JPH06157600A - タンパク質およびその他の分子を固定および架橋するための方法およびその使用 - Google Patents

タンパク質およびその他の分子を固定および架橋するための方法およびその使用

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JPH06157600A
JPH06157600A JP4015038A JP1503892A JPH06157600A JP H06157600 A JPH06157600 A JP H06157600A JP 4015038 A JP4015038 A JP 4015038A JP 1503892 A JP1503892 A JP 1503892A JP H06157600 A JPH06157600 A JP H06157600A
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chelating
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レスリー・デリーマー・アンダーソン
Gary Samuel David
ゲイリー・サミュエル・デイビッド
Susan Marie Hochschwender
スーザン・マリー・ホフシュヴェンダー
Mary Seybold Kasher
メアリー・シーボルド・カッシャー
Michele Ceceil Smith
ミシェル・セシル・スミス
William Peter C Stemmer
ウィリアム・ペーター・クリスティアーン・ステマー
James Allen Cook
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は、生物学的に活性な分子またはリポ
ーターグループと遷移金属イオンの間で動力学的に不活
性な錯体を形成させる方法を提供する。また本発明は、
固体支持体上でＩＰまたは受容体を精製する方法を提供
する。さらに本発明は、金属結合部位を有する２または
それ以上の生物学的に活性な分子またはリポーターグル
ープを架橋させることによって、ヘテロ二量化、ホモ二
量化または多量化錯体を形成させる方法を提供する。 【効果】 本発明の動力学的に不活性な[固定化金属／
ＣＰ−タンパク質]錯体は、固定化ＣＰ−タンパク質と
種々のリガンドのいずれかの相互作用を調べるのに有用
な測定系の成分を与える。本発明の方法を利用してＩＰ
またはその他の生物学的に活性な分子を固定することに
より、これらの分子を、アフィニティークロマトグラフ
ィー系において抗原またはリガンド結合部位の暴露が最
大になるように配向させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、タンパク質を固定化お
よび精製するための方法を提供するものである。本発明
は、ＣＰ−タンパク質と結合金属イオンの間で動力学的
に不活性な錯体を形成させるための金属結合部位を保持
している生物学的に活性な分子またはリポーターグルー
プと遷移金属イオンの間で動力学的に不活性な錯体を形
成させるための方法を提供するものである。また、本発
明は、固体支持体上でＩＰまたは受容体を精製する方法
を提供するものである。さらに、本発明は、金属結合部
位を有する２またはそれ以上の生物学的に活性な分子ま
たはリポーターグループを架橋させることによって、ヘ
テロ二量化、ホモ二量化または多量化錯体を形成させる
方法を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】固定化金属イオンアフィニティークロマ
トグラフィー(ＩＭＡＣ)はタンパク質の精製に用いられ
る方法である。この方法は、遷移金属に結合する一部タ
ンパク質の天然の能力に基づいている[Porath,J., Carl
sson,J., Olsson,I., and Belfrage,G. (1975) Nature
258, 598-599]。遷移金属に対するタンパク質の親和性
は、金属イオンと相互作用し、それと結合するタンパク
質の１次構造中のアミノ酸の性質に由来する。しかし、
このような金属／タンパク質の結合の生成は、全てのタ
ンパク質が金属と結合するアミノ酸配列を保持している
訳ではないことからランダムである。また、金属イオン
に対する結合の強さは特定のタンパク質によって変化
し、予測することができない。さらに、ある混合物中の
２またはそれ以上のタンパク質分子がそのような金属結
合配列を保持しているときには、精製法としてのこの方
法の有用性は、両方が固定化金属イオンに結合すること
により減少する。
【０００３】ＩＭＡＣ法のこれらの欠点は、この天然の
タンパク質−金属の結合現象を利用することによってタ
ンパク質の精製のための予測可能かつ特異的な方法を与
えるＣＰ−ＩＭＡＣ法の出現によって解決された。この
「ＣＰ−ＩＭＡＣ」なる語句は、「キレート化ペプチ
ド」を用いて固定化金属イオンを特異的に結合させ、Ｉ
ＭＡＣの原理によってこのようなキレート化ペプチドを
含有するタンパク質を精製することを反映したものであ
る。キレート化ペプチドは、金属イオンと相互作用して
これに結合するように特別に設計された短いアミノ酸配
列である[Smith,M.C., Furman,T.C., Ingolia,T.D., Pi
dgeon,C. (1988) J.Biol.Chem. 263, 7211-7215]。キレ
ート化ペプチドを保持しているタンパク質(本明細書で
はＣＰ−タンパク質と呼ぶ)は、固定化金属イオンに高
い特異性で比較的安定に結合するであろう。これによ
り、カラムから全ての非特異的にまたは弱く結合したタ
ンパク質を除去し、その後に精製ＣＰ−タンパク質を単
離することが可能になる。所望なら、次にこのＣＰ−タ
ンパク質を酵素によってまたは化学的に処理してキレー
ト化ペプチドを除去し、所望の精製タンパク質だけを残
すことができる。しかし、ＣＰ−ＩＭＡＣの利用は、Ｃ
Ｐ−タンパク質／金属錯体の永久的ではない性質によっ
て制限されている。タンパク質を支持マトリックスにさ
らに永久的に結合させることができるなら、タンパク質
との関係においてキレート化ペプチドを利用することを
他の多くの応用に拡張することができる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＣＰ−ＩＭ
ＡＣ法によってＣＰ−タンパク質を金属イオンに結合さ
せ、次いで金属イオンの酸化状態を変化させて、ＣＰ−
ＩＭＡＣ法で使用される不安定な錯体を動力学的に不活
性な錯体に変換することによる、ＣＰ−タンパク質と金
属イオンの間の動力学的に不活性な錯体を形成させるた
めの可逆的な方法を開示するものである。
【０００５】本発明は、結合媒体として金属イオンを使
用することによって分子を架橋する方法を提供するもの
である。本発明は、以下の詳細な説明および特許請求の
範囲に記載したように広い応用可能性を有している。本
結合方法を利用することによって創製される二官能性分
子は広い応用範囲を有している。分子を架橋するための
他の化学的手段が存在しているが、以下に説明するキレ
ート化ペプチドおよび有機キレート化種によって得られ
る金属イオンに対する特異性は、分子中の特定の位置
に、特に分子がタンパク質であるときにその特定の位置
に、結合が生じるように結合を操作することを可能にす
る。
【０００６】また、本発明は、生物学的測定系において
タンパク質を使用する際に、およびタンパク質の精製に
おいて有用な、タンパク質を固定化するための単純化か
つ改良された方法を提供するものである。常法によれ
ば、通常、ＣＰ−ＩＭＡＣ法または他の方法でタンパク
質を精製し、クロマトグラフィーカラムから精製タンパ
ク質を溶離し、次いでアフィニティー測定法において使
用するために、この精製タンパク質を固定化するであろ
う第２のカラム材料にこの精製タンパク質を再導入す
る。しかし、このような方法は、アフィニティー測定カ
ラムを調製するために複数の工程と少なくとも２種類の
異なる固体支持体を必要とする。本発明は、ＣＰ−ＩＭ
ＡＣ法に改良を加えることによって、既存の方法を単一
のカラム操作に単純化するものである。
【０００７】本発明の要旨は、内生の金属結合部位を保
持しているか、またはそれを含むように修飾した生物学
的に活性な分子またはリポーターグループと遷移金属イ
オンの間で動力学的に不活性な錯体を形成させることか
らなる。本発明の方法によれば、ＣＰ−ＩＭＡＣ法によ
ってタンパク質を精製する際に使用する金属イオンを酸
化または還元して、ＣＰ−タンパク質と結合金属イオン
の間で動力学的に不活性な錯体を形成させる。この動力
学的に不活性な[固定化金属／ＣＰ−タンパク質]錯体
は、種々の配位子のいずれかと固定化ＣＰ−タンパク質
の相互作用を調べる際に有用な測定系の成分を与える。
本発明は、ＣＰ−ＩＭＡＣ法に固有の特異性を利用する
ものであるが、さらに簡素かつ有効な測定系の開発に新
しい道を開くものである。
【０００８】さらに、本発明は、固体支持体上でＩＰま
たは受容体を精製する方法を提供するものである。例え
ば、固定化されたＣＰ誘導体化されたタンパク質を用い
てこのタンパク質に対する抗体を単離および精製するこ
とができる。本発明の方法を用いるＩＰまたは他の生物
学的に活性な分子の固定化によって、これらの分子を、
アフィニティークロマトグラフィー系において抗原また
は配位子結合部位の暴露が最大になるように配向させる
ことができる。１つの例として、医学診断用の試験キッ
トはＩＰを利用して疾病状態に特徴的な抗原の存在を示
している。本発明は、このような系においてＩＰの利用
性および効率を高めるようにＩＰを配向させるのに有用
な方法を提供するものである。
【０００９】また、本発明は、内生の金属結合部位を有
するか、または金属結合部位を含むように修飾された２
またはそれ以上の生物学的に活性な分子またはリポータ
ーグループを架橋させることによって、ヘテロ二量化、
ホモ二量化または多量化錯体を形成させる方法を提供す
るものである。
【００１０】図面の説明 添付の図面に示した制限部位および機能地図は、本明細
書中で議論する組換えＤＮＡベクターのおよその表示で
ある。この制限部位の情報は完全なものではない。即
ち、図面に表示されている制限部位よりもさらに多くの
ある種の制限部位がベクター上に存在していることもあ
る。図１は、ＣＰ−Ｅ７融合腫瘍タンパク質とＲＢ抗-
腫瘍タンパク質を用いる本明細書中に例示の測定系を図
式的に示すものである。図２は、プラスミドpＨＰＶ１
６の制限部位および機能地図である。図３は、プラスミ
ドpＣＺＲ３２２の制限部位および機能地図である。図
４は、プラスミドp１６Ｅ７の制限部位および機能地図
である。図５は、プラスミドp１６Ｅ７eの制限部位およ
び機能地図である。図６は、プラスミドpＡbＴ９３００
の制限部位および機能地図である。図７は、プラスミド
pＢlueＢacＲＢの合成の工程図である。図８は、プラス
ミドpＢlueＢacの制限部位および機能地図である。図９
は、プラスミドpＢlueＢacＲＢの制限部位および機能地
図である。図１０は、プラスミドpＲＢ60の合成の工程
図である。図１１は、プラスミドpＲＢ60の制限部位お
よび機能地図である。図１２は、プラスミドpＪＥＣＭ
Ｆv６の創製の工程図である(前半部)。図１３は、プラ
スミドpＪＥＣＭＦv６の創製の工程図である(後半部)。
図１４は、プラスミドpＵＣ１８の制限部位および機能
地図である。図１５は、プラスミドＶec１６ＣＨＡＫの
制限部位および機能地図である。図１６は、プラスミド
pＵＣＥＭＦv１の制限部位および機能地図である。図１
７は、プラスミドpＪＣＥＭＦv６の制限部位および機能
地図である。
【００１１】図１８は、ＣＨＥＬ培地をＩＭＡＣクロマ
トグラフィーにかけた結果を示すグラフである。培地
(２０ml)を２.５mlまで濃縮し、１.０ml／分で２.×３
０mmのＮi(II) ＩＭＡＣカラムにかけた。結合したタン
パク質を一連の段階勾配液で溶離した。段階１：５０％
緩衝液Ａ、５０％緩衝液Ｂ(pＨ５.８)；段階２：１００
％緩衝液Ｂ；段階３：１００％緩衝液Ａ；段階４：１０
０％緩衝液Ｃ。図１９は、図１８で行なったＩＭＡＣ由
来の分画をＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析にかけた結果を示すも
のである。タンパク質を、ＤＴＴの非存在下に１０％ゲ
ル上で分離した。レーン１および１０：高Ｍw標準；レ
ーン２：pＨ８洗浄；レーン３：pＨ４.２５洗浄；レー
ン４：pＨ７.５洗浄；レーン５および６：グリシン洗浄
分画；レーン８：カラム流出；レーン９：ＣＨＥＬ１３
培地。図２０は、Ａ：抗ヒトＩgＧ重鎖およびＢ：抗ヒ
トＩgＧ軽鎖を用いたＩＭＡＣ分画のウエスタン・ブロ
ット分析の結果を示すものである。レーン１：グリシン
洗浄分画；レーン２：pＨ４.２５洗浄；レーン３：pＨ
５.８洗浄；レーン４：カラム流出；レーン５：ＣＨＥ
Ｌ１３培地。図２１は、ＩＭＡＣ分画の非還元および還
元ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析の結果を示すものである。レー
ン１〜５は非還元であり、レーン７〜９は還元である。
レーン１：高Ｍw標準；レーン２：ＸＣＥＭ対照抗体；
レーン３：ＣＨＥＬ１３培地；レーン４：カラム流出；
レーン５：グリシン洗浄分画；レーン６および１０：ブ
ランク；レーン７：低Ｍw標準；レーン８：ＸＣＥＭ対
照抗体；レーン９：グリシン洗浄分画。
【００１２】図２２は、ＣＨＥＬ培地(血清不含培地に
一層適合させた細胞)をＩＭＡＣクロマトグラフィーに
かけた結果を示すグラフである。培地(３００ml)を９.
９ml／分で４.６×５０mmのＩＭＡＣカラムにかけた。
結合したタンパク質を３.０ml／分で一連の段階勾配液
により溶離した。段階１：５０％緩衝液Ａ、５０％緩衝
液Ｂ(pＨ５.８)；段階２：１００％緩衝液Ｂ；段階３：
１００％緩衝液Ａ。最後の勾配段階は１００％Ａから１
００％Ｃまでの１０分間勾配であった。図２３は、図２
２からのグリシン勾配分画の非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分
析の結果を示すものである。レーン２：高Ｍw標準；レ
ーン３：分画３９；レーン４：分画４０；レーン５：分
画４２；レーン６：分画４３。図２４は、１２マイクロ
メーター・スキャナー・ヘッド(scanner head)と１００
マイクロメーター・カンチレバー(cantilever)を用い、
ＰＢＳ(pＨ７)のもとで得た、新たに切断したマイカ表
面の原子力顕微鏡イメージ(像)である。この力は約１０
-7ニュートンであった。図２５は、ニッケル注入したマ
イカ表面の原子力顕微鏡イメージである。１mＭの塩化
ニッケル(５μl)を新たに切断したマイカ表面にスポッ
トし、１分間静置し、Ｍilli-ＱR水ですすいだ。これを
室温で２０分間風乾し、１２マイクロメーター・スキャ
ナー・ヘッドと１００マイクロメーター・カンチレバー
を用いてＰＢＳ(pＨ７)のもとで像を造らせた。力は約
１０-9ニュートンであった。
【００１３】図２６は、マイカ−ＣＨＥＬ１３の原子力
顕微鏡イメージである。０.５μg／mlのＣＨＥＬ１３
(１００μl)を新たに切断したマイカ表面上の液体セル
中に注入し、マイカ表面と１０分間接触させた。次い
で、この液体セルをリン酸緩衝食塩水で洗い流し、１２
マイクロメーター・スキャナー・ヘッドと１００マイク
ロメーター・カンチレバーを用いてＰＢＳ(pＨ７)のも
とで像を造らせた。力は約１０-9ニュートンであった。
図２７は、ＸＣＥＭ４４９を伴うマイカ−ニッケルの原
子力顕微鏡イメージである。１mＭの塩化ニッケル(５μ
l)を新たに切断したマイカ表面にスポットし、１分間静
置し、Ｍilli-ＱR水ですすいだ。これを室温で２０分間
風乾し、液体セルに結合させた。０.５μg／mlのＸＣＥ
Ｍ４４９抗体(１００μl)をこの液体セル中に１０分間
注入し、次いでＰＢＳで洗い流した。１２マイクロメー
ター・スキャナー・ヘッドと１００マイクロメーター・
カンチレバーを用いてＰＢＳのもとで像を造らせた。力
は約１０-8ニュートンであった。図２８は、ＣＨＥＬ１
３に暴露したニッケル注入マイカ表面の原子力顕微鏡イ
メージである。１mＭの塩化ニッケル(５μl)を新たに切
断したマイカ表面にスポットし、１分間静置し、Ｍilli
-ＱR水ですすいだ。これを室温で２０分間風乾し、液体
セルに結合させた。０.５μg／mlのＣＨＥＬ１３(１０
０μl)をこの液体セル中に注入し、ニッケル注入マイカ
表面と１０分間接触させた。次いで、この液体セルをＰ
ＢＳで洗い流し、１２マイクロメーター・スキャナー・
ヘッドと１００マイクロメーター・カンチレバーを用い
てＰＢＳのもとで像を造らせた。力は約１０-8ニュート
ンであった。図２９は、結合ニッケルを含むＣＨＥＬ１
３に暴露したニッケル注入マイカ表面の原子力顕微鏡イ
メージである。１mＭの塩化ニッケル(５μl)を新たに切
断したマイカ表面にスポットし、１分間静置し、Ｍilli
-ＱR水ですすいだ。これを室温で２０分間風乾し、液体
セルに結合させた。０.５μg／mlのＣＨＥＬ１３(１８
０μl)を１０mＭの塩化ニッケル(２０μl)と３０分間プ
レインキュベートした。この物質(１００μl)を液体セ
ル中に注入し、ニッケル−マイカ表面と１０分間インキ
ュベートした。次いで、この液体セルをＰＢＳで洗い流
し、１２マイクロメーター・スキャナー・ヘッドと１０
０マイクロメーター・カンチレバーを用いてＰＢＳのも
とで像を造らせた。力は約１０-9ニュートンであった。
【００１４】定 義 Ａla：アミノ酸 アラニン。 類似体：別の化合物と機能的に類似しているが、異なっ
た構造を有している化合物。 抗−腫瘍遺伝子：細胞の増殖を制御するのに関与してい
る腫瘍抑制遺伝子。この種の遺伝子の不活性化は、癌に
おけるように調節されない細胞増殖を導く。 抗−腫瘍タンパク質：抗−腫瘍遺伝子によってコードさ
れている細胞増殖を調節するポリペプチド。 Ａrg：アミノ酸 アルギニン。 Ａsn：アミノ酸 アスパラギン。 Ａsp：アミノ酸 アスパラギン酸。 塩基対(bp)：ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。Ａ、Ｃ、Ｇ、
およびＴの短縮形は、それらがＤＮＡ分子中に現れると
きに、それぞれ５'-モノホスフェート形のヌクレオチド
(デオキシ)アデニン、(デオキシ)シチジン、(デオキ
シ)グアニン、および(デオキシ)チミンに対応する。
Ｕ、Ｃ、Ｇ、およびＴの短縮形は、それらがＲＮＡ分子
中に現れるときに、それぞれ５'-モノホスフェート形の
ヌクレオシドウラシル、シチジン、グアニン、およびチ
ミンに対応する。２本鎖ＤＮＡにおいては、塩基対はＡ
とＴまたはＣとＧの対を指す。ＤＮＡ／ＲＮＡのヘテロ
２本鎖においては、塩基対はＴとＵまたはＣとＧの対を
指す。
【００１５】生物学的に活性な分子(ＢＡＭ)：ＩＰ、タ
ンパク質、ヌクレオチド、脂質、炭水化物、酵素、薬物
および補助因子からなる群から選ばれる化合物を指す。 ＣＨＥＬ１３：重鎖のカルボキシ末端にキレート化ペプ
チドを導入するように修飾したＸＣＥＭ４４９抗体[Bei
dlerら, (1988) J.Immunology 141: 453-460；参考とし
て本明細書の一部を構成する]。 キレート化ペプチドまたはキレート性ペプチド(ＣＰ)：
複数の配位部位を有する金属イオンと錯体化することが
できるアミノ酸配列。別の分子と結合させてＣＰの表示
を行なうときは(例えば、ＣＰ−酵素)、その分子がキレ
ート化ペプチドに共有結合していることを示す。 キレート化剤(キレーター)：有機キレート化剤またはキ
レート化ペプチド。 ＣＰ−Ｅ７：キレート化ペプチドに共有結合したＥ７腫
瘍タンパク質またはその機能的誘導体のアミノ酸配列か
らなる融合タンパク質。 ＣＰ−固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフ
ィー(ＣＰ−ＩＭＡＣ)：米国特許Ｎo.4,569,794(この教
示の全ては参考として本明細書の一部を構成する)に記
載のように、配位して錯体化した金属イオンを保持する
固体支持体に、キレート化ペプチドを含む融合タンパク
質または遊離のキレート化ペプチドを結合させる方法。
【００１６】 ＣＰ−ＲＢ：キレート化ペプチドに共有結合したＲＢ
抗-腫瘍タンパク質またはその機能的誘導体のアミノ酸
配列からなる融合タンパク質。 ＣＰ−タンパク質：キレート化ペプチドに直接または間
接的に共有結合したタンパク質のアミノ酸配列からなる
タンパク質。 ＣＰ−分子：ある分子に直接または間接的に共有結合し
たキレート化ペプチドのアミノ酸配列からなるハイブリ
ッド分子。 Ｃys：アミノ酸 システインまたは別の半分のシステイ
ン残基にジスルフィド架橋によって共有結合した半分の
システイン残基。 ＤＮＡ：デオキシリボ核酸。 Ｅ７：ヒト乳頭腫ウイルスゲノムのＥ７遺伝子から導か
れる腫瘍タンパク質またはその機能的誘導体。 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸の短縮形。 機能的類似体：天然型の分子または化合物と比較して、
類似した機能的性質を有しているが、しかし修飾された
構造を有している分子を指す。機能的類似体には、親分
子と類似した機能的性質および反応性を有する親分子の
フラグメントまたは親分子への付加体が含まれる。
【００１７】 融合タンパク質：異種の供給源から導かれた２種類のア
ミノ酸配列の結合体からなるポリペプチドを指す。 融合腫瘍タンパク質：あるアミノ酸配列が腫瘍タンパク
質のアミノ酸配列を含有している融合タンパク質。 Ｇln：アミノ酸 グルタミン。 Ｇlu：アミノ酸 グルタミン酸。 Ｇly：アミノ酸 グリシン。 Ｈis：アミノ酸 ヒスチジン。 ＩＤＡ：イミノジ酢酸の短縮形。 ＩＭＡＣ：固定化金属イオンアフィニティークロマトグ
ラフィーの短縮形。 免疫反応性タンパク質(ＩＰ)：抗体、抗体フラグメント
(Ｆab、Ｆab'、Ｆab2'、およびＦvフラグメントなどで
あるが、これらに限定はされない)、およびキメラ、ヒ
ト化またはＣＤＲ−グラフト化した抗体(これらを導い
た親の抗体分子と同様、類似の性質を有する抗原を結合
することができる)、ならびに「１本鎖ポリペプチド結
合分子」(ＰＣＴ出願 Ｎo.PCT/US 87/02208、国際公開
Ｎo.WO 88/01649、国際公開日 1988年3月10日；この教
示の全ては参考として本明細書の一部を構成する)を包
括的に記述するのに用いる用語である。ＩＰには、Ｊea
n Ｐierre Ｍach and associatesが開示しているような
ＭＡＢ３５、ＣＨＡ２５５、ＣＥＭ２３１、およびＸＣ
ＥＭ４４９(Beidlerら)が含まれる。
【００１８】 Ｉle：アミノ酸 イソロイシン。 Ｌeu：アミノ酸 ロイシン。 Ｌys：アミノ酸 リジン。 Ｍet：アミノ酸 メチオニン。 Ｍilli-ＱR水：Ｍillipore Ｃorporation[Ashby Road,
Bedford, MA 01730]から入手できるＭilli-ＱR濾過シス
テムで精製された水。 mＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ。 ＭＷＣＯ：分子量カットオフ(排除)の短縮形。 腫瘍遺伝子：腫瘍タンパク質をコードしている遺伝子。 腫瘍タンパク質：細胞が新生物として形質転換されるよ
うに、細胞の正常な代謝制御および代謝に影響を与え
る、腫瘍遺伝子によってコードされているポリペプチ
ド。 有機キレート化剤：イミノジ酢酸、ニトリロトリ酢酸、
テルピリジン、ビピリジン、トリエチレンテトラアミ
ン、ビエチレントリアミンなどの二座配位子、三座配位
子、四座配位子、三脚配位子、および大環式配位子。
【００１９】 Ｏrn：アミノ酸 オルニチン。 ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水の短縮形。 Ｐhe：アミノ酸 フェニルアラニン。 プラスミド：染色体外の自己複製型の遺伝子要素。 ＰＭＳＦ：フッ化フェニルメチルスルホニルの短縮形。 Ｐro：アミノ酸 プロリン。 ＲＢタンパク質：Ｆriend,Ｓ.Ｈ.ら[P.N.A.S.-U.S.A. 8
4: 9059-9063 (1987)]が開示しているようなＤＮＡ配列
を含有するヒト網膜芽腫遺伝子から導いた抗−腫瘍タン
パク質またはその機能的誘導体。 リーディングフレーム(読み枠)：翻訳装置であるtＲＮ
Ａ、リボソームおよび関連因子によってトリプレットで
「読まれる」翻訳が起こるヌクレオチド配列である。こ
こで、それぞれのトリプレットは特定のアミノ酸に対応
している。それぞれのトリプレットが異なっており、同
じ長さを有しているので、暗号配列は３の倍数でなけれ
ばならない。塩基対の挿入または削除(フレームシフト
突然変異と呼ばれる)により、同一のＤＮＡセグメント
によってコードされている２種類の異なるタンパク質が
得られることになる。これに対する保証を行なうため
に、所望のポリペプチドに対応するトリプレットコドン
を開始コドンから３の倍数で並べなければならない。即
ち、正しい「リーディングフレーム」が維持されなけれ
ばならない。キレート化ペプチドを含有する融合タンパ
ク質の創製の際には、構造タンパク質をコードしている
ＤＮＡ配列のリーディングフレームをキレート化ペプチ
ドをコードしているＤＮＡ配列において維持しなければ
ならない。
【００２０】 組換えＤＮＡクローニングベクター：１またはそれ以上
の別のＤＮＡセグメントを付加したかまたは付加するこ
とができるＤＮＡ分子からなるあらゆる自律的に複製す
る媒体であって、プラスミドおよびファージを含むが、
これらに限定はされない。 組換えＤＮＡ発現ベクター：プロモーターが導入された
あらゆる組換えＤＮＡクローニングベクター。 レプリコン：プラスミドまたは他のベクターの自律的な
複製を可能にし、それを制御するＤＮＡ配列。 リポーター分子(または、リポーターグループ)：診断に
応用する際に通常用いられる化合物、例えば視覚性の染
料、蛍光キレート化剤、放射活性化合物、および光度測
定法において有用な性質を有するその他の化合物を指
す。 ＲＮＡ：リボ核酸。 ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィーの短
縮形。 Ｓer：アミノ酸 セリン。 １本鎖ポリペプチド結合分子：ＰＣＴ国際特許出願 Ｎ
o.PCT/US87/02208(国際公開 Ｎo.WO 88/01649のもとで1
988年3月10日公開)に記載されているような免疫学的特
異性を保持しているポリペプチド。
【００２１】 固体支持体：多孔性膜、ビーズ、微小粒子、クロマトグ
ラフィー用樹脂、微量滴定プレート、マイカ(雲母)など
の形態の不溶性の天然または合成ポリマー。 スペーサー：１〜５０個のモノマー単位で構成されるポ
リペプチド、タンパク質、ポリサッカリド、ポリヌクレ
オチドまたは合成の有機部分を指す。 Ｔhr：アミノ酸 トレオニン。 転写：ＤＮＡのヌクレオチド配列中に含まれる情報が相
補性のＲＮＡ配列に移される過程。 翻訳：メッセンジャーＲＮＡの遺伝情報を用いてポリペ
プチド鎖の合成を指定および指令する過程。 トリス：トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの短縮
形。 Ｔrp：アミノ酸 トリプトファン。 Ｔyr：アミノ酸 チロシン。 Ｖal：アミノ酸 バリン。 ベクター：適当なコントロール配列と結合させたときに
形質転換しようとする宿主細胞に特定の性質を付与す
る、適当なタンパク質分子に対応するポリヌクレオチド
配列を保持している遺伝子操作に用いるレプリコンであ
る。プラスミド、ウイルス、およびバクテリオファージ
はそれ自体が本来レプリコンであるので、これらが適当
なベクターである。制限酵素およびリガーゼを用いて異
なる供給源由来のＤＮＡ分子を切断および結合すること
によって人工的なベクターが構築される。ベクターに
は、組換えＤＮＡクローニングベクターおよび組換えＤ
ＮＡ発現ベクターが含まれる。ベクターが細菌細胞に導
入されたときには、この過程は形質転換と呼ばれる。真
核細胞における同様の過程はトランスフェクションと呼
ばれる。 Ｘ-ガル：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル β
−Ｄ−ガラクトシドの短縮形。
【００２２】
【課題を解決するための手段】本発明は、生物学的に活
性な分子、リポーター分子、または固体支持体に共有結
合した２またはそれ以上の同一または異なるキレート化
剤との動力学的に不活性な遷移金属錯体の製造方法であ
って、(a)遷移金属と２またはそれ以上の同一または異
なるキレート化剤を用いて動力学的に不安定な遷移金属
錯体を調製し；そして(b)該金属イオンの酸化状態を変
化させて動力学的に不活性な遷移金属錯体を形成させ
る；ことからなる方法を提供するものである。最初に金
属イオンを単純にその動力学的に不活性な酸化状態で用
いるよりも、金属イオンを不安定な酸化状態で用いて金
属結合部分を含む分子の間で錯体を形成させることに重
要な利点が存在する。即ち、不活性な酸化状態にある金
属イオンとキレート化ペプチド含有の分子の間で錯体を
直接的に形成させるのは、実際的な用途を持つには遅す
ぎるであろう。共有結合架橋法を凌ぐ動力学的に不活性
な金属イオン架橋の利点の１つは、適当な酸化還元試薬
を加えることによって架橋をもう一度不安定なものにす
ることができることである。結合の可逆性の可能性は、
固相に固定したタンパク質の分析に著しい利点を与え、
マトリックスに結合したこれら試薬を再利用する機会を
与える。
【００２３】本発明は、以下の式で示される化合物を提
供するものである： [ＢＡＭ−(スペーサー)x−キレート化剤]n−(Ｍ) {式中、ＢＡＭは生物学的に活性な分子であり；スペー
サーは、１〜５０個のモノマー単位で構成されるポリペ
プチド、タンパク質、ポリサッカリド、ポリヌクレオチ
ドまたは合成の有機部分であり；キレート化剤は、有機
キレート化剤またはキレート化ペプチドであり；Ｍは、
動力学的に不活性な遷移金属イオン錯体を形成しうる遷
移金属イオンであって、かつ、動力学的に不活性な酸化
状態にあり；ｎは１〜４であり(ここで、それぞれの[Ｂ
ＡＭ−(スペーサー)x−キレート化剤]は同一または異な
っている)；そしてｘは０または１である}。
【００２４】また、本発明は、以下の式で示される化合
物を提供するものである： [ＢＡＭ−(スペーサー1)x−キレート化剤1−(Ｍ)−キレ
ート化剤2−(スペーサー2)y]n−固体支持体 {式中、ＢＡＭは生物学的に活性な分子またはリポータ
ーグループであり；スペーサーは、１〜５０個のモノマ
ー単位で構成されるポリペプチド、タンパク質、ポリサ
ッカリド、ポリヌクレオチドまたは合成の有機部分であ
り；キレート化剤は、有機キレート化剤またはキレート
化ペプチドであり；Ｍは、動力学的に不活性な遷移金属
イオン錯体を形成しうる遷移金属イオンであって、か
つ、動力学的に不活性な酸化状態にあり；ｘは０または
１であり；ｙは０または１であり；ｎは固体支持体に結
合した単位の数である}。本発明の好ましい態様では、
核は本明細書中に定義したような固体支持体である。さ
らに、核は、１〜５０個のモノマー単位で構成されるポ
リペプチド、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリサッ
カリド、または合成の有機部分を必要とする(ここで、
この核はそれに共有結合した少なくとも２個のキレート
化剤を有している)。
【００２５】さらに、本発明は、それぞれの遷移金属イ
オン錯体モノマーが以下の式で示される基である不均質
または均質な遷移金属イオンポリマーを提供するもので
ある： [(Ｍ)−キレート化剤1−(スペーサー1)x−ＢＡＭ−(ス
ペーサー2)y−キレート化剤2−]n {式中、ＢＡＭは生物学的に活性な分子またはリポータ
ーグループであり；スペーサーは、１〜５０個のモノマ
ー単位で構成されるポリペプチド、タンパク質、ポリサ
ッカリド、ポリヌクレオチドまたは合成の有機部分であ
り；キレート化剤は、有機キレート化剤またはキレート
化ペプチドであり；Ｍは、動力学的に不活性な遷移金属
イオン錯体を形成しうる遷移金属イオンであって、か
つ、動力学的に不活性な酸化状態にあり；そして、それ
ぞれのモノマー単位において、スペーサー1とスペーサ
ー2は同一または異なっており；キレート化剤1とキレー
ト化剤2は同一または異なっており；ｘは０または１で
あり；ｙは０または１であり；そしてｎは１〜１０6で
ある}。
【００２６】上記の本発明化合物において有用な遷移金
属イオンには、Ｖ(II)、Ｃr(III)、Ｍn(IV)、Ｆe(II)、
Ｉr(III)、Ｒu(II)、Ｏs(II)、Ｃo(III)、Ｒh(III)、Ｐ
d(IV)、またはＰt(IV)が含まれる。本発明の好ましい態
様においては、遷移金属イオンはＣr(III)、Ｒu(II)、
またはＣo(III)からなる群から選ばれる。本明細書に例
示した本発明の最も好ましい態様においては、遷移金属
イオンはＣo(III)である。
【００２７】上記の化合物を記述する際に用いるキレー
ト化剤なる用語は、二座配位子、三座配位子、四座配位
子、三脚配位子、および大環式配位子からなる群から選
ばれる有機キレート化剤を指す。本発明の好ましい態様
においては、少なくとも１つの該キレート化剤は、イミ
ノジ酢酸、ニトリロトリ酢酸、テルピリジン、ビピリジ
ン、トリエチレンテトラアミン、ビエチレントリアミン
およびその誘導体からなる群から選ばれる有機キレート
化剤である。本明細書に例示した本発明の最も好ましい
態様においては、少なくとも１つの該キレート化剤はイ
ミノジ酢酸である。
【００２８】また、上記の式で示される化合物におい
て、少なくとも１つの該キレート化剤が、式： (Ｈis)x−(Ａ)y−(Ｈis)z [式中、Ａは１またはそれ以上のアミノ酸であり；ｘは
