JPH0576360A

JPH0576360A - 組織プラスミノーゲン活性化物質及びその誘導体を折り畳む改良法

Info

Publication number: JPH0576360A
Application number: JP3202722A
Authority: JP
Inventors: Cameron Mckeller Warren; ウアーレン・キヤメロン・マツクケラー; Suu Robey Caroline; キヤロライン・スー・ロベイ
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1991-07-15
Filing date: 1991-08-13
Publication date: 1993-03-30

Abstract

(57)【要約】【目的】クリングル−２を含む組織プラスミノーゲン
活性化因子および組織プラスミノーゲン活性化因子誘導
体の基質特異的な、酵素的に活性な分子の収量を増加さ
せる。【構成】折り畳み溶液に有効量のリジンを加えること
を特徴とする方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】蛋白の適正な配座と生物学的活性の間の関
係は長い間認められてきた。アンフィンセン［１９７
３、サイエンス第１８１巻２２３−２４０頁］はリボヌ
クレアーゼに関する業績により蛋白の折り畳みの分野に
おける仕事の先鋒となった。アンフィンセンの研究は、
その三次構造が適切なジスルフィド結合の形成に依存す
るリボヌクレアーゼの酵素活性における適切なジスルフ
ィド結合の形成の重要性を明らかにした。

【０００２】原核細胞における蛋白産物の発現のための
様々な遺伝子の遺伝子工学は、生物活性を維持するため
の多くの蛋白の厳密な配座の必要性に再び大きな注目を
している。原核生物中にクローニングされた多くの遺伝
子は、生物活性が最小のまたは生物活性が無い不溶性ア
モルファス複合体を蛋白産物に形成させるためにのみ有
効に発現されてきた。不溶性及び不活性は非常にしばし
ば、分子間または分子内の不適当なジスルフィド結合の
所産である。適切なジスルフィドの形成に依存する多数
のドメインを有する、より大きな、より複雑な蛋白は、
特に、含まれる多数のシステインの可能な順列及び組合
せに起因する折り畳みの問題を包含し易い。

【０００３】蛋白を生物活性に適切な配座に折り畳む様
々な試みがなされてきた。アンフィンセンの先駆的仕事
は、酵素の変性及び還元が、変性剤および還元剤を取り
除いた後でも不活性な産物を産むことを示した。酵素活
性が長時間の後に戻ることを発見したアンフィンセンの
見込みは、還元されたスルフヒドリル基の酸化及びこれ
に伴う活性型への折り畳みに帰するべきものとして正し
く認識された。蛋白化学における近年の研究は、蛋白の
折り畳みの分野を著しく広げた。蛋白を折り畳む方法
は、目的のポリペプチドを線状化する変性溶液の使用
と、これに続いて変性剤を除いて折り畳みをさせること
を含む。蛋白の変性に使用される溶液及びその中で該蛋
白を再び折り畳む溶液は、科学文献中に詳しく記載され
ている。

【０００４】マイアー、１９６８、バイオケミストリー
第７巻７６５頁及びシュテルワーゲン、１９６８、バイ
オケミストリー第７巻２８９３頁、は、蛋白を変性させ
るための尿素の使用を報告している。パトチョルニク及
びクラウス、１９７５、ピュア・アプライド・ケミスト
リー第４３巻５０３頁に記載の固相吸着；シーナ及びラ
イト、１９７５、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー第２５０巻８６２４頁及びジュノリーノ
等、１９７８、アーカイブズ・オブ・バイオケミストリ
ー・アンド・バイオフィジクス第１９１巻２６９頁に記
載の不溶性担体への共有結合による付着；並びにクレイ
トン、１９８６、プロテイン・ストラクチュア、フォー
ルディング、アンド・デザイン、オクセンダー編、アラ
ン・リス、ニューヨーク、２４９−２５７頁に記載のイ
オン交換樹脂への吸着を含む様々な取り組みが、溶液中
で蛋白を折り畳むための別法であり、システインの分子
間結合を最小にする理論的利点を提供する。蛋白の折り
畳みのための溶液は、しばしば下降濃度勾配の変性溶液
である。下降濃度勾配は、透析またはクロマトグラフィ
ー的手法によって作り出す。アームド等、１９７５、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第２５
０巻８４７７頁により報告されているグルタチオン酸化
還元緩衝液が広く使用され、多くの蛋白に対し成功して
いるようである。

【０００５】先行文献中の折り畳み法は、見かけ上多く
の蛋白に対し成功しているようである。しかしながら、
多数のジスルフィド結合を含む複雑な三次構造を有する
組織プラスミノーゲン活性化因子のような蛋白は、既存
の方法によっては効果的に折り畳めない。

【０００６】組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−Ｐ
Ａ）は、プラスミノーゲンをプラスミンに変換する。プ
ラスミンはフィブリン凝塊を酵素的に消化する。ｔ−Ｐ
Ａおよびｔ−ＰＡの誘導体は、ホメオスタシスの平衡異
常の処置において医学的および商業的重要性がある。ホ
メオスタシスがくずれると、フィブリン凝塊が形成さ
れ、心筋梗塞、深部静脈血栓症、脳卒中、及び肺塞栓を
もたらし得る。ｔ−ＰＡまたはｔ−ＰＡ誘導体による医
学的介入は、上記のホメオスタシス異常の処置における
測り知れない有用性を提供するものである。

【０００７】ｔ−ＰＡの構造の複雑さ及び生物活性に必
要な多数のジスルフィド結合は、ｔＰＡまたはｔ−ＰＡ
誘導体の適切な折り畳みに対する甚だしい障害を提起す
る。本発明は、有効量のリジンの添加が、ｔ−ＰＡ及び
クリングル−２を含むその誘導体の適切な折り畳みを促
進し、その結果既存の折り畳み法の効率を高める、とい
う驚くべき発見を開示及び特許請求するものである。

【０００８】図面の簡単な説明を下に述べる。図は縮尺
に正確に描かれてはいない。簡略化のため、実施例に記
載された組み立てに使用されない幾つかの制限エンドヌ
クレアーゼ部位は列記していない。

【０００９】図１はヒトｔ−ＰＡのアミノ酸配列を示
す。図２はプラスミドｐｔＰＡ１０２の制限部位及び機
能地図である。図３はプラスミドｐｔＰＡ１０３の制限
部位及び機能地図である。図４はプラスミドｐＵＣ１９
ＴＰＡＦＥの制限部位及び機能地図である。図５はプ
ラスミドｐＢＷ２８の制限部位及び機能地図である。図
６はプラスミドｐｔＰＡ３０１の制限部位及び機能地図
である。図７はプラスミドｐｔＰＡ３０３の制限部位及
び機能地図である。図８はプラスミドｐＢＷ３２の制限
部位及び機能地図である。図９はプラスミドｐＢＷ３
３、３５、３６の制限部位及び機能地図である。図１０
はプラスミドｐＣＺ１０６の制限部位及び機能地図であ
る。

【００１０】図１１はプラスミドｐＫＣ２８３の制限部
位及び機能地図である。図１２はプラスミドｐＫＳ２８
３−ＰＸの制限部位及び機能地図である。図１３はプラ
スミドｐＫＣ２８３−Ｌの制限部位及び機能地図であ
る。図１４はプラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢの制限部位
及び機能地図である。図１５はプラスミドｐＫＣ２８３
−ＰＲＳの制限部位及び機能地図である。図１６はプラ
スミドｐＬ３２の制限部位及び機能地図である。図１７
はプラスミドｐＬ４７の制限部位及び機能地図である。
図１８はプラスミドｐＬ８４の制限部位及び機能地図で
ある。図１９はプラスミドｐＬ９５の制限部位及び機能
地図である。図２０はプラスミドｐＲ１２の制限部位及
び機能地図である。図２１はプラスミドｐＲ１２ＡＲ１
の制限部位及び機能地図である。図２２はプラスミドｐ
Ｌ１１０の制限部位及び機能地図である。図２３はプラ
スミドｐＣＺ１０１の制限部位及び機能地図である。図
２４はプラスミドｐＬ２１９の制限部位及び機能地図で
ある。図２５は、ｔ−ＰＡ−６活性に及ぼす二段階折り
畳み法の第２段階における尿素濃度の効果を例示してい
る。

【００１１】本発明は、クリングル−２を含むｔ−ＰＡ
及びｔ−ＰＡ誘導体を折り畳む改良法であって、有効量
のリジンを加えて基質特異的な酵素的に活性な分子の収
量を増加させることからなる方法を提供するものであ
る。恐らくこのリジンはクリングル−２のリジン結合サ
イト（部位）と結合し、それによりクリングル−２を含
むｔ−ＰＡまたはｔ−ＰＡ誘導体の適切な折り畳みを促
進するのであろう。

【００１２】図１はヒトｔ−ＰＡのアミノ酸配列の図で
ある。ｔ−ＰＡ分子には非常に多くの生物活性が存在す
る。ｔ−ＰＡの様々な生物学的特性と結びついているｔ
−ＰＡ分子の領域（ドメイン）を図１に示す。ｔ−ＰＡ
の治療上の有用性を改善する努力の過程で、遺伝子工学
により幾つかのｔ−ＰＡ誘導体が組み立てられた。例え
ばｔ−ＰＡ−３においては、両方のクリングル（図１の
１及び２）が除去されている。ｔ−ＰＡ−４はクリング
ル１を含まない。ｔ−ＰＡ−６は、フィンガー、表皮成
長因子、及びクリングル１ドメインを欠いている。ｔ−
ＰＡ−３、ｔ−ＰＡ−４、及びｔ−ＰＡ−６は、上に特
定した領域を削除すべく化学合成されたオリゴヌクレオ
チド配列及びｍ１３ベクターを用いて、ｔ−ＰＡコード
化領域のサイト特異的突然変異誘発によって組み立てら
れた。ｔ−ＰＡ−３、ｔ−ＰＡ−４、及びｔ−ＰＡ−６
のための発現ベクターの組み立ては、実施例１−３０に
詳説してある。ｔ−ＰＡ−６に類似のｔ−ＰＡ誘導体
は、１９８７年２月９日公開のＥ．Ｐ．Ｏ．公開番号０
２３４０５１に開示及び特許請求されている。本発
明は、天然のｔ−ＰＡと同様、基質特異的な酵素的に活
性なｔ−ＰＡ誘導体の折り畳みにも適用することができ
る。

【００１３】本発明は、クリングル−２を含み原核細胞
において発現されるｔ−ＰＡまたはｔ−ＰＡ誘導体のた
めの改良折り畳み法のみを包含する。しかしながら、本
発明の実施の際に当業者を教え導くため、本明細書に開
示され特許請求される折り畳み法のための出発物質の供
給源として使用される発現ベクターの性質を詳しく記述
する。

【００１４】プラスミドｐＢＷ３３はｔ−ＰＡ−３のた
めの好ましい原核細胞発現ベクターである。プラスミド
ｐＢＷ３３の組み立ては実施例１０に述べる。プラスミ
ドｐＬ２１９はｔ−ＰＡ−４のための好ましい原核細胞
発現ベクターである。プラスミドｐＬ２１９の組み立て
は実施例２９に教示する。ｔ−ＰＡ−６のための好まし
い原核細胞発現ベクターであるプラスミドｐＬ２３１の
組み立ては実施例３１に教示する。上に述べた原核細胞
用発現ベクターは、記載されたｔ−ＰＡ誘導体とは異な
る種であるが、多くの特徴を共有する。プラスミドｐＢ
Ｗ３３、ｐＬ２１９、及びｐＬ２３１は、共に以下の特
徴を有する：テトラサイクリン耐性遺伝子が選択マーカ
ーとして使用される；プラスミドｐＢＲ３２２から誘導
される大腸菌の複製起点が複製に使用される；ラムダｐ
Ｌプロモーターがｔ−ＰＡ誘導体の発現を駆動する；そ
して、生成物発現の熱的誘導が、ｃＩ８５７、温度感受
性リプレッサーの使用により達成される。したがって、
本発明方法を例示するために用いられるいかなるｔ−Ｐ
Ａ誘導体の発現にも、微生物学的技術に精通しているこ
とのみが求められる。

【００１５】折り畳み法の改善のための出発物質として
働く蛋白の顆粒は、発現系を、所望密度の発現系が得ら
れるまでおよそ３２℃で、その後温度を約４２℃に変え
て培養することによって生成される。温度を〜４２℃に
高めることはｃＩ８５７リプレッサーの熱不活性化を導
き、そしてｐＬプロモーターから駆動される組み替え蛋
白の発現をさせる。大腸菌宿主細胞内におけるｔ−ＰＡ
誘導体の蓄積の結果、蛋白顆粒または包括体が形成され
る。この包括体は、所望の組み替え蛋白及び大腸菌の種
々の組成物からなる。

【００１６】ｔ−ＰＡまたはｔ−ＰＡ誘導体を折り畳む
に先立ち、顆粒を可溶化する必要がある。ｔ−ＰＡまた
はｔ−ＰＡ誘導体の顆粒を蒸留水に懸濁（１ｍｌ／ｇ）
する。本発明方法の例示に用いられる組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子及びその誘導体を含む蛋白顆粒の均質
な懸濁液の調製には、４℃におけるおよそ１時間の穏や
かな撹拌で充分である。可溶化した顆粒の蛋白濃度は、
プロテイン・アッセイ・リエイジャント・プロダクトＮ
ｏ．２３２００（ピアス・ケミカル・Ｃｏ．、ロックフ
ォード、ＩＬ）及び販売業者の供給する方法を用いて測
定した。スルフィトリシス及びイオン交換精製した物質
は、折り畳み工程（ステップ）に好ましい出発物質を含
む。スルフィトリシス法の詳細は実施例３２に記載す
る。実施例３３は、スルフィトリシスされたｔ−ＰＡ−
６のイオン交換精製を述べている。

【００１７】組み替えＤＮＡ技術により産生された蛋白
の折り畳みは、慣例によると、塩酸グアニジンまたは尿
素のいずれかを用いて蛋白を変性し、続いて非変性溶媒
に対して透析することに依存してきた。したがって、さ
らなる折り畳みの助けとなる環境を提供するために工程
１の変性溶液を希釈することのみを含む本発明に係る二
段階法は、蛋白の折り畳みの分野における著しい進歩で
ある。

【００１８】二段階折り畳み法を実施例３４に例示す
る。この二段階法は、およそ７Ｍの尿素中の蛋白の溶液
を調製し、次いで工程１（〜７Ｍ尿素）の溶液を希釈し
て、さらなる折り畳みの助けとなる環境を提供すること
からなる。実施例３４はｔ−ＰＡ−６を折り畳むための
二段階法の使用を教示している。ｔ−ＰＡ−３およびｔ
−ＰＡ−４が透析により得られるのと同様な効率で折り
畳まれることにより、他のｔ−ＰＡ誘導体に対するこの
二段階法の広範な有用性が確認された。実施例３４の二
段階折り畳み法の結果、酵素的に活性な型の折り畳まれ
たｔ−ＰＡ−６が１０−１５％得られる。

【００１９】二段階法を用いた場合の折り畳み効率対透
析を用いた場合の折り畳み効率の比較を実施例３５に示
す。比較の結果を下記の表１に示す。

【表１】

【００２０】折り畳みの有効性を達成する二段階法の能
力が透析により得られる能力に匹敵することは、表１に
おいて明らかである。折り畳み法を二段階の、希釈に基
づく方法に簡略化することにより、透析を上回る顕著な
利点が提示される。工業的規模の透析における透析型
（ダイアフィルトレーション）緩衝液交換装置の使用
は、頻繁に流体力学的ずれ力を産み、よって生物活性物
質の回収を損なう。従って、この二段階法は、蛋白の折
り畳みの分野における著しい進歩である。さらに、この
二段階法は、ｔ−ＰＡ−４およびｔ−ＰＡ−６の折り畳
みが好結果であったことに例示されるように、ｔ−ＰＡ
誘導体の折り畳みに対して広範に適用できる。

【００２１】工程１及び２における尿素濃度を変えて、
それぞれの工程における好ましい尿素濃度を決定した。
実施例３６Ａは、工程１の最適な尿素濃度を産み出すた
めに利用される実験的方法を提示している。実施例３４
に教示される標準的第二工程の後、工程１における７Ｍ
の尿素濃度は４９０ｕ／ｍｌのｔ−ＰＡ活性をもたら
し、また４Ｍの尿素濃度は２３ｕ／ｍｌのｔ−ＰＡ活性
を、そして工程１における１Ｍの尿素濃度は検出不能レ
ベルのｔ−ＰＡ活性をもたらした。したがって、工程１
における好ましい尿素濃度は、約５Ｍないし約８Ｍ尿素
であり、およそ７Ｍが特に好ましい。

【００２２】さらに図２５は、折り畳みにおける尿素濃
度の影響を示している。ｔ−ＰＡ誘導体の試料を、フィ
ブリン板に対するフィブリン溶解活性について、折り畳
み混合物から直接検定した。各々の時点で試料を採取
し、さらなるジスルフィド再配置を防ぐためにテトラチ
オン酸カリウムを試料に加えた。図２５のデータは、工
程２に対しては１．５Ｍないし３．５Ｍの範囲が好まし
い尿素濃度であることを示している。したがって、折り
畳み法の工程２を開始するには工程１の溶液を１：２ま
たは１：３に希釈するのが好ましい。

