JPH05506780A - 植物特異的な共生シグナルとして作用し得るリポ―オリゴサッカライド構造を有する物質、それらの製造方法及び適用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 植物特異的な共生シグナルとして作用し得るリポ−オリゴサツカライド構造を有 する物質、それらの製造方法及び適用 本発明は、植物に特異的な（ｐｌａｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　）共生シグナル（ ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ　ｓｉｇｎａｌｓ　）の形成が可能であるリボ−オリゴサツ カライド構造を有する物質、該物質の製造方法及びその適用に関する。

すでに公知のように、植物はその生長のためにアンモニア又は硝酸塩のような結 合した窒素源を必要とする。大気中の窒素（Ｎ　’）からアンモニア（ＮＨ３） への化学的又は生物学的還元による窒素の固定は、それゆえ農業生産上重要な役 割を演じている。

またすでに知られているように、共生微生物は、窒素の生物学的固定により植物 の生長及び発生を促進することが可能である。

リゾビウム科（Ｒｈ１ｚｏｂｉａｃｅａｅ　）は、一般的に植物と共生的な結合 をすることにより窒素を固定することができる、グラム陰性の土壌細菌である： 窒素固定細菌とのこのような共生が成立することにより、同化可能な窒素量が少 ない土壌中においても、非常に多くの植物が成育可能となる。

光合成により、パートナ−である植物は、窒素分子をアンモニアに還元するため に必要なエネルギーを細菌に提供しティる。その代わりに、共生微生物（ｍｉｃ ｒｏｓ）ｒｍｂｉｏｎｔ）により固定されたアンモニアは宿主植物に提供され、 植物の窒素代謝に取り込まれている。リゾビウム科のような窒素固定細菌とマメ 科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓｅａｅ　ｆａｍｉｌｙ　）の植物との間に成立する共生 的結合は、生態学的及び農業経済学的観点から最も重要である。該結合により、 主に宿主植物の根土に多節（ｎｏｄｏｓｉｔｉｅｓ　）又は根粒（ｎｏｄｕｌｅ ｓ　）が形成される。

これら多節の内部では、細菌はニトロゲナーゼ酵素複合体（ｎｉｔｒｏｇｅｎａ ｓｅ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｃｏｍｐｌｅｘ　）により大気中の窒素をアンモニ アに還元している。

リゾビウム科の窒素固定化細菌（リゾビウム（Ｒｂｉｚｏｂｉｕｍ）、ブラディ リゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）　、ジノリゾビウム（Ｓｉｎｏ ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）及びアゾリゾビウム（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）属 ）とマメ科の植物との共生は、それゆえ、温帯性（ｔｅｍｐｏｒａ、ｔｅ）及び 熱帯性農業において非常に重要な役目を担っているのである。大豆（５ｏｙｂｅ ａｎ）やグラウンドナツツ（ｇｒｏｕｎｄ　ｎｕｔｓ　）のように油及びタンパ ク質に富んだ植物、アルファルファ（Ｉｕｃｅｒｎｅ）やクローバ−（ｃｌｏｖ ｅｒ）のような飼料用植物、エントウ（ｐｅａｓ　）やフィールドビーン（ｆｉ ｅｌｄ　ｂｅａｎ　）のようにタンパク質に富んだ植物、豆（ｂｅａｎｓ）　、 エントウ（ｐｅａｓ　）　、ヒラマメ（１ｅｎｔｉｌｓ）やヒョコマメ（ｃｈｉ ｃｋｐｅａｓ）のような食用植物、セスバニア（５ｅｓｂａｎｉａ　）のような 緑肥。これらの共生のおかげで、マメ科を窒素肥料中で栽培すると、他の科（ｆ ａｍｉｌｙ　）に属する植物の栽培に比べてより経済的である。この点において 、窒素肥料の大量使用が相当の不利益を被ることに注意しなければならない。第 １に、肥料の製造、輸送及び施用は化石エネルギーを浪費し、その結果種々の結 果を招く：農業レベルにおいては農業家の製造コストを増大させ、環境レベルに おいてはＣＯ２量を増大させて温室効果に寄与することになる。さらに、窒素肥 料を無分別に施用したり大量に施用すると、地表水を富栄養化して淡水（ｆｒｅ ｓｈ　ｗａｔｅｒｓ　）の汚染を引き起こし、地下水層の硝酸量を増大させるこ とになる。これら様々な理由により、窒素の生物学的固定の利用の増加が好まし いものとされている。

窒素肥料の大量施用による多大な損害を考慮すると、植物、特にヒト及び動物の 栄養に重要な役割を持つ栽培種による生物学的窒素固定の寄与を増大させること が、それゆえ必要である。生態学的見地及び経済的見地の双方から最も満足され る解決策は、リゾビウム科−マメ科の共生（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ−Ｌｅｇ ｕｍｉｎｏｓｅａｅ　ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ　）を改善することである。

この改善を、種子へのコーディングにより、又は種子と混合された粒剤により又 は液体培地中で培養することによって、リゾビウム科（特にリゾビウム又はブラ ディリゾビウム）を、播種時に供給することにより行うことが提案された。これ ら細菌の供給は、しかしながら、適切な共生細菌が自生していないか土壌中に非 常に豊富に存在していないという比較的まれな場合にしか効果的ではない。その 反対の場合、即ち、土壌中にすでにこれらの細菌を含んでいる場合、窒素固定に は必ずしも効果的ではないにも拘らず、選抜された細菌の導入を制限する要素と なり得る、土壌中に存在する自生細菌との競合のために、意図的に導入した菌株 を生育させることは実際上不可能である。

また、植物をリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の細菌に由来するエキソポリ サッカライド（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　）で、又は１個以上のこ の様なエキソポリサッカライド（ＥＰＳ）のユニットを含むオリゴサツカライド で処理することにより、リゾビウム属−マメ科の共生を向上させる方法も提案さ れた［−ＷＯ８７１０６７９６なる番号で公開されたＰＣＴ国際出願（ザ　オー ストラリアン　ナショナル　ユニバージティー（ＴＩＩＩＥ　ＡＵＳＴＲＡＬＩ ＡＮ　ＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＵＮＩＶＥＲ３ＩＴＹ）により出願され、発明者とし てＢ、　Ｇ、　ＲＯＬＦＥ、　Ｓ、　Ｐ、　ＤＪＯＲＤＪＥＶＩＣ，Ｊ、　Ｗ、 　ＲＥＤＭＯＮＤ　及ヒＭ、　ＢＡＴＬＥＹヲ記載）　ヲ参照］。

しかし、該ＥＰＳは非共生遺伝子（ｎｏｎ−ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ　ｇｅｎｅｓ　 ）によりコードされた生成物である。実際、これらエキソポリサッカライドの生 合成は、感染と根粒着性（ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ　）を制御するｎｏｄ遺伝子に よる直接的な制御を受けてはいない。これらエキソポリサッカライドは、そのプ ラスミドｐＳｙｍが除かれた（　ｃｕｒｅｄ）リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ 　）菌株によって合成され、そのプラスミドは共生遺伝子のほとんどを特にｎｏ ｄ遺伝子を含んでいる。

根粒形成過程に関係している遺伝子の位置は確認されており、幾つかの共通及び 特異的な根粒着性遺伝子（ｎｏｄ遺伝子）が同定され、特性付けられている（ロ ング、ニス。

アール、　（Ｌｏｎｇ、　Ｓ、　Ｒ，）　、セル（Ｃｅｌｌ）、１９８９．　５ ６゜２０３−２１４を参照）　。ｎｏｄＡ、Ｂ、Ｃ遺伝子が様々な種の共生リゾ ビウム科に共通である根粒着性遺伝子であるのに対して、特異的なｎｏｄ遺伝子 は宿主スペクトラムを決定し且つそれゆえ様々な種において異なって存在してお り、ｎｏｄＤ型の調節遺伝子はｎｏｄ遺伝子全体の発現を制御している。

共通遺伝子ｎｏｄＡ、Ｂ、Ｃは、マメ科植物との窒素固定共生の確立が可能であ る４つの細菌属において同定された：リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）、ブ ラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）、ジノリゾビウム（Ｓｉ ｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）及びアゾリゾビウム（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　 ）。リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）属については、これら遺伝子のヌクレ オチド配列はアール、メリロティ（Ｒ，ｍｅｌｉｌｏｔｉ　ＸＴＯｒ　６　ｋ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１９８４．　１２． 　９５０９−９５２２　；Ｊａｃｏｂｓｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ ｌ、、１９８５．　１６２．４６９−４７６　；　Ｅｇｅｌｈｏｆｆ　ｅｔ　ａ ｌ、、　ＤＮＡ、１９８５．４．　２４１−２４２）。アール、レグミノサルム （Ｒ，ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ　）（Ｒｏｓｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕ ｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１９８４゜１２．９４９７−９５０８）　、ア ール、トリフオリゴ（Ｒ。

ｔｒｉｆｏｌｉｉ　）（５ｃｈｏｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ。、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅｓ、、１９８６．１４．２８９１−２９０３）において得られてい る。

ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）種（５ｃｏｔｔ、　Ｎ ｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、１９８６．　１４．　２９０５−２９１９）。