０〜１０であり；ｙは０〜４であり；ｚは０〜１０であ
る]で示されるキレート化ペプチドおよびそのモノマ
ー、ダイマー、およびトリマー(ここで、このダイマー
またはトリマーのそれぞれのモノマー単位は同一または
異なっている)であることも可能である。本発明の好ま
しい態様においては、ｘは０〜３であり、ｙは０〜４で
あり、ｚは０〜３である。本発明のさらに好ましい態様
においては、該キレート化ペプチドは、式：Ｈis-Ｔrp-
Ｈis-Ｍet-Ｔyr、Ｈis-Ｈis-Ｈis-Ｍet-Ｔyr、Ｈis-Ｔr
p-Ｈis-Ｔrp-Ｈis、Ｈis-Ｔrp-Ｈis-Ｈis-Ｈis、Ｈis-
Ｈis-Ｈis-Ｈis-Ｔyr-Ｍet-Ｈis-Ｈis-Ｈis-Ｈis-Ｔy
r、Ｈis-Ｔrp-Ｈis-Ｈis-Ｈis-Ｐro、Ｈis-Ｈis-Ｈis-
Ｈis-Ｈis、Ｈis-Ｇly-Ｈis-Ｇly-Ｇly-Ｇly-Ｈis-Ｇly
-Ｈis、およびＨis-Ｇly-Ｈis-Ｇly-Ｇly-Ｇly-Ｇly-Ｇ
ly-Ｇly-Ｈis-Ｇly-Ｈisで示されるキレート化ペプチド
から選ばれる。本明細書に例示した本発明の最も好まし
い態様においては、キレート化ペプチドは、式：Ｈis-
Ｔrp-Ｈis-Ｈis-Ｈisで示される。
【００２９】種々の化合物を生物学的に活性な分子また
はリポーターグループとして構造中に導入することがで
きる。これらの生物学的に活性な分子およびリポーター
グループは、タンパク質、酵素、薬物、蛍光染料、放射
活性リガンド、ヌクレオチド、ＩＰ、炭水化物、または
脂質からなる群から選ばれる。一層好ましい本発明の化
合物においては、少なくとも１つの該ＩＰはタンパク質
である。一層好ましい本発明の化合物においては、少な
くとも１つの該ＩＰは酵素である。一層好ましい本発明
の化合物においては、少なくとも１つの該生物学的に活
性な分子はＩＰである。一層好ましい本発明の化合物に
おいては、少なくとも１つの該生物学的に活性な分子は
抗体である。一層好ましい本発明の化合物においては、
少なくとも１つの該ＩＰはＦab、Ｆab'またはＦv分子で
ある。一層好ましい本発明の化合物においては、少なく
とも１つの該生物学的に活性な分子はキメラ、ヒト化、
またはＣＤＲ-グラフト化抗体である。
【００３０】また、本発明は、生物学的に活性な分子ま
たはリポーター分子に共有結合したキレート化剤と、固
体支持体上に固定化した遷移金属イオンの間で動力学的
に不活性な遷移金属イオン錯体を形成させることによっ
て、タンパク質を精製および固定化する方法であって、
(a)生物学的に活性な分子またはリポーター分子に結合
している該キレート化剤と、固体支持体上に固定された
動力学的に不安定な酸化状態にある該遷移金属イオンの
間で動力学的に不安定な遷移金属錯体を調製し；そして
(b)該遷移金属イオンの酸化状態を動力学的に不活性な
酸化状態に変える；ことからなる方法を提供するもので
ある。次いで、このカラムを親和性結合検定において用
いることができる。ＣＰ−ＩＭＡＣ精製法の原理とその
実施については、Ｓmith,Ｍ.Ｃ.およびＰidgeon,Ｃ.[米
国特許Ｎo.4,569,794(1986年2月11日発行)；この教示の
全ては参考として本明細書の一部を構成する]が開示し
ている。
【００３１】本方法で形成される「動力学的(速度論的)
に不活性な錯体」に関連して、「不活性な」と「安定
な」なる用語は区別しなければならない。「不活性な」
なる用語は、不安定性の度合いを指すものである。不安
定性とは、配位圏中の１またはそれ以上の配位子を他の
配位子で置換する結果になる反応に関与する特定の錯化
イオンの能力を意味する。水性の環境下では、占有され
ていない[樹脂-キレート化剤-Ｍn+](ここで、Ｍは遷移
金属イオンであり、ｎは酸化数である)の配位位置は水
分子で占有されている。[樹脂-キレート化剤-Ｃo(II)-
キレート化剤-タンパク質]錯体を形成させるためには、
これらの水分子をキレート化ペプチドまたは有機キレー
ト化剤で置換しなければならない。このような反応が迅
速に起こるときには、この反応は「不安定な」ものであ
ると言われる。しかし、このような反応が極めてゆっく
り起こるかまたは全く起こらないときには、この錯体は
動力学的に「不活性」であると言われる。動力学的な不
安定性または不活性性は反応速度に関係するものであ
り、熱力学的な安定性または不安定性と混同すべきでは
ない。安定性は平衡状態のもとで存在する特定の種の熱
力学的傾向を指すものである。この点について、Ｃotto
nおよびＷilkinsonは次のように言及している：「この
[不安定と安定]の相違の簡単な例は[Ｃo(ＮＨ3)6]3+イ
オンによって示される。このイオンは、次の平衡定数： [Ｃo(ＮＨ3)6]3+＋６Ｈ3Ｏ+＝[Ｃo(Ｈ2Ｏ)6]3+＋６ＮＨ4 + Ｋ＝１０25 で示されるように熱力学的には不安定であるにもかかわ
らず、動力学的な不活性性の故に、または不安定性の欠
如の故に、酸性溶媒中では数日間にわたって存在するで
あろう。対照的に、[Ｎi(ＣＮ)4]2-の安定性は、次のよ
うに： [Ｎi(ＣＮ)4]2-＝Ｎi2+＋４ＣＮ- Ｋ＝１０-22 極めて高いが、この溶液に加えたアイソトープでラベル
したシアニドイオンによるＣＮ-イオンの交換速度は通
常の方法で測定することができないほど早い。」[Advanc
ed Inorganic Chemistry, Cotton,F.A. and Wilkinson,
G. (1972) 3rd ed.Interscience Publishers, p.652]。
このように、動力学的に不活性な(分子−キレート化剤)
−金属イオン−(キレート化剤−分子)錯体の形成は、数
日から数年の期間にわたる２つの分子の有効な結合を確
実なものにする。
【００３２】この金属結合部分は、キレート化ペプチド
または有機キレート化剤であってよい。このような有機
キレート化剤の例には、二座、三座および四座配位子
[例えば、イミノジ酢酸(ＩＤＡ)、ニトリロトリ酢酸(Ｎ
ＴＡ)、テルピリジン、ビピリジン、トリエチレンテト
ラアミン、ビエチレントリアミン]、三脚配位子(例え
ば、ホウ酸ポリピラゾリル配位子)、および大環式配位
子(例えば、１,４,７−トリアザシクロノナン、ジメチ
ルグリオキシム、フェナントロリン、ジフェニルグリオ
キシム)などが含まれる。後に行なう動力学的に不安定
な酸化状態から動力学的に不活性な酸化状態への金属イ
オンの酸化状態の変更によって、分子と金属イオンの間
の不活性な錯体が形成される結果になるであろう。
【００３３】固定化金属イオンとの錯体を形成するであ
ろう種々のキレート化ペプチドを用いることができる。
このようなキレート化ペプチドは、以下の式： (Ｈis)x−(Ａ)y−(Ｈis)z [式中、Ａはアミノ酸であり；ｘは０〜１０であり；ｙ
は０〜４であり；ｚは０〜１０である]で示されるキレ
ート化ペプチドおよびそのポリマー(ここで、このポリ
マーのそれぞれのモノマー単位は同一または異なってい
る)である。本発明の好ましい態様においては、このキ
レート化ペプチドは、少なくとも１個、好ましくは２個
またはそれ以上のヒスチジン残基を含有する長さが２〜
１０アミノ酸であってよい。本発明の好ましい態様にお
いては、ＡはＴrp、Ｇly、またはＴyrからなる群から選
ばれる。本発明を実施する際に最も好ましいキレート化
ペプチドを、以下の表１に示す：
【表１】 表１ キレート化ペプチド 文字表示 アミノ酸配列 (a) His-Trp-His-Met-Tyr (Seq.ID#1) (b) His-His-His-Met-Tyr (Seq.ID#2) (c) His-His-His-His-Tyr (Seq.ID#3) (d) His-Trp-His-Trp-His (Seq.ID#4) (e) His-Trp-His-His-His (Seq.ID#5) (f) His-His-His-His-Tyr-Met-His-His-His-His-Tyr (Seq.ID#6) (g) His-His-His-His-His (Seq.ID#7) (h) His-Trp-His-His-His-Pro (Seq.ID#8) (i) His-Gly-His-Gly-Gly-Gly-His-Gly-His (Seq.ID#9) (j) His-Gly-His-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-His-Gly-His (Seq.ID#10)
【００３４】組換えタンパク質の特徴であるＮ末端メチ
オニン残基を有していてもよく、また上記のキレート性
ペプチド配列の機能面を保持することもできる。さら
に、ＣＰ−タンパク質のＮ末端とキレート性ペプチドと
の間に１から約１２個のアミノ酸を含有させ、キレート
性ペプチドの金属結合性を保持することができる。６以
上のアミノ酸がある種のＣＰ−ＲＢ構造物のアミノ末端
に位置する場合のあることが見いだされた。キレート性
ペプチドと構造タンパク質との間にアミノ酸をいくつ配
置できるかの決定は、構造タンパク質の性質に左右され
る。従って、ペプチドスペーサーは構造タンパク質の物
理的性質を妨害する程の大きさを持つべきでない。キレ
ート性ペプチドがタンパク質のＣ末端に位置する場合、
キレート性ペプチドの後に１から約１２個のアミノ酸を
有することもできる。また、キレート性ペプチドをタン
パク質の一次構造に組込み、それにより表面暴露させ、
金属イオンと錯体化できるようにすることもできる。
【００３５】種々の金属イオンを本発明の実施に使用で
きる。Ｃr(III)、Ｖ(II)、Ｍn(IV)などの充填(ｄ6)又は
半充填(ｄ3)レベルにある正八面体の錯体、及びＣo(II
I)、Ｆe(II)、Ｒu(II)、Ｏs(II)、Ｒh(III)、Ｉr(II
I)、Ｐd(IV)及びＰt(IV)などの低スピン体が極めて不活
性である傾向を持ち、本発明を実施するうえで有用であ
る。Hanzik, Robert P.のInorganic Aspects of Biolog
ical and Organic Chemistry, アカデニック・プレス，
ニューヨーク，1976，109頁。Cotton,F.A.及びWilkinso
n,G.前掲も参照のこと。当業者ならば、これら金属イオ
ンを本発明の実施に使用することに関連するパラメータ
ーを理解できよう。金属イオンとしてＣo、Ｃr又はＲu
を選択すれば、本発明を好ましく実施することができ
る。最も好ましくは、Ｃo(II)、Ｃr(II)又はＲu(III)か
ら初め、それぞれＣo(III)、Ｃr(III)又はＲu(II)と
し、不活性錯体を生成させるのが望ましい。金属イオン
Ｚn、Ｃｕ又はＮｉは精製の目的には有用であるが、コ
バルトイオンなどの好ましい金属イオンから得られるも
のと同程度には得られる錯体を不活性にしないように思
われる。
【００３６】具体的なキレート化剤として使用するため
には、より好ましい特定の金属イオンがある。一般に、
本発明の目的では、硬い(ハード)金属イオンはより硬い
リガンドと錯体化させ、軟らかい(ソフト)金属イオンは
軟らかいリガンドと錯体化させるべきである。例えば、
使用するキレート化剤がイミノ二酢酸(ＩＤＡ)の場合、
好ましい金属イオンとしてはＣr(III)、Ｖ(II)、Ｍn(I
V)、Ｃo(III)、Ｆe(II)、Ｒu(II)、及びＰt(IV)などが
ある。使用するキレート化剤がニトリロ三酢酸(ＮＴＡ)
の場合は、Ｃr(III)、Ｖ(II)、Ｍn(IV)、Ｃo(III)、Ｆe
(II)、Ｒu(II)、及びＰt(IV)が好ましい金属イオンであ
る。使用する金属イオンがテルピリジン、ビピリジン又
はポリピラゾリルホウ酸塩リガンドの場合、好ましい金
属イオンは、Ｃo(III)、Ｆe(II)、Ｒu(II)、Ｏs(II)、
Ｒh(III)、Ｉr(III)、Ｐd(IV)及びＰt(IV)である。使用
するキレート化剤がトリエチレンテトラアミン、ビエチ
レンテトラアミン又は１，４，７−トリアザシクロナン
である場合、好ましい金属イオンは、Ｃo(III)、Ｃr(II
I)、Ｆe(II)、Ｒu(II)、Ｏs(II)、Ｒh(III)、Ｉr(II
I)、Ｐd(IV)及びＰt(IV)などが好ましい金属イオンであ
る。
【００３７】金属イオンの酸化状態に必須の変化を起こ
させるには、種々の酸化還元試薬を使用することができ
る。例えば、酸素、過酸化水素及び過酸などの酸化剤を
本発明の実施に使用できる。還元剤としては、チオール
類、フェロシアン化カリウム、チオシアン酸カリウム、
亜硫酸、及びナトリウム・ジチオナイトなどがある。こ
れらは、適当な濃度の水溶液中で製造される。
【００３８】当業者であれば、上記のキレート化剤との
不活性な錯体を速度論的に形成させるために、これら金
属イオンの酸化状態をすべての条件下で変化させるのに
すべての酸化還元試薬が必ずしも適当でないことは理解
されよう。適当な酸化還元試薬を選択するための１つの
要因は、不安定錯体の電気化学ポテンシャルを考慮し、
全体の自由エネルギーを反応が自発的になるようにする
試薬を使用することである。当業者であれば、架橋させ
るべき分子の性質によっては、すべての酸化還元試薬が
必ずしも適当でないことは理解されよう。さらに、特定
の酸化還元試薬によってタンパク質又は前駆分子が失活
されることを考慮しなければならない。
【００３９】本明細書に記載する手法は、分子を架橋し
てホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多重体又はヘテロ多
重体の錯体を調製するための広範な方法に適用すること
ができる。キレート性ペプチド又は有機キレート化剤
は、当業者に周知の化学的方法によって薬物、蛍光色
素、放射活性リガンド、ヌクレオチド、タンパク質、Ｉ
Ｐ類、炭水化物、脂質又は酵素などの種々の分子にカッ
プリングすることができる。例えば、Means,G.E.及びFe
eney,R.E.のChemical Modifications of Proteins,ホー
ルデン・デイ，サンフランシスコ，1971を参照のこと。
この対における第２の分子は、キレート化剤又は他の多
座配位の金属結合部を使用することにより結合された金
属イオンを有することができる。あるいは、これら多座
配位リガンドを、当業者に周知の化学的方法によって、
薬物、蛍光色素、放射活性リガンド、ヌクレオチド、タ
ンパク質、ＩＰ類、炭水化物、脂質又は酵素などの他の
分子に結合することができる。
【００４０】例えば、本発明の方法を実施するには、キ
レート性ペプチドをタンパク質の一次構造に組込み、金
属キレート性部分を提供すればよい。このようなタンパ
ク質はＣＰ−タンパク質と呼ばれる。実質的にあらゆる
タンパク質をＣＰ−タンパク質型に組込むことができ
る。ＣＰ−タンパク質のキレート性ペプチドドメインは
固定化金属イオン、金属イオンＣＰタンパク質錯体、又
は支持体に結合するＣＰタンパク質となる遊離金属イオ
ン、ＣＰ−タンパク質／金属イオン錯体又は金属イオン
にそれぞれ結合する。金属イオンは固相支持体に固定化
することができ、又は溶液中に遊離していてもよい。金
属イオンはまた、金属結合性部位を有する他の分子に結
合することができ、それによりＣＰ−分子のホモ二量体
及びヘテロ二量体が形成され得る。
【００４１】ＣＰ−タンパク質は種々の方法により調製
することができる。ＣＰ−タンパク質は組換えＤＮＡ技
法又は、溶液もしくは固相ペプチド合成もしくは通常の
溶液法によりカップリングしたタンパク質フラグメント
から開始する溶液中の半合成などの周知の方法によって
調製することができる。本発明を好ましく実施するに
は、目的のタンパク質のコード化配列中にキレート性ペ
プチドをコードする解読枠内(イン・フレーム)ＤＮＡ配
列を加える、組換えＤＮＡ法によってＣＰ−タンパク質
を調製する。キレート性ペプチドのコード化配列の組込
みは、通常の遺伝子クローニング法又は複製連鎖反応
(ＰＣＲ)により行い、そしてＣＰ−タンパク質をコード
している合成遺伝子を作成し、増幅すればよい。合成Ｐ
ＣＲプライマーはキレート性ペプチドのコード化配列を
含有するように作成することができ、そうすればＰＣＲ
によって調製されるＤＮＡにキレート性ペプチドコード
化配列を直接組込むことができる。このようなコード化
配列の発現産物は、キレート性ペプチドを有する「ＣＰ
−タンパク質」である。
【００４２】最終的ＣＰ−タンパク質内のキレート性ペ
プチドの置換は、タンパク質の性質によって大いに左右
される。キレート性ペプチドのコード化配列はタンパク
質コード化配列の５'又は３'末端のいずれかに、又はそ
の近傍に組込むことができ、その結果、キレート性ペプ
チドがタンパク質のアミノ若しくはカルボキシ末端のい
ずれかに又はその近傍に存在するようになる。さらに、
キレート性ペプチドは、タンパク質の一次構造内に組込
むことにより、表面暴露させて金属イオンと錯体化でき
るようにすることもできる。すべての場合において、好
ましくは、キレート性ペプチドをタンパク質に組込むに
当たり、タンパク質の生物学的性質への影響を最小限に
抑えるべきである。なお、立体的障害によりキレート性
ペプチドと金属イオンとの結合が妨害され、固定化が妨
げられるようなときには、キレート性ペプチドと固定化
しようとしているタンパク質との間にある種の「スペー
サー」を提供するのが望ましい場合がある。このような
スペーサーとしては、１から約３０アミノ酸のペプチド
が挙げられる。キレート性ペプチドはまた、種々の長さ
の有機リンカーによってタンパク質と連結すれば、所望
の間隙効果を得ることができる。所望のポリペプチドス
ペーサーをコードしているＤＮＡ配列(キレート性ペプ
チド及びタンパク質分子の適切な解読枠を保持してい
る)を、キレート性ペプチドをコードしているＤＮＡ配
列と固定化しようとしているタンパク質との間に挿入す
ることによりＣＰ−タンパク質を組換えＤＮＡ技術によ
って調製すれば、ポリペプチドスペーサーの組込みが容
易に行われる。
【００４３】キレート性ペプチドとタンパク質との間に
特異的なタンパク質分解性の開裂点を付与すれば、キレ
ート性ペプチドとタンパク質との間の連結を操作するた
めのある種の適用に有用である。タンパク質分解は、酵
素学的(例えば、トリプシン、キモトリプシン)又は化学
的(例えば臭化シアン)手段により行うことができる。さ
らに、ＣＰ−タンパク質のＮ末端から偶数位にプロリン
残基を導入すれば、ＣＰ配列がプロリンを含有していな
い限り、ＤＡＰ−Ｉ(ジアミノペプチダーゼ)の作用によ
ってキレート性ペプチドを除去することが容易になる。
【００４４】このようなＣＰ−タンパク質は、広範囲の
種々の他のＣＰ−タンパク質及び金属結合部分を有する
非タンパク質化合物にコンジュゲートすることができ
る。例えば、それぞれがキレート性ペプチドを有する２
つの同一タンパク質を使用することにより、ホモ二量体
の生成を導くキレート性ペプチドの媒介によってこれら
ＣＰ−タンパク質間の橋(ブリッジ)として金属イオンの
不活性型が機能する、速度論的に不活性な連結が、これ
らタンパク質間に作成され得る。同様に、タンパク質が
同じでない場合は、不均質な錯体が同じようにして作成
され得る。例えば、それぞれがキレート性ペプチドを有
する２つの異なるＩＰを金属イオンによりカップリング
することができる。得られた化合物は二機能性の抗体と
して機能するであろう。例えば、１つが腫瘍細胞の表面
抗原に対する特異性を有し、他方がイメージング(画像
化)試薬に対する特異性を有している、それぞれがキレ
ート性ペプチドを有する２つの別のＩＰを金属イオンに
よってカップリングすれば、それは腫瘍の診断及び位置
決定に有用であろう。さらに、キレート性ペプチドを抗
体の重鎖のカルボキシ末端に結合すれば、Ａb−(ＣＰ)2
分子を作成することができる。次いで、抗体のキレート
性ペプチドを使用すれば、その抗体をＣＰ−蛍光色素、
ＣＰ−薬物、ＣＰ−酵素、ＣＰ−放射活性リガンド、Ｃ
Ｐ−炭水化物又はＣＰ−イメージング試薬などの別のＣ
Ｐ−分子にカップリングすることができよう。
【００４５】さらに、不活性金属錯体は、２つ又はそれ
以上の金属錯体性の基を有するリンカー機能を使用する
ことにより作成することができる。金属錯体性の基は有
機、キレート化剤又は上記のキレート性ペプチド、又は
２つの混合体であることができる。例えば、このような
錯体は以下の模式図により表される： １）[ＢＡＭ-(スペーサー)-キレーター]n-(Ｍ)-キレー
ター-リンカー ２）[ＢＡＭ-(スペーサー)-キレーター-(Ｍ)-キレータ
ー-(スペーサー)]-リンカー ３）[(Ｍ)-キレーター-(スペーサー)-ＢＡＭ-(スペーサ
ー)-キレーター-]
【００４６】上記の式１、２及び３では、「ＢＡＭ」は
生物学的に活性な分子又はレポーター基であり、「スペ
ーサー」はポリペプチド、タンパク質、ポリサッカライ
ド、ポリヌクレオチド又は１から５０個のモノマー単位
から構成される合成有機部分であり、「キレーター」
は、１つ又はそれ以上の遷移金属イオンの配位部位と結
合できる遷移金属イオンキレート性部分であり、「Ｍ」
は速度論的に不活性な遷移金属イオン錯体を形成できる
遷移金属イオンであり、そしてＭは速度論的に不活性な
酸化状態にある。さらに、上記の式３では、各[ＢＡＭ-
(スペーサー)x-キレーター]モノマーは同一又は異なっ
ていてもよい。５から５０個のモノマー単位(例えば、
アミノ酸、ヘキソース、ペントース、ヌクレオチド、メ
チレン基、メチン基、アクリル酸残基など)をリンカー
分子に使用するのが好ましい。上記式３で示されるよう
に、キレート機能はリンカー分子の末端にあるのではな
い。結局、上記の式では、レポーター分子は１つの生物
学的活性分子を除いてすべてと置換できることに留意す
べきである。
【００４７】本発明はさらに、(a) キレーターを有す
るタンパク質と遷移金属イオンを有する固相支持体との
間に速度論的に不活性な錯体を形成させ、(b) 該速度
論的に不活性な錯体を、リガンド−タンパク質錯体のイ
ンヒビターを含有する溶液に暴露し、(c) リガンドを
導入し、(d) 非特異的に結合している分子を除去し、
そして(e) 溶出液中のリガンド及びあり得るインヒビ
ターの濃度を定量する工程からなることを特徴とする検
定系を提供するものである。
【００４８】この検定系によれば、固定化ＣＰ−タンパ
ク質又は有機キレート化剤によって固定化されたタンパ
ク質と種々のリガンドとの相互作用の研究を容易に行え
る。本発明の好ましい実施では、タンパク質における別
の分子との相互作用の研究を行う際、そのタンパク質を
上記のＣＰ−タンパク質型として調製する。ＩＭＡＣカ
ラムをスミス(Smith)らの米国特許第４，５６９，７９
４号の教示に従って製造する。多くの金属イオンを使用
する場合は、酸化還元剤がカラムマトリックスに導入さ
れ、それが存在しないよう注意を払わなければならな
い。固定化金属イオンは不安定な酸化状態でなければな
らない。ＣＰ−タンパク質を含有する溶液をＩＭＡＣカ
ラムに導入する。ＣＰ−タンパク質を不活性な酸化状態
にある固定化金属イオンに連結したなら、３つの代替法
を利用できる：(１) pＨを低下させるか、又はイミダ
ゾール(即ち、通常のＣＰ−ＩＭＡＣ精製)などの夾雑物
を添加し、結合した金属イオンからＣＰ−タンパク質を
遊離させる、又は(２) 化学的又は酵素学的手段により
構造タンパク質とキレート性ペプチド配列との間の固定
化ＣＰ−タンパク質の適当な部位を開裂することによ
り、実質的に純粋なタンパク質を単離し、同時にマトリ
ックスに結合したキレート性ペプチドをそのままにす
る、又は(３) 金属イオンの酸化状態を変化させ、ＣＰ
−タンパク質をカラムマトリックスに「ロック(lock)す
る」。
【００４９】結合した金属イオンの酸化状態を変化させ
ることにより、代替法(３)に示すように、[金属イオン-
ＣＰ−タンパク質]錯体の速度論パラメーターを変化さ
せ、キレート性ペプチド又はＣＰ−タンパク質と支持マ
トリックスとを速度論的に不活性に連結させることがで
きる。次いで、速度論的に不活性な金属イオンの連結を
介して固定化されたこのＣＰ−タンパク質を使用し、タ
ンパク質、リガンド、リガンドとなり得るもの、及びタ
ンパク質とリガンドとの結合を妨害することのできる化
合物間の相互作用を研究することができる。
【００５０】本発明は、本明細書に例示する１つの態様
として、腫瘍タンパク質(oncoprotein)と抗-腫瘍タンパ
ク質(anti-oncoprotein)との相互作用を研究するための
検定系を提供するものである。これにより、腫瘍タンパ
ク質／抗-腫瘍タンパク質錯体(複合体)の形成を阻害す
るインヒビターについての迅速なスクリーニングが可能
となる。正常細胞の新生物トランスフォーメーションに
おいて、腫瘍タンパク質が細胞内伝達物質として役立っ
ていることは周知である。抗-腫瘍タンパク質は、細胞
増殖を阻害又は調節する。特定の腫瘍タンパク質は、抗
-腫瘍タンパク質と結合してそれらに影響を与え、それ
により抗-腫瘍タンパク質がその機能を発揮することを
妨害し、細胞を癌にすると考えられる。従って、抗癌剤
を開発するには、腫瘍タンパク質／抗-腫瘍タンパク質
複合体の形成を妨害する物質を決定するのが望ましい。
しかし、このような活性を有する化合物を従来の方法に
より単離、決定することは非常に能率が悪い。本明細書
に説明する本発明を利用すれば、腫瘍タンパク質／抗-
腫瘍タンパク質複合体の形成を妨害する化合物を決定す
るための感度の高い迅速な手段が提供される。
【００５１】簡単に説明すれば、このような腫瘍タンパ
ク質／抗-腫瘍タンパク質の検定操作は以下のようにな
る。ＣＰ−腫瘍タンパク質を通常のＣＰ−ＩＭＡＣ法に
より単離する。次いで、弱い競合体を導入して、非特異
的に結合する分子を遊離させる。次ぎに、結合金属イオ
ンの酸化状態を変化させて速度論的に不活性な錯体を形
成させ、金属イオンを不安定なものから速度論的に不活
性な酸化状態に変化させる。次いで、試験化合物を固定
化ＣＰ−腫瘍タンパク質を含む反応容器に入れ、次いで
抗-腫瘍タンパク質を加える。次ぎに、抗-腫瘍タンパク
質に対する抗体を入れる。蛍光的に又は酵素的に標識し
た抗-腫瘍タンパク質抗体に対する別の抗体を加える。
各相毎に洗浄して非結合分子を除去する。好ましい本発
明の実施では、蛍光的に標識した抗-腫瘍タンパク質を
一次及び二次抗体として使用し、さらに検定を単純化す
る。次いで、得られた混合物の蛍光を評価し、又は酵素
活性を検定する。標識化抗-(抗-腫瘍タンパク質抗体)抗
体の特徴である蛍光又は酵素活性の存在は、腫瘍タンパ
ク質／抗-腫瘍タンパク質複合体の形成を示すことにな
る。このことはまた、試験化合物が腫瘍タンパク質／抗
-腫瘍タンパク質複合体の形成を妨害しないことを示し
ている。蛍光又は酵素活性が存在しないか、又はそれが
減少すれば、その試験化合物が腫瘍タンパク質／抗-腫
瘍タンパク質複合体の形成を妨害し、従ってそれが抗癌
剤であり得ることを示している。この検定系は、パンデ
ックスR(PandexR)[Baxter-Dade Diagnostics]系などの
自動操作にも適用することができ、抗癌剤の効率的な高
容量スクリーニングを可能とするものである。
【００５２】上記の検定系は、抗-腫瘍タンパク質／腫
瘍タンパク質の相互作用の研究のみに限定されるもので
ない。実質的にあらゆるタンパク質−リガンド対をこの
系に使用することができる。例えば、この同じ原理は、
メチシリン耐性のブドウ状球菌(スタフィロコッカス)に
見いだされる修飾ペニシリン結合性のタンパク質に対す
る親和性を有している化合物のスクリーニングにも適用
することができよう。ペニシリン結合性タンパク質は、
多くのβ-ラクタム抗生物質の抗微生物作用に必須であ
る。メチシリン耐性微生物は、広範な通常のβ-ラクタ
ム抗生物質に対して低い親和性を有するペニシリン結合
性タンパク質を産生する。スタフィロコッカスのメチシ
リン耐性株から単離したペニシリン結合性タンパク質を
ＣＰ−タンパク質に導入すれば、それらを精製でき、ま
たカラムに固定化でき、それにより修飾ペニシリン結合
性タンパク質に結合する化合物をスクリーニングするた
めの迅速な検定が可能になる。科学者はこの手法によ
り、メチシリン耐性感染に対する有用な薬物の有効な検
索手段を得ることができる。
【００５３】本明細書に例示しているように、本発明
は、ヒト乳頭腫ウイルス(ＨＰＶ)１６型のＨＰＶ Ｅ７
タンパク質(腫瘍タンパク質)と網膜芽腫遺伝子の産物、
ＲＢタンパク質(抗-腫瘍タンパク質)との結合を阻害す
る物質を発見するために有用である検定系を提供する。
ＨＰＶ−Ｅ７タンパク質は生殖器ヒト乳頭腫ウイルスの
主要なトランスフォーミングタンパク質である。ＲＢタ
ンパク質は、正常細胞の発育を調節するよう機能する抗
-腫瘍遺伝子の産物であると考えられている。ＨＰＶ−
Ｅ７腫瘍タンパク質は、インビトロにおいてＲＢ抗-腫
瘍タンパク質と複合化することが示されている[Dyson,
N.、Howley,P.M.、Munger,K.、Harlow,E.(1989) Scienc
e 243 934−937]。従って、ＨＰＶ−Ｅ７／ＲＢ複合体
の形成は、腫瘍の原因となる細胞の無制御な増殖によっ
て明らかにされる正常細胞の発育制御の喪失をもたら
す、と考えることは理屈に合う。結果的に、ＨＰＶ−Ｅ
７／ＲＢ複合体の形成を阻害する化合物は、ＨＰＶ誘発
性の形成異常症及び悪性に対する抗ウイルス性又は抗癌
性の物質であり得る。多くの場合、ＨＰＶの場合のよう
に、組織培養においてトランスフォーミングウイルスを
生成させることができない。従って、抗-ウイルス化合
物を同定するための組織培養検定を開発することは、不
可能である。しかし、本発明によって証明されるよう
に、Ｅ.coli (大腸菌)に形質転換したクローン化ウイル
スゲノムを利用すれば、腫瘍タンパク質を細胞不含の検
定系で使用するに充分な量で得ることができる。
【００５４】ＣＰ−Ｅ７タンパク質の固定化型は、Ｅ７
タンパク質と結合する新規な化合物を発見するのに有用
であり、また治療物質としても有用であり得る。例え
ば、ＲＢ組換えワクシニアウイルス、vＡbＴ３３４[App
lied bioTechnology,ケンブリッジ，MA]によって感染さ
せたアフリカミドリザルの腎セルラインＢＳＣ−４０
(A.BruskinのApplied bioTechnology，ケンブリッジ，M
Aから得た)から調製した核抽出物をＩＤＡ−Ｃo(III)−
ＣＰe−Ｅ７−樹脂錯体に適用した。このＩＤＡ−Ｃo(I
II)−ＣＰe−Ｅ７−樹脂錯体から非特異的に結合するタ
ンパク質を洗浄した。２−メルカプトエタノールを使用
し、コバルトイオンの酸化状態を＋２状態に変化させ、
速度論的に不安定な樹脂−ＩＤＡ−Ｃo(II)−ＣＰe−Ｅ
７−[結合タンパク質]錯体を作成し、ＣＰ−Ｅ７−[結
合タンパク質]錯体を除去した。樹脂−ＩＤＡ−Ｃo(II
I)−ミオグロビンに結合するタンパク質と樹脂−ＩＤＡ
−Ｃo(III)−ＣＰe−Ｅ７とをＮovexトリス−グリシン
系のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより比較すると、核抽出物から
得られた少なくとも８つのタンパク質がＥ７と特異的に
結合することが証明された。非感染性のＢＳＣ−４０細
胞の核抽出物から得たＥ７と結合するタンパク質の、Ｎ
ovexゲル上における分子量は３５０kＤa、１４０kＤa、
５４kＤa、４６kＤa、４１kＤa、３０kＤa、２１．５k
Ｄa及び１３．５kＤaであった。ＲＢ組換えワクシニア
ウイルスvＡbＴ３３４によって感染させたＢＳＣ−４０
細胞から得られたタンパク質の分子量は３００kＤa、１
４０kＤa、１１０kＤa、４６kＤa、４１kＤa、３０kＤ
a、２５kＤa及び２０kＤaであった。２つのゲルから得
たタンパク質をＰroＢlotR[Applied Biosystems, フォ
スター・シティー，CA]に移し、アミノ酸配列分析を行
った。４６kＤaタンパク質の配列分析により、以下のＮ
末端配列が得られた：
【００５５】 Ｍ-Ｅ-Ｖ-Ｋ-Ｋ-Ｐ-Ａ-Ａ-Ａ-Ａ-Ａ-Ｐ-Ｇ-Ｔ-Ａ-Ｅ-Ｋ-Ｌ-Ｓ-Ｐ-Ｋ-Ａ-Ａ (Ｓeq.ＩＤ＃１１) これは、ラットのコラーゲン結合性タンパク質(ＧＰ４
６)及びマウスセリンプロテアーゼインヒビターのホモ
ログ(homolog)Ｊ６と相同性を有する。以下のＮ末端配
列： Ｍ-Ｋ-Ｇ-Ｄ-Ｐ-Ｋ-Ｋ-Ｋ-Ｘ-Ｗ (Ｓeq.ＩＤ＃１
２) を有する３０kＤaタンパク質は、ヒト高移動群タンパク
質(human high mobilitygroup protein)ＨＭＧ１と相同
性を有する。これらのタンパク質は容易に配列決定で
き、該タンパク質をコードしているＤＮＡ配列を単離す
るためのハイブリダイゼーションプロトコールに使用で
きる一連の縮重プローブを設計することができる。次い
で、これらの遺伝子を周知の組換え発現系に組込み、そ
のようなタンパク質を単離、生産することができる。従
って、本発明はこれら新規なＥ７結合性分子をも包含す
るものである。
【００５６】遊離Ｅ７を使用する競合実験を行い、これ
ら核タンパク質と樹脂−ＩＤＡ−Ｃo(III)−ＣＰe−Ｅ
７錯体との特異的な結合性を確認した。前もって清澄に
しておいた上記の核抽出物を種々の量の遊離Ｅ７(０、
１００、５００、１０００及び５０００nｇ)、及び樹脂
−ＩＤＡ−Ｃo(III)−ＣＰe−Ｅ７錯体に加え、穏やか
に回転させながら４℃で２時間インキュベートした。そ
の試料を遠心し、上清を除去し、得られた樹脂をＮＰ−
４０緩衝液１ml で２回洗浄し、緩衝液を加えた後、１
０分間穏やかに回転させた。その樹脂−ＩＤＡ−Ｃo(II
I)−ＣＰe−Ｅ７錯体をＮovex トリス−グリシン ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ ２×試料緩衝液及びβ-メルカプトエタノ
ール５μl で処理し、５分間煮沸し、３分間遠心した。
β-メルカプトエタノールは、樹脂に結合されたタンパ
