JPH0564582A - アンモニア酸化細菌およびその増殖法 - Google Patents
アンモニア酸化細菌およびその増殖法Info
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- JPH0564582A JPH0564582A JP25453391A JP25453391A JPH0564582A JP H0564582 A JPH0564582 A JP H0564582A JP 25453391 A JP25453391 A JP 25453391A JP 25453391 A JP25453391 A JP 25453391A JP H0564582 A JPH0564582 A JP H0564582A
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- Japan
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- culture medium
- medium
- nitrosomonas
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、ＧＣ含量が４８．０±０．２％で
ある新規なニトロソモナス属細菌である。 【効果】 本発明によるニトロソモナス属細菌は、高い
増殖能を有するアンモニア酸化細菌であり、かつ、リン
酸濃度が高い環境や低温もしくは高温の環境にあっても
依然として高い増殖能を有する。
ある新規なニトロソモナス属細菌である。 【効果】 本発明によるニトロソモナス属細菌は、高い
増殖能を有するアンモニア酸化細菌であり、かつ、リン
酸濃度が高い環境や低温もしくは高温の環境にあっても
依然として高い増殖能を有する。
Description
【０００１】［発明の背景］
【産業上の利用分野】本発明は新規なアンモニア酸化細
菌に関し、特に高濃度のリン酸を含む培地や低温の環境
においても増殖能にすぐれた新規なアンモニア酸化細菌
に関する。
菌に関し、特に高濃度のリン酸を含む培地や低温の環境
においても増殖能にすぐれた新規なアンモニア酸化細菌
に関する。
【０００２】
【従来の技術】アンモニア酸化細菌は硝化細菌の一種で
あって、排水処理における窒素除去に必須の細菌であ
る。
あって、排水処理における窒素除去に必須の細菌であ
る。
【０００３】しかしながら、実際の廃水処理においては
アンモニア酸化細菌の増殖速度が一般的に低いため、硝
化工程が窒素除去系の律速段階となってしまうことが多
かった。増殖速度が低くなってしまう原因には、菌体自
身の増殖能が低いことに加え、アンモニア酸化細菌の増
殖にともなって培地中に蓄積した亜硝酸が培地のｐＨを
低下させ、増殖の阻害を引き起こしてしまうことがあげ
られる。このｐＨの低下による増殖阻害を防ぐ方法とし
て、アルカリを加えることでｐＨを中性付近に保つこと
も考えられるが、装置が複雑となりまたその操作も煩雑
化する。従って、実際の排水処理システムには、広いｐ
Ｈにおいて増殖可能なアンモニア酸化細菌を存在させる
のが有利といえる。さらに、家庭排水などを処理する浄
化槽には、低温から高温にいたる比較的広い温度範囲に
あって高い増殖速度を有するアンモニア酸化細菌が有利
であるといえる。
アンモニア酸化細菌の増殖速度が一般的に低いため、硝
化工程が窒素除去系の律速段階となってしまうことが多
かった。増殖速度が低くなってしまう原因には、菌体自
身の増殖能が低いことに加え、アンモニア酸化細菌の増
殖にともなって培地中に蓄積した亜硝酸が培地のｐＨを
低下させ、増殖の阻害を引き起こしてしまうことがあげ
られる。このｐＨの低下による増殖阻害を防ぐ方法とし
て、アルカリを加えることでｐＨを中性付近に保つこと
も考えられるが、装置が複雑となりまたその操作も煩雑
化する。従って、実際の排水処理システムには、広いｐ
Ｈにおいて増殖可能なアンモニア酸化細菌を存在させる
のが有利といえる。さらに、家庭排水などを処理する浄
化槽には、低温から高温にいたる比較的広い温度範囲に
あって高い増殖速度を有するアンモニア酸化細菌が有利
であるといえる。
【０００４】さらに、実際の排水浄化システムにアンモ
ニア酸化細菌を導入する際には、大量の菌体をその増殖
によって準備しなければならない。その効率のよい増殖
のためには培地のｐＨの低下を防ぐのが望ましいといえ
る。その手段として緩衝液を培地に添加することも考え
られるが、比較的安価なリン酸塩を用いると、高濃度の
リン酸もまたアンモニア酸化細菌の増殖を阻害してしま
う。従って、排水処理システムに導入されるアンモニア
酸化細菌にあっては、高リン酸濃度の培地でも高い増殖
能を有するものが有利であるといえる。
ニア酸化細菌を導入する際には、大量の菌体をその増殖
によって準備しなければならない。その効率のよい増殖
のためには培地のｐＨの低下を防ぐのが望ましいといえ
る。その手段として緩衝液を培地に添加することも考え
られるが、比較的安価なリン酸塩を用いると、高濃度の
