MX2011004592A - Lipoquito oligosacaridos que estimulan la simbiosis en una micorrizacion arbuscular. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a lipoquito oligosacáridos, obtenibles de hongos micorríticos arbusculares, que son útiles para estimular la simbiosis micorrítica arbuscular y la formación de raíces laterales.

Description

? POQUITO OLIGOSACÁRIDOS QU E ESTIMU LAN LA SIMBIOSIS EN UNA MICORRIZACIÓN ARBUSCULAR La invención se refiere a lipoquito oligosacáridos que intervienen en la simbiosis de la microrrización arbuscular y a sus aplicaciones.

Los hongos micorríticos arbusculares (MA) establecieron asociaciones simbióticas con las raíces de plantas durante más de 400 millones de años, desde la aparición de las primeras plantas terrícolas, lo que sugiere que los hongos MA ayudaron a las plantas en la colonización que estas hicieron de la tierra (Remy y col., 1994). Este grupo de hongos, a los que recientemente se dio la nueva denominación de Glomeromycota, es uno de los que tiene más amplia distribución y las asociaciones con MA están ampliamente distribuidas por todo el reino vegetal, comprendidas las angiospermas, gimnospermas, pteridófitas y algunas briófitas (Smith y Read, 2008). Entre las angiospermas, cuando menos el 80% de las especies puede formar simbiosis con MA, siendo las únicas excepciones de importancia las Brassicaceae y las Chenopodiaceae. Los hongos MA tienen la capacidad de transferir nutrientes minerales raros o con muy escasa solubilidad, tales como fósforo, cinc y cobre, desde el suelo hacia la planta que, a su vez, proporciona hidratos de carbono al hongo. Este intercambio de nutrientes puede ser de importancia crucial cuando la fertilidad del suelo y la disponisibilidad de agua son bajas, condiciones que limitan seriamente la producción agrícola en la mayor parte del mundo (Smith y Read , 2008).

Otra asociación simbiótica conocida entre plantas y microorganismos del suelo es la simbiosis rizobial: En contraste con la simbiosis micorrítica arbuscular, que está vastamente distribuida entre las plantas, la simbiosis rizobial se limita a las legumbres y, en vez de hongos, entraña bacterias fijadoras de nitrógeno a las que colectivamente se denomina rizobios, que pertenecen a varios géneros, incluyendo Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium y Sinorhizobium. La simbiosis rizobial da por resultado la formación de estructuras específicas, los nodulos, sobre las raíces de la legumbre hospedante. Los nodulos proporcionan un ambiente adecuado para los rizobios, permitiéndoles fijar el nitrógeno molecular y suministrar nitrógeno combinado al hospedante leguminoso. La iniciación de la asociación rizobio - legumbre depende de las señales simbióticas que producen ambos organismos simbiontes. Las señales que emite la planta son, por lo común, flavonoides que se excretan en los exudados radiculares. Estos flavonoides interactúan con factores de transcripción rizobial de la familia NodD, que activan la transcripción de genes de nodulacion (nod) que intervienen en la producción de las moléculas de señalización bacteriana denominadas factores Nod (Dénarié y col., 1996). Los factores Nod comparten una estructura básica común que consiste en una cadena central de quitina de cuatro o cinco residuos de N-acetil glucosamina beta unión en 1 ,-4, N-acilados en el extremo no reductor con un grupo de ácido graso de longitud y grado de insaturación variables. Esta estructura básica se puede metilar en N aún más, en el extremo no reductor y también se los puede sustituir con O en el extremo no reductor y/o en el extremo reductor. Esta variedad de sustituyentes brinda una vasta diversidad de factores Nod con diferentes estructuras (para la descripción de diversas estructuras de factores Nod , véase Dénarié y col. , 1 996; D'Haeze y col., 2002). La especificidad dentro de la interacción legumbre / rizobio (es decir, una especie dada de rizobios forma nodulos en ciertas especies de legumbres) es resultado de esta diversidad.

La disección genética del sendero interviniente en la señalización del factor Nod en las raíces de la legumbre modelo Medicago truncatula identificó varios genes involucrados en este sendero (Stacey y col. , 2006). Hay cada vez mayor cantidad de evidencias de que los receptores de factores Nod son quinasas similares a receptores con dominios LysM que se unen a azúcares, tales como las que están codificadas por los genes NFP y LYK3 de M. truncatula. La interacción de un factor Nod con su receptor induce una cascada descendente de señalización, comprendida la rápida afluencia de iones calcio, la aparición de picos de calcio y la expresión de genes específicos de nodulina. Estos sucesos en dirección descendente entrañan, en genes particulares, la codificación de proteínas intervinientes en la señalización de calcio, tales como DM11 , DM12 y DM13 de M. truncatula, que codifican, respectivamente, un canal de cationes, una quinasa parecida a un receptor con repeticiones ricas en leucina y una quinasa de proteína dependiente de Caz+/calmodulina y genes que codifican proteínas que intervienen en el control de la expresión de genes, tales como NSP1 y NSP2 que codifican factores de transcripción.

Aunque los hongos MA son extremadamente importantes, tanto en lo agricultura como en lo ecolog ía, los mecanismos celulares y moleculares que controlan la formación de la simbiosis micorrítica , son mucho menos conocidos que los que intervienen en la simbiosis rizobial.

Se demostró, en M. truncatula, que los programas de nodulación y micorríticos comparten, como mínimo, tres componentes (Catoira y col. 2000) a saber: los productos de los genes DM11 , DM12 y DM13 que intervienen en la señalización del calcio.

Sin embargo, los sucesos que tienen lugar en sentido ascendente y descendente de esta señalización de calcio todavía están deficientemente caracterizados en el caso de la simbiosis micorrítica arbuscular, en especial aquellos sucesos que intervienen en ia señalización temprana y que llevan al reconocimiento entre la planta y sus asociados fungióos. El estudio de estos sucesos se vio obstaculizado por los hechos: que el asociado fúngico es un simbionte obligatorio que no se puede hacer crecer en un medio puro de cultivo en ausencia de- plantas vivas y la ausencia de herramientas genéticas disponibles para este grupo de hongos (Harrison, 2005). Sin embargo se ha demostrado recientemente que las señales difundibles son intercambiadas entre los simbiontes ante la interacción física. En la planta lateral, los compuestos de la familia apocarotenoide, estrigalactonas, puede ser secretada en los exudados de raíz y estimular la ramificación en hifas de esporas en germinación de hongos MA, dando una señal a un interruptor fisiológico para el crecimiento fúngico presimbiótico activo (Akiyama y col. , 2005; Besserer y col. , 2006). Del lado del hongo, también se informó sobre la existencia de compuestos difundibles producidos por hongos MA y con capacidad para activar reacciones vegetales que se relacionan con el programa de endomicorrización (Kosuta y col., 2003; Weidmann y col. , 2004; Navazio y col., 2007). Dicho de modo más específico, una serie de experimentos efectuados con M. truncatula demostró hace poco que los hongos MA producen compuestos difundibles que tienen la capacidad de estimular la expresión de diversas respuestas de las plantas. Tres especies de Gigaspora y una especie de Glomus pod ían disparar, a través de una membrana de celofán, la inducción de la expresión del gen simbiótico MtENOD H en las raíces de plántulas (Kosuta y col., 2003). Tres patógenos fúngicos no desencadenaron la misma respuesta, lo que da apoyo a la hipótesis de que a la respuesta la indujo una molécula específica de señalización de hongos MA. De manera análoga se demostró que un hongo MA, Glomus intraradices, activa, a través de una membrana, la transcripción de genes vegetales cuya expresión depende del gen simbiótico DM13 (Weidmann y col. 2004). Por añadidura se descubrió que una señal difundible proveniente de hongos MA provocaba una elevación transitoria del calcio citosólico en cultivos de células de soja, así como la regulación positiva de genes relacionados con los DM11, DM12 y DM13 (Navazio y col. , 2007).

