JPH06194366A - 特異物質測定法 - Google Patents

特異物質測定法

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JPH06194366A
JPH06194366A JP34681592A JP34681592A JPH06194366A JP H06194366 A JPH06194366 A JP H06194366A JP 34681592 A JP34681592 A JP 34681592A JP 34681592 A JP34681592 A JP 34681592A JP H06194366 A JPH06194366 A JP H06194366A
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JP
Japan
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casein
heat treated
treated casein
heat
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JP34681592A
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Shigeyuki Watanabe
繁幸 渡邊
Hiroshi Nagasaki
宏 長崎
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COSMO SOGO KENKYUSHO KK
Cosmo Oil Co Ltd
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COSMO SOGO KENKYUSHO KK
Cosmo Oil Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 特異物質認識反応を利用した特異物質測定法
において、特異物質認識反応時に、非特異的反応阻害剤
として熱処理したカゼインを共存させる特異物質測定
法。 【効果】 容易に入手可能な熱処理カゼインを非特異的
反応阻害剤として用いることにより、定量値に影響を及
ぼす、非特異的反応を防止し、高感度に特異物質測定を
行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は特異物質測定法に関し、
更に詳細には簡便な操作により非特異的反応を阻害し、
検体中の被測定物質を正確に測定する特異物質測定法に
関する。
【0002】
【従来の技術】近年、免疫学的測定法やレクチン−糖鎖
反応による測定法に代表される特異物質測定法は臨床検
査や生化学の分野で広く用いられている定量法であり、
基本的には被検体中の被測定物質のみを抗原抗体反応等
の特異物質認識反応により検出しようとする方法であ
る。このうち、免疫学的測定法は、反応形式により競合
法、サンドイッチ法等に、また検出のための標識手段に
より酵素免疫測定法(EIA)、放射線免疫測定法(R
IA)等に分類されている。更にこのうち、酵素免疫測
定法は、(1)酵素が放射線物質よりも長期に安定であ
り経済性に優れている、(2)操作方法が簡便で特殊な
装置や施設を必要としない等の理由から近年急速に普及
している。また、当該EIA法においては特にELIS
Aに代表されるサンドイッチ法が多用されている。
【0003】ところで当該特異物質測定法は、前述のよ
うに基本的に抗原と抗体との反応のように特異物質認識
反応を検出するものであるが、被検体としては被測定物
質以外の未知の物質が極めて多種、かつ多量含まれてい
る血清や血漿等が用いられる。これらの未知の物質の中
には被測定物質が関与する特異物質認識反応に悪影響を
及ぼす物質(妨害物質)が存在することが知られてい
る。この妨害物質としては、(1)特異物質認識反応を
直接妨害する物質、(2)特異物質認識反応には直接関
与しないが非特異的な反応を起こし、測定値に影響を与
える物質等がある。このうち、(1)については、原因
が判明すれば解決できるが、(2)については原因が不
明であるために解決が困難である。
【0004】かかる観点から、非特異的反応を阻害する
物質についての検討が広く行われており、例えばカゼイ
ンが非特異的反応阻害剤として有用であることが報告さ
れている(特開平1−217266号公報)。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】しかしカゼインを非特
異反応阻害剤として用いた場合、検体である体液中に混
入してくる内在性のペルオキシダーゼとカゼインが吸着
し、EIA法における正確な測定を妨害することがあ
る。例えば検体として溶血した血清を用いた場合、赤血
球中のグルタチオンペルオキシダーゼ等の吸着による妨
害である。また、カゼインを消化酵素等で処理した分解
物を利用する方法(特開平2−36353号公報)も提
案されているが、消化酵素等による処理は作業が煩雑で
非常に時間がかかる難点がある。従って、本発明の目的
は、簡便な操作で非特異的反応を阻害することによる高
精度な特異物質測定法、及びこれに用いる非特異的反応
阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】そこで本発明者らは免疫反応のような特異
物質認識反応における非特異的反応を高度に阻害し、標
識剤である酵素等に何ら悪影響を及ぼさない非特異的反
応阻害剤について種々検討した結果、全く意外にも熱処
理したカゼインを用いることにより上記課題が解決され
ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0007】すなわち、本発明は特異物質認識反応を利
用した特異物質測定法において、特異物質認識反応時
に、非特異的反応阻害剤として熱処理したカゼインを共
存させることを特徴とする特異物質測定法を提供するも
のである。また、本発明は熱処理したカゼインを含有す
る特異物質測定法における非特異的反応阻害剤を提供す
るものである。更に本発明は熱処理したカゼインを吸着
してなる固相担体を提供するものである。
【0008】本発明に用いられる熱処理したカゼイン
は、哺乳動物の乳汁中に多量に含まれるカゼインを蛋白
が変性する程度に加熱することにより得られる。ここで
用いられるカゼインとしては、例えば牛乳から精製した
カゼイン;α、β、γ等のカゼインの分画物;水酸基な
どを修飾した修飾カゼイン等が挙げられる。また、熱処
理は例えばカゼインを適当な溶媒、好ましくは緩衝液に
溶解し、0.001〜1000mg/mlの濃度に調整した
カゼイン溶液、好ましくは0.05〜10mg/mlの濃度
に調整したカゼイン溶液を、40〜250℃で数分〜数
十時間の熱処理、好ましくは60〜150℃にて15〜
45分間熱処理を行い変性させ、冷却することにより行
われる。また熱処理は、オートクレイブ処理のように加
圧状態であっても可能である。なお、変性したか否かは
抗カゼイン抗体の反応性によって確認できる。本発明で
用いることができるのは熱処理したカゼインであり、熱
処理した脱脂粉乳や更にそれを透析したものでは本発明
の効果を奏さない。この理由については明らかではない
が、脱脂粉乳に含まれるカゼイン以外の蛋白成分の影響
によるものと思われる。
【0009】熱処理したカゼインを利用した特異物質測
定法は、通常の免疫学的測定法やレクチン−糖鎖反応に
よる測定法における特異物質認識反応時に当該熱処理カ
ゼインを存在させることにより実施される。特異物質認
識反応系に熱処理カゼインを存在せしめるには、熱処理
カゼインを被検液、被測定物質を認識する物質を含有す
る液、及びその両者のいずれに添加してもよい。また、
熱処理カゼインは、溶液の形態で特異物質認識反応系に
導入してもよいが、固相担体に吸着させて導入してもよ
い。
【0010】熱処理カゼインを溶液の形態で導入する場
合には、特異物質認識反応時に熱処理カゼイン溶液を添
加してもよいが、予め通常希釈液として用いられる緩衝
液中に添加しておき、通常の操作手順により被検液、反
応試薬の希釈時に導入するのが好ましい。また、熱処理
カゼインを固相担体に吸着させて特異物質認識反応系に
導入するには、通常の特異物質測定法に用いられる担体
に熱処理カゼインを吸着させ、これを反応系に浸漬すれ
ばよい。ここで用いられる担体としては、ポリスチレン
等のスチレン系ポリマー類でつくられたプレートやビー
ズが好ましい。担体への熱処理カゼインの吸着は、担体
を熱処理カゼイン溶液中に浸漬することにより容易に行
われる。浸漬は0〜30℃、好ましくは2〜8℃にて十
数分〜一夜、好ましくは12時間以上で完了する。浸漬
終了後担体と溶液とを分離し、担体を再度防腐剤入りの
溶液で保存するか、あるいは乾燥させて、低温にて保存
すればよい。
【0011】本発明の測定法における熱処理カゼインの
添加量は、用いる被検液の種類により異なるが、例えば
反応系中に0.001〜100mg/ml、特に0.1〜2
0mg/mlとなるように添加するのが好ましい。
【0012】本発明の測定法は、特異物質認識反応時に
熱処理カゼインを存在せしめる以外は常法に従って行う
ことができる。従って、本発明の測定法には抗原抗体反
応を利用した免疫学的測定法及びレクチン−糖鎖反応を
利用した反応等が含まれる。また免疫学的測定法のう
ち、競合法、サンドイッチ法のいずれも含まれ、また標
識手段としてもRIA、EIAのいずれも含まれる。こ
のうち、EIA、特にペルオキシダーゼを用いたEIA
のサンドイッチ法、更に抗原又は抗体を固定化した固相
担体と被検液とを反応させるEIA法に適用するのが好
ましい。この抗原又は抗体を固定化した固相担体と被検
液を反応させる測定法の場合には、当該抗原又は抗体を
固定化した固相担体に熱処理カゼインを吸着させて使用
するのが好ましい。また、標識第2抗体を用いるサンド
イッチ法の場合には、固相担体だけでなく、標識第2抗
体溶液中にも熱処理カゼインを添加するのが好ましい。
【0013】なお、本発明の測定法に用いられる試験液
としては、特に制限されないが、血清、血漿、胸水、尿
等の体液成分が好ましい。被測定物質としては、胎児性
蛋白質、酵素、ホルモン等の蛋白類やレクチンを用いた
糖鎖類が好ましい。
【0014】
【発明の効果】本発明によれば容易に入手可能な熱処理
カゼインを非特異的反応阻害剤として用いることによ
り、定量値に影響を及ぼす非特異的反応を防止し、高感
度に特異物質測定を行うことができる。
【0015】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を説明するが、本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0016】実施例1 市販品である牛乳由来のカゼインを、2mg/mlになるよ
うに、10mMナトリウムを含む0.01Mリン酸緩衝液
(pH7.2)に溶解し(未処理)、その溶解液を100
℃にて30分間熱処理を行った。処理後、溶液を4℃ま
で冷却し、洗浄済みの6.4mmのポリスチレンビーズを
0.5ml/beadになるように溶液中にいれ、一夜4
℃で放置し、非特異的反応阻害担体を作製した。被検血
清として、健常人検体中に市販品であるヘモグロビン精