リン酸もまたアンモニア酸化細菌の増殖を阻害してしま
う。従って、排水処理システムに導入されるアンモニア
酸化細菌にあっては、高リン酸濃度の培地でも高い増殖
能を有するものが有利であるといえる。
【０００５】［発明の概要］
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは高い増殖
能を有するアンモニア酸化細菌をもとめ探索を行ってき
た。その結果、今般、広範な温度およびｐＨ領域におい
て、さらにリン酸濃度が高い環境において、高い増殖能
を有する新規なアンモニア酸化細菌を見出し、本発明を
完成した。
能を有するアンモニア酸化細菌をもとめ探索を行ってき
た。その結果、今般、広範な温度およびｐＨ領域におい
て、さらにリン酸濃度が高い環境において、高い増殖能
を有する新規なアンモニア酸化細菌を見出し、本発明を
完成した。
【０００６】従って本発明は、広範な温度およびｐＨに
おいて高い増殖能を有するアンモニア酸化細菌を提供す
ることを目的としている。
おいて高い増殖能を有するアンモニア酸化細菌を提供す
ることを目的としている。
【０００７】さらに本発明は、リン酸濃度が高い培地に
おいても依然として高い増殖能を有するアンモニア酸化
細菌を提供することを目的としている。
おいても依然として高い増殖能を有するアンモニア酸化
細菌を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】前記目的は、本発明によ
る細菌であるＧＣ含量が４８．０±０．２％であるニト
ロソモナスｓｐによって達成される。
る細菌であるＧＣ含量が４８．０±０．２％であるニト
ロソモナスｓｐによって達成される。
【０００９】［発明の具体的説明］微生物の寄託 本発明による微生物は、合併処理浄化槽の曝気槽内の生
物膜から分離、採取された新菌株である。この菌株は後
述する菌学的性質をもとに、Bergey's Manualof System
atic Bacteriology，vol 3 (1989)を参考にして同定さ
れ、ニトロソモナス属に属するがその公知種には属さな
い細菌であることから、ニトロソモナス（Nitrosomonas
)ｓｐ ＴＯＣＣ０００２株と命名した。この菌株は受
託番号「微工研菌寄第１１９９７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１
１９９７」）のもとに、工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されている。
物膜から分離、採取された新菌株である。この菌株は後
述する菌学的性質をもとに、Bergey's Manualof System
atic Bacteriology，vol 3 (1989)を参考にして同定さ
れ、ニトロソモナス属に属するがその公知種には属さな
い細菌であることから、ニトロソモナス（Nitrosomonas
)ｓｐ ＴＯＣＣ０００２株と命名した。この菌株は受
託番号「微工研菌寄第１１９９７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１
１９９７」）のもとに、工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されている。
【００１０】菌学的性質 本発明によるニトロソモナスｓｐ ＴＯＣＣ０００２株
の菌学的性質を列挙すれば次の通りである。 Ｉ．形態的性質 １．細胞の形および大きさ：短桿菌（約０．７−０．８
μｍ×１．０−１．２μｍ） ２．細胞膜の性質：細胞周囲に多層状のラメラ構造とし
て存在 ３．細胞の多形成の有無：単独の細胞として存在する ４．運動性の有無（鞭毛の着生状態）：あり ５．胞子の有無：なし ６．グラム染色性：陰性
の菌学的性質を列挙すれば次の通りである。 Ｉ．形態的性質 １．細胞の形および大きさ：短桿菌（約０．７−０．８
μｍ×１．０−１．２μｍ） ２．細胞膜の性質：細胞周囲に多層状のラメラ構造とし
て存在 ３．細胞の多形成の有無：単独の細胞として存在する ４．運動性の有無（鞭毛の着生状態）：あり ５．胞子の有無：なし ６．グラム染色性：陰性
【００１１】II．生理学的性質： １．増殖のエネルギー・炭素源 (１) アンモニア：利用する（アンモニアを亜硝酸へ酸
化する） (２) 尿素：利用しない (３) 炭酸ガス：利用する (４) 炭酸イオン：利用する (５) 重炭酸イオン：利用する (６) 糖：利用しない (７) 蛋白質：利用しない ２．生育の範囲 (１) ｐＨ：６．３−８．７ (２) 温度：１０−３３℃ ３．酸素に対する態度：絶対好気性
化する） (２) 尿素：利用しない (３) 炭酸ガス：利用する (４) 炭酸イオン：利用する (５) 重炭酸イオン：利用する (６) 糖：利用しない (７) 蛋白質：利用しない ２．生育の範囲 (１) ｐＨ：６．３−８．７ (２) 温度：１０−３３℃ ３．酸素に対する態度：絶対好気性