Olah y col. (2005) informaron que factores Nod provenientes de Sinorhizobium meliloti, el simbionte rizobial de M. truncatula, ten ían la capacidad de estimular la micorrización y la formación de raíces laterales en M. truncatula. La estimulación de la formación de ra íces laterales también se observó con factores d ifundibles provenientes de hongos micorríticos arbusculares (factores Myc), pero no con factores Nod provenientes de especies rizobiales (Sinorhizobium fredii y Rhizobium leguminosarum) , que no pueden nodular Medicago sp. Aquellos investigadores también informaron que todos los genes en el sendero de seña lización de factores Nod actualmente identificados comprendido, en particula r, el gen NFP que codifica el receptor putativo de factores Nod , así como los genes DM13 y NSP1, eran necesarios para la estim ulación de la formación de ra íces laterales por parte de los factores Nod, pero no por factores Myc, que únicamente precisaban los genes DM11 y DM12. Sobre la base de estas observaciones , estos autores propusieron un modelo que explica ba la esti mulación de la micorrización y de la formación de ra íces laterales en legum bres por ambos factores Myc y Nod . De acuerdo con este modelo , los factores Myc y los factores Nod , a los que reconocían diferentes receptores de la superficie celular, activaban un sendero común de señalización de DM I 1 /DM I2/DM I3; en el caso de los factores Myc, D M 11 y DM I2 eran suficientes para la estimulación de la formación de ra íces laterales, en tanto que DM I3 era necesario para la estimulación de la micorrización. Olah y col . también d iscu rrieron sobre la posible naturaleza q uímica de los factores Myc. Plantearon la hipótesis de que era improbable q ue fueran compuestos parecidos a las auxinas, dado que el efecto que tenían sobre el desarrollo radicular era diferente del observado con aquellos compuestos. También sugirieron que la estructura de esos factores debía de ser diferente de la estructura de los factores Nod , ya que daba la impresión de que el receptor de NFP los discriminaba.

En consecuencia, parece que aunque la existencia de "factores Myc" difundibles producidos por hongos MA, y que tienen la capacidad de activar respuestas en plantas, se reconoce en la tecnología, a la naturaleza química de estos factores no se la identificó hasta lo presente.

Ahora, los inventores de la invención han alcanzado éxito en la purificación de factores Myc a partir de los exudados provenientes tanto de raíces micorrizadas como de esporas en germinación del hongo MA Glomus intradices. También han establecido la estructura química, y demostrado que estimulan con eficacia el desarrollo del sistema radicular y la colonización de las raíces por parte de un hongo MA.

Los factores Myc purificados por los inventores son una mezcla de lipoquito oligosacáridos sulfatados y no sulfatados (LCO); que comparten con los factores Nod una cadena central común básica de quitina de residuos de N-acetil glucosamina unida en enlace beta 1 ,-4, acilados en N en el extremo no reductor con un grupo de ácido graso. Sin embargo, los factores Myc tienen estructuras más simples que los factores Nod. La única sustitución por O que se observa en los factores Myc es la sulfatación en O en el extremo de reducción de la molécula.

Ninguna otra sustitución en O, tal como O-carbamoilo en el extremo no reductor u O-fucosilo en el extremo reductor, se pudo detectar. La única sustitución en N en el residuo GIcNac de la terminal no reductora, para los factores Myc purificados provenientes de Glomus intradices es la acilación por ácidos grasos comunes, principalmente los ácidos oleico (C18: 1 ) y palmítico (C1 6:0). En cambio, la sustitución en N de factores Nod es más compleja. Con frecuencia es una doble sustitución por un grupo N-metilo y un grupo N-acilo (frecuentemente, ácido vaccénico), como en las cepas rizobiales que forman nodulos en la mayor parte de las legumbres tropicales y en las legumbres de la subfamilia Mimosoi'deae. A la metilación en N la especifica el muy difundido gen rizobial nodS (Dénarié y col. , 1 996). Como alternativa, la acilación en N por parte de un ácido graso poliinsaturado específico es la regla entre los rizobios que forman nodulos en las legumbres de clima templado del ciado de las Galegoides (Dénarié y col., 1996). De hecho, los LCO que tienen una estructura tan simple como la de los factores Myc caracterizada por los inventores, no se observaron entre los factores Nod sintetizados por las diversas cepas rizobiales que se estudiaron hasta ahora (Dénarié y col. , 1996; D'Haeze y col., 2002).

La invención proporciona un proceso para obtener factores Myc a partir de un hongo del grupo Glomeromycota, donde el mencionado proceso comprende la obtención de exudados a partir de raíces de plantas micorrizadas con el mencionado hongo o a partir de esporas en germinación del mencionado hongo; extraer los mencionados exudados con butanol y recuperar el extracto de butanol que contiene los mencionados lipoquito oligosacáridos.

De acuerdo con una modalidad preferida de la invención , el mencionado proceso comprende las etapas adicionales de someter el mencionado extracto de butanol a la extracción en fase sólida sobre una fase inversa C18, con sucesivos lavados en acetonitrilo al 20%, 50% y 100% y la recuperación de la fracción eluida en acetonitrilo al 50%, que contiene los mencionados factores Myc.

Aún de mayor preferencia, el mencionado proceso comprende las etapas ulteriores de someter la mencionada fracción eluida en acetonitrilo al 50%, a una cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa sobre una columna de fase inversa C1 8, empleándose un gradiente lineal de 20% a 100% de acetonitrilo y recuperando la fracción eluida en 30 - 48% de acetonitrilo que contiene lipoquito oligosacáridos sulfatados, y/ o la fracción eluida en 64-72% de acetonitrilo que contiene lipoquito oligosacáridos no sulfatados.

De acuerdo con una modalidad particular de la invención, el mencionado hongo proveniente del grupo Glomeromycota es Glomus intraradices.

Los factores Myc fúngicos también se pueden extraer, de otras especies de Glomeromycota que los producen, utilizando las etapas de extracción que se dieran a conocer arriba, o variaciones de ellas.

En el presente texto, a un factor Myc se lo define como un lipoquito oligosacárido representado por la fórmula (I) de en la que n = 0, 1, 2, 3, 4, o 5; de preferencia, 2 o 3; R, representa un sustituyente lípidico que contiene de 12 a 22 y, de preferencia, de 14 a 20, átomos de carbono, que puede ser saturado o mono, di, tri, tetra, penta o hexainsaturado; y R2 representa H o S03H.

De preferencia, el sustituyente lipídico Ri es una cadena de ácido graso. H-i también puede representar un análogo aromático de una cadena de ácidos grasos, tal como en los análogos de factores Nod que se dan a conocer en, por ejemplo, Grenouillat y col. (2004), o la PCT WO/2005/063784.

Ventajosamente, R<i representa una cadena de ácidos grasos sintetizados por hongos micorríticos arbusculares; en particular una cadena de ácidos grasos en C16 o C18, saturada o mono o di-insaturada. De preferencia, cuando la mencionada cadena de ácidos grasos es insaturada, comprende, cuando menos, una cis-insaturación (por ejemplo, el ácido oleico C18:1). A modo de ejemplos no limitantes de cadenas preferidas de ácidos grasos se pueden mencionar las C16:0, C18:0, C16:1u>5, C16:1ü)7, C18:1ü)5, C18:1ü)7, C18:1CO9, 18:2?6,9, C20:0 ¡so, C20: 1 oo9 y C20:4u)9,12, 15.

Los factores Myc adicionalmente se pueden caracterizar, y también diferenciar, de los lipoquito oligosacáridos de estructura relacionada, tales como los factores Nod, por las propiedades biológicas. Estas propiedades biológicas se pueden someter a prueba empleándose los bioensayos adecuados. En particular se pueden utilizar bioensayos basados sobre la capacidad de los factores Myc para estimular la formación de raíces laterales en la legumbre modelo M. truncatula. Dicho de modo más específico: si bien los factores Myc comparten con los factores Nod la capacidad de estimular la formación de raíces laterales en plantas de tipo silvestre pero no en los mutantes defectuosos en simbiosis dmil , dmi2 y dmi3, los factores Myc también tienen la capacidad , a diferencia de los factores Nod, de estimular la formación de raíces laterales en el mutante defectuoso en simbiosis nspl .

Si se deseare, también se cuenta con bioensayos para diferenciar factores Myc no sulfatados de factores Myc sulfatados (por ejemplo, si en un extracto fúngico se quiere separar fracciones que contuvieran factores Myc no sulfatados de las que contuvieran factores Myc sulfatados): por ejemplo, los factores Myc sulfatados tienen la capacidad de inducir la expresión del gen MtENODH en las raíces en crecimiento de M. truncatula, en tanto que los factores Myc no sulfatados tienen la capacidad de inducir la ramificación de los pelos radiculares en veza.