アゾリゾビウム　力ウリノダンス（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｃａｕｌｉｎｏ ｄａｎｓ　）　（Ｇｏｅｔｈａｌｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、、　 Ｇｅｎｅｔ、、１９８９．２１９，２８９−２９８）。

本発明者の投入かを含む研究者チームは、リゾビウムメリロティ（Ｒｈｉｚｏｂ ｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ　）中で、これら細菌の培養上清中に存在する宿主特 異的な細胞外Ｎｏｄシグナルの生産を、共通遺伝子ｎｏｄＡ、ＢＳＣが、特異的 遺伝子ｎｏｄＨ及びｎｏｄＱと共に、誘導することを証明した（特に、’７ｔ− シャーら（ＦＡＵＣＨＥＲｅｔ　ａｌ、　）、　Ｊ、　ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ（１ ９８８）、１７２．５４８９−５４２９及びフォーシャーら（ＦＡＵＣＨＥＲｅ ｔ　ａｌ、　）、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒａ ｃｔ、（１９８９）、２．２９１−３００を参照）。さらに、これら２つの文献 学後者の文献は、該無菌上清を限外濾過して分画することにより、５，０００Ｄ ａ未満の分子量（ａｐｐａｒｅｎｔ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ）を有する ２つのＮｏｄファクターの存在を明らかにできることを記載している。

感染と根粒着性の特異性は、アール、メリロティ（Ｒ，ｍｅｌｉｌｏｔｉ　）に より２つのレベルにおいて決定される、すなわちニーｎｏｄＤ遺伝子は、植物が 生産する特異的なシグナルの存在に依存して他のｎｏｄオペロンの発現を活性化 する（ジョージパルら（Ｇｙｏｒｇｙｐａｌ　ｅｔ　ａｌ、）、　Ｍｏ１ｅｃ、 　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、、１９８８，２１２．８５−９２）　、及び−ｎｏｄＨ及びｎｏｄ Ｑのような特異的な遺伝子は、活性化されると、アルファルファのような宿主マ メ科植物を認識して刺激できるようにする細菌性細胞外シグナル（Ｎｏｄファク ター）の生産を決定する（フォーシャーら（Ｆａｕｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）、 　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９８８．　１７２．　５４８９−５４９９；フ ォーシャーら（Ｆａｕｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｐｌａｎｔ −Ｍｉｃｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔ、、１９８９．　２．　２９１−３００） 　ｏ　しかしながら、該細胞性シグナルの化学的構造は未知である。

本発明の目的はそれゆえ、共生Ｎｏｄシグナル（Ｎｏｄ　ｓｉｇｎａｌｓ）の化 学的構造を決定すること、そのような化学的構造を有する物質を提供すること、 そのような共生Ｎｏｄシグナル（Ｎｏｄ　ｓｉｇｎａｌｓ　）として作用するこ とが可能な物質の製造方法を提供すること、及び両種物界及び動物界（ヒトを含 む）に属する生物をこれら物質を用いて行う処置方法を提供するものである。

本発明の目的は、Ｎｏｄファクター又はそのアナログの一つの構造を有する実質 的に純粋な物質にあり、該Ｎｏｄファクターの特徴は、その生合成が、リゾビウ ム科（Ｒｈ１ｚｏｂｉａｃｅａｅ　）　、特にリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ 　）属、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）属、ジノリゾ ビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）属及びアゾリゾビウム（Ａｚｏｒｈｉ ｚｏｂｉｕｍ　）属に共通している、少なくとも一つの根粒着性遺伝子（ｎｏｄ Ａ、Ｂ、Ｃ）の制御下にあるという事実であり、上記物質はエキソポリサッカラ イドに由来しないリポオリゴサツカライドからなることを特徴としている。

本発明との関連においては、″Ｎｏｄファクター”は、ｎｏｄ遺伝子の直接的な 制御下で生産されるシグナル分子を意味するものと解釈され、該シグナルにより 共生細菌は植物に感染して多節（ｎｏｄｏｓｉｔｉｅｓ　）の形成を促すことが 可能となるのである。

該実質的に純粋な物質の有利な実施態様によれば、該物質がその構造を含有して いるＮｏｄファクターの特徴は、植物に特異的な共生シグナルであり且つ該Ｎｏ ｄファクターが関連する宿主植物への細菌の感染能力を高めることが可能であり 、及び／又は該Ｎｏｄファクターが関連する宿主植物上での根粒形成を促進する ことができ、及び／又はマメ科の共生遺伝子の転写を誘導することができること である。

本発明の上記実質的に純粋な物質の他の有利な実施態様によれば、該物質がその 構造を含有しているＮｏｄファクターはレクチンリガンドの構造的特性（５ｔｒ ｕｃｔｕｒａ］　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を有している。

本発明の主題はまた、下記一般式Ｉで表されることを特徴とするリポ−オリゴサ ツカライド物質でもある：式■ ［式中、 −Ｇは、種々置換された、例えば、窒素原子上にアセチル基が、酸素原子上にス ルフェート基、アセチル基及び／又はエーテル基が置換したヘキソサミンを示し 、−Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は同−又は異なッテ、Ｈｌ　ＣＨ３ ｃｏ−１ｃＸＨ，Ｃｏ−（ｘはｏ〜１７の整数を、ｙは１〜３５の整数を示す） 、又は例えばカルバミル基のような他の任意のアシル基を示し、〜Ｒ４は、少な くとも１２個の炭素原子を含むモノ−、ジー又はトリ不飽和脂肪族鎖を示し、 −ｎは１〜４の整数を示す。］。

本発明のより好ましい実施態様によれば、Ｇは：・アール、メリロティ（Ｒ，ｍ ｅｌｉｌｏｔｉ　）中ではＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン　６−スルフェート を示し、・アール、レグミノサルム　ビー、ブイ、ビシアエ（Ｒ，１ｅｇｕ＋＋ ＋ｉｎｏｓａｒｕｍ　ｂ、　ｖ、　ｖｉｃｉａｅ　）中では、Ｎ−アセチル−Ｄ −グルコサミンを示す。

本発明の有利な実施態様によれば、本発明によるリポ−オリゴサツカライドは下 記式（Ｉ　Ｉ）で示されることを特徴とするものである： ［式中、Ｒは、Ｈ又はＣＨ３ＣＯ−を示し、ｎは２又は３である。コ ＲがＨである一般式（Ｉ　Ｉ）のアール、メリロティ（Ｒ。

ｍｅｌｉｌｏｔｉ　）リポ−オリゴサツカライドは、以下、−船名ＮｏｄＲｍと 称し：ｎ＝２の場合、対応するリポ−オリゴサツカライドはＮｏｄＲｍ−１と称 し；ｎ＝３の場合、対応するリポ−オリゴサツカライドはＮｏｄＲｍ−３と称す る。

ＲがＣＨ３ＣＯ−である一般式（Ｉ　Ｉ）のリポ−オリゴサツカライドは、以下 、−船名Ａｃ−ＮｏｄＲｍと称し；ｎ＝２の場合、対応するリポ−オリゴサツカ ライドはＡｃ−ＮｏｄＲｍ−１と称し；ｎ＝３の場合、対応するリポ−オリゴサ ツカライドはＡｃ−ＮｏｄＲｍ−３と称する。

本発明の目的は本発明による実質的に純粋である物質を製造する方法を提供する ことでもあり、該方法は出発物質としてリゾビウム科（Ｒｈ１ｚｏｂｉａｃｅａ ｅ　）の培養上清を使用する精製プロセス、オサイド合成（ｏｓｉｄｅ　５ｙｎ ｔｈｅｓｅｓ　）における連続的又は収束性の合成を利用するルーティンプロセ ス、リゾビウム科（Ｒｈ１ｚｏｂｉａｃｅａｅ　ｆａｍｉｌｙ）又はその他に属 する微生物中にクローン化されたｎｏｄ遺伝子を出発物質として使用し、必要に 応じて、適当なプロモーターの制御下及び／又は適当な突然変異を受けた調節遺 伝子の存在下で、遺伝子工学により該物質を製造するプロセスを含んでいる。

本発明による実質的に純粋である物質を製造する方法の有利な実施態様によれば 、第１段階において、（１）共通及び特異的ｎｏｄ遺伝子及び与えられたりゾビ ウム科細菌の調節遺伝子を含む断片、もしくは（２）ｎｏｄ遺伝子の発現のため の調節遺伝子のいずれかを、リゾビウム科細菌（Ｒｈ１ｚｏｂｉａｃｅａｅ　ｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ　）又は他の任意の適当な細菌中で複製可能なプラスミド中に クローニングすることにより、組換プラスミドが得られる。次いで、リゾビウム 科細菌又は他の任意の適当な細菌は、Ｎｏｄファクターを高度に過剰生産する突 然変異菌株を得るべく、該組換プラスミドを導入して修飾され、該突然変異菌株 は適当な培養培地中にて培養され；第２段階においては、培養上清を回収し、適 当な低級アルコールで抽出して精製するか、又は抽出残有を同一液抽出に続いて 逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、ゲル浸透りｏｖトゲラフ　イー　（ｇｅｌ　 ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ　ｃｈｒｏｍａｔ。