【００１２】III ．その他の性質 (１) 菌体内ＤＮＡのＧＣ含量（％）：４８．５±０．
２ (２) 寒天培地での増殖は可能であるが、その他の有機
物を主成分とする培地では培養は一般に困難
２ (２) 寒天培地での増殖は可能であるが、その他の有機
物を主成分とする培地では培養は一般に困難
【００１３】菌株の同定 次に本発明による菌株をニトロソモナス属に属する菌株
であると同定した根拠を以下に示す。本菌株は上記菌学
的性質が示すように「アンモニアの亜硝酸への酸化を行
い、短桿菌、運動性があり、細胞周囲にラメラ構造とし
て存在する細胞膜を有し、ＧＣ含量（％）が４８．５±
０．２である」などの特徴を有する。このような細菌
は、前記したBergey's Manual によればニトロソモナス
属に属するとするのが適当である。
であると同定した根拠を以下に示す。本菌株は上記菌学
的性質が示すように「アンモニアの亜硝酸への酸化を行
い、短桿菌、運動性があり、細胞周囲にラメラ構造とし
て存在する細胞膜を有し、ＧＣ含量（％）が４８．５±
０．２である」などの特徴を有する。このような細菌
は、前記したBergey's Manual によればニトロソモナス
属に属するとするのが適当である。
【００１４】次に本発明による菌株を公知のニトロソモ
ナス属細菌と、(i)ＤＮＡ ＧＣ含量、(ii)ＤＮＡ−Ｄ
ＮＡハイブリダイセーションについて比較した（実験の
詳細は後記実施例参照）。その結果、ＧＣ含量において
本発明による菌株は、ＩＦＯ１４２９８株より１．５
％、ＡＴＣＣ２５９７８株より２．４％低い値を示し
た。また、ＤＮＡの相同性は本発明による菌株と前記公
知株とでは１５〜２７％程度に過ぎないことがわかっ
た。従って、本発明による菌株は、ニトロソモナス属の
公知種に属するものとは認められないと結論した。
ナス属細菌と、(i)ＤＮＡ ＧＣ含量、(ii)ＤＮＡ−Ｄ
ＮＡハイブリダイセーションについて比較した（実験の
詳細は後記実施例参照）。その結果、ＧＣ含量において
本発明による菌株は、ＩＦＯ１４２９８株より１．５
％、ＡＴＣＣ２５９７８株より２．４％低い値を示し
た。また、ＤＮＡの相同性は本発明による菌株と前記公
知株とでは１５〜２７％程度に過ぎないことがわかっ
た。従って、本発明による菌株は、ニトロソモナス属の
公知種に属するものとは認められないと結論した。
【００１５】培養条件 本発明によるニトロソモナス属細菌の培養は、その基質
となるアンモニアが存在する限りにおいて、培地の種類
および培養条件を含め合目的的な任意のものでありうる
（培地および培養条件の好ましい具体例については後記
実験例参照）。培地の栄養源としては、本発明による細
菌が同化しうるあらゆるものが利用可能である。例え
ば、培地中にＮＨ４ ＋（ＮＨ３）、二酸化炭素、酸素、
リン、銅、カリウムおよびナトリウムを必須栄養源とし
て存在させるのが好ましい。更に微量栄養源として、マ
グネシウム、マンガン、モリブデン、カルシウム、鉄な
どを培地に添加することも好ましい。培養温度は１０−
３３℃、好ましくは２８℃であり、培養ｐＨは６．３−
８．７、好ましくは７．５−８．１である。
となるアンモニアが存在する限りにおいて、培地の種類
および培養条件を含め合目的的な任意のものでありうる
（培地および培養条件の好ましい具体例については後記
実験例参照）。培地の栄養源としては、本発明による細
菌が同化しうるあらゆるものが利用可能である。例え
ば、培地中にＮＨ４ ＋（ＮＨ３）、二酸化炭素、酸素、
リン、銅、カリウムおよびナトリウムを必須栄養源とし
て存在させるのが好ましい。更に微量栄養源として、マ
グネシウム、マンガン、モリブデン、カルシウム、鉄な
どを培地に添加することも好ましい。培養温度は１０−
３３℃、好ましくは２８℃であり、培養ｐＨは６．３−
８．７、好ましくは７．５−８．１である。
【００１６】アンモニア酸化能 本発明によるニトロソモナス属細菌は好気的条件下で下
記の反応式のとおりアンモニアを亜硝酸に酸化するアン
モニア酸化細菌である。 ＮＨ４＋＋１．５Ｏ２ → ＮＯ２ −＋Ｈ２Ｏ＋２Ｈ＋ 本発明による細菌は、広い温度領域において優れた増殖
を示す。例えば、低温領域にあっては１５℃以下の温度
においても増殖可能である。特に１０℃において０．０
０３／時、場合によっては０．００３５／時以上、の比
増殖速度を示すことは、低温での排水処理に非常に有利
である。また、比較的高温の領域でも本発明による細菌
は優れた増殖を示す。例えば、２８℃において０．０３
／時以上、場合によっては０．０４／時以上、の比増殖
速度を示す。
記の反応式のとおりアンモニアを亜硝酸に酸化するアン
モニア酸化細菌である。 ＮＨ４＋＋１．５Ｏ２ → ＮＯ２ −＋Ｈ２Ｏ＋２Ｈ＋ 本発明による細菌は、広い温度領域において優れた増殖
を示す。例えば、低温領域にあっては１５℃以下の温度
においても増殖可能である。特に１０℃において０．０
０３／時、場合によっては０．００３５／時以上、の比
増殖速度を示すことは、低温での排水処理に非常に有利