Los factores Myc se pueden purificar a partir de hongos, tal como se describiera arriba. También se los puede obtener por síntesis química y/o producir en células modificadas genéticamente. Por ejemplo, una cadena central de quito oligosacáridos, sulfatados o no, se puede sintetizar en bacterias recombinantes, tal como dan a conocer, por ejemplo, Samain y col. (1997, 1999) para la síntesis de precursores de los factores Nod, y posteriormente acilatar sobre el grupo amino libre del azúcar de la terminal no reductora, tal como se da a conocer, por ejemplo, en Ohsten Rasmussen y col. (2004). También se puede utilizar una cepa muíante de una bacteria de las Rhizobiaceae que produjera factores Myc en vez de factores Nod, por ejemplo, una cepa modificada genéticamente con el objeto de expresar, entre los genes estructurales del sendero biosintético de Nod, nada más que los que intervienen en la síntesis de la cadena central de quito oligosacáridos y los que intervienen en la acilación en N de la glucosamina de la terminal no reductora, por parte de un ácido graso adecuado de C16 o C18 y, como opción, los que intervienen en la sulfatación en O de la glucosamina de la terminal de reducción, tal como dan a conocer, por ejemplo, Ardourel y col. (1994), o Lugtenberg y col. (1995).

La invención también abarca mezclas de diferentes factores Myc de la fórmula (I) y, en particular, mezclas de factores Myc sulfatados y no sulfatados que constan de uno o más lipoquito oligosacáridos, de la fórmula (I), donde R2 representa H y uno o más lipoquito oligosacáridos de la fórmula (I), donde R2 representa S03H. Los lipoquito oligosacáridos de la mencionada mezcla pueden diferir aún más entre ellos por la cantidad de residuos de N- acetil glucosamina y/o la naturaleza del sustituyente (por ejemplo, la longitud y/o el grado de insaturación de la cadena de ácidos grasos).

Mezclas de los factores Myc de la invención se pueden obtener, por ejemplo, extrayendo factores Myc de hongos micorríticos arbusculares, tal como se describiera arriba, y recuperando el extracto fúngico. También se las puede obtener produciendo por separado los diferentes factores Myc y mezclándolos.

Los lipoquito oligosacáridos purificados o sintéticos y, más específicamente, los factores Myc purificados o sintéticos de fórmula (I) o las mezclas de ellos que se describe en la presente se pueden utilizar para estimular la micorrización y, de ese modo, tener una amplia gama de aplicaciones en agricultura, horticultura y silvicultura, para la mayor parte de las plantas cultivadas que pueden establecer micorrización y que, por consiguiente, poseen receptores de factores Myc.

Además de su utilización para estimular la simbiosis micorrítica arbuscular, a los factores Myc purificados o sintéticos o las mezclas de ellos también se los puede emplear: - para estimular la germinación de semillas, lo que puede ser útil para el tratamiento de semillas con una amplia gama de aplicaciones en agricultura, horticultura y silvicultura; - para estimular el desarrollo del sistema radicular, lo que es beneficioso para mejorar la nutrición de agua y minerales.

Se pueden usar, por ejemplo, para tratar semillas o agregarse a inoculantes que contuvieran hongos micorríticos arbusculares o agregarse al suelo o al sustrato de cultivo de la planta. A los factores Myc purificados o sintéticos que obedecen al presente invento se los puede emplear con cualquier planta, a saber: con plantas que puedan establecer micorrización, incluidas tanto plantas leguminosas como no leguminosas y comprendidas también las dicotiledóneas así como las monocotiledóneas tales como los cereales. Se los puede utilizar para plantas cultivadas en condiciones de cámaras de cultivo, así como en invernaderos, o en condiciones de campo.

También se los puede emplear para estimular la colonización micorrítica en la producción de inoculantes micorríticos (esto es, espora o hifas de hongos MA o fragmentos de raíces micorrizadas); como aditivo a los medios de cultivo que se utilizan para la producción de estos inoculantes por plantas que se cultivan en suelo o en condiciones hidropónicas o aeropónicas, o por cocultivo de hongos micorríticos con raíces escindidas.

La invención también comprende composiciones que contienen factores Myc purificados o sintéticos o mezclas de estos, y un portador agrícolamente adecuado. Las composiciones de la invención también pueden comprender cepas mulantes de bacterias Rhizobiaceae modificadas genéticamente con el objeto de producir factores Myc, en vez de factores Nod, tal como se describiera arriba. Las composiciones que se prefieren son aquellas que contienen una mezcla de factores Myc sulfatados y no sulfatados.

Como opción, los factores Myc se pueden combinar con otros constituyentes activos, tales como flavonoides; apocarotenoides, tales como estrigolactonas, o jasmonato, que son compuestos vegetales de los que se informó que actúan como señales simbióticas (Harrison, 2005; Akiyama y col., 2005; Besserer y col. , 2006).

La formulación de estas composiciones depende de la modalidad de aplicación que se pretende (por ejemplo, recubrir semillas, agregar a un medio de cultivo para la producción de inoculantes micorríticos, tratar la planta del suelo). Se los puede formular, por ejemplo, como sólidos dispersables en agua o solubles en agua, tales como polvos, granulos, pildoras o pel ículas; como soluciones, suspensiones o emulsiones acuosas líquidas, o como geles.

De acuerdo con una modalidad preferida, estas composiciones se asocian con material fúngico y/o vegetal, por ejemplo, con un inoculante de un hongo micorrítíco arbuscular o con semillas de una planta que tiene la capacidad de establecer micorrización , de modo ventajoso, las mencionadas semillas están recubiertas con la composición.

Ventajosamente, los factores Myc se utilizan en la composición en una concentración de 10"5 M a 10"12 M. Cuando se agregan a un medio de cultivo para la producción de esporas de hongos MA, se los puede emplear en una concentración de 1 CT6 M a 1 0~1 0 M ; de preferencia, en una concentración de 1 0"7 a 10"9 M en el medio. Cuando se los usa para el tratamiento de semillas o para estimular el desarrollo del sistema radicular, se los puede usar en una concentración de 1 0"B M a 1 0"1 0 M; de preferencia, en una concentración de 10"7 a 10"9 M . Cuando se emplea una mezcla de factores Myc sulfatados y no sulfatados, se pueden emplear concentraciones tan bajas como de 1 0"8 a 1 CT10 M.

La invención se habrá de comprender con mayor claridad con la ayuda de la descripción adicional, que se refiere a los ejemplos que se dan abajo y a los dibujos anexos. Se debe entender con claridad, sin embargo, que estos ejemplos y dibujos se dan tan sólo como ilustración del tema de la invención y en modo alguno no constituyen una limitación de él.

LEYENDAS DE LOS DIBUJOS Fig. 1. Ensayos biológicos que se utilizaron para detectar señales simbióticas de hongos MA a. El ensayo para MtENODU . Raíces de plántulas transgénicas de M. truncatula Jemalong A17 que llevan el constructor del pMtENOD 1 1-GUS reportero. La actividad de GUS se detecta por tinción histoquímica con b-glucurónico 5-bromo-4-cloro-3-indolilo. (1 ) Raíces control tratadas con acetonitrilo 2,5%. (2) Fracción después de SPE y elución con acetonitrilo al 50% diluido 40 veces. (3) La misma fracción con una ulterior dilución diez veces mayor. b. El ensayo VsHab. Pelos radiculares de veza ( Vicia sativa subsp. nigra) observados con microscopio óptico después de tinción con azul de metileno. ( 1 ) Los pelos radiculares tratados con una fracción inactiva son rectos. (2) Los pelos radiculares tratados con fracciones activas aparecen claramente ramificados.

Fig. 2. Perfil de extractos provenientes de exudados de raíz micorrizada, por HPLC en fase inversa semipreparativa C18.

La fase inicial ¡socrática con acetonitrilo al 20% duró 1 0 minutos y la siguió un gradiente de acetonitrilo 20-1 00% durante 20 minutos. El perfil revela la abundancia de material contaminante presente en los exudados de raíz micorrizada. Se recogieron fracciones cada dos minutos y se las sometió a prueba para establecer la actividad biológica sobre MtENODH y VsHab. Las barras horizontales indican el tiempo de retención de los compuestos en la fracción A que son activos sobre MtENODH , y de los compuestos de la fracción B, más hidrófobos, que son activos sobre VsHab.

Fig. 3. Perfil de extractos provenientes de exudados de esporas en germinación por HPLC en fase inversa semipreparativa C18.