【００２３】好ましい尿素濃度の下で折り畳みは約４８
時間で完了する。よって、折り畳みの第二工程のために
は約４８時間が好ましい。基質特異的な、酵素的に活性
なｔ−ＰＡまたはｔ−ＰＡ誘導体に必要な複雑なジスル
フィド結合は、この二段階法において２つの別個の折り
畳み環境を与えることによって達成される。この２つの
折り畳み環境、即ち各々およそ７Ｍの尿素及びおよそ
１．５Ｍ−３．５Ｍの尿素は、その特定のドメインの折
り畳みをより助ける条件の下で、ｔ−ＰＡまたはｔ−Ｐ
Ａ誘導体のドメインの連続的折り畳みをさせる。

【００２４】このように、本発明方法（二段階法を使用
して実施した場合）は、（ａ）ｔ−ＰＡまたはｔ−ＰＡ
誘導体の二次及び三次構造を破壊するに充分な濃度の尿
素中に該ｔ−ＰＡまたはｔ−ＰＡ誘導体の溶液を作成
し、そして（ｂ）工程（ａ）の溶液を希釈して、該ｔ−
ＰＡまたはｔ−ＰＡ誘導体が基質特異的な、酵素的に活
性な分子にさらに折り畳まれるのを助ける第二の環境を
作り出す、ことからなる。本発明中で使用する語句「二
次及び三次構造を破壊する」は、二次及び三次構造を全
く取り除いてしまうことを意味する訳ではない。二次及
び三次構造の破壊は、適切なドメインの折り畳みの開始
に必要な移行状態を獲得するために必要なのである。

【００２５】ジスルフィド結合の再配置を終了させる試
薬の添加は、最適な再折り畳み条件を明確にする際に重
要である。試料を折り畳み工程から採取し、希釈し、そ
してフィブリン溶解活性について検定すると、高濃度の
尿素から採取された試料中に人為的に高められた活性が
認められた。フィブリン溶解検定に必要な希釈は、幾ら
かの折り畳みがフィブリン溶解検定の過程で起こるに充
分な程度に尿素濃度を低下させるということがわかっ
た。テトラチオン酸カリウムの添加は試料の活性の正確
な測定を可能にする。フィブリン溶解活性は、アストロ
ップ及びミュラーツ、１９５２、アーカイブズ・オブ・
バイオケミストリー第４０巻３４６頁のフィブリン板法
と実質的に同様にして測定した。折り畳み効率は、２０
００００ｕ／ｍｇの蛋白の変換を用いるフィブリン板検
定で決定されたフィブリン溶解活性を基準にする。蛋白
濃度は、走査クマシーブルー染色ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲルとレーザー濃度計から導かれる吸収法により測
定した。

【００２６】本発明のさらに別の側面は、折り畳み過程
の第二工程へのトゥイーンの添加である。トゥイーンの
好ましい濃度は、種々の濃度のトゥイーン２０（ポリオ
キシエチレンソルビタンモノラウレート）及びトゥイ
ーン８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエ
ート）を評価する二段階折り畳み法を用いて決定した。
ｔ−ＰＡ−６の試料を、第二工程に種々の濃度のトゥイ
ーンを含む二段階法を用いて折り畳んだ。イオン交換精
製しスルフィトリシスしたｔ−ＰＡ−６を、工程１の緩
衝液（７Ｍ尿素、５０ｍＭトリス、０．１５Ｍ一塩酸リ
ジン、７ｍＭ一塩酸システイン、０．２ＭＮａＣｌ、１
ｍＭＮａ₂ＥＤＴＡ、ｐＨ９．２）中に希釈し、約１６
時間インキュベートした。第二工程は、工程１の混合物
を工程２の緩衝液（５０ｍＭトリス、８０ｍＭ一塩酸リ
ジン、２ｍＭ一塩酸システイン、ｐＨ９．２）で１：３
に希釈することにより実施した。第二工程を開始する希
釈を実施する際、種々の量のトゥイーン２０またはトゥ
イーン８０のいずれかを第二工程の折り畳み溶液に加
え、ある範囲のトゥイーン濃度を作り出した。折り畳み
を４８時間進行させ、この時点で試料を除去し、テトラ
チオン酸カリウムで処理して折り畳みを停止させ、そし
てフィブリン溶解活性について検定した。

【００２７】トゥイーン２０及びトゥイーン８０のどち
らも、蛋白の適正な折り畳みを促進した。本発明の第二
工程においては、０．３％ないし１．０の範囲のトゥイ
ーン濃度が好ましい。クリングル−２を含むｔ−ＰＡま
たはｔ−ＰＡ誘導体のための二段階折り畳み工程の折り
畳み溶液にリジンを添加すると、基質特異的な、酵素的
に活性な物質の収量において著しい且つ予期されなかっ
た増加がもたらされた。アルギニンはフィブリン溶解活
性ｔ−ＰＡまたはｔ−ＰＡ誘導体の収量を有意に増加さ
せないので、ｔ−ＰＡ折り畳みに及ぼすリジンの効果は
カチオン性アミノ酸に付随する一般的現象ではない。こ
の効果を説明する実験結果を下の表２に示す。

【００２８】

【表２】ｔ−ＰＡ誘導体の折り畳みに及ぼすリジン及びアルギニンの効果アミノ酸添加最終活性（工程１）（最終的工程２におけるｕ／ｍｌ）なし１７７リジン（０．１５Ｍ）４９０アルギニン（０．１５Ｍ）１８３

【００２９】表２のデータは、工程１で０．１５Ｍのリ
ジンを加えた外は実施例３４に示した二段階折り畳み法
と実質的に同様にしてｔ−ＰＡ−６を折り畳むことによ
って得られた。工程２を開始するために工程１の１：３
希釈を行なった。リジンの存在は、この二段階折り畳み
法の好ましい態様である。折り畳み法の工程２における
リジンの好ましい濃度は約０．０１Ｍないし約１．５Ｍ
であり、より好ましくは約０．０２０ないし約１．０Ｍ
であり、約０．１３Ｍのリジン濃度が最も好ましい。

【００３０】上に述べたリジンの好ましい濃度は、どの
ｔ−ＰＡ誘導体が折り畳まれるかにかかわらず、好まし
い濃度である。変性剤の濃度を低くするために二段階
法、ダイアフィルトレーション、または透析のいずれが
使用されるかにかかわらず、リジンがｔ−ＰＡおよびｔ
−ＰＡ誘導体の折り畳みを促進するということに当業者
は気づくであろう。クリングル−２を含むｔ−ＰＡまた
はｔ−ＰＡ誘導体の折り畳みを促進するためのリジンの
使用にあたり唯一の重要点は、その分子が基質特異的
な、酵素的に活性な型に折り畳まれる間、リジンが有効
濃度で存在するということである。

【００３１】実施例１Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２９４／ｐＴ
ＰＡ１０２の培養及びプラスミドｐＴＰＡ１０２の単離Ａ．Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２９４／ｐＴＰＡ１０２の培養０．２％カザミノ酸及び１００μｇ／ｍｌアンピシリン
を含有するＭ９培地（マニアティス等、１９８２、モレ
キュラー・クローニング、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー）１ＬにＥ．ｃｏｌｉＭＭ２９４／
ｐＴＰＡ１０２（ＮＲＲＬＢ−１５８３４）を接種
し、３７℃で振盪しながら５９０ｎｍにおける光学密度
（Ｏ．Ｄ．）が〜０．５吸収単位となるまでインキュベ
ートした。この時点でクロラムフェニコール粉末を最終
濃度２５０ｍｇ／ｍｌとなるように加え、インキュベー
ションを一夜続けた。

【００３２】Ｂ．プラスミドｐＴＰＡ１０２の単離マニアティス等、１９８２から適合させた手法に従っ
て、実施例１Ａに記載の培養からＥ．ｃｏｌｉＭＭ２９
４／ｐＴＰＡ１０２を収穫した。細胞を４℃における４
０００ｇ、１０分間の遠沈により収穫し、上清は捨て
た。この細胞ペレットを氷冷ＳＴＥ緩衝液（０．１ＭＮ
ａＣｌ；１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８；および
１ｍＭＥＤＴＡ）１００ｍｌで洗浄した。トリスはトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの略である。ＥＤ
ＴＡはエチレンジアミン四酢酸の略である。洗浄後、細
胞ペレットを、リゾチーム５ｍｇ／ｍｌを含有する溶液
１（５０ｍＭグルコース；２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．０；及び１０ｍＭＥＤＴＡ）１０ｍｌに再懸濁
し、室温で１０分間放置した。次に溶液２（０．２ＮＮ
ａＯＨ及び１％ＳＤＳ）２０ｍｌをこのリゾチーム処理
した細胞に加え、溶液を逆さにすることにより穏やかに
撹拌した。この混合物を氷上で１０分間インキュベート
した。

【００３３】溶解した細胞混合物に氷冷５Ｍ酢酸カリウ
ム１５ｍｌ（ｐＨ４．８）を加え、この溶液を逆さにし
て撹拌した。溶液を氷上で１０分間インキュベートし
た。氷酢酸１１．５ｍｌを水２８．５ｍｌおよび５Ｍ酢
酸カリウム６０ｍｌに添加することにより、５Ｍ酢酸カ
リウム溶液を調製した。得られた溶液は、カリウムにつ
いて３Ｍ、そして酢酸について５Ｍであった。

【００３４】溶解した細胞混合物を４℃においてベック
マンＳＷ２７で２００００ｒｐｍで２０分間遠沈した。
細胞ＤＮＡ及び破片は管の底にペレットを形成した。上
清約３６ｍｌを回収し、イソプロパノール０．６容量を
加え、混合し、得られた溶液を室温で１５分間放置し
た。プラスミドＤＮＡを室温における１２０００ｇ、３
０分間の遠沈により集めた。上清を捨て、ＤＮＡペレッ
トを室温で７０％エタノールで洗浄した。エタノール洗
液を傾瀉し、ペレットを真空乾燥機で乾燥した。次いで
このペレットをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、
１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）８ｍｌに再懸濁した。

【００３５】ＣｓＣｌ８ｇをこのＤＮＡ溶液に加えた。
ＣｓＣｌ−ＤＮＡ溶液各１０ｍｌにつき約０．８ｍｌの
１０ｍｇ／ｍｌエチジウムブロミド水溶液を加えた。こ
の溶液の最終密度は約１．５５ｇ／ｍｌ、そしてエチジ
ウムブロミド濃度は約６００μｇ／ｍｌであった。この
溶液をベックマン・タイプ５０遠沈管に移し、次にパラ
フィン油を一杯に満たし、封入し、そして２０℃、４５
０００ｒｐｍで２４時間遠沈した。遠沈後、２個のＤＮ
Ａのバンドを通常の光の下で見ることができた。管から
蓋を取った後、２１番の皮下注射用針を付けた注射筒を
遠沈管の壁から挿入することにより、下側のＤＮＡバン
ドを取った。

【００３６】水で飽和させた１−ブタノールで数回抽出
することにより、エチジウムブロミドを除いた。ＣｓＣ
ｌは、ＴＥ緩衝液に対する透析により除去した。緩衝化
フェノール、次いでクロロホルムにより抽出した後、Ｄ
ＮＡを沈澱させ、７０％エタノールで洗浄し、乾燥し
た。約１ｍｇのプラスミドｐＴＰＡ１０２が得られ、４
℃でＴＥ緩衝液中に約１μｇ／ｕｌの濃度で保存した。
プラスミドｐＴＰＡ１０２の制限サイト及び機能地図を
添付図面の図２に示す。

【００３７】実施例２Ａ．中間体プラスミドｐＴＰＡ１０３の組み立てＥ．ｃｏｌｉＫ１２ＭＭ２９４細胞（ＮＲＲＬ
Ｂ−１５６２５）から単離されたプラスミドｐＴＰＡ１
０２約５０μｇを、ＴｔｈＩＩＩ．１制限酵素（注）５
０単位を用いて、制限緩衝液Ａ（１００ｍＭＮａＣｌ、
１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ｍＭＭｇＣ
ｌ₂、１ｍＭジチオトレイトール）中３７℃で完全に消
化した。この消化は、大きさが４．４ｋｂ、３．１ｋ
ｂ、及び０．５ｋｂの３個のフラグメントを生成した。
エチジウムブロミドで染色し、紫外光で蛍光バンドを可
視化することにより、分離したフラグメントのアガロー
スゲル中の位置を決定した。４．４ｋｂフラグメントを
含む薄片を剃刀の刃で切取り、ＤＥＡＥ膜（ＮＡ４５、
シュライヒャー・アンド・シュエル・Ｉｎｃ．）を隙間
に挿入した。次いでゲルの薄片を元の位置に戻した。Ｄ
ＮＡがＤＥＡＥ膜上に移動するまで電気泳動を続けた。
ＤＮＡを含む膜の場所を切り取り、０．５ｍｌのエッペ
ンドルフ管の中で、２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）中
１５０ｍＭのＮａＣｌ２００μｌで３回洗浄した。ＤＮ
Ａを、６５℃で、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）中
１ＭのＮａＣｌ２００μｌを用いて膜から溶出させた。
次いでこのＤＮＡを９５％エタノール２．５容量で沈澱
させ、０．３ＭＮａＯＡｃ中に再懸濁し、遠沈により再
度沈澱化し、集めた。

【００３８】このＤＮＡペレット約５μｇを、各ｄＮＴ
Ｐ（１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ）１μｌ及びＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩの大
きなフラグメントであるクレナウ酵素（ベーリンガー・
マンハイム）１０単位を添加したニック翻訳緩衝液（Ｎ
ＴＢ；５０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．２、１０ｍＭ
ＭｇＳＯ₄、０．１ｍＭＤＴＴ）に再懸濁した。ＤＴＴ
はジチオトレイトールの略である。ｄＮＴＰはデオキシ
ヌクレオチド三燐酸の略である。反応を室温（２０℃）
で３０分間行ない、６５℃、５分間の熱処理により停止
させた。ＢａｍＨＩリンカー（５'−ＣＧＧＡＴＣＣＧ
−３'、ニュー・イングランド・バイオラブズより）を
キナーゼ処理し、４．４ｋｂフラグメントにライゲーシ
ョンした。

【００３９】得られたライゲーション混合物（２０μ
ｌ）を１ＸＡ制限緩衝液１００μｌに希釈し、１０単
位のＢａｍＨＩおよび１単位のＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素
を加えた。３７℃で〜２．４ｋｂ及び〜２．０ｋｂフラ
グメントが生成するまでインキュベーションした。これ
らのフラグメントを１％アガロースゲル上で分離し、そ
して〜２．０ｋｂフラグメントを上記のごとくゲル精製
し、次いでプラスミドｐＲＣのＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａ
ｍＨＩサイトの間にライゲーションした。

【００４０】翻訳の前に、ライゲーション混合物（２０
μｌ）を制限緩衝液Ａ１００μｌ中に希釈し、ＮｃｏＩ
制限酵素２μｌを添加した後３７℃で２時間インキュベ
ートした。この処理は、望ましくない組み替えを防ぐ。（注）制限酵素及び使用説明は以下の供給源より得られ
る：１．ニュー・イングランド・バイオラブズ・Ｉｎｃ．、
３２トーザー・ロード、ビバリー、マサチューセッツ０
１９１５２．ベーリンガー−マンハイム・バイオケミカルズ、７
９４１キャッスルウェイ・ドライブ、インディアナポリ
ス、インディアナ４６２５０３．ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ・Ｉｎｃ．、
８７１７グローブモント・サークル、ガイザースバー
ク、メリーランド２０７６０これ以後、ニュー・イングランド・バイオラブズ、ベー
リンガー−マンハイム、及びベセスダ・リサーチ・ラブ
ズは、それぞれＮＥＢ、ＢＭＢ、及びＢＲＬと称する。

【００４１】Ｂ．形質転換得られたライゲーション混合物を用いて、ウェンシン
ク、１９７４、セル第３巻３１５頁の形質転換方法と実
質的に同様にして、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３０８
を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含有するＴＹ平板
（１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、０．５％塩化
ナトリウム、１．５％寒天、ｐＨ７．４）上で形質転換
した。細菌の菌株Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３０８
は、ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリー
（ペオリア、イリノイズ）に寄託され、永久ストック・
カルチャー・コレクションの一部となっており、ここか
ら受理番号ＮＲＲＬＢ−１５６２４の下で一般に入手
可能である。形質転換体はそのアンピシリン耐性及びカ
ナマイシン感受性表現型により、並びにプラスミドＤＮ
Ａの制限酵素分析により同定した。得られた細胞を用い
て実施例１の方法と実質的に同様にしてプラスミドｐＴ
ＰＡ１０３を単離した。

【００４２】Ｃ．プラスミドｐＴＰＡ１０３ｄｅｒ
ＮｄｅＩの組み立てＡ制限緩衝液２０μｌに入れたプラスミドｐＴＰＡ１０
３約１μｇを制限酵素ＢｇｌＩＩにより３７℃で消化し
て線状物を生成させた。線状化したプラスミドを、０．
３ＭのＮａＯＡｃの存在下でエタノール２．５容量を用
いて沈澱させ、ＤＮＡを遠沈により集めた。このＤＮＡ
ペレットを、各ｄＮＴＰの１０ｍＭ溶液（１０ｍＭｄ
ＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰ）１μｌ及
びクレナウ酵素（ＢＭＢ）１０単位を添加したニック翻
訳緩衝液１００μｌ中に再懸濁した。反応は室温（２０
℃）で３０分間実施し、６５℃で５分間の熱処理により
停止させた。ＮｄｅＩリンカー（５'−ＣＣＡＴＡＴＧ
Ｇ−３'、ＮＥＢ）約０．１μｇをＴＥ緩衝液（１０ｍ
ＭトリスＨＣｌｐＨ８；１ｍＭＥＤＴＡ）１０μｌ中
で９０℃に加熱し、温度を徐々に１５℃まで下げること
により再アニーリングした。このリンカーを、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ（４００００単位／ｍｌ）１μｌ及びＡＴＰ
（最終濃度０．５ｍＭ）の存在下で、「充填された」Ｂ
ｇｌＩＩフラグメントに加えた。ライゲーションは１５
℃で２０時間であった。次いでライゲーション混合物
を、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３０８
細胞に導入した。形質転換体をそのアンピシリン耐性表
現型により、そして制限酵素分析により同定した。ＤＮ
Ａ配列決定により、ｐＴＰＡ１０３ｄｅｒＮｄｅＩ
が以下の配列を含むことが確認された：５'．．．．．ＣＣＡＴＡＴＧＧＧＡＴＣＴＴＡＣ．．．３’