である。また、比較的高温の領域でも本発明による細菌
は優れた増殖を示す。例えば、２８℃において０．０３
／時以上、場合によっては０．０４／時以上、の比増殖
速度を示す。
【００１７】さらに本発明による細菌はリン酸濃度が高
濃度の環境にあっても優れた増殖を示す。例えば、リン
酸濃度が１００〜２００ｍＭ以上の培地にあっても本発
明による細菌は上記した増殖能を有する。このことは、
前記したアンモニア酸化によって生成する亜硝酸による
ｐＨの低下を防ぐため低廉なリン酸緩衝液を利用するこ
とができる点で有利である。
濃度の環境にあっても優れた増殖を示す。例えば、リン
酸濃度が１００〜２００ｍＭ以上の培地にあっても本発
明による細菌は上記した増殖能を有する。このことは、
前記したアンモニア酸化によって生成する亜硝酸による
ｐＨの低下を防ぐため低廉なリン酸緩衝液を利用するこ
とができる点で有利である。
【００１８】また、本発明による細菌は広いｐＨ領域で
その増殖を行うことができる。例えば、本発明による細
菌はｐＨが６．５以下の領域においても増殖し、ｐＨ
６．５における比増殖速度は約０．０２／時を示す。ま
た、本発明による細菌は、高ｐＨ領域、例えばｐＨ８．
５以上、の領域においても増殖し、ｐＨ８．５における
比増殖速度は約０．０１／時以上を示す。
その増殖を行うことができる。例えば、本発明による細
菌はｐＨが６．５以下の領域においても増殖し、ｐＨ
６．５における比増殖速度は約０．０２／時を示す。ま
た、本発明による細菌は、高ｐＨ領域、例えばｐＨ８．
５以上、の領域においても増殖し、ｐＨ８．５における
比増殖速度は約０．０１／時以上を示す。
【００１９】
［実験例］実施例１ 菌株の取得 (１) 集積培養 分離源として、合併処理浄化槽の曝気槽内の生物膜を用
意した。生物膜を下記の組成の集積培地に分散した。な
お、この集積培地はHooper及びNason による培地（J. B
iol. Chem.(1965), vol 240, p4044-4057 ）を、山中ら
（山中建生著、微生物のエネルギー代謝（1986）、学会
出版センター）が改変したものである。
意した。生物膜を下記の組成の集積培地に分散した。な
お、この集積培地はHooper及びNason による培地（J. B
iol. Chem.(1965), vol 240, p4044-4057 ）を、山中ら
（山中建生著、微生物のエネルギー代謝（1986）、学会
出版センター）が改変したものである。
【００２０】集積培地の培地組成 リン酸水素二ナトリウム・１２水塩 ３３．８ ｇ リン酸一カリウム ０．７７ｇ 硫酸アンモニウム ２．５ ｇ 硫酸銅・５水和物 ０．５ｍｇ （以上、１２１℃で１５分間加圧滅菌したもの） Ｍｅｔａｌ ｍｉｘｔｕｒｅ＊ １ml（１リッ
トルあたり） ＊Ｍｅｔａｌ ｍｉｘｔｕｒｅとは、以下の (a)約８０
０mlおよび (b)約２００mlを別々に調製し、別々にオー
トクレーブした後に混合して全量１０００mlとしたもの
をいい、培養開始前に濾過滅菌して加えた。
トルあたり） ＊Ｍｅｔａｌ ｍｉｘｔｕｒｅとは、以下の (a)約８０
０mlおよび (b)約２００mlを別々に調製し、別々にオー
トクレーブした後に混合して全量１０００mlとしたもの
をいい、培養開始前に濾過滅菌して加えた。
【００２１】 (a)硫酸マグネシウム・７水塩 １０ｇ 硫酸マンガン・４−６水塩 ２ｇ モリブデン酸アンモニウム ５ｍｇ 塩化カルシウム・２水塩 ２ｇ (b)ＥＤＤＨＡ １ｇ （Ethylenediamine-di(o-hydroxyphenylacetic acid ） 塩化第二鉄・６水塩 ０．５ｇ 培養は、２０℃、１５０ｒｐｍの回転振盪培養により行
った。十分量の亜硝酸（ＮＯ２−Ｎで２００ｍｇ／Ｌ）
が生成したところで、新鮮な培地に継代培養した。この
ときの接種率は５％であった。以上の操作を亜硝酸の生
成速度が最大になり安定するまで行った。なお、亜硝酸
の定量はイオンクロマトグラフを用いて行った。
った。十分量の亜硝酸（ＮＯ２−Ｎで２００ｍｇ／Ｌ）
が生成したところで、新鮮な培地に継代培養した。この
ときの接種率は５％であった。以上の操作を亜硝酸の生
成速度が最大になり安定するまで行った。なお、亜硝酸
の定量はイオンクロマトグラフを用いて行った。
【００２２】(２) 系統希釈法による分離 次に、以上の集積培養物より１０倍希釈を繰り返すこと
で１０-n希釈系列を作る。この希釈液を下記の組成の培
地に接種した。
で１０-n希釈系列を作る。この希釈液を下記の組成の培
地に接種した。
【００２３】 硫酸アンモニウム ０．５ｇ 塩化ナトリウム ０．３ｇ リン酸二カリウム １．０ｇ 硫酸マグネシウム・７水塩 ０．３ｇ 硫酸第一鉄・７水塩 ０．０３ｇ 炭酸カルシウム ７．５ｇ （以上、１２１℃で１５分間加圧滅菌した） 培養により亜硝酸の生成が認められたものの中から最も
高い希釈度の希釈液を接種した培養物を選び出した。こ
うして得られた培養物中の従属栄養微生物の混在の有無
を以下の培地で培養することにより確認した。