ク質が遊離する程にＣo(III)が速度論的に不安定である
Ｃo(II)状態に還元した。得られた上清(５０μl／レー
ン)をＮovex トリス−グリシンの４−２０％ゲルの電気
泳動にかけた。得られたゲルは、上記のＣo(III)−ＣＰ
e−Ｅ７樹脂に固有のバンドが、過剰の遊離Ｅ７との競
合によって減少され、削除され得ることを示していた。
【００５７】この検定は、他のＨＰＶ Ｅ７タンパク質
のインヒビターの検出に有用である。ヒト生殖管を感染
するＨＰＶには少なくとも１２個の型がある。これらの
ウイルスによって引き起こされ、及び／又はそれらが絡
む病巣は、良性の生殖器いぼから同位置の癌腫及び侵襲
性癌腫への形成異常にまでに及ぶ。ＨＰＶ６、１１、１
６及び１８それぞれのＥ７タンパク質は異なる親和性を
もってＲＢタンパク質と結合する。Munger,K.、Wernes
s,B.A.、Dyson,N.、Phelps,W.C.、Harlow,E.及びHowle
y,P.M.(1989) EMBO J.8:4099-4105。この検定系の方法
により、種々のＨＰＶ Ｅ７腫瘍タンパク質によってＲ
Ｂタンパク質の不活化を妨げる物質を決定するための有
用な機序が提供されるので、この方法は、これら種々の
ＨＰＶが関連する疾患を処置及び予防するのに有用な物
質を発見するために有用となるであろう。
【００５８】さらに、種々のＤＮＡ腫瘍ウイルス由来の
ウイルス腫瘍タンパク質がＲＢタンパク質に結合するこ
とが証明された。これらの例としては、アデノウイルス
Ｅ１Ａ腫瘍遺伝子産物[Whyte,P.らのNature 334,124-12
9(1988)]、ＳＶ４０ラージＴ抗原[DeCaprio,J.A.らのCe
ll 54,275-283(1988)]、及びポリオーマウイルスラージ
Ｔ抗原などがある。これらのタンパク質は各々、ＨＰＶ
Ｅ１Ａとアミノ酸配列の相同領域を共有している。こ
のアミノ酸配列相同領域は、腫瘍タンパク質／抗-腫瘍
タンパク質複合体の形成に絡んでいる。この知見は、こ
の相同領域の突然変異により腫瘍タンパク質／ＲＢ複合
体の形成が妨害されることを示した研究によって支持さ
れた。Mungerらの前掲、DeCaprio,J.A.らの前掲。従っ
て、本発明は、ＤＮＡ腫瘍ウイルスによって誘発される
癌形成に対する抗癌剤を発見するうえで、有意に優れた
進歩を提供するものである。さらに、抗-腫瘍タンパク
質はこのアミノ酸配列相同領域と相互作用すると考えら
れるので、この領域の合成構造アナログもこの検定に使
用でき(完全長のタンパク質自身の代わりとして)、それ
により広範な腫瘍遺伝子産物による細胞トランスフォー
メーションを阻害する物質を発見できる。
【００５９】本発明がＥ７及び／又はＲＢタンパク質と
相互作用する物質のみの研究に限定されるものでないこ
とに留意すべきである。殆どあらゆる腫瘍タンパク質／
抗-腫瘍タンパク質の「対」を選択し、この方法に組み
入れることができる。例えば、腫瘍タンパク質ＨＰＶ
Ｅ６、アデノウイルスＥ１Ｂ、及び／又はＳＶ４０ラー
ジＴ抗原もＣＰ−タンパク質として発現させることがで
き、また上記と同様にマトリックスに結合できる。抗-
腫瘍タンパク質p５３はこれら腫瘍タンパク質のそれぞ
れと結合される。好ましい本発明の実施では、ＣＰ−腫
瘍タンパク質をマトリックスに固定化することにより、
腫瘍タンパク質結合性インヒビターを同定できる。ま
た、ＣＰ−抗-腫瘍タンパク質を固定化して腫瘍タンパ
ク質／抗-腫瘍タンパク質相互作用のインヒビターを同
定することもできる。この場合、抗-腫瘍タンパク質に
結合する分子が同定されるであろう。このクラスのイン
ヒビターは、抗-腫瘍タンパク質の正常機能を阻害する
という望ましくない特性を有する場合があることに留意
すべきである。組換えＤＮＡ手法又は化学合成のいずれ
かにより所望の腫瘍タンパク質をＣＰ−タンパク質型に
導入するだけで、本発明は、無数に存在し得る種々の腫
瘍タンパク質／抗-腫瘍タンパク質相互作用のインヒビ
ターを決定するために適用できるので、本発明の有用性
が増大されるのは明らかである。
【００６０】本明細書に例示している腫瘍タンパク質／
抗-腫瘍タンパク質検定系の原理を模式的に添付の図１
に示す。本明細書に記載しているように、Ｅ７腫瘍タン
パク質及びＲＢ抗-腫瘍タンパク質は共に、ＣＰ−タン
パク質として発現される。これらは、キレート性ペプチ
ドの５'をコードしている解読枠内ＤＮＡ配列をＥ７及
びＲＢタンパク質のコード化配列に付加することによ
り、調製される。これらコード化配列の産物はＥ７及び
ＲＢ ＣＰ−タンパク質であり、それぞれアミノ末端に
キレート性ペプチドを有している。これらを本明細書で
はそれぞれＣＰ−Ｅ７及びＣＰ−ＲＢと呼ぶ。本明細書
に例示しているように、結合Ｃo(II)イオンを有するイ
ミノ二酢酸(ＩＤＡ)分子は、ファスト・フロー・アガロ
ース又はＴＳＫ−ＰＷゲルなどの親水性樹脂と共有結合
する。固定化されたＣo(II)イオンはＣＰ−Ｅ７及びＣ
Ｐ−ＲＢタンパク質のキレート性ペプチドと相互作用
し、ＣＰ−Ｅ７及びＣＰ−ＲＢタンパク質をカラムに連
結させる。これにより、ＣＰ−Ｅ７及びＣＰ−ＲＢタン
パク質を精製するための容易な方法が提供される。[Ｃ
Ｐ−タンパク質／Ｃo(II)−樹脂]錯体、即ち「非ロッ
ク」型を形成させることにより、粗製の混合物からＣＰ
−Ｅ７及びＣＰ−ＲＢタンパク質が精製される。次い
で、ＲＢ構造配列／キレート性ペプチドの相互作用境界
において融合タンパク質をキレート化すると同時にカラ
ムに連結させるか、又は過剰のイミダゾールを加えた
後、化学的又は酵素学的方法によりキレート性ペプチド
を除去してそのゲルからＣＰ−ＲＢタンパク質を溶出さ
せるかのいずれかにより、ＲＢタンパク質を遊離の形態
で単離することができる。キレート性ペプチドが、融合
するポリペプチドの機能を妨害しないなら、ＣＰ−タン
パク質を後に使用するためにキレート性ペプチドを除去
する必要はない。
【００６１】ＣＰ−Ｅ７の場合、カラム酸素、酸素含有
ガス又はＣo(II)をＣo(III)に酸化できるがＣＰ−Ｅ７
分子を失活した状態にまで酸化しない他の酸化剤を導入
し、結合コバルトイオンを＋２から＋３の酸化状態にま
で酸化することによりタンパク質をマトリックスに「ロ
ック(locked)」する。本発明の好ましい実施では、以下
のバッチ法によりこれを行う。固定化ＩＤＡ−Ｃo(II)
−ＣＰ−Ｅ７錯体を含有するカラムの内容物を試験管に
移す。設定したゲルの上部空間を酸素又は酸素含有ガス
と置き換え、封管する。その試験管を２４時間連続して
反転させ、酸素含有ガスをＩＤＡ−Ｃo(II)−ＣＰ−Ｅ
７錯体を含有するビーズと混合し、Ｃo(II)をＣo(III)
にまで酸化する。得られたＣＰ−Ｅ７−Ｃo(III)錯体は
「ロック」型であった。
【００６２】「ロック」型のＣＰ−Ｅ７は、Ｅ７リガン
ド及びあり得る競合物の添加に基づく、Ｅ７に結合する
分子の検定又はＲＢなどの既知のＥ７リガンドの結合を
阻害する分子の検定に有用である理想的なリガンドを提
供する。上記のように、この方法はＥ７腫瘍タンパク質
に限定されるものでない。融合タンパク質として発現で
きるあらゆるタンパク質をこの方法によりカラムマトリ
ックスに固定化することができる。従って、これと実質
的に同様の方法によれば、このような結合ＣＰ−タンパ
ク質の結合性又は酵素活性の検定法を容易に開発するこ
とができる。
【００６３】タンパク質の固定化ＣＰ型はさらに、この
タンパク質に対する抗体を血清から単離、精製するため
の方法であって、(a) キレーターを有するＢＡＭと結
合遷移金属イオンを有する固体支持体との間の速度論的
に不活性な錯体を形成させ、(b) 該速度論的に不活性
な錯体を、該ＢＡＭに対する免疫反応性タンパク質を含
有する溶液に暴露し、(c) 非特異的な結合分子を除去
し、そして(e) 結合免疫反応性タンパク質を取り出す
工程からなる方法にも使用できる。
【００６４】既知のタンパク質に対する抗体を調製する
ための方法は当業者に多く知られている。抗体の目的に
しようとするタンパク質をＣＰ−タンパク質に組込む
か、又は有機キレート化剤を添加し、それを既述のよう
にしてカラムに固定化することにより、決定又は他の溶
液から所望の抗体を単離することができる。非結合化タ
ンパク質をカラムから溶出した後、固定化ＣＰ−タンパ
ク質自身は除去しない周知の方法によりカラムから抗-
ＣＰ−タンパク質抗体を溶出すればよい。注意して制御
したグラジエントを使用すれば、異なる親和性をもって
ＣＰ−タンパク質に結合し、又はＣＰ−タンパク質分子
の種々のエピトープに結合するいずれかの別種の抗-Ｃ
Ｐ−タンパク質抗体を溶出させることができる。上述の
ようにして、結合金属イオンの酸化状態を速度論的に不
安定な型に変化させ、抗体−ＣＰ−タンパク質複合体を
溶出させれば、抗体−ＣＰ−タンパク質複合体も無傷で
取り出すことができる。
【００６５】例えば、本明細書の実施例１０に記載して
いるように、固定化ＣＰe−Ｅ７タンパク質を使用し、
ウサギ血清から抗-Ｅ７抗体を精製した。抗-Ｅ７抗体
は、Reichlin,M.のMethods In Enzymology 70:159-165
(1980)の教示に実質的に従い、Hazelton Research Prod
ucts, Inc.,P.O.ボックス7200, デンバー, PA 17517に
推奨されている免疫スケジュールにより取り扱った。Ｃ
o(III)−ＩＤＡ−樹脂に固定化したＣＰe−Ｅ７(本明細
書の実施例１から４．Ｂに記載)を使用し、抗体単離の
ためのアフィニティーカラムを調製した。注射したウサ
ギから得た血清をＩＤＡ−Ｃo(III)−ＣＰe−Ｅ７樹脂
錯体に適用し、９０分間反応させた。未結合のタンパク
質をそのカラムから洗い流し、緩衝液Ｂ(１００mＭ グ
リシン、７．５Ｍ 尿素、pＨ２．５)の０から１００％
グラジエントを使用してカラムから抗-Ｅ７−抗体を取
り出した。標準的なＥＬＩＳＡ法及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により、抗-Ｅ７−抗体の存在が確かめられた。
【００６６】本発明を実施することにより開発される検
定系、例えば上記のＥ７／ＲＢ腫瘍タンパク質／抗-腫
瘍タンパク質検定法は、反応容器がマルチウエル パン
デックスR(multiwell PandexR)検定平板又はマイクロタ
イター平板のウエルであるような自動操作に容易に適用
することができる。
【００６７】ＣＰ−Ｅ７融合腫瘍タンパク質を調製する
ため、pＢＲ３２２[Durstら, 1983]のＢamＨＩ部位にＨ
ＰＶ１６ゲノムがクローンされているプラスミドpＨＰ
Ｖ１６[Behringwerke, A.G., ハイデルベルク, ドイツ]
から、Ｅ７タンパク質のコード化配列を単離する。プラ
スミドpＨＰＶ１６の制限部位および機能地図を図２に
示す。プラスミドpＨＰＶ１６をＮcoＩ及びＮsiＩ制限
エンドヌクレアーゼで消化し、ＨＰＶ１６Ｅ７構造遺伝
子を含む３０１塩基対のヌクレオチド配列を得た。
【００６８】次いで、Ｅ７コード化配列をプラスミドp
ＣＺＲ３２２にクローンした。プラスミドpＣＺＲ３２
２の制限部位および機能地図を図３に示す。プラスミド
pＣＺＲ３２２は、温度誘発性のラムダpＬプロモーター
の下流にクローンされているヒト成長ホルモン(hＧＨ)
遺伝子を含有している。プラスミドpＣＺＲ３２２のヒ
ト成長ホルモン(hＧＨ)をコードしているＤＮＡ配列を
Ｅ７遺伝子をコードする３０１bp ＮsiＩ−ＮcoＩフラ
グメントと置き換えた。得られたプラスミドをp１６Ｅ
７と呼ぶ。Ｅ７コード化配列をpＣＺＲ３２２に挿入す
るには、合成オリゴヌクレオチドリンカーを使用すれば
容易になる。当業者であれば、本発明を実施するために
種々の発現プラスミドが使用可能であることが容易に考
えられる。本発明を実施するために有用である市販され
ている発現プラスミドを例示すれば、一連のpＮＨプラ
スミド[ストラタジーン(Stratagene, ラジョラ, CA)か
ら市販されている]、及び一連のpＫＫ２２３、pＰＬ−
ラムダ、p４３Ｊ００１、pＤＲ５４０、及びpＤＲ７２
０[ファルマシア，ピスカッタウェイ，N.J.から市販さ
れている]がある。効率的なタンパク質発現のために必
須の条件は当業者に容易に知れる。
【００６９】プラスミドpＣＺＲ３２２をＮdeＩ及びＢa
mＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、hＧＨコード化
配列を切除した。５．８kb ＢamＨＩ−ＮdeＩベクター
フラグメントをアガロースゲル電気泳動によって単離
し、次いで当業者に周知の手法により子牛腸アルカリホ
スファターゼで処理して線状ＤＮＡ分子から５'リン酸
基を除去した。この操作のためのプロトコールは、Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual,サンブルック(Sa
mbrook,J.)、Fritsch,E.F.及びManiatis,T., コールド
・スプリング・ハーバー・プレス，1989，1.58−1.61頁
に記載されている。上記の単離Ｅ７配列は依然５'リン
酸基を有しているが、それを合成リンカー及びＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼの存在下に脱リン酸化ＤＮＡに加えた。配
列：５'−ＴＡＴＧＣＡ−３'を有する１本鎖デオキシヌ
クレオチドリンカーを使用し、ＮdeＩエンドヌクレアー
ゼにより切断したベクターＤＮＡの末端を、ＮsiＩ制限
エンドヌクレアーゼにより切断したＥ７コード化配列の
末端に連結した。式：
【化１】 で示される２本鎖デオキシヌクレオチドリンカーを使用
し、Ｅ７コード化配列のＮcoＩ末端とベクターＤＮＡの
ＢamＨＩ末端との連結を容易ならしめた。これらのオリ
ゴヌクレオチドリンカーは、アプライド・バイオシステ
ムズ３８０Ａ型又は３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置[Applied
Biosystems, フォスター・シティー，CAから市販され
ている]などの通常のＤＮＡ合成装置を使用し、当業界
周知の方法により調製することができる。得られたＤＮ
ＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下に連結した。プラス
ミドp１６Ｅ７の制限部位および機能地図を図４に示
す。次いで、連結混合物を使用し、直接コンピーテント
なＥ.coli ＤＨ５αＦ1細胞[ＢＲＬ，ガイセルスバー
グ，MD]を形質転換した。
【００７０】プラスミドp１６Ｅ７のＥ７腫瘍タンパク
質をコードしているＤＮＡ配列にキレート性ペプチド
５'をコードするＤＮＡ配列を挿入し、ＣＰ−Ｅ７融合
腫瘍タンパク質をコードしている配列を調製した。Ｎde
Ｉ認識配列を含有するよう操作した、表１に示している
キレート性ペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチ
ドは、プロメガ[Promega, Inc., マジソン, WI]及びイ
ンディアナ・ユニバーシティー・スクール・オブ・メデ
ィシン(インディアナポリス，IN)から入手した。当業者
には、これらキレート性ペプチドをコードするＤＮＡ配
列が合成法によって調製できることは明らかである。さ
らに、当業者であれば、これらキレート性ペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列をＣＰ−タンパク質を発現す
るベクターに組込むことができる。本明細書に例示する
本発明の好ましい実施では、p１６Ｅ７のＥ７コード化
配列の５'末端にあるそのプラスミドに唯一のＮdeＩ部
位を利用し、Ｍet−Ｈis−Ｔrp−Ｈis−Ｈis−Ｈisキレ
ート性ペプチドをコードする合成ＤＮＡフラグメントを
そこにクローンする。Ｈis−Ｔrp−Ｈis−Ｈis−Ｈisキ
レート性ペプチドのプラスミドp１６Ｅ７への組込みを
反映している、この得られたプラスミドをp１６Ｅ７eと
命名する。p１６Ｅ７eの制限部位および機能地図を図５
に示す。次いで、プラスミドp１６Ｅ７eをコンピーテン
トなＥ.coli ＤＨ５αＦ1細胞[ＢＲＬ，ガイセルスバー
グ，MD]に導入した。
【００７１】プラスミドpＣＺＲ３２２及びプラスミドp
１６Ｅ７eの親発現ベクターは、温度感受性リプレッサ
ーの制御下にあるバクテリオファージラムダpＬプロモ
ーターを含有している。このリプレッサーは３０℃で機
能するが、４２℃では機能しない。発現プラスミドp１
６Ｅ７eによりＥ.coli 株Ｌ２０１細胞[M.Lei, LillyRe
search Laboratories]を形質転換した。５μｇ/ml テト
ラサイクリンを含有する２×ＴＹブロス中で、細胞を３
０℃でＯＤ600＝０．６−０．８まで増殖させ、次いで
４２℃で１６時間増殖させることによりタンパク質発現
を誘発させた。遠心により細胞を採取し、細胞溶解し、
Laemmli(1970)の教示に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
りタンパク質分析を行った。
【００７２】ＰＣＲ法に若干の修正を加え、ＣＰ−ＲＢ
タンパク質をコードしているＤＮＡ配列を調製した。ヒ
ト網膜芽腫遺伝子をコードするＤＮＡ配列及びその先端
削除型をＰＣＲ法により増幅した。ＲＢタンパク質のコ
ード化配列をプラスミドpＡbＴ９３００[アプライド・
バイオテクノロジー，ケンブリッジ，マサチューセッ
ツ]から単離した。プラスミドpＡbＴ９３００の制限部
位および機能地図を図６に示す。ＲＢ遺伝子に相当する
ヌクレオチド配列プラスミドは、pＡbＴ９３００の４６
００bp ＫpnＩ及びＳacＩフラグメントに含有されてい
る。
【００７３】この４６００bp ＫpnＩ−ＳacＩフラグメ
ントは大き過ぎてＥ.coli 内で十分に発現されない。従
って、検定系に使用するため、ＲＢタンパク質を製造す
るための２つの経路を利用する：(１)完全なＲＢ遺伝子
をバクロウイルス発現系で発現させる、又は(２)Ｅ７結
合ドメインを含有するＲＢタンパク質の６０kd Ｃ末端
領域[Hu,Q.、Dyson,N.及びHarlow,E.のEMBO J.9,1147-1
155(1990)]をプラスミドpＣＺＲ３２２にサブクローン
し、Ｅ.coli 細胞内で発現させる。本明細書では例示し
ているように両方法とも使用している。従って、ＣＰ−
ＲＢ融合抗-腫瘍タンパク質の２つの型が調製された。
これらをＣＰe−ＲＢ60及びＣＰe−ＲＢと命名する。Ｃ
Ｐe−ＲＢ60タンパク質は、Ｈis−Ｔrp−Ｈis−Ｈis−
Ｈisキレート性ペプチドに機能的に連結したＲＢタンパ
ク質の６０kd カルボキシ末端Ｅ７結合領域を含有して
いる。ＣＰe−ＲＢは、Ｈis−Ｔrp−Ｈis−Ｈis−Ｈis
キレート性ペプチドに機能的に連結している全ＲＢタン
パク質又はその機能的誘導体を意味する。上記のよう
に、既述した種々のキレート性ペプチドも本発明を実施
するために使用することができる。ＣＰe−ＲＢ及びＣ
Ｐe−ＲＢ60タンパク質の両者をコードしているＤＮＡ
配列は、ＰＣＲ法により調製される。
【００７４】ＰＣＲ法の使用に関連する原理及び手法
は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,２版，
サンブルック(Sambrook,J.)、Fritsch,E.F.及びManiati
s,T.,コールド・スプリング・ハーバー・プレス，1989
に記載されている(この全教示を引用によって本明細書
に包含させる)。ＰＣＲ法に使用するよう説明されてい
るプライマーはすべて、アプライド・バイオシステムズ
３８０Ａ型又は３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置[Applied Bio
systems, フォスター・シティー，CA から市販されてい
る]を製造元の教示に実質的に従って利用するような、
当業界周知の方法により合成することができる。
【００７５】プラスミドpＢlueＢacＲＢの合成の模式図
を図７に示す。ＣＰe−ＲＢタンパク質をコードしてい
るＤＮＡ配列を、ＲＢ遺伝子の翻訳領域に相当するpＡb
Ｔ９３００プラスミドの２７９０bp 配列のＰＣＲ増幅
により、調製した。この２７９０bp コード化配列の増
幅に使用する５'−プライマーは、ＳpeＩ制限エンドヌ
クレアーゼ開裂部位をコードしている配列、Ｍet−Ｈis
−Ｔrp−Ｈis−Ｈis−Ｈisアミノ酸配列、及びＲＢ遺伝
子の最初の２０ヌクレオチドを含有している。この４８
−mer ５'−プライマーは以下のようである：
【化２】 他のキレート性ペプチド及び／又は制限酵素開裂部位を
含有するＣＰ−ＲＢタンパク質を発現させるために必須
のこの５'−プライマーに対する修飾は、当業者に明ら
かであろう。２７９０bp コード化配列の増幅に使用で
きる３'−プライマーは、ＳpeＩ及びＢamＨＩ制限エン
ドヌクレアーゼ開裂部位及びＲＢ遺伝子の最後の７コド
ンに相補的なＤＮＡ配列を含有している。この３７−me
r ３'−プライマーのＤＮＡ配列は以下のようである：
【化３】 ＰＣＲ法によって調製されたＣＰe−ＲＢタンパク質を
コードしているＤＮＡ配列をバクロウイルス発現プラス
ミドpＢlueＢac[Invitrogen Corporation, サンジェゴ,
カリフォルニア]に挿入した。プラスミドpＢlueＢacの
制限部位および機能地図を図８に示す。
【００７６】バクロウイルス発現系により、原核生物発
現系の顕著な利点が提供される。この態様の主要な利点
はウイルスのゲノムが巨大なことであり(１３０kbp)、
巨大であるため、他のキレート性ペプチドを含有するＣ
Ｐe−ＲＢコード化配列又はＣＰ−ＲＢコード化配列な
どの外来ＤＮＡセグメントの大部分を収容できる。次ぎ
に、バクロウイルスは脊椎動物に対して非感染性である
こと、即ち腫瘍遺伝子が発現しても顕著な安全性の利点
を有することである。バクロウイルスの生活環の概説
は、Doerfler,W.及びBohm,P.のThe Molecular Biology
of Baculoviruses, スプリンガー−ベルラーグ, ニュー
ヨーク(1986)に見いだすことができる。野生型バクロウ
イルスのポリヘドリン遺伝子を相同的組換えによって外
来遺伝子と置き換え、組換えバクロウイルスを生成させ
る。ポリヘドリン遺伝子の発現を喪失させると、特有の
プラーク形態が現れた。外来(ＣＰ−ＲＢ)ＤＮＡがポリ
ヘドリンＤＮＡの両側にフランキングするよう外来(Ｃ
Ｐ−ＲＢ)遺伝子を特別のバクロウイルス発現ベクター
に挿入し、組換えバクロウイルスを調製した。本明細書
に例示しているように、約２，８１０bp ＣＰe−ＲＢ
ＰＣＲ産物をＳpeＩで開裂させ、pＢlueＢac バクロウ
イルス発現ベクターの唯一のＮheＩ制限部位に挿入し
た。ＮheＩ又はＳpeＩの開裂により作成される末端は同
一であるので、ＮheＩ又はＳpeＩによって開裂させた２
つのＤＮＡ分子は互い連結することができる。ＣＰe−
ＲＢ配列をpＢlueＢac に組込むことにより作成された
ベクターをpＢlueＢacＲＢと命名する。本発明の実施に
有用である他のバクロウイルス発現ベクターとしては、
pＶＬ９４１、pＶＬ１３９３、pＶＬ１３９２、pＡc７
００、pＡc７０１及びpＡc７０２が挙げられるが、これ
らに限定されない。ＣＰ−ＲＢコード化配列を調製する
のに使用される５'及び３'ＰＣＲプライマーに必須であ
る、これら代替ベクターに組込むための修飾は、当業者
であれば容易に理解されるであろう。
【００７７】次いで、外来(ＣＰ−ＲＢ)ＤＮＡを含有す
るベクターを精製野生型バクロウイルスＤＮＡと共に昆
虫細胞にトランスフェクトする。プラスミドpＢlueＢac
ＲＢ(図９)をスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera
frugiperda)Ｓf９細胞にトランスフェクトする。相同的
組換えにより、外来(ＣＰ−ＲＢ)遺伝子はポリヘドリン
遺伝子と置き換わる。組換えが成功したなら、外来(Ｃ
Ｐ−ＲＢ)遺伝子はポリヘドリンプロモーターの制御下
に置かれることになる。組換えが成功した細胞は野生型
ウイルス又はポリヘドリン遺伝子を発現するウイルスに
よって感染された細胞の特徴である明るい光沢のある外
観を欠いているので、それらは光学顕微鏡によって容易
に同定される。pＢlueＢac である場合、コロニーは、
Ｘ−ガルの存在下に培養した場合にpＢlueＢac 親ベク
ター遺伝子のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子によって産生
される特徴的な青色によって組換えバクロウイルスの存
在を示す。次いで、組換えの可能性あるプラークをスク
リーニングし、それらがＣＰ−ＲＢタンパク質を産生す
るか否かを決定する。次いで、陽性の組換え体を野生型
組換え体が無くなるまでプラーク精製する。
【００７８】先に概略示した方法と同様の方法により、
ＲＢ遺伝子の６０kd Ｃ末端領域に相当するpＡbＴ９３
００プラスミドの約１２９０bp フラグメントをＰＣＲ
増幅することにより、ＣＰ−ＲＢ60タンパク質をコード
しているＤＮＡ配列を調製する(図１０)。先端削除した
ＲＢコード化配列の増幅に使用される５'−プライマー
は、ＳpeＩ及びＮsiＩ制限エンドヌクレアーゼ開裂部
位、Ｍet−Ｈis−Ｔrp−Ｈis−Ｈis−Ｈisキレート性ペ
プチド、及びＭet３８７に相当するコドンから始まる先
端削除ＲＢ遺伝子の最初の２２ヌクレオチドを含有して
いる。この５０−mer ５'−プライマーは以下で示され
る:
【化４】 Ｍet−Ｈis−Ｔrp−Ｈis−Ｈis−Ｈisキレート性ペプチ
ド以外のキレート性ペプチドが本発明の実施に使用でき
ることに留意すべきである。上記の５'−プライマーに
施し、表１に示すような他のキレート性ペプチドを含有
するＣＰ−ＲＢ60タンパク質を発現するための修飾は、
当業者ならば容易に理解される。先端削除ＲＢの増幅の
ために使用される３'−プライマーは、完全長のＲＢ Ｄ
ＮＡ配列のＰＣＲ増幅に使用する３'−プライマーと同
じプライマーである。
【００７９】プラスミドpＲＢ60は、ＣＰ−ＲＢ60タン
パク質を発現するプラスミドである。プラスミドpＣＺ
Ｒ３２２のhＧＨコード化配列をＰＣＲによって調製さ
れるＣＰ−ＲＢ60コード化配列と置き換えることで、プ
ラスミドpＲＢを調製する。この操作の模式図を図１０
に示す。プラスミドpＣＺＲ３２２をＮdeＩ及びＢamＨ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼで開裂し、hＧＨコード化配
列を切除する。５．８kbＢamＨＩ−ＮdeＩベクターフラ
グメントをアガロースゲル電気泳動により単離し、次い
で子牛腸アルカリホスファターゼで処理して線状ＤＮＡ
分子から５'リン酸基を除去する。ＣＰ−ＲＢ60ＰＣＲ
産物をＮsiＩ及びＢamＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消
化した。５'リン酸基を有する得られたＣＰ−ＲＢ60Ｄ
ＮＡ配列を合成リンカー及びＴ４ ＤＮＡリガーゼの存
在下に脱リン酸化ＤＮＡに加える。配列：５'−ＴＡＴ
ＧＣＡ−３'を有する１本鎖デオキシリボヌクレオチド
リンカーを使用し、ＮdeＩエンドヌクレアーゼによって
切断したベクターの末端をＮsiＩ制限エンドヌクレアー
ゼによって切断したＣＰ−ＲＢ60コード化配列の末端に
連結する。得られたプラスミドをpＲＢ60と命名する。p
ＲＢ60の制限部位および機能地図を図１１に示す。次い
で、連結混合物を使用し、コンピーテントなＥ.coli Ｄ
Ｈ５αＦ1細胞[ＢＲＬ，ガイセルスベルグ，ＭＤ]を直
接形質転換する。
【００８０】上記のＥ.coli 細胞から単離した発現プラ
スミドp１６Ｅ７e及びpＲＢ60をコンピーテントなＥ.co
li 株Ｌ２０１細胞[M.Lei、Lilly Research Laboratori
es]に導入する。５μｇ/ml テトラサイクリンを含有す
る２×ＴＹブロス中で、細胞を３０℃でＯＤ600＝０．
６−０．８にまで増殖させ、次いで４２℃で１６時間増
殖させることによりタンパク質発現を誘発させた。４４
００×Ｇの遠心１０分により細胞を採取した。試料緩衝
液(０．０６２Ｍ トリス-ＨＣl pＨ６．８、２％ＳＤ
Ｓ、１０％グリセリン、５％２−メルカプトエタノー
ル、０．００１％ブロムフェノール・ブルー)中、１０
０℃で５分間加熱することにより、細胞を細胞溶解し、
Laemmli(1970)の教示に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
りタンパク質分析を行った。
【００８１】ＣＰ−ＲＢ60及びＣＰ−Ｅ７タンパク質の
同定は、以下のようにしてウェスターン・ブロット分析
により行った。誘発したp１６Ｅ７e−又はpＲＢ60−を
含有するＬ２０１細胞から得たタンパク質をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより分離し、０．０５Ｍ トリス-ＨＣl pＨ
８．３、０．３８Ｍ グリシン、２０％メタノール中、
４０ボルト(２００−３００mＡ)で１６時間かけてニト
ロセルロースに電気泳動的に移動させた。以後のすべて
の工程は振盪させながら２２℃で行った。フィルターを
５％ＢＬＯＴＴＯ(５％乾燥ミルク粉末、２０pｇ／ml
チメロサール(thimerosal)、消泡剤Ａ(Antifoam A))で
１６時間ブロックし、ＴＢＳ−Ｔween(２０mＭトリス-
ＨＣl、５００mＭ ＮaＣl、０．０５％Ｔween、pＨ７．
５)で２回洗浄し、ＨＰＶ１６ Ｅ７に対するマウスモノ
クローナル抗体[Triton Biosciencis,アラメダ,CAから
市販されている]又はＲＢに対するウサギポリクローナ
ル抗体のそれぞれＴween-３％ＢＬＯＴＴＯ中１：１０
０又は１：２０，０００希釈物と共に２時間インキュベ
ートした。次いで、フィルターをＴＢＳ−Ｔweenで１０
分間洗浄した。ＴＢＳ−Ｔween−３％ＢＬＯＴＴＯ中で
それぞれ１：６６７に希釈したビオチン化ヤギ−抗-マ
ウス抗体又はビオチン化ヤギ−抗-ウサギ抗体[ＢＲＬ，
ガイセルスバーグ，ＭＤ]を加え、１時間インキュベー
トした。次いで、フィルターをＴＢＳ−Ｔweenで５分間
３回洗浄した。０．０５％Ｔweenを含有するＡＰ７．５
(０．１Ｍ ＮaＣl、２．０mＭ ＭgＣl2、pＨ７．５)で
１：１２，０００に希釈したストレプトアバジン(Strep
tavadin)−アルカリホスファターゼのコンジュゲート体
を加え、１０分間インキュベートした。フィルターを
０．０５％Ｔweenを含有するＡＰ７．５で１０分間２回
洗浄し、次いで炭酸塩緩衝液(０．１Ｍ ＮaＨＣＯ3、５
０mＭ ＭgＣl2、pＨ９．８)で２回洗浄した。ニトロブ
ルー・テトラゾリウム・クロライド(７０％Ｎ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミド中７５mｇ/ml)４４ml 及び５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−p−トルイジン塩(１
００％Ｎ−ジメチルホルムアミド中５０mｇ/ml)３３ml
を炭酸塩緩衝液に加え、使用直前に発色溶液を調製し
た。この発色溶液をフィルターに加え、所望の強度にな
るまでインキュベートした。希釈水で１０分間すすいて
発色を停止させ、発色溶液が完全に除去するよう少なく
とも１回水交換を行った。
【００８２】ＣＰe−ＲＢ60とＣＰe−Ｅ７タンパク質と
を過剰に産生するように工作された大腸菌(Ｅ．coli)は
発現産物に富む封入体または顆粒を含有しており、精製
の第１工程として単離された。凍結細胞ペーストを懸濁
し、４mg／mlリゾチームを含有するＮa2ＥＤＴＡを加え
た。高度に粘性となった溶液を、次いで、さらに３０分
間氷上で冷却した。冷却懸濁液をヴィヴラセル・ソニケ
ーター(Ｖibracell sonicator)でソニケートし、細胞
を溶解した。ライゼート(溶解液)を遠心し、ペレットを
１ＭＮaＣlで洗浄した。次いで、ペレットを１Ｍ尿素、
次いで、蒸留水で洗浄した。洗浄ペレットを凍結乾燥
し、亜硫酸分解試薬(７．５Ｍ尿素、０.５ＭＴris、１
００mＭＮa2ＳＯ3、１０mＭＮa2Ｓ4Ｏ6,pＨ８.２)に再
溶解し、Ｅ７およびＲＢ60中のシステインをＳ−スルホ
ネートに変換した。反応物を室温で３時間またはそれ以
上撹拌した。
【００８３】亜硫酸分解反応混合物を０.４５ミクロン
のフィルターで濾過し、記載の方法[スミスら(Ｓmith
et al．)１９８７]で調製したＮi(ＩＩ)またはＣo(Ｉ
Ｉ)ＩＭＡＣカラムに適用した。既述のごとく、Ｎi(Ｉ
Ｉ)は、ＣＰ−タンパクと金属イオンとの動力学的に不
活な錯体（コンプレックス)の生成ではなく、精製の目
的には用い得る。本明細書に例示したように、ＣＰ−Ｒ
ＢおよびＣＰ−ＲＢ60タンパク質は樹脂にロック(lock)
されないはずなので、Ｎi(ＩＩ)をこれらのタンパク質
の単離に用いた。本明細書に記載の本発明の好ましい実
施態様では、Ｃo(ＩＩ)カラムを調製する場合には、全
バッファーおよび水を脱気し、ヘリウム洗浄(パージ)を
行って空気を排除し、Ｃo(ＩＩ)のＣo(ＩＩＩ)への早す
ぎる(プレマチュア)酸化を防止する。亜硫酸分解溶液の
１ml試料をカラムに注入し、通常約１.５カラム容量の
Ａバッファーを用い、基線が０に戻るまで０.２ml／分
で洗浄する。次いで、pＨを下げるか、イミダゾール等
の置換試薬を加えるか、のいずれかの方法で結合したＣ
Ｐ−Ｅ７およびＣＰ−ＲＢ60タンパク質を溶離すること
ができる。pＨ漸減グラジエントを調製するのに用いる
Ｂバッファーは５０mＭ酢酸、０.５ＭＮaＣl、７Ｍ尿
素、pＨ３.７であった。１５０分間でＢを０−１００
％、または約３倍カラム量、用いるとpＨ７.５から３.