製品(内在性ペルオキシダーゼ含有)を5000mg/dl
添加した検体を用い、50μl試験管にいれた。次に標
識抗体としてHRP(Horseradish Per
oxidase)を標識した抗CEA抗体を200ng/
mlに調製し、この溶液を250μl添加した。次いで、
試験管内に非特異的反応阻害担体(ポリスチレンビー
ズ)を加え、室温にて2時間反応させ、洗浄した。洗浄
後担体を他の試験管に移し変え、OPD(オルトフェニ
ルジアミン)0.2%、過酸化水素0.02%からなる
基質液を250μl加え、30分間室温にて放置した後
1N硫酸1mlにより反応停止をさせ、492nmの吸光度
を測定した。
【0017】比較例1 熱処理しないカゼインを用いて実施例1と同様な操作で
非特異的反応阻害担体を作製し、実施例1と同様な方法
で測定を行った。
【0018】参考例1 内在性ペルオキシダーゼの非特異的反応を確認するため
に標識抗体を入れない標識抗体希釈液のみを用いて、実
施例1と同様な方法にて測定を行った。
【0019】実施例1、比較例1及び参考例1の結果を
表1に示す。その結果、標識抗体の有無は非特異的反応
量には関与がなく、標識抗体による非特異的反応ではな
いことが参考例1及び比較例1より確認された。更に、
従来の熱処理しないカゼインを非特異的反応阻害剤とし
て用いた場合(比較例1)に比べ、本発明の熱処理した
カゼインを非特異的反応阻害剤を用いた場合は有意に低
値を示し、高い非特異的反応阻害効果を示した。
【0020】
【表1】
【0021】実施例2及び3 市販品のカゼイン画分であるα−カゼイン(実施例
2)、β−カゼイン(実施例3)を用いて実施例1と同
様な方法にて非特異的反応阻害担体を作製し、実施例1
と同様の方法にて測定した。その結果、表2に示すよう
にカゼインの画分であるα−カゼイン、β−カゼインを
用いても本発明方法に高い効果を示した。
【0022】
【表2】
【0023】実施例4 市販品の抗CEA抗体をポリスチレンビーズに吸着させ
た後、これに実施例1と同様な方法にて熱処理カゼイン
を吸着させて抗体結合担体を作製し、実施例1と同様な
測定系を確立した。測定検体としては、添加血清に実施
例1で用いたヘモグロビンを0、100、300、50
0mg/dlに調製し、測定値への影響について検討した。
その結果、図1に示すように未処理カゼインを非特異的
反応阻害剤として用いたものは、ヘモグロビン濃度が高
くなると測定値も高値となり、誤差を生じたが、熱処理
カゼインを非特異的反応阻害剤として用いたものは、測
定値への影響はなく、正確な値を示した。
【0024】比較例2 市販品である脱脂粉乳を、2重量%になるように、10
mMナトリウムを含む0.01Mリン酸緩衝液(pH7.
2)に溶解し(未処理)、その溶解液を100℃にて3
0分間熱処理を行った。処理後、溶液を4℃まで冷却し
た。次に、透析膜を用いて3日間透析処理した。次に洗
浄済みの6.4mmのポリスチレンビーズを0.5ml/br
ead になるように溶液中に入れ、一夜4℃で放置し、非
特異的反応阻害担体を作製した。以降の操作は、実施例
1と同様の手順で行った。
【図面な簡単な説明】
【図1】非特異的反応阻害剤(熱処理カゼイン又は未処
理カゼイン)のヘモグロビン濃度変化によるCEA測定
値に及ぼす影響を示す図である。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 特異物質認識反応を利用した特異物質測
    定法において、特異物質認識反応時に、非特異的反応阻
    害剤として熱処理したカゼインを共存させることを特徴
    とする特異物質測定法。
  2. 【請求項2】 熱処理したカゼインが、被検液、被測定
    物質を認識する物質を含有する液、又はその両者に添加
    されるものである請求項1記載の特異物質測定法。
  3. 【請求項3】 熱処理したカゼインが、固相担体に吸着
    されるものである請求項1記載の特異物質測定法。
  4. 【請求項4】 熱処理したカゼインを含有する特異物質
    測定法における非特異的反応阻害剤。
  5. 【請求項5】 熱処理したカゼインを吸着してなる固相
    担体。
JP34681592A 1992-12-25 1992-12-25 特異物質測定法 Pending JPH06194366A (ja)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2535713A1 (en) 2011-06-16 2012-12-19 Fujifilm Corporation Highly sensitive immunochromatography method and immunochromatography kit

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP2535713A1 (en) 2011-06-16 2012-12-19 Fujifilm Corporation Highly sensitive immunochromatography method and immunochromatography kit
US8716032B2 (en) 2011-06-16 2014-05-06 Fujifilm Corporation Highly sensitive immunochromatography method and kit employing protein hydrolysates

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