JPH0582390B2

JPH0582390B2 -

Info

Publication number: JPH0582390B2
Application number: JP60203286A
Authority: JP
Inventors: Kazuo Suzuki; Susumu Kuraishi; Toshio Fujikura; Tsukasa Matsumoto
Original assignee: Cosmo Oil Co Ltd
Current assignee: Cosmo Oil Co Ltd
Priority date: 1985-09-17
Filing date: 1985-09-17
Publication date: 1993-11-18
Also published as: JPS6263581A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は豆科植物から細胞分裂阻害作用を有す
る５，７，3′，4′，5′−ペンタヒドロキシフラボ
ノールを時間的に速やかに高収量で分離精製する
方法に関するものである。

従来の技術及び問題点本発明者ら及び共同研究者は1984年８月26日〜
31日に東京において開催された第３回国際細胞生
物会議において、フラボノイド系化合物である
５，７，2′，4′，5′−ペンタヒドロキシフラボノ
ールをホワイトクローバー（シロツメグサ）から
はじめて抽出、単離し、これが細胞分裂阻害作用
を有することを報告した〔日本細胞生物学会
（The Japan Society for Cell Biology）発行、
国際細胞生物会議1984（International Cell
Biology 1984）に提出された論文の要旨集−第
518頁、論文No.5063参照〕。

この化合物はUVスペクトル、GC−マススペ
クトル、赤外スペクトル及び60MHz ¹H−NMR
スペクトルの解析により５，７，2′，4′，5′−ペ
ンタヒドロキシフラボノールと同定されたもので
ある。しかしながら、その後に¹³C−NMRスペ
クロメーター及び400MHz¹H−NMRスペクトロ
メーターの使用が可能になり、これを用いて同じ
物質のスペクトルを解析した結果、該物質は正し
くは５，７，3′，4′，5′−ペンタヒドロキシフラ
ボノール、すなわち一般名ミリセチンとして知ら
れる化合物であることが判明した。

前記1984年の学会において本発明者ら及び共同
研究者が提案したホワイトクローバーからのミリ
セチン、すなわち５，７，3′，4′，5′−ペンタヒ
ドロキシフラボノールの抽出分離精製法は、ホワ
イトクローバーの種子をエタノール及び酢酸エチ
ルで順次抽出し、これをクロマトグラフイーの手
法によつて、たとえばポリビニルピロリドン及び
シリカゲルのカラムクロマトグラフイー、ついで
ペーパークロマトグラフイー、さらに高速液体ク
ロマトグラフイーによつて精製することからな
り、かくして目的化合物を純粋な形で単離するこ
とができる。しかしながら、このような方法はき
わめて繁雑であり、分離精製に長時間を要し、し
かも収量がきわめて悪く、工業的には全く適用し
難いものであつた。すなわち、上記方法による収
量は１Kgの種子から僅かに５〜10mgに過ぎなかつ
た。

問題点を解決するための手段、作用及び効果本発明者らは上記既提案の方法よりも簡便かつ
効率的で、工業的に適用可能なホワイトクローバ
ーからの５，７，3′，4′，5′−ペンタヒドロキシ
フラボノールの単離法について鋭意研究した結
果、本発明の方法を確立し、さらに本発明の目的
達成のためにこの方法をホワイトクローバー以外
の豆科植物の組織にも適用し得ることを認めて本
発明を完成した。

したがつて本発明は、豆科植物の組織を沸点95
℃以下の水溶性溶剤の水溶液で抽出処理し、処理
液から溶剤を除去した残りの水溶液層をPH6.5〜
8.5に調整したのち、水に難溶性の極性溶剤を用
いて溶剤抽出を行ない、次いで抽出液をゲル過
に付して５，７，3′，4′，5′−ペンタヒドロキシ
フラボノールを分離することを特徴とする５，
７，3′，4′，5′−ペンタヒドロキシフラボノール
の分離精製法を提供するものである。本方法によ
つて従来不可能であつた５，７，3′，4′，5′−ペ
ンタヒドロキシフラボノールを高収量で大量に分
離精製することがはじめて可能になつた。