７の線状グラジエントが得られた。本明細書に記載の本
発明の好ましい実施態様では、ＣＰ−Ｅ７およびＣＰ−
ＲＢ60タンパク質をイミダゾールグラジエントで溶離し
た。イミダゾールグラジエントを調製するのに用いたＢ
バッファーは０.５Ｍイミダゾール、５０mＭＮaＨ2ＰＯ
4、０.５ＭＮaＣl、７Ｍ尿素、pＨ７.５であった。ＣＰ
−ＲＢおよびＣＰ−ＲＢ60タンパク質の溶離には０−１
００％Ｂ３００ml、または約４.５カラム容量を用い
た。クロマトグラムのピークのタンパク質含量を、Ｎov
ex Ｔricine−ＰＡＧＥゲルシステムを用いるＳＤＳ−
ＰＡＧＥ、およびウエスタンブロットによって求めた。
ＣＰ−ＲＢ60およびＣＰ−Ｅ７を含有する画分を分取し
た後、セファデックスＧ２５カラムで脱塩した。次い
で、脱塩したプールを凍結乾燥した。ＡＢＩ４７７Ａプ
ロテインシーケンサーを用い、業者の指示に従い、ＣＰ
−ＲＢ60およびＣＰ−Ｅ７のＮ−末端配列を得た。ＣＰ
−ＲＢ60およびＣＰ−Ｅ７タンパク質のアミノ酸分析は
ベックマン６３００自動分析器を用いて行った。
【００８４】分析システムにおけるその役割を果たさせ
るために、ＣＰタンパク質を支持体−固定化金属イオン
に“ロック"した。金属イオンはＴoyopearlＲ ＡＦ−
キレート６５０Ｍ(ＴosoＨaas,Ｒohm and Ｈaas Ｂu
ilding, Ｉndependence Ｍall Ｗest, Ｐhiladelphi
a, ＰＡ１９１０５)のような樹脂に２機能性分子を介し
て結合させるとよい。そのような２機能性分子は２つの
領域を有する:１つは選択した樹脂に結合するように企
画され、第２はＩＤＡのように金属イオンとのキレート
結合能力を有し、金属イオンを樹脂に固定化し、金属イ
オンをＣＰタンパク質が接近し得るコンホメーション
(立体配座)に保持する手段とを提供する。
【００８５】本明細書に例示したように、ＣＰe−Ｂ７
タンパク質は以下の方法で支持体にロックされた。固定
化ＩＤＡ−Ｃo(ＩＩ)−ＣＰe−Ｅ７錯体を含有するカラ
ムの内容物を試験管に移した。沈降したゲルの上方の空
間を酸素または酸素含有ガスで置換し、キャップをし
た。試験管を２４時間連続的に反転させて酸素含有ガス
と固定化ＩＤＡ−Ｃo(ＩＩ)−ＣＰe−Ｅ７錯体を含有す
るビーズとを混合してＣo(ＩＩ)をＣo(ＩＩＩ)に酸化し
た。それによりＣＰe−Ｂ７は“ロックされた"コンホメ
ーションをとっていると仮定する。次いで、等量ずつの
固定化ＩＤＡ−Ｃo(ＩＩ)−ＣＰe−Ｅ７錯体を有するビ
ーズを、たとえばエッペンドルフ管、またはマイクロタ
イタープレートのウエルような反応容器に移す。次い
で、被検化合物をＩＤＡ−Ｃo(ＩＩ)−ＣＰe−Ｅ７錯体
を含有する反応容器に導入する。次いで、ＲＢ、ＣＰe
−ＲＢ、ＲＢ60またはＣＰe−ＲＢ60タンパク質を管に
加える。腫瘍タンパク質(oncoprotein)／抗腫瘍タンパ
ク質複合体の形成の存在は、様々な方法で決定すること
ができる。本発明の好ましい実施態様では、分析に蛍光
標識したＲＢ、ＣＰe−ＲＢ、ＲＢ60またはＣＰe−ＲＢ
60を用いて蛍光強度を記録することにより結合を測定す
る。あるいは、腫瘍タンパク質を放射能または酵素との
コンジュゲート(複合体)として標識してもよい。直接的
な腫瘍タンパク質の修飾はすべて腫瘍タンパク質／抗腫
瘍タンパク質複合体の形成を阻害しないような方法で達
成される必要がある。あるいは、酵素的に、蛍光的に、
または放射活性に標識された腫瘍タンパク質の抗体を管
に導入し、腫瘍タンパク質／抗腫瘍タンパク質複合体の
存在を測定することができる。
【００８６】本発明はさらに固体支持体上に免疫反応性
タンパク質を配向するための方法を提供するものであっ
て、該方法は:(a)式: [ＢＡＭ−(spacer1)x−chelator1−(Ｍ)−chelator2−
(spacer2)y]n−固体支持体 (式中、ＢＡＭは免疫反応性タンパク質、spacerは１〜
５０モノマー単位のポリペプチド、タンパク質、多糖
類、ポリヌクレオチド、または合成有機部分、Ｍは動力
学的に不活性な遷移金属イオン錯体を形成することがで
きる遷移金属イオン、Ｍは動力学的に不安定な酸化状態
にある、xは０または１、yは０または１、nは固体支持
体に結合しているモノマーの数を表す)で示される処方
化合物を形成し、および(b)該遷移金属イオンの酸化状
態を動力学的に不活な酸化状態に変化させる工程からな
る。
【００８７】ＩＰ分子類は通常、イムノアフィニティー
クロマトグラフィー工程および免疫学に基づく臨床試験
用のキットに用いられるために、様々な化学手段を通し
て固体支持体に結合する。一般に用いられる結合法、例
えばリジン残基を介しての結合、はしばしば免疫学的反
応性分子のランダム (無作為な）コンフィギュレーショ
ン(立体配置)をもたらす。結果的に、多くのＩＰ分子類
の抗原結合部位が、抗原にとって接近不可能となる。従
って、特定量の抗原の当量の結合を得るには過剰量のＩ
Ｐが必要である。さらに、従来の結合法の無作為な配向
により接近不可能になった抗原結合部位に関して暴露さ
れるこれらＩＰ分子類の抗原結合部位のフラクションを
正確に定性することができなければ、たとえ生成物の正
確さが適切以上であったとしても、ロット間の一致性を
確保することは困難である。従って、抗原結合部位(類)
が周囲環境、つまり潜在抗原に最大にさらされるように
ＩＰ分子を配向させることが望ましい。本発明はＩＰ分
子の特異的な配向を達成し、それに伴い、上で該説した
望ましい目的を達成する方法を提供するものである。
【００８８】抗体配向作用は図２４−２９に図示されて
いる。図２４はＰＢＳ(pＨ７)の下で１２マイクロメー
タースキャナーヘッドと１００マイクロメーターカンチ
レバー(cantilever)を用いてイメージ形成した、破壊し
たばかりの雲母(アルミノケイ酸塩)表面の原子力顕微鏡
像である。原子力はおよそ１０-7ニュートンである。図
から、破壊したばかりの雲母表面をこれらの条件下で観
察すると、肉眼視像、および原子的な像のいずれでもフ
ラットであることが分かる。図２５はニッケルに暴露し
た後の雲母表面の原子力顕微鏡像である。塩化ニッケル
を破壊したばかりの雲母表面に暴露し、洗浄し、風乾
し、同じ条件下で像を観察した。この写真はニッケルを
なじませた(含浸させた)雲母表面もこれらの条件下で原
子的にフラットであることを示している。
【００８９】次いで、タンパク質の原子力顕微鏡像を調
べ、固定化金属イオンを介してタンパク質の配向および
固定化が達成されたか否かを決定した。図２６は裸ＣＨ
ＥＬ１３タンパク質と接触させた雲母の原子力顕微鏡像
である。ＣＨＥＬ１３を破壊したばかりの雲母表面に暴
露させ、上記と同様の条件下で像を形成させた。カンチ
レバーの動きに伴うタンパク質の塗末化（smearing)
は、裸のタンパク質のみでは雲母表面に結合しないこと
を示している。ＣＨＥＬ１３タンパク質は１０-9Ｎの低
強度で押し付けられた(プッシュされた)。図２７は、キ
レート化(chelating)ペプチドなしにＣＨＥＬ１３の親
抗体であるＸＣＥＭ４４９に暴露させた、ニッケルをな
じませた雲母表面の原子力顕微鏡像である。表面は上記
図２６と同様に調製し、上記同様の条件下で像を形成さ
せた。カンチレバーによるタンパク質の塗末形成から、
キレート化ペプチド不在下では、抗体のニッケル含浸雲
母表面に特異的な結合がないことが分かる。
【００９０】次いで、キレート化ペプチドを含有するタ
ンパク質をニッケルをなじませた雲母表面に暴露した。
図２８はＣＨＥＬ１３に暴露した後の雲母ニッケルの原
子力顕微鏡像である。球状構造のサイズ測定はそれらが
約１４２オングストローム×３４オングストロームであ
ることを示している。これは従来の電子顕微鏡で示され
たＩgＧ１抗体の測定値、１５０オングストローム×３
８オングストロームに似通っている。距離のカンチレバ
ー測定は測定された構造の厳密性に依存している。この
写真で示された球状構造はカンチレバーと一緒には動か
ず、キレート化ペプチドを含有するタンパク質はニッケ
ルをなじませた雲母表面に結合することを示している。
【００９１】固定化が単にＣＨＥＬ１３タンパク質のな
んらかの特殊な側面によるものではなく、表面への結合
が固定化された金属イオンを介して起こることを確かに
するために、ＣＨＥＬ１３を含む結合ニッケルイオンを
ニッケルをなじませた雲母表面に暴露した。図２９にこ
の実験を示す。カンチレバーによって動かしたタンパク
質は最高の塗末像を与えた。図２８で得られた結果と比
較すると、これは、タンパク質が雲母に結合するのでは
なく、雲母表面への特異的な結合が、まさにニッケルイ
オンを介して起きていることを示唆している。
【００９２】本明細書に例示の本発明の好ましい実施態
様では、ＩＰ類をＣＰ−タンパク質形に導入する。既述
のごとく、ＣＰ−ＩＰは組換えＤＮＡ法で合成するか、
または液相または固相ペプチド合成、または従来の溶液
法で結合させたタンパク質フラグメントを開始に用いる
溶液中半合成法等の周知の化学的工程で合成してもよ
い。組換えＣＰ−ＩＰ類(ＣＰ−ＩＰs)は分子の抗原結
合部位をコードするＤＮＡ配列の遠位の暗号配列の領域
内にキレート形成ペプチドをコードするＤＮＡ配列を挿
入することにより製造される。そのようなＣＰ−ＩＰ類
は他のＣＰ−タンパクの固定化金属イオン結合能力を有
する。そのようなＣＰ−ＩＰ類の抗原結合部位の暴露を
最大にする本発明方法を用いる場合、ＩＰ分子の抗原結
合部位から遠位の金属結合部分に結合することが好まし
い。これらのＣＰ−ＩＰ類は次いで、従来のＣＰ−ＩＭ
ＡＣ法で生成し、および／または、動力学的に不活な錯
体を達成するために、結合金属イオンの酸化状態を変え
ることにより支持マトリクスにロックされる。
【００９３】広範なＩＰ分子のＤＮＡ配列が知られてお
り、単離されている。これらはまた、それらの元の構造
にキレート化ペプチドを導入することで本発明方法に用
いるようにすることができる。そのようなＩＰ類の例と
して、抗体フラグメント(Ｆab、Ｆab'、Ｆab2'およびＦ
vフラグメントがあるが、これらに限定されない)、キメ
ラ、擬人化、またはＣＤＲ−接続抗体等であって、それ
らが導かれた親抗体の抗原結合能力と同じ性質の抗原結
合能力を有するもの、および“１本鎖ポリペプチド結合
分子"を挙げることがことができるが、これらに限定さ
れない。好ましいＩＰ類はＣＥＭ、ＣＥＬ００７、また
はＭab３５抗体またはその抗原結合フラグメント、ＣＨ
Ａ２５５抗体またはそのフラグメント、およびＣＥＭ２
３１.６.７のＦvフラグメントを含む。
【００９４】ＦＶ分子は抗体のＶh(免疫グロブリンＨ鎖
の可変領域)フラグメントおよびＶＬ(免疫グロブリンＬ
鎖の可変領域)フラグメントが一緒になって形成される
２量体を表す。Ｆv−ＣＰなる記号はキレート化ペプチ
ドと共有結合で結合したＦv分子を意味し、その結合は
Ｆv分子の抗原結合能力を損なわない。プロペプチド配
列の開裂および成熟Ｆv−ＣＰ分子の集合はペリプラズ
ムへの移動の間に起き、培地に分泌される活性なＦv−
ＣＰ分子を与える。得られたＦv−ＣＰ分子の安定性は
ＶhおよびＶＬ領域間の接近した会合領域内でのジスル
フィド結合の形成を可能にするシステイン残基を含ませ
ることにより増大され得る。
【００９５】本明細書で例示したように、His-Trp-His-
His-Hisキレート化ペプチド配列をコードするＤＮＡ配
列はＣＥＭ２３１.６.７抗体のＨ鎖抗体フラグメントの
可変領域の３’末端のフレーム内（インフレーム）に挿
入された。ＣＥＭ２３１.６.７抗体のＨ鎖抗体フラグメ
ントのＤＮＡ配列はプラスミドｐＮＣＥＭＧ１に含有さ
れている。プラスミドｐＮＣＥＭＧ１の構築の詳細は欧
州特許出願８９３０２３１２.７（公開番号０ ３３２
４２４、１９８９年９月１３日公開）に開示されてお
り、本明細書ではその全記載を引用する。ＣＥＭ２３
１.６.７抗体のＬ鎖抗体フラグメントのＤＮＡ配列はプ
ラスミドｐＣＥＭＫに含有されている。プラスミドｐＣ
ＥＭＫの構築の詳細は同じく、欧州特許出願８９３０２
３１２.７に記載されている。これら２つの暗号配列を
プラスミドｐＪＣＥＭＦｖ６に、Ｌｐｐプロモーターと
Ｌａｃオペレーター領域の調節下に導入した。プラスミ
ドｐＪＣＥＭＦｖ６の構築模式図は図１２および１３に
記載されている。このプラスミドの発現産物はＶｈフラ
グメントのカルボキシ末端にHis-Met-His-His-Hisキレ
ート化ペプチド配列を有するpro−Ｖｈフラグメントとp
ro−ＶＬフラグメントである。ＶＬおよびＶｈフラグメ
ントをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。プラ
スミドｐＪＣＥＭＦｖ６の構築に用いたＰＣＲプライマ
ーを表２に示し、以後は、その番号で表す。
【００９６】
【表２】 ｐＧＣＥＭＫのＶＬコード化配列の増幅に用いた５’お
よび３’ＰＣＲプライマーは、それぞれ、プライマー７
２５および７２６であった。プライマー７２５および７
２６は、それぞれ、ＢglＩおよびＰvuＩ制限エンドヌク
レアーゼ開裂部位に相当するポジティブ鎖配列をコード
する。ｐＮＣＥＭＧ１のＶｈコード化配列の増幅に用い
た５’および３’ＰＣＲプライマーは、それぞれ、プラ
イマー７７２および７２９であった。プライマー７７２
および７２９は、それぞれ、ＰvuＩおよびＢamＨＩ制限
エンドヌクレアーゼ開裂部位に相当するポジティブ鎖配
列をコードする。ＰＣＲで生産されたＶＬ領域をコード
化するＤＮＡをＢglＩおよびＰvuＩ制限エンドヌクレア
ーゼで消化した。ＰＣＲで生産されたＶｈ領域をコード
化するＤＮＡをＰvuＩおよびＢamＨＩ制限エンドヌクレ
アーゼで消化した。ＰvuＩ消化によってＶＬコード化配
列の５’末端およびＶｈコード化配列の３’末端に生成
した粘着末端は適合する。
【００９７】ベクターＶec１６ＣＨＡＫをＢglＩおよび
ＢamＨＩ制限酵素で消化し、ＶＬコード化配列の５’末
端およびＶｈコード化配列の３’末端のそれぞれに適合
する粘着末端を生成させた。ベクターＶec１６ＣＨＡＫ
は以下のようにして構築される。プラスミドｐＵＣ１８
をＥcoＲＩおよびＨindIII制限エンドヌクレアーゼで消
化した。プラスミドｐＵＣ１８はＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ
（Ｇaithersburg, ＭＤ）から購入することができる。
プラスミドｐＵＣ１８の制限部位および機能地図を添付
の図１４に示す。ベクターＤＮＡの約２.６kb断片を、
実質上、マニアティス（Maniatis,T)、フリッツ（Frits
h,E.F.)およびサムブルック(Sambrook,J.)の方法［Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Ha
rbor Press(1982), p.150-172］に従い、臭化エチジウ
ム含有ＴＢＥ（Ｔris−ボレート電気泳動バッファー、
０.０８９ＭＴris、０.０８９Ｍホウ酸、０.００２ＭＥ
ＤＴＡ）アガロースゲル上で単離、精製した。ＤＮＡを
長波長（３００−３６０ｎｍ）ＵＶ光で観察し、ＥcoＲ
Ｉ−ＨindIII消化ベクターＤＮＡに相当するバンドをＤ
Ｅ８１ＤＥＡＥペーパー上に、電気泳動で単離した［シ
ュレイヒャー（Schleicher)およびシュエル(Schuell),
Keene, NH］。ＤＮＡを１ＭＮaＣlでメンブランから溶
離した後、エタノール沈殿させた。
【００９８】式：
【化５】 および
【化６】 で示される２個の合成オリゴヌクレオチドをアプライド
バイオシステムスモデル３８０Ａまたは３８０ＢＤＮＡ
合成装置（Applied Biosystems Model 380A or 380B DN
A synthsizer）（Applied Biosystems、 Foster City, C
A)を用いて合成し、アニーリングした。これら２個のオ
リゴヌクレオチドをアニーリングして得られた２本鎖ポ
リリンカーをｐＵＣ１８の約２.６kbベクターＤＮＡに
結合させた。得られたベクターをＶec１６ＣＨＡＫと呼
称する。Ｖec１６ＣＨＡＫの制限部位および機能地図を
図１５に示す。ベクターを結合（ライゲート）し、得ら
れたプラスミドをｐＵＣＥＭＦｖ１と命名した。
【００９９】プラスミドｐＵＣＥＭＦｖ１を次いで、Ｘ
baＩおよびＥco１０９で消化した。ＸbaＩ−Ｅco１０９
消化断片を工程の後の段階でプラスミドｐ６ＣＥＭＦｖ
６に結合させるために保存した。プラスミドｐＵＣＥＭ
Ｆｖ１はさらにompＡ−ＶＬおよびompＡ−Ｖｈコード化
配列の増幅の鋳型として用いられた。ompＡ−ＶＬ暗号
配列のための５’および３’プライマーは、それぞれプ
ライマー８３０および８２４である。このようにしてＸ
baＩおよびＡspＩ制限部位で囲まれたompＡ−ＶＬ断片
が得られた。ompＡ−Ｖｈ領域の増幅には５’プライマ
ー８２３と３’プライマー８２８を用いた。ompＡシグ
ナルペプチドはギライブらによって記載された［Ghraye
b,J. et al.,EMBO J. ３: 2437-2442 (1984)］。このよ
うにしてＡspＩおよびＢamＨＩ制限部位で囲まれたomp
Ａ−Ｖｈ断片が得られた。これらの断片をＸbaＩ、Ａsp
ＩおよびＢamＨＩで消化して粘着末端を生成させ、Ｘba
ＩおよびＢamＨＩ消化ｐＵＣ１８ＤＮＡに付加した。ｐ
ＵＣＥＭＦｖ４と命名された生成ベクターを再結合さ
せ、これを用いてコンピテントＥ.coli ＤＨ５α細胞を
上記同様に形質転換した。
【０１００】ＣＥＭ２３１.６.７のompＡ−Ｖｈフラグ
メントをコードする、プラスミドｐＧＣＥＭＦｖ４のＡ
spＩ−ＢamＨＩ断片をＰＣＲの鋳型として用いた。用い
た３’ＰＣＲプライマー（＃８７２）はHis-Trp-His-Hi
s-Hisキレート化ペプチドをコードする配列とＢamＨＩ
制限部位とを含有する。５’プライマー（＃８７１）は
ＡspＩ制限エンドヌクレアーゼ開裂部位をコードする。
ＰＣＲの後、この断片をＡspＩ−ＢamＨＩ消化ｐＵＣＥ
ＭＦｖ４ベクターに再結合した。得られたベクターをｐ
６ＣＥＭＦｖ１０と命名し、これを用いて上記のごとく
コンピテントＥ．coliＤＨ５α細胞を形質転換した。
【０１０１】ベクターｐＧＣＥＭＦｖ１０をＢamＨＩお
よびＥco１０９制限エンドヌクレアーゼで消化する。実
質上、上記と同様にして約０.３kbＥcoＲＩ−ＢamＨＩ
断片を単離、精製した。これをｐＵＣＥＭＦｖ１から得
たＸbaＩ−Ｅco１０９断片、および約２.６kbＸbaＩ−
ＢamＨＩ消化ｐＵＣ１８ベクターＤＮＡと、３断片ライ
ゲーションで結合させた。得られたベクターをｐ６ＣＥ
ＭＦｖ６と命名し、これを用いて上記のごとくコンピテ
ントＥ．coli ＤＨ５α細胞を形質転換した。プラスミ
ドｐ６ＣＥＭＦｖ６をＸbaＩおよびＢamＨＩ制限エンド
ヌクレアーゼで消化し、上記のごとく、タンデム（直
列）ＶＬおよびＶｈコード化配列を含有する断片を単
離、精製した。この断片をプラスミドｐＪＧ１０５のＸ
baＩ−ＢａｍＨＩ領域に挿入した。プラスミドｐＪＧ１
０５は先に得られたクロラムフェニコール耐性発現プラ
スミドであり、ギライブらによって記載された［Ｇｈｒ
ａｙｅｂ， ＥＭＢＯ Ｊ． ３: 2437-2442 (198
4)］。得られたプラスミドをｐＪＣＥＭＦｖ６と呼称す
る。この結果、ＶＬおよびＶｈタンデム配列がＬpp−Ｌ
acプロモーターおよびオペレーター領域のコントロール
下におかれる。プラスミドｐＪＣＥＭＦｖ６はまたクロ
ラムフェニコール耐性遺伝子をも含有する。
【０１０２】プラスミドｐＪＣＥＭＦｖ６プラスミドＤ
ＮＡを用いてＥ．coli ＤＨ１０Ｂ（ＢＲＬ，Gaithersb
urg, ＭＤ)を形質転換した。細胞を０.０、０.０１また
は０.１ｍＭのいずれかのイソプロピルチオガラクトシ
ドを含有する発現培地（24g/L Tryptone, 48g/L酵母エ
キス、6.1g/Lりん酸二ナトリウム、6.1g/Lりん酸一ナト
リウム)中、３０℃で一夜培養した。培養後、遠心して
菌を培地から分離し、ＥＬＩＳＡ阻害アッセイによって
ヒト発がん抗原（ＣＥＡ）に対する抗体活性を試験し
た。阻害アッセイは、まず９６ウエルのマイクロタイタ
ープレートをＣＥＡと反応するネズミモノクローナル抗
体ＣＥＶ１２４で被覆した。結合後、プレートをＣＥＡ
源と一緒にインキュベーションし、プレート上の抗体と
結合させた。被検物質またはＣＥＭ２３１.６.７のＦa
b'フラグメント（後者は阻害の標準曲線を与える）をプ
レートに加え、次いで、ビオチンに結合した抗体である
ＸＣＥＭ４４９抗体で希釈した。最後に、洗浄後、ビオ
チン抱合体の存在または不在をアビジン−ＨＲＰ、次い
で、ＯＰＤ基質（Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)と
の反応によって決定した。結果はＤＨ１０Ｂ中のｐＪＣ
ＥＭＦｖ６によりHis-Trp-His-His-Hisキレート化ペプ
チドを含有する活性なＦｖ抗体が産生されていることを
示している（Ｆab'標準曲線に基づいて）。
【０１０３】Ｆｖ−ＣＰ分子を含有する培養培地を次い
で、Ｆｖ分子の精製のために、固定化Ｃo（ＩＩ）イオ
ンを有する疎水性樹脂のカラムに導入した。非特異的に
結合したあらゆる分子を除去するためにカラムを弱い金
属イオン錯体形成剤で洗浄した。次いで、酸素または酸
素含有ガスを導入するか、あるいはＣo（ＩＩ）イオン
をＣo（ＩＩＩ）に酸化することはできるがＣＰ−Ｆv分
子をカラム材料にとって不活性な状態に酸化することは
ない、他の酸化剤を導入することにより、Ｃo（ＩＩ）
イオンをＣo（ＩＩＩ）に酸化した。本発明の好ましい
実施態様では、これをバッチ工程で行った。固定化ＩＤ
Ａ−Ｃo（ＩＩ）−ＣＰ−Ｆv錯体を含有するカラム内容
物を試験管に入れた。沈降したゲル上の空間を酸素また
は酸素含有ガスで置換し、キャップをした。試験管を２
４時間連続的に反転させて酸素含有ガスと固定化ＩＤＡ
−Ｃo（ＩＩ）−ＣＰ−Ｆv錯体を含有するビーズとを混
合してＣo(ＩＩ)をＣo(ＩＩＩ)に酸化した。この結果、
ＣＰ−Ｆv分子は固定化Ｃo(ＩＩＩ)イオンと動力学的に
不活性な錯体を形成した。この動力学的に不活性な固定
化ＩＤＡ−Ｃo（ＩＩＩ）−ＣＰ−Ｆv錯体を次いで、カ
ラム免疫精製クロマトグラフィーに、臨床試験キットの
試薬として用いることができ、あるいは様々に適用する
ことができる。
【０１０４】
【実施例】以下の実施例は単に本発明の実施を例示する
だけであり、本発明の範囲を限定するものとみなされる
べきではない。
【０１０５】実施例１：プラスミドｐ１６Ｅ７の作成 プラスミドｐ１６Ｅ７はＣＰ−Ｅ７発現ベクターｐ１６
Ｅ７ｅの親プラスミドである。Ｅ−７タンパク質のコー
ド配列はｐＨＰＶ１６プラスミド（Behringwerke,A.G.,
Heidelberg,Germany）から単離されたものであり、ｐＢ
Ｒ３２２（Dust等、１９８３年）のＢａｍＨＩ部位中に
クローニングされたＨＰＶ１６ゲノムを含有している。
ｐＨＰＶ１６プラスミドの制限部位および機能地図を図
２に示す。ｐＨＰＶ１６プラスミドをＮｃｏＩおよびＮ
ｓｉＩ制限エンドヌクレーゼで消化することにより、Ｈ
ＰＶ−Ｅ７構造遺伝子を含有する３０１塩基対のヌクレ
オチド配列を得る。
【０１０６】プラスミドｐ１６Ｅを構築するために、Ｅ
７遺伝子をコードするこの３０１ｂｐ断片をプラスミド
ｐＣＺＲ３２２中に挿入した。プラスミドｐＣＺＲ３２
２の制限部位および機能地図を図３に示す。ｐＣＺＲ３
２２はプラスミドｐＬ１１０から誘導された。プラスミ
ドｐＬ１１０は大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＬ１１０
株から得た。プラスミドｐＬ１１０の構築および大腸菌
Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＬ１１０株は、米国特許第４８
７４７０３号、Jaskunas,S.Richard、１９８９年１０月
１７日発行（この文献の教示はすべて本明細書の一部を
構成する）によって提供されている。大腸菌Ｋ１２ Ｒ
Ｖ３０８／ｐＬ１１０細菌を、５０μｇ／ｍｌカナマイ
シンを補足したＴＹブロス（１％トリプトン、０．５％
酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）
中、２５℃で、従来の微生物学的手法に従って培養し
た。この培養を新鮮なブロス中に１：１０に希釈して３
７℃で３時間インキュベートした後、その培養の約０．
５ｍｌを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、約
１５秒間遠心分離した。特に示さない限り、すべての操
作を周囲温度で行った。得られた上清を微量チップ吸引
器で慎重に除去し、その細胞ペレットを直前に調製した
リゾチーム溶液（２μｇ／ｍｌリゾチーム、５０ｍＭグ
ルコース、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、および２５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８）約１００μｌ中に再懸濁した。
アルカリ−ＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）溶液
（０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％ ＳＤＳ）約２００μｌを
加え、そのチューブを穏やかに反転させた後、溶解が完
結するまで（〜５分間）０℃に保った。次に、３Ｍ酢酸
ナトリウム約１５０μｌを加え、数秒間反転させること
によってチューブの内容物を穏やかに混合した。このチ
ューブを少なくとも６０分間０℃に保った後、１５分間
遠心分離することにより、ほぼ透明な上清を得た。この
上清を新しい遠心チューブに移し、これに３体積の冷１
００％エタノールを加えた。このチューブをドライアイ
ス／エタノール上に５分間置いた後、得られた沈殿を遠
心分離（５分間）によって集め、その上清を吸引除去し
た。集めたペレットをＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）１００μｌに溶
解した。これが目的のｐＬ１１０プラスミドＤＮＡであ
る。
【０１０７】ｐＬ１１０の目的の〜５．８ｋｂ断片を以
下の方法で得た。プラスミドｐＬ１１０約５μｇを、高
塩濃度緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、
５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）５０μｌ中で、Ｘ
ｂａＩ制限酵素〜１０単位と共に、３７℃でインキュベ
ートした。約０．５時間後、ＢａｍＨＩ〜１０単位を加
え、その溶液を約０．５時間インキュベートした。目的
の〜５．８ｋｂＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ制限断片を従来の
方法で、アガロースゲル電気泳動（Maniatis等、１９８
２年）によって分離し、単離した後、これをＴＥ緩衝液
約１００μｌに溶解し、使用するまで０℃で保存した。
プラスミドｐＣＺ２４４をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制
限エンドヌクレアーゼで消化し、基本的に上記の方法に
準じてその〜０．８ｋｂ断片を単離した。
【０１０８】プラスミドＰＬ１１０の〜５．８ｋｂＢａ
ｍＨＩ−ＸｂａＩ断片約１μｇおよびプラスミドｐＣＺ
２４４の〜０．６ｋｂＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片０．５
μｇを連結し、得られたプラスミドを、基本的に上記の
教示に従って実行する大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８の形質
転換に使用した。プラスミドｐＣＺ２４４はプラスミド
ｐＣＺＲ１１４０から誘導された。ｐＣＺＲ１１４０の
構築については、Schoner,R.G.等、欧州特許出願第８５
３０１４６９．４号、公開番号０１５４５３９（１９８
５年９月１１日公開）（この文献の教示する内容はすべ
て本明細書の一部を構成する）に認めることができる。
プラスミドｐＣＺＲ１１４０をＣｌａＩで消化し、その
末端をクレノーで補充し、再連結することによって、そ
のＣｌａＩ制限部位を除去した。このプラスミド中に、
Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔヒトプロインスリン誘
導体をコードする次に示すＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ配列を
挿入することにより、ｐＣＺ２４４を作成した：
【化７】
【０１０９】得られた形質転換体のいくつかは、従来の
アガロースゲル電気泳動（Maniatis等、１９８２年）お
よび他の試験で示されるように、目的の〜６．４ｋｂプ
ラスミドのみを含有している（図１１）。本明細書で大
腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＣＺＲ２４４１と命名した
このような形質転換体を１つ選択し、これを適切な抗生
物質を含むＴＹ寒天培地に接種して、従来の微生物学的
手法を用いて培養した。プラスミドｐＣＺＲ２４４１を
ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩで上記のように消化し、Ｎｄ
ｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位に隣接するｍｅｔ−ｈＧ
Ｈをコードする次の配列：
【化８】 で置換した。得られた〜６．４ｋｂのベクターをｐＣＺ
Ｒ３００．１と命名する。ｐＣＺＲ２４４１の〜６．４
ｋｂＸｂａＩ−ＮｄｅＩ断片を次のリンカー：
【化９】 を用いて連結することによって、ｐＣＺＲ３００．１か
らｐＣＺＲ３２２を誘導した。
【０１１０】プラスミドｐＣＺＲ３２２は、ラムダｐＬ
プロモーターの下流にクローニングされたヒト成長ホル
モン（ｈＧＨ）遺伝子を含有する。このｈＧＨコード配
列を、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いてＥ７コ
ード配列に置換することによって、プラスミドｐ１６Ｅ
７を作成した。この操作法の概略図を図４に示す。プラ
スミドｐＣＺＲ３２２をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限
エンドヌクレアーゼで切断することにより、そのｈＧＨ
コード配列を切り出した。目的の５．８ｋｂＢａｍＨＩ
−ＮｄｅＩ制限断片をアガロースゲル電気泳動で分離し
て単離し、次いで当該技術分野でよく知られている技術
に従って、これをウシ腸アルカリホスファターゼで処理
することにより、その直鎖状ＤＮＡ分子から５’リン酸
基を除去した。この操作に関する実験法は、Molecular
Cloning:A Laboratory Manual,Sambrook,J.,Fritsch,E.