ｇｒａｐｈｙ）　、イオン交換クロマトグラフィー及び逆相分析ＨＰＬＣクロマ トグラフィーを行う。

該工程の有利な態様によれば、Ｎｏｄファクター−過剰生産性プラスミドが、非 エキソポリサッカライド生産性変異体すゾビウム科細菌中に導入される。

本発明による実質的に純粋である物質を製造する方法の他の有利な実施態様によ れば、Ｎｏｄファクターを高度に生産するりゾビウム科細菌の野生株を出発物質 として使用し、該株を適当な培養培地中にて培養した後、培養上清を回収し、上 記の方法に従って処理する。

本発明の主題は、その唯一の又は一つの活性成分が上述の実質的に純粋である物 質である植物処理剤（ｐｌａｎｔ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｇｅｎｔ）　、特に ニー植物を病原体に対して防御する機構を刺激する薬剤（ａｇｅｎｔ）、 −特に窒素固定に関して、マメ科の共生特性を刺激する薬剤（ａｇｅｎｔ）であ る。

本発明による植物処理剤の有利な実施態様によれば、該処理剤は、上記物質が単 独でもしくは他の活性成分と共に存在する、種子をコーティングするための組成 物の形態又は噴霧用の水性溶液もしくは懸濁液の形態に製剤化されている。

本発明による植物処理剤の他の有利な実施態様によれば、該植物処理剤が前記防 御機構又は共生特性を刺激するための薬剤として使用される場合、前記コーティ ング組成物又は水性溶液もしくは懸濁液中において、上記物質が１０−６Ｍ〜１ ０”Ｍの濃度で存在することである。

さらに本発明の主題は、その唯一の又は一つの活性成分が上述した実質的に純粋 な物質である治療剤である。

該治療剤の有利な実施態様によれば、上記物質は該治療剤中に１０　Ｍ〜１０” Ｍの濃度で存在する。

上述の内容に加え、本発明は以下の記載から明らかになる内容をも包含するもの である。

本発明は以下の実施例に関連した記載からさらに明瞭に理解されるものである。

これら実施例及び添付の図面が本発明の目的を単に例証したものに過ぎず、本発 明がこれらに限定されないのはいうまでもない。

実施例 ｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ　）の培養培地を使用して精製する本発明化合物 の調製。

Ａ、化合物の製造 リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）による細胞外Ｎｏｄファクターの製造は、 一方では、共通遺伝子ｎ、ｏｄＡ、Ｂ、Ｃの制御下にあり（ｖａｎ　Ｂｒｕｓｓ ｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１９８４９９）、そして 一方では、宿主特異的なｎｏｄ遺伝子、例えばアール、メリロティ（Ｒ，ｍｅｌ ｉｌｏｔｉ　）　、ｎ　ｏ　ｄＨ及びｎｏｄＱの制御下にある（　Ｆａｕｃｈｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒ２９１−３００）。

共通遺伝子ｎｏｄＡ、Ｂ、Ｃの転写の調節は、ｎｏｄＤｌ、ｎｏｄＤ２、ｎｏｄ Ｄ３及びｓｙｒＭ遺伝子によりコードされている調節タンパクの制御下にある（ 　Ｍｕｌｌｉｇａｎｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ、１９８５．　８２．　６６０９ −６６１３　；　Ｇｙｏｒｇｙｐａｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　 Ｇｅｎｅｔ、、　１９８８．　２１２゜８５−９２）。タンパクＮｏｄＤ１は、 マメ科の根の浸出液中に存在する成る種の誘導性フラボノイド、例えばルテオリ ン（Ｉｕｔｅｏｌｉｎ　）の存在下においてのみ活性を有する（　Ｍｕｌｌｉｇ ａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ、１９８５．　８２．　６６０９−６６１３　 ；　Ｐｅｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、１９８６．　２３３゜９ ７７−９８０）。マルチコピープラスミド（ｍｕｌｔｉｃｏｐｙｐｌａｓｍｉｄ ）中にｎｏｄＤ３及びｓｙｒＭ遺伝子が存在することにより、誘導性フラボノイ ドが存在しない場合においてさえもＮｏｄＡ、Ｂ、、Ｃ遺伝子の構成的な活性化 をもたらす（Ｍｕｌｌｉｇａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９８９． 　１２２゜７−１８）。

他のｎｏｄ遺伝子の調節を決定するために、宿主特異性のためのｎｏｄＥ、ｎｏ ｄＧ及びｎｏｄＨ遺伝子と、β−ガラクトシダーゼをコードしている大腸菌由来 の１ａｃＺ遺伝子との融合物を構築した。これらの融合物により、アール、メリ ロティ（Ｒ，ｍｅｌｉｌｏｔｉ　）においては、宿主特異性のためのｎｏｄ遺伝 子が、一般の遺伝子ｎｏｄＡ、Ｂ。

Ｃと同じように調節されていることを証明することができた：（ｉ）、：れらの 転写が、ｎｏｄＤｌ、ｎｏｄＤ３及びｓｙｒＭにより活性化されること、（ｉｉ ）ｎｏｄＤｌによる活性化にルテオリンが要求されること、（ｉｉｉ）調節遺伝 子及び構造遺伝子が不和合群（ｉｍｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｇｒｏｕｐ） Ｉｎｃ−ＰＬ　（１細胞中５−１０コピー存在）のプラスミド中に存在している 場合、転写の活性化はさらに高いものであること。

該情報に基づき発明者らは、アール、メリロティ（Ｒ，ｍｅｌｉｌｏｔｉ　）の メガプラスミド（ｍｅｇａｐｌａｓｍｉｄ　）　ｐ　Ｓ　ｙ　ｍのｎｏｄ領域の ３Ｏ−ｋｂ断片がクローン化されているｐＲＫ２由来のプラスミドｐＲＫ２９０ を選択するに至った。

この組換プラスミドｐＧＭｒ１４９は全ての共通及び特異的ｎｏｄ遺伝子と共に 調節遺伝子ｎｏｄＤ１、ｎｏｄＤ３及びｓｙｒＭを含んでいる（Ｄｅｂｅｌｌｅ 　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂａｃｔｒｉｏｌ。

。プラスミドｐＧＭ１１４９を含むアール、メリロティ（Ｒ，ｍｅｌｉｌｏｔｉ 　）菌株がＮｏｄファクターを過剰生産することを示した：確かにそれらの生産 は野生型のアール、メリロティ（Ｒ，ｍｅｌｉｌｏｔｉ　）菌株に比べて少なく とも１００倍は多い。

Ｎｏｄファクターの大量生産、例えば発酵槽培養（ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ　ｃｕｌ ｔｕｒｅ　）においては、エキソポロサツカライドが多く生産されると培養液の 濾過及びシグナル分子の精製において不都合が生じ得る。それゆえ発明者らは、 過剰生産されるプラスミドｐＧＭ１１４９を、エキソポリサッカライドを生産し ないアール、メリロティ（Ｒ，ｍｅｌｉｌｏｔｉ　）　突然変異株ＥＪ３５５に 導入することが好ましいと考えた。

菌株ＥＪ３５５　（ｐＧＭＩ　１４９）は、Ｎｏｄファクターを大量に生産する がエキソポリサッカライドは全く生産しない。

ｎｏｄ遺伝子の発現レベルを測定するためにアール、ツリロティ（Ｒ，ｍｅｌｉ ｌｏｔｉ　）のｎｏｄ遺伝子とエシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ ｏｌｉ　）由来の１ａｃＺ遺伝子との遺伝子融合を使用して（ｎｏｄ：：ｌａｃ 融合物）、本発明者らはｎ、　ｏ　ｄ遺伝子の良好な発現とＮｏｄファクターの 高生産を可能とする培地を開発した。満足し得る培地は、炭素源としてコハク酸 そして窒素及び炭素源としてグルタメートを含む無機培地である。事実、タンパ ク溶解物及び酵母抽出物を含む富培地（ｒｉｃｈ　ｍｅｄｉｕｍ）中てはｎｏｄ 遺伝子の転写の活性化はより低く；さらには、単純な培地から調製した培養液上 清を使用するとＮｏｄファクターの精製は容易である。該培地の組成は、例えば 以下のようなものである・ 一無機塩： １４−７　ｍＭ　Ｋ　ＨＰ　Ｏ；　１１−５　ｍ　Ｍ　Ｋ　２　ＨＰ０４；１ｍ Ｍ　Ｍｇ５Ｏ；０．４６ｍＭ　ＣａＣｌ２；３７μＭ　ＦｅＣｌ３、 一有機化合物： ５．３ｍＭＬ−グルタミン酸ナトリウム；７．４ｍＭコハク酸ナトナトリウム； ２μビオチン；１０μＭ　ルテオリン。

Ｂ、１．化合物の精製 Ｂ、１．１．化合物はブタノールを用いてリゾビウム　ツリロティ（Ｒｈｉｚｏ ｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ　）の培養培地（１５１）から抽出する（３リツト ルのＢｕＯＨを用いて２回抽出）。

ブタノール相を水（１リツトル）で洗った後、減圧下にて濃縮した。得られた残 渣を水（５００ｍｌ）に溶解し、酢酸エチルで２回抽出する（２回３００ｍ１） 。水相を最後に濃縮して凍結乾燥する。