Las condiciones cromatográficas son las mismas que en la figura 2. El perfil revela que los exudados de espora contienen mucho menos material contaminante que los exudados de ra íz micorrizada. Se recogieron fracciones cada dos minutos y se las sometió a prueba para establecer la actividad biológica sobre MtENOD H y VsHab. Las barras horizontales indican el tiempo de retención de los compuestos en la fracción A que son activos sobre MtENOD H , y de los compuestos de la fracción B, más hidrófobos, que son activos sobre VsHab.

Fig. 4. Influencia de una hidrólisis metanólica leve sobre la actividad biológica de la fracción A.

Se informó sobre una hidrólisis metanólica leve para eliminar el grupo sulfato de los LCO sulfatados, sin alterar otros rasgos estructurales de estas moléculas. La fracción A recogida durante la H PLC semipreparativa de exudados de espora en germinación estaba levemente hidrolizada y se la sometió a prueba para establecer la actividad biológica, en ensayos sobre MtENODH y VsHab. La actividad biológica se representa con barras verticales. Mientras que la fracción A no hidrolizada es activa sobre MtENODH e inactiva sobre VsHab, la fracción hidrolizada perdió actividad sobre MtENODH y ganó actividad sobre VsHab. Estos datos indican que la actividad biológica de la fracción A en el ensayo con MtENOD1 1 se debe a la presencia de LCO sulfatado.

Fig. 5. LCO tetrámeros sulfatados acilados en N por ácidos grasos C16.

Vestigios de UPLC/MS, en la modalidad negativa, de la fracción 4 aislada después de la H PLC C18 semipreparativa. Se proporcionan corrientes iónicas extraídas, correspondientes a tetrámeros sulfatados y los espectros correspondientes. Esta figura indica que compuestos que responden a m/z 1 101 ,5; 1 103,5 y 1 105,5 están efectivamente presentes en las muestras. Estos m/z corresponden a LCO tetrámeros sulfatados acilados en N por C16:2, C16:1 and C1 6:0, respectivamente. Con respecto a las intensidades relativas de los tres, parece ser que la de 1 105,5 (LCO-IV-C1 6:0) es la más abundante, seguida por la de 1 103.5 (LCO-IV-C16: 1 ).

Fig. 6. LCO tetrámeros sulfatados acilados en N por ácido graso C18: 1 .

Vestigios de UPLC/MS, en la modalidad negativa , de la fracción 5 aislada después de la HPLC C18 semipreparativa, mostrando que el compuesto más abundante (m/z 1 135,5) está acilado en N por un ácido graso C18:1 .

Este perfil también indica que en esta fracción (m/z 1 1 33.5) no hay presentes LCO que tengan un ácido graso C1 8:0, ya que este ion no es más que el isótopo +2 de los LCO que llevan la cadena C18: 1 . Tal como demuestra el segundo espectro de masa, el LCO insaturado en C 8 es un compuesto de muy escasa importancia.

Fig. 7. LCO pentámeros sulfatados acilados en N por acilo graso C18:1.

Este perfil muestra que también hay presentes lipoquitopentámeros pero, en comparación con los tetrámeros correspondientes (véase figura 5) son 30 veces menos abundantes, aproximadamente. Se puede detectar el LCO-V-C18: 1 .

Fig. 8. Comprobación de la presencia o la ausencia de un compuesto dado.

Cuando la masa solicitada no corresponde a iones presentes en la muestra, el perfil, en vez de dar un solo pico, da una cantidad muy grande de picos de fondo. El muy complejo perfil que se obtuvo con un m/z 1332.6 de corriente iónica demuestra la ausencia de un quitopentámero C1 8:2 en la muestra. En contraste, el pico único y neto que se observa con un m/z 1 334,6 de corriente iónica muestra con claridad la presencia de un pentámero C1 8:1 .

Fig. 9. Comparación del patrón de fragmentación por MS/MS del principal factor Myc sulfatado y del factor Nod en S. meliloti Demostrar la presencia de compuestos que tienen la masa adecuada en el tiempo esperado de retención en HPLC, no es suficiente para certificar su estructura. En consecuencia llevamos a cabo un análisis MS/MS del principal compuesto Myc sulfatado. Esta figura presenta la comparación entre el factor Nod tetramérico sulfatado acilado en N por C16:2 en MS/MS en modalidad negativa, de S. meliloti y el que se registró en el principal factor Myc tetrámero presente en la muestra. Iones característicos del extremo reductor a m/z 503 (Y2), 605 y 706 (Y3) se detectan con claridad en ambos casos, así como la característica pérdida neutral de 101 amu (ruptura intracíclica) a partir del ion molecular. El encaje perfecto entre los dos patrones de fragmentación indica la asociación estructural de las dos moléculas.

Fig. 10. Efecto de las fracciones de extracto de Myc sobre la formación de raíces laterales (LRF) en M. truncatula (A) La señal fúngica MA que estimula la LRF es anfifílica.

Comparación del efecto de extractos acuosos (Aq), de butanol (BuOH) y acetato de etilo (EA) de exudados de espora germinante (GSP24) sobre M. truncatula A17. El extracto de butanol estimula la LRF desde el día 5 en adelante (significativa a P<0,05), en tanto que los extractos acuoso y de acetato de acetilo no son activos.

(B) La estimulación de la LRF se hace por intermedio de la trayectoria de señalización simbiótica de DMI.

Comparación del efecto de extractos de butanol de exudado de raíz micorrítica (MRE1 ), después purificado por SPE eluido con acetonitrilo al 50%, sobre el tipo silvestre (A 17) de M. truncatula y sobre un mutante (Y 6) de dmil. El extracto de Myc estimula la LRF en el tipo silvestre, pero no en el mutante.

(C) Ambas fracciones A y B estimulan la LRF.

Después de una HPLC semipreparativa de exudados de raíz micorrizada (MRE-1 ) se recogió fracciones A y B. Fracción MRE-1 A contenía LCO sulfatados y la fracción MRE-1 B contenía LCO no sulfatados. Ambas fracciones estimulaban de manera significativa la LRF ( P<0,05).

Figura 11. Efecto de una mezcla de factores yc sulfatados y no sulfatados sobre la micorrización de Medicago truncatula. a. Micorrización en condiciones axénicas. Se cultivaron plantas en tubos de ensayo sobre medio M inclinados gelificados, sobre el que se incorporaron factores Myc en una concentración de 10"8 M . 50 esporas esterilizadas {Glomus intraradices) se sembraron próximas a raíces de plántulas. . La magnitud de la micorrización se midió contando el número de unidades de infección seis semanas después de la inoculación. Los resultados se analizaron mediante la prueba estadística no paramétrica Kruskal-Wallis. b. Micorrización en condiciones de falta de esterilización. Se cultivaron plantas sobre un sustrato compuesto por gránulos de arcilla calcinada; se las inoculó con 50 esporas esterilizadas de G. intraradices, añadiéndose factores Myc a la solución nutritiva en una concentración de 10"8 M. Tres semanas después de la inoculación se estimó la colonización radicular mediante el método de intersección de cuadrículas.

Figura 12. Efecto de los factores Myc sobre la arquitectura de las raíces, en Medicago truncatula. a. Efecto sobre la formación de raíces laterales. Histograma que muestra el efecto de una mezcla de factores Myc, tanto sulfatados como no sulfatados (NS + S), factores Myc (S) y factores Myc no sulfatados (NS) en concentraciones de 10"8 M, 1 0"9 M y 10~10 M , sobre la formación de raíces laterales del tipo silvestre de M. truncatula (A 17), ocho d ías después del tratamiento.

Se utilizaron cuarenta plantas por experimento y se llevó a cabo el análisis estadístico mediante la prueba de la t de Student entre las plantas control y las tratadas. b. Efecto sobre la longitud total de la raíz. Histograma que muestra el efecto de una mezcla de factores Myc sulfatados y no sulfatados sobre la longitud total de la raíz de plántulas. Las plántulas se cultivaron durante ocho días, se cortaron las raíces y el sistema radicular se exploró y midió mediante el programa informático WinRhizo. A los datos se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis. (*) y (**) denotan, respectivamente, una diferencia significativa (P<0.05) o sumamente significativa (P<0.01 ) y las barras representan el error standard de la media (SEM).

Figura 13. Análisis genético del sendero de señalización activado por los factores Myc, que conduce a la estimulación de la formación de raíces laterales.