高い希釈度の希釈液を接種した培養物を選び出した。こ
うして得られた培養物中の従属栄養微生物の混在の有無
を以下の培地で培養することにより確認した。
【００２４】 Nutrient broth (Difco) ２ｇ Bacto Agar (Difco) １２ｇ （以上、１２１℃で１５分間加熱滅菌した） 以上の培地での２０℃、一週間以上の培養後に、コロニ
ー形成が認められないものを硝化細菌のみからなる培養
物とした。
ー形成が認められないものを硝化細菌のみからなる培養
物とした。
【００２５】(３) コロニー分離による硝化細菌の純粋
分離 単一の硝化細菌細胞由来の純粋分離株の取得のために更
に平板培地上でのコロニー形成とその分離を行った。平
板培地の作成は次のように行った。すなわち、２倍濃度
の前記 (１) の集積培地１容、２％寒天１容を、１２１
℃、１５分間加圧滅菌した後、７０℃まで冷却し、この
混合物1000mlに対し前記Ｍｅｔａｌ ｍｉｘｔｕｒｅを
１ml加え混合した。これをシャーレに分注し、寒天を固
化させた後、前記 (２) で得た硝化細菌の培養物を適当
に希釈して広げた。２０℃で２週間以上培養した後に形
成されたコロニーを釣菌し、前記前記 (１) の集積培地
に移植した。こうして得られた分離株は単一の細胞由来
の遺伝的に純系の分離株である。
分離 単一の硝化細菌細胞由来の純粋分離株の取得のために更
に平板培地上でのコロニー形成とその分離を行った。平
板培地の作成は次のように行った。すなわち、２倍濃度
の前記 (１) の集積培地１容、２％寒天１容を、１２１
℃、１５分間加圧滅菌した後、７０℃まで冷却し、この
混合物1000mlに対し前記Ｍｅｔａｌ ｍｉｘｔｕｒｅを
１ml加え混合した。これをシャーレに分注し、寒天を固
化させた後、前記 (２) で得た硝化細菌の培養物を適当
に希釈して広げた。２０℃で２週間以上培養した後に形
成されたコロニーを釣菌し、前記前記 (１) の集積培地
に移植した。こうして得られた分離株は単一の細胞由来
の遺伝的に純系の分離株である。
【００２６】(４) 菌体収量 前記 (１) の集積培地を用いて菌体を増殖させた場合の
菌体収量を次のように測定した。まず、前記 (３) で得
た菌体を接種率５％で前記集積培地に接種し、２８℃で
１５０rpm の回転振盪培養に付した。１２０時間培養
後、菌体を０．２２μｍのメンブランフィルター上に集
めた。純水で培地成分を洗い出し、１０５℃で２時間乾
燥した後、その重量を測定した。また、同一の条件でＩ
ＦＯ１４２９８株を培養した。菌体の収量は、前記
(３) で得た菌体の場合１５．２mg、ＩＦＯ１４２９８
株の場合２．１mgであった。
菌体収量を次のように測定した。まず、前記 (３) で得
た菌体を接種率５％で前記集積培地に接種し、２８℃で
１５０rpm の回転振盪培養に付した。１２０時間培養
後、菌体を０．２２μｍのメンブランフィルター上に集
めた。純水で培地成分を洗い出し、１０５℃で２時間乾
燥した後、その重量を測定した。また、同一の条件でＩ
ＦＯ１４２９８株を培養した。菌体の収量は、前記
(３) で得た菌体の場合１５．２mg、ＩＦＯ１４２９８
株の場合２．１mgであった。
【００２７】実験例２ 透過電子顕微鏡による細胞の内
部構造の観察 細胞をグルタルアルデヒド、オスミウム酸で固定した
後、寒天中に包埋した。寒天を１ｍｍ角のブロック状に
切断し、以下に用いた。前記寒天ブロックを、エタノー
ル、プロピレンオキサイドで脱水し、リンタングステン
酸を用いて予備染色した後、エポキシ樹脂（Epon 812）
に包埋し、６０℃で４８時間重合させた。このようにし
て得た試料をミクロトームを用いて超薄切片を調製し、
その後クエン酸鉛で染色した。こうして得た試料を透過
電子顕微鏡によって観察した。この顕微鏡写真を図１
（ａ）および（ｂ）として示す。
部構造の観察 細胞をグルタルアルデヒド、オスミウム酸で固定した
後、寒天中に包埋した。寒天を１ｍｍ角のブロック状に
切断し、以下に用いた。前記寒天ブロックを、エタノー
ル、プロピレンオキサイドで脱水し、リンタングステン
酸を用いて予備染色した後、エポキシ樹脂（Epon 812）
に包埋し、６０℃で４８時間重合させた。このようにし
て得た試料をミクロトームを用いて超薄切片を調製し、
その後クエン酸鉛で染色した。こうして得た試料を透過
電子顕微鏡によって観察した。この顕微鏡写真を図１
（ａ）および（ｂ）として示す。
【００２８】実験例３ 菌体内ＤＮＡのＧＣ含量の測定 実験例１で得た菌体をリゾチーム、ＳＤＳによって溶菌
し、フェノール、クロロホルムによって蛋白質を変性さ
せて取り除いた後、ＤＮＡをエタノール沈殿させて回収
した。さらに混在するＲＮＡおよび蛋白質を取り除き高
純度のＲＮＡ標品を得るために、ＲＮＡａｓｅ、プロテ
イネーゼＫで処理した後、フェノール処理のよって残存
蛋白質を取り除き、エタノールによってＤＮＡを沈殿回
収した。これをＤＮＡ標品として下記の操作に付した。
し、フェノール、クロロホルムによって蛋白質を変性さ