Ｂ、１．２．逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーブタノール抽出により得られた残 渣を、７．５Ｘ２５０ｍｍの１０μｍ　μｍボンダバク（μｍ　Ｂｏｎｄａｐａ ｋ）　Ｃ１８カラム−ウォーター　アソシエイツ（Ｗａｔｅｒ　Ａｓ５ｏｃｉａ ｔｅｓ　）　−上で、流速２　ｍｌ／ｍｉｎにて、８０−２０　水−エタノール 混合物Ａから純粋エタノールＢまでの直線状勾配を用いて逆相ＨＰＬＣクロマト グラフィーに供する（Ｆｉｇ、１．１）；検出は２２０　ｎｍで実施する。生物 学的活性を示すエリアを更に精製するために回収する。

Ｂ、１．３．ゲル浸透クロマトグラフィー該分画を、セファデックス（５ｅｐｈ ａｄｅｘ　）　Ｌ　Ｈ２０カラム（ＩＸ２０ｃｍカラム、ＬＨ２０フェーズ（ｐ ｈａｓｅ）、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　）上でエタノールのような 溶媒中、流速４　ｍｌ／ｈｏｕｒにてゲル浸透により精製する。検出は２２０　 ｎｍで実施する。カラムはあらかじめポリエチレングリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ）標 準液を用いてキャリブレーションを行なった（Ｆｉｇ、１．２参照）。活性な陰 を施した分画を回収する。

Ｂ、１，４．イオン交換クロマトグラフィー活性化合物（陰を施したエリア）を 、イオン交換カラム（１ｘ２ｃｍＤＥＡＥ−トリスアクリルカラム（ＤＥＡＥ− Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　ｃｏｌｕｍｎ）　；　Ｉ　Ｂ　Ｆ）上で、５ｘｌＯ’Ｎ） リス−塩酸緩衝液、ｐＨ＝８．２中Ｏと０．ＩＮの直線状ＮａＣ１勾配を用いて 溶出する（Ｆｉｇ、１．３）。

Ｂ、１．　５．逆相分析ＨＰＬＣクロマトグラフィー最終精製段階は、分析カラ ム（４，５ｘ２５０ｍｍ；５μｍスフェリソルブ（５ｐｈｅｒｉｓｏｒｂ　）　 ／　Ｃ１８フェーズ）上で、溶媒として８０−２０　水−アセトニトリル混合物 を流速ｌ　ｍｌ／ｍｉｎで用いる逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーである；３０ ０μｇを注入する（Ｆ　ｉ　ｇ、１．　４　ａ）　。こうして、２２０　ｎｍで 吸収する２つのピークが検出され、これらは生物学的活性を示す。構造的な研究 によると、実際には、平衡した２つの型（フリーのα及びβアノマー型（ａｎｏ ｍｅｒｉｃ　ｆｏｒｍ）　）として出現する同一の化合物であることが判るであ ろう。

Ｂ、２．成分の分析 Ｂ、２．１．モノサッカライド類の分析化合物を完全に加水分解（３Ｎ　ＨＣｌ 、３　ｈ；１００℃）した後、過アセチル化（ｐｅｒａｃｅｔｙｌａｔｅｄ）メ チルグリコシドに誘導化した後、２−デオキシ−２−アセトアミドグルコース又 はアセチルグルコサミン（ＮＡｃＧｌｃ）と同定された単一のモノサッカライド が蒸気相クロマトグラフィーで検出される。該糖はキラルなアルコールと共にグ ルコシドパーアセテート（ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ　ｐｅｒａｃｅｔａｔｅ　）を調 製、Ｄ及びＬ型シリーズの（−）−２−ブタノール−Ｎ−アセチルグルコサミン 標準とｖＰＣを使用して比較した後に、Ｄシリーズであることが判明した。

化合物を四重水素化ホウ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ　ｂｏｒｏｄｅｕｔｅｒｉ ｄｅ　）　（ＩＮ　ＮａＢＤ４／Ｈ２０；　１８ｈ　；　２０℃）を用いて還元 し、制御されたメタツリシス（ＩＮＭｅＯＨ／ＨＣＩ；８０°Ｃ，１ｈ）を実施 した後、水−ジクロロメタン分配を行う。水相にはｖＰＣで同定された１−〇− Ｍｅ−ＮａｃＧｌｎと２−デオキシ−２−アセトアミドグルコ−スが含まれる（ Ｆｉｇ、２．１）；ｖＰＣによる同定は、ヘリウム及びＦＩＤ検出器を使用して ０．３２ｍｍＸ３０ｍ　ＯＶ１カラム上で実施する。有機相には、Ｃ１６：２脂 肪酸によりＮ−アセチル化されているグルコサミンのメチルグルコシドが含まれ 、これは、パートリメチルシリル化された誘導体（ｐｅｒｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓ ｉｌｙｌａｔｅｄ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ　）について文献のデータを用いた電 子衝撃マススペクトルにより同定される（　Ｄｅｍａｒｙ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｎｏｕｖ、　Ｊ、　Ｃｈｉｍｉｅ、１９７７．２．３７３−３７８）；脂 肪酸により窒素原子がアミド化され、パートリメチルシリル化された１−ＯＭｅ グルコサミンの電子衝撃マススペクトル（ＥＩ−ＭＳ）をＦｉｇ、２．３に示す 。側鎖を接触水素化し、メタツリシス（ＭｅＯＨ，３Ｎ　ＨＣＩ；２ｈ；１００ ℃）そしてアセチル化を行なった後、バーアセチル化誘導体のｖｐｃ分析−０， ３２ｍｍｘ３０ｍ　ＯＶ１カラム上ヘリウム及びＦＩＤ検出器を用いて実施−に より、１−ＯＭｅ−ＧｌｃＮＡｃ及びパルミン酸メチル（少量のステアリン酸メ チルを伴う）を可視化することによって、該Ｎ−アシルー糖の構造を確認するこ とが可能となる（Ｆｉｇ、２゜２）。

該分析により、添付のＦｉｇ、３に要約した分析手順を用いて、３タイプのグル コサミン：ＮＡｃＧｌｃ、還元性ＮａｃＧ１ｃ及びＮ−アシルＧｌｃの存在を確 認することが可能である。

Ｂ、２，２．脂肪酸組成 化合物中に存在する脂肪酸をけん化（５％　ＫＯＨ，１８ｈ；８０℃）後に単離 し、メチルエステルの形態でｖｐｃ分析−０，３２ｍｍ、Ｘ３０ｍ０Ｖ１カラム 上でヘリウム及びＦＩＤ検出器を使用−に供した（Ｆｉｇ、２゜４）。該試験に より、主要なＣ１６：２脂肪酸に加えて、他の少量物：Ｃ１６：Ｏ”　１６：１ 、Ｃ１８：０及びＣ１８：１の同定が可能となった。

０１６：２脂肪酸の２つの二重結合の位置を、パーフルオロベンジルエステルか ら形成されたカルボキシレートのＭＳ−ＭＳマススペクトルから特定することは 可能であり（Ｊ。

Ｃ，Ｐｒｏｍｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｒａｐｉｄ　Ｃｏｍｍ、　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃ ｔｒｏｍ、、１９８７゜１．８Ｏ−８２）、鎖の２及び９位に位置していた。

Ｂ、２．３．スルフェート官能基の検出３５Ｓ−ラベルされた硫酸ナトリウムの 存在下で細菌を培養した後肢化合物を精製し、ＵＶ−吸収プロフィールと３５８ −取り込みとの間で観察された関係から、該化合物中にスルフェート官能基が存 在することを証明することができる。

Ｆｉｇ、ｌ、４ｂは、３５Ｓの取り込みで得られた上記関係を示すものであり、 これは、（３５Ｓ）−Ｎａ　Ｓｏ　中で培養後、Ｆｉｇ、１．４ａで示されたプ ロフィールに基き分画化して液体シンチレーションにより放射活性を測定して得 たものである。

Ｂ、２．　４．グリコシド間結合形式の決定種々のグルコサミン間の結合形式は 、ＮａＢＤ４で還元した化合物のパーメチル化、加水分解及び既述の方法に従っ てアルジトールアセテートの調製（Ｋ、　５ｔｅｌｌｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　、　１９７３．１５５−．４６４−４７２）後 、ＶＰＣ−ＭＳ分析により決定された；還元された化合物をパーメチル化して得 られたアルジトールアセテートの電子衝撃マススペクトルをＦｉｇ、２．５に示 す。該試験により、４位と６位において置換された還元性グルコサミン、末端グ ルコサミン及び１位と４位において結合されたグルコサミンにそれぞれ由来する 、１．　２．　３及び５位（スペクトルａ）及び２，３．４及び６位（スペクト ルｂ）においてテトラメチル化され、並びに２，３及びと６位（スペクトルＣ） においてトリー〇−メチル化されたアルジトールアセテートを同定することが可 能となる。

