JPH05508778A - リンホカイン１５４ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ゛　リンホカイン１５４ 本発明は活性化された１９２８球によって産生される分泌蛋白質に関するもので ある。特に、本発明はリンホカイン１５４に関するものである。

背景情報 静止性の非分裂性Ｔリンパ球は、細胞増殖及び分化したフェノ型の発現を生じさ せる制御因子と考えられる細胞遺伝子の活性化によって抗原及びミトゲン刺激に 応答する。植物性赤血球凝集素（ＰＨＡ）及びホルボール１２−ミリステート１ ３−アセテート（ＰＭＡ）のミトゲン性混合物を用いるヒト末梢血Ｔ細胞の処理 は、生体内で細胞に存在している抗原プラス抗原の効果を模擬的に現している。

前記の２種の試薬は、細胞サイクルを経由する進行に対して重要な遺伝子発現を 誘発することが知られている〔リード（Ｒｅｅｄ）他、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８３：８９８２，１９８８）。

１９２８球の活性化は、更に多（の細胞型（免疫系の多くの細胞型）の発育及び 分化を、優先的にしかし選択的ではなく、命じる遺伝子産生分泌因子を誘発する 〔デュモンド（Ｄｕｍｏｎｄｅ　）他、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、２２ ４：８８．！９６９；モスマン、ティー、アール、（ＭＯｓｍａｎｎ、Ｔ、Ｒ， ）　、“ヘルパーＴ細胞及びそれらのリンホカイン（Ｈｅｌｐｅｒ　Ｔ　ｃｅｌ ｌｓ　ａｎｄ、　ｔｈｅｉｒ　Ｉｙｍｐｈｏｋｆｎｅｓ）　−、Ｔ細胞（Ｔ　ｃ ｅｌｌ）　ｒ　フェルトマン（Ｆｅｌｄｍａｎｎ）　、ラム（Ｌａｍｂ）及びオ ーウェン（Ｏｗｅｎ）出版、１９８Ｂジヨン　ライレイ　アンド　サン（Ｊｏｈ ｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ　）　＊　ニューヨーク；ロックリン（Ｒｏ ｃｋｌｉｎ　）他＋　Ａｄｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

２９：５５．１９８０）。活性化されたＴ細胞からの培養上澄み液は、Ｔ細胞発 育〔タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　）他。

ネイチャー、３０２：３０５．１９８３）、Ｂ細胞発育及び分化〔ナーメン（Ｎ ａａ＋ｅｎ　）他、ネイチ−？−，３３３：５７１．１９８８．キャンベル（Ｃ ａｍｐｂｅｌｌ）他＊　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８４　：　６６２９．１９８７ 　；ヒラメ（旧ｒａｎｏ）他、ネイチャー、３２４ニア８，１９８６；ヨコタ（ Ｙｏｋｏｔａ）他、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 。

８３：５８９４．１９８６）、抗ウィルス活性（グレイ（Ｇｒａｙ）他、ネイチ ＋−，２９５：５０３．Ｌ９８２）、炎症の際に伴われる細胞の活性化（ヨシム ラ（Ｙｏｓｈｉａ＋ｕｒａ）他、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ、８４　：　９２３３゜１９８７）、並びに造血性細胞先駆体発育 及び成熟〔ヤング（Ｙａｎｇ）他、細胞（Ｃｅｌｌ）、４７：３，１９８６）を 包含する複合的な生物学的活性を示す。ＩＬ−２ないしＩＬ−８を包含する多数 のリンホカイン及びサイトカイン（キ＋、／ベル他、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、８４：６６２９，１９８７．ヒラノ他、ネイ チャー、３２４ニア３．１９８６；ナーメン他、ネイチャー、３３３：５７１． １９８８．タニグチ他、ネイチャー、３０２：８０５．１９８３．ヤング他、細 胞、４７：３，１９８６；ヨコタ他、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８３　：　５８９４．１９８Ｂ、ヨシムラ他、　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵｓＡ、８４：９２３３，１９８７）、Ｉ ＦＮ−γ（グレイ他、ネイチャー、２９５：５０３，１９８２）、ＧＭ−ＣＳＦ 　（つヤング（Ｗｏｎｇ）他、サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ）、２２８：８１０ ．１９８５）、ＴＮＦ　（キュツリ（Ｃｕｔｕｒ量）　他、　Ｊ、　Ｅｘｐ、Ｍ ｅｄ、１６５：　１５８１．　１９８７）　、ＬＴ　（ギュッ、す他、　Ｊ、　 Ｂｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６５　：　１５８１．１９８７）及び他のものが同定、 精製され、そしてそれらをコード化している遺伝子が続いて分子的に複製された 。複製遺伝子は、他の分泌蛋白質の不存在下で生物学的機能のために試験され得 る純粋な組み換え蛋白質の生成のために非常に有用であることが証明された。こ の様にして、個々の蛋白質のために明瞭に機能を設定することが可能になった。