せて取り除いた後、ＤＮＡをエタノール沈殿させて回収
した。さらに混在するＲＮＡおよび蛋白質を取り除き高
純度のＲＮＡ標品を得るために、ＲＮＡａｓｅ、プロテ
イネーゼＫで処理した後、フェノール処理のよって残存
蛋白質を取り除き、エタノールによってＤＮＡを沈殿回
収した。これをＤＮＡ標品として下記の操作に付した。
【００２９】こうして得たＤＮＡを、１００℃で１５分
間処理し、一本鎖ＤＮＡを調製した。この一本鎖ＤＮＡ
をヌクレアーゼＰ１で処理し、ヌクレオチドとした。更
に、アルカリ性フォスファターゼで処理し、ヌクレオシ
ドとした後にＨＰＬＣを用いて各塩基の含量を測定し
た。標準物質としては、ヌクレオチドスタンダード（ヤ
マサ醤油株式会社製）をアルカリ性フォスファターゼで
処理し、ヌクレオシドとしたものを用いた。なお、ＨＰ
ＬＣの分析条件はカラム：ＳＴＲ ＯＤＳ−Ｈ（島津製
作所）、移動相：０．２Ｍ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４／アセト
ニトリル（４０／１）、温度：４０℃、流量：１．０ml
／min、検出：２７０nmであった。また、ニトロソモナ
ス・ユーロパイア（Nitrosomonas europaea ）ＩＦＯ１
４２９８株およびニトロソモナス・ユウロパイアＡＴＣ
Ｃ２５９７８株の菌体内ＤＮＡのＧＣ含量を同様にして
測定した。それらの結果は、次の表に示される通りであ
る。
間処理し、一本鎖ＤＮＡを調製した。この一本鎖ＤＮＡ
をヌクレアーゼＰ１で処理し、ヌクレオチドとした。更
に、アルカリ性フォスファターゼで処理し、ヌクレオシ
ドとした後にＨＰＬＣを用いて各塩基の含量を測定し
た。標準物質としては、ヌクレオチドスタンダード（ヤ
マサ醤油株式会社製）をアルカリ性フォスファターゼで
処理し、ヌクレオシドとしたものを用いた。なお、ＨＰ
ＬＣの分析条件はカラム：ＳＴＲ ＯＤＳ−Ｈ（島津製
作所）、移動相：０．２Ｍ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４／アセト
ニトリル（４０／１）、温度：４０℃、流量：１．０ml
／min、検出：２７０nmであった。また、ニトロソモナ
ス・ユーロパイア（Nitrosomonas europaea ）ＩＦＯ１
４２９８株およびニトロソモナス・ユウロパイアＡＴＣ
Ｃ２５９７８株の菌体内ＤＮＡのＧＣ含量を同様にして
測定した。それらの結果は、次の表に示される通りであ
る。
【００３０】 第１表 ＧＣ含量 ＴＯＣＣ０００２株 ４８．５±０．２ ＩＦＯ１４２９８株 ４９．５±０．２ ＡＴＣＣ２５９７８株 ５０．９±０．１
【００３１】実験例４ ＤＮＡ相同性 ＤＮＡの相同性は文献記載の方法に従って測定した（駒
形和男編、微生物の化学分類実験法（1982）、学会出版
センター）。すなわち、実験例３で用意したＤＮＡ標品
を１００℃で２０分間処理して一本鎖とした後、ニトロ
セルロース上に８０℃で３時間加熱することによって固
定した。また、 3Ｈ標識プローブはニックトランスレー
ションキット（宝酒造株式会社製）を使用したニックト
ランスレーション法によって調製した。このようにして
得たセルロース上に固定したＤＮＡと 3Ｈ標識プローブ
とを、６８℃で４０〜４８時間ハイブリダイズさせた。
ハイブリダイズしなかったプローブをフィルターから洗
い落とし、放射線活性を液体シンチレーションカウンタ
ーで測定し、相同性をもとめた。
形和男編、微生物の化学分類実験法（1982）、学会出版
センター）。すなわち、実験例３で用意したＤＮＡ標品
を１００℃で２０分間処理して一本鎖とした後、ニトロ
セルロース上に８０℃で３時間加熱することによって固
定した。また、 3Ｈ標識プローブはニックトランスレー
ションキット（宝酒造株式会社製）を使用したニックト
ランスレーション法によって調製した。このようにして
得たセルロース上に固定したＤＮＡと 3Ｈ標識プローブ
とを、６８℃で４０〜４８時間ハイブリダイズさせた。
ハイブリダイズしなかったプローブをフィルターから洗
い落とし、放射線活性を液体シンチレーションカウンタ
ーで測定し、相同性をもとめた。
【００３２】 第２表 ＤＮＡの相同性（％） 標識ＤＮＡ TOCC 0002 IFO 14298 ATCC 25978 非標識ＤＮＡ TOCC 0002 １００ ２７ １６ IFO 14298 １５ １００ ８０ ATCC 25978 １９ ８７ １００
【００３３】実験例５ 比増殖速度の温度依存性 本発明による菌株の比増殖速度の温度依存性を評価する
ため、実験例１で得た菌体を前記実験例１ (１) の集積
培地で培養した。培養時の接種率は５％であり、培養は
１５０ｒｐｍの回転振盪培養により行った。比増殖速度
は、培養温度を１０、１５、２０および２８℃とした時
に生成した亜硝酸量を経時的に測定し、その量の自然対
数をプロットして、その傾きから算出した。なお、亜硝
酸量はイオンクロマトグラフによって定量した。
ため、実験例１で得た菌体を前記実験例１ (１) の集積