F.およびManiatis,T.,Cold Spring Harbor Press,1989,
1.58〜1.61頁に認められる。まだ５’リン酸基を有して
いる上で単離したＥ７配列を、脱リン酸化した上記ＤＮ
Ａに合成リンカーの存在下で加えた。配列：５’−ＴＡ
ＴＧＣＡ−３’を有する一本鎖６−ヌクレオチドリンカ
ーを使用して、ＮｄｅＩエンドヌクレアーゼで切断した
上記のベクターＤＮＡの末端を、ＮｓｉＩ制限エンドヌ
クレアーゼで切断したＥ７コード配列の末端に連結し
た。次式：
【化１０】 の二本鎖リンカーを使用して、Ｅ７コード配列のＮｃｏ
Ｉ末端の、該ベクターＤＮＡのＢａｍＨＩ末端への連結
を容易にした。これらのオリゴヌクレオチドリンカーは
従来のＤＮＡ合成装置（例えばApplied Biosystems Mod
el 380Aまたは380B DNA synthesizer(Applied Biosyste
ms,Foster City,CAから市販されている)）を使用する当
該技術分野でよく知られた技術によって調製できる。こ
のＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で連結した。次
にこの連結混合物を直接用いて、感応性（コンピテン
ト）大腸菌ＤＨ５αＦ’細胞（BRL,Gaithersburg,MD）
を形質転換した。プラスミドＤＮＡを形質転換細胞から
調製し、シークエナーゼキット（Sequenase kit；Unite
d States Biochemical Corporation,Cleveland,Ohio）
を用いる二本鎖ＤＮＡ配列分析によって、適切な構築を
立証した。プラスミドｐ１６Ｅ７の制限部位および機能
地図を図４に示す。
【０１１１】実施例２：プラスミドｐ１６Ｅ７ｅの構築 Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓキレ
ート化ペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチド
を、基本的に上記の実施例１の教示に従って調製したプ
ラスミドｐ１６Ｅ７中のＥ７タンパク質をコードする配
列の５’末端に挿入することによって、ＣＰ−Ｅ７融合
腫瘍タンパク質をコードするプラスミドを作成した。こ
のキレート化ペプチドをコードし、ＮｄｅＩ認識配列を
含有するように加工された、次の配列：
【化１１】 の合成オリゴヌクレオチドリンカーを、Indiana Univer
sity School of Medicine(Indianapolis,IN）から購入
し、Ｅ７コード配列の５’末端のＮｄｅＩユニーク（唯
一の）部位を利用して、ｐ１６Ｅ７プラスミド中にこの
リンカーをクローニングした。このような二本鎖オリゴ
ヌクレオチドを、従来から入手可能なＤＮＡ合成装置を
用いる当該技術分野でよく知られた技術で調製するか、
もしくはこのような合成を専門とする市販の供給源から
入手することもできる。プラスミドｐ１６Ｅ７ｅの制限
部位および機能地図を図５に示す。プラスミドｐ１６Ｅ
７ｅを用いて、感応性大腸菌ＤＨ５αＦ’（BRL,Gaithe
rsburg,MD）を形質転換した。目的の構築を、実施例１
に記述したＤＮＡ配列分析により立証した。
【０１１２】親発現ベクター（ｐＣＺＲ３２２）は、温
度感受性リプレッサーの制御下にあるバクテリオファー
ジラムダｐＬプロモーターを含有している。このリプレ
ッサーは３０℃では機能するが、４２℃では非機能的で
ある。発現プラスミドｐ１６Ｅ７およびｐ１６Ｅ７ｅを
用いて、大腸菌Ｌ２０１株細胞（M.Lei,Lilly Research
Laboratories）を形質転換した。５ｍｇ／ｍｌテトラ
サイクリンを含有する２ｘＴＹブロス中で、ＯＤ600が
０．６〜０．８になるまで細胞を生育した後、４２℃で
１６時間生育することにより、タンパク質の発現を誘導
した。４４００ｘｇで１０分間遠心分離することにより
細胞を集めた。試料緩衝液（０．０６２５Ｍ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ ＳＤＳ、１０％ グリ
セロール、５％ ２−メルカプトエタノール、０．００
１％ ブロモフェノールブルー）中で５分間１００℃に
加熱することにより細胞を溶解し、そのタンパク質をLa
emmli,１９７０年（この文献の教示する内容はすべて本
明細書の一部を構成する）の教示に従ってＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで分析した。
【０１１３】実施例３：ウエスタンブロット分析 タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、これを、０．
０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、０．３８Ｍ
グリシン、２０％ メタノール中、４０Ｖ（２００〜
３００ｍＡ）で１６時間電気泳動的にニトロセルロース
に転移させた。以降の工程はすべて２２℃で振盪しなが
ら実行した。フィルターを５％ＢＬＯＴＴＯ（５％乾燥
ミルク粉末、２０ｐｇ／ｍｌチメロサール、アンタイフ
ォームＡ（消泡剤）（Sigma Chemical Co.)）で１６時
間遮断し、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅ
ｎR（Sigma)、ｐＨ７．５）で２回洗浄し、これをＨＰ
Ｖ１６ Ｅ７マウス単クローン抗体（Triton Bioscienc
es,Alameda,CA）またはＲＢに対する適切なウサギポリ
クローン抗体（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−３％ＢＬＯＴＴＯ
中にそれぞれ１：１００または１：２００００で希釈し
たもの）と共に、２時間インキュベートした。次にフィ
ルターをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１０分間洗浄した。ビオ
チニル化（biotinylated）したヤギ抗マウス抗体または
ビオチニル化したヤギ抗ウサギ抗体（BRL）をそれぞれ
ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−３％ＢＬＯＴＴＯ中に１：６６７
で希釈し、これを加えて１時間インキュベートした。次
にフィルターをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで各５分間３回洗浄
した。ストレプタバジン（streptavadin）−アルカリホ
スファターゼ複合体（BRL）を０．０５％Ｔｗｅｅｎを
含有するＡＰ７．５（０．１Ｍ ＮａＣｌ、２．０ｍＭ
ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．５）中に１；１２０００で希釈
し、これを加えて１０分間インキュベートした。フィル
ターを０．０５％ＴｗｅｅｎRを含有するＡＰ７．５で
各１０分間２回洗浄した後、炭酸塩緩衝液（０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ3、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ９．８）で２
回洗浄した。使用する直前に、ニトロブルーテトラゾリ
ウムクロリド（７５ｍｇ／ｍｌ濃度の７０％Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド溶液）４４μｌおよび５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−ｐ−トルイジン塩（５０ｍｇ
／ｍｌ濃度の１００％Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液）
３３ｍｌを炭酸塩緩衝液１０ｍｌに加えることによっ
て、発色溶液を調製した。発色溶液をフィルターに加え
て、望ましい強度が得られるまでインキュベートした。
蒸留水中で１０分間濯ぎ、発色溶液の完全な除去を確実
にするためにその間に少なくとも一回水を交換すること
により、発色反応を停止した。
【０１１４】実施例４．Ａ：ＨＰＶ１６ ＣＰｅ−Ｅ７
タンパク質の精製 ＣＰ−Ｅ７タンパク質を過剰生産するように加工した大
腸菌は、発現産物が濃縮されたインクルージョンボディ
ー（細胞封入体）または顆粒を含有し、これを精製の第
１工程として単離した。凍結細胞ペースト各１ｇを５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）１０ｍｌ中に懸濁し、これを
室温で少なくとも２０分間撹拌した。細胞を懸濁した
後、元の細胞ペースト１ｇに対して１ｍｌの割合で、４
ｍｇ／ｍｌリゾチームを含む５０ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡ
を加えた。この溶液を室温で少なくとも２０分間、ある
いは溶液が高粘性になるまで撹拌した後、氷上でさらに
３０分間冷却した。冷却したこの懸濁液を、８に設定し
たビブラセルソニケーター（Vibracell sonicator；Son
ics & Materials,Inc）で、各２分間（各サイクル間は
氷上で５分間隔）のサイクルで３回超音波処理した。次
にこの溶解液を３０００ｘｇ、４℃で４０分間遠心分離
した。そのペレットを１Ｍ ＮａＣｌ中に再懸濁し、３
０００ｘｇ、４℃で４０分間遠心分離することにより、
洗浄した。次いでこのペレットを１Ｍ尿素で同様に洗浄
した後、さらに蒸留水で洗浄した。洗浄したこのペレッ
トを凍結乾燥した後、これを亜硫酸塩分解試薬（sulfit
olysis reagent）（７．５Ｍ尿素、０．５Ｍ Ｔｒｉ
ｓ、１００ｍＭ Ｎａ2ＳＯ3、１０ｍＭ Ｎａ2Ｓ
4Ｏ6、ｐＨ８．２）中に溶解（１０ｍｇ固体／ｍｌ）す
ることにより、Ｅ７中の７つのシステインをＳ−スルホ
ネートに変換した。この反応液を室温で少なくとも３時
間撹拌した。
【０１１５】この亜硫酸塩分解反応混合物を０．４５ミ
クロンフィルターを通して濾過し、Ａ緩衝液（５０ｍＭ
ＮａＨ2ＰＯ4、０．５Ｍ ＮａＣｌ、７Ｍ尿素、ｐＨ
７．５）で平衡化したＮｉ（II）またはＣｏ（II）ＩＭ
ＡＣカラムにかけた。このＮｉ（II）またはＣｏ（II）
ＩＭＡＣカラムはSmith等、１９８８年に記述されてい
るようにして調製した。本発明の好ましい実施におい
て、Ｃｏ（II）カラムを調製する際に、Ｃｏ（II）から
Ｃｏ（III）への早すぎる酸化を防ぐために、すべての
緩衝液および水を脱気し、ヘリウムでパージすることに
よって空気を排除した。簡単に記述すると、１．０ｘ１
０ｃｍのＨＲカラムにファルマシアファストフローキレ
ーティングゲル（Pharamacia Fast-Flow Chelating Ge
l）を充填してＦＰＬＣに連結し、これを４カラム体積
の蒸留水で洗浄した後、５０ｍＭ ＮｉＣｌ2またはＣ
ｏＣｌ2溶液４ｍｌをこのカラムに充填した。金属を充
填したこのカラムを再度４カラム体積の蒸留水で洗浄し
た後、Ａ緩衝液で平衡化した。亜硫酸塩分解溶液の１ｍ
ｌ試料をこのカラムに注入し、流速０．２ｍｌ／分のＡ
緩衝液で基線（ベースライン）がゼロに戻るまで（一般
的には約１．５カラム体積）洗浄した。次に、ｐＨを下
げるか、あるいは脱離配位子（イミダゾールなど）を導
入することによって、結合した物質を溶出させた。ｐＨ
が減少する勾配を作るために使用したＢ緩衝液は、５０
ｍＭ 酢酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ、７Ｍ 尿素、ｐＨ
３．７であった。Ｂ緩衝液０％から１００％への１５０
分間の勾配、または約３カラム体積の勾配によって、ｐ
Ｈ７．５から３．７までの直線的ｐＨ勾配が得られ、こ
れを利用してＣＰａ−Ｅ７、ＣＰｂ−Ｅ７、およびＣＰ
ｃ−Ｅ７を溶出させた。イミダゾール勾配を作るために
使用したＢ緩衝液は０．５Ｍ イミダゾール、５０ｍＭ
ＮａＨ2ＰＯ4、０．５Ｍ ＮａＣｌ、７Ｍ 尿素、ｐ
Ｈ７．５から構成された。Ｂ緩衝液０％から１００％へ
の３００ｍｌにわたる勾配、または約４．５カラム体積
の勾配を利用して、ＣＰａ−Ｅ７からＣＰｅ−Ｅ７まで
をカラムから溶出させた。
【０１１６】クロマトグラムのピークのタンパク質含量
を、ノベックス・トリシン−ＰＡＧＥシステム（Novex
Tricine-PAGE system）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ
びウエスタンブロットによって決定した。同じイミダゾ
ール勾配で流したブランク（無添加）ＩＭＡＣを用い
て、高イミダゾール濃度でＮｉ（II）がカラムから浸出
するか否かを決定した。各分画のＮｉ（II）濃度を、過
剰量のＥＤＴＡを用いて、過去に記述されたように（Sm
ith等、１９８７年）滴定することにより測定した。Ｃ
Ｐ−Ｅ７が含まれる分画を集め、これを、５０ｍＭ炭酸
水素アンモニウム（ｐＨ８．０）緩衝液で平衡化したセ
ファデックスＧ２５カラム上で脱塩した。次に、この脱
塩貯蔵液を凍結乾燥した。
【０１１７】ＡＢＩ４７７Ａプロテインシークエンサー
（ABI 477A Protein Sequencer）をその製造者の指示に
従って使用して、ＣＰｅ−Ｅ７のＮ−末端配列を決定し
た。ＣＰｂ−Ｅ７、ＣＰｃ−Ｅ７、およびＣＰｅ−Ｅ７
タンパク質のアミノ酸分析を、ベックマン６３０オート
マチックアナライザー（Beckman 6300 Automatic Analy
zer）で実行した。
【０１１８】実施例４．Ｂ：速度論的に不活性な固定化
樹脂−ＩＤＡ−Ｃｏ(III)−ＣＰｅ−Ｅ７錯体の調製 以下に記述する方法で速度論的に不活性な固定化樹脂−
イミノジ酢酸−Ｃｏ(III)−ＣＰｅ−Ｅ７錯体を形成さ
せることにより、上記の実施例４．Ａの教示するところ
に従って調製した精製ＣＰｅ−Ｅ７タンパク質を固定化
した。
【０１１９】ＩＤＡを通して固定化したＣｏ（II）を、
市販のＩＤＡ樹脂（例えば、ファルマシアキレーティン
グセファロースファストフロー（Parmachia Chelating
SepharoseR Fast Flow；Pharmacia LKB Biotechnology,
800 Centennial Avenue,Piscataway,NJ 08854）、トヨ
パールＡＦ−キレート６５０Ｍ（ToyopearlR AF-Chelat
e 650M；TosoHaas,Rohm and Haas Building,Independen
ce Mall West,Philadelphia,PA 19105）、またはパーセ
プティブバイオシステムズポロスＭＣ／Ｐ[PerSeptive
Biosystems PorosR MC/P；PerSeptive Biosystems,Univ
ersity Park atMIT,38 Sidney Street,Cambridge,MA 02
139)など]を用いて調製した。この樹脂(固定した樹脂
４.０ｍｌ）を脱気したミリＱ水（Milli-QR water）１
５ｍｌで３回洗浄し、各洗浄後に遠心分離して、窒素雰
囲気下に保持した。１００ｍｌ丸底フラスコ中のミリＱ
水５０ｍｌに窒素を２０分間通気することにより、Ｃｏ
Ｃｌ 2の５０ｍＭ溶液を調製した。この水に固体ＣｏＣ
ｌ2（０.３２５ｇ）を、溶液中に窒素を通気しながら加
えた。窒素の層をこのＣｏＣｌ2溶液上に保った。
【０１２０】Ｃｏ(II)−ＩＤＡ−樹脂を調製するため
に、窒素雰囲気下で、上記の５０ｍＭＣｏＣｌ2溶液１
２ｍｌを使い捨てプラスチックシリンジで、洗浄した樹
脂に移して、１５分間反応させた。窒素下で、この樹脂
を遠心分離し、脱気ミリＱ水１５ｍｌで３回洗浄した。
次に、この洗浄したＣｏ(II)−ＩＤＡ−樹脂を、脱気し
た緩衝液１５ｍｌで２回洗浄することにより、緩衝液
（１００ｍＭ リン酸塩、０．５Ｍ ＮａＣｌ、７Ｍ
尿素、ｐＨ７．５）で平衡化した。この樹脂を尿素を含
まない緩衝液中で平衡化しても同じ結果が得られる。
【０１２１】精製したＣＰｅ−Ｅ７タンパク質（または
ミオグロビン）を、窒素で覆ったこのＣｏ(II)−ＩＤＡ
−樹脂に、最終濃度３．０ｍｇタンパク質／ｍｌ−樹脂
で加えた。Ｃｏ(II)−ＩＤＡ−樹脂および精製ＣＰｅ−
Ｅ７タンパク質を含むこの容器に堅く蓋をして、終夜穏
やかに回転させることにより、固定化した速度論的に不
安定な樹脂−ＩＤＡ−Ｃｏ(II)−ＣＰｅ−Ｅ７錯体を形
成させた。
【０１２２】次に、この樹脂−ＩＤＡ−Ｃｏ(II)−ＣＰ
ｅ−Ｅ７スラリーに、泡立てないように穏やかに空気ま
たは９５％Ｏ2／５％ＣＯ2を少なくとも８時間（ミオグ
ロビンの場合は４時間）通気することによって、固定化
した速度論的に不安定な樹脂−ＩＤＡ−Ｃｏ(II)−ＣＰ
ｅ−Ｅ７錯体を酸化し、固定化した速度論的に不活性な
樹脂−ＩＤＡ−Ｃｏ(III)−ＣＰｅ−Ｅ７錯体を得た。
０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．３）溶液１００μｌをこ
のスラリー１００μｌに加えて１０分間混合することに
よって、Ｃｏ(II)のＣｏ(III)への酸化が完了したと判
断した。Ｃｏ(II)が速度論的に不活性なＣｏ(III)状態
に酸化されていたならば、樹脂はそのピンク色を維持
し、その上清は透明であろう。もしこの酸化が未完結で
あれば、その上清はピンク色になり、樹脂は透明であろ
う。ほとんどの場合、約８時間穏やかに空気をその樹脂
スラリーに通気した後、その容器に蓋をして終夜穏やか
に回転させる。
【０１２３】この酸化反応が完結した後、その樹脂を同
体積の０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．３）で洗浄し、１
００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄して
平衡化し、４℃に保存する。
【０１２４】実施例５：プラスミドｐＢｌｕｅＢａｃＲ
ＢおよびｐＢｌｕｅＢａｃＲＢ60の作成 ヒトの網膜芽腫遺伝子をコードするＤＮＡ配列をｐＡｂ
Ｔ９３００プラスミド（Applied Biotechnology,Cambri
dge,Massachusetts）から単離した。プラスミドｐＡｂ
Ｔ９３００の制限部位および機能地図を図６に示す。完
全なＲＢ遺伝子のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列はFrie
nd,S.H.等(1987)PNAS-USA 84,9059-9063（この文献の教
示はすべて本明細書の一部を構成する）に開示されてい
る。
【０１２５】ＣＰ−ＲＢおよびＣＰ−ＲＢ60タンパク質
の両者をコードするＤＮＡ配列を、ｐＡｂＴ９３００の
ＲＢ遺伝子を利用するＰＣＲ（PCR）を用いて増幅し
た。ＰＣＲの使用に関する原理と技術は、Molecular Cl
oning:A Laboratory Manual,第２版,Sambrook,A,Fritsc
h,E.F.,およびManiatis,T.,(1989),Cold Spring Harbor
Press（この文献の教示はすべて本明細書の一部を構成
する）に記述されている。パーキンエルマーシータスＤ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus DNA The
rmal Cycler）およびジーンアンプキット（GeneAmp ki
t）を用い、基本的に製造者の指示に従いつつこれに改
良（プラスミドＤＮＡ１０ｎｇを使用し、反応液に４％
ＤＭＳＯを加えた）を加えたＰＣＲ（PCR）によって、
ＣＰ−ＲＢおよびＣＰ−ＲＢ60タンパク質に対応するＤ
ＮＡ分子を得た。このサーマルサイクラーを以下の条件
に設定した：１サイクル＠９４℃（２分）、５０℃（１
分）、７２℃（４分）。９サイクル＠９４℃（１分）、
５０℃（１分）、７２℃（４分）。５サイクル＠９４℃
（１分）、５０℃（１分）、７２℃（５．３分）。５サ
イクル＠９４℃（１分）、５０℃（１分）、７２℃
（７．０分）。５サイクル＠９４℃（１分）、５０℃
（１分）、７２℃（８．３分）。５サイクル＠９４℃
（１分）、５０℃（１分）、７２℃（１０．０分）。こ
のＰＣＲ工程で使用するために記述されたプライマーの
すべては、当該技術分野でよく知られた技術によって
（例えば、アプライドバイオシステムズモデル３８０Ａ
または３８０ＢＤＮＡ合成機（Applied Biosystems,Fos
ter City,California）をその製造者によって提供され
ている指示に基本的に従って利用することによって）合
成できる。
【０１２６】プラスミドｐＢｌｕｅＢａｃＲＢ合成の模
式的表現を図７に記載する。ＣＰ−ＲＢタンパク質をコ
ードするＤＮＡ配列を、ＲＢ遺伝子の被翻訳領域に対応
するｐＡｂＴ９３００プラスミドの約２７９０ｂｐ断片
のＰＣＲ増幅によって作成した。この２７９０ｂｐＲＢ
コード配列の増幅に使用した５’プライマーは、Ｓｐｅ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼ切断部位、Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓキレート化ペプチド、
およびＲＢ遺伝子の最初の２０ヌクレオチドを包含す
る。この４８マー（４８量体）の５’−プライマーのＤ
ＮＡ配列は次の配列：
【化１２】 である。Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈ
ｉｓキレート化ペプチド以外のキレート化ペプチドも本
発明の実施に適することは当業者にはわかるであろう。
また、他のキレート化ペプチドを包含するＣＰ−ＲＢタ
ンパク質を発現させるために、上述の５’−プライマー
に加えられる改良は、当業者には容易に明らかである。
２７９０ｂｐのＲＢコード配列の増幅に使用する３’−
プライマーは、ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌ
クレーゼ切断部位、並びに、ＲＢ遺伝子の少なくとも７
コドンに対して相補的なＤＮＡ配列を包含する。この３
７マーの３’−プライマーのＤＮＡ配列は：
【化１３】 である。ＰＣＲによって作成されたＣＰ−ＲＢタンパク
質をコードするこのＤＮＡ配列を、バキュロウイルス発
現プラスミドｐＢｌｕｅＢａｃ（Invitorogen Corporat
ion,San Diego,CA）中の、唯一のＮｈｅＩ制限部位中に
挿入した。プラスミドｐＢｌｕｅＢａｃの制限部位およ
び機能地図を図８に示す。プラスミドｐＢｌｕｅＢａｃ
をＮｈｅＩ制限エンドヌクレアーゼで切断し、これをウ
シ腸アルカリホスファターゼで処理した。ＰＣＲで製造
したＣＰ−ＲＢコード配列をＳｐｅＩ制限エンドヌクレ
アーゼで消化することにより、制限エンドヌクレアーゼ
ＮｈｅＩによる切断で得られる末端と同一であり、従っ
てこれに連結できる末端を得た。次に、切断したＣＰ−
ＲＢ ＰＣＲ産物を、脱リン酸化したｐＢｌｕｅＢａｃ
ＤＮＡに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下で加えた。得
られたプラスミドがｐＢｌｕｅＢａｃＲＢである。ｐＢ
ｌｕｅＢａｃＲＢの制限部位および機能地図を図９に示
す。
【０１２７】上に概略を記した方法と同様の方法で、Ｃ
Ｐ−ＲＢ60タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ＲＢ
遺伝子の６０ｋｄＣ−末端領域に対応するｐＡｂＴ９３
００プラスミドの約１２９０ｂｐ３’断片のＰＣＲ増幅
によって調製した。この先端の削除されたＲＢコード配
列の増幅に使用した５’−プライマーは、ＮｓｉＩおよ
びＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位、Ｍｅｔ−
Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓキレート化ペ
プチド、並びに、Ｍｅｔ387に対応するコドンから始ま
る先端の削除されたＲＢ遺伝子の最初の２２ヌクレオチ
ドを包含する。この５０マーの５’−プライマーのＤＮ
Ａ配列は：
【化１４】 である。このＰＣＲによって調製した、ＣＰ−ＲＢ60タ
ンパク質をコードするＤＮＡ配列を、上述のようにｐＢ
ｌｕｅＢａｃ中の唯一のＮｈｅＩ部位中に挿入し、プラ
スミドｐＢｌｕｅＢａｃＲＢ60を得る。Ｍｅｔ−Ｈｉｓ
−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓキレート化ペプチド
以外のキレート化ペプチドも本発明の実施に組み込まれ
得る。表１に例示したような他のキレート化ペプチドを
包含するＣＰ−ＲＢ60タンパク質を発現させるために、
上述の５’−プライマーに加えられる改良は、当業者に
は容易に明らかである。この先端の削除されたＲＢの増
幅に使用する３’−プライマーは、全長（フルレング
ス）ＲＢ ＤＮＡ配列のＰＣＲ増殖に使用した３’−プ
ライマーと同じプライマーである。
【０１２８】実施例６：プラスミドｐＲＢ60の作成 プラスミドｐＲＢ60はＣＰ−ＲＢ60タンパク質を発現す
る細菌性発現プラスミドである。プラスミドｐＣＺＲ３
２２のｈＧＨコード配列を、上記の実施例５の教示に基
本的に従って行うＰＣＲで調製したＣＰ−ＲＢ60コード
配列で置き換えることによって、プラスミドｐＲＢを作
成した。この操作法の概略図を図１０に記載する。プラ
スミドｐＣＺＲ３２２をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限
エンドヌクレアーゼで切断することにより、そのｈＧＨ
コード配列を切り出した。次にこの反応混合物をウシ腸
アルカリホスファターゼで処理することにより、この直
線状にしたＤＮＡ分子の５'リン酸基を除去した。ＰＣ
Ｒで製造したＣＰ−ＲＢ60タンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列を、ＮｓｉＩおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレ
アーゼで消化した。５'リン酸基を保持するこのＣＰ−
ＲＢ60ＤＮＡ配列を合成リンカーおよびＴ４ＤＮＡリガ
ーゼの存在下で、脱リン酸化した上記のＤＮＡに加え
た。実施例１に記述したように調製した、配列：５'−
ＴＡＴＧＣＡ−３'を有する一本鎖ＤＮＡリンカーを用
いて、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩで切断した上記
ベクターの末端を、制限エンドヌクレアーゼＮｓｉＩで
切断したＣＰ−ＲＢ60コード配列の末端に連結した。得
られたプラスミドをｐＲＢ60と命名する。ｐＲＢ60の制
限部位および機能地図を図１１に示す。次にこの連結混
合物を用いて、感応性大腸菌ＤＨ５αＦ'細胞（BRL,Gai
thersburg,MD）を形質転換した。目的の構築を、実施例
１に記述したＤＮＡ配列分析によって立証した。ＣＰｅ
−ＲＢ60タンパク質を発現させ、基本的に上記の実施例
４．Ａの教示に準じて精製した。
【０１２９】実施例７：完全なＣＰｅ−ＲＢタンパク質
のバキュロウイルス発現 実質的に上記の実施例５の教示に準じて調製したプラス
ミドｐＢlueＢacを用い、当該技術分野でよく知られた
技術によって感応性大腸菌ＨＢ０１株細胞を形質転換し
た。形質転換体を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含
むＬＢ寒天プレート上で選択した。ＣsＣl／臭化エチジ
ウム平衡遠心分離工程を含むアルカリ溶解法を用いて大
量にプラスミドを調製するために、１コロニーを選択し
た。
【０１３０】２５ｃｍ2フラスコ７つに、１フラスコあ
たり約２．５ｘ１０6のSpodoptera frugiperda（Ｓｆ
９）細胞を接種した。Spodoptera frugiperda（Ｓｆ
９）細胞はアメリカンタイプカルチャーコレクションか
ら受託番号＃ＣＲＬ１７１１の下で入手できる。この細
胞を少なくとも３時間付着させた後、培地を除去し、１
０％熱不活化胎生ウシ血清（ＦＢＳ）および５０μｇ／
ｍｌ ゲンタマイシンを含むグレースアンセラエ培地
（Grace's Antheraea medium；GIBCO/BRL,Gaithersbur
g,MD）約２ｍｌで置換した。フラスコを室温でインキュ
ベートした。それぞれ０μｇ、０．５μｇ、１μｇ、２
μｇ、４μｇ、６μｇ、８μｇの野生型バキュロウイル
スＤＮＡを含む滅菌チューブを調製した。各チューブ
に、上で調製したｐＢｌｕｅＢａｃ ＲＢ ＤＮＡ ２
μｇ、およびトランスフェクション緩衝液９５０μｌを
加えた。トランスフェクション緩衝液は、１０ｘＨＥＢ
Ｓ（１．３７Ｍ ＮａＣｌ、０．０６Ｍ Ｄ+−グルコ
ース、０．０５Ｍ ＫＣｌ、０．００７Ｍ Ｎａ2ＨＰ
Ｏ4−７Ｈ2Ｏ、０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ、水溶液、ｐＨ
７．１、フィルター滅菌済み）１０ｍｌ、１μｇ／ｍｌ
超音波処理済みサケ精子ＤＮＡ１．５ｍｌ、滅菌水（ｐ
Ｈ７．１）８８．５ｍｌを混合することにより調製し
た。このＤＮＡ／トランスフェクション緩衝液混合物に
２．５Ｍ ＣａＣｌ2５０μｇを加えた。この溶液を混
合し、１ｍｌピペットを用いて通気した。このチューブ
を室温で２５分間インキュベートした。沈殿が生成する
であろう。次に、ＤＮＡ沈殿物を含有するこの溶液を、
上で調製した２５ｃｍ2フラスコ中のＳｆ９細胞に加え
た。このフラスコを２７℃で４時間インキュベートし
た。各フラスコからパスツールピペットで培地を除去
し、グレースアンセラエ培地／１０％ＦＢＳ／５０μｇ
／ｍｌゲンタマイシンで注意深く濯いだ。１５０μｇ／
ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含む完全培地を加えた。フラスコを
２７℃で３ないし５日間インキュベートし、毎日、培地
中の封入体（occlusion bodies）および青色について観
測した。一般的には３日目ないし４日目で青色に変化し
始め、毎日その強度が増加した。細胞を十分感染させた