Ｂ、３．マススペクトル Ｂ、３．１．ポジティブモード（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｍｏｄｅ）　Ｆ　Ａ　Ｂマ ススペクトロメトリー 該化合物のポジティブモードＦＡＢマススペクトロメトリー（Ｆｉｇ、４．１、 ｍ／ｚ　４，０００がらｍ／ｚ１００までスキャンニング（ノミナルマス））は 、ｍ／ｚ−１１２５に対応するナトリウム−含有イオンをともなった擬分子イオ ン（ｐｓｅｕｄｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　１ｏｎ）　（Ｍ＋Ｈ）　＋、ｍ／　ｚ　 ＝　１１０３を示す。ｍ　／　ｚ　＝　１０２３および８０２において、それぞ れスルフェートとＮＡｃグルコサミンスルフｘ　−ト（ＮＡｃＧＩｕｃｏｓａｍ ｉｎｅ　５ｕｌｆａｔｅ　）の喪失（１ｏｓｓ　）に基づくフラグメントイオン も観察された。ｍ／ｚ＝８０２のイオンの分解が、ＭＳ−ＭＳスペクトロメトリ ーで観察され（Ｆｉｇ、４−２；Ｂ／Ｅスキャン）、種々のモノサッカライド間 の切断の後、ｍ／ｚ＝５９９及び３９６における２つのグリコシリルフラグメン トとなる。これら２つのスペクトルより、還元糖がスルフェート官能基で置換さ れ、末端糖がＣ１６：２脂肪酸で置換された直線上のテトラサツカライド構造を 確認することができる。

Ｂ、３．　２．ネガティブモード（ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｍｏｄｅ）　Ｆ　Ａ　Ｂ マススペクトロメトリー ｍ、／ｚ＝１１０１における擬分子イオン（Ｍ−Ｈ）−とは別に、ネガティブモ ードＦＡＢマススペクトロメトリーはグリコサイドキャビティー　（ｇｌｙｃｏ ｓｉｄｅ　ｃａｖｉｔｉｅｓ　）に起因し得るフラグメントを示す。これらイオ ンの分析から、上述したのと同様な構造上の結論に至る：マトリックスとしてチ オグリセロールを使用したネガティブＦＡＢイオン化マススペクトルを示すＦｉ ｇ、４．３を参照。

Ｂ、４．ＮＭＲ Ｂ、４．１．　’ＨＮＭＲ及びプロトン等核（ｈｏｎ＋ｏｎｕｃｌｅａｒ）２Ｄ −ＮＭＲ（ＣｏＳＹ） ＩＨＮＭＲ及びＣｏＳＹ−ＮＭＲスペクトルに関するデータから、以下の構造的 要素を確認することができる：ａ）側鎖は、ＩＨＮＭＲにおいて２つの二重結合 に対応する２タイプのビニルプロトンを示す。低磁場の２つのシグナル（δ＝５ ．９５ｐｐｍ；ＩＨ及びδ＝６．８０ｐｐｍ；ＩＨ）は、カルボニル官能基に共 役している二重結合によるものであり、Ｅ立体配置に特徴的な大きなカップリン グコンスタント（Ｊ＝１５Ｈｚ）を有している；　Ｆ　ｉ　ｇ。

５．１は上述の’ＨＮＭＲスペクトルを示す；溶媒にはＣＤ３０Ｄを、周波数は ３００ＭＨｚが用いられる（”Ｂｒｕｋｅｒ″装置）。鎖中の磁気的に等価な２ つのプロトンは単独のシグナルとして現れる（δ＝５．３５ｐｐｍ）。これら２ つの二重結合のプロトンは、２Ｄ−ＣｏＳＹにおいては、直鎖に特徴的である他 の脂肪族性プロトンとの一連の相関（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）を示す；Ｆｉｇ 、５．２は、溶媒２Ｄ−ＮＭＲスペクトルを示す。

ｂ）アノメリック（ａｎｏｍｅｒｉｃ　）プロトン：サツカライド領域のＣ０３ Ｙ’Ｈ等核２Ｄ−ＮＭＲスペクトルをＦ　ｉ　ｇ。

５．３に示す：溶媒としてＣＤ３０Ｄを用い、周波数３０Ｑ　Ｍ　Ｈｚを用いて 得られた（”Ｂｒｕｋｅｒ”装置）該スペクトルは、３．４〜５．２ｐｐｍのサ ツカライドプロトン領域にアノメリックプロトンに由来するただ一つの相関しか 持たない５つのシグナルを示す。さらに、該スペクトルのこの領域において相関 がないことから示されるように、水の分解されていないコンプレックス（ｕｎｒ ｅｓｏｌｖｅｄ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｆｏｒ　ｗａｔｅｒ　）によりどのシグナル もマスク（ｍａｓｋ　）されていない。これらアノメリックシグナルは、β結合 の３つのダブレット（δ＝４．４０から４．５５１）Ｉ）ｍ；３Ｈ；Ｊ＝８．５ Ｈｚ）及びα及びβ型のアノメリックプロトンに由来する２つのダブレット（δ （α）＝５．Ｏ５ｐｐｍ；Ｊ＝３．４Ｈｚ及びδ（β）＝４．６０ｐｐｍ；Ｊ＝ ８゜５Ｈｚ）に対応する。

Ｃ）環のプロトン：サツカライド環は、フリーのα及びβ型のオリゴサツカライ ドが共存することによりスプリット（５ｐｌｉｔ）するアセトアミド基のメチル シグナルにより特徴付けられる（δ＝２．０から２．１５ｐｐｍ；６ｓ；９Ｈ） 。該環の他のプロトンは３．２から３．９ｐｐｍの間で共鳴している。よりマス クされていない３つのシグナルのみがスルフェート基に近く位置している水素に 由来している。２Ｄ−ＣｏＳＹ　（Ｆ　ｉ　ｇ、５．３）で観察されたこれら３ つのシグナル間の相関モードは、プロトン５及び６（Ｈ５／Ｈ６ｂ、Ｈ５／Ｈ６ ａ及びＨ６ａ／Ｈ６ｂ相関）に特徴的なものである。この結果から、スルフェー ト官能基を６位に位置付けることが可能となる。

Ｂ、　４．２．１３ＣＮＭＲ プロトン−デカップルされた１３ＣＮＭＲスペクトル（Ｆｉｇ、５．　４）の種 々のシグナルの由来に基き、以下の要因から二不飽和（ｄｉ−ｕｎｓａｔｕｒａ ｔｅｄ　）脂肪酸鎖、グルコサミン間のβ１→４結合様式及び６におけるスルフ ェートの位置を確認することが可能となった：Ｆｉｇ、５．４は、５０．４ＭＨ ｚ　（″ｂｒｕｋｅｒ″装置）にて溶媒としテＤ２０を使用して得られた１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを示す：ａ）脂肪酸鎖：側鎖（Ｃ２−から０１６−）の炭素の ケミカルシフトは、共役二重結合（Ｃ２，とＣ３弓δ−１２５及び１５５ｐｐｍ ）及び内部二重結合（Ｃ＋とＣ；δ＝１３９　１（１，− ３ｐｐｍ）を有する脂肪酸に特徴的なものである。

ｂ）アノメリック炭素：非還元性モノサッカライドのアノメリック炭素に由来す る主要（ｐｒｅｐｏｎｄｅｒａｎｔ　）なシグナル（δ＝１０３．７ｐｐｍ、） は、ＮＡｃＧｌｃのメチルグルコピラノシドの０１と同様なケミカルシフトを示 す。より弱い強度の２つのシグナルは還元性グルコサミンの０１に由来し、これ ら２つのフリーなアノメリック型として現れる（δＣａ＝９３．ｌｐｐｍ及びδ Ｃ１β＝９７．　８ｐｐｍ）ａ Ｃ）環二文献データによると、種々のシグナルの帰属（ａｔｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ）により、テトラサツカライド中のβ１→４結合が確認される。この帰属は、還 元性グルコサミンの炭素が２つのグループのシグナルに分離するため複雑である 。

６位にスルフェート官能基が存在することは、該官能基を有している炭素６がマ スクされていないことから支持される（δＣ６−１＝６８．７ｐｐｍ）。

実施例２−ＮｏｄＲｍ−１フアクターの生物学的活性の検出 （ｉ）ザートら（Ｚａａｔ　ｅｔ　ａｌ　）により記載されたヴエツチ（ｖｅｔ ｃｈ）の根毛変形の特異的活性試験（Ｈａｄ）（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１９８７，１６９．３３８８−３３９１）、及び（ｉ　 ｉ）フォーシャーら（Ｆａｕｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ）により記載されたアルファ ルファ（１ｕｃｅｒｎｅ）根毛の変形及び分枝（ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ　） 試験（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１９８８．エユ物学的活性から、本発明の物 質が、その生産がｎｏｄ遺伝子の制御下にある植物特異的な共生シグナルである ことが判明した。

確かに： １）種々の物理化学的性質に基づいた３タイプの精製、即ち、イオン交換、ゲル 濾過及び逆相クロマトグラフィーの後に、全ての場合において、該分子の存在− そのＨＰＬＣプロフィール、マススペクトロメトリー及び’ＨＮＭＲスペクトル によって特徴付けられる−とアルファルファに対するその特異的Ｈａｄ活性との 間に絶対的な相関関係が観察された。

２）ｎｏｄ遺伝子の活性の増大（転写の誘導もしくはこれら遺伝子のコピー数（ ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｃｏｐｉｅｓ　）の増加による）は、分子の生産の増大と 関連している一方で、ｎｏｄＡ又はｎ、　ｏ　ｄ　Ｃ遺伝子中のＴｎ５　ｈラン スボゾンによる突然変異は該生産を抑制する効果を有している。