培地で培養した。培養時の接種率は５％であり、培養は
１５０ｒｐｍの回転振盪培養により行った。比増殖速度
は、培養温度を１０、１５、２０および２８℃とした時
に生成した亜硝酸量を経時的に測定し、その量の自然対
数をプロットして、その傾きから算出した。なお、亜硝
酸量はイオンクロマトグラフによって定量した。
【００３４】また、同一の条件でＩＦＯ１４２９８株お
よびＡＴＣＣ２５９７８株の増殖速度を測定しようとし
たが、ＡＴＣＣ２５９７８株は、前記実験例１(１) の
集積培地ではリン酸濃度が高いため（前記集積培地のリ
ン酸濃度は１００mmol以上）増殖しなかった。
よびＡＴＣＣ２５９７８株の増殖速度を測定しようとし
たが、ＡＴＣＣ２５９７８株は、前記実験例１(１) の
集積培地ではリン酸濃度が高いため（前記集積培地のリ
ン酸濃度は１００mmol以上）増殖しなかった。
【００３５】比増殖速度と培養温度の関係は図２に示さ
れる通りである。図２から明らかなように、本発明によ
る菌株は公知のニトロソモナス属細菌に比較して大きな
比増殖速度を有する。特に１０℃における比増殖速度
（および世代時間）を比較すると次の表の通りとなり、
従来公知のニトロソモナス属細菌に比較して比較的低温
においても増殖可能な菌株であることが解る。
れる通りである。図２から明らかなように、本発明によ
る菌株は公知のニトロソモナス属細菌に比較して大きな
比増殖速度を有する。特に１０℃における比増殖速度
（および世代時間）を比較すると次の表の通りとなり、
従来公知のニトロソモナス属細菌に比較して比較的低温
においても増殖可能な菌株であることが解る。
【００３６】 第３表 １０℃における比増殖速度と世代時間 ＴＯＣＣ０００２株 ＩＦＯ１４２９８株 比増殖速度（／hr） 0.0035±0.0011 0.0004±0.0003 世代時間（hr） 214.6±51.6 1240.8±96.0
【００３７】実験例６ 比増殖速度のｐＨ依存性 本発明による菌株の比増殖速度のｐＨ依存性を評価する
ため、実験例１で得た菌体を前記実験例１ (１) の集積
培地で培養した。ただし、培地のｐＨはｐＨ６．１−
７．６の領域はリン酸水素二ナトリウム・１２水塩およ
びリン酸一カリウムの比を変えることで、またｐＨ７．
７−８．７の領域はリン酸塩としてリン酸一カリウム５
ｇ／Ｌのみを加えさらに１００ｍＭ ＴＡＰＳを加える
ことでｐＨを変化させた。また、硫酸アンモニウム濃度
はｐＨ変化を最小にするために１ｇ／Ｌとした。培養時
の接種率は５％であり、培養は１５０ｒｐｍの回転振盪
培養により行った。比増殖速度は生成した亜硝酸量を経
時的に測定し、その量の自然対数をプロットして、その
傾きから算出した。なお、亜硝酸量は実験例５と同様に
定量した。また、同一の条件でＩＦＯ１４２９８株の比
増殖速度を測定した。比増殖速度とｐＨの関係は図３に
示される通りである。
ため、実験例１で得た菌体を前記実験例１ (１) の集積
培地で培養した。ただし、培地のｐＨはｐＨ６．１−
７．６の領域はリン酸水素二ナトリウム・１２水塩およ
びリン酸一カリウムの比を変えることで、またｐＨ７．
７−８．７の領域はリン酸塩としてリン酸一カリウム５
ｇ／Ｌのみを加えさらに１００ｍＭ ＴＡＰＳを加える
ことでｐＨを変化させた。また、硫酸アンモニウム濃度
はｐＨ変化を最小にするために１ｇ／Ｌとした。培養時
の接種率は５％であり、培養は１５０ｒｐｍの回転振盪
培養により行った。比増殖速度は生成した亜硝酸量を経
時的に測定し、その量の自然対数をプロットして、その
傾きから算出した。なお、亜硝酸量は実験例５と同様に
定量した。また、同一の条件でＩＦＯ１４２９８株の比
増殖速度を測定した。比増殖速度とｐＨの関係は図３に
示される通りである。
【００３８】実験例７ リン酸高濃度培地での増殖能 前記実験例１ (１) の集積培地の培地組成をすべて２倍
濃度にして調製した培地（リン酸濃度は約２００ｍＭ）
で増殖させ、生成する亜硝酸量を測定した。なお、培地
のｐＨは７．８であり、培養温度は２８℃であった。ま
た、同一の条件でＩＦＯ１４２９８株の増殖し、生成す
る亜硝酸量を測定した。培養時間と亜硝酸量の関係は図
４に示される通りである。本発明による菌体は、高リン
酸濃度の培地にあっても増殖阻害を受けず、増殖可能で
あることが解る。
濃度にして調製した培地（リン酸濃度は約２００ｍＭ）
で増殖させ、生成する亜硝酸量を測定した。なお、培地
のｐＨは７．８であり、培養温度は２８℃であった。ま
た、同一の条件でＩＦＯ１４２９８株の増殖し、生成す
る亜硝酸量を測定した。培養時間と亜硝酸量の関係は図
４に示される通りである。本発明による菌体は、高リン
酸濃度の培地にあっても増殖阻害を受けず、増殖可能で
あることが解る。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による細菌の生物の形態を示す電子顕微
鏡写真。
鏡写真。
【図２】本発明による細菌の比増殖速度と培養温度の関
係を示す図。
係を示す図。