Histograma que muestra el efecto del factor Myc no sulfatado (10-8 M) sobre la formación de raíces laterales del tipo silvestre (A17) de M. truncatula y mutantes dmi1 , dm¡2, dm¡3 y nsp 1 simbióticos del sendero de señalización. A las medias se las representa como porcentaje del valor de control ocho d ías después del tratamiento.

Para cada genotipo se combinaron datos provenientes de, como mínimo, dos experimentos independientes con 40 plantas por experimento y se llevaron a cabo las comparaciones estadísticas utilizándose la prueba t de Student entre controles y cada tratamiento (**) indica una diferencia sumamente significativa (P < 0,01 ) y las barras representan el error standard de la media (SEM).

Figura 14. Efecto de los factores Myc sobre la colonización micorrítica in vitro de raíces de zanahoria transformadas y escindidas. a. Efecto de una mezcla de factores Myc bacterianos sulfatados y no sulfatados. Se inocularon raíces con esporas esterilizadas de G. intraradices (10 esporas / mi de medio de cultivo) y se las trató una vez por semana, durante tres semanas, con mezcla, o sin ella, de factores Myc a 10"8M. Se observó la velocidad de colonización micorrítica al cabo de seis semanas. (**) denota una diferencia sumamente significativa con el control ( prueba t de Student, valor-P < 0,01 ). Las barras verticales representan el error standard de la media (SEM). b. Efecto de una mezcla de factores Mvc sintéticos sulfatados y no sulfatados. Se inocularon raíces con esporas esterilizadas de G. intraradices (100 esporas / mi de medio de cultivo) y se las trató una vez por semana, durante cuatro semanas, con mezcla, o sin ella, de factores Myc en una concentración de 1 0~8 M . Se observó la velocidad de colonización micorrítica al cabo de ochos semanas. (**) denota una diferencia significativa con el control ( prueba t de Student, valor-P = 0,01 1 9).

Figura 15. Efecto de los factores Myc sobre la micorrización de Tagetes patula. a : Efecto de una mezcla de Factores Myc sulfatados y no sulfatados sobre la cantidad de unidades de infección por planta (a1 ), la longitud de la raíz (a2) y la densidad de la infección (a3). Se inocularon plantas con alrededor de 100 esporas esterilizadas de Glomus intraradices y se las trató dos veces por semana durante tres semanas con factores Myc, o sin ellos, a 10"8M. La cantidad de unidades de infección, la longitud de la raíz y la densidad de unidades de infección se determinaron al cabo de cuatro semanas. (**) denota una diferencia sumamente significativa con el control (prueba de Student, valor-P = 0,004086). b : Efecto de Factores Mvc sulfatados (S), no sulfatados (NS) o de una mezcla tanto de sulfatados como de no sulfatados (NS + S) sobre la colonización micorrítica de raíces. Se inoculó plantas con alrededor de 100 esporas esterilizadas de G. intraradices y se las trató dos veces por semana durante tres semanas con factores Myc o sin ellos a 1 0"8 M. La velocidad de colonización se midió al cabo de cuatro semanas.

Figura 16. Efecto de factores Myc sobre la germinación de semillas de tomate. a. Efecto de Factores Myc no sulfatados (NS). sulfatados (S) v de una mezcla tanto de sulfatados como de no sulfatados (NS + S) sobre la germinación de semillas de tomate a 14°C. Se agregaron factores Myc a placas de germinación a 1 0"8 M , 1 0"9 M y 1 0"10 M. Se anotó la velocidad de germinación todos los días. Los resultados fueron analizados con la prueba de Kruskal-Wallls. (***) y (**) denotan, respectivamente, una diferencia significativa sumamente elevada (valor-P < 0,001 ) y muy elevada (<0 ,01 ) respecto del control y las barras verticales representan el error standard de la media (SEM). b. Efecto de una mezcla de factores Myc sulfatados y no sulfatados sobre la germinación de semillas a 14°C b1. Cinética de la germinación. Se añadió factores Myc en una concentración de 10~10 M. Los resultados fueron analizados con la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis . Después del día 6, las diferencias fueron muy significativas. Las barras verticales representan el error standard de la media (SEM). b2. Fotografía de placas de germinación representativas, con factores Myc y sin ellos, diez días después de la siembra.

MATERIALES Y MÉTODOS Fuentes naturales de Factores Mvc La cepa DAOM 197198 del hongo MA Glomus intraradices, que se mantuvo en cocultivo con raíces escindidas durante muchos años (Chabot y col . , 1992), está bien caracterizada y se está determinando la secuencia de su genoma . A esta cepa la utiliza la compañía PREMIER TECH para la preparación industrial de inoculantes comerciales y para la producción de esporas purificadas con fines de investigación científica. Por ejemplo, a estas esporas purificadas se las empleó como fuente de ADN para el proyecto de secuenciación del genoma de G. intraradices. Nosotros hemos utilizado dos clases de exudados, ambos preparados a partir de materiales que adquiridos de PREM IER TECH BIOTECHNOLOGI ES (Rivére-du-Loup, Québec, Canadá): (i) Exudados provenientes de raíces micorrizadas (EMR).

La producción de micorriza se consiguió mediante el cocultivo de G. intraradices con raíces transformadas escindidas de zanahoria. El medio de cultivo se solidificó con Phytagel. Después del crecimiento adecuado de las raíces micorrizadas, al gel se lo licuó mediante el agregado de citrato de sodio en carácter de agente quelante y al EMR líquido se lo acondicionó en recipientes de cuatro litros que se guardaron a 4°C. (ii) Exudados provenientes de esporas en germinación (GSP). Esporas estériles purificadas del hongo MA Glomus intraradices se acondicionaron por botellas que contenían un millón de esporas aproximadamente. Las botellas se guardaron a 4°C. Se hicieron germinar las esporas a 30° C en una incubadora con 2% de C02 durante 10 d ías.

Bioensavos utilizados para la purificación de factores Mvc Para detectar la presencia de señales simbióticas de hongos MA durante las diversas etapas de extracción y purificación , se utilizó tres bioensayos. (i) Se demostró que el constructo de M. truncatula ENOD11 ::GUS se inducía durante la formación de micorriza y por un compuesto difundible proveniente de diversos hongos MA (Journet y col. , 2001 ; Kosuta y col. 2003) (= ensayo MtENOD H ). (ii) Se demostró que a la formación de raíces laterales en M. truncatula la estimulaba un compuesto difundible proveniente de diversos hongos MA y que la respuesta necesitaba el sendero de señalización simbiótica de DMI (Olah y col. , 2005) (= ensayo MtLRF). (¡ii) Por añadidura utilizamos un ensayo modificado para la ramificación de los pelos radiculares de Vicia sativa (veza) que permite la detección de diversos LCO no sulfatados (= ensayo VsHab). (i) Inducción del gen simbiótico MtENOD 11 en Medicado truncatula transaénica.

Con anterioridad hemos demostrado, a través de experimentos en los cuales al hongo MA se le separaba de la raíz de la planta mediante una membrana de celofán, que un compuesto difundible de hongo MA puede inducir la expresión de un transgen MtENOD H promotor-givs/A en el crecimiento de raíces laterales de M. truncatula (Kosuta y col . , 2003). El protocolo que se siguió fue tal como se describiera anteriormente (Andriakaja y col., 2007) con las siguientes modificaciones: no se insertó un disco de papel sobre la parte superior de la placa de agar y el tratamiento se efectuó mediante el agregado de 40 microlitros por plántula. Para comprobar si la respuesta de ENOD 1 1 se inducía a través del sendero de señalización de DMl, hemos comparado la respuesta que se observó en el tipo silvestre línea A 7 de M. truncatula y enuna línea muíante que llevaba una mutación en el gen DM11 (mutación Y6). (ii) Ramificación de los pelos radiculares de veza La veza { Vicia sativa subsp. nigra) es una legumbre de semillas pequeñas que es conveniente para la observación microscópica de deformaciones en los pelos radiculares. A las deformaciones en los pelos radiculares de veza no sólo las desencadenan los factores Nod del simbionte bacteriano específico Rhizobium legumlnosarum bv. viciae sino, también una variedad de factores Nod no sulfatados (Roche y col. , 1991 ; Price y col., 1992).