報告された多数のリンホカインにおいては、各々はそれ自体の単一の生物学的特 性スペクトルを有している。

多（のリンホカインが医療の用途のために開廃されたけれども、大部分のリンホ カインは所望の結果の一部を行う様な複雑な生物学的な系に関して作用する。そ れ故、新規リンホカインは、新規な生物学的活性スペクトル全体のための可能性 を有するのみならず、治療の全般的効力を有効にするために、従来の生成物と共 に相乗的に作用し得る。

発明の要約 したがって、新規に同定されたリンホカインを提供することが本発明の目的であ る。

一態様において、本発明は蛋白質１５４をコード化しているＤＮＡセグメントに 関するものである。

他の態様において、本発明は通常結合されている蛋白質を実質的に有しない蛋白 質１５４に関するものである。

別の態様において、本発明は図２に示されるアミノ酸配列の全部、又は単一部分 を存する組み換えによって製造された又は化学的に合成された蛋白質に関するも のである。

他の態様において、本発明は組み換えＤＮＡ構造体及びそれを用いて変換された ホスト細胞に関するものである。前記ＤＮＡ構造体は蛋白質１５４をコード化し ているＤＮＡセグメント及びベクターからなる。

別の態様において、本発明は、その中にコード化された蛋白質１５４を発現させ 、次いで前記蛋白質を単離する方法で、本発明のホスト細胞を培養することから なる組み換え蛋白質１５４を製造するための方法に関するものである。

更に他の態様において、本発明は蛋白質１５４に対して特異的な抗体に関するも のである。

本発明の種々の他の目的及び利点は、下記の本発明の記載及び図面から明らかに なるであろう。

図ＩＡ、ＩＢ及びＩＣは、ｐＡＴ１５４　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。

図２は、ｐＡＴ１５４　ｃＤＮＡの最長公開解読構造の推定されているアミノ酸 配列を示す。前記蛋白質中に含まれる古典的な疎水性導入領域は下線を付されて いる。

図８は、蛋白質１５４の疎水性度プロットを示す。

図４は、生体内転移及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気伝導法（ＳＤ−３Ｐ ＡＧＥ）を経た、完全長さのｃＤＮＡクローンの生体内転写を示す。最初の二つ のレインは各々、低分子量標準（、ＬＭＷ）及び高分子量標準（ＨＭＷ）を示す 。矢印は、約１５ｋｄの分子量を有する１５４翻訳蛋白質を指摘している。

の８　な２日 活性化されたＴ細胞の上澄み液における追加の生物学的活性（この活性は未確認 タンパク質によって媒介されつるものである。）を特徴付けるための一つのアプ ローチは、活性化Ｔ細胞において表現されている遺伝子を直接同定することにあ り、そのタンパク質産生物は、それらが分泌タンパク質であることを示唆すると ころの構造的特徴を有し、本発明者は、ヒト末梢血液子細胞においてミトゲンに より誘発される６０個以上の遺伝子を単離した（　Ｚｉｐｆｅｌ等、Ｍｏ１．　 Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　９　：　１０３４−１０４０．１９８９）、これらク ローンのうち、本発明者は、リンフ才力インをコード化する１５４個の遺伝子を 十分に特徴付けた。

したがって、本発明は、タンパク質１５４（リンフオ　゛カイン１５４）の全て 、または特異な部分をコード化するＤＮＡセグメント、および、その中にコード 化されたタンパク質（またはポリペプチド）、またはその対立変種に関する０本 発明は、特に、ヒトタンパク質１５４にば、本発明者によりクローンされそして 部分、的に配列されたマウスタンパク質１５４である０本明細書で用いる゛°特 異な部分”とは、少なくとも５（または６）個のアミノ酸、またはこれに対応し て、少なくとも１５（または１８）個のヌクレオチドよりなるものと定義される 。

本発明は、図２に与えられた全てのアミノ酸配列（例えば、図ＩＡ、図ＩＢおよ び図ＩＣに与えられたＤＮＡセグメントｐＡＴ１５４のようなもの）、またはそ の全ての特異な部分をコード化するＤＮＡセグメントに関する。また、本発明が 関係するＤＮＡセグメントには、図２のものと実質的に同一のタンパク質をコー ド化するものが含まれ、それには、例えば、その対立形態のものまたはマウスリ ンフ才力イン１５４が該当する。本発明のＤＮＡセグメントは、試料中のリンフ 才力イン１５４をコード化するＤＮＡまたはＲＮＡの存在を検出するためのプロ ーブとして使用することができる。