以下に本発明の目的を好ましく達成し得る実施
態様について説明する。

本発明の方法の第１段階は豆科植物の組織を沸
点95℃以下の水溶性溶剤の水溶液で抽出処理する
方法である。豆科植物の例としてはホワイトクロ
ーバー（しろつめくさ）、むらさきうまごやし
（もくしゆく）、むらさきつめくさ（あかつめく
さ）、げんげ（れんげそう）、はりえにしだ、むら
さきそしんか、えんじゆ、めどはぎ、すずめのえ
んどう、からすのえんどう、やはずそう等があ
る。これらの組織としては種子が好ましい。沸点
約95℃以下、特に約90℃以下の水溶性溶剤は５，
７，3′，4′，5′−ペンタヒドロキシフラボノール
を溶解するものであればいずれでもよいが、例え
ばメタノール、エタノール、イソプロパノール、
アセトン、テトラヒドロフラン、第三ブチルアル
コールのようなアルコール類、エーテル類、ケト
ン類などをあげることができる。水溶性溶剤とし
ては水への溶解度が約40重量％以上、特に約50重
量％以上の有機溶剤が好ましく、抽出処理操作後
における溶剤の除去を容易にするため沸点が水よ
り低いもの、すなわち沸点が95℃以下、好ましく
は約90℃以下のものを用いる。豆科植物の組織は
破砕して溶剤抽出に付すことが好ましい。溶剤抽
出に用いる溶剤水溶液の濃度は特に限定されない
が、通常50〜80容量％が用いられる。抽出温度は
常圧あるいは加圧下での溶剤の沸点以下であれば
よい。抽出方法は通常工業的に用いられている方
法であればいずれの方法を用いてもよい。

第２段階は水に難溶性の極性溶剤を用いる溶剤
抽出であるが、本処理に先立つて第１段階で得た
抽出処理液から水溶性溶剤を常圧あるいは減圧下
の蒸発あるいは蒸留によつて除いた残りの水溶液
層をPH調整剤によつてPH6.5〜8.5、好ましくはPH
7.0〜8.0に調整する。PHが6.5より低い場合、ある
いは8.5より高い場合には、次後の抽出処理時に
水溶液中の５，７，3′，4′，5′−ペンタヒドロキ
シフラボノールが分解し、収量が低下する。ここ
で用いるPH調整剤は任意のものでよく、例えば重
炭酸ソーダ、亜硫酸ソーダ、マツキルベイン緩衝
液、ミハエリス緩衝液、ブリトン−ロビンソン緩
衝液などが用いられる。PH調整をした水溶液層を
ついで有機溶剤によつて抽出する。使用する有機
溶剤は水に難溶性で、５，７，3′，4′，5′−ペン
タヒドロキシフラボノールを溶かすものであれば
任意のものでよく、例えばジクロルメタン、クロ
ロホルム、ｎ−ブタノール、ｎ−アミルアルコー
ル、ｎ−ヘキサノール、エチルエーテル、イソプ
ロピルエーテル、メチルエチルケトン、メチルブ
チルケトン、メチルイソブチルケトン、酢酸エチ
ル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチルのようなハロ
ゲン化炭化水素、アルコール類、エーテル類、ケ
トン類、エステル類などがある。使用する溶剤と
しては水への溶解度が約0.1〜30重量％、特に約
２〜10重量％の極性有機溶剤が好ましい。実質的
に水に不溶な溶剤は使用に適しない。抽出温度は
常圧あるいは加圧下での溶剤の沸点以下であれば
よい。抽出方法は通常工業的に用いられている方
法であればいずれの方法を用いてもよい。この段
階の操作において水溶液層をPH調整する前に炭化
水素溶剤、例えば石油エーテル、ｎ−ヘキサンな
どによつて洗浄処理を行ない、水溶液層に混入し
ている油脂類などの不純物を炭化水素系溶剤に溶
かして取り除いておけば、次後の有機溶剤による
抽出処理が容易になるので好ましい。