Así, pues, este ensayo es apropiado para detectar la presencia de LCO no sulfatados. En informes previos, el ensayo se efectuaba en un medio líquido. Hemos diseñado un ensayo sobre placa de agar que es más sensible y reproducible. A semillas primero se las esterilizó en ácido sulfúrico durante 20 minutos, enjuagó dos veces con agua esterilizada y después trató durante 20 minutos en hipoclorito de calcio (5g/150ml después de filtración en papel) y enjuagó cinco veces con agua esterilizada. Las semillas se dejaron en agua durante toda una noche a 4°C, transfirieron sobre placas de agar e incubaron tres d ías a 4°C para aumentar la homogeneidad de la germinación. A las placas después se las dejó durante 36 horas a 22°C en la oscuridad para la germinación. Cinco plántulas jóvenes (longitud de ra íz de aproximadamente 1 cm) se sembraron en disco de Petri sobre placas de agar Fahraeus, rodeadas con parafilm y se las dejó tres días en posición vertical en una cámara de cultivo a 22°C. Cuando las raíces se volvieron pilosas, a lo largo de las raíces se depositaron con suavidad 40 microlitros de la solución que se iba a someter a prueba y a las plántulas se las cultivó durante 30 horas a 22°C. Para la observación de la ramificación de los pelos radiculares, se seccionaron las raíces, se insertaron entre un cubre y un portaobjetos en una solución al 0,02% de azul de metileno y fueron observadas bajo un microscopio óptico. Se observaron diez plantas por tratamiento.

Ensayos de micorrización Fuentes de inóculos de hongos MA para experimentos de micorrización fueron esporas esterilizadas de Glomus intraradices, ya fueran adquiridas de Premier Tech Biotechnologies Ltée (Riviére-du-loup, Québec, Canadá) o producidas sobre raíces de zanahoria transformadas y escindidas, tal como describen Bécard y Fortín (1988). Raíces micorrizadas de zanahoria transformadas se cultivaron tal como se describiera en Chabot y col. (1992) y se subcultivaron cada diez semanas sobre medio M (Bécard y Fortín, 1 988) gelificado con Phytagel al 0,4% (Sigma). Después de la solubilización del Phytagel con solución amortiguadora de citrato (Doner y Bécard, 1991 ), se recogieron esporas tal como se describiera , en condiciones de esterilidad y se guardaron a 4°C en agua ultrapura durante, como mínimo, cuatro semanas antes de que las utilizara.

Se llevaron a cabo pruebas de micorrización sobre tres especies de planta: la legumbre modelo M. truncatula y dos que no son legumbres, zanahoria (Daucus carota, familia Umbelliferae) y la damasquina (Tagetes patula, familia Asteraceae).

Se disolvieron factores Myc en agua / acetonitrilo (50/50) para preparar una solución madre al 10"3 M, la que se diluyó con agua o medio de cultivo hasta las concentraciones adecuadas. La misma cantidad de vestigios de solvente acetonitrilo se agregaron a placas control.

Micorrización ¡n vitro de raíces de zanahoria transformadas escindidas Raíces de zanahoria esterilizadas, transformadas y escindidas se cultivaron sobre medio M solidificado por Phytagel al 0,4% , a 24°C en la oscuridad y subcultivadas cada diez semanas (Chabot y col. , 1992). Se recogieron ra íces por solubilización de Phytagel con solución amortiguadora de citrato (Doner y Bécard, 1991 ) y se las lavó con agua desionizada esterilizada. Se prepararon placas para ensayo de micorrización del modo siguiente: en discos de Petri (0 90 mm) se vertió una primera capa de 20 mi de medio M que contenía 0,3% de Phytagel y se la dejó para que solidificara. Después se vertió una segunda capa del mismo medio, que contenía 20 o 200 esporas/mililitro y factores Myc en la concentración adecuada. En placas control, la solución de factores Myc se remplazó por el mismo volumen del medio que se utilizara para preparar la solución de factores Myc. Fragmentos de raíz se tendieron sobre la superficie de medio en la misma cantidad aproximadamente (número de fragmentos y longitud de raíz) en los diferentes discos. Los discos se cerraron con cinta Parafilm y se incubaron en la oscuridad, en una sala de cultivo a 24°C y 50% de humedad, durante seis u ocho semanas. Factores Myc se agregaron una vez por semana sobre la superficie del disco, durante las primeras tres o cuatro semanas, para experimentos de seis u ocho semanas respectivamente. Para observar la colonización fúngica, se recogieron raíces después de la licuación del Phytagel mediante solución amortiguadora de citrato, se lavaron y tiñeron con el método de tinta- vinagre (Vierheilig y col. 1 988). Se estimó la velocidad de colonización mediante el método de la intersección de cuadrículas (Giovanetti y Mosse, 1980).

Micorrización in vivo de Tagetes oatula Semillas de Tagetes patula, var. Légion d'honneur se obtuvieron de Caillard (84091 Avignon, France). Se cultivaron plántulas durante cuatro semanas en tubos tipo Falcon de 50 mi llenos con un sustrato formado por arcilla lavada y autoclaveada ( montmorillonita granular calcinada; ref "Oil Dry US Special", Brenntag Bretagne, Zl de Tory, BP41 , Avenue des Ferrancins, 71210 ontchanin). Para asegurar el regado de las plántulas, en los tubos se practicaron tres agujeros pequeños en el fondo y a los tubos se los colocó de manera individual en cajas pláticas de 120 mi (5,5cm de diámetro / 7cm de altura), cerrados con una tapa opaca perforada para recibir y fijar los tubos tipo Falcon.

Se llenaron cajas con 80 mi de agua y se envolvieron con hoja de aluminio. Se hidrató el sustrato de arcilla de los tubos de Falcon con 20 mi de solución con bajo contenido de fosfato Long Ashton (Hewitt y col, 1966). En cada tubo se colocó una semilla por debajo de la superficie del sustrato y alrededor de la semilla se dejó caer un centenar de esporas de hongo, en 1 mi de solución de factores Myc en una concentración de 10"7 M o 1 ml de solución control. Cada planta recibió 1 mi de solución de factores Myc en una concentración de 0"7 M o ml de solución control, dos veces por semana durante tres semanas. Se colocaron macetas en una cámara de cultivo, a 25°C, con un fotoperíodo de 16 horas y una intensidad de luz de 180 µ???e?e??.??"2^"1.

Se llevaron a cabo dos series de experimentos: en el primero, una mezcla de Factores Myc sintéticos sulfatados y no sulfatados se sometió a prueba con 12 plántulas por tratamiento. En el segundo, sulfatados y no sulfatados y una mezcla de ambos se sometieron a prueba con 20 plántulas por tratamiento. Las plantas se cosecharon al cabo de cuatro semanas. El sistema interior de raíces se tiñó con tinta negra Schaeffer (Vierheilig y col, 1998). La cuantificación de la colonización de las raíces por parte del hongo se realizó bajo una lupa estereoscópica y se emplearon dos métodos: (i) para el primer experimento se contó la cantidad de unidades de infección (zonas que conten ían arbúsculos, vesículas y redes internas de hifas) de cada planta y (ii) para el segundo método, el porcentaje de longitud de raíz colonizada por el hongo, es decir, que exhibía arbúsculos, vesículas o ambas se determinó mediante el método de intersección de cuadrículas (Giovannetti y col, 1980).

Micorrización de Medicaao truncatula en condiciones axénicas Se cultivaron plantas en tubos de ensayo, sobre 20 mi de medio M gelificado y dispuesto en pico de flauta (Oláh y col, 2005), tal como se describe en Ben Amor y col. (2003). Factores Myc en una concentración de 10"8 M (o solución control) se incorporaron directamente al medio estéril. Cincuenta esporas esterilizadas de G. intraradices se colocaron en el fondo de cada pico de flauta, cerca de la raíz de la plántula. Los tubos de ensayo se colocaron en una cámara de cultivo a 25°C, con un fotoperíodo de 16 horas y una intensidad de luz de 366 pEinstein.m"2.s"1. Al cabo de seis semanas la arquitectura del sistema radicular se analizó mediante el Winrhizo Scientific Software (Instruments Regent Inc, 2672 Chemin Ste Foy RD, Sainte Foy, Quebec, Canadá). La cuantificación de la colonización radicular se hizo por el recuento directo de las unidades de infección mediante una lupa estereoscópica, después de efectuarse la tinción de la raíz según el método de tinta- vinagre (Vierheilig y col, 1998).