本発明はまた上記に挙げたセグメントに相補的なヌクレオチド配列に関する。

本発明はさらに、それが普通会合しているところのタンパク質が実質上無いタン パク質１５４に関する。リンフ才力イン１５４は、当業者により、タンパク質精 製のための当該分野に知られたプロトコルを使用して精製することができる０本 発明はまた、化学的に合成または組換え的に産生されるところのリンフ才力イン １５４およびそのペプチドフラグメントに関する。

本発明のタンパク質およびポリペプチドは゛、当該分野にて知られたプロトコル において、抗原として、それについての抗体、モノクローン性およびポリクロー ン性の双方を産生ずるために使用することができる。例えば、図２に与えられた 配列のエピトープ（またはその対立変種）に相当するアミノ酸配列を有するポリ ペプチドは、リンフ才力イン１５４にとって特異な抗体を生成するのに使用する ことができる。かかる抗体は、生分析におい用することができる。

本発明はさらに、組換えＤＮＡ構造に、そしてこれを用いて転換された宿主細胞 に関する。当該分野にて知られた標準方法論を使用して、リンフ才力イン１５４ の全て、または特異な部分゛をコード化する上記のＤＮＡセグメントとベクター よりなる組換えＤＮＡ構造は、過度の用途のために適するベクターには、限定さ れるものではないが、細菌ベクターｐ　Ｅ　Ｔ　−３（５ｔｕｄｉｅｒ等、　Ｍ ｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙ＋＊ｏｌｏｇｙ　１８５：発行中、１９９０）　、 酵母ベクターＹ　Ｒｐ　Ｒ１（Ｒｙｍｏｎｄ等、Ｇｅｎｅ　２５：　２４９．１ ９８３）および真核生物ベクターｐ　Ｂ　Ｃ１２−ＣＭ　Ｖ　（Ｃｕｌｌｅｎ％ Ｃｅ１ｌ・４６：９７３．１９８６）が含まれる。ＤＮＡセグメントは活性化Ｔ ンの形態をとる。ＤＮＡセグメントは、例えばプロモータが該当する、規則的要 素と手術可能に結合されたベクターの中に存在しつる。宿主細胞は、原核生物（ 例えば細菌）であっても、より低次の真核生物（例えば、酵母を含む、真菌類） であっても、またはより高次の真核生物（例えば、哺乳網）であってもよい。

本発明の宿主細胞は組換え的に産生されたリンフ才力イン１５４を生成するため に使用することができる。該宿主細胞は、構造中にコード化されたクンバク質１ ５４（またはその特異的なポリペプチド）が表現されるような条件の下で培養す ることができる。表現されたタンパク質は、標準タンパク質単雌プロトコルを使 用して単離することができる。

本発明は、また、膜形態のリンフ才力イン１５４およびその表面にそのように表 現する宿主細胞に関する。当業者が解釈できるように、膜形態のタンパク質１５ ４は該タンパク質をコード化するＤＮＡセグメント上のトランスメンブランアン カーコード化配列の追加により生成することができる。さらに、かかるＤＮＡセ グメントをコード化する組換えＤＮＡ構造により転換された宿主細胞は、その表 面上にタンパク質１５４を表現するであろう。

リンフ才力インは免疫系に関して広い配列の活性を提供する。リンフ才力イン活 性は、ウィルス感染を攻撃することにつき、マクロファージのような補充細胞か ら、有効な免疫応答を据えつける特異的なサイトにまでわたる。本発明のリンフ 才力イン１５４は、かかる活性を提供することができそして従って種々の処置養 、生法において使用することができるであろう。

例えば、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、一定の細胞、例えば腫瘍細 胞上にて細胞毒性効果を成すことができそして従って癌の治療に使用することが できるであろう。さらに１本発明のタンパク質またはポリペプチドは、抗−ウィ ルス活性および／または抗−寄生虫活性（例えばリンフ才力イン　γ−インター フェロンの活性）を有することができ、この場合１本発明は、ウィルス感染また は寄生虫感染の治療に使用することができる。リンフ才力イン１５４は、また、 細胞、特に、造血細胞の成長および／または分化に効果がある（数種のイかかる 活性は、免疫系の細胞を悪影響および／または枯渇せしめるところの疾病の治療 において有用である。加えて、リンフ才力イン１５４は、使用される本発明のタ ンパク質またはポリペプチドが、例えば、移植患者の血液または尿中のタンパク 質またはポリペプチドの存在をモニターすることにより移植組織の拒絶を検出す るのを、可能とするような免疫系を増大する能力を有することができる。患者の 生物学的液体中のタンパク質またはポリしていることの早期の指標となりつるで あろう。