【００４３】実施例３プラスミドｐＵＣ１９ＴＰＡ
ＦＥの組み立てプラスミドｐＴＰＡ１０３ｄｅｒＮｄｅＩ約１０μ
ｇを、１００μｌの制限酵素緩衝液Ａ中で、ＡｖａＩＩ
２０単位により３７℃で５時間消化した。得られた制限
フラグメントを１％アガロースゲル上で分離し、〜１４
００ｂｐフラグメントを実施例２Ａの教示に従って精製
した。ＮＴＢ緩衝液２０μｌ中の精製した１４００ｂｐ
フラグメント約１μｇをクレナウ酵素で処理し、キナー
ゼ処理したＨｐａＩリンカー（５’−ＣＧＴＴＡＡＣＧ
−３'）５５ピコモルを、実施例２の教示に従ってライ
ゲーション緩衝液１００μｌ中でライゲーションした。

【００４４】リンカーの組み立てに使用されたＤＮＡフ
ラグメントは、システック１４５０ＡＤＮＡ合成機
（システック・Ｉｎｃ．、３８１６チャンドラー・ドラ
イブ、ミネアポリス、ＭＮ）またはＡＢＳ３８０ＡＤ
ＮＡ合成機（アプライド・バイオシステムズ・Ｉｎ
ｃ．、８５０リンカーン・センター・ドライブ、フォス
ター・シティー、ＣＡ９４４０４）のいずれかを使用す
ることにより合成できる。当分野において多くのＤＮＡ
合成機器が知られており、このフラグメントの作成に使
用することができる。さらに、このフラグメントは、イ
タクラ等、１９７７、サイエンス第１９８巻１０５６頁
及びクレア等、１９７８、プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オ
ブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ第７
５巻５７６５頁の方法と実質的に同様にして、常套的に
製造することもできる。ライゲーションの後、１Ｍトリ
スＨＣｌ（ｐＨ８）１０μｌ及びＥｃｏＲＩ制限酵素５
単位を加え、消化を３７℃で完結するまで実施した。こ
の試料を６５℃で５分間処理し、０．３ＭＮａＯＡｃの
存在下、９５％エタノール２．５容量でＤＮＡを沈澱さ
せた。ＤＮＡを遠沈により集め、ライゲーション緩衝液
１０μｌに再懸濁した。

【００４５】プラスミドｐＵＣ１９（ファルマシア・Ｉ
ｎｃ．、８００センテニアル・ドライブ、ピスキャタウ
ェイ、ＮＪ）約５μｇを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭβ−メルカプトエ
タノール及び２０ｍＭＫＣｌを含有する制限緩衝液１０
０μｌ中、３７℃でＳｍａＩ制限酵素により完全に消化
した。１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）約１０μｌ及びＥ
ｃｏＲＩ制限酵素１０単位を加え、消化が完了するまで
３７℃でインキュベーションを続けた。消化されたプラ
スミドＤＮＡを１％アガロースゲル上に流し、大きなＥ
ｃｏＲＩからＳｍａＩに至る制限フラグメントをゲル精
製した。ゲル精製したフラグメント約１μｇをライゲー
ション緩衝液１０μｌに溶解し、上記のごとく調製した
ｐＴＰＡ１０３ｄｅｒＮｄｅＩからの７７０ｂｐフ
ラグメントと混合した。０．５ｍＭＡＴＰ２μｌおよび
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（４００００単位／ｍｌ；ＮＥＢ）
１μｌを加え、ライゲーションを１５℃で２時間実施し
た。ライゲーション混合物を、５００ｍＭＡＴＰ及び４
０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有するリガーゼ緩衝液
１００μｌ中に希釈し、２３℃に２時間保持した。

【００４６】ライゲーション混合物約１０μｌをコンピ
テントなＥ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＲ１△Ｍ１５細胞
（ＮＲＲＬＢ−１５４４０）中に導入し、これを、１
００μｇ／ｍｌアンピシリン、４０μｇ／ｍｌＸ−ｇ
ａｌ（シグマ）及び１ｍＭＩＰＴＧ（シグマ）を含有
するＴＹ寒天平板に蒔いた。平板を３７℃で一夜インキ
ュベートし、形質転換体を、結果として「白色の」コロ
ニー表現型をもたらす、Ｘ−ｇａｌの利用不能性によっ
て同定した。これらのコロニーを、１００μｇ／ｍｌア
ンピシリンを含有するＴＹブロス中で増殖し、プラスミ
ドＤＮＡを制限分析のために抽出した。所望のプラスミ
ドは約７７０ｂｐの挿入物並びにＮｄｅＩ及びＨｐａＩ
のための新たな制限サイトを有していた。ｐＵＣ１９
ＴＰＡＦＥと命名されたこのプラスミドは、天然ｔ−
ＰＡの最初の９６アミノ酸残基を含むが、翻訳活性化配
列の添加のため、アミノ酸配列は、アミノ酸残基ＭＥＴ
及びＧＬＹを各々アミノ酸残基番号１及び２として含め
て番号付けをし直した。

【００４７】実施例４プラスミドｐＢＷ２５の組み立
てＡ．ｐＵＣ１９ＴＰＡＦＥＨｐａＩ−ＢａｍＨＩ
フラグメントの単離分析的ゲル電気泳動により確認される部分的消化のみを
達成するために、ｐＵＣ１９ＴＰＡＦＥおよそ７μ
ｇを、ＨｐａＩ緩衝液１００μｌ中ＨｐａＩ制限酵素〜
１８単位により３７℃で２０分間消化した。反応物の塩
濃度をＢａｍＨＩ緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍ
ＭトリスｐＨ８．０、１０ｍＭＭｇＣｌ₂）で１５０μ
ｌに調節し、ＢａｍＨＩ制限酵素〜１６単位を加えた。
この反応物を３７℃で９０分間インキュベートした。Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱により濃縮し、調製用１．５％ア
ガロースゲル上で電気泳動した。ゲルを１μｇ／ｍｌエ
チジウムブロミド中で染色し、ＤＮＡバンドを長波長Ｕ
Ｖ光の下で可視化した。適当な大きなＨｐａＩ−Ｂａｍ
ＨＩバンド（完全なＨｐａＩ−ＢａｍＨＩ消化物との比
較及び無傷のプラスミドによって決定する）を切り取
り、−２０℃で１時間凍結した。ＤＮＡを凍結圧搾法
（サーリング等、１９７５、アナリティカル・バイオケ
ミストリー第６６巻２１３頁）により回収し、０．３Ｍ
ＮａＯＡｃ及び２．５容量の９５％エタノールから２回
沈澱させた。最終的ペレットは７０％エタノールで２回
すすぎ、減圧乾燥し、蒸留水２０μｌに再懸濁した。

【００４８】Ｂ．プラスミドｐＴＰＡ１０３の〜１０１
５ｂｐＳｃａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントの単離ｐＴＰＡ１０３約１３μｇを、ＳｃａＩ緩衝液（１００
ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリスｐＨ７．５、１０ｍＭＭ
ｇＣｌ₂）１００μｌ中、ＳｃａＩ制限酵素１８単位に
より３７℃で９０分間消化した。反応物をＢａｍＨＩ緩
衝液で１５０μｌに調節し、ＢａｍＨＩ制限酵素〜１６
単位を加え、反応物を３７℃で９０分間インキュベート
した。１．５％アガロース調製用ゲルにロードするに先
立ち、ＤＮＡをエタノール沈澱により濃縮した。実施例
４Ａに記載のごとく、〜１０１５ｂｐＳｃａＩ−Ｂａ
ｍＨＩバンドを可視化し、切取り、回収した。

【００４９】Ｃ．ライゲーション実施例４Ａ及び４Ｂに記載の上記フラグメントの各々約
１００ｎｇを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．５、１
０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＤＴＴ、６μｇＢＳＡ及び
１ｍＭＡＴＰを含有する反応混合物２０μｌ中、１ワイ
ス単位のリガーゼ（プロメガ・バイオテク）により１６
℃で１８時間ライゲーションした。ＢＳＡは牛血清アル
ブミンの略である。

【００５０】Ｄ．Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２９４への導入上のライゲーション混合物を、５０ｍＭＮａＣｌ−１０
ｍＭＭｇＣｌ₂−１０ｍＭＣａＣｌ₂で５０μｌに希釈
し、実施例２Ｂの教示に従って新たに調製したコンピテ
ントなＥ．ｃｏｌｉＭＭ２９４細胞１００μｌの形質
転換に使用した。この形質転換混合物を、アンピシリン
１００μｇ／ｍｌを含有するＢＨＩ（ブレイン・ハート
・インフュージョン、ディフコ）平板に蒔いた。形質転
換体は、〜１０７９ｂｐＥｃｏＲＩフラグメントの存在
を含め、そのアンピシリン耐性表現型及びプラスミドＤ
ＮＡの制限酵素分析によって同定した。

【００５１】Ｅ．Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２９４／ｐＢＷ２
５の培養及びプラスミドｐＢＷ２５の単離ＴＹの代わりにＢＨＩブロスを使用する外は本質的に実
施例１Ａに記載のようにして、Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２９
４／ｐＢＷ２５を培養した。プラスミドの単離は、２つ
の連続的で均質な勾配の代わりに１つの不連続なＣｓＣ
ｌ勾配（密度＝１．８０ｇ／ｍｌ及び１．４７ｇ／ｍ
ｌ）を実施する外は、本質的に実施例１Ｂの教示のごと
く実施した（ガージャー等、１９８３、バイオケミカル
・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケー
ション第１１７（３）巻８３５頁）。

【００５２】実施例５プラスミドｐＭ８ＢＷ２６の組
み立てＡ．プラスミドｐＢＷ２５の〜８１０ｂｐＨｉｎｄＩ
ＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントの単離プラスミドｐＢＷ２５約５μｇを、１ｘＨｉｎｄＩＩ
Ｉ緩衝液（５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
ｐＨ８．０、１０ｍＭＮａＣｌ₂）１５０μｌ中、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ１０単位により３７℃で９０分間消化し
た。１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）１５μｌ及びＥ
ｃｏＲＩ２４単位を加え、３７℃でのインキュベーショ
ンを９０分間続けた。ＤＮＡをエタノール沈澱により濃
縮し、１．５％アガロース調製用ゲル上で電気泳動し
た。〜８１０ｂｐフラグメントを実施例４Ａに記載のよ
うに可視化し、回収した。

【００５３】Ｂ．〜７．２ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩＭ１３ｍｐ８ベクターの単離Ｍ１３ｍｐ８ＤＮＡ（ＮＥＢより入手可能）約４．５
μｇを実施例５Ａに記載のごとく消化した。〜７．２ｋ
ｂＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩベクターフラグメント
を、実施例４Ａに記載のように電気泳動し、同定し、そ
して回収した。

【００５４】Ｃ．Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０３のライゲー
ション及びトランスフェクションｐＢＷ２５からのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメ
ント及びＭ１３ｍｐ８からのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉベクター各々約０．１μｇを、反応温度を１４℃とす
る外は実施例４Ｃに記載のようにライゲーションした。
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０３細胞（ＢＲＬ）をコンピテント
とし、トランスフェクション当りの使用ＤＮＡ量が異な
る外は本質的にＢＲＬＭ１３クローニング／「ジデオ
キシ」シークエンシング・インストラクション・マニュ
アルに記載のようにして、ライゲーション混合物により
トランスフェクトした。組み替えプラークを、挿入によ
るβ−ガラクトシダーゼ活性の不活性化（白色プラーク
の形成）により同定し、ＲＦＤＮＡの制限消化によっ
て確認した。スクリーニング目的のため、６個の白色プ
ラークを２．５ｍｌＴＹブロス中に拾い、ここに対数期
のＪＭ１０３０．４ｍｌを加えた（ＴＹブロス培養
は、ｐｒｏＡＢをも有するＦエピソームの保持を確実と
するため、最小培地保存種から接種した）。培養を振盪
しながら３７℃で８時間インキュベーションした。１．
５ｍｌの等分試料からの細胞をペレット化し、バーンボ
イム及びドーリー、１９７９、ヌクレイック・アシド・
リサーチ第７巻１５１３頁のアルカリミニスクリーン法
の教示に実質的に従ってＲＦＤＮＡを単離した。各培養
の残りは保存種用に４℃で保管した。

【００５５】Ｄ．ＪＭ１０３／ｐＭ８ＢＷ２６の培養及
び一本鎖ｐＭ８ＢＷ２６の単離対数期のＪＭ１０３５０ｍｌを適当な保存種（実施例
５Ｃに記載）に感染させ、振盪しながら３７℃で１８時
間インキュベーションした。細胞を低速度の遠沈により
ペレット化し、上記マニュアルに記載の方法の規模を拡
大することにより、培養上清から一本鎖ＤＮＡを調製し
た。

【００５６】実施例６プラスミドｐＭ８ＢＷ２７の組
み立てのための部位特異的突然変異誘発Ａ．突然変異誘発クレナウ反応を室温で３０分間、次いで３７℃で６０分
間、次に１０℃で１８時間行なう外はアーデルマン等、
１９８３、ＤＮＡ第２（３）巻１８３−１９３頁の教示
に実質的に従って、一本鎖ｐＭ８ＢＷ２６に突然変異を
誘発した。さらに、Ｓ１処理を２０℃で５分間行ない、
塩濃度を半分に減らし、そしてＭ１３シークエンシング
・プライマー（ＢＲＬ）を使用した。使用した合成オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドプライマーは、天然ｔ−Ｐ
Ａのアミノ酸残基８７から２６１までを削除する５'−
ＧＧＧＡＡＧＴＧＣＴＧＴＧＡＡＡＴＡＴＣＣＡＣＣＴ
ＧＣＧＧＣＣＴＧＡＧＡ−３'であった。

【００５７】Ｂ．ＪＭ１０３のトランスフェクション及
び組み替え体の同定得られた突然変異誘発混合物を使用して、実施例５Ｃの
教示のようにＪＭ１０３をトランスフェクトした。所望
の突然変異体を、ＲＦＤＮＡの制限消化分析により、
そしてマクサム及びギルバートのＤＮＡ配列決定により
同定した。

【００５８】実施例７プラスミドｐＢＷ２８の組み立
てＡ．プラスミドｐＴＰＡ１０３からの〜６８９ｂｐＥｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントの単離プラスミドｐＴＰＡ１０３を、１ＸＢａｍＨＩ緩衝液
中、ＢａｍＨＩ制限酵素により完全に消化した。緩衝液
の濃度は、実施例５Ａに教示されるようにＥｃｏＲＩ消
化に合わせて調節した。このフラグメントを実施例４Ａ
の教示に実質的に従って単離及び回収した。

【００５９】Ｂ．プラスミドｐＬ１１０のＸｂａＩ−Ｂ
ａｍＨＩベクターの単離プラスミドｐＬ１１０（ｐＬ１１０の組み立ては後の実
施例に開示してある）をＢａｍＨＩ制限酵素によって部
分的に消化した。反応物を同容量のクロロホルムで１回
抽出し、次いで水相をエタノールで沈澱させた。次に回
収したＤＮＡを１ＸＸｂａＩ緩衝液（１５０ｍＭＮａ
Ｃｌ、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂）中、ＸｂａＩ制限酵素により３７℃で完全
に消化した。〜５９００ｂｐＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ線
状フラグメントを実施例４Ａの教示に実質的に従って単
離及び回収した。

【００６０】Ｃ．二重シストロンの組み立て実施例３Ａの教示のようにしてリンカーを合成できる。
このフラグメントの配列は以下の通りである：

【化１】

【００６１】Ｄ．プラスミドｐＭ８ＢＷ２７からの〜５
６３ｂｐＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントの単離酵素ＢａｍＨＩの代わりにＮｄｅＩで置換する外は実施
例７Ａの教示に実質的に従って、ＲＦｐＭ８ＢＷ２７
をＮｄｅＩ制限酵素で、次いでＥｃｏＲＩ制限酵素で消
化した。このフラグメントは実施例４Ａの教示に実質的
に従って単離及び回収した。

【００６２】Ｅ．Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２９４／ｐＢＷ２
８のライゲーション及び組み立て実施例４Ｃおよび４Ｄの教示に実質的に従って、実施例
ＡからＤまでに記載の上記フラグメント各々約５０ｎｇ
をライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２９４を形質
転換した。形質転換体を、そのテトラサイクリン耐性表
現型及びプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定
した。