第３段階は第２段階で得た抽出液をゲル過に
よつて分画処理を行ない、目的とする５，７，
3′，4′，5′−ペンタヒドロキシフラボノールを得
る工程である。ゲル過は例えばフアルマシア社
製セフアデツクスLH−20、セフアデツクスLH
−60、セフアソーブHPウルトラフアイン、セフ
アデツクスＧ−15、セフアデツクスＧ−25などの
ゲル過用親油性ゲル粒子あるいは親水性ゲル粒
子を用いて行なう。親油性ゲルの使用がより好ま
しい。ゲル粒子は分子量が約400以下の画分が分
画できる分子量分画範囲をもつものが好ましく、
またゲル過能に加えて吸着クロマトグラフイ
ー、分配型クロマトグラフイー、逆相分配型クロ
マトグラフイーなど他の機能を兼ねるものでもよ
い。ゲル過を行なう際使用する分画液として
は、親水性ゲルを用いるときは水、前述のような
水溶性溶剤、水溶性溶剤水溶液、好ましくはこの
水溶性溶剤と前述した水に難溶性の極性溶剤との
混合物が使用でき、親油性ゲルを用いるときは前
記の水に難溶性の極性溶剤、好ましくはこの水に
難溶性の極性溶剤と水溶性溶剤との混合物が使用
できる。このゲル過操作の前処理としては、前
記抽出液を減圧下においてあるいは加熱して溶剤
を蒸発もしくは蒸留するなどして濃縮することが
好ましく、またシリカゲルクロマトグラフイーな
どのカラムクロマト法によりあらかじめ不純物を
分離除去しておくことが好ましい。シリカゲルク
ロマトグラフイーなどのカラムクロマトグラフイ
ーをあらかじめ行なつておくと、ゲル過のゲル
粒子の汚れが少なく、効率のよい分離が行なわれ
る。このカラムクロマトグラフイーを行なう際の
分画液としては、シリカゲルのような親水性ゲル
を用いるときは水、前記水溶性溶剤、水溶性溶剤
水溶液、好ましくは水溶性溶剤と水に難溶性の極
性溶剤との混合物が使用でき、またオクタデシル
シリケートなどのような親油性ゲルを用いるとき
は前記水に難溶性の極性溶剤、好ましくはこれと
水溶性溶剤との混合物が使用できる。カラムクロ
マト法による不純物除去はゲル過の後に行なう
こともできる。

ゲル過操作段階で得られる５，７，3′，4′，
5′−ペンタヒドロキシフラボノールは必要に応じ
て結晶化法または高速液体クロマトグラフイーに
よりさらに精製してもよい。これらの場合に使用
する溶剤あるいは溶出溶剤としては前記の水に難
溶性の極性溶剤あるいはこれと水溶性溶剤との混
合物がある。

実施例以下実施例により本発明を説明する。

実施例１１破砕したホワイトクローバー種子１Kgに70容
量％エタノール水溶液５を加えて抽出操作を
行ない、固液を分離した。

２固形物に新たに70容量％エタノール水溶液５
を加えて１）と同様の抽出操作を行なう。

３１）と２）の抽出液を集め、抽出液中のエタ
ノールをエバポレーターによつて蒸発除去し、
水溶液層が約1000mlになるまで濃縮した。

４水溶液層を石油エーテル１によつて２回洗
浄し、水溶液層に混入している油脂類などの不
純物を除去した。

５水溶液層に粉末重炭酸ナトリウムを加え、PH
を7.4に調整したのち、酢酸エチル1000mlによ
つて２回抽出操作を行なつた。

６酢酸エチル抽出液を集め、エバポレーターで
約100mlまで濃縮した。

７濃縮液をシリカゲルカラムによつて分離し、
５，７，3′，4′，5′−ペンタヒドロキシフラボ
ノール画分を採取し、さらにこの画分をセフア
デツクスカラムLH−20によつて分離し、５，
７，3′，4′，5′−ペンタヒドロキシフラボノー
ル画分を採取した。分画液としてはいずれも酢
酸エチルとエタノールとの等容量混合液を用い
た。