ない。

実施例 ｐＡＴ１５４のＣＤＮＡクローンは、前に報告した差引ハイブリッド形成ライブ ラリー（シフニル他、Ｍｏ１、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、９：ｆ０４２−１０４８． １９８９）から起源的に単離された。追加のクローンはλ２ａｐライブラリー（ ストラタジーン）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（ショート他、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ 、Ｒｅｓ。

１６：７５８３−７６００．１９８８８）、またはグエブラーーホフマン法（グ ブラー他、Ｇｅｎｅ、２５　：　２６３、　１９８３）に従って作成したオリゴ ・ｄＴ・プライムド・λｇｔｌｏライブラリーから単離した。

簡単に説明すると、ヒト末梢血液子細胞を全血から単離し、そしてシクロへキシ ミド（ＣＸ）（１０μｇ　／　ｍｌ）の存在下、分裂促進剤の植物凝集素（ＰＨ Ａ）（１ｄｇ／ｍｌ）とホルボール・１２−ミリステート・Ｉ３−アセテート（ ＰＭＡ）（２０ｎｇ／ｍｌ）を使用してｉｎ　ｖｉｔｒｏで４．５時間にわたり 刺激した。

ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを、λｇｔｌＯまたはラリ−から起源的に単離し たｐＡＴ１５４の４５３ｂｐプローブを使用してスクリーニングした。ｍＲＮＡ の長さにわたる合計７個のクローンを単離し、マツプ化し配列解析をした。

配列解析 核酸配列は、ｐＡＴ１５４のｃＤＮＡ群の両方の鎖に基づいて、サンガー・ジデ オキシ・チェーン・ターミネーション法（サンガー他、Ｐｒｏ、Ｎａｔ１．Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７７：５４６８−５４６７．１９７７）（図ＩＡ、Ｉ ＢとＩＣを参照）により、決定した。

１５４挿入部を含有するｐブルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｆｐｔ）（スト ラタジーン）のマイクログラムを、室温で５分間にわたり０．２ＮＮａＯＨの最 終濃度でアルカリ変性した。ＤＮＡを５Ｍ　ＮＨ４０ＡＣで中和し、−７０℃エ タ左−ルの３倍容積中で沈澱し、１０分間にわたりドライアイス上に置いた。そ のＤＮＡをベレットにし、再懸濁した。　配列決定反応（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ 　ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、ＵＳＢ−シークエナーゼ■キットを使用してそのメー カーの指示に従って実施した。

伸長とターミネーションは、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下 実施した（ウィンシップ、Ｐ、Ｒ，＊　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、　１７：　 １２８Ｂ、、１９８９）。配列決定反応物は、４分間にわたり８０℃以上に加熱 し、定常８５Ｗで、８Ｍの尿素を含有する８％の変性化ポリアクリルアミド上電 気泳動した。核酸配列は、オートラジオグラフィーフィルムに対して暴露した後 決定した。核酸配列の入力と決定は、コンピュータパッケージ「マイクログラム （ＭｉｃｒｏＧｅｎｉｅ）（ベックマン）を使用して実施した（クイーン他、Ｎ ｕｃ、Ａｃｆｄｓ、Ｒｅｓ、１２：５８１−５９９．　１９８４）。推定アミノ 酸配列が、決定され（図２）そして典型的な嫌水性のリーダー領域を含むがトラ ンスメンブラン・アンカーを持たないことが示れれており、これはｐＡＴ１５４ タンパク質が分泌されたことを示している（図３を参照）。

コンピュータ援助検索解析 コンピュータパッケージ・シーンパンク（Ｖ、６８＋５／９０から最新まで）を 、ｐＡＴ１５４のｃ　ＤＮＡとアミノ酸配列に統計的に適切に類似である公知文 献中の核酸とタンパク質配−列を検索するために利用した。ｐＡＴ１５４に顕著 に類似している配列は見出されなかった。