Micorrización de Medicaao truncatula sobre un sustrato de arcilla calcinada Plántulas germinadas se cultivaron durante tres semanas en tubos tipo Falcon de 50 mi, tal como se describiera arriba para la micorrización de Tagetes. Veinte esporas de G. intraradices se dejaron caer alrededor de las ra íces de las plántulas, en 1 mi de solución de factor Myc al 1 CT7 M Myc o de control. Después cada planta recibió 1 mililitro de factor Myc en una concentración de 10~7 M , o 1 ml de solución control, dos veces por semana durante dos semanas. Se efectuaron dos series de experimentos con 12 plántulas por tratamiento. Las macetas se colocaron en una cámara de cultivo a 25°C, con un fotoperíodo de 1 6 horas y una intensidad de luz de 366 pEinstein.m"2.s"1.

Se cosecharon las plantas al cabo de 3 semanas. El sistema radicular interno se tiñó con tinta negra de Schaeffer (Vierheilig y col, 1998). El porcentaje de longitud de raíz colonizada por el hongo, o sea que exhibía arbúsculos, vesículas o ambos, se estableció con el método de la intersección de cuadrículas (Giovannetti y col. , 1 980) Bioensavos utilizados para poner a prueba la actividad de desarrollo de los factores yc Se diseñaron bioensayos para estudiar la actividad de desarrollo que tienen los factores Myc purificados o sintéticos. (i) Estimulación del desa rrol lo del sistema radicular de la leg um bre modelo M. truncatula.

Con anterioridad demostramos q ue un factor difu ndible proveniente de hongos MA estim ula la formación de ra íces latera les (LRF) en M. truncatula a través de la trayectoria de DM I (Olah y col . , 2005). Hemos utilizado este bioensayo para poner a prueba la actividad del desarrollo que tienen los factores Myc purificados. El protocolo que se sig uió es el que se describiera anteriormente, con la salvedad de que al m edio no se le agregó vitaminas.

La identificación de los genes de planta q ue interven ía n en la señalización de los factores Myc se llevó a cabo en M. truncatula, empleándose el análisis genético de la respuesta para LRF q ue ya se descri bió (Olah y col. , 2005) . Las respuestas de LRF a los factores Myc se estudiaron en la l ínea Jemalong A1 7 del tipo silvestre de M. truncatula, utilizada como control , y en los mutantes defectuosos para sim biosis dmi1 (Y6), dm¡2 (TR25), dm¡3 (TRV25), y nsp 1 (B85). (¡i) Germinación de semilllas de tomate Semillas de la variedad Heinz 1706 de tomate proven ían de la colección Núcleo de semillas de tomate del IN RA. Su provisión fue gentileza de René Damidaux, del laboratorio de "Génétique et Amélioration des Fruits et Légumes" ['Genética y Mejoramiento de Frutas y Legumbres] en el IN RA 84143 Montfavet cedex (France). De esta muestra de la colección núcleo, las semillas se multiplicaron en el LIPM (INRA-CNRS, Toulouse). Las semillas se guardaron a 4°C. Las semillas se esterilizaron durante 45 minutos en una solución filtrada de hipoclorito de calcio 0,262 (2,5 g of CaOCI2 in 75 mililitros de agua), a lo cual se le habían agregado dos gotas de Tween 20. Se eliminó, la solución de hipoclorito y las semillas se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril. Se prepararon placas de agar para germinación, disolviendo 9,375 g of Agar Difco Granulado (Becton-Dickinson) en un litro de agua destilada. Se preparó una solución de factor Myc 10~3 M en 50/50 agua / acetonitrilo y después se la diluyó con agua hasta alcanzarse las diluciones apropiadas. La misma cantidad de vestigios de solvente acetonitrilo se añadió a las placas control. Se sembró quince semillas por placa, con seis u ocho repeticiones por tratamiento. A las placas se incubaron en la oscuridad a 14°C, 20°C y 28°C. Se anotó todos los días la velocidad de germinación.

Análisis estadístico de los datos.

Los datos de los ensayos biológicos se analizaron en forma estadística con la prueba t de Student o con el análisis de la varianza para datos que seguían una distribución nomal y que tenían varianzas homogéneas, y las pruebas no paramétricas de Kruskal-Wallis o Wilcoxon para las distribuciones no normales. Los programas informáticos para estadísticas eran de R system (R Development Core Team, 2009).

Análisis bioquímicos Extracción líquido/ líquido para exudados de raíces micorrizadas: En un bulbo de dos litros, una primera vez se extrajo 1 ,6 litros de exudados de raíz micorrizada, con 400 mi (¼ de volumen) de butanol (1 -butanol o 2-metil -1 - propanol) y a la mezcla se la dejó reposar para su decantación, obteniéndose una fase limpia de butanol con una delgada interfase, lo que permitió una buena separación de las fases acuosa y de butanol (como mínimo, seis horas). Después, la fase acuosa fue extraído una segunda vez con 350 mi (aproximadamente 1 /5 del volumen) de butanol y se la dejó en reposo toda una noche. Después de esta segunda extracción, la fase total de butanol (extracción 1 y extracción 2) se evaporó hasta alcanzar un volumen de 0,5 litro aproximadamente, al que se lavó mediante una extracción líquido / líquido con el mismo volumen de agua bidestilada. La fase lavada de butanol se evaporó, se transfirió a un balón pequeño y se secó empleándose un evaporador rotatorio. Después, al extracto seco se lo volvió a disolver en 5 mililitros de agua/acetonitrilo (1/1 ) y se lo filtró en algodón (en forma preliminar, lavado con cloroformo) en un tubo de vidrio de 8 mililitros y después se la secó bajo corriente de nitrógeno.

Extracción líquido/ líquido para exudados de esporas en germinación Exudados provenientes de un millón de esporas en germinación (aproximadamente, 150 mi) se extrajeron, primero, con 1 /3 del volumen de acetato de etilo. A la mezcla se la dejó reposar para que se produzca la decantación , obteniéndose una interfase delgada y una buena separación de las fases acuosa y de acetato de etilo (como m ínimo, seis horas). La fase acuosa se extrajo una segunda vez con 1 /3 del volumen de acetato de etilo y se la dejó en reposo toda una noche. Después, a la fase acuosa fue extra ído con butanol (1 -butanol o 2-metil-1 -propanol) siguiéndose las mismas etapas que para la extracción del acetato de etilo. Los volúmenes de las fases butanol y acetato de etilo se redujeron a unos pocos mililitros, utilizándose un evaporador rotatorio. Cada fase se transfirió a un tubo de 5 mililitros y se secó bajo corriente de nitrógeno.

Purificación por extracción en fase sólida (SPE): Preparación de la columna: El sistema de SPE estaba constituido por una columna de vidrio Chromabond de 3ml llena con fase inversa C18 (SUPELCO Discovery DSC-1 8). En la parte inferior de la columna se introdujo un primer filtro de fibra de vidrio. La fase sólida se agregó al interior de la columna para representar una altura de 3,5 centímetros en la columna. Un segundo filtro de fibra de vidrio se colocó sobre la parte superior de la fase sólida y se lo empujó hacia adentro para comprimir la fase sólida. Antes de que se la usara, la columna se lavó con acetonitrilo (ACN) y con agua y después se la acondicionó con acetonitrilo (ACN) 20% en agua.

Prefiltración: Se disolvió extracto en un mililitro de ACN 20%. El extracto se filtró en algodón dentro de una pipeta Pasteur (en forma preliminar, lavada con cloroformo) y se lo depositó sobre la columna C18. El tubo y los filtros se enjuagaron con 1 ,5 mililitros de ACN 20%.

Cromatografía: Mediante el empleo de una jeringa, al extracto se lo empujó a través de la fase C 18. El l íquido que salió de la columna se recogió en un tubo de vidrio de 8 mililitros. Para eliminar los componentes no adsorbidos, la fase se lavó en forma abundante (equivalente al quíntuplo del volumen de la fase sólida con ACN 20% en agua). Este volumen se recuperó en el mismo tubo. Después, a las moléculas que quedaron retenidas en la columna se las eluyó con una solución al 50% de ACN en agua . Cuando el volumen de elución fue equivalente al quíntuplo del volumen de la fase sólida, se le recuperó en un segundo tubo de vidrio. Por último, a las moléculas intensamente adsorbidas se las eluyó desde la columna con ACN 100%. El volumen de solvente (alrededor de 6 mi) se recuperó en un tercer tubo. A las tres soluciones (20%, 50% y 100% de ACN) se las evaporó bajo corriente de nitrógeno, con el objeto de obtener residuos secos. A cada residuo después se lo pudo volver a disolver en el volumen adecuado para llevar a cabo la HPLC semipreparativa. Se empleó una columna de SPE para purificar 5 litros, aproximadamente, de exudados de raíz micorrizada.