【００６３】実施例８プラスミドｐＴＰＡ３０３の組
み立てＡ．プラスミドｐＳＶ２−β−グロブリンの〜４．２ｋ
ｂＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントの単
離プラスミドｐＳＶ２−β−グロブリンＤＮＡ（ＮＲＲＬ
Ｂ−１５９２８）およそ１０μｇを、１０ＸＨｉｎ
ｄＩＩＩ反応緩衝液１０μｌ、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
５μｌ（〜５０単位）、及びＨ₂Ｏ８５μｌに溶解し、
反応物を３７℃に２時間保持した。次いで反応混合物を
ＬｉＣｌ中０．１５Ｍとし、エタノール２．５容量を添
加しドライアイス−エタノール浴で冷却した後、ＤＮＡ
を遠沈によりペレット化した。

【００６４】このＤＮＡペレットを１０ＸＢｇｌＩＩ
緩衝液１０μｌ、制限酵素ＢｇｌＩＩ５μｌ（〜５０単
位）及びＨ₂Ｏ８５μｌに溶解し、反応物を３７℃に２
時間保持した。このＢｇｌＩＩ消化の後、反応混合物を
０．８５％アガロースゲル上にロードし、フラグメント
を電気泳動によって分離した。エチジウムブロミドで染
色したゲルを紫外光の下で調べた後、所望の〜４．２ｋ
ｂＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを含有して
いるバンドをゲルから切取り、実施例４Ａに記載のよう
に抽出した。このペレットをｄＨ₂Ｏ１０μｌに再懸濁
し、所望とするプラスミドｐＳＶ２−β−グロブリンの
〜４．２ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ制限フラグメ
ント〜５μｇを構成した。

【００６５】Ｂ．プラスミドｐＴＰＡ１０３の〜２．０
ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ制限フラグメントの
単離所望とする実施例２からのプラスミドｐＴＰＡ１０３の
〜２．０ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ制限フラグ
メントの単離を、上の教示に実質的に従って達成した。
得られたＤＮＡ〜５μｇを蒸留水１０μｌに懸濁し、−
２０℃で保存した。

【００６６】Ｃ．中間体プラスミドｐＴＰＡ３０１を組
み立てるための、フラグメントのライゲーションプラスミドｐＳＶ２−β−グロブリンの〜４．２ｋｂ
ＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメント２μｌ、
プラスミドｐＴＰＡ１０３の〜２．０ｋｂＨｉｎｄＩ
ＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメント４μｌを混合し、次いで
１０Ｘのリガーゼ緩衝液２μｌ、１０ｍＭＡＴＰ２μ
ｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μｌ（〜１０単位）、及びＨ
₂Ｏ９μｌと共に４℃で一夜インキュベートした。ライ
ゲーションされたＤＮＡは所望のプラスミドｐＴＰＡ３
０１を構成し、このプラスミドの制限サイト及び機能地
図を添付図面の図１３に示す。

【００６７】Ｄ．Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＲ１／ｐＴ
ＰＡ３０１の組み立て所望のＥ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＲ１／ｐＴＰＡ３０１
形質転換体を実施例２Ｂの教示に実質的に従って組み立
てた。プラスミドｐＴＰＡ１０２ＤＮＡの単離方法に
実質的に従って、このＥ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＲ１／
ｐＴＰＡ３０１形質転換体からプラスミドＤＮＡを取得
した。

【００６８】Ｅ．プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ上のＢ
ａｍＨＩ認識配列の組み立てプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２
ＨＢ１０１／ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ＡＴＣＣ３７１４
６より単離）１０μｇを、１０ＸＰｖｕＩＩ塩１０μ
ｌ、ＰｖｕＩＩ制限酵素２μｌ（〜２０単位）、及びＨ
₂Ｏ８８μｌと混合し、得られた反応物を３７℃で２時
間インキュベートした。反応をフェノール及びクロロホ
ルム抽出により停止させ、この後ＰｖｕＩＩ消化プラス
ミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒＤＮＡを遠沈により沈澱、回
収した。

【００６９】ＢａｍＨＩリンカー（５'−ＣＧＧＡＴＣ
ＣＣＧ−３'）を以下の方法によりキナーゼ処理し、ラ
イゲーション用に準備した。Ｈ₂Ｏ５μｌに入れたリン
カー１μｇに、５Ｘキナーゼ塩（３００ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．８；５０ｍＭＭｇＣｌ₂、２５ｍＭＤ
ＴＴ）１０μｌ、５ｍＭＡＴＰ５μｌ、ＢＳＡ（１ｍ
ｇ／ｍｌ）５μｌ、１０ｍＭスペルミジン５μｌ、Ｈ₂
Ｏ１９μｌ及びポリヌクレオチドキナーゼ１μｌ（１０
単位／μｌ）を加えた。次いでこの反応物を３７℃で６
０分間インキュベーションし、−２０℃で保存した。Ｐ
ｖｕＩＩ消化プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ５μｌ（〜
５μｇ）及びキナーゼ処理したＢａｍＨＩリンカー１２
μｌ（〜．２５μｇ）を混合し、Ｈ₂Ｏ１５μｌ、１０
Ｘリガーゼ緩衝液２μｌ、５ｍＭＡＴＰ１０μｌ、Ｂ
ＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）２μｌ、１０ｍＭスペルミジン２
μｌ、及びＴ４ＤＮＡリガーゼ２μｌ（〜２単位）と共
に１６℃で一夜インキュベートした。

【００７０】１０ＸＢａｍＨＩ反応緩衝液１０μｌ、
ＢａｍＨＩ制限酵素１０μｌ（〜１５０単位）、ＢＳＡ
（１ｍｇ／ｍｌ）２μｌ及びＨ₂Ｏ２７μｌを反応物に
加え、次にこれを３７℃で３時間インキュベートした。
反応物を１％アガロースゲル上にロードし、実施例２Ａ
の教示と実質的に同様にして所望の〜１．９ｋｂフラグ
メントを単離した。これらの実施例において行なわれる
リンカーの添加は全て、得られるベクター中の複数のリ
ンカー配列の可能性を減少させるため、アガロースゲル
上で常套的に精製した。得られたフラグメント〜３μｇ
をＴＥ緩衝液１０μｌに懸濁した。

【００７１】Ｆ．ライゲーション次に、プラスミドｐＴＰＡ３０１およそ１５μｌ（〜１
μｇ）を、上に教示されるようにＢａｍＨＩ制限酵素で
消化した。プラスミドｐＴＰＡ３０１には特有のＢａｍ
ＨＩサイトがあるため、このＢａｍＨＩ消化は線状のＤ
ＮＡ片を産む。このＢａｍＨＩ消化ｐＴＰＡ３０１をエ
タノール沈澱し、ｄＨ₂Ｏ９４μｌに再懸濁し、そして
子牛の腸管のアルカリフォスファターゼ（コラボラティ
ブ・リサーチ・Ｉｎｃ．、１２８スプリング・ストリー
ト、レキシングトン、ＭＡ０２１７３）１単位、及び１
ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ９．０）５μｌを用いて６５℃で
４５分間フォスファターゼ処理した。次いでこのＤＮＡ
をフェノール：クロロホルム、クロロホルム：イソアミ
ルアルコール抽出し、エタノール沈澱し、Ｈ₂Ｏ２０μ
ｌに再懸濁した。フォスファターゼ処理したｐＴＰＡ３
０１１０μｌ（〜．２５μｇ）をＢａｍＨＩ−ｄｈｆ
ｒフラグメント５μｌ（〜１．５μｇ）、１０Ｘリガー
ゼ塩５μｌ、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）５μｌ、５ｍＭ
ＡＴＰ１０μｌ、Ｔ４リガーゼ３μｌ、及びＨ₂Ｏ１
２μｌに加えた。この反応物を１５℃で一夜インキュベ
ートした。

【００７２】プラスミドｐＴＰＡ３０３を実施例２Ｂの
教示と実質的に同様にしてＥ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＲ
１（ＮＲＲＬＢ−１５２１０）に導入し、得られる
Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＲ１／ｐＴＰＡ３０３形質転
換体を、そのアンピシリン耐性表現型により、そしてそ
のプラスミドＤＮＡのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限
酵素分析により、同定した。プラスミドｐＴＰＡ３０３
は実施例１の方法と実質的に同様にしてこの形質転換体
から単離した。

【００７３】実施例９プラスミドｐＢＷ３２の組み立
てＡ．プラスミドｐＴＰＡ３０３の〜２７００ｂｐＥｃ
ｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントの単離プラスミドｐＴＰＡ３０３約１０μｇを、１ＸＢｇｌ
ＩＩ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、
５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂）中、ＢｇｌＩ
Ｉ制限酵素２０単位により３７℃で完全に消化した。ト
リス−ＨＣｌの濃度は、ＥｃｏＲＩ制限酵素２０単位に
よる消化のためには１１０ｍＭに調節した。所望のフラ
グメントを実施例４Ａの教示と実質的に同様にして単
離、回収した。

【００７４】Ｂ．プラスミドｐＴＰＡ３０３の〜２３４
０ｂｐＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの単
離プラスミドｐＴＰＡ３０３を、実施例５Ａの教示と実質
的に同様にして、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵
素で二重消化した。〜２３４０ｂｐフラグメントを実施
例４Ａに教示のように単離、回収した。

【００７５】Ｃ．プラスミドｐＴＰＡ３０３からの〜１
９９０ｂｐフラグメントの単離プラスミドｐＴＰＡ３０３をＨｉｎｄＩＩＩ緩衝液中、
ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｓｔＩ制限酵素で二重消化した。
〜１９９０ｂｐフラグメントを実施例４Ａに教示のよう
に単離、回収した。

【００７６】Ｄ．プラスミドｐＢＷ２８の〜６８０ｂｐ
ＸｈｏＩＩ−ＳｓｔＩフラグメントの単離プラスミドｐＢＷ２８約１０μｇをＸｈｏＩＩ緩衝液
中、ＸｈｏＩＩ酵素により完全に消化した。酵素を熱不
活性化するために反応物を６５℃で１０分間加熱し、次
いでＤＮＡをエタノール沈澱により回収した。続いてこ
のＤＮＡをＳｓｔＩ酵素で完全に消化した。所望のフラ
グメントを実施例４Ａに教示のごとく単離、回収した。

【００７７】Ｅ．Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２９４のライゲー
ション及び形質転換ＡないしＤに記載の上記フラグメント各々約０．１μｇ
を実施例４Ｃの教示と実質的に同様にしてライゲーショ
ンした。このライゲーション混合物を、実施例４Ｄに教
示のごとくＥ．ｃｏｌｉＭＭ２９４の形質転換に使用
した。形質転換体をそのアンピシリン耐性表現型及びプ
ラスミドＤＮＡの制限分析により同定した。

【００７８】実施例１０プラスミドｐＢＷ３３の組み
立てＡ．プラスミドｐＢＷ２８のＣｌａＩ部分消化プラスミドｐＢＷ２８約１０μｇを３本の管各々で、Ｃ
ｌａＩ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
９）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＮａＣｌ）１００
μｌ中に希釈した。ＣｌａＩ制限酵素５単位をそれぞれ
の管に加え、３７℃におけるインキュベーションを、そ
れぞれ３０秒間、１分間、及び２分間行なった。ＥＤＴ
Ａを２５ｍＭになるように添加することにより、反応を
停止した。クロロホルム抽出の後ＤＮＡをエタノール沈
澱した。

【００７９】Ｂ．ＣｌａＩ末端のクレナウ平滑化５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭＭｇ
Ｃｌ₂、２５０ｍＭｄＡＴＰ、２５０ｍＭｄＧＴＰ、
２５０ｍＭｄＣＴＰ、２５０ｍＭＴＴＰに入れた試料
当り４．５単位のクレナウによって、１４Ａに記載のｐ
ＢＷ２８のＣｌａＩ消化物を平滑化した。反応物を２０
℃で３０分間インキュベートし、次いで酵素の熱不活性
化により停止した。ＤＮＡをエタノール沈澱により回収
した。

【００８０】このＤＮＡを、〜１３０Ｖ及び〜７５ｍＡ
で２−３時間、０．６％の低温ゲル化アガロース（シー
・プラーク、ＦＭＣコープ、マリン・コロイズ、ロック
ランド、ＭＥ０４８４１）ゲルにかけた。ゲルをエチジ
ウムブロミドの希釈溶液中で染色し、バンドを長波長Ｕ
Ｖ光の下で可視化した。プラスミドＤＮＡ上に存在する
２つのＣｌａＩサイトの片方でのみ切られた最も大きな
線状のバンドを切り取った。３個の全ての試料からのバ
ンドをプールし、１００μｌに規模を落とす外はメソッ
ズ・イン・エンザイモロジー第１０１巻８５頁（アカデ
ミック・プレス、ウー及びグロスマン編）と実質的に同
様にしてＤＮＡを再ライゲーションした。

【００８１】Ｃ．Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２９４の形質転換コンピテントなＥ．ｃｏｌｉＭＭ２９４を調製し、ライ
ゲーション混合物１００μｌにつき０．３ｍｌのコンピ
テント細胞を使用し、この方法の規模を然るべく拡大す
る外は実施例４Ｄに教示されるようにして、ライゲーシ
ョン混合物により形質転換した。形質転換体は、そのテ
トラサイクリン耐性表現型及びプラスミドＤＮＡの制限
消化分析により同定した。ｐＢＷ３３の配列は下に示す
ようにｐＢＷ２８の配列とは異なる。

【化２】シストロン中２個の塩基の挿入が位相を変え、その結
果、ｐＢＷ２８で用いられる停止コード１ではなく、ｐ
ＢＷ３３においては停止コード２が用いられる。

【００８２】実施例１１プラスミドｐＢＷ３５の組み
立てＡ．ｐＢＷ２８からの６．４ｋｂＸｂａＩ−ＳｓｔＩ
フラグメントの単離プラスミドｐＢＷ２８をＳｓｔＩ制限酵素で完全に消化
した。緩衝液の条件を調節し、このＤＮＡをさらにＸｂ
ａＩで完全に消化した。ＤＮＡをエタノール沈澱により
濃縮し、〜６．４ｋｂフラグメントを実施例４Ａに教示
のごとく単離、回収した。

【００８３】Ｂ．プラスミドｐＢＷ２８からの〜７００
ｂｐＳｓｔＩ−ＮｄｅＩフラグメントの単離ＸｂａＩの代わりにＮｄｅＩ制限酵素で置き換える外は
実施例１１Ａに記載のように、このフラグメントの消化
及び単離を実施した。

【００８４】Ｃ．ＸｂａＩ−ＮｄｅＩリンカーの組み立
て以下のリンカーを合成した：

【化３】合成後、各リンカー〜２００ｐｍｏｌを、５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０
ｍＭジチオトレイトール、ＡＴＰ２ｎｍｏｌ、γ³²Ｐ−
ＡＴＰ５０μＣｉ（ニュー・イングランド・ヌクレア
ー（ＮＥＮ））及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ１１
リチャードソン単位を含有する反応液２０μｌ中で３７
℃で３０分間キナーゼ処理した。酵素の添加及びインキ
ュベーション工程を反復した。反応は、７０℃で１０分
間の酵素の熱不活性化によって停止した。０．３５Ｍ蟻
酸アンモニウム中のＤＥ８１紙上の下降ペーパークロマ
トグラフィーにより、ホスホリル化効率を確認した。ホ
スホリル化の後、各反応物の等分試料を混合し、９０℃
で２分間加熱し、水浴中で５時間徐々に室温まで冷却し
て鎖のアニーリングをさせた。

【００８５】Ｄ．ライゲーション及びＥ．ｃｏｌｉＭ
Ｍ２９４への導入反応物１００μｌ中アニーリングされたリンカー〜５０
ｐｍｏｌを用いて実施例１０Ｂの教示と実質的に同様に
して、上に記載のフラグメント及びリンカーをライゲー
ションした。Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２９４を、実施例１０
Ｃの教示のように、このライゲーションされた物質で形
質転換した。形質転換体は、そのテトラサイクリン耐性
表現型及びプラスミドＤＮＡの制限消化分析によって同
定した。このリンカーは別のＮｄｅＩ消化フラグメント
ともライゲーションするが、ＮｄｅＩ制限サイトはライ
ゲーション時に再生されないであろう。したがって、プ
ラスミドｐＢＷ３５は、プラスミドｐＢＷ３３及びｐＢ
Ｗ３６の両者に共通のＮｄｅＩサイトを含まない。

【００８６】実施例１２プラスミドｐＢＷ３６の組み
立て実施例１１Ｃにおいて同定されたリンカーの代わりに以
下のリンカーで置き換える外は、プラスミドｐＢＷ３５
の場合の教示と全く同様にして、プラスミドｐＢＷ３６
を組み立てた：

【化４】

【００８７】実施例１３Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ
３０８の形質転換コンピテント細胞を形質転換に先立ち２０％グリセロー
ル中−９０℃で保存する外は実施例２Ｂの教示と実質的
に同様にして、プラスミドｐＢＷ３３、ｐＢＷ３５、及
びｐＢＷ３６ＤＮＡの各々約０．１μｇをＥ．ｃｏｌｉ
ＲＶ３０８に導入した。形質転換体をそのテトラサイ
クリン耐性表現型により、そしてプラスミドＤＮＡの制
限酵素分析により、同定した。得られた細胞は、実施例
１の方法と実質的に同様にして、それぞれのプラスミド
ＤＮＡを単離するのに使用した。

【００８８】実施例１４ランナウェイ・レプリコン含
有プラスミドの組み立てＡ．ランナウェイ・レプリコン含有フラグメントの単離実施例７Ａの教示と実質的に同様にして、プラスミドｐ
ＣＺ１０６（ＮＲＲＬＢ−１５９５９）を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩおよびＢａｍＨＩで二重消化する。所望の〜１０
ｋｂＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩベクターフラグメント
は、実施例４Ａの教示と同様にして単離できる。