８５，７，3′，4′，5′−ペンタヒドロキシフラ
ボノール画分をジクロルメタンから再結晶して
結晶1.74ｇを得た。この結晶を高速液体クロマ
トグラフイーで分析した結果、５，７，3′，
4′，5′−ペンタヒドロキシフラボノール純度が
99.5％であつた。またこの結晶は融点199℃
（分解）、赤外線吸収分析（KBr錠法）の主要
ピークは3350，1660，1605，1508cm^-1にあり、
60MHzプロトン核磁気共鳴分析（ジメチルスル
ホキシド溶液）の結果は7.80δ（1H，ｓ）、7.368
（1H，ｓ）、6.46δ（1H，ｄＪ＝2Hz）、6.30δ
（1H，ｄＪ＝2Hz）であり、400MHzプロト
ン核磁気共鳴スペクトル分析（ジメチルスルホ
キシド溶液）の結果は既知試料のスペクトルと
一致し（3′，5′−OH（9.3ppm）〕、さらに¹³C核
磁気共鳴スペクトル分析の結果（δ）は
105.94ppm、95.81ppm、92.48ppm（理論値はそ
れぞれ104.9ppm、96.8ppm、94.3ppm）であつ
た。

本方法で得られた５，７，3′，4′，5′−ペンタ
ヒドロキシフラボノール結晶の細胞分裂阻害効果
をFELC細胞（Friend virus infected murine
erythroleukemic cells）について検討したとこ
ろ、強い阻害効果を有していた。また、５，７，
3′，4′，5′−ペンタヒドロキシフラボノールを取
り除けば、FELC細胞の分裂活性は回復し、阻害
効果が可逆的であり、細胞毒性がない（non−
cytotoxic）ことが示された。

実施例２エタノールの代りにメタノールを使用し、PH調
整を7.4でなくPH8.0とし、酢酸エチルの代りにメ
チルエチルケトンを使用した以外は実施例１の方
法を反復して５，７，3′，4′，5′−ペンタヒドロ
キシフラボノールを得た。その収量は1.37ｇであ
つた。

実施例３エタノールの代りにアセトンを使用し、PH調整
を7.4でなくPH7.0とし、酢酸エチルの代りにジク
ロルメタンを使用した以外は実施例１の方法を反
復して５，７，3′，4′，5′−ペンタヒドロキシフ
ラボノールを得た。その収量は、1.25ｇであつ
た。

実施例４酢酸エチルの代りにメチルイソブチルケトンを
使用し、セフアデツクスLH−20の代りにセフア
デツクスLH−60を使用した以外は実施例１の方
法を反復して５，７，3′，4′，5′−ペンタヒドロ
キシフラボノールを得た。その収量は、1.51ｇで
あつた。

比較例ホワイトクローバー種子１Kgに70容量％エタノ
ール水溶液５を加えて抽出操作を行ない、固液
を分離し、固形物に新たに70容量％エタノール水
溶液５を加えて同様の抽出操作を行ない、これ
らの抽出液を集めて、抽出液中のエタノールをエ
バポレーターで蒸発除去し、水溶液層が約1000ml
になるまで濃縮した。

水溶液層を石油エーテル１によつて２回洗浄
し、残つた水溶液層中の成分を酢酸エチル1000ml
で２回抽出し、抽出液を集めて、エバポレーター
で約100mlまで濃縮した。

濃縮液を吸着クロマトグラフイー（ポリビニル
ピロリドンカラム）、次いでシリカゲルカラムに
よつて分離したのち、ペーパークロマトグラフイ
ー〔ワツトマン（Whatmann）、3MM〕によつ
て分離した。

分離液から溶剤を留去したのち、70〜80℃の酢
酸イソアミル15mlで溶解し、これにクロロホルム
40mlを加え、−20℃で結晶を析出させた。得られ
た結晶は7.5mg、５，７，3′，4′，5′−ペンタヒド
ロキシフラボノールの純度は99.4％であつた。

Claims

【特許請求の範囲】

１豆科植物の組織を沸点95℃以下の水溶性溶剤
の水溶液で抽出処理し、処理液から溶剤を除去し
た残りの水溶液層をPH6.5〜8.5に調整した後水に
難溶性の極性溶剤を用いて溶剤抽出を行ない、次
いで抽出液をゲル過に付して５，７，3′，4′，
5′−ペンタヒドロキシフラボノールを分離するこ
とを特徴とする５，７，3′，4′，5′−ペンタヒド
ロキシフラボノールの分離精製法。