３）根毛分枝バイオアッセイにより検出された化合物ＮｏｄＲｍ−１の生物学的 活性は、非常に高く且つ特異的である。

ＮｏｄＲｍ−１溶液は、１０−”−１０−１０Ｍのオーダーの濃度において、同 種宿主（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｈｏｓｔ）であるアルファルファにおけるＨａ ｄ反応を引き起こすが、異種宿主（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｈｏｓｔ）であ るヴエッチでは引き起こさない。ＮｏｄＲｍ−１化合物（化学式ＩＩ参照）は１ ０”Ｍの濃度でもアルファルファに対して尚活性を示す。

ＮｏｄＲｍ、−１化合物に関するＩＨＮＭＲスペクトルは、９５％以上の純度を 示す（Ｆｉｇ、５．１参照）。

オーキシンやサイトカイニンのような植物ホルモンに特徴的である芳香族核を含 む分子は、活性フラクションからは検出されなかった。それゆえ、外部経路（ｅ ｘｏｇｅｎｅｏｕｓｒｏｕｔｅ　）から添加した場合これら植物ホルモンが作用 する限界濃度（１０’Ｍ）よりも約１０００．０００倍低い濃度である１０−１ ２Ｍ未満の濃度において、ホルモン性夾雑物混入が存在する可能性があるので、 観察された効果がこのような夾雑物に由来しないことを示すものである。

宿主特異的な遺伝子において影響を受けたアール、メリロティ（Ｆｌ、　ｍｅｌ ｉｌｏｔｉ　）突然変異株の研究から、生存しているリゾビウム細胞の共生行動 の特異性とそれらの無菌上清のＨａｄバイオアッセイの特異性との間の絶対的な 相関関係が明らかにされたので、上記Ｎｏｄシグナルが特異的感染及び根粒着性 （ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ　）の誘導に係わっていることを示すものである。

ＮｏｄＲｍ−１化合物は非常に高い生物学的活性とともに非常に高い特異性を有 している。事実、１０”Ｍのオーダーの非常に低い濃度で宿主植物において検出 される反応を引き起こすが、オーキシンやサイトカイニンのような公知の植物ホ ルモンは、かなり高い濃度（１０”−１０−８Ｍ）で作用する。一方、先行文献 に記載され且つ低い濃度（１０’Ｍ）において作用する“エリジター（ｅｌｉｃ ｉｔｏｒ　）”型オリゴサツカライド類は、特異的ではなく、これに対して、本 発明によるＮｏｄＲｍ−１シグナル分子は活性の非常に高い特異性を有している ：即ち、１０”’Ｍの濃度において同種植物であるアルファルファには作用する が、ヴエッチのような非宿主植物に対しては１０”’Ｍの濃度でも不活性のまま である。該分子はそれゆえ、植物に対する活性に関しては新規でかつ重要な特性 を示すものである。

細菌の不存在下及び低濃度（１０−７−１０’Ｍ）において、シグナル分子Ｎｏ ｄＲｍ−１は、アルファルファの根における多節形成（ｎｏｄｏｓｉｔｙ　ｆｏ ｒｍａｔｉｏｎ　）の誘導を惹起し、該多節（１ｏｄｏｓｉｔｉｅｓ　）は、共 生細菌によって引き起こされるアルファルファの多節の存在論的（ｏｎｔｏｌｏ ｇｉｃａｌ）、形態学的及び構造上の（ａｎａｔｏｍｉｃａｌ　）特徴を示す。

ＮｏｄＲｍ−１はそれゆえ、アルファルファの根に対して器官形成効果（ｏｒｇ ａｎｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　）を有するものである。

細菌の不存在下及び非常に低い濃度（１０−９Ｍ−１０−１２Ｍ）において、化 合物Ｎｏｄ、Ｒｍ−１はアルファルファの根毛の変形及びマメ科（Ｌｅｇｕｍｉ ｎｏｓｅａｅ　）の共生遺伝子の転写誘導を引き起こす。アール、メリロティ（ Ｒ。

ｍｅｌｉｌｏｔｉ）存在下にて同じ薬量でＮｏｄＲｍ、−１化合物を添加すると 、感染及び根の多節形成を促進させる。例えば、該化合物を、播種時に種子にコ ーティングすることによりマメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓｅａｅ　）に添加するこ とによって、多節形成及び窒素固定の確立を促進できるものである。

スルフェート化された（　５ｕｌｆａｔｅｄ、　）へキソサミンのオリゴマーが 細菌から単離されたのは初めてであることを強調することは重要である。事実、 スルフェート化された糖は動物からは単離されたことがあるものの、今までに植 物もしくは細菌から検出されたこともなければ、まして単離されたこともない。

さらには、本発明によるスルフェート化されアシル化されたヘキソサミンオリゴ マーは、微小用量においても活性を有する点において、顕著な生物学的活性を示 すものである；事実、それらは植物ホルモンに比べて少なくとも１．Ｏｏ、ｏｏ ｏ倍活性が高い。このような低い用量でこのような活性を有する天然物質の使用 は、植物分野において今までに提案されたことがない。この顕著な活性は、本発 明の物質が特定のレセプターに対して親和性−植物ホルモン類を含めて、今まで に知られている生成物より実質的に高い親和性−を有していることを示唆するも のである。糖に対して親和性を有するレセプターは、一般的に糖タンパク質及び 特にレクチンの構造を有している；しかしこのようなレセプターは動物界にも存 在する：本発明による物質はそれゆえ重要な治療学的活性を有する可能性がある に違いないと考えられている。特に、本発明による治療剤は、とりわけ、ヒト及 び動物における病原体に対する防御機構の刺激に適している。

実施例３−リゾビウム　メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）の 培養液からの精製によるＡｃ−ＮｏｄＲｍ−１及びＡｃ−ＮｏｄＲＭ−３物質の 調製Ａ、　化合物の製造 “過剰生産性（ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）”のプラスミドｐＧＭ１１４９を アール、メリロティ（Ｒ，ｍｅ　１ｉ　１ｏｔｉ）２０１１菌株に導入する代り に、調節遺伝子対ｓ　ｙ　ｒ　Ｍ　／　Ｎ　ｏ　ｄ　Ｄ　３だけを含むプラスミ ドｐＭＨ５８２を導入すると、共通及び特異的なｎｏｄ遺伝子の転写の顕著な増 大並びにＮｏｄファクターの生産の増大もまた生ずる。このような菌株の上清か らのブタノールによる抽出物（ｂｕｔａｎｏｌ　ｉｃ　ｅｘｔｒａｃｔｓ）は、 これらをＨＰＬＣクロマトグラフィーによって分画した場合、アール、メリロテ イ　（Ｒ，ｍｅｌｉｌｏｔｉ）２０１１菌株（ｐＧＭ１１４９）の抽出物のそれ とは異なるプロフィール（ｐｒｏｆｉｌｅ）を示し、これは新規化合物が製造さ れていることを意味する。

得られた化合物を実施例１に記載された手順に従って精製する。最後の逆相分析 （ｒｅｖｅｒｓｅｄ　ｐｈａｓｅａｎａｌｙｔｉｃａｌ）ＨＰＬＣクロマトグラ フィーのステップによってＡｃ−ＮｏｄＲＭｍ−１化合物をＡｃ−ＮｏｄＲｍ− ３化合物から分離できる。

２、構造の検討 ２．１．ＡＣ−ＮｏｄＲｍ−１化合物の構造化合物Ａｃ−ＮｏｄＲｍ−１は、ナ トリウムメタル−トによる処理によって、実施例１において構造が決定されたＮ 　ｏ　ｄ　Ｒｍ　−１に転換される。

２．１．２．質量分析 化合物Ａｃ−ＮｏｄＲｍ−１のポジティブモード（ｐ。

ｓ　ｉ　ｔ　ｉｖｅ　ｍｏｄｅ）ＦＡＢ質量スペクトル（Ｆ　ｉ　ｇ。

６Ａ）は、ｍｌｚ　１１６７の（Ｍ＋、Ｎａ）＋イオン及び十 ｍ／ｚ＝１１８９の（Ｍ＋　２　Ｎ　ａ−Ｈ）　だけでなく、ｍ／　ｚ　＝　１ １４５にプロトン化された分子イオン（ｐ　ｒ　ｏ　ｔｏｎａｔｅｄ　ｍｏ！ｅ ｃｕｌａｒ　１ｏｎ）を示す。ＭＳ／ＭＳＳ／側定法（Ｆｉｇ、　６Ｂ：　Ｂ／ Ｅ　スキャン（ｓｃａｎ））による上記プロトン化分子イオンの分解により、ｍ ｌｚ　１０６５、ｍｌｚ　８４４、ｍ／ｚ６４１及びｍ、／ｚ　４３８のフラグ メントイオン（ｆｒａｇｍｅｎｔ　１ｏｎ）が生じる。ｍｌｚ　１０６５及びｍ ｌｚ　８８４のフラグメントイオンはそれぞれＳ　Ｏ３及びＮ−アセチル−Ｄ− グルコサミンスルフェートの喪失に由来する。ｍｌｚ　６４１及びｍｌｚ　４３ ８のフラグメントは、グリコシド間結合（ｉｎｔｅｒｇｌｙｃｏｓｉｄｅｂｏｎ ｄｓ）の分解によって得られるグリコシリウムイオン（ｇｌｙｃｏｓｙｌｉｕｍ 　１ｏｎ）に対応する。これら二つのスペクトルは、化合物Ａｃ−ＮｏｄＲｍ− １が非還元性末端グルコサミン（ｎｏｎｒｅｄｕｃｉｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　 ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）上のアセテート基（ａｃｅｔａｔｅ　ｇｒｏｕｐ）の 存在によってのみ化合物ＮｏｄＲｍ−１と異なることを示す。