【００８９】Ｂ．プロモーター含有フラグメントの単離プラスミドｐＬ１１０をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ制限酵
素で二重消化する。所望の〜１．９ｋｂフラグメントは
実施例７Ｂに教示されるように単離、回収できる。

【００９０】Ｃ．〜１．３ｋｂＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ
フラグメントの単離プラスミドｐＢＷ３５及びｐＢＷ３６を、ＸｂａＩ及び
ＢａｍＨＩ制限酵素による別個の反応で、個別に二重消
化した。実施例７Ｂに教示のように、所望のフラグメン
トを単離、回収した。さらに、当業者は、プラスミドｐ
ＢＷ３３から〜１．３ｋｂＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグ
メントを単離し、プラスミドｐＢＷ３５及びｐＢＷ３６
からの所望の〜１．３ｋｂＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラ
グメントの代わりにこのフラグメントで置き換えること
ができるであろう。プラスミドｐＢＷ３５及びｐＢＷ３
６からの個々の〜１．３ｋｂＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフ
ラグメントを、引続きそれぞれプラスミドｐＢＷ４１及
びｐＢＷ４２を組み立てるためのライゲーションに使用
した。

【００９１】Ｄ．ライゲーション及び形質転換〜１０ｋｂＸｂａＩ−ＢａｍＨＩベクター、ｐＬ１１
０からの〜１．９ｋｂＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメン
ト及びプラスミドｐＢＷ３５及びｐＢＷ３６からのそれ
ぞれのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、実施例４
Ｃの教示に実質的に従って個別にライゲーションした。
このライゲーション混合物を分割して、両宿主菌株を３
７℃ではなく３２℃で増殖させる外は実施例４Ｄの教示
と実質的に同様にして、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３
０８／ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ及びＥ．ｃｏｌｉＮ５２
７１宿主細胞の形質転換に使用した。

【００９２】プラスミドｐＲＫ２４８ｃＩｔｓは、ノー
ザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリーズに寄託
され永久ストック・カルチャー・コレクションの一部と
なっている菌株であり、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＭＣＢ
３６０４としても知られるＥ．ｃｏｌｉＫ１２ＪＭ
Ｂ９／ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓから単離することができ
る。プラスミドｐＲＫ２４８ｃＩｔｓは、受理番号ＮＲ
ＲＬＢ−１５６３１の下でＮＲＲＬから入手できる。
プラスミドｐＲＫ２４８ｃＩｔｓは、ＣＩ８５７と称す
るラムダｐＬリプレッサー遺伝子ｃＩの温度感受性変異
体を含み、プラスミドｐＲＫ２４８ｃＩｔｓの組み立て
は、バーナード及びヘリンスキー、１９７９、メソッズ
・オブ・エンザイモロジー第６８巻４８２頁、及び、バ
ーナード等、１９７９、ジーン第５巻５９頁に記載され
ている。プラスミドｐＲＫ２４８ｃＩｔｓは、実施例１
の方法と実質的に同様にして単離、精製し、次いで実施
例２Ｂの方法と実質的に同様にしてＥ．ｃｏｌｉＫ１
２ＲＶ３０８に導入した。プラスミドｐＲＫ２４８ｃ
Ｉｔｓはテトラサイクリン耐性付与遺伝子を含み、アン
ピシリン耐性付与遺伝子を含まないため、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｋ１２ＲＶ３０８／ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ形質転換
体の選択の基礎にはテトラサイクリン耐性を使用した。

【００９３】しかしながら、この実施例の目的のために
は、プラスミドｐＲＫ２４８ｃＩｔｓの代わりに種々の
プラスミドを使用することができるであろう。このよう
なプラスミドは、必ず、温度感受性ラムダｐＬリプレッ
サー遺伝子、アンピシリン耐性付与遺伝子に独立した選
択マーカー、そして、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４から
のレプリコンのようなレプリコン、またはプラスミドｐ
ＢＲ３２２のレプリコンと両立できるＲ因子を含んでい
る。さらに、本発明に係る新規な活性化配列の温度感受
性制御は、染色体によって組み込まれた温度感受性ｃＩ
リプレッサー遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉＮ５２７１
（ローテンバーガー等、１９８３、ジーン第２３巻７５
頁）のような宿主細胞を使用することによっても得るこ
とができる。

【００９４】Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３０８／ｐＲ
Ｋ２４８ｃＩｔｓ形質転換体及びＥ．ｃｏｌｉＮ５２
７１宿主細胞は、宿主培養を３７℃ではなく３２℃で増
殖させる外は実施例２Ｂの方法と実質的に同様にして、
形質転換に対しコンピテントとした。別個の形質転換に
おいて、プラスミドｐＢＷ４１及びｐＢＷ４２を、Ｅ．
ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３０８／ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ
及びＥ．ｃｏｌｉＮ５２７１コンピテント細胞に導入
した。一般に、発現プラスミドは、ｐＬプロモーターを
抑制するためのｃＩ８５７遺伝子を持っている必要がな
く、また誘導をさせるために熱不活性化に訴える必要も
ないと信じられている。プラスミドのコピー数が増加す
るにつれてリプレッサー活性は希釈されていく。次い
で、得られたＥ．ｃｏｌｉＮ５２７１形質転換体を用
いてそれら各々のランナウェイ・レプリコン含有プラス
ミドｐＢＷ４１及びｐＢＷ４２を単離した。

【００９５】実施例１５ランナウェイ・レプリコン・
プラスミドｐＢＷ４０の組み立てプラスミドｐＢＷ４０は、ｐＢＷ３５またはｐＢＷ３６
からの類似のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントの代わ
りにｐＢＷ３３からの〜１．３ｋｂＸｂａＩ−Ｂａｍ
ＨＩフラグメントで置き換える外は、実質的にプラスミ
ドｐＢＷ４１及びｐＢＷ４２の組み立てのために教示さ
れるようにして組み立てることができる。Ｅ．ｃｏｌｉ
への導入後、次に、得られた形質転換体をプラスミドｐ
ＢＷ４０ＤＮＡの単離に使用できる。

【００９６】実施例１６プラスミドｐＫＣ２８３の単
離Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＢＥ１２０１／ｐＫＣ２８３の
凍結乾燥物を、ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラ
ボラトリー（ペオリア、イリノイズ６１６０４）から受
理番号ＮＲＲＬＢ−１５８３０の下で入手する。この
凍結乾燥物を、ＬＢ培地１０ｍｌ（１Ｌにつきバクト・
トリプトン１０ｇ、バクト酵母抽出物５ｇ、およびＮａ
Ｃｌ１０ｇ、ｐＨを７．５に調節）を入れた管に傾瀉
し、３２℃で２時間インキュベートし、この時点で培養
をアンピシリンについて５０μｇ／ｍｌとし、次いで３
２℃で一夜インキュベートした。Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２
ＢＥ１２０１／ｐＫＣ２８３細胞は、細胞ＤＮＡに組
み込まれた温度感受性ｃＩリプレッサー遺伝子を含むた
め、この細胞は３２℃で培養した。野生型ラムダｐＬリ
プレッサー遺伝子を含む、またはラムダｐＬプロモータ
ーを含まない細胞をこのプラスミド単離法に利用する場
合は、本明細書中の続く実施例に記載されるように、イ
ンキュベーションの温度は３７℃である。

【００９７】一夜経過した培養の小部分を、Ｅ．ｃｏｌ
ｉＫ１２ＢＥ１２０１／ｐＫＣ２８３の単一コロニ
ー単離物が取得できるようなやり方で、アンピシリン５
０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天（１５ｇ／ｌのバクト
寒天を含むＬＢ培地）平板に置く。得られた単一コロニ
ーを、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地
１０ｍｌに接種し、激しく振盪しながら３２℃で一夜イ
ンキュベートした。一夜経過した培養１０ｍｌをＬＢ培
地５００ｍｌに接種し、激しく振盪しながら培養が定常
期に至るまで３２℃でインキュベートした。プラスミド
ＤＮＡを実施例１Ｂの教示に従って単離した。プラスミ
ドｐＫＣ２８３の制限サイト及び機能地図を、添付図面
の図１１に示す。

【００９８】実施例１７プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸ
の組み立て実施例２０で調製したプラスミドｐＫＣ２８３ＤＮＡ
約１０μｌを、１０Ｘ中等度塩制限緩衝液（５００ｍＭ
ＮａＣｌ；１００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５；１０
０ｍＭＭｇＣｌ₂；及び１０ｍＭＤＴＴ）２０μｌ、
１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ２０μｌ、制限酵素ＰｖｕＩＩ５μ
ｌ（〜５０単位）、及び水１４５μｌと混合し、得られ
た反応物を３７℃で２時間インキュベーションした。こ
こに記載される制限酵素反応は、フェノール次いでクロ
ロホルム抽出により常套的に停止させ、この後ＤＮＡの
沈澱化、エタノール洗浄、そしてこのＤＮＡのＴＥ緩衝
液への再懸濁を行なった。ＰｖｕＩＩ消化を上記のよう
に停止させた後、ＰｖｕＩＩ消化プラスミドｐＫＣ２８
３ＤＮＡを沈澱させ、次いでＴＥ緩衝液５μｌに再懸濁
した。

【００９９】ＸｈｏＩリンカー（５'−ＣＣＴＣＧＡＧ
Ｇ−３'）約６００ピコモル（ｐＭ）を実施例８Ｅの教
示に従ってキナーゼ処理し、次にこのキナーゼ処理した
ＸｈｏＩリンカー約１２．５μｌを、ＰｖｕＩＩ消化プ
ラスミドｐＫＣ２８３ＤＮＡ５μｌに加えた。次に、１
０Ｘリガーゼ緩衝液（３００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ
７．６；１００ｍＭＭｇＣｌ₂；及び５０ｍＭＤＴ
Ｔ）２．５μｌ、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ２．５μｌ、５
ｍＭＡＴＰ７μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２．５μｌ
（Ｐ−Ｌバイオケミカルズの定義によると約２．５単
位）、１０ｍＭスペルミジン２．５μｌ、及び水３μｌ
を、このＤＮＡに加えた。得られたライゲーション反応
物を４℃で一夜インキュベートした。ライゲーション反
応の後、この反応混合物を、高塩緩衝液（０．１ＭＮａ
Ｃｌ；０．０５ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５；１０．０
ｍＭＭｇＣｌ₂；及び１ｍＭＤＴＴ）の組成を有するよ
う調節した。制限酵素ＸｈｏＩ約１０μｌ（１００単
位）をこの混合物に加え、得られた反応物を３７℃で２
時間インキュベートした。

【０１００】反応を停止させ、そして、ＸｈｏＩリンカ
ーをライゲーション混合物に添加しなかった外は上の記
載のようにして、ＸｈｏＩ消化ＤＮＡを沈澱させ、再懸
濁し、そしてライゲーションした。ライゲーションされ
たＤＮＡは、所望のプラスミドｐＫＣ２８３ＰＸを構成
した。

【０１０１】実施例１８Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＭＯ
（λ⁺）／ｐＫＣ２８３ＰＸの組み立てＥ．ｃｏｌｉＫ１２ＭＯ（λ⁺）は、受理番号ＮＲ
ＲＬＢ−１５９９３の下でノーザン・リージョナル・
リサーチ・ラボラトリーズから、凍結乾燥された形態で
入手できる。Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＭＯ（λ⁺）は野
生型ラムダｐＬｃＩリプレッサー遺伝子を含んでおり、
従って本発明に係るハイブリッドｐＬ−ｌｐｐプロモー
ターからの転写はＥ．ｃｏｌｉＫ１２ＭＯ（λ⁺）
細胞では起こらない。凍結乾燥物を再構成し、ＭＯ（λ
⁺）の単一コロニーを単離し、そして、インキュベーシ
ョン温度を３７℃とし、アンピシリンを増殖培地に使用
しない外は実施例２０と実質的に同様にして、ＭＯ（λ
⁺）細胞の一夜経過後の培養１０ｍｌを調製する。

【０１０２】この一夜経過後の培養５０μｌを用いて、
１０ｍＭＭｇＳＯ₄及び１０ｍＭＭｇＣｌ₂をも含有する
ＬＢ培地５ｍｌに接種した。この培養を激しく振盪しな
がら３７℃で一夜インキュベーションした。翌朝、培養
を、１０ｍＭＭｇＳＯ₄及び１０ｍＭＭｇＣｌ₂を含有す
るＬＢ培地で２００ｍｌに希釈した。希釈した培養を激
しく振盪しながら３７℃で、５５０ｎｍにおける吸収
（Ａ₅₅₀）が約０．５となるまでインキュベーションし
たが、これは細胞密度が約１Ｘ１０⁸細胞／ｍｌである
ことを示すものである。培養を氷水浴中で１０分間冷却
し、次いで細胞を４℃における４０００ｇ、１０分間の
遠沈によって集めた。この細胞ペレットを１０ｍＭの冷
ＮａＣｌ１００ｍｌに再懸濁し、次いで直ちに遠沈によ
り再ペレット化した。この細胞ペレットを３０ｍＭＣａ
Ｃｌ₂１００ｍｌに再懸濁し、氷上で２０分間インキュ
ベーションした。

【０１０３】細胞を再び遠沈により集め、３０ｍＭのＣ
ａＣｌ₂１０ｍｌに再懸濁した。この細胞の等分試料
１．５ｍｌを、実施例１７で調製したライゲーションさ
れたＤＮＡに加えた。ＤＮＡはＣａＣｌ₂で３０ｍＭと
しておく。細胞−ＤＮＡ混合物を氷上で１時間インキュ
ベートし、４２℃で９０秒間の熱ショックを与え、次い
で氷上で約２分間冷却した。細胞−ＤＮＡ混合物をＬＢ
培地１０ｍｌに希釈して１２５ｍｌフラスコに入れ、３
７℃で１時間インキュベーションした。等分試料１００
μｌを、アンピシリンを含有するＬＢ寒天平板に蒔き、
コロニーが出現するまで３７℃でインキュベーションし
た。

【０１０４】コロニーを個別に培養し、それぞれのコロ
ニーのプラスミドＤＮＡを、制限酵素分析及びゲル電気
泳動によって調べた。プラスミドＤＮＡの単離を実施例
１６の方法に従って小スケールで実施したが、ＣｓＣｌ
勾配の工程は、所望のＥ．ｃｏｌｉＫ１２ＭＯ（λ
⁺）／ｐＫＣ２８３ＰＸ形質転換体が同定されるまで省
略した。プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸの制限サイト及び
機能地図を添付図面の図１２に示す。

【０１０５】実施例１９Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＭＯ
（λ⁺）／ｐＫＣ２８３−Ｌの組み立て実施例１６の方法に従って製造したプラスミドｐＫＣ２
８３ＰＸＤＮＡおよそ１０μｇを、１０Ｘ高塩緩衝液
２０μｌ、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ２０μｌ、制限酵素Ｂｇ
ｌＩＩ５μｌ（〜５０単位）、制限酵素ＸｈｏＩ５μｌ
（〜５０単位）、及び水１５０μｌに溶解し、得られた
反応物を３７℃で２時間インキュベートした。反応を停
止させ、ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ消化ＤＮＡを沈澱させた
後、このＤＮＡをＴＥ緩衝液５μｌに再懸濁した。

【０１０６】ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ制限酵素開裂の特
徴を持つ一本鎖ＤＮＡ末端を有するＤＮＡリンカーを合
成し、ホスホリル化した。このリンカーは、実施例８Ｅ
の方法と実質的に同様にしてホスホリル化した。このＤ
ＮＡリンカーは以下の構造を有していた：

【化５】

【０１０７】このリンカー及びＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ消
化プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸを、実施例１７の方法と
実質的に同様にしてライゲーションした。ライゲーショ
ンされたＤＮＡは所望のプラスミドｐＫＣ２８３−Ｌを
構成していた。プラスミドｐＫＣ２８３−Ｌの制限サイ
ト及び機能地図を添付図面の図１３に示す。実施例１８
の方法と実質的に同様にして、プラスミドｐＫＣ２８３
−ＬＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉＫ１２ＭＯ（λ⁺）の
形質転換に使用し、得られたＥ．ｃｏｌｉＫ１２Ｍ
Ｏ（λ⁺）／ｐＫＣ２８３−Ｌ形質転換体を同定した。

【０１０８】実施例２０Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＭＯ
（λ⁺）／ｐＫＣ２８３−ＬＢの組み立て実質上、実施例１６の方法に従って製造したプラスミド
ｐＫＣ２８３−ＬＤＮＡ約１０μｇを、１０Ｘ高塩緩
衝液２０μｌ、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ２０μｌ、制限酵素
ＸｈｏＩ５μｌ（〜５０単位）、及び水１５５μｌに溶
解し、得られた反応物を３７℃で２時間インキュベート
した。次いで、９５％エタノール３容量及び３Ｍ酢酸ナ
トリウム１／１０容量の添加、ドライアイス−エタノー
ル浴中での５分間のインキュベーション、及び遠沈によ
り、ＸｈｏＩ消化プラスミドｐＫＣ２８３−ＬＤＮＡ
を反応混合物から沈澱させた。得られたＤＮＡペレット
を７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、そして、１０Ｘ
ニック翻訳緩衝液（０．５ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．
２；０．１ＭＭｇＳＯ₄；及び１ｍＭＤＴＴ）２μｌ、
各ｄＮＴＰについて２ｍＭの溶液１μｌ、水１５μｌ、
クレナウ１μｌ（〜６単位）、及び１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ
１μｌに再懸濁した。得られた反応物を２５℃で３０分
間インキュベーションし、この溶液を７０℃で５分間イ
ンキュベーションすることにより、反応を停止させた。