後（４〜５日間）、７つのフラスコの各トランスフェク
ション上清（培養培地およびウイルスよりなる）を滅菌
したコニカル（円錐形）遠心管に移し、１０００ｘｇ、
４℃で１０分間遠心分離した。次に各ウイルス上清を新
しい滅菌管に移した。このトランスフェクション上清の
連続希釈液を１０-4、１０-5、および１０-6希釈で調製
した。１５０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むアガロース
上層を用いて、このウイルスを“プラーク化した”。乾
燥を防ぐためにこのプレートをパラフィルム（Parafilm
R）で封印した。封入体（野生型ウイルス）を含有する
プラーク、並びに、青色のプラーク（組換えウイルス）
に関して、これらのプレートを毎日検査した。一般に感
染後４日ないし５日でプラークが目視できるようになっ
た。青色プラークの数を計数し、これを、野生型バキュ
ロウイルスＤＮＡのどの濃度が最高頻度の組換え体をも
たらしたかを決定するのに使用した。この野生型バキュ
ロウイルスＤＮＡ保存液を用いる以降のトランスフェク
ションにはすべてこの濃度を使用した。
【０１３１】実施例８Ａ：ＲＢ−ワクシニアウイルス感
染細胞からの核抽出物の単離によるＲＢの調製 ＲＢタンパク質を得るための別法は、組換えＲＢ−ワク
シニアウイルスｖＡｂＴ３３４（Applied bioTechnolog
y,Cambridge,MA）に感染した細胞の核抽出物を調製する
ことである。アフリカミドリザルの腎細胞株ＢＳＣ−４
０はＡ．Ｂｒｕｓｋｉｎ（Applied bioTechnology,Camb
ridge,MA）から入手可能である。細胞を５％胎生ウシ血
清および５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むダルベッ
コ改良イーグル培地中、５％ＣＯ2湿潤雰囲気下で、３
７℃で生育した。ＢＳＣ４０細胞を１５０ｍｍ皿中に全
面生長させた後、これをｖＡｂＴ３４４に感染の多重度
２で感染させた。細胞を３７℃で２４時間インキュベー
トした。以降の工程はすべて４℃で実行した。細胞を、
１プレートあたり２ｍｌの低塩濃度緩衝液（ＬＳＢ）
（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ ＤＴＴ）
で１回洗浄した後、１プレートあたり２ｍｌのＬＳＢ−
ＰＩ（０．１％トリトンおよびプロテアーゼインヒビタ
ー：１μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプ
チン、１μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、１００μｇ／ｍｌ
フッ化フェニルメチルスルホニル、５０μｇ／ｍｌ Ｎ
−α−ｐ−トシル−Ｌ−リシンクロロメチルケトン、お
よび１００μｇ／ｍｌ Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラ
ニンクロロメチルケトンを含むＬＳＢ）と共に５分間イ
ンキュベートすることによって細胞を溶解した。この溶
解液をプレートからかき集め、１０００ｘｇで５分間の
遠心分離によって核を集めた。この核を２〜３パックド
（袋状；packed）核体積のＬＳＢ−ＰＩで２回洗浄し
た。この核ペレットを、２５０ｍＭ ＮａＣｌを含む
１．５パックド核体積のＬＳＢ−ＰＩ中に再懸濁し、ピ
ペッティングすることによって穏やかに混合して、５分
間インキュベートした後、２０００ｘｇで５分間遠心分
離した。その上清（核抽出物）を直ちに次に調製に用い
た。
【０１３２】実施例８Ｂ：速度論的に不活性な固定化Ｉ
ＤＡ−Ｃｏ(III)−ＣＰｅ−Ｅ７に対するＲＢ結合 種々の量の遊離ＣＰ−Ｅ７（０、１００、１０００、お
よび５０００ｎｇ）を含む、基本的に本明細書の実施例
４．Ｂに準じて調製したＣｏ(III)−ＣＰｅ−Ｅ７樹脂
の５０％スラリー（５μｌ）を、上の実施例８Ａに記述
したように調製した組換えＲＢ核抽出物１００μｌに加
えた。基本的に上の実施例４．Ｂの教示に準じて調製し
た、Ｃｏ(III)−ミオグロビンの５０％スラリー（５μ
ｌ）の入った別のチューブを、この樹脂に対するＲＢの
非特異的結合を測定するための対照として用いた。これ
らのチューブを封印し、４℃で２時間穏やかに回転させ
た。これらのチューブを微量遠心機中で３分間遠心分離
した。その上清を除去し、樹脂をＮＰ−４０緩衝液（５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％
ＮＰ−４０、ｐＨ８．０）１ｍｌで、この緩衝液の添加
後１０分間穏やかに回転させることによって、２回洗浄
した。各樹脂試料をノベックス・トリス−グリシンＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ２ｘ試料緩衝液（Novex Tris-Glycine SDS
-PAGE 2X sample buffer；Novex,P.O.Box 1158,Encinit
as,CA 92024）３０μｌ、０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．
３）１０μｌ、およびβ−メルカプトエタノール５μｌ
で処理し、５分間煮沸し、３分間遠心分離した。このβ
−メルカプトエタノールは、樹脂に結合したタンパク質
が放出されるように、Ｃｏ(III)を、速度論的に不安定
なＣｏ(II)状態に還元した。この上清（４０μｌ）を、
トリス−グリシン緩衝液系中のノベックスの既充填４〜
２０％勾配ゲルにかけて、１２５Ｖの一定電圧で２時間
電気泳動した。
【０１３３】サートブロット法（Sartoblot procedur
e；Bjerrum,O.J.およびSchafer-Nielsen,C.,“Buffer S
ystems and Transfer Parameters For Semidry Electro
blotting With A Horizontal Apparatus”,Electrophor
esis 86(1986),Dunn,M.J.編,Verlag-Chimie,Weinheim,
３１５頁）を用いるウエスタンブロットによって、ＲＢ
結合を検出した。ペーパーを、ＲＢに対するウサギ抗体
（抗血清の１：２０００希釈）でプローブし、次いで濃
度０．７μＣｉ／ｍｌの125Ｉ−ロバ抗ウサギＩｇＧで
プローブした。次にこのニトロセルロース紙をプラスチ
ックラップで包み、これを１８時間フィルムに暴露し
た。その結果は、ＩＤＡ−Ｃｏ(III)−ＣＰｅ−Ｅ７樹
脂のみがＲＢを特異的に結合し、過剰量の遊離Ｅ７また
はＣＰ−Ｅ７との競争によってこの結合が減少し得るこ
とを明らかにした。ＩＤＡ−Ｃｏ(III)−ミオグロビン
樹脂は同等の特異性度でＲＢを結合することができなか
った。
【０１３４】実施例８Ｃ：ＩＤＡ固定化ＩＤＡ−Ｃｏ(I
II)−ＣＰｅ−Ｅ７に対する核タンパク質の結合 ＩＤＡ−Ｃｏ(III)−ミオグロビン樹脂の５０％スラリ
ー（１００μｌ）を、ＮＰ−４０緩衝液（５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ−４
０、ｐＨ８．０）１０００μｌ、および実施例８Ａに記
述したように調製したＲＢ−ワクシニア感染細胞または
非感染細胞からの核抽出物２０００μｌに加えた。この
チューブを封印し、４℃で２時間穏やかに回転させるこ
とによって、この核抽出物を予備処理した。このチュー
ブを微量遠心機中で３分間遠心分離してその上清を取り
出して保存した。この上清の２．２５ｍｌを、ＩＤＡ−
Ｃｏ(III)−ＣＰｅ−Ｅ７樹脂１００μｌに加え、その
チューブを封印して４℃で２時間穏やかに回転させた。
このチューブを微量遠心機中で３分間遠心分離し、その
上清を取り出して、樹脂を、ＮＰ−４０ １ｍｌを添加
した後１０分間穏やかに回転させることにより、２回洗
浄した。ＩＤＡ−Ｃｏ(III)−ミオグロビン樹脂および
ＩＤＡ−Ｃｏ(III)−ＣＰｅ−Ｅ７樹脂を、ノベックス
・トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ２ｘ試料緩衝液１
７５μｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．３）５０μ
ｌ、およびβ−メルカプトエタノール２５μｌで処理
し、５分間煮沸し、３分間遠心分離した。このβ−メル
カプトエタノールは、樹脂に結合したタンパク質が放出
されるように、Ｃｏ(III)を、速度論的に不安定なＣｏ
(II)状態に還元した。その上清（５０μｌ／レーン）を
ノベックス・トリス−グリシン４〜２０％ゲルに充填
し、１２５Ｖの一定電圧で２時間電気泳動し、これをク
ーマシーブルーで染色した。ＩＤＡ−Ｃｏ(III)−ミオ
グロビン樹脂およびＩＤＡ−Ｃｏ(III)−ＣＰｅ−Ｅ７
樹脂に結合したタンパク質を比較することによって、少
なくとも８タンパク質がＥ７を特異的に結合することが
示された。ノベックスゲル上のこれらの非感染細胞タン
パク質の分子量は、３５０ｋＤａ、１４０ｋＤａ、５４
ｋＤａ、４６ｋＤａ、４１ｋＤａ、３０ｋＤａ、２１．
５ｋＤａ、および１３．５ｋＤａである。ノベックスゲ
ル上のこれらの感染細胞タンパク質の分子量は、３００
ｋＤａ、１４０ｋＤａ、１１０ｋＤａ、４６ｋＤａ、４
１ｋＤａ、３０ｋＤａ、２５ｋＤａ、および２０ｋＤａ
である。複製ゲルのタンパク質をプロブロット（ProBlo
tR；Applied Biosystems,Foster City,CA）に転移させ
て、さらに配列分析した。感染細胞および非感染細胞の
４６ｋＤａタンパク質の配列分析は、次のＮ−末端配
列：
【化１５】 を与え、これらはラットのコラーゲン結合タンパク質
（ＧＰ４６）およびマウスのセリンプロテーゼインヒビ
ターホモログＪ６との相同性を有している。非感染細胞
の３０ｋＤａタンパク質は、次のＮ−末端配列：
【化１６】 を有し、これはヒトの高移動度タンパク質（high mobil
ity propein）ＨＭＧ１との相同性を有している。
【０１３５】これらの核タンパク質のＩＤＡ−Ｃｏ(II
I)−ＣＰｅ−Ｅ７樹脂に対する特異的結合を確認するた
めに、遊離のＥ７を用いた競争実験を実行した。上述の
予備処理した核抽出物を、種々の量の遊離Ｅ７（０、１
００、５００、１０００、および５０００ｎｇ）および
ＩＤＡ−Ｃｏ(III)−ＣＰｅ−Ｅ７樹脂５μｌに加え
て、穏やかに回転させながら４℃で２時間インキュベー
トした。この試料を微量遠心機中で３分間遠心分離し
た。上清を除去し、樹脂をＮＰ−４０ １ｍｌで、緩衝
液添加後１０分間穏やかに回転させることにより、２回
洗浄した。このＩＤＡ−Ｃｏ(III)−ＣＰｅ−Ｅ７樹脂
をノベックス・トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ２ｘ
試料緩衝液３０μｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．
３）１０μｌ、およびβ−メルカプトエタノール５μｌ
で処理し、５分間煮沸し、３分間遠心分離した。このβ
−メルカプトエタノールは、樹脂に結合したタンパク質
が放出されるように、Ｃｏ(III)を、速度論的に不安定
なＣｏ(II)状態に還元した。その上清（５０μｌ／レー
ン）をノベックス・トリス−グリシン４〜２０％ゲルに
充填し、１２５Ｖの一定電圧で２時間電気泳動した。ゲ
ルを１０％ＴＣＡ、３．５％ ５−スルホサリチル酸、
および５０％メタノールで３０分間固定した後、クーマ
シーブルーで終夜染色した。このゲルは、上述のＩＤＡ
−Ｃｏ(III)−ＣＰｅ−Ｅ７樹脂に特有のバンドが、過
剰量の遊離Ｅ７によって減少するか、あるいは無くなり
得ることを明らかにした。
【０１３６】実施例９：有機キレート化試薬イミノジ酢
酸の前駆体の調製 実施例９．Ａ ：パラ−ニトロベンジルイミノジ酢酸の調
製 ニトリロトリ酢酸（１．２ｍｇ、６．３ｍｍｏｌ）、ピ
リジン（８ｍｍｏｌ）、および無水酢酸（１ｍｌ）を混
合し、得られた懸濁液を酸が溶解して淡黄色の溶液が得
られるまで加熱した。次にこの溶液を、溶液が淡褐色に
なるまで３０分間（還流させずに）加熱した。この溶液
を室温に冷却し、減圧下で溶媒を留去することにより、
ニトリロトリ酢酸無水物の褐色油状溶液を得た。
【０１３７】パラ−ニトロベンジルアミン（１ｇ、５．
３ｍｍｏｌ）を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐ
Ｈ９）の緩衝液（５０ｍｌ）に溶解し、これを濾過し
た。濾過したこの溶液に、上で得た酸無水物溶液を激し
く撹拌しながら滴下した。この酸無水物を添加する度
に、溶液のｐＨを飽和炭酸ナトリウム溶液で９に調節し
た。酸無水物をすべて添加した時に反応が完結した。１
Ｍ塩酸溶液を添加し、溶液のｐＨを１に酸性化すること
により、反応溶液からパラ−ニトロベンジル−イミノジ
酢酸を沈殿させた。酸性化したこの溶液を濾過すること
により、標記の化合物１．７６ｇを得た。ＨＰＬＣ（He
wlettpackard Model 1090A，ＲＰ−１８微小径カラム）
（溶出液：１００％緩衝液Ａ（緩衝液Ａ＝５０ｍＭ酢酸
トリエチルアンモニウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
６．０）から１００％メタノールへの１０分間にわたる
勾配）によってその純度を確認した。核磁気共鳴によ
り、その構造を確認した（３００ｍＨｚ（ＣＤＣ
ｌ3）：δ３．４１２（２Ｈ）；３．２７（４Ｈ），
４．５０（２Ｈ）；４．７５（溶媒）；４．２８〜７．
４５（２Ｈ），８．１２５〜８．１５３（２Ｈ））。炭
素−１３により、その構造（δ４４．９３（１Ｃ），６
１．１１（３Ｃ）；１２６．５７（２Ｃ），１３０．５
３（２Ｃ），１２６．５７〜１３０．５３（６芳香族
Ｃ），１４８．６５（１Ｃ），１４９．４１（１Ｃ），
１７７．６７（１Ｃ）；１８１．８８（２Ｃ））を確認
した。
【０１３８】実施例９．Ｂ：パラ−アミノベンジルイミ
ノジ酢酸の調製 パラ−ニトロベンジルイミノジ酢酸（１ｇ、３．０８ｍ
ｍｏｌ）およびミリＱ水（５５ｍｌ）を混合した。１０
Ｎ ＮａＯＨ溶液を添加することにより、得られた溶液
のｐＨを１１．５に調節した。パラジウム触媒（５％パ
ラジウム−炭素、７００ｍｇ）を水素雰囲気下で加え
た。この反応混合物を約６時間撹拌した後、ガラスシン
ター（ガラス焼結製品）および０．４５ミクロンミレッ
クスフィルター（Millex filter）を通して濾過した。
１Ｎ塩酸で濾液のｐＨを２以下に調節した後、減圧下で
乾固した。その残渣をミリＱ水（１０ｍｌ）に溶解し、
１ｍｌずつに分注して使用するまで−７０℃に保存し
た。核磁気共鳴は、その構造（３００ｍＨｚ（ＣＤＣｌ
3）：δ３．２６８（４Ｈ），３．５９１（２Ｈ）；
４．３２１（２Ｈ），４．７４１（溶媒）；６．８２２
〜６．８５０（２Ｈ）；７．１４２〜７．１７０（２
Ｈ））を裏付ける。炭素−１３は、その構造（δ４５．
０９（１Ｃ）；６１．０５（１Ｃ）；６１．１５３（２
Ｃ）；１１９．３８９（２Ｃ）；１３１．２９５（２
Ｃ）；１３１．５６８（１Ｃ）；１４８．１０４（１
Ｃ），１７６．７（１Ｃ）；１８１．８４３（２Ｃ））
を裏付ける。
【０１３９】実施例９．Ｃ：パラ−(イソチオシアナー
ト)−ベンジルイミノジ酢酸の調製 実施例９．Ｂで調製した試薬３単位（３ｍｌ）を溶解
し、混合して、減圧下で乾固した。得られた残渣に３Ｍ
塩酸（８ｍｌ）および蒸留したチオホスゲン（１ｍｌ）
を加え、その反応液を周囲温度で終夜撹拌した。ジエチ
ルエーテル（１２ｍｌ）を加え、得られた沈殿を濾過に
よって単離した。集めた固体をジエチルエーテルで洗浄
し、減圧下で乾燥した。次に残渣をミリＱ水（７ｍｌ）
に溶解し、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3（ｐＨ８．２）で溶
液のｐＨを７に調節した後、１ｍｌずつに分注して−７
０℃で保存した。核磁気共鳴により、その構造（３００
ｍＨｚ（ＣＤＣｌ3）：δ３．３３６（４Ｈ）；３．５
０６（２Ｈ）；４．３７６（２Ｈ），４．７５１（溶
媒）；芳香族領域７．２４０〜７．２５４（４Ｈ））が
確認された。炭素−１３により、その構造（δ４５．０
１８（１Ｃ），６０．５１０（１Ｃ）；６０．８４４
（２Ｃ）；１２８．５９２〜１４０．００８（６芳香族
炭素）；次式：
【化１７】 の構造を有する炭素の領域１７５．７〜１８０．２（２
Ｃ））を確認した。赤外分光測定は、Ｎ−Ｈ伸縮（３４
００ｃｍ-1）；Ｓ＝Ｃ＝Ｎ伸縮（２１００ｃｍ-1）；Ｃ
＝Ｏ伸縮（１６５０〜１７５０ｃｍ-1）を示す。
【０１４０】実施例１０：固定化Ｃｏ(III) ＣＰｅ−Ｅ
７を利用する抗Ｅ７抗体のアフィニティー精製 上記の実施例４Ｂに記述したように、ファルマシアキレ
ーティングセファロースファストフローを用いてＩＤＡ
−Ｃｏ(III)−ＣＰｅ−Ｅ７樹脂を調製した。アフィニ
ティーカラム（１．０ｘ１０．０ｃｍ）にこの樹脂を充
填した後、これを緩衝液Ｃ（１００ｍＭ ＮａＨ2Ｐ
Ｏ4、ｐＨ８．１）で平衡化した。ウサギ血清３ｍｌを
流速０．２ｍｌ／分でこのカラムに充填した。全試料を
充填し終わったときに注入を止め、固定化ＩＤＡ−Ｃｏ
(III)−ＣＰｅ−Ｅ７と９０分間反応させた。未結合の
タンパク質を溶出させるために、このカラムを２カラム
体積の緩衝液Ｃで洗浄した。結合したタンパク質を、２
０分間で０％緩衝液Ｄから１００％緩衝液Ｄ（１００ｍ
Ｍグリシン、７．５Ｍ尿素、ｐＨ２．５）への直線的勾
配で溶出させた。各分画を３Ｍトリス塩基で中性化した
後、トリス−グリシン緩衝液系を用いるノベックスの既
充填４〜２０％勾配ゲルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で分析した。各分画中の抗Ｅ７抗体を、４９０ｎｍでの
ｏ−フェニレンジアミン検出を用いる標準的なＥＬＩＳ
Ａ法を用いて測定した。これらの実験の結果により、分
子量１５０ｋＤａの主要バンドおよび少量の不純なより
低分子量のバンド（複数）を伴う結合タンパク質のピー
ク中に抗Ｅ７抗体が含まれることがわかった。
【０１４１】実施例１１：アフィニティークロマトグラ
フィーカラムおよび抗Ｅ７抗体を利用するＨＰＶ１６
Ｅ７の精製 直接発現産物ＨＰＶ１６−Ｅ７を含有する大腸菌細胞を
溶解し、可溶化し、実施例４でＣＰ−Ｅ７タンパク質に
関して記述したように亜硫酸塩分解した。次にこの溶液
を、１００ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）で平
衡化した２．５ｘ４０ｃｍのセファデックスＧ２５カラ
ムで脱塩することによって、亜硫酸塩分解溶液の過剰の
亜硫酸塩および尿素を除去した。脱塩したこの溶液を、
イムノピュアＡｇ／Ａｂイモビライゼーションキット＃
３（ImmunoPure Ag/Ab Immobilization Kit #3;Pierce
Chemical Co.USA,3747 N.Meridian Rd.,Rockford,IL 61
105）に付属のカルボキンクカップリングゲル（Carboli
nkR Coupling Gel）を用い、製造者の指示にしたがって
調製した抗Ｅ７アフィニティーカラムに充填した。この
結合（コンジュゲーション）反応に使用した抗Ｅ−７ポ
リクローン抗体を、まず、実施例１０に記述したように
ＩＭＡＣカラム上に固定化したＣＰ−Ｅ７のカラム上
で、ウサギ抗血清に通すことによって精製した。この抗
Ｅ７アフィニティーカラムに結合したタンパク質を、７
Ｍ尿素、１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．３の緩衝液で溶
出させた。このＥ７貯蔵液を上述のように５０ｍＭ炭酸
水素塩緩衝液で平衡化したＧ２５カラムで脱塩した後、
凍結乾燥した。
【０１４２】実施例１２ プラスミドpＪＣＥＭＦv６の
構築 以下の記載は、抗体分子のＦv結合フラグメントの生産
を結果として行なう原核細胞のための発現ベクターの構
築を提供するものである。抗体分子は、重鎖可変領域と
結合した軽鎖可変領域(両領域はネズミハイブリドーマ
・セルラインＣＥＭ２３１.６.７由来である)から成
る。この抗体分子は、ヒト癌胎児性抗原と反応する。プ
ラスミドpＪＣＥＭＦv６によりコードされているＦvタ
ンパク質は、重鎖サブユニットのＣ末端に融合されたＨ
is-Ｔrp-Ｈis-Ｈis-Ｈisキレート化ペプチドを含有す
る。
【０１４３】ネズミハイブリドーマＣＥＭ２３１.６.７
は、１９８８年１月７日、AmericanType Culture Colle
ction, Rockville, MDに受託番号＃ＡＴＣＣ ＨＢ９６
２０で寄託された。ＣＥＭ２３１.６.７の軽鎖および重
鎖をコードしているゲノムＤＮＡの単離は、欧州特許出
願８９３０２３１２.７、欧州公開番号０ ３３２ ４２
４ Ａ２、公開日１９８９年９月１３日において開示さ
れており、この全ての教示内容は本明細書の一部を構成
するものとする。これらの実施例は、軽鎖に対するヒト
／マウス キメラ発現ベクター(pＧＣＥＭＫ)および重鎖
に対する該ベクター(pＮＣＥＭＧl)の構築のためのＣＥ
Ｍ２３１.６.７可変領域の使用について記述する。これ
はpＪＣＥＭＦv６を構築するためのＤＮＡの供給源とし
て用いられる２つのベクターである。pＪＣＥＭＦv６の
構築のために使用されるこの２つのベクターはゲノムＤ
ＮＡクローニングから得られたが、cＤＮＡ供給源か
ら、さらには完全な合成遺伝子から得られるベクターを
用いて構築を行なうこともできるだろう。本発明の実施
において、表IIに示したオリゴヌクレオチド・プライマ
ーを用いたが、これ以降はその番号で示す。
【０１４４】実施例１２.Ａ. プラスミドpＧＣＥＭＫお
よびpＮＣＥＭＧlの構築 プラスミドpＧＣＥＭＫおよびpＮＣＥＭＧlの構築の詳
細については、欧州特許出願８９３０２３１２.７(公開
番号０ ３３２ ４２４、１９８９年９月１３日公開)に
より教示されている。
【０１４５】実施例１２.Ｂ. プラスミドpＵＣＥＭＦv
１の構築 軽鎖および重鎖可変領域ＤＮＡは、ＰＣＲによりPerkin
Elmer Cetus DNA Thermal Cycler and Geneamp kitを
用いて製造者の指示に従い得た。Thermal Cyclerは以下
の条件に設定した：３分間、９４℃で１サイクルに続い
て９４℃(１分間)、５０℃(１分間)、７２℃(２分間)で
２５サイクル、４秒／サイクルの自動延長および７２℃
(１０分間)での最終サイクル。
【０１４６】軽鎖暗号配列のＰＣＲによる増幅のため
に、pＧＣＥＭＫを鋳型ＤＮＡとして５'プライマー７２
５および３'プライマー７２６と共に用い、結果として
ＢglIおよびＰvuＩ制限部位を有する軽鎖可変遺伝子Ｄ
ＮＡ配列を得た。ＰＣＲにより得たＤＮＡをフェノール
／クロロホルムの１容量で抽出し、２.５Ｍ酢酸ナトリ
ウム１/１０容量およびエタノール２容量を加えること
により沈澱させて精製した。次いで、製造者の指示(GIB
CO-BRL.P.O., Box 6009, Gaithersburg, MD)に従い、Ｂ
glIおよびＰvuＩ制限酵素を用いて軽鎖ＤＮＡを消化し
た。消化後、臭化エチジウムを含有するＴＢＥアガロー
スゲル上でのアガロースゲル電気泳動により軽鎖ＤＮＡ
を単離した。ＤＮＡをＵＶ光の下で視覚化し、ＢglI-Ｐ
vuＩ消化軽鎖ＤＮＡに対応するバンドをＤＥ８１ ＤＥ
ＡＥ紙(Schleicher and Schuell, Keene, NH)上への電
気泳動により単離した。１Ｍ塩化ナトリウム中での溶離
によりＤＮＡを膜から除去し、次いでエタノールで沈澱
させた。
【０１４７】重鎖可変領域ＤＮＡは、軽鎖について上に
記載した方法と同様の、以下の例外を有する方法で得
た。プラスミドpＮＣＥＭＧlを重鎖可変領域ＤＮＡの供
給源として用いた。このプラスミドは、ＰＣＲ反応のた
めの重鎖可変領域ＤＮＡの鋳型を提供した。用いた５'
および３'プライマーは、各々７７２および７２９であ
った。ＰＣＲに続いて、重鎖可変領域ＤＮＡに対応する
増幅されたＤＮＡをＰvuＩおよびＢamＨＩ制限エンドヌ
クレアーゼで消化した。重鎖可変領域に対応するＤＮＡ
を上に教示した方法に実質的に従って単離および精製し
た。
【０１４８】ベクターＶec１６ＣＨＡＫを以下の方法に
より構築した。プラスミドpＵＣ１８をＥcoＲIおよびＨ
indIII制限エンドヌクレアーゼで消化した。プラスミド
pＵＣ１８はGIBCO-BRL, Gaithersburg, MDから市販品と
して入手可能である。プラスミドpＵＣ１８の制限部位
および機能地図を図１４に示す。Maniatis, T., Fritsc
h, E.F., and Sambrook, J., Molecular Cloning: A La
boratory Manual, Cold Sping Harbor press (1982),
p.150-172による方法に実質的に従って、ベクターＤＮ
Ａの約２.６kbフラグメントを単離し、臭化エチジウム
を含むＴＢＥ(０.０８９Ｍトリス、０.０８９Ｍボロン
酸、０.００２Ｍ ＥＤＴＡ)アガロースゲル上で精製し
た。ＤＮＡを長波(３００〜３６０nm)ＵＶ光の下で視覚
化し、ＥcoＲI−ＨindIII消化ベクターＤＮＡに対応す
るバンドをＤＥ８１ ＤＥＡＥ紙(Schleicher and Schue
ll, Keene, NH)上への電気泳動により単離した。１Ｍ塩
化ナトリウム中での溶離により膜からこのＤＮＡを除去
し、次いでエタノールで沈殿させた。以下の式で示され
る２つの合成オリゴヌクレオチド：
【化１８】 および
【化１９】 を、Applied Biosystems Model 380Aまたは380B DNA sy
nthesizer (Applied Biosystems, Foster City, CA)を
用いて合成してアニーリングした。これらの２つのオリ
ゴヌクレオチドをアニーリングすることにより調製され
た二本鎖のポリリンカーをpＵＣ１８の約２.６kbベクタ
ーＤＮＡと連結させた。得られたベクターをＶec１６Ｃ
ＨＡＫと表示する。Ｖec１６ＣＨＡＫの制限部位および
機能地図を図１５に示す。
【０１４９】Ｖec１６ＣＨＡＫをＡflIIIおよびＢglI制
限エンドヌクレアーゼで消化した。上述の方法に実質的
に従って、４１０bpＡflIII−ＢglIフラグメントを単離
し、精製した。別の工程において、Ｖec１６ＣＨＡＫを
ＢamＨI−ＡflIII制限エンドヌクレアーゼで消化した。
約２２５０bpのＢamＨI−ＡflIIIフラグメントを上記と
同様に単離し、精製した。
【０１５０】ＰＣＲにより製造される軽鎖および重鎖可
変領域のＤＮＡ配列を、ベクターＶec１６ＣＨＡＫの４
１０bpのＡflIII−ＢglIおよび２２５０bpのＢamＨI−
ＡflIIIフラグメントと４フラグメント連結で混合し
た。ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ(GIBCO/BRL, Gaithers
burg, MD)の存在下で連結した。得られたプラスミドをp
ＵＣＥＭＦv１と表した。プラスミドpＵＣＥＭＦv１の
制限部位および機能地図を添付の図中図１６に示す。製
造者により推奨されたプロトコールに実質的に従って、
塩化カルシウム形質転換法により、コンピテントな大腸
菌ＤＨ５α細胞(BRL, Gaithersburg, MD)を形質転換す
るためにpＵＣＥＭＦv１を用いた。形質転換細胞を１０
０μg/mlメチシリンを含むＬＢ寒天上にプレートし、３
７℃で一晩インキュベートした。コロニーは増殖し、Sa
mbrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (199
0)による教示に実質的に従って、プラスミドＤＮＡを精
製し、制限酵素消化により分析した。
【０１５１】実施例１２.Ｃ. プラスミドpＵＣＥＭＦv
４の構築 軽鎖および重鎖可変領域に対応する２つのＰＣＲフラグ
メントをＸbaI−ＢamＨI消化pＵＣ１８プラスミドに挿
入することによりプラスミドpＵＣＥＭＦv４を作成し
た。ＰＣＲ増幅のための条件は上述の通りである。１つ
の反応において、pＵＣＥＭＦv１をプライマー８３０お
よび８２４と共に鋳型ＤＮＡとして用いた。プライマー
８３０および８２４は、ＸbaIおよびＡspIのための制限
部位を各々提供する。ＰＣＲの後、精製に先立ってこの
フラグメントをＸbaIおよびＡspI(＝Ａsp７１８)で消化
した。上記実施例１２.Ｂ.の教示に実質的に従って、単
離および精製を行った。他のＰＣＲ工程のために、pＵ
ＣＥＭＦv１鋳型ＤＮＡをプライマー８２３および８２
４と共に用いた。プライマー８２３および８２４はＡsp
IおよびＢamＨIのための制限部位を各々提供する。次い
で、このフラグメントをＡspIおよびＢamＨIで消化し、
精製した。上記実施例１２.Ｂ.の教示に実質的に従っ
て、単離および精製を行った。最終構築工程において、
ＸbaIおよびＢamＨI制限酵素でpＵＣ１８を消化するこ
とにより得、精製した約２.６kbのpＵＣ１８のＤＮＡフ
ラグメントに、２つのＰＣＲ由来フラグメントを連結し
た。得られたプラスミドpＵＣＥＭＦv４を用いて、コン
ピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換した。上記実
施例１２.Ｃ.において述べた一般原則を用いて、pＵＣ
ＥＭＦv４プラスミドを含む細菌コロニーの産生および
選択を行った。
【０１５２】実施例１２.Ｄ. プラスミドp６ＣＥＭＶ
１０の構築 ３つのフラグメントを連結することによりp６ＣＥＭＶ
１０を製造した。１つのフラグメントは、pＵＣＥＭＦv
４由来のＸbaI−ＡspI制限フラグメントであった。第二
のフラグメントは、pＵＣＥＭＦv４を鋳型ＤＮＡとして
プライマー８７２および８７１と共に用いたＰＣＲによ
り得た。ＰＣＲ反応の後、制限のために用いた酵素がＡ
spI(＝Ａsp７１８)およびＢamＨIであることを除いては
上記実施例１２の教示に従ってＤＮＡを処理した。上記
のフラグメントを、pＵＣ１８由来の２.６kbの精製Ｘba
I−ＢamＨIフラグメントに連結した。上記実施例１２.