化合物Ａｃ−ＮｏｄＲｍ−１のＩＨＮＭＲスペクトルによって、化合物ＮｏｄＲ ｍ−１について実施例１（Ｂ。

４．１１項）に記載された構造上のエレメントを確証することができる。

（ｉ）共役（結合）したものを含む二つのＥ配置にある二重結合 （１１）β結合に特有なアノメリックシグナル（ａｎｏｍｅｒｉｃ　ｓｉｇｎａ ｌｓ） （ｉｉｉ　）　６位のスルフェート基に特徴的なシグナル。

更に、化合物ＮｏｄＲｍ−１のスペクトルにはなく、Ｏ−脱アセチル化（０−ｄ ｅａｃｅｔｙｌａｔ　１ｏｎ）すると消失してしまうδ＝４．１６ｐｐｍ及びδ ＝４．４６ｐｐｍの二つのシグナルによって、非還元性末端糖の６位のアセテー ト基の位置を特定（ｌｏｃａｌｉｚｅ）できる。

２．２．化合物Ａｃ−ＮｏｄＲｍ−３の構造ポジティブモードＦＡＢ質量スペク トル（Ｆ　ｉ　ｇ、　）によって化合物Ａｃ−ＮｏｄＲｍ−３の構造を確立した 。ｍ／　ｚ　＝　１３７０のナトリウム含有イオン（Ｍ＋Ｎａ）＋及びｍ、／ｚ ＝１３９２の（Ｍ＋　２　Ｎ　ａ−Ｈ）＋だけでなく、ｍ／ｚ＝１３４８にプロ トン化された分子イオンが観察される。ｍ／ｚ＝１２６８及びｒｎ　／　ｚ　＝ 　１０４７のイオンはそれぞれ（Ｍ＋Ｈ）＋からのＳＯ及びＮ−アセチルグルコ サミンスルフェートの喪失に由来する。ｍ　／　ｚ　＝　８４４、ｍ／ｚ＝６４ １及びｍ　／　ｚ　＝　４３８のイオンはグリコシド間開裂（ｉｎｔｅｒｇｌｙ ｃｏｓｉｄｅ　ｃｌｅａｖａｇｅ）によって得られるグルコシリウムイオン（ｇ ｌｙｃ。

ｓｙ　ｌ　ｉｕｍ　ｉ　ｏｎ）に由来する。このスペクトルは以下のことを示す 。すなわち、Ａｃ−ＮｏｄＲｍ’−３は＝（ｉ）五つのＤ−グルコサミン誘導体 の直鎖（ｌｉｎｅａｒ　ｃｈａｉｎ）から成る： （ｉｉ）非還元性末端グルコサミン残基上に炭素数１６の二不飽和（ｄｉｕｎｓ ａｔｕｒａｔｅｄ）のＮ−アシル鎖及び０−アセテート基を有する； （ｉｉｉ　）還元性Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基上にスルフェート官能 基（ｓｕｌｆａｔｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｇｒｏｕｐ）を有する。

エンドキチナーゼ（ｅｘｏｃｈｉ　ｔ　１ｎａｓｅ）（ストレプトコッカス　グ リセウス（Ｓｔ　ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）から抽出、ジグ７ 　（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）　）の存在下てＡｃ−ＮｏｄＲｍ−３化合物をインキュベ ートすると、特にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、及びＮ−アシル−Ｏ−アセ チル−Ｄ−グルコサミン残基間を放出する。これは、最初の三つのＮ−アセチル −Ｄ−グルコサミン残基間の結合かβ−１，４型のものであることを示す。

エンドキチナーゼ（ｅｎｄｏｃｈｉ　ｔ　１ｎａｓｅ）（これもまたストレプト コッカス　グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔ。

ｃｏｃｃｕｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）からの抽出による、ボエリンガー（Ｂｏｅ　ｒ 　ｉｎｇｅ　ｒ））によりＡｃ−Ｎｏｄ、Ｒｍ−３を消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ）すると、Ｎ−アシル−〇−アセチルーＤ−グルコサミンを生成し、このことは 、非還元性末端残基との結合がまたβ−１，４型のものであることを示す。

実施例４−リゾビウム　レグミノサルム　ビオヴアーヴイシアエ（Ｒｈｉｚｏｂ ｉｕｍ　ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ　ｂｉｏｖａｒ　ｖｉｃｉａｅ）培養液か らのＮＯｄファクターの調製 Ａ、Ｎｏｄファクターの製造 欧州諸国では、この１０年間にエントウ及びフィールドビーン（ｆｉｅｌｄ　ｂ ｅａｎ）のようなタンパク質に富んだ植物の栽培がかなり発達した。そのため、 本発明者らは、これらのタンパク質に富んだ植物の共生細菌であるリゾビウム　 レグミノサルム　ビー、ヴイ、ヴイシアエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｅｇｕｍｉ ｎｏｓａｒｕｍ　ｂ。

ｖ、　ｖｉｃｉａｅ）によってＮｏｄファクターを製造する研究を始めた。

本発明者らは、これらシグナルの生産を増大させることを目的として、アール、 レグミノサルム（Ｒ，ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）２４８菌体にプラスミドｐ ｌＪ１０８９を導入した。ｐＬＡＦＲ１ベクターから誘導されたこのプラスミド は、アール、レグミノサルム（Ｒ，ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）の全Ｎｏｄ領 域、即ち、オペロンｎ。

ｄＤ、　ｎｏｄ、へ　ＢＣＩＪ、　ｎｏｄＦＥＬ　Ｓ　ｎｏｄＭＮＴ。

ｎｏｄＯを含む（ダウニーら（Ｄｏｗｎｉｅ　ｅｔ　ａｌ。

）、ＥＮｉＢＯＪ、、１９８３．　２．　９４７−９５２）。

ｎｏｄ遺伝子の転写を誘導させるために、ルテオリン（ｌｕｔｅｏｌｉｎｅ）の 代りにフラバノン、ナリンゲニンを使用し、アール、メリロティ（Ｒ，ｍｅ　１ 　ｉ　ｌｏｔ　ｉ）と同一の培地で２４８菌株（ｐｌＪ１０８９）を培養する。

ｎｏｄ遺伝子を誘導した後、培養上清は安定なヴエツチ種（ｖｅｔｃｈ　５ｐｅ ｃｉｅｓ）（ビシアサティヴア亜種ニグラ（Ｖｉｃｉａ　５ａｔｉｖａ　５ｕｂ ｓｐ、　ｎｉｇｒａ））の根毛の変形（ｄｅ　ｆ　ｏ　ｒｍａ　ｔ　１ｏｎ）の 高い活性を示す。この活性は、共通遺伝子ｎｏｄＡＢＣにおいて突然変異された アール、レグミノサルム（Ｒ，１ｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）２４８菌株の培養 上清では検出さ実施例１　（Ｂ、１．　１．　）に記載された手順に従って培養 培地からＮｏｄ化合物を抽出する。抽出物を凍結乾燥し、次に、実施例１　（Ｂ 、１．　２．　）に記載された手順に従って逆相ＨＰＬＣによってクロマトグラ フィーを行う（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｅｄ）。Ｎｏｄ化合物を、次に、５ ｅｐ−ｐａｋ　ＱＭＡカートリッジ（つｔ−タースミ’、１ポア（Ｗａｔｅｒｓ 　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））上でアセテートの形で精製する。化合物を５ｍｌの無 水エタノールで溶出させる。

Ｃ０構造決定 ポジティブモードＦＡＢ質量スペクトルは支配的に三つのプロトン化された分子 イオンを、それぞれｍ　／　ｚ　＝　１０８９、ｍ／ｚ＝１０９１及びｍ／ｚ　 １１１７のそれらのナトリウム含有イオン（Ｍ＋Ｎａ）　に付随して、ｍ／ｚ＝ １０６７、ｍ／ｚ＝１０６９及びｍ／ｚ＝１０９５に示す。Ｍ　Ｓ　／Ｍ　Ｓ分 光測定法によるｍ、／ｚ＝１０８９　（ｍ、／ｚ＝１０９１及びｍ／ｚ＝１１１ ７それぞれ）のイオンの分解によって、ｍ／ｚ＝８６８（それぞれｍ／ｚ＝８７ ０及びｍ／ｚ＝８９６）　、ｍ／ｚ＝６６５　（それぞれｍ／ｚ＝６６７及びｍ 、　／　ｚ　＝　６９３　）並びにｍ／ｚ＝４６２（それぞれｍ／ｚ＝４６４及 びｍ　／　ｚ　＝　４９０　）のフラグメントイオンが生成される。これらのイ オンは、Ｎ−アセチルグルコサミン残基に対応する質量が２０３のフラグメント の喪失を引続きともなうグリコシド間（ｉｎｔｅｒｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）の分裂 によって得られる。