【０１０９】ＢａｍＨＩリンカー（５'−ＣＧＧＧＡＴ
ＣＣＣＧ−３'）を、実施例１７の方法と実質的に同様
にして、ホスホリル化し、そしてＸｈｏＩ消化したクレ
ナウ処理プラスミドｐＫＣ２８３−ＬＤＮＡにライゲ
ーションした。ライゲーション反応の後、このＤＮＡを
高塩緩衝液中、ＢａｍＨＩ約１００単位により３７℃で
約２時間消化した。ＢａｍＨＩ消化後、ＤＮＡを実施例
１７の方法と実質的に同様にして、ライゲーション用に
準備した。

【０１１０】実施例１６及び１７の方法と実質的に同様
にして、〜５．９ｋｂＢａｍＨＩ制限フラグメントを
ライゲーションにより円形とし、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２
ＭＯ（λ⁺）に導入した。Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２Ｍ
Ｏ（λ⁺）／ｐＫＣ２８３−ＬＢ形質転換体を同定し、
次いで実施例１６の方法と実質的に同様にしてプラスミ
ドｐＫＣ２８３−ＬＢＤＮＡを調製した。プラスミド
ｐＫＣ２８３−ＬＢの制限サイト及び機能地図を添付図
面の図１４に示す。

【０１１１】実施例２１Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＭＯ
（λ⁺）／ｐＬ３２の組み立て出発プラスミド、制限酵素、及び使用されるリンカーを
除いては実施例２０の方法と実質的に同様にして、プラ
スミドｐＫＣ２８３ＰＸ約１０μｇを高塩緩衝液中、制
限酵素ＳａｌＩで消化し、クレナウで処理し、そしてＥ
ｃｏＲＩリンカー（５'−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣ−
３'）とライゲーションした。〜２．１ｋｂＤＮＡの
切取りをもたらす制限酵素ＥｃｏＲＩでの消化の後、〜
４．０ｋｂＥｃｏＲＩ制限フラグメントをライゲーショ
ンによって円形とし、プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲＳを
生成させた。ライゲーションされたＤＮＡを、実施例１
８の方法と実質的に同様にしてＥ．ｃｏｌｉＫ１２
ＭＯ（λ⁺）の形質転換に使用した。Ｅ．ｃｏｌｉＫ
１２ＭＯ（λ⁺）／ｐＫＣ２８３ＰＲＳ形質転換体を
同定後、プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲＳＤＮＡを実施
例１６の方法と実質的に同様にして製造した。プラスミ
ドｐＫＣ２８３ＰＲＳの制限サイト及び機能地図を添付
図面の図１５に示した。

【０１１２】プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲＳ約１０μｇ
を高塩緩衝液２００μｌ中、制限酵素ＰｓｔＩ及びＳｐ
ｈＩそれぞれ約５０単位で消化した。反応物を３７℃で
約２時間インキュベーションした後、反応混合物を０．
６％低温ゲル化アガロースゲル上で〜１３０Ｖ及び〜７
５ｍＡで２−３時間、トリス酢酸塩緩衝液（０．０４Ｍ
トリス酢酸塩、１ｍＭＥＤＴＡ）中で電気泳動した。

【０１１３】ゲルをエチジウムブロミドの希釈溶液中で
染色し、長波長ＵＶ光で可視化した〜０．８５ｋｂＰｓ
ｔＩ−ＳｐｈＩ制限フラグメントを構成するＤＮＡのバ
ンドを小さな切片としてゲルから切り取った。切片の容
量を、重量及びその切片の密度によって決定し、同容量
の１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）を切片の入った
管に加えた。次いで切片を７２℃におけるインキュベー
ションにより融解した。約１００μｌの容量において、
プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲＳの〜０．８５ｋｂＰｓｔ
Ｉ−ＳｐｈＩ制限フラグメント約１μｇが得られた。同
様のやり方で、プラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢを制限酵
素ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩで消化し、得られた〜３．０
ｋｂ制限フラグメントをアガロースゲル電気泳動によっ
て単離し、ライゲーションのために準備した。

【０１１４】実施例１７の方法と実質的に同様にして、
プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲＳの〜０．８５ｋｂＰｓｔ
Ｉ−ＳｐｈＩ制限フラグメントをプラスミドｐＫＣ２８
３−ＬＢの〜３．０ｋｂＰｓｔＩ−ＳｐｈＩ制限フラグ
メントにライゲーションした。ライゲーションされたＤ
ＮＡは所望のプラスミドｐＬ３２を構成していた。プラ
スミドｐＬ３２の制限サイト及び機能地図を添付図面の
図１６に示す。プラスミドｐＬ３２を実施例１８の方法
と実質的に同様にしてＥ．ｃｏｌｉＫ１２ＭＯ（λ⁺）
細胞に導入した。プラスミドｐＬ３２ＤＮＡを実施例
１６の方法と実質的に同様にしてＥ．ｃｏｌｉＫ１２
ＭＯ（λ⁺）／ｐＬ３２形質転換体から製造した。プ
ラスミドｐＬ３２ＤＮＡの分析は、１以上のＥｃｏＲ
Ｉリンカーが、プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸのクレナウ
処理されたＳａｌＩ末端に結合していることを証明し
た。１以上のＥｃｏＲＩリンカーの存在は、プラスミド
ｐＬ３２またはプラスミドｐＬ３２の誘導体の有用性に
は影響せず、これらＥｃｏＲＩリンカーのうち２個が互
いにライゲーションする場合常に生成するＸｈｏＩ制限
サイトの存在によって発見できる。

【０１１５】実施例２２Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＭＯ
（λ⁺）／ｐＬ４７の組み立てプラスミドｐＣＣ１０１の制限サイト及び機能地図を添
付図面の図２３に示す。プラスミドｐＣＣ１０１の組み
立ては、１９８８年５月７日登録の米国特許第４７４５
０６９号の実施例３に教示されている。ＥＫ−ＢＧＨコ
ード化ＤＮＡを単離するために、プラスミドｐＣＣ１０
１約１０μｇを、制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ各々
約５０単位を含有する高塩緩衝液２００μｌ中で消化し
た。消化産物をアガロースゲル電気泳動によって分離
し、ＥＫ−ＢＧＨをコードしている〜０．６ｋｂＸｂａ
Ｉ−ＢａｍＨＩ制限フラグメントを実施例２１の方法と
実質的に同様にして単離し、ライゲーション用に準備し
た。

【０１１６】プラスミドｐＬ３２もまた制限酵素Ｘｂａ
ＩおよびＢａｍＨＩで消化し、〜３．９ｋｂ制限フラグ
メントを単離し、ライゲーション用に準備した。プラス
ミドｐＬ３２の〜３．９ｋｂＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ制限
フラグメントを実施例１７の方法と実質的に同様にして
プラスミドｐＣＣ１０１の〜０．６ｋｂＸｂａＩ−Ｂａ
ｍＨＩ制限フラグメントにライゲーションしてプラスミ
ドｐＬ４７を生成した。プラスミドｐＬ４７の制限サイ
ト及び機能地図を添付図面の図１７に示す。プラスミド
ｐＬ４７を実施例１８の方法と実質的に同様にしてＥ．
ｃｏｌｉＫ１２ＭＯ（λ⁺）に導入し、Ｅ．ｃｏｌ
ｉＫ１２ＭＯ（λ⁺）／ｐＬ４７形質転換体を同定
した。プラスミドｐＬ４７ＤＮＡは、実施例１６の方
法と実質的に同様にして、形質転換体から調製した。

【０１１７】実施例２３Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＭＯ
（λ⁺）／ｐＬ８４の組み立てプラスミドｐＬ３２約１０μｇを高塩緩衝液２００μｌ
中、制限酵素ＢａｍＨＩ約５０単位によって３７℃で約
２時間消化した。ＢａｍＨＩ消化プラスミドｐＬ３２
ＤＮＡを、実施例２０の方法と実質的に同様にして、沈
澱させ、クレナウで処理し、そしてＳａｌＩリンカー
（５'−ＣＧＴＣＧＡＣＧ−３'）にライゲーションし
た。ＳａｌＩリンカーがライゲーションされた後、制限
酵素ＳａｌＩ約１００単位及び制限酵素ＸｂａＩ約５０
単位をライゲーション混合物に加え、これを高塩緩衝液
の組成を有するよう調節し、得られた反応物を３７℃で
２時間インキュベーションした。反応産物をアガロース
ゲル電気泳動によって分離し、〜３．９ｋｂＳａｌＩ−
ＸｂａＩ制限フラグメントを実施例２１の方法と実質的
に同様にして単離し、ライゲーション用に準備した。

【０１１８】プラスミドｐＣＣ１０１約１０μｇを、高
塩緩衝液２００μｌ中、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩ
各々約５０単位により、３７℃で２時間消化した。反応
生成物をアガロースゲル電気泳動により分離し、ＥＫ−
ＢＧＨ及びＥ．ｃｏｌｉｌｐｐ遺伝子の翻訳ターミネ
ーターをコードしている〜１．６ｋｂＳａｌＩ−Ｘｂ
ａＩ制限フラグメントを、実施例２１の方法と実質的に
同様にして単離し、ライゲーション用に準備した。

【０１１９】プラスミドｐＬ３２から誘導される〜３．
９ｋｂＳａｌＩ−ＸｂａＩ制限フラグメントを、実施
例１７の方法と実質的に同様にして、プラスミドｐＣＣ
１０１の〜１．６ｋｂＳａｌＩ−ＸｂａＩ制限フラグ
メントにライゲーションした。ライゲーションされたＤ
ＮＡは所望のプラスミドｐＬ８４を構成していた。プラ
スミドｐＬ８４の制限サイト及び機能地図を添付図面の
図１８に示す。このライゲーションされたＤＮＡは、実
施例１８の方法と実質的に同様にしてＥ．ｃｏｌｉＫ
１２ＭＯ（λ⁺）細胞の形質転換に使用した。プラス
ミドｐＬ８４ＤＮＡを実施例１６の方法と実質的に同様
にしてＥ．ｃｏｌｉＫ１２ＭＯ（λ⁺）／ｐＬ８４
形質転換体から調製した。

【０１２０】実施例２４Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＭＯ
（λ⁺）／ｐＬ９５の組み立てプラスミドｐＬ８４約１０μｇを、高塩緩衝液約２００
μｌ中、制限酵素ＮｄｅＩ約５０単位により、３７℃で
２時間消化した。次いで実施例２０の方法と実質的に同
様にして、ＮｄｅＩ消化ＤＮＡを沈澱させ、クレナウで
処理した。次に、ＮｄｅＩ消化され、クレナウ処理され
たプラスミドｐＬ８４ＤＮＡを、実施例１７の方法と実
質的に同様にしてＫｐｎＩリンカー（５'−ＧＧＧＴＡ
ＣＣＣ−３'）にライゲーションした。リンカーのライ
ゲーションの後、このＤＮＡを沈澱させ、得られるＤＮ
Ａペレットを、１０Ｘ低塩緩衝液（０．１ＭトリスＨＣ
ｌ、ｐＨ７．６；０．１ＭＭｇＣｌ₂；及び１０ｍＭ
ＤＴＴ）２０μｌ、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ２０μｌ、制限
酵素ＫｐｎＩ５μｌ（約５０単位）、及び水１５５μｌ
に再懸濁した。得られた反応物を３７℃で２時間インキ
ュベーションした。

【０１２１】ＫｐｎＩ消化の後、ＤＮＡを低融点アガロ
ースゲルにロードし、実施例２１の方法と実質的に同様
にして、〜３．８ｋｂ制限フラグメントを単離し、ライ
ゲーションにより再び円形とした。ライゲーションされ
たＤＮＡはプラスミドｐＬ９５を構成し、これを実施例
２２の方法と実質的に同様にして、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１
２ＭＯ（λ⁺）の形質転換に使用した。プラスミドｐ
Ｌ９５の制限サイト及び機能地図を添付図面の図１９に
示す。

【０１２２】実施例２５Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ
３０８／ｐＰＲ１２ＡＲ１の組み立てプラスミドｐＰＲ１２は、温度感受性ｐＬリプレッサー
遺伝子ｃＩ８５７及びプラスミドｐＢＲ３２２テトラサ
イクリン耐性付与遺伝子を含んでいる。プラスミドｐＰ
Ｒ１２は、１９８４年３月１３日登録の米国特許第４４
３６８１５号に開示及び特許請求されている。プラスミ
ドｐＰＲ１２の制限サイト及び機能地図を添付図面の図
２１に示す。

【０１２３】プラスミドｐＰＲ１２約１０μｇを、高塩
緩衝液２００μｌ中、制限酵素ＥｃｏＲＩ約５０単位に
より、３７℃で２時間消化した。次いで実施例２０の方
法と実質的に同様にして、ＥｃｏＲＩ消化プラスミドｐ
ＰＲ１２ＤＮＡを沈澱させ、クレナウで処理した。クレ
ナウ反応の後、ＥｃｏＲＩ消化されクレナウ処理された
プラスミドｐＰＲ１２ＤＮＡを、実施例１７の方法と実
質的に同様にして、ライゲーションにより再度円形とし
た。ライゲーションされたＤＮＡは所望プラスミドｐＰ
Ｒ１２△Ｒ１を構成し、これを、選択がアンピシリン耐
性ではなくテトラサイクリン（５μｇ／ｍｌ）耐性に基
づく以外は実施例１８の方法と実質的に同様にして、
Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３０８の形質転換に使用し
た。Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３０８は受理番号ＮＲ
ＲＬＢ−１５６２４の下でＮＲＲＬより入手可能であ
る。Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３０８／ｐＰＲ１２△
Ｒ１形質転換体を同定した後、実施例１６の方法と実質
的に同様にして、プラスミドｐＰＲ１２△Ｒ１ＤＮＡ
をこの形質転換体から調製した。

【０１２４】プラスミドｐＰＲ１２△Ｒ１約１０μｇ
を、中等度塩緩衝液（ＢＭＢ）２００μｌ中、制限酵素
ＡｖａＩ約５０単位により、３７℃で２時間消化した。
実施例２０の方法と実質的に同様にして、ＡｖａＩ消化
プラスミドｐＰＲ１２△Ｒ１ＤＮＡを沈澱させ、クレナ
ウで処理した。クレナウ反応の後、ＡｖａＩ消化されク
レナウ処理されたプラスミドｐＰＲ１２△Ｒ１ＤＮＡ
を、実施例１７の方法と実質的に同様にして、ＥｃｏＲ
Ｉリンカー（５'−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣ−３'）に
ライゲーションした。リンカーのライゲーションの後、
ＤＮＡを沈澱させ、次いで制限酵素ＥｃｏＲＩ約５０単
位を含有する高塩緩衝液約２００μｌに再懸濁した。得
られた反応物を３７℃で約２時間インキュベーションし
た。ＥｃｏＲＩ消化後、反応混合物をアガロースゲルに
ロードし、実施例２１の方法と実質的に同様にして〜
５．１ｋｂＥｃｏＲＩ制限フラグメントを精製した。こ
の〜５．１ｋｂＥｃｏＲＩ制限フラグメントを、実施例
１７の方法と実質的に同様にしてライゲーションにより
再び円形とした。ライゲーションされたＤＮＡは所望プ
ラスミドｐＰＲ１２ＡＲ１を構成していた。プラスミド
ｐＰＲ１２ＡＲ１ＤＮＡを、選択がアンピシリン耐性で
はなくテトラサイクリン耐性に基づく以外は実施例１８
の方法と実質的に同様にして、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２
ＲＶ３０８に導入した。Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３
０８／ｐＰＲ１２ＡＲ１形質転換体を同定した後、実施
例１６の方法と実質的に同様にして、プラスミドｐＰＲ
１２ＡＲ１ＤＮＡを調製した。プラスミドｐＰＲ１２
ＡＲ１の制限サイト及び機能地図を添付図面の図２１に
示す。

【０１２５】実施例２６Ｅ.coli Ｋ１２ＲＶ３０８
／pＬ１１０の構築プラスミドpＰＲ１２ＡＲ１ＤＮＡ約１０μgを、ＰstI
およびＥcoＲI制限酵素各々約５０単位を含有している
高塩緩衝液約２００mlに懸濁し、この消化反応物を３７
℃で約２時間インキュベートした。次いで、実質上実施
例２１の方法に従い、反応混合物をアガロースゲルに負
荷し、プラスミドpＰＲ１２ＡＲ１の〜２.９kb ＰstI−
ＥcoＲI制限フラグメントを単離し、ライゲーション用
に調製した。

【０１２６】プラスミドpＬ４７約１０μgを、ＰstIお
よびＢamＨI制限酵素にて高塩緩衝液２００μl中、３７
℃で２時間、消化した。実質上実施例２１の方法に従
い、このＰstI−ＢamＨI消化したＤＮＡをアガロースゲ
ルに負荷し、複製起点およびアンピシリン耐性付与遺伝
子の一部分を含有している〜２.７kb ＰstI−ＢamＨI制
限フラグメントを単離し、ライゲーション用に調製し
た。別の反応では、実質上実施例２１の方法に従い、プ
ラスミドpＬ４７ＤＮＡ約１０μgを、制限酵素ＥcoＲI
およびＢamＨIにて高塩緩衝液２００μl中、３７℃で２
時間消化し、新規な転写および翻訳活性化配列およびＥ
Ｋ−ＢＧＨをコードしているＤＮＡを含有している〜
１.０３kb ＥcoＲI−ＢamＨI制限フラグメントを単離
し、ライゲーション用に調製した。得られた〜１.０３k
b ＥcoＲI−ＢamＨI制限フラグメント〜２μgをプラス
ミドpＬ１１０の構築で使用した。