Ｃ.に記載の一般法を用いて、細菌コロニーの産生およ
び選択を行った。
【０１５３】実施例１２.Ｅ. プラスミドp６ＣＥＭＦv
６の構築 p６ＣＥＭＦv６は、３つの別々の供給源から得た３つの
フラグメントの連結により構築した。pＵＣＥＭＦv１を
ＸbaIおよびＥco１０９で消化し、０.４kbのフラグメン
トを得た。p６ＣＥＭv１０をＥco１０９およびＢamＨI
で消化して０.３kbのフラグメントを得た。次いで、こ
れらの２つのフラグメントを、ＸbaIおよびＢamＨIによ
るpＵＣ１８の消化により得た２.６kbの精製フラグメン
トに連結した。上記実施例１２.Ｂ.に記載の一般法を用
いて、細菌コロニーの産生および選択を行った。
【０１５４】実施例１２.Ｆ. プラスミドpＪＣＥＭＦv
６の構築 pＪＣＥＭＦv６は、２つのフラグメントの連結により得
た。p６ＣＥＭＦv６由来の約０.７kbのＸbaIおよびＢam
ＨI消化フラグメントを、ＸbaI、ＥcoＲIおよびＢamＨI
を用いた消化によりpＪＧ１０５から得た約１１kbのフ
ラグメントに連結した。pＪＧ１０５は、Ghrayebら(EMB
O J. 3: 2437-2442, 1984)により予め得られたクロラム
フェニコール耐性の発現プラスミドである。薬物耐性コ
ロニーを選択するためにアンピシリンの代わりに３０mg
/mlクロラムフェニコールを用いた以外は上記実施例１
２.Ｃ.で述べた一般法に従って、細菌を形質転換し、増
殖させて選択した。
【０１５５】実施例１２.Ｇ. クローン化された遺伝子
のＤＮＡ配列 市販品として入手可能な配列決定キットSequenase(U.S.
Biochemicals, Cleveland, OH)により提供されるプロ
トコールを用いた二本鎖鋳型のための標準的な方法によ
り、クローン化されたＣＥＭ２３１.６.７のＨis-Ｔrp-
Ｈis-Ｈis-Ｈis融合ペプチドを伴う重鎖および軽鎖可変
領域の配列決定を行った。ompＡリーダーペプチドを含
む軽鎖可変領域のＤＮＡ配列は以下の通りである：
【化２０】 ompＡリーダーペプチドを含み、Ｈis-Ｔrp-Ｈis-Ｈis-
Ｈisキレート化ペプチド暗号配列を３'末端に組み込ん
でいる重鎖可変領域のＤＮＡ配列は以下の通りである：
【化２１】 ＤＮＡstar(Madison, WI)から市販品として入手可能な
コンピューター・ソフトウエア・プログラムＭＡＰＳＥ
Ｑにより、得られたＤＮＡ配列からアミノ酸配列を推定
した。
【０１５６】実施例１２.Ｈ. pＪＣＥＭＦv６の発現お
よび抗体活性 プラスミドpＪＣＥＭＦv６ＤＮＡを用いて、コンピテン
トな大腸菌株ＤＨ１０Ｂ(BRL, Gaithersburg, MD)を形
質転換した。０.０、０.０１もしくは０.１mＭのいずれ
かの濃度のイソプロピルチオガラクトシドを含む発現培
地(トリプトン２４g/Ｌ、酵母抽出物４８g/Ｌ、リン酸
二ナトリウム６.１g/Ｌ、リン酸一ナトリウム６.１g/
Ｌ)中で、細胞を３０℃で一晩増殖させた。培養後、培
地を遠心により細菌から分離し、ヒト癌胎児性抗原(Ｃ
ＥＡ)に対する抗体活性についてＥＬＩＳＡ阻害検定法
により試験した。阻害検定法は、ＣＥＡと反応するモノ
クローナルなネズミ抗体ＣＥＶ１２４で最初に被覆され
た９６ウエルの微量滴定プレート中で行った。結合後、
Ｔ８４結腸癌の溶解性抽出物を含有するＣＥＡと共にプ
レートをインキュベートし、プレート上の抗体への結合
を可能とした。被験物質またはＣＥＭ２３１.６.７のＦ
ab'フラグメント(後者は阻害に対する標準曲線を提供す
る)をプレートに加え、続いてビオチンに結合されたＸ
ＣＥＭ４４９抗体を希釈の後に添加した。非結合性の分
子を除去するために洗浄した後、ビオチンコンジュゲー
トの存在または非存在を、アビジン−ＨＲＰに続いてＯ
ＰＤ基質(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)を用いる反
応により測定した。この結果により、pＪＣＥＭＦv６で
形質転換されたＤＨ１０Ｂ細胞は、活性なＣＰ−Ｆv抗
体タンパク質を生産することが示された。
【０１５７】実施例１３ ベクターの構築 可変の軽鎖および重鎖可変領域のためのゲノムＤＮＡを
得てクローン化するための実施例において、ＣＥＭ ２
３１.６.７と表されるネズミハイブリドーマ細胞を用い
た。ネズミハイブリドーマＣＥＭ ２３１.６.７は、１
９８８年１月７日、American Type Culture Collectio
n, Rockville, Marylandに受託番号ＨＢ９６２０で受託
されている。ネズミハイブリドーマＣＥＭ ２３１.６.
７およびヒト抹消血リンパ球から得たクローン化された
ゲノムＤＮＡは、キメラ遺伝子の構築のために用いた。
キメラ遺伝子のトランスフェクションは、本質的にTone
guzzo, F.ら[Molecular and Cell. Biol., 6:703-706
(1986)]およびChu, G.ら[Nucleic Acid Res., 15:1311-
1325 (1987)]の記載に本質的に従った電気泳動法により
行った。これらの文献は、本明細書中の一部を構成する
ものとする。宿主細胞ＳＰ２／０−Ａg１４ハイブリド
ーマ細胞は、キメラ遺伝子の受容体である。ＳＰ２／０
−Ａg１４ハイブリドーマ細胞は、American Type Cultu
re Collection, Rockville, MDから入手可能である。
【０１５８】実施例１３Ａ. pＮＣＥＭγ１の単離 pＮＣＥＭγ１、抗−ＣＥＡ ＩgＧ１重鎖発現ベクター
は、米国特許出願番号０７／２７２,５７７(１９８８年
１１月１７日出願)に記載されており、この全体は本明
細書の一部を構成するものとする。このプラスミドの単
離およびＣsＣl精製は、いくつかの実験室マニュアル
(例えば、Molecular Cloning, a laboratory manual. 2
nd Ed. by J. Sambrook, E.F. Fritch, and T.Maniati
s, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harb
or, 1989)において記述されている標準的なＤＮＡ製造
法により行った。
【０１５９】実施例１３.Ｂ. Ｈis-Ｔrp-Ｈis-Ｈis-Ｈ
is-ＰroをコードするＣ末端ペプチドを有する抗−ＣＥ
Ａ ＩgＧ１重鎖を含むプラスミドpＮＣＥＭγ１−ＣＨ
ＥＬ１３の構築 クローニング法は、発現ベクターpＮＣＥＭγ１から得
た４つのＤＮＡフラグメントの産生を含むものである。
最初のフラグメント(約９.０kb)は、Stratagene (San D
iego, CA)から得たUniversal Restriction Buffer中のG
IBCO-BRL(Gaithersburg, MD)から入手した制限酵素Ｓal
I、ＮruIおよびＣlaIを各々２０単位用いてＴＥ緩衝液
中のpＮＣＥＭγ１ ＤＮＡ(１０μg)を、制限消化する
ことにより得た。消化は、３７℃で２時間行った。エタ
ノール沈殿および水中での再懸濁の後に、消化したＤＮ
Ａを０.５μg/ml臭化ブロマイドを含む０.５％ＴＢＥア
ガロースゲル中で、９０Ｖ、４５分間電気泳動した。Ｕ
Ｖ透過光ボックス上での視覚化に続いて、９.０kbのフ
ラグメントをSchleicher and Schuell (Keene, NH)から
得たＤＥＡＥ ８１紙上へ電気泳動した。フラグメント
を１.２Ｍ塩化ナトリウム中で溶離し、エタノール沈殿
により回収した。次いで、フラグメント１と称される溶
離されたフラグメントを水(２０μl)中に再懸濁した。
第二のフラグメントをＰＣＲ(ＰＣＲ Technology, edit
ed by H.A. Erlich, Stockton Press, New York, 1989
に記載された様に)により調製した。２つのオリゴヌク
レオチドプライマーをMilligen Biosearch[Milliporeの
一部門(Bedford, MA)]から得たＤＮＡ合成装置(Model 8
700)で、製造者のプロトコールを用いて合成した。プラ
イマー１(＃９８４)は、pＮＣＥＭγ１における１個の
ＳalI制限部位の５'の３０塩基対配列に合うよう設計し
た。プライマー２(＃８５５)は、pＮＣＥＭγ１遺伝子
のＣＨ３領域内の３０bpの相補鎖に合うように、そして
停止コドンおよびＸmaIII制限配列の尾部と共にＨis-Ｔ
rp-Ｈis-Ｈis-Ｈis-Ｐroをコードする１８塩基対の配列
を含むよう設計した。鋳型、この２つのプライマー、d
ＮＴＰ混合物、およびＴＡＱポリメラーゼを共に混合
し、反応緩衝液中、最終容量が１００μｌとなるように
した。鉱油（５０μl)を反応物の上に浮かべ、この試験
管をPerkinElmer Cetus (Emeryville, CA)から得たＤＮ
Ａサーモサイクラー中に入れ、９４℃で１分間、６０℃
で１分間および７２℃で２分間、２５サイクルに設定し
た。このＰＣＲ反応の後、反応混合物(５μl)をＴＢＥ
緩衝液中の０.７５％アガロースゲル上で分析した。所
望の約１.８kbのフラグメントをＵＶ透視計を通じて観
察した。ここでフラグメント２と称されるこのフラグメ
ントを、フラグメント１について上述した様にして単
離、精製して、加えたキレート化ペプチド配列を以下に
示す様に配列確認するためにAmerican Type Culture Co
llection (ATCC Designation 31344)より入手可能な保
持ベクターpＢＲ３２２中にクローン化した。pＢＲ３２
２ベクター(１０μg)およびフラグメント２をＳalIおよ
びＸmaIIIで別々に消化した。ＳalI消化は、上記の様に
して行った。２０単位の酵素および制限緩衝液＃５(GIB
CO-BRL, Gaithersburg, MD)を含むＸmaIII消化は、３７
℃で２時間行った。pＢＲ３２２ ＳalI／ＸmaIII ４.１
kbフラグメント(３００ng)(上述の通りＤＥＡＥ８１紙
を用いて単離)およびＰＣＲ産生ＳalI−ＸmaIII消化１.
８kbフラグメント(２００ng)を、リガーゼ緩衝液中、４
単位のＴ４リガーゼおよび０.５mＭＡＴＰを含有する全
量２０μl中に共に再懸濁した。リガーゼおよび緩衝液
はStratagene (San Diego, CA)から入手可能である。連
結は１４℃で一晩行った。American Type Culture Coll
ection (ATCC Designation #53338)から入手可能なＭＣ
１０６１コンピテントな細菌細胞(１００μl)と共に、
連結混合物(１０μl)を氷上で３０分間インキュベート
した。上記のMolecular Cloningに記載の様に、混合物
に４２℃で４５秒間熱ショックを与え、その後ＳＯＣ
(１ml)を加え、３７℃で振盪しながら１時間培養した。
次いで、形質転換されたＭＣ１０６１細胞をＬＢ−ＡＭ
Ｐプレート(５０μg/mlアンピシリン)上に一晩３７℃で
プレートした。増殖したコロニーから得たＤＮＡを、正
しい挿入サイズについて制限消化による分析をしたとこ
ろ、成功裏の形質転換が示された。第三のフラグメント
を以下に示すようにしてＰＣＲにより生成した。プライ
マー１(＃９７７)は、pＮＣＥＭγ１の３０塩基対領域
に適合し、さらにキレート化ペプチド配列、停止コド
ン、および５'尾部としてのＸmaIII部位を提供した。プ
ライマー２(＃９７８)は、ポリアデニル化シグナルの
３'の４２bpの相補鎖およびＮruI制限部位を含んでい
た。ＰＣＲ試薬および条件はフラグメント２について上
で述べたものと同一であった。３２４bpフラグメントが
このＰＣＲ工程から得られ、これをフラグメント３と称
した。第４のフラグメントは、フラグメント２およびフ
ラグメント３をＰＣＲ工程のための鋳型として用いるこ
とにより得た。この工程において、プライマー１(＃８
５４)は、フラグメント２およびプライマー２(＃９７
８)の５'配列およびフラグメント３の３’配列に適合し
た。部分的に重複するＰＣＲ反応を行い、フラグメント
２およびフラグメント３の合計に等しいサイズのフラグ
メントを産出した。ＰＣＲ条件は上述の通りとした。２
１３４bpのフラグメント４は、上述の様にＳalIおよび
ＮruIで消化し、フラグメント１に連結した。連結生成
物を用いて、ＢＲＬ(Gaithersburg, MD)から得たＤＨ１
０Ｂ Electromax細胞を形質転換した。形質転換細胞を
Ｌ−ブロス、アンピシリンプレート(５０μg/mlアンピ
シリン)上にプレートし、一晩３７℃で増殖させた。得
られたコロニーからのＤＮＡを、正しい挿入サイズにつ
いて制限消化により分析したところ、成功裏の形質転換
が示された。
【０１６０】実施例１３.Ｃ. キメラ軽鎖免疫グロブリ
ン遺伝子を含むプラスミドpＧＣＥＭＫ(ＳＲＥ)の構築 ヒトκ遺伝子に融合されたネズミＶＬ領域を含む真核性
発現ベクターを、American Type Culture Collection
(ATCC Designation # 37145)より入手可能なベクターp
ＳＶ２gptを用いて構築した。pＳＶ２gptＤＮＡ(１μg)
を、１単位／μg(ＤＮＡ)の制限酵素ＥcoＲIを用いて反
応緩衝液＃３(GIBCO-BRL, Gaithersburg,Maryland)中で
消化した。次いで、上記のMolecular Cloning.に記載の
様にして全容量５０μl中のdＴＴＰ、dＧＴＰ、dＣＴＰ
およびdＡＴＰの４つのデオキシリボヌクレオチドの各
々５mＭを１０μg、２単位のクレノウ酵素および１０×
緩衝液(０.５Ｍトリス塩酸、pＨ７.５；０.１Ｍ ＭgＣl
2；１０mＭジチオトレイトール)を加えることによりＥc
oＲI末端を平滑にした。反応を室温で３０分間行い、次
いで、新しいベクターのための新しいＣlaI部位を創造
するためにリン酸化ＣlaIリンカー(２μg)(New England
BioLabs, Beverly, MA)をＥcoＲI平滑末端pＳＶ２gpt
(５００ng)に連結するという連結反応を行った。ＣlaI
リンカー配列はd(pCATCCGATG)であった。連結反応は、
実施例１３Ｂで述べた様にして行った。連結後、過剰な
リンカーを、実施例１３Ｂと同様にＤＮＡの電気泳動お
よびＤＥＡＥ８１紙上への線状pＳＶ２gpt−ＣlaIフラ
グメントの単離により除去した。コンピテントなＨＢ１
０１細胞を実施例１３Ｂと同様に形質転換し、そこから
得たアンピシリン耐性コロニーを制限酵素消化により分
析した。
【０１６１】次いで、得られたベクターpＳＶ２gpt−Ｃ
laIをＣlaIおよびＢamＨI制限酵素(１単位/μg(ＤＮ
Ａ))で消化した。また、キメラベクターpＨＫＣＥ−１
０をこれらの２つの酵素で消化した。実施例１３Ｂで述
べた様にして４.５kbのpＳＶ２gptＣlaI−ＢamＨIフラ
グメントおよび９kbのＣlaI−ＢamＨI pＨＫＣＥ−１０
フラグメントをＤＥＡＥ８１紙上に単離した。上述の標
準的な連結反応は、９kbのフラグメントの挿入ＤＮＡ
(３７５ng)および４.５kbのベクターＤＮＡ(２００ng)
を用いて行った。ＨＢ１０１の形質転換に続いて、pＧ
ＣＥＭＫと称される組換えプラスミドは、プラスミドＤ
ＮＡの制限マッピングにより同定した。さらにこのプラ
スミドに対する１つの修飾は、ヒトc−fos遺伝子の約８
０塩基対領域を含む推定の非組織特異的なエンハンサー
を添加することであった(Treisman, R., Cell 42. 889-
902, 1985; Chen, W.S. et al, Nature 238, 820-823,
1987)。この８０bp領域をまず合成し、ＡatIIおよびＨi
ndIII制限末端を含めることによりpＵＣ１９にクローン
化した。エンハンサー構成成分をpＵＣ１９から除去
し、これらの制限部位の３'突出末端を以下に示すよう
にして充填した：ＡatII／ＨindIII消化pＵＣ１９−Ｓ
ＲＥベクター(２０μg)を１０×Ｔ４ポリメラーゼ緩衝
液(７００mＭトリス、pＨ７.４、１００mＭ ＭgＣl2；
５０mＭ ＤＴＴ)(３μl)、dＮＴＰ混合物(dＡＴＰ、dＴ
ＴＰ、dＣＴＰおよびdＧＴＰの各々０.５mＭ、pＨ７.
０)、水(３μl)およびGIBCO-BRL (Gaithersburg, MD)か
ら得たＴ４ＤＮＡポリメラーゼ(１μg)(５単位)と共に
混合した。この混合物を３７℃で１５分間インキュベー
トし、次いで１０分間７０℃に加熱した。フェノール／
クロロホルム抽出およびエタノール沈殿の後、ＣlaIリ
ンカーを１０２bpの構成成分の末端に上述の様に加え
た。エンハンサー構成成分の２個のコピーをpＧＣＥＭ
Ｋの１つのＣlaI部位に上述の様に連結した。このプラ
スミドはＳＲＥ３.９と称されるＣＥＭキメラ軽鎖産生
セルラインを製造するのに用いられるκ軽鎖発現ベクタ
ーである。
【０１６２】実施例１４ ベクターのＤＮＡ配列および
クローン化された遺伝子 DuPont (Wilmington, DE)のGenesis 2000自動化配列決
定装置に適合するU.S.Biochemicals (Cleveland, Ohio)
から市販品として入手可能な配列決定キットSequenas
e、およびStratagene, Inc. (La Jolla, CA)から市販品
として入手可能なBluescript/DNA Sequencing Systemに
より提供されるプロトコールを用いて二本鎖鋳型のため
の標準的な方法により、クローン化された重鎖遺伝子p
ＮＣＥＭγ１−ＣＨＥＬ１３の配列決定を行った。クロ
ーン化された重鎖領域について得られたＤＮＡ配列、コ
ードされたポリペプチドのアミノ酸配列は、DNAStar (M
adison, WI)から市販品として入手可能なコンピュータ
ー・ソフト・プログラムＭＡＰＳＥＱにより推定した。
【０１６３】実施例１５ 抗体遺伝子のトランスフェク
ション 実施例１５.Ａ. キメラ構築物pＧＣＥＭＫ(ＳＲＥ)を
有するキメラ軽鎖遺伝子のトランスフェクション トランスフェクションのために用いられるプラスミドを
コードしている軽鎖免疫グロブリンは、上記実施例１３
Ｃで記述したpＧＣＥＭＫ(ＳＲＥ)であった。ヒトκ遺
伝子に融合されるネズミ可変軽鎖(Ｖk)遺伝子を有するp
ＧＣＥＭＫ(ＳＲＥ)プラスミドは、Chuら[Nucleic Acid
s Research 15:1311-1325 (1987)]により開示されてい
る電気泳動法によりまずＳＰ２／０ハイブリドーマ細胞
にトランスフェクションした。ＳＰ２／０細胞を１０％
ＦＢＳを含む培地中で増殖させ、電気泳動の前３日間対
数増殖の状態で維持した。制限酵素ＰvuI(１u/μl)およ
びGIBCO-BRL (Gaithersburg, Maryland)から得た反応緩
衝液＃７を用いて、プラスミドベクターpＧＣＥＭＫ(Ｓ
ＲＥ)(２０μg)を線状にした。トランスフェクションの
時点で、ＳＰ２／０細胞をＩＥＣ臨床用遠心機(８００r
pm、１０分間、室温)で遠心することにより集めた。次
いで、６mＭデキストロースを含むGIBCO Laboratories
(Grand Island, NY)から得たHanks Buffered Saline So
lution中で細胞を洗浄し、最終濃度１.０×１０7細胞/m
lで再懸濁した。０.５mlの細胞をキュベット中に１×１
０7細胞/mlの密度で等分し、線状としたＤＮＡを加え
た。GibcoーBRL (Gaithersburg, MD)から得たCell-Pora
torを用いて３００μＦおよび３５０ボルトの設定で電
気泳動を行った。次いで、電気泳動した細胞をＨＨ３培
地および１０％子ウシ胎児血清中に２×１０5/ml(Ｔ７
５フラスコ中)の密度で７２時間再懸濁した(３７℃、５
％ＣＯ2)。次いで、細胞を適当な抗生物質中に２４ウエ
ルプレート中１×１０5細胞/mlの密度でプレートし；p
ＧＣＥＭＫ(ＳＲＥ)を含むＳＰ２／０細胞を、Sigma (S
t. Louis, Missouri)から入手可能なＨＭＡＸ培地(５０
ng/mlヒポキサンチン、２５０ng/mlミコフェノール酸お
よび５０μg/mlキサンチン)中にプレートした。上清(２
００μl)をＨＭＡＸ耐性コロニーを含む各ウエルから集
めた。次いで、pＧＣＥＭＫ(ＳＲＥ)のキメラ免疫グロ
ブリン遺伝子の発現を指示するであろうヒトκ定常領域
遺伝子の存在について、この上清を試験した。
【０１６４】実施例１５.Ｂ. キメラＣＥＭ軽鎖を分泌
するＳＰ２／０細胞の同定 ヒトκについてEngvall, E.およびPerlmann, P.[Immuno
chemistry, 8:871-874(1971)]により記載されている様
に、キメラＣＥＭ κ遺伝子を発現しているトランスフ
ェクションされたＳＰ２／０細胞を、標準的な酵素−結
合イムノソルベント試験法(ＥＬＩＳＡ)により同定し
た。本試験法の目的は、pＧＣＥＭＫ(ＳＲＥ)プラスミ
ドベクターによりコードされたキメラκ鎖ポリペプチド
を分泌しているこれらの細胞を同定することであった。
１０mＭリン酸ナトリウム(pＨ７.４)中のヤギ抗−ヒト
κ鎖(Tago #4106 Tago Inc., 887 Mitten Road, Burlin
game,CA)の５μg/ml溶液を調製した。９６ウエルプレー
トの各ウエルをこの溶液(５０μl)で被覆した。次い
で、このプレートを３７℃で一晩インキュベートした。
次いでプレートを水で、次にＰＢＳ＋０.１％ツィーン
(w/v)で充分にすすいだ。上清の分画(５０μl)を各ウエ
ルに加え、室温で２時間インキュベートした。再びプレ
ートを上述の様にしてすすいだ。ヤギ抗−ヒトκ鎖アル
カリホスファターゼコンジュゲート(Tago #2496 Tago I
nc., 887 Mitten Road, Burlingame, CA)を上清の物質
と同じ培地中で１：１０００に希釈した。１ウエル当た
り１００μlを加え、室温で１時間インキュベートし
た。プレートを上述の様にすすいだ。アルカリホスファ
ターゼ基質を包装の指示に従い調製し、蒸留水３ml当た
り１タブレットと本基質(１５０μl)を各ウエルに加
え、３７℃で３０分間インキュベートした。３００mＭ
ＥＤＴＡ(５０μl)で反応を失活させ、次いで４０５nＭ
での吸光度を測定した。最も高いレベルのκ発現を示し
ている上清をサブクローンし、キメラ構築物pＮＣＥＭ
Ｇ１−ＣＨＥＬ １３の導入のために発展させた。
【０１６５】実施例１５.Ｃ. 重鎖キメラ構築物pＮＣ
ＥＭＧ１−ＣＨＥＬ １３を有するキメラκ産生細胞の
トランスフェクション ＳＰ２／０細胞のトランスフェクションのために用いら
れる重鎖免疫グロブリンをコードしているプラスミドは
pＮＣＥＭＧ１−ＣＨＥＬ １３であり、実施例１３で詳
述された構築物から得られた。キメラＣＥＭκ遺伝子を
発現しているサブクローン化された細胞群を、キメラＣ
ＥＭ重鎖遺伝子を含有しているプラスミド構築物と共に
電気泳動した。κ遺伝子の電気泳動のために、ＳＰ２／
０キメラκ産生細胞(ＳＲＥ３.９)を電気泳動の前３日
間対数増殖に維持した。プラスミドＤＮＡ pＮＣＥＭＧ
１−ＣＨＥＬ １３(２０μg)を、GIBCO-BRL (Gaithersb
urg, MD)から得た反応緩衝液＃６中の酵素ＰvuIで線状
にした。細胞を集め、洗浄して、１×１０7細胞/mlの密
度で再懸濁した。ＤＮＡを加えて、上記実施例１５.Ａ
に記述した様にして混合物を電気泳動した。細胞を２.