HPLC semipreparativa: La purificación se efectuó en un módulo de separación Shimadzu LC10 para Cromatografía Líquida de AltoRendimiento (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) con una columna semipreparativa de fase inversa C18 (8 mm x 250 mm; 5 im, Equisorb, CIL-Cluzeau). El circuito de inyección tenía un volumen de 100 microlitros. El procedimiento cromatográfico fue el siguiente: durante 10 minutos en modalidad isocrática con solvente A (acetonitrilo 20% en agua), a lo que siguió un gradiente lineal durante 20 minutos desde el solvente A al solvente B (acetonitrilo 100% ) y otra etapa isocrática en acetonitrilo 100% durante 5 minutos. Dos minutos son necesarios para regresar a las condiciones iniciales (ACN 20%). La velocidad de caudal fue de 2 mi min"1 y la absorción UV se controló a 206 nm. La recolección de muestras a lo largo del gradiente se llevó a cabo cada minuto (2 mililitros), lo que dio por resultado 14 fracciones.

HPLC analítico suplementario para la detección de LCO no sulfatados La purificación se efectuó en un módulo de separación Shimadzu LC10 para Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) con una columna de fase C8 (Zorbax XDB-C8 HP-Eclipse (Hewlett Packard) 5pm, 4,6x150 mm) durante 5 minutos en modalidad isocrática con metanol 30% en solvente agua, a lo que siguió un gradiente lineal durante 20 minutos hasta el solvente metanol 100%, a lo que siguió otra etapa isocrática con metanol 100% durante 5 minutos. 2 minutos fueron necesarios para regresar a las condiciones iniciales. La velocidad de caudal fue de 1 mi min"1 y la absorción UV se controló a 206 nm. La recolección de muestras tuvo lugar a lo largo del gradiente y la etapa isocrática, con metanol 100% cada minuto (alrededor de 1 mililitro) de 15 a 23 minutos, produciéndose 8 fracciones.

Análisis de UPLC-ToF MS: Cada fracción que se recogió de la HPLC semipreparativa se sometió al análisis de UPLC-MS en un Acquity UPLC asociado con un espectrómetro de masas Q-Tof Premier (Waters Corporation). La columna UPLC era una columna Acquity (2,1 mm x 10 cm, 1 .7pm) (Waters, USA), y la velocidad de caudal era de 0,45 ml/min. Para los compuestos más hidrófilos (fracciones 1 a 9 de la HPLC semipreparativa), el programa era un gradiente lineal que iba desde ACN 10% (en 1 % ácido acético/ agua) hasta ACN 100% en un lapso de 7 minutos, a lo que seguía una etapa ¡socrática con ACN 100% durante 2 minutos y después regresar a las condiciones iniciales (2 minutos) y, por último, una etapa de reacondicionamiento de 1 minuto con ACN 10% (en 1 % ácido acético/ agua). Para obtenerse una mejor resolución de los compuestos más hidrófobos (fracciones 6 a 1 1 de la HPLC semipreparativa), el gradiente UPLC era más extenso: gradiente lineal que empezaba en ACN 25% en en 0,1 % ácido acético/ agua y llegaba a ACN 100% en un lapso de 7 minutos. Para el espectrómetro de masa, el capilar se fijó en 3,2 kV y el cono, en 10 V. El bloqueo interno se llevó a cabo mediante la introducción continua adentro de la fuente de una solución de leucina-encefalina. El espectrofotómetro se calibró antes de cada experimento. Los compuestos más hidrófilos (fracciones 1 a 9 de la HPLC semipreparativa) se analizaron, tanto en la modalidad negativa como en la positiva, con el objeto de respectivamente facilitar la detección de compuestos aniónicos (sulfatados) y catiónicos (no sulfatados).

Para la fragmentación de moléculas se seleccionaron iones específicos y se sometieron al análisis MS/MS mediante la utilización de energía de colisión a 15V.

Hidrólisis leve: Este método se emplea para eliminar el grupo sulfato de los LCO sulfatados, sin afectar el resto de las moléculas (Roche y col. , 1991 b). La fracción A, con elución de entre 15 y 16 minutos en HPLC semi preparativa, se transfirió en una ampolla de vidrio con rosca y se secó bajo corriente de nitrógeno. Se redisolvió en metanol anhidro y se volvió a secar, con el objeto de eliminar el agua residual. 250 µ? de HCL 0.05M en metanol se le añadieron a la muestra seca . La reacción se llevó a cabo durante toda la noche a temperatura ambiente. Después la muestra se volvió a secar bajo corriente de nitrógeno y se lavó dos veces con metanol anhidro, con el objeto de eliminar todo el ácido.

Producción de cantidades en miligramos de factores Mvc La purificación de factores Myc a partir de exudados de esporas en germinación de Glomus intraradices y de raíces micorrizadas da, como resultado, rendimientos extremadamente bajos. Se siguieron dos estrategias para producir grandes cantidades de estas moléculas, haciendo uso de la ingeniería genética de bacterias. (i Producción de factores Mvc por parte de mutantes de Rizobios.

Los rizobios producen factores Nod que son LCO sustituidos que comparten algunas similitudes estructurales con los factores Myc. La principal diferencia es que los factores Myc son LCO muy simples con una cantidad muy limitada de sustituciones restringidas, en lo esencial, a la posible sulfatación en O del residuo de N-acetil glucosamina reductor. Nuestra estrategia consistió en utilizar mutantes rizobianos alterados en los genes que codifican las enzimas responsables de las sustituciones de precursores de factores Nod y que, en consecuencia , secretan LCO muy simples, similares a los factores Myc. Optamos por emplear cepas mutantes derivadas de especies rizobianas que producen la mayoría de los LCO tetrámeros y la minoría (alrededor de 10%s) de LCO pentámeros, como en el caso de los factores Myc fúngicos.

Para la producción de factores Myc sulfatados usamos un muíante doble de Sinorhizobium mellloti nodFEnodL. La mutación nodL suprime la acetilación en O del residuo GlucNac de la terminal no reductora y la mutación nodFE bloquea la síntesis del ácido graso 16:2 insaturado resultante en la acilación en N con ácidos grasos C18:1 (vaccénico) o C16:0 (palmítico) (Ardourel y col., 1994). para aumentar la producción de LCO, en la cepa muíante se introdujo un plásmido mulíicopia que lleva genes nod reguladores (pMH682). La cepa sobreproductora resultante, GMI 6629, se cultivó en un medio líquido de cultivo que contenía 5 g/ml de íetraciclina para mantener la presencia del plásmido pMH682 y de luteolina (10µ?) en carácfer de inducíor del gen nod (Ardourel y col, 1994). Cuando el cultivo bacteriano alcanzó una densidad celular de alrededor de 109 células por mililitro se extrajeron los factores Nod mediante extracción líquido / líquido con butanol y acetato de etilo (Roche y col, 1991 ). Después, los LCO se purificaron por HPLC sobre una columna de fase inversa C18, tal como se describiera anteriormente (Demont y col, 1993), con la modificación siguiente del gradiente agua-acetonitrilo: a una fase ¡socrática de 10 minutos con acetonitrilo 20% la siguió un gradiente lineal que pasaba 20 a 65% de acetonitrilo durante 30 minutos a una velocidad de caudal de 2ml/min. Los picos que contenían LCO sulfatados se recogieron entre 32 y 35% de acetonitrilo y se analizaron por espectrometría de masas: una mayoría de LCO era tetrámera y una minoría, pentámera, como para los factores Myc. Los LCO eran sulfatados en O en el extremo reductor y acilados en N con ácidos grasos C18:1 y C16:0 en el extremo no reductor. No se pudo detectar sustituciones de acetilo en O.

Para la producción de factores Myc no sulfatados se utilizó la cepa PR5045 (pMP247). Es un derivado de la cepa RCR5 de R. leguminosarum bv. trifolii, curada del plásmido Sym, en la cual se introdujo un plásmido multicopia que contiene los genes comunes nodABCU (= pMP247) (Lugtenberg y col, 1995). Esta cepa sobreproductora se cultivó en medio de cultivo B con 5pg/ml de tetraciclina para mantener