【０１２７】形質転換体を選択するための基準としてア
ンピシリン耐性ではなくテトラサイクリン耐性を使用し
た以外、実質上実施例１７および１８の方法に従い、プ
ラスミドpＬ４７の〜２.７kb ＰstI−ＢamＨIおよび〜
１.０３kb ＥcoＲI−ＢamＨI制限フラグメントをプラス
ミドpＰＲ１２ＡＲ１の〜２.９kb ＰstI−ＥcoＲI制限
フラグメントにライゲートしてプラスミドpＬ１１０を
構築し、このライゲートされたＤＮＡをＥ.coliＫ１２
ＲＶ３０８を形質転換するために使用した。

【０１２８】２個のＰstI制限酵素認識部位はＥＫ−Ｂ
ＧＨをコードしている領域に存在しており、これは添付
の図面に示された制限部位および機能地図に描かれてい
ない。プラスミドpＬ１１０の制限部位および機能地図
を添付の図面の図２２に示す。

【０１２９】実施例２７プラスミドpＢＷ４６の構築Ａ．プラスミドpＢＷ４４の構築 pＢＷ３３およびpＬ１９５由来の制限フラグメントを使
用し、３部分ライゲーション反応でプラスミドpＢＷ４
４を構築した。再ライゲーションすると、合して、t−
ＰＡ遺伝子のカルボキシ末端のコード領域以外のプラス
ミドを再構築するpＢＷ３３由来の２個のフラグメント
を単離した。プラスミドpＬ１９５から単離した第３の
フラグメントは、t−ＰＡ遺伝子のカルボキシ末端のコ
ード領域マイナス３'−非コード配列の多くを含有す
る。

【０１３０】実質上実施例４Ａの教示に従い、必要に応
じて適当な制限酵素および緩衝液を置き換えて、プラス
ミドpＢＷ３３由来の〜３.９kb ＢamＨI−ＣlaIおよび
〜２.７kb ＣlaI−ＳstＩ制限フラグメントを単離し
た。次いで、pＬ１９５由来の〜０.３kb ＳstＩ−Ｂam
ＨIフラグメントを単離し、２個のpＢＷ３３制限フラグ
メントと混合し、ＡＴＰの終濃度を５００μＭに高めた
以外、実施例４Ｃの教示に従ってライゲートした。１５
μg／mlの濃度でテトラサイクリンを使用し、形質転換
体を３２℃でインキュベートした以外、実質上実施例１
Ｂの教示に従い、このライゲーション産物を使用して
Ｅ.coli ＭＭ２９４細胞を形質転換した。

【０１３１】Ｂ．プラスミドmp８ＢＷ４５の構築Ｓ１処理を２０℃で１０分間行ない、以下の合成オリゴ
デオキシリボヌクレオチドプライマー： 5'-GGATTTGCTGGGAAGTCCTGTGAAATATCCACC-3' を置き換えた以外、アデルマン等(Adelman et al., 198
3,DNA2(3):183-193)の部位特異的突然変異誘発法に従っ
て１本鎖pＭ８ＢＷ２７からこのベクターを構築した。
このプライマーを使用してＣＹＳ₈₃のヌクレオチド番号
４３７をグアニンからシトシンに変更し、それによって
ＣＹＳ₈₃をＳＥＲ₈₃に変更した。

【０１３２】得られた突然変異誘発混合物を使用し、実
施例５Ｃの教示に従ってＥ.coli ＪＭ１０９細胞(ＢＲ
Ｌから市販品として入手可能)に感染させた。合成オリ
ゴデオキシリボヌクレオチド5'-GGGAAGTCCTGTGAAA-3'と
ハイブリダイズさせることによって、所望の突然変異体
を確認した。簡単に言うと、ミリポア８２mm ＨＡＴＦ
フィルターを置き換え、これらのフィルターをオートク
レーブ処理の代わりにスチーム処理する以外、ハナハン
およびメセルソン(Hanahan and Meselson, 1980,Gene 1
0:63-67)による記載に従って、フィルターを調製した。

【０１３３】予め冷却した(４℃で６０分間)積層プレー
トの上部に１−２分間フィルターを置くことによって、
プラークを採取した。次いで、以下の溶液：０.１ＭＮ
aＯＨ、１.５ＭＮaＣlで５分間、および０.５Ｍトリ
ス、pＨ７.５、３ＭＮaＣlで更に５分間、飽和させた
ワットマン３ＭＭ濾紙にフィルターを移した。フィルタ
ーを風乾し、次に、８０℃で２時間焼いた。フィルター
を、６×ＳＳＣ(０.９ＭＮaＣlおよび０.０９Ｍクエン
酸Ｎa)、０.１％ピロリン酸ナトリウム、０.１％ドデシ
ル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、１０×デンハーツ(Denhard
t's)(０.２％フィコル、０.２％ポリビニルピロリド
ン、０.２％ＢＳＡ)および１μg／ml Ｅ.coliＤＮＡの
溶液中、４５℃で９０分間、プレハイブリダイズさせ
た。

【０１３４】次に、以下の様にしてフィルターをハイブ
リダイズさせた。放射活性なプローブ(比活性＝７２μ
Ｃi／pmol)をハイブリダイゼーション緩衝液(６×ＳＳ
Ｃ、０.１％ピロリン酸ナトリウム、１０×Ｄenhardt'
s)で０.２３pmol／mlの濃度に希釈し、フィルターに加
えた。ハイブリダイゼーションを４５℃で２時間進行さ
せた。以下のスケジュールに従い、フィルターを６×Ｓ
ＳＣで洗浄した。増強スクリーンを使用し、フィルターを−７０℃にて１
時間、Ｘ線フィルムに感光させた。プローブにハイブリ
ダイズしたプラークからのＤＮＡを抽出し、ジデオキシ
配列決定法によって確認した。

【０１３５】Ｃ．最終構築 pＢＷ４４およびmp８ＢＷ４５由来の制限フラグメント
を使用し、３部分ライゲーションでプラスミドpＢＷ４
６を構築した。システイン置換が行われたt−ＰＡをコ
ードしている配列部分を含有しているmp８ＢＷ４５由来
のフラグメントをプラスミドpＢＷ４４由来の２個のフ
ラグメントにライゲートし、それによって、遊離のスル
フヒドリル残基を含有していない、クリングルのない形
態のt−ＰＡをコードしている新規な遺伝子配列を作成
した。

【０１３６】実質上、実施例４Ａの教示に従い、必要に
応じて適当な制限酵素および緩衝液を置き換えて、pＢ
Ｗ４４由来の〜４４４０bp ＥcoＲI−ＣlaIおよび〜１
９５０ＣlaI−ＮdeＩ制限フラグメントを単離した。次
いで、実質上、実施例２７の教示に従い、mp８ＢＷ４５
由来の〜５６２bp ＮdeＩ−ＥcoＲIフラグメントを単離
し、上のフラグメントと混合し、ライゲートした。この
ライゲーション産物を使用してＥ.coli ＭＭ２９４細胞
を形質転換し、実質上、バーンボイムおよびドーリーの
アルカリミニスクリーン法(Birnboim and Doly, 1979)
に従ってＲＦＤＮＡを単離した。ＳＥＲ₈₃mt−ＰＡ３
の発現のために、このプラスミドＤＮＡでＥ.coli Ｋ１
２ＲＶ３０８を形質転換した。

【０１３７】実施例２８プラスミドmp１８ＢＷ５０の
構築Ａ．mp１８ＢＷ４７の構築実質上、実施例５の教示に従い、種々の制限酵素を使用
するために変更した条件を使用して、このベクターを構
築した。即ち、mp１８(ＢＲＬ)由来の〜７２５０bp Ｈi
ndＩＩＩ−ＳstＩ制限フラグメントを、pＴＰＡ１０３
由来の〜１４４０ＨindＩＩＩ−ＳstＩフラグメントに
ライゲートした。このライゲートされた原料を使用し
て、Ｅ.coli ＪＭ１０９細胞(ＢＲＬ)をトランスフェク
トし、得られたトランスフェクトされた細胞を培養し、
以下の突然変異誘発例で出発物質として使用するための
１本鎖ＤＮＡを製造した。

【０１３８】Ｂ．部位特異的突然変異誘発クレノウ反応を室温で６０分間、次に３７℃で４時間、
次いで４℃で一夜行なう以外、実質上、実施例６の教示
に従って、１本鎖mp１８ＢＷ４７を突然変異誘発した。
更に、Ｓ１処理を２０℃で２０分間行なった。合成オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドプライマー： 5'-GGATTTGCTGGGAAGTCCTGTGAAATAGGAAACAGTGACTGCTAC-
3' を使用し、天然のt−ＰＡのアミノ酸残基８７〜１７５
を欠失させた。

【０１３９】実施例２７の教示に従い、得られた突然変
異誘発混合物を使用してＥ.coli ＪＭ１０９細胞をトラ
ンスフェクトし、合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
プローブ(5'-GTCCTGTGAAATAGGAA-3')とハイブリダイズ
させることによって、所望の突然変異体を確認した。Ｍ
１３配列決定プライマー(5'-GTGCCCCGAAGGATTTG-3')を
使用し、Ｍ１３配列決定法によってこれらのポジティブ
な変異体を更に確認し、組換体クローンをmp１８ＢＷ５
０と命名した。

【０１４０】実施例２９プラスミドpＬ２１９の構築プラスミドpＬ２１９は、最初のクリングル(Ｋ１)ドメ
イン、アミノ酸残基８７〜１７５が欠失され、ＣＹＳ₈₃
残基がＳＥＲ₈₃に変更された、mt−ＰＡ４と呼ばれる修
飾t−ＰＡをコードしている遺伝子配列を含有する原核
生物性発現ベクターである。この誘導体を構築するため
に、前に構築した３種類のベクターから制限フラグメン
トを単離し、複数のライゲーション反応においてＴ４リ
ガーゼによって連結させた。即ち、Ｋ１ドメインの欠失
を含む、mt−ＰＡ４遺伝子の５'アミノ末端を含有して
いる〜１.０kb ＢglＩＩ−ＳstＩフラグメントを、複製
型mp１８ＢＷ５０から単離した。２シストロン構築物を
含有している〜５０bp ＸbaＩ−ＸhoＩＩ制限フラグメ
ントをプラスミドpＢＷ３３から単離した。これらの２
個のフラグメントを、pＢＷ４６由来の〜６.１kb Ｓst
Ｉ−ＸbaＩフラグメントと混合してライゲートし、Ｅ.c
oli ＲＶ３０８を形質転換するために使用した。プラス
ミドpＬ２１９の制限部位および機能地図を添付の図面
の図２４に示す。実質上、実施例２７の方法に従い、
Ｅ.coli ＲＶ３０８／pＬ２１９形質転換体からプラス
ミドpＬ２１９ＤＮＡを製造した。

【０１４１】実施例３０Ａ．ＴＰＡをコードしている領域の部位特異的突然変異
誘発およびＭＰ１８ＢＷ５２の構築 dＨ₂Ｏ１０μlに入れたプラスミドpＴＰＡ１０３(実施
例２)約５μgを、１０×ＨindＩＩＩ緩衝液約１０μlお
よびｄＨ₂Ｏ８０μlに加える。制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ１μｌ（約２０単位)をプラスミドpＴＰＡ１０３ＤＮ
Ａの溶液に加え、得られた反応物を３７℃で９０分間イ
ンキュベートする。制限酵素ＳstＩ１μl(約２０単位)
および１Ｍトリス−ＨＣl、pＨ＝７.６１０μlを、Ｈi
ndＩＩＩ消化プラスミドpＴＰＡ１０３ＤＮＡの溶液に
加え、得られた反応物を３７℃で９０分間インキュベー
トする。エタノール沈澱によってＨindＩＩＩ−ＳstＩ
消化プラスミドpＴＰＡ１０３ＤＮＡを濃縮し、１.５
％アガロースゲルに負荷し、〜１.４kb ＨindＩＩＩ−
ＳstＩ制限フラグメントがその他の消化産物から分離さ
れるまで電気泳動させる。〜１.４kb ＨindＩＩＩ−Ｓs
tＩ制限フラグメント約０.５μgをゲルから分離し、ラ
イゲーションのために調製し、dＨ₂Ｏ２０μlに再懸濁
する。

【０１４２】dＨ₂Ｏ３５μlに入れた複製形(ＲＦ)のＭ
１３mp１８ＤＮＡ(ＮＥＢから入手可能)約４.５μg
を、１０×ＨindＩＩＩ緩衝液１０μlおよびdＨ₂Ｏ５
５μlに加える。制限酵素ＨindＩＩＩ１μl(約２０単
位)をＭ１３mp１８ＤＮＡの溶液に加え、得られた反応
物を３７℃で１時間インキュベートした。制限酵素Ｓst
Ｉ１μl(約２０単位)および１Ｍトリス−ＨＣl、pＨ＝
７.６１０μlを、ＨindＩＩＩで消化したＭ１３mp１８
ＤＮＡの溶液に加え、得られた反応物を３７℃で１時
間インキュベートする。エタノール沈澱によってＨind
ＩＩＩ−ＳstＩ−消化Ｍ１３mp１８ＤＮＡを集め、ア
ガロースゲル電気泳動のための調製物に再懸濁し、上記
と同様にしてゲル電気泳動によって大きい制限フラグメ
ントを単離する。Ｍ１３mp１８の大きいＨindＩＩＩ−
ＳstＩ制限フラグメント約１μg、１０×Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ緩衝液２μl、dＨ₂Ｏ１２μlおよびＴ４ＤＮＡ
リガーゼ〜１μl(約１ワイス単位)を、プラスミドpＴＰ
Ａ１０３の〜１.４kb ＨindＩＩＩ−ＳstＩ制限フラグ
メント３μlに加え、得られたライゲーション反応物を
１６℃で一夜インキュベートする。

【０１４３】１回のトランスフェクションに使用したＤ
ＮＡの量を変える以外、実質上、ＢＲＬＭ１３クロー
ニング／‘ジデオキシ’・シーケンシング・インストラ
クション・マニュアル(‘Dideoxy’ Sequencing Instru
ction Manual)に記載の方法に従い、Ｅ.coli ＪＭ１０
３細胞(ＢＲＬから入手可能)をコンピテントにし、ライ
ゲーション混合物でトランスフェクトした。β−ガラク
トシダーゼα−フラグメントをコードしている遺伝子を
挿入的に不活化し、それによりＸ−Ｇalをそのインディ
ゴ色切断産物に切断する能力をなくすることによって、
組換体プラークを確認する。スクリーニングするため
に、幾つかの白色プラークを採取してＬブロス２.５ml
に入れ、対数増殖期のＥ.coli Ｋ１２ＪＭ１０３０.
４mlを加え、最小培地ストックで培養して、proＡＢを
担持するＦエピソームの保持を保証する。Ｌブロス１リ
ットルは、ディフコ・バクト・トリプトン１０g、ディ
フコ酵母エキス５g、ＮaＣｌ５g、およびグルコース１
gを含有する。２.５mlずつのプラーク含有細胞懸濁液を
エアシェーカーにて３７℃で８時間インキュベートす
る。実質上、バーンボイムおよびドーリーのアルカリミ
ニスクリーン法(Birnboimand Doly,1979,Nuc.Acids Re
s. 7:1513)に従い、１.５mlずつからの細胞をペレット
化し、ＲＦＤＮＡを単離する。各培養の残部をストッ
ク用に４℃で貯蔵する。ＭＰ１８ＢＷ４７と命名された
所望のファージは、Ｍ１３mp１８の〜７.２kb ＥcoＲI
−ＨindＩＩＩ制限フラグメントにライゲートした、プ
ラスミドpＢＷ２５の〜１.４kb ＨindＩＩＩ−ＳstＩ制
限フラグメント(実施例４)を含有する。

【０１４４】対数期Ｅ.coli ＪＭ１０３約５０mlをＭＰ
１８ＢＷ４７で感染させ、エアシェーカーにて３７℃で
１８時間インキュベートする。インストラクション・マ
ニュアルに示された方法をスケールアップすることによ
って、感染した細胞を低速遠心によりペレット化し、培
養上清から１本鎖ＭＰ１８ＢＷ４７ＤＮＡを製造す
る。クレノウ反応を室温で３０分間、次に３７℃で６０
分間、次いで１０℃で１８時間行なう以外、実質上、ア
デルマン等の教示(Adelman et al., 1983 DNA 2(3):183
-193)に従い、１本鎖ＭＰ１８ＢＷ４７を突然変異誘発
する。更に、Ｓ１処理を２０℃で行ない、緩衝液の塩濃
度をその製造業者によって推奨された２分の１とし、Ｍ
１３シーケンシング・プライマー(ＢＲＬ)を使用する。
天然のＴＰＡのアミノ酸残基４〜１７５のためのコード
配列を欠失させるために使用した合成オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドプライマーは、5'-GGAGCCAGATCTTACCAAG
GAAACAGTGACTGCTAC-3'である。

【０１４５】実質上、上記の感染法に従い、得られた突
然変異誘発混合物を使用してＥ.coli Ｋ１２ＪＭ１０
３をトランスフェクトする。ＲＦＤＮＡの制限酵素分
析およびマクサムおよびギルバート(Maxam and Gilber
t)によって所望の突然変異体を確認し、天然のＴＰＡの
アミノ酸残基４〜１７５が欠失されているＤＮＡ配列を
ＭＰ１８ＢＷ５２と命名する。