これらのスペクトルはＮｏｄＲ１化合物が線状のＮ−アセチルへキソサミン鎖か ら成ることを示す。ｍ／ｚ＝４６２．４６４及び４９０のイオンは、種々Ｎ−ア シル化された０−アセチルへキソサミンに対応する。

非還元性末端残基に結合（ｃａｒｒｉｅｄ　ｂｙ）した脂肪酸を、Ｂ、２．２． 項に記載された手順に従ってけん化した後、ＧＣ／ＭＳによって分析した。この 研究によっＣ、及びＣ。

て次の主たる脂肪酸二Ｃ１６：Ｏ’１５．１　１８゜１を同定できた。

上記より明らかなように、本発明は、ここに、より明快に記載されたこの実行（ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ）、具体的表現（ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）及び 適用（ａｐｐｌ　１ｃａｔ　１ｏｎｓ）に限定されるものではない；それどころ か、本発明の枠組又は目的（ｓｃｏｐｅ）からはずれることなく当業者が思い付 く全ての変形を包含する。

ＮＯｄＲｍ ＮＡｃＧｌｃ　＋　Ｃ１６：Ｏ脂肪酸 Ｆ工Ｇ、６−Ａ ｍＨｚ Ｆ工Ｇ−６−Ｂ Ｆ工Ｇ、７ 要約書 実質的に純粋な物質は、ＮＯｄファクター又はそのアナログの一つの構造を有す る。Ｎｏｄファクターは、その生合成がリゾビウム科（Ｒｈ１ｚｏｂｉａｃｅａ ｅ　）　、特にリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）属、ブラディリゾビウム（ ＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕＩｌ＋）属、ジノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏ ｂｉｕｍ　）属及びアゾリゾビウム（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）属に共通し ている、少なくとも一つの根粒着性遺伝子（ｎｏｄＡＳＢ、Ｃ）の制御下にある ことを特徴としている。上記物質は、エキソポリサッカライド類に由来しないリ ボ−オリゴサツカライドからなり、一般式（Ｉ）で示される。一般式（Ｉ）中、 その構造を有しているＮｏｄファクターは、植物に特異的な共生シグナルであり 、且つ該Ｎｏｄファクターが関連する宿主植物への細菌の感染能力を高めること が可能であり、及び／又は該Ｎｏｄファクターが関連する宿主植物上での根粒形 成を促進することができ、及び／又はマメ科の共生遺伝子の転写を誘導すること ができる。植物処理への適用並びにヒト及び動物において活性のある治療剤。Ｇ は、種々置換された、例えば、窒素原子上にアセチル基が、酸素原子上にスルフ ェート基、アセチル基及び／又はエーテル基が置換したヘキソサミンを示し、Ｒ １、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は同−又は異なって、Ｈ１ＣＨ３ＣＯ−１ ＣｘＨ９Ｃ○−（ＸはＯ〜１７の整数を、ｙは１〜３５の整数を示す）、又は例 えばカルバミル基のような他の任意のアシル基を示し、Ｒ４は、少なくとも１２ 個の炭素原子を含むモノ−、ジー又はトリ不飽和脂肪族鎖を示し、ｎは１〜４の 整数を示す。

（Ｉ）

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｎｏｄファクター又はそのアナログの一つの構造を有する実質的に純粋な物 質であり、Ｎｏｄファクターの生合成がリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａ ｅ）、特にリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、ブラディリゾビウム（Ｂｒａ ｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、シソリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ） 属及びアゾリゾビウム（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に共通している、少なく とも一つの根粒着性遺伝子（ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ）（ｎｏｄＡ、Ｂ 、Ｃ）の制御下にあることを特徴とし、上記物質がエキソポリサッカライド類に 由来しないリポーオリゴサッカライドからなることを特徴とする物質。
2. ２．実質的に純粋な物質がその構造を有しているＮｏｄファクターが、植物に特 異的な共生シグナルであり、且つ、関連する宿主植物への細菌の感染能力を高め ることが可能であり、及び／又は関連する宿主植物上での根粒形成を促進するこ とができ、及び／又はマメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓｅａｅ）の共生遺伝子の転写 を誘導することができる請求項１に記載の実質的に純粋な物質。
3. ３．実質的に純粋な物質がその構造を有しているＮｏｄファクターが、レクチン リガンドの構造的特性（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を有して いることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の実質的に純粋な物質。
4. ４．下記一般式Ｉで表されることを特徴とするリポーオリゴサッカライド物質： ▲数式、化学式、表等があります▼式Ｉ［式中、 −Ｇは、種々置換された、例えば、窒素原子上にアセチル基が、酸素原子上にス ルフェート基、アセチル基及び／又はエーテル基が置換したヘキソサミンを示し 、−Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は同一又は異なって、Ｈ、ＣＨ３Ｃ Ｏ−、ＣｘＨｙＣＯ−（ｘは０〜１７の整数を、ｙは１〜３５の整数を示す）、 又は例えばカルバミル基のような他の任意のアシル基を示し、−Ｒ４は、少なく とも１２個の炭素原子を含むモノ−、ジ−又はトリ不飽和脂肪族鎖を示し、 −ｎは１〜４の整数を示す。］。
5. ５．Ｇが： ・アール．メリロティ（Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）中ではＮ−アセチル−Ｄ−グル コサミン６−スルフェートを示し、・アール．レグミノサルムビー．プイ．ビシ アエ（Ｒ．ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍｂ．ｖ．ｖｉｃｉａｅ）中では、Ｎ−ア セチル−Ｄ−グルコサミンを示すことを特徴とする請求項４に記載のオリゴサッ カライド。
6. ６．下記式（ＩＩ）： ▲数式、化学式、表等があります▼式ＩＩ［式中、Ｒは、Ｈ又はＣＨ３ＣＯ−を 示し、ｎは２又は３である。］で示されることを特徴とする請求項４及び５のい ずれかに記載のオリゴサッカライド。
7. ７．出発物質としてリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）の培養上清を使 用する精製プロセス、オサイド合成（ｏｓｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｅｓ）における 連続的又は収束性の合成を利用するルーティンプロセス、及びリゾビウム科（Ｒ ｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ　ｆａｍｉｌｙ）又はその他に属する微生物中にクロー ン化されたｎｏｄ遺伝子を出発物質として使用し、必要に応じて、適当なプロモ ーターの制御下及び／又は適当な突然変異を受けた調節遺伝子の存在下で、遺伝 子工学により該物質を製造するプロセスを含んでいる群から選ばれることを特徴 とする請求項１〜６のいずれかに記載の物質の製造方法。
8. ８．第１段階において、（１）共通及び特異的ｎｏｄ遺伝子及び与えられたリゾ ビウム科細菌（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の調節遺伝子 を含む断片、もしくは（２）ｎｏｄ遺伝子の発現のための調節遺伝子のいずれか を、リゾビウム科細菌（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又は 他の任意の適当な細菌中で複製可能なプラスミド中にクローニングすることによ り、組換プラスミドが得られる。次いで、リゾビウム科細菌（Ｒｈｉｚｏｂｉａ ｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又は他の任意の適当な細菌は、Ｎｏｄファクター を高度に過剰生産する突然変異菌株を得るべく、該組換プラスミドを導入して修 飾され、該突然変異菌株は適当な培養培地中にて培養され；第２段階においては 、培養上清を回収し、適当な低級アルコールで抽出して精製するか、又は抽出残 査を固−液抽出に続いて逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグ ラフィー（ｇｅｌｐｅｒｍｅａｔｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、イオ ン交換クロマトグラフィー及び逆相分析ＨＰＬＣクロマトグラフィーを行うこと により精製することを特徴とする、精製により、請求項１〜６のいずれかに記載 の物質を製造する方法。
9. ９．Ｎｏｄファクター−過剰生産性プラスミドが、非エキソポリサッカライド生 産性変異体リゾビウム科細菌中に導入される請求項８に記載の物質の製造方法。
10. １０．Ｎｏｄファクターを高度に生産するリゾビウム科細菌の野生株を出発物質 として使用し、該株を適当な培養培地中にて培養した後、培養上清を回収し、請 求項８に記載の第２段階の方法に従って精製することを特徴とする請求項１〜６ のいずれかに記載の物質の製造方法。
11. １１．その唯一の又は一つの活性成分が請求項１〜６のいずれかに記載の物質で あることを特徴とする植物処理剤。
12. １２．その唯一の又は一つの活性成分が１０−６Ｍ〜１０−１４Ｍの濃度で存在 することを特徴とする請求項１１に記載の植物処理剤。
13. １３．その唯一の又は一つの活性成分が請求項１〜６のいずれかに記載の物質で あることを特徴とするヒト及び動物において活性のある治療剤。
14. １４．組成物中に１０−５Ｍ〜１０−８Ｍの濃度で存在することを特徴とする請 求項１３に記載の治療剤。