５×１０5細胞/mlで１０％子ウシ胎児血清およびＨＭＡ
Ｘを含むＨＨ３培地中にプレートし、３７℃、５％ＣＯ
2で７２時間増殖させた。次いで、細胞を２４ウエルプ
レート中、ＨＭＡＸおよびGIBCO-BRL (Gaithersburg, M
D)から得たＧ４１８抗生物質(ゲネチシン)を活性濃度５
００μg/mlで含む培地中に５×１０4/mlでプレートし
た。選択を１４日間維持し、その時点でＨＭＡＸ／Ｇ４
１８耐性コロニーを有するこれらのコロニーは以降の分
析に対して同定された。
【０１６６】実施例１６ ＣＨＥＬ−１３抗体を分泌し
ている細胞の同定および分析 実施例１６.Ａ. 組み立てられたＩgＧ１抗体発現のＥ
ＬＩＳＡ 組み立てられた抗体の検定は、微量滴定プレートのウエ
ルを１０mＭホスフェート(pＨ７〜８)中のヤギ抗−ヒト
ＩgＧ抗体試薬(Tago #3100, Tago Inc., 887Mitten Roa
d, Burlingame, CA)(５μg/ml)を用いて被覆することに
より行った。プレートを３７℃で一晩乾燥し、次いでＰ
ＢＳおよび０.１％ツィーン−２０、次いで水により洗
浄した。細胞上清(５０μl)を各ウエルに加え、室温で
２時間インキュベートした。再びプレートを上述の様に
してすすいだ。ヤギ抗−ヒトκ鎖アルカリホスファター
ゼコンジュゲート(Tago #2496, Tago Inc., 887 Mitten
Road, Burlingame, CA)を、上清の物質と同じ培地中
１：１０００に希釈した。１ウエル当たり１００μlを
加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを上
述と同様にしてすすいだ。アルカリホスファターゼ基質
を、包装の指示に従い調製し、蒸留水３mlあたり１タブ
レットおよび本基質(１５０μl)を各ウエルに加え、３
７℃で３０分間インキュベートした。トランスフェクト
ーマＸＣＥＭ４４９.０８から精製したタンパク質を陽
性コントロールとして用いた。
【０１６７】実施例１６.Ｂ. 組み立てられたキメラ抗
体の定量 無傷の抗体の定量は、本質的には組み立てられたＩg Ｅ
ＬＩＳＡで述べた様にして行った。５〜１８０ng/mlの
範囲でキメラＣＥＭ抗体の既知の濃度の希釈列をプレー
トすることにより、標準曲線を作成した。光学密度は４
０５nmで測定し、適当な標準曲線に対して各試料を定量
した。
【０１６８】実施例１７ ＣＨＥＬ−１３抗体の精製 血清フリーもしくは１％子ウシ胎児血清を含む培地中で
増殖させたＣＨＥＬ−１３分泌細胞の最終培養物から得
た培養上清(３００ml)を緩衝液Ａ[１００mＭＮaＨ2ＰＯ
4(pＨ７.４)；１００mＭ ＮaＣl](１０Ｌ)に対して４℃
で１８時間透析した。透析後、培地を３０００×gで１
０分間遠心した。透明になった培地をデカンテーション
した。Perspective Biosystems (Cambridge, MA)から得
た４.６×５０mmのイミノジアセテート・カラムに製造者
の指示に従いＮi2+をロードした。Ｎi2+をロードしたカ
ラムを緩衝液Ａで平衡化した。Waters (South San Fran
cisco, CA)から得たＨＰＬＣポンプ(モデル５１０)を用
い、１０ml/分の流速で、透明にした培地をカラム上に
ロードした。培地をロードした後、カラムを緩衝液Ａ
(５０ml)で洗浄した。カラムをHewlett Packard (Palo
Alto, CA)から得たModel 1090 HPLCに移した。次いで、
このカラムを緩衝液Ａの≧１５mlを用いて流速３ml/分
で洗浄した。カラムを１５mlの５０％緩衝液Ａ；５０％
緩衝液Ｂ(１００mＭＮaＨ2ＰＯ4(pＨ４.２５)：１００m
Ｍ ＮaＣl)次いで≧３０mlの緩衝液Ｂで順に洗浄した。
これらの洗浄の後に、カラムを緩衝液Ａ(６ml)で再平衡
化した。結合したＣＨＥＬ−１３を、１０分間で展開し
た緩衝液Ａから緩衝液Ｃ[１Ｍグリシン(pＨ８.７)；１
００mＭ ＮaＣl]への直線勾配で溶離した。分画を集
め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより抗体含量を分析した。分画
を含有している抗体を、８００倍過剰量のＰＢＳ[１０m
Ｍ Ｎa2ＨＰＯ4(pＨ７.０)；１５０mＭ ＮaＣl]に対し
て、４０℃で１８時間透析した。W.R. Grace and Co.
(Danvers, MA)から得たＹＭ１０メンブランを有するア
ミコン濃縮セルを用いて、プールされた抗体を濃縮し
た。混在しているＮi2+を以下の様にして除去した：
(１)ＰＢＳ中の１０mＭ ＥＤＴＡを用いて抗体溶液を１
０倍に希釈し；(２)抗体を元の容量まで再濃縮し；(３)
次いで、抗体をＥＤＴＡ−フリーＰＢＳで１０倍に希釈
して、元の容量の１/２まで濃縮し；(４)抗体をＥＤＴ
Ａ−フリーＰＢＳで２０倍に希釈して再濃縮し；(５)少
なくとも８０,０００の因子により希釈されるまで工程
(４)を繰り返した。抗体の最終濃度を、２８０nm[Ａ0.1
%(１cm)＝１.４と推定]での吸光度により推定し、４５
０μg/mlであることがわかった。
【０１６９】実施例１８ Ｃ末端金属−結合ペプチドに
ついての原子力顕微鏡イメージ 実施例１８.Ａ. 金属イオンを含有するための適当な表
面の調製 １mＭ塩化ニッケル(５μl)を切断したばかりのマイカ表
面にスポットし、１分間静置し、Milli-QR水ですすい
だ。これを室温で２０分間風乾し、ＰＢＳ(pＨ７.０)の
下で１２のマイクロメーター・スキャナー・ヘッドおよ
び１００のマイクロメーター・カンチレバーを使用し、
Digital Instruments, Inc. (Santa Barbara, CA)から
得た原子力顕微鏡を用いてイメージした。図２４にはマ
イカ単独のイメージを示し、図２５にはニッケル−マイ
カのイメージを示す。カンチレバー・チップに適用され
た力は、約１０-9ニュートンである。
【０１７０】実施例１８.Ｂ. ニッケル−マイカに結合
した抗体 切断したばかりのマイカ表面上の液体セル中に０.５μg
/ml ＣＨＥＬ１３(１００μl)を注入し、１０分間マイ
カ表面と接触させた。次いで、液体セルをＰＢＳで洗い
流し、ＰＢＳ(pＨ７)の下でイメージした。その力は約
１０-9ニュートンであった。カンチレバー動作によるタ
ンパク質の塗布により、タンパク質はマイカ表面単独に
結合していないことが示唆されている。図２６を参照。
次いで、金属結合ペプチドを含まない抗体ＸＣＥＭ４４
９をニッケル−マイカ表面上で試験した。１mＭ塩化ニ
ッケル(５μl)を切断したてのマイカ表面上にスポット
し、１分間静置し、Milli-QR水ですすいだ。これを室温
で２０分間風乾し、液体セルに接着させた。０.５μg/m
l ＸＣＥＭ４４９(１００μl)を液体セル中に注入し、
次いでＰＢＳで洗い流した。カンチレバーによるタンパ
ク質の塗布により、このタンパク質はマイカに対して非
特異的な結合をしていることが示唆された。結果を図２
７に示す。
【０１７１】次いで、ＣＨＥＬ１３を有するマイカ−ニ
ッケルを以下の方法で実験した。１mＭ塩化ニッケル(５
μl)を切断したばかりのマイカ表面上にスポットし、１
分間静置し、Milli-QR水ですすいだ。これを室温で２０
分間風乾し、液体セルに接着させた。０.５μg/ml ＣＨ
ＥＬ１３(１００μl)を液体セル中に注入し、ニッケル
−マイカ表面と１０分間接触させた。次いで液体セルを
ＰＢＳで洗い流し、イメージした。図２８にこのイメー
ジを示す。カンチレバーと共に移動しなかった球状構造
により、物質はニッケル−マイカ表面に結合しているこ
とが示唆される。構造のサイズの測定により、それらは
約１４２Å×３４Åであることが示された。これは電子
顕微鏡により計測された１５０Å×３８Åという測定値
に匹敵するものである。カンチレバーによる距離の測定
値は、測定する構造の剛性に依存する。
【０１７２】金属結合(キレート化)ペプチドが実際にニ
ッケルに結合していることを示すために、以下の実験を
行った。１mＭ塩化ニッケル(５μl)を切断したばかりの
マイカ表面上にスポットし、１分間静置し、Milli-QR水
ですすいだ。これを室温で２０分間風乾し、液体セルに
接着させた。０.５μg/ml ＣＨＥＬ１３(１８０μｌ）
を１０ｍＭ塩化ニッケル(２０μl)と共に３０分間プレ
インキュベートした。この物質(１００μl)を液体セル
中に注入し、ニッケル−マイカ表面と１０分間インキュ
ベートした。次いで液体セルをＰＢＳで洗い流し、イメ
ージした。図２９に示す様に、タンパク質はカンチレバ
ーにより移動し、塗布されたイメージが得られた。これ
は、表面に対する結合は実際に金属結合(キレート化)ペ
プチドを通じて起こっていることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＣＰ−Ｅ７融合腫瘍タンパク質とＲＢ抗-腫
瘍タンパク質を用いる本明細書中に例示の測定系を図式
的に示す模式図である。
【図２】 プラスミドpＨＰＶ１６の制限部位および機
能地図を示す模式図である。
【図３】 プラスミドpＣＺＲ３２２の制限部位および
機能地図を示す模式図である。
【図４】 プラスミドp１６Ｅ７の制限部位および機能
地図を示す模式図である。
【図５】 プラスミドp１６Ｅ７eの制限部位および機能
地図を示す模式図である。
【図６】 プラスミドpＡbＴ９３００の制限部位および
機能地図を示す模式図である。
【図７】 プラスミドpＢlueＢacＲＢの合成の工程図で
ある。
【図８】 プラスミドpＢlueＢacの制限部位および機能
地図を示す模式図である。
【図９】 プラスミドpＢlueＢacＲＢの制限部位および
機能地図を示す模式図である。
【図１０】 プラスミドpＲＢ60の合成の工程図であ
る。
【図１１】 プラスミドpＲＢ60の制限部位および機能
地図を示す模式図である。
【図１２】 プラスミドpＪＥＣＭＦv６の創製の工程図
である(前半部)。
【図１３】 プラスミドpＪＥＣＭＦv６の創製の工程図
である(後半部)。
【図１４】 プラスミドpＵＣ１８の制限部位および機
能地図を示す模式図である。
【図１５】 プラスミドＶec１６ＣＨＡＫの制限部位お
よび機能地図を示す模式図である。
【図１６】 プラスミドpＵＣＥＭＦv１の制限部位およ
び機能地図を示す模式図である。
【図１７】 プラスミドpＪＣＥＭＦv６の制限部位およ
び機能地図を示す模式図である。
【図１８】 ＣＨＥＬ培地をＩＭＡＣクロマトグラフィ
ーにかけた結果を示すグラフである。
【図１９】 図１８で得たＩＭＡＣ由来の分画をＳＤＳ
-ＰＡＧＥ分析にかけた結果を示す模式図である。
【図２０】 Ａ：抗ヒトＩgＧ重鎖およびＢ：抗ヒトＩg
Ｇ軽鎖を用いたＩＭＡＣ分画のウエスタン・ブロット分
析の結果を示す模式図である。
【図２１】 ＩＭＡＣ分画の非還元および還元ＳＤＳ-
ＰＡＧＥ分析の結果を示す模式図である。
【図２２】 ＣＨＥＬ培地(血清不含培地に一層適合さ
せた細胞)をＩＭＡＣクロマトグラフィーにかけた結果
を示すグラフである。
【図２３】 図２２からのグリシン勾配分画の非還元Ｓ
ＤＳ-ＰＡＧＥ分析の結果を示す模式図である。
【図２４】 １２マイクロメーター・スキャナー・ヘッ
ドと１００マイクロメーター・カンチレバーを用いてＰ
ＢＳ(pＨ７)のもとで得た、新たに切断したマイカ表面
の原子力顕微鏡イメージ(像)の模式図である。
【図２５】 ニッケル注入したマイカ表面の原子力顕微
鏡イメージの模式図である。
【図２６】 マイカ−ＣＨＥＬ１３の原子力顕微鏡イメ
ージの模式図である。
【図２７】 ＸＣＥＭ４４９を伴うマイカ−ニッケルの
原子力顕微鏡イメージの模式図である。
【図２８】 ＣＨＥＬ１３に暴露したニッケル注入マイ
カ表面の原子力顕微鏡イメージの模式図である。
【図２９】 結合ニッケルを含むＣＨＥＬ１３に暴露し
たニッケル注入マイカ表面の原子力顕微鏡イメージの模
式図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１１月１１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＣＰ−Ｅ７融合腫瘍タンパク質とＲＢ抗-腫
瘍タンパク質を用いる本明細書中に例示の測定系を図式
的に示す模式図である。
【図２】 プラスミドpＨＰＶ１６の制限部位および機
能地図を示す模式図である。
【図３】 プラスミドpＣＺＲ３２２の制限部位および
機能地図を示す模式図である。
【図４】 プラスミドp１６Ｅ７の制限部位および機能
地図を示す模式図である。
【図５】 プラスミドp１６Ｅ７eの制限部位および機能
地図を示す模式図である。
【図６】 プラスミドpＡbＴ９３００の制限部位および
機能地図を示す模式図である。
【図７】 プラスミドpＢlueＢacＲＢの合成の工程図で
ある。
【図８】 プラスミドpＢlueＢacの制限部位および機能
地図を示す模式図である。
【図９】 プラスミドpＢlueＢacＲＢの制限部位および
機能地図を示す模式図である。
【図１０】 プラスミドpＲＢ60の合成の工程図であ
る。
【図１１】 プラスミドpＲＢ60の制限部位および機能
地図を示す模式図である。
【図１２】 プラスミドpＪＥＣＭＦv６の創製の工程図
である(前半部)。
【図１３】 プラスミドpＪＥＣＭＦv６の創製の工程図
である(後半部)。
【図１４】 プラスミドpＵＣ１８の制限部位および機
能地図を示す模式図である。
【図１５】 プラスミドＶec１６ＣＨＡＫの制限部位お
よび機能地図を示す模式図である。
【図１６】 プラスミドpＵＣＥＭＦv１の制限部位およ
び機能地図を示す模式図である。
【図１７】 プラスミドpＪＣＥＭＦv６の制限部位およ
び機能地図を示す模式図である。
【図１８】 ＣＨＥＬ培地をＩＭＡＣクロマトグラフィ
ーにかけた結果を示すグラフである。
【図１９】 図１８で得たＩＭＡＣ由来の分画を電気泳
動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)分析にかけた結果を示す図面に代
わる写真である。
【図２０】 Ａ：抗ヒトＩgＧ重鎖およびＢ：抗ヒトＩg
Ｇ軽鎖を用いたＩＭＡＣ分画の電気泳動(ウエスタン・
ブロット)分析の結果を示す図面に代わる写真である。
【図２１】 ＩＭＡＣ分画の非還元および還元電気泳動
(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)分析の結果を示す図面に代わる写真
である。
【図２２】 ＣＨＥＬ培地(血清不含培地に一層適合さ
せた細胞)をＩＭＡＣクロマトグラフィーにかけた結果
を示すグラフである。
【図２３】 図２２からのグリシン勾配分画の非還元電
気泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)分析の結果を示す図面に代わ
る写真である。
【図２４】 １２マイクロメーター・スキャナー・ヘッ
ドと１００マイクロメーター・カンチレバーを用いてＰ
ＢＳ(pＨ７)のもとで得た、新たに切断したマイカ表面
の粒子構造(原子力顕微鏡イメージ)を示す図面に代わる
写真である。
【図２５】 ニッケル注入したマイカ表面の粒子構造
(原子力顕微鏡イメージ)を示す図面に代わる写真であ
る。
【図２６】 マイカ−ＣＨＥＬ１３の粒子構造(原子力
顕微鏡イメージ)を示す図面に代わる写真である。
【図２７】 ＸＣＥＭ４４９を伴うマイカ−ニッケルの
粒子構造(原子力顕微鏡イメージ）を示す図面に代わる
写真である。
【図２８】 ＣＨＥＬ１３に暴露したニッケル注入マイ
カ表面の粒子構造(原子力顕微鏡イメージ）を示す図面
に代わる写真である。
【図２９】 結合ニッケルを含むＣＨＥＬ１３に暴露し
たニッケル注入マイカ表面の粒子構造(原子力顕微鏡イ
メージ）を示す図面に代わる写真である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１２】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１３】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１５】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１７】
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１９】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２０】
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２１】
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２３】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２４】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２５】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２６】
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２７】
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２８】
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２９】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/547 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/12 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (71)出願人 592022741 スーザン・マリー・ホフシュヴェンダー ＳＵＳＡＮ ＭＡＲＩＥ ＨＯＣＨＳＣＨ ＷＥＮＤＥＲ アメリカ合衆国92014カリフォルニア州デ ル・マル、マンゴ・ドライブ13850番 ア パートメント33 (71)出願人 592022752 メアリー・シーボルド・カッシャー ＭＡＲＹ ＳＥＹＢＯＬＤ ＫＡＳＨＥＲ アメリカ合衆国46256インディアナ州イン ディアナポリス、ウォーター・トレイス 8062番 (71)出願人 592022763 ミシェル・セシル・スミス ＭＩＣＨＥＬＥ ＣＥＣＥＩＬ ＳＭＩＴ Ｈ アメリカ合衆国46234インディアナ州イン ディアナポリス、ノース・レイクリッジ・ ドライブ4515番 (71)出願人 592022774 ウィリアム・ペーター・クリスティアー ン・ステマー ＷＩＬＬＩＡＭ ＰＥＴＥＲ ＣＨＲＩＳ ＴＩＡＡＮ ＳＴＥＭＭＥＲ アメリカ合衆国92009カリフォルニア州カ ールスバッド、アベニダ・テレサ2943番 (71)出願人 592022785 ジェイムズ・アレン・クック ＪＡＭＥＳ ＡＬＬＥＮ ＣＯＯＫ アメリカ合衆国46219インディアナ州イン ディアナポリス、アルハートン・ノース・ ドライブ5174番 (72)発明者 レスリー・デリーマー・アンダーソン アメリカ合衆国92024カリフォルニア州エ ンシニタス、ホリーリッジ・ドライブ634 番 (72)発明者 ゲイリー・サミュエル・デイビッド アメリカ合衆国92037カリフォルニア州 ラ・ジョラ、プール・ストリート9477番 (72)発明者 スーザン・マリー・ホフシュヴェンダー アメリカ合衆国92014カリフォルニア州デ ル・マル、マンゴ・ドライブ13850番 ア パートメント33 (72)発明者 メアリー・シーボルド・カッシャー アメリカ合衆国46256インディアナ州イン ディアナポリス、ウォーター・トレイス 8062番 (72)発明者 ミシェル・セシル・スミス アメリカ合衆国46234インディアナ州イン ディアナポリス、ノース・レイクリッジ・ ドライブ4515番 (72)発明者 ウィリアム・ペーター・クリスティアー ン・ステマー アメリカ合衆国92009カリフォルニア州カ ールスバッド、アベニダ・テレサ2943番 (72)発明者 ジェイムズ・アレン・クック アメリカ合衆国46219インディアナ州イン ディアナポリス、アルハートン・ノース・ ドライブ5174番

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の式で示される化合物： [ＢＡＭ−(スペーサー)x−キレート化剤]n−(Ｍ) {式中、ＢＡＭは生物学的に活性な分子であり；スペー
    サーは、１〜５０個のモノマー単位で構成されるポリペ
    プチド、タンパク質、ポリサッカリド、ポリヌクレオチ
    ドまたは合成の有機部分であり；キレート化剤は、二座
    配位子、三座配位子、四座配位子、三脚配位子、および
    大環式配位子からなる群から選ばれる有機キレート化
    剤、または式： (Ｈis)x−(Ａ)y−(Ｈis)z [式中、Ａは１またはそれ以上のアミノ酸であり；ｘは
    ０〜１０であり；ｙは０〜４であり；ｚは０〜１０であ
    る]で示されるキレート化ペプチドおよびそのポリマー
    であり(ここで、このポリマーのそれぞれのモノマー単
    位は同一または異なっている)；Ｍは、Ｖ、Ｃr、Ｍn、
    Ｆe、Ｒu、Ｏs、Ｃo、Ｒh、Ｐd、またはＰtからなる群
    から選ばれる遷移金属イオンであって、かつ、動力学的
    に不活性な酸化状態にあり；ｎは１〜４であり(ここ
    で、それぞれの[ＢＡＭ−(スペーサー)x−キレート化
    剤]は同一または異なっている)；ｘは０または１であ
    る}。
  2. 【請求項２】 タンパク質が、ＲＢ抗−腫瘍タンパク
    質、ＲＢ抗−腫瘍タンパク質の６０kd Ｅ７結合ドメイ
    ン、およびＥ７腫瘍タンパク質である請求項６に記載の
    化合物。
  3. 【請求項３】 以下の式で示される化合物： [ＢＡＭ−(スペーサー1)x−キレート化剤1−(Ｍ)−キレ
    ート化剤2-(スペーサー2)y]n−固体支持体 {式中、ＢＡＭは生物学的に活性な分子であり；スペー
    サーは、１〜５０個のモノマー単位で構成されるポリペ
    プチド、タンパク質、ポリサッカリド、ポリヌクレオチ
    ドまたは合成の有機部分であり；キレート化剤は、二座
    配位子、三座配位子、四座配位子、三脚配位子、および
    大環式配位子からなる群から選ばれる有機キレート化
    剤、または式： (Ｈis)x−(Ａ)y−(Ｈis)z [式中、Ａは１またはそれ以上のアミノ酸であり；ｘは
    ０〜１０であり；ｙは０〜４であり；ｚは０〜１０であ
    る]で示されるキレート化ペプチドおよびそのポリマー
    であり(ここで、このポリマーのそれぞれのモノマー単
    位は同一または異なっている)；Ｍは、Ｖ、Ｃr、Ｍn、
    Ｆe、Ｒu、Ｏs、Ｃo、Ｒh、Ｐd、およびＰtからなる群
    から選ばれる遷移金属イオンであって、かつ、動力学的
    に不活性な酸化状態にあり；ｘは０または１であり；ｙ
    は０または１であり；ｎは固体支持体に結合した単位の
    数である}。
  4. 【請求項４】 ＢＡＭが免疫反応性タンパク質であり、
    ｘが０であり、キレート化剤1がＨis-Ｔrp-Ｈis-Ｍet-
    Ｔyr、Ｈis-Ｈis-Ｈis-Ｍet-Ｔyr、Ｈis-Ｔrp-Ｈis-Ｔr
    p-Ｈis、Ｈis-Ｔrp-Ｈis-Ｈis-Ｈis、Ｈis-Ｈis-Ｈis-
    Ｈis-Ｔyr-Ｍet-Ｈis-Ｈis-Ｈis-Ｈis-ＴyrおよびＨis-
    Ｈis-Ｈis-Ｈis-Ｈisからなる群から選ばれるキレート
    化ペプチドであり、ＭがＣo(III)であり、ｙが０であ
    り、キレート化剤2がイミノジ酢酸であり、そしてｎが
    １〜１０００である請求項８に記載の化合物。
  5. 【請求項５】 それぞれのモノマーが以下の式で示され
    る化合物である不均質または均質ポリマー： [(Ｍ)−キレート化剤1−(スペーサー1)x−ＢＡＭ−(ス
    ペーサー２）ｙ−キレート化剤２−]n {式中、ＢＡＭは生物学的に活性な分子であり；スペー
    サーは、１〜５０個のモノマー単位で構成されるポリペ
    プチド、タンパク質、ポリサッカリド、ポリヌクレオチ
    ドまたは合成の有機部分であり；キレート化剤は、二座
    配位子、三座配位子、四座配位子、三脚配位子、および
    大環式配位子からなる群から選ばれる有機キレート化
    剤、または式： (Ｈis)x−(Ａ)y−(Ｈis)z [式中、Ａは１またはそれ以上のアミノ酸であり；ｘは
    ０〜１０であり；ｙは０〜４であり；ｚは０〜１０であ
    る]で示されるキレート化ペプチドおよびそのポリマー
    であり(ここで、このポリマーのそれぞれのモノマー単
    位は同一または異なっている)；Ｍは、Ｖ、Ｃr、Ｍn、
    Ｆe、Ｒu、Ｏs、Ｃo、Ｒh、Ｐd、およびＰtからなる群
    から選ばれる遷移金属イオンであって、かつ、動力学的
    に不活性な酸化状態にあり；そして、それぞれのモノマ
    ー単位において、 スペーサー1とスペーサー2は同一または異なっており；
    キレート化剤1とキレート化剤2は同一または異なってお
    り；ｘは０または１であり；ｙは０または１であり；そ
    してｎは１〜１０6である}。
  6. 【請求項６】 (a)遷移金属と２またはそれ以上の同一
    または異なるキレート化剤を用いて動力学的に不安定な
    遷移金属錯体を調製し；そして(b)該金属イオンの酸化
    状態を変化させて動力学的に不活性な遷移金属錯体を得
    る；ことからなる、生物学的に活性な分子、リポーター
    分子、または固体支持体に共有結合した２またはそれ以
    上の同一または異なるキレート化剤との動力学的に不活
    性な遷移金属錯体の製造方法。
  7. 【請求項７】 遷移金属イオンがＣr、Ｖ、Ｍn、Ｃo、
    Ｆe、Ｒu、Ｏs、Ｒh、Ｉr、Ｐd、およびＰtからなる群
    から選ばれる請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 キレート化剤が、二座配位子、三座配位
    子、四座配位子、三脚配位子、および大環式配位子から
    なる群から選ばれる有機キレート化剤、または式： (Ｈis)x−(Ａ)y−(Ｈis)z [式中、Ａは１またはそれ以上のアミノ酸であり；ｘは
    ０〜１０であり；ｙは０〜４であり；ｚは０〜１０であ
    る]で示されるキレート化ペプチドおよびそのポリマー
    (ここで、このポリマーのそれぞれのモノマー単位は同
    一または異なっている)である請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 (a)キレート化部分を保持している生物
    学的に活性な分子またはリポーター分子を含有する溶液
    を、動力学的に不安定な酸化状態にある固定化遷移金属
    イオンを保持している固体支持体に適用し； (b)該固定化遷移金属イオンと該生物学的に活性な分子
    またはリポーター分子の間で動力学的に不安定な錯体を
    形成させ； (c)非特異的に結合した分子を除去し；そして (d)該遷移金属イオンの酸化状態を動力学的に不活性な
    酸化状態に変える；ことからなる、生物学的に活性な分
    子またはリポーター分子に共有結合したキレート化剤と
    遷移金属イオンの間で動力学的に不活性な遷移金属イオ
    ン錯体を形成させることによって、生物学的に活性な分
    子またはリポーター分子を精製および固定化する方法。
  10. 【請求項１０】 遷移金属イオンがＣr、Ｖ、Ｍn、Ｃ
    o、Ｆe、Ｒu、Ｏs、Ｒh、Ｉr、Ｐd、およびＰtからなる
    群から選ばれる請求項１４に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 キレート化剤が、二座配位子、三座配
    位子、四座配位子、三脚配位子、および大環式配位子か
    らなる群から選ばれる有機キレート化剤、または式： (Ｈis)x−(Ａ)y−(Ｈis)z [式中、Ａは１またはそれ以上のアミノ酸であり；ｘは
    ０〜１０であり；ｙは０〜４であり；ｚは０〜１０であ
    る]で示されるキレート化ペプチドおよびそのポリマー
    (ここで、このポリマーのそれぞれのモノマー単位は同
    一または異なっている)である請求項１４に記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】 金属イオンがＣo、ＣrおよびＲuから
    なる群から選ばれ、生物学的に活性な分子またはリポー
    ター分子が薬物、蛍光染料、放射活性リガンド、ヌクレ
    オチド、タンパク質、ＲＢタンパク質、ＲＢタンパク質
    の６０kd Ｅ７結合ドメイン、Ｅ７タンパク質、ＣＥＭ
    ２３１.６.７抗体のＦvフラグメント、免疫反応性タン
    パク質、炭水化物、脂質および酵素からなる群から選ば
    れる請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 (a)キレート化剤を保持しているＢＡ
    Ｍと結合遷移金属イオンを保持している固体支持体の間
    で動力学的に不活性な錯体を形成させ； (b)該動力学的に不活性な錯体を、該ＢＡＭに対する免
    疫反応性タンパク質を含有する溶液に暴露し； (c)非特異的に結合した分子を除去し；そして (e)結合した免疫反応性タンパク質を除去する；ことか
    らなる、免疫反応性タンパク質の精製方法。
  14. 【請求項１４】 ＭがＶ、Ｃr、Ｍn、Ｆe、Ｒu、Ｏs、
    Ｃo、Ｒh、Ｐd、およびＰtからなる群から選ばれる請求
    項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 キレート化剤が、二座配位子、三座配
    位子、四座配位子、三脚配位子、および大環式配位子か
    らなる群から選ばれる有機キレート化剤、または式： (Ｈis)x−(Ａ)y−(Ｈis)z [式中、Ａは１またはそれ以上のアミノ酸であり；ｘは
    ０〜１０であり；ｙは０〜４であり；ｚは０〜１０であ
    る]で示されるキレート化ペプチドおよびそのポリマー
    (ここで、このポリマーのそれぞれのモノマー単位は同
    一または異なっている)である請求項１４に記載の方
    法。
  16. 【請求項１６】 タンパク質が、ＲＢ抗−腫瘍タンパク
    質、ＲＢ抗−腫瘍タンパク質の６０kd Ｅ７結合ドメイ
    ン、およびＥ７腫瘍タンパク質からなる群から選ばれる
    請求項１５に記載の化合物。
  17. 【請求項１７】 (a)キレート化剤を保持しているタン
    パク質と、Ｖ、Ｃr、Ｍn、Ｆe、Ｒu、Ｏs、Ｃo、Ｒh、
    Ｐd、およびＰtからなる群から選ばれる遷移金属イオン
    を保持している固体支持体の間で動力学的に不活性な錯
    体を形成させ; (b)該動力学的に不活性な錯体を、配位子−タンパク質
    錯体の可能性ある阻害物質を含有する溶液に暴露し； (c)配位子を導入し； (d)非特異的に結合した分子を除去し；そして (e)溶離液中の配位子と可能性ある阻害物質の濃度を定
    量する；ことからなる、タンパク質への配位子の結合を
    破壊する物質の検出方法。
  18. 【請求項１８】 キレート化剤が、二座配位子、三座配
    位子、四座配位子、三脚配位子、および大環式配位子か
    らなる群から選ばれる有機キレート化剤、または式： (Ｈis)x−(Ａ)y−(Ｈis)z [式中、Ａは１またはそれ以上のアミノ酸であり；ｘは
    ０〜１０であり；ｙは０〜４であり；ｚは０〜１０であ
    る]で示されるキレート化ペプチドおよびそのポリマー
    (ここで、このポリマーのそれぞれのモノマー単位は同
    一または異なっている)である請求項１７に記載の方
    法。
  19. 【請求項１９】 タンパク質が酵素、ホルモン、免疫反
    応性タンパク質、ＲＢ抗−腫瘍タンパク質、ＲＢ抗−腫
    瘍タンパク質の６０kd Ｅ７結合ドメイン、およびＥ７
    腫瘍タンパク質からなる群から選ばれる請求項１８に記
    載の化合物。
  20. 【請求項２０】 (a)式： [ＢＡＭ−(スペーサー1)x−キレート化剤1−(Ｍ)−キレ
    ート化剤2−(スペーサー2)y]n−固体支持体 {式中、ＢＡＭは免疫反応性タンパク質であり；スペー
    サーは、１〜５０個のモノマー単位で構成されるポリペ
    プチド、タンパク質、ポリサッカリド、ポリヌクレオチ
    ドまたは合成の有機部分であり；Ｍは、動力学的に不活
    性な遷移金属イオン錯体を形成しうる遷移金属イオンで
    あって、動力学的に不安定な酸化状態にあり、かつ、
    Ｖ、Ｃr、Ｍn、Ｆe、Ｒu、Ｏs、Ｃo、Ｒh、Ｐd、および
    Ｐtからなる群から選ばれ；ｘは０または１であり；ｙ
    は０または１であり；ｎは固体支持体に結合したモノマ
    ーの数である}で示される化合物を形成し；そして(b)酸
    化状態の該遷移金属イオンを動力学的に不活性な酸化状
    態に変える；ことからなる、免疫反応性タンパク質の配
    向方法。
  21. 【請求項２１】 少なくとも１つのキレート化剤が、二
    座配位子、三座配位子、四座配位子、三脚配位子、およ
    び大環式配位子からなる群から選ばれる有機キレート化
    剤、または式： (Ｈis)x−(Ａ)y−(Ｈis)z [式中、Ａは１またはそれ以上のアミノ酸であり；ｘは
    ０〜１０であり；ｙは０〜４であり；ｚは０〜１０であ
    る]で示されるキレート化ペプチドおよびそのポリマー
    (ここで、このポリマーのそれぞれのモノマー単位は同
    一または異なっている)である請求項２０に記載の方
    法。
  22. 【請求項２２】 ＢＡＭが免疫反応性タンパク質であ
    り、ｘが０であり、キレート化剤1がＨis-Ｔrp-Ｈis-Ｍ
    et-Ｔyr、Ｈis-Ｈis-Ｈis-Ｍet-Ｔyr、Ｈis-Ｔrp-Ｈis-
    Ｔrp-Ｈis、Ｈis-Ｔrp-Ｈis-Ｈis-Ｈis、Ｈis-Ｈis-Ｈi
    s-Ｈis-Ｔyr-Ｍet-Ｈis-Ｈis-Ｈis-Ｈis-ＴyrおよびＨi
    s-Ｈis-Ｈis-Ｈis-Ｈisからなる群から選ばれるキレー
    ト化ペプチドであり、ＭがＣo(III)であり、ｙが０であ
    り、キレート化剤2がイミノジ酢酸であり、そしてｎが
    １〜１０００である請求項２１に記載の化合物。
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