【０１４６】実施例３１プラスミドpＬ２３１の構築Ａ．プラスミド構成成分の調製プラスミドpＬ２３１は、t−ＰＡ−６と命名されたt−
ＰＡ誘導体をコードしている。プラスミドpＢＷ３３(実
施例１０)、pＢＷ４６(実施例２７)およびpＭＰ１８Ｂ
Ｗ５２(実施例２９)から、以下の様にしてプラスミドp
Ｌ２３１を構築した。

【０１４７】実質上、実施例１の方法に従い、Ｅ.coli
ＭＭ２９４／pＢＷ３３からプラスミドpＢＷ３３ＤＮ
Ａを製造した。プラスミドpＢＷ３３を順次、ＸbaＩお
よびＸhoＩＩで消化した。ＸbaＩはニュー・イングラン
ド・バイオラブス(New England Biolabs)から購入し
た。ＸbaＩ約２０Ｕを使用し、５０mＭＮaＣl、１０m
Ｍトリス−ＨＣl(pＨ＝７.９)、１０mＭＭgＣl₂、およ
び１００μg／mlのウシ血清アルブミンを含有している
全消化容量２０μl中にて、プラスミドpＢＷ３３約１０
μlを３７℃で１時間、消化した。次いで、プラスミドp
ＢＷ３３のＸbaＩ消化混合物をＸhoＩＩ(Boehringer Ma
nnheim)〜２０Ｕにて３７℃で更に１時間消化した。プ
ラスミドpＢＷ３３のＸbaＩおよびＸhoＩＩ消化から得
られた制限フラグメントを、０.６％アガロースゲルで
電気泳動することによって分離した。〜５０bpフラグメ
ントをゲルから集め、エタノール沈澱させ、減圧乾燥
し、次いで、ＴＥ〜１０μlに再懸濁した。この〜５０b
p ＸbaＩ−ＸhoＩＩフラグメントは、実施例７Ｃに記載
されたダブル−シストロンを含有している。

【０１４８】実質上、実施例１の方法に従い、Ｅ.coli
ＲＶ３０８／pＢＷ４６からプラスミドpＢＷ４６ＤＮ
Ａを製造した。プラスミドpＢＷ４６約１０μgを順次、
ＸbaＩおよびＳstＩで消化し、〜４.７kb制限フラグメ
ントを作成した。ＸbaＩ消化法は前記のものである。Ｓ
stＩ(ＢＭＢ)約１０Ｕを使用し、プラスミドpＢＷ４６
〜１０μgをベーリンガー・マンハイム・コア緩衝液(Bo
ehringer Mannheim Core buffer)中、３７℃で１時間消
化した。消化混合物の電気泳動後、０.６％アガロース
ゲルから〜４.７kb ＸbaＩ−ＳstＩ制限フラグメントを
回収した。pＢＷ４６の〜４.７kb ＸbaＩ−ＳstＩフラ
グメントをエタノール沈澱させ、減圧乾燥し、ＴＥ１０
μlに再懸濁した。

【０１４９】実質上、実施例１の方法に従い、Ｅ.coli
Ｋ１２ＪＭ１０３／mp１８ＢＷ５１からプラスミドmp
１８ＢＷ５２を作成した。mp１８ＢＷ５２をＢglＩＩお
よびＳstＩで二重消化した。ＢglＩＩおよびＳstＩはＢ
ＲＬから入手し、供給者によって与えられた指針に従っ
て消化を行なった。電気泳動後に０.６％アガロースゲ
ルから〜７１８bpフラグメントを集め、エタノール沈澱
させ、ＴＥ１０μlに再懸濁した。

【０１５０】Ｂ．プラスミドpＬ２３１構成成分のライ
ゲーションプラスミドpＢＷ３３の〜５０bp ＸbaＩ−ＸhoＩＩフラ
グメント、プラスミドpＢＷ４６の〜４.７kb ＸbaＩ−
ＳstＩフラグメント、およびmp１８ＢＷ５２の〜７１８
bp ＢglＩＩ−ＳstＩフラグメントをライゲートし、プ
ラスミドpＬ２３１を得た。pＢＷ３３のＸhoＩＩ消化お
よびmp１８ＢＷ５２のＢglＩＩ消化から得られた粘着末
端は相補的であり、プラスミドpＬ２３１のみが前記構
成成分のライゲーションに由来する。ライゲーション混
合物は、pＢＷ３３ＸbaＩ−ＸhoＩＩフラグメント〜
１.５μl、pＢＷ４６ＸbaＩ−ＳstＩフラグメント〜１
０μl、mp１８ＢＷ５／ＢglＩＩ−ＳstＩフラグメント
〜１０μl、０.１mg／ml ＢＳＡ、８３mＭＡＴＰ、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ(ＮＥＢ)〜３Ｕを含有し、水を加え
て６０μlの終容量を得た。ライゲーション反応を１５
℃で一夜、進行させた。

【０１５１】Ｃ．Ｅ.coli Ｋ１２ＲＶ３０８／pＬ２３
１の構築実施例３５Ｂのライゲーション混合物を使用し、コンピ
テントなＥ.coli Ｋ１２を形質転換した。次に、得られ
たＥ.coli Ｋ１２ＲＶ３０８／pＬ２３１を２ＸＹＴ
培地で培養した。バクトトリプトン１６g、バクト−酵
母エキス１０g、およびＮaＣｌ５gを蒸留水９００mlに
溶解することによって、２ＸＹＴ培地を調製した。培
地のpＨをＮaＯＨで７.０に調節し、その後、Ｈ₂Ｏで容
量を１Ｌに調節した。次に、１５／lb／in²で２０分間
オートクレーブ処理することによって、培地を滅菌し
た。プラスミドpＬ２３１は、それらが全て熱誘導可能
であり、ラムダpＬプロモーターによって制御される発
現系であり、選択可能なマーカーとしてテトラサイクリ
ン耐性を利用するという点で、t−ＰＡ３(pＢＷ４６)お
よびt−ＰＡ４(pＬ２１９)のために使用した発現ベクタ
ーに類似している。t−ＰＡ−６およびt−ＰＡ−４、ま
たはt−ＰＡ−３の発現は、本明細書に記載された発現
系を十分な細胞量が集積するまで２ＸＹＴ培地または
当業者周知のその他のこの様な培地で培養し、その後、
温度を４２℃に上昇させればよい。発現ベクターを有さ
ず、従って抗生物質耐性を失っているＥ.coliの外殖を
防ぐために、培地にテトラサイクリンを加えるのが好ま
しい。

【０１５２】実施例３２スルフィトリシス法以下の様にして、尿素スルフィトリシス溶液を調製し
た。トリス(６.０６g／Ｌ)、テトラチオン酸カリウム
(３.９３g／Ｌ)、無水亜硫酸ナトリウム(１２.６g／Ｌ)
およびＥＤＴＡ(０.５７g／Ｌ)を冷脱イオン尿素(７Ｍ)
に加え、溶液をpＨ８.５に調節する。顆粒由来の蛋白の
溶液を、蛋白１グラム当たり１Ｌのスルフィトリシス溶
液で希釈した。次に、この溶液を４℃で一夜、穏やかに
撹拌した。

【０１５３】実施例３３イオン交換による精製スルフィトリシスしたt−ＰＡ−６の精製のために、フ
ァースト・フローＱ(Fast Flow Q, Pharmacia)クロマト
グラフィーを使用した。クロマトグラフィーの交換、洗
浄および溶離期のために、４０ml／cm²／時の流速を使
用した。精製工程の前に、以後、平衡化緩衝液と呼ぶ７
Ｍ尿素中５０mＭトリス、pＨ８.５でカラムを平衡化し
た。

【０１５４】クロマトグラフィー精製の前に、スルフィ
トリシスしたt−ＰＡ−６の濾液の伝導度を調べ、必要
に応じ、７Ｍ尿素で希釈することによって伝導度を２５
００uＭＨＯＳまで低下させた。伝導度が２５００uＭＨ
ＯＳの好ましい範囲に設定されたら、pＨを測定し、８.
４５〜８.５５の好ましい範囲に調節した。

【０１５５】試料をカラムに負荷し、次に、カラムの１
倍容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した。平衡化緩衝
液中０〜０.６ＭＮaＣlの直線状塩グラジエントを使用
し、カラムからt−ＰＡ−６を溶離させた。画分を集
め、これらが十分な蛋白濃度を有している場合、これら
をプールした。フィブリン・プレート検定を使用して、
フィブリン溶解活性を調べた。

【０１５６】実施例３４２ステップ蛋白折り畳み法 t−ＰＡ−６の折り畳み法における第１ステップのため
の出発物質をフルフィトリシスし(実施例３２)、イオン
交換によってt−ＰＡ−６を精製した(実施例３３)。ス
ルフィトリシスされたt−ＰＡ−６を、７Ｍ尿素の使用
により、クロマトグラフィー溶出溶液(７Ｍ尿素、５０m
Ｍトリス、変動濃度のＮaＣl)から約１０μg／mlの終濃
度まで希釈した。試薬を加えて、以下の終濃度：７Ｍ尿
素、５０mＭトリス、０.１５Ｍリジン一塩酸塩、７mＭ
システイン一塩酸塩、０.２ＭＮaＣl、１mＭＮa₂ＥＤ
ＴＡを得、ＮaＯＨを加えてpＨを９.２に調節した。

【０１５７】ステップ１の試料を５０mＭトリス、８０m
Ｍリジン一塩酸塩、２mＭシステイン一塩酸塩で１：２
に希釈することによってステップ２の折り畳み工程を開
始し、この折り畳み溶液をpＨ９.２に調節した。ステッ
プ２の折り畳み工程は、約４℃で約１６時間穏やかに撹
拌した。

【０１５８】実施例３５ t−ＰＡ−６の折り畳み効率
に対する透析および２ステップ折り畳み法の比較実質上、実施例３３の教示に従い、２ステップ法を行っ
た。比較のために、ステップ１の混合物の試料を、ステ
ップ１の緩衝液(７Ｍ尿素、５０mＭトリス、０.１５Ｍ
リジン一塩酸塩、７mＭシステイン一塩酸塩、０.２Ｍ
ＮaＣl、１mＭＮａ₂ＥＤＴＡ、pＨ９.２)１部、および
ステップ２の緩衝液(５０mＭトリス、８０mＭリジン一
塩酸塩、および２mＭシステイン一塩酸塩、pＨ９.２)２
部からなる緩衝液に対して透析した。８,０００ＭＷで
カットオフする透析チューブを使用し、透析を４℃で約
１６時間(一夜)行なった。この実施例の結果を表１に示
す。

【０１５９】実施例３６２ステップ折り畳み法におけ
る至適尿素濃度Ａ．２ステップ折り畳み法の第１ステップにおける尿素
濃度の影響実質上、実施例３４の教示に従い、蛋白折り畳み法を使
用して、２ステップ法のそれぞれのステップのための至
適尿素濃度を調べた。第１ステップにおける尿素濃度、
７Ｍ、４Ｍおよび１Ｍを、折り畳み効率に対するその効
果について評価した。評価したそれぞれの尿素濃度は、
更に５０mＭトリス、０.１５Ｍリジン一塩酸塩、７mＭ
システイン一塩酸塩、０.２ＭＮaＣl、１mＭＮa₂ＥＤ
ＴＡ、pＨ９.２を含有するように処方した。第１ステッ
プが終了したら、第２ステップの通常の条件下に、種々
の尿素濃度の試料を折り畳んだ。

【０１６０】Ｂ．２ステップ折り畳み法の第２ステップ
における尿素濃度の影響イオン交換によって精製し、スルフィトリシスしたt−
ＰＡ−６Ａを、７Ｍ尿素、５０mＭトリス、０.１５Ｍリ
ジン一塩酸塩、７mＭシステイン一塩酸塩、０.２ＭＮa
Ｃl、１mＭＮa₂ＥＤＴＡ、pＨ９.２中、６μg／mlの終
濃度に希釈した。この第１ステップ試料を穏やかに撹拌
しながら約４℃で約１６時間インキュベートした。第１
ステップの後、t−ＰＡ−６Ａ混合物を種々の量の第２
ステップ緩衝液(５０mＭトリス、８０mＭリジン一塩酸
塩、および２mＭシステイン一塩酸塩、pＨ９.２)で希釈
し、尿素濃度の範囲を得た。２ステップ法の第２ステッ
プにおける折り畳み効率のために評価した尿素濃度は、
０.１４Ｍ、０.３５Ｍ、０.５６Ｍ、０.７０Ｍ、１.０
５Ｍ、１.４Ｍ、１.７５Ｍ、２.１Ｍ、２.４５Ｍ、２.
８Ｍ、３.１５Ｍ、３.５Ｍ、３.８５Ｍ、４.２Ｍ、４.
５５Ｍ、４.９Ｍ、５.２５Ｍ、５.６Ｍ、５.９５Ｍ、
６.３Ｍ、６.６５Ｍ、７.０Ｍであった。前記の尿素濃
度を含有している各試料に更に、５０mＭトリス、８０m
Ｍリジン一塩酸塩、および２mＭシステイン一塩酸塩を
含有させた。即ち、この実施例の全ての態様は、種々の
尿素濃度を折り畳み法の第２ステップで評価した以外、
実施例３４の教示と同様にして行なった。この研究の結
果を図２５に示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトｔ−ＰＡのアミノ酸配列を示す模式図で
ある。

【図２】プラスミドｐｔＰＡ１０２の制限部位及び機
能地図である。

【図３】プラスミドｐｔＰＡ１０３の制限部位及び機
能地図である。

【図４】プラスミドｐＵＣ１９ＴＰＡＦＥの制限部
位及び機能地図である。

【図５】プラスミドｐＢＷ２８の制限部位及び機能地
図である。

【図６】プラスミドｐｔＰＡ３０１の制限部位及び機
能地図である。

【図７】プラスミドｐｔＰＡ３０３の制限部位及び機
能地図である。

【図８】プラスミドｐＢＷ３２の制限部位及び機能地
図である。

【図９】プラスミドｐＢＷ３３、３５、３６の制限部
位及び機能地図である。

【図１０】プラスミドｐＣＺ１０６の制限部位及び機
能地図である。

【図１１】プラスミドｐＫＣ２８３の制限部位及び機
能地図である。

【図１２】プラスミドｐＫＳ２８３−ＰＸの制限部位
及び機能地図である。

【図１３】プラスミドｐＫＣ２８３−Ｌの制限部位及
び機能地図である。

【図１４】プラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢの制限部位
及び機能地図である。

【図１５】プラスミドｐＫＣ２８３−ＰＲＳの制限部
位及び機能地図である。

【図１６】プラスミドｐＬ３２の制限部位及び機能地
図である。

【図１７】プラスミドｐＬ４７の制限部位及び機能地
図である。

【図１８】プラスミドｐＬ８４の制限部位及び機能地
図である。

【図１９】プラスミドｐＬ９５の制限部位及び機能地
図である。

【図２０】プラスミドｐＲ１２の制限部位及び機能地
図である。

【図２１】プラスミドｐＲ１２ＡＲ１の制限部位及び
機能地図である。

【図２２】プラスミドｐＬ１１０の制限部位及び機能
地図である。

【図２３】プラスミドｐＣＺ１０１の制限部位及び機
能地図である。

【図２４】プラスミドｐＬ２１９の制限部位及び機能
地図である。

【図２５】ｔ−ＰＡ−６活性に及ぼす二段階折り畳み
法の第２段階における尿素濃度の効果を示すグラフであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者キヤロライン・スー・ロベイアメリカ合衆国46219インデイアナ州インデイアナポリス、ノース・オーデユボン・ロード61番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】クリングル−２を含む組織プラスミノー
ゲン活性化因子および組織プラスミノーゲン活性化因子
誘導体を折り畳む方法であって、折り畳み溶液に有効量
のリジンを加えて基質特異的な、酵素的に活性な分子の
収量を増加させることからなる方法。
【請求項２】リジン濃度が約０.０１Ｍ〜約１.５Ｍの
範囲である請求項１に記載の方法。
【請求項３】リジン濃度が約０.０２Ｍ〜約１Ｍの範
囲である請求項２に記載の方法。
【請求項４】リジン濃度が約０.１３Ｍである請求項
３に記載の方法。
【請求項５】組織プラスミノーゲン活性化因子誘導体
がt−ＰＡ−６である請求項４に記載の方法。
【請求項６】更に、(a) ｔ−ＰＡまたはｔ−ＰＡ誘導
体の二次及び三次構造を破壊するに充分な濃度の尿素中
に該ｔ−ＰＡまたはｔ−ＰＡ誘導体の溶液を作成し、そ
して(b) ステップ(a)の溶液を希釈して、該ｔ−ＰＡま
たはｔ−ＰＡ誘導体が基質特異的な、酵素的に活性な分
子にさらに折り畳まれるのを助ける第二の環境を作り出
すことを含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】ステップ(a)における尿素濃度が約５Ｍ
〜８Ｍである請求項７に記載の方法。
【請求項８】尿素濃度が約７Ｍである請求項７に記載
の方法。
【請求項９】有効濃度のリジンが折り畳み法の第２ス
テップにのみ存在する請求項７に記載の方法。
【請求項１０】リジン濃度が約０.１３Ｍである請求
項６に記載の方法。
【請求項１１】 t−ＰＡ誘導体がt−ＰＡ−６である請
求項１０に記載の方法。