej prítomná medzi uvedenou oblasťou alebo jej časťou alebo jej ekvivalentom a oblasťou kódujúcou proteín sekvencie DNA, v polohe smerom ku 3'-koncu oci nej, sekvencia zosilňujúca transláciu.

10. Rekombinantná sekvencia DNA podľa ľubovolného z nárokov 8 alebo 9, vyznačená tým, že heterológnym génom je markérový gén pre výber alebo vyhľadávanie, alebo gén, ktorého produkt je schopný poskytovať rezistenciu alebo toleranciu voči aspoň jednej z položiek skupiny zahrňujúcej hmyz, herbicídy, huby, baktérie a vírusy.

11. Rekombinantná sekvencia DNA podľa ľubovolného z nárokov 1 až 10, vyznačená tým, že sa v tejto rekombinantnej sekvencii pridal, odstránil alebo nahradil jeden alebo viac nukleotidov, bez toho, aby sa podstatne ovplyvnila jej funkcia alebo jej schopnosť kódovať aminokyseliny.

12. Rekombinantná sekvencia DNA podľa ľubovolného z nárokov 1 až 11, vyznačená tým, že je modifikovaná tak, že sa použijú kodóny, preferované organizmom, do ktorého sa má rekombinantná DNA inzertovať, takže sa expresiou takto modifikovanej DNA v hore uvedenom organizme získa v podstate podobný proteín ako expresiou nemodifikovanej rekombínantnej DNA v organizme, v ktorom sú komponenty rekombínantnej DNA, ktoré kódujú proteín, endogénne.

13. Sekvencia DNA, vyznačená tým, že je komplementárna ku sekvencii, ktorá za prísnych podmienkok hybridizuje s rekombinantnou sekvenciou DNA podľa ľubovolného z nárokov 1 až 12.

14. DNA-vektor, vyznačený t ý m , že obsahuje rekombinantnú sekvenciu DNA podľa ľubovolného z nárokov 1 až 12, alebo sekvenciu DNA podľa nároku 13.

Proteín získaný expresiou DNA podľa ľubovolného z nárokov 1 až 13.

16. Proteín, v y z n a č e n ý aminokyselín znázornenú v SEQ ID č. lent tejto sekvencie.

tým, že má sekvenciu

2, alebo funkčný ekviva41.

17. Mikroorganizmus alebo rastlinná bunka alebo protoplast, vyznačený tý m , že bol transformovaný rekombinantnou DNA podľa ľubovolného z nárokov 1 až 11 alebo sekvenciou DNA podľa nároku 12.

18. Rastlina, ktorej genóm obsahuje vektor podľa nároku

14, a v ktorej je exprimovaná rekombinantná DNA.

19. Rastlina podľa nároku 18, vybraná zo skupiny zahrňujúcej paradajku, piepor, mangovník, broskyňu, jabloň, hrušku, jahodu, banánovník, dyňu, repku a repicu typu canola, slnečnicu, tabak, cukrovú repu, pšenicu, jačmeň, ryžu, kukuricu, bavlník, zemiak, mrkvu, šalát, kapustu a cibuľu.

20. Potomstvo a semená rastlín podľa ľubovolného z nárokov 18 alebo 19, a semená a potomstvo tohto potomstva.