読み枠のｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳 １５４読み枠を含有する１　０μｇｐＡＴＩ　５４のｃＤＮＡの全量を、ｐブル ースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）のマルチクローン部位のＣ１ａｌ切断 によりリニア化（１１ｎｅａｒ　１ｚｅ）Ｌ／た。最終の切断物を０゜５ＭＮａ Ｃ１に調節し、３７℃で３０分間にわたり、プロトコールＫ（Ｉｍｇ／ｍｌ）で 処理した。ｃＤＮＡを１＝１のフェノール／クロロホルムとエタノニル沈澱とで ２回処理し、乾燥した。得られたペレットを、再懸濁して、ピロ炭酸ジエチルで 処理した水を使用して０．５μｇ／μｌの最終濃度にした。Ｔ３ＲＮＡポリメラ ーゼを使用する１　５４　ｃＤＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳は、メーカーの指示 に従って実施された。ｍ　ＲＮ　Ａの１８ｍ液滴は、１０分間にわたりＬ　ｘＴ ＢＥ　１％アガロースゲルの電気泳動により訂正的に試験した。

１５４タンパク質のｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳ウサギのレチキュロリゼー）（ｒｅｔ ｉｃｕｌｏｌｙｓ　ａ　ｔ　ｅ）系（プロメガ）を利用してＬ　５４ｍＲＮＡを 翻訳した。プロメガのプロトコールに従って、１５４ｍＲＮＡの５μｍ（転写し た全ｍＲＮＡの２０％に相当する）を、ウサギのレチキュロリゼート（ｒｅｔｉ ｃｕｌｏｌｙｓａｔｅ）、−アミノ酸（システィン欠）とシスティン、Ｌ−［” Ｓｌ　（ＮＥＮ）と混合した。この混合物を８０℃で６０分間にわたりインキュ ベートした。遊離標識体を、４℃で一夜にわたり、０．１　ＭＮ　Ｈａ　ＨＣＯ ＊　’に対する透析〔エンプロチク・プロシアライザー（ＥｍｐｒｏＴｅｃｈ　 Ｐｒｏｄｉａｌｙｚｅｒ））により翻訳最終物から除いた。試料を凍結乾燥し、 ２０％５ｘ試料緩衝液を含有する容積５０μｍのＨ，０中に再懸濁した。システ ィン、Ｌ−［”Ｓｌの取込みを定電圧１１０ＶでのＩＺ５％ポリアクリルアミド ゲル上で翻訳物を電気泳動しそしてゲルをオートラジオグラフィーフィルム（図 ４）に暴露することにより解析した。

上述した全ての刊行物は、ここでは引用により包含される。

上述の発明は、理解をよくするために記述れれたものである。しかしながら、当 業者はこの開示により、本発明の真実の範囲から垂離しないで、変形と改良をで きることは理解されるだろう。

ＦＩＧ、ＩＡ 」 ＦＩＧ、４ 要　約　書 本発明は、新規に同定された、分泌されたタンパク質（リンホカイン）、すなわ ちリンホカイン１５４に関する。本発明は、タンパク質１５４をコード化するＤ ＮＡセグメントならびに該タンパク質自体に関する。本発明はさらに、前記タン パク質をコード化する組換えＤＮＡ構築物およびそれで形質転換された宿主細胞 に関する。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成５年２月１５日　・り

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．タンパク質１５４をコード化する単離されたＤＮＡセグメント。
2. ２．図２に与えられたアミノ酸配列をコード化する請求項１記載のＤＮＡセグメ ント。
3. ３．図２に与えられた配列のアミノ酸を少なくとも５個コード化する請求項１記 載のＤＮＡセグメント。
4. ４．通常会合されているタンパク質が実質的にない分泌されたタンパク質１５４ 。
5. ５．図２に与えられたアミノ酸配列を有する請求項４記載のタンパク質またはそ のアレリック変形体。
6. ６．図２に与えられた配列のアミノ酸を少なくとも５個有する請求項４記載のタ ンパク質。
7. ７．図２に与えられたアミノ酸配列を有する組換えにより製造されたタンパク質 またはそのアレリック変形体。
8. ８．ｉ）請求項１記載のＤＮＡセグメント、およびｉｉ）ベクター、 からなる組換えＤＮＡ構築物。
9. ９．請求項８記載の組換えＤＮＡ構築物で、該組換えＤＮＡ構築物中にコード化 された前記タンパク質の発現を可能にするように安定に形質転換された宿主細胞 。
10. １０．請求項９記載の宿主細胞を、前記タンパク質の発現を可能にするように培 養し、そして前記タンパク質を単離することからなる組換えタンパク質１５４の 製造方法。
11. １１．タンパク質１５４に特異的な抗体。
12. １２．モノクローナルである請求項１１記載の抗体。
13. １３．ポリクローナルである請求項１１記載の抗体。
14. １４．組換えタンパク質１５４の製造のために請求項９記載の最終細胞を使用す る方法。