【図３】本発明による細菌の比増殖速度とｐＨの関係を
示す図。
示す図。
【図４】リン酸濃度が２００ｍＭである培地における本
発明による細菌の培養時間と生成する亜硝酸の量の関係
を示す図。
発明による細菌の培養時間と生成する亜硝酸の量の関係
を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 野 口 朋 子 福岡県北九州市小倉北区中島２丁目１番１ 号 東陶機器株式会社内 (72)発明者 河 野 秀 平 福岡県北九州市小倉北区中島２丁目１番１ 号 東陶機器株式会社内
Claims (6)
- 【請求項１】ＧＣ含量が４８．０±０．２％である、ニ
トロソモナスｓｐ。 - 【請求項２】ニトロソモナス ＴＯＣＣ０００２株。
- 【請求項３】１０℃および２８℃における比増殖速度が
それぞれ０．００３／時以上および０．０３／時以上で
ある、請求項１記載のニトロソモナスｓｐ。 - 【請求項４】リン酸濃度が１００ｍＭ以上の培地におい
て、１０℃および２８℃における比増殖速度がそれぞれ
０．００３／時以上および０．０３／時以上である、請
求項３記載のニトロソモナス・ｓｐ。 - 【請求項５】ｐＨ８．５以上において増殖可能な請求項
１記載のニトロソモナスｓｐ。 - 【請求項６】請求項１〜５のいずれか一項記載のニトロ
ソモナスｓｐを、リン酸濃度が１００ｍＭ以上の培地で
培養し増殖させることからなる、アンモニア酸化細菌の
菌体増殖法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25453391A JPH0564582A (ja) | 1991-09-06 | 1991-09-06 | アンモニア酸化細菌およびその増殖法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25453391A JPH0564582A (ja) | 1991-09-06 | 1991-09-06 | アンモニア酸化細菌およびその増殖法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0564582A true JPH0564582A (ja) | 1993-03-19 |
Family
ID=17266370
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25453391A Pending JPH0564582A (ja) | 1991-09-06 | 1991-09-06 | アンモニア酸化細菌およびその増殖法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0564582A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7117889B2 (en) | 2003-06-09 | 2006-10-10 | Tgk Co., Ltd. | Three-way valve |
| KR101143391B1 (ko) * | 2009-07-08 | 2012-05-24 | 서울대학교산학협력단 | 암모늄이온 화합물의 부분질산화용 활성슬러지 제조방법 및 상기 활성슬러지를 이용한 암모니아 또는 암모늄이온 화합물 함유 폐수처리법 |
| JP2013540578A (ja) * | 2010-08-18 | 2013-11-07 | ノボザイムス バイオロジカルズ，インコーポレイティド | 水生生物及び液体の処理方法 |
| CN114230022A (zh) * | 2021-12-17 | 2022-03-25 | 湖北工业大学 | 一种缓解高盐对亚硝化单胞菌氨氧化活性抑制效应的方法 |
-
1991
- 1991-09-06 JP JP25453391A patent/JPH0564582A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7117889B2 (en) | 2003-06-09 | 2006-10-10 | Tgk Co., Ltd. | Three-way valve |
| KR101143391B1 (ko) * | 2009-07-08 | 2012-05-24 | 서울대학교산학협력단 | 암모늄이온 화합물의 부분질산화용 활성슬러지 제조방법 및 상기 활성슬러지를 이용한 암모니아 또는 암모늄이온 화합물 함유 폐수처리법 |
| JP2013540578A (ja) * | 2010-08-18 | 2013-11-07 | ノボザイムス バイオロジカルズ，インコーポレイティド | 水生生物及び液体の処理方法 |
| CN114230022A (zh) * | 2021-12-17 | 2022-03-25 | 湖北工业大学 | 一种缓解高盐对亚硝化单胞菌氨氧化活性抑制效应的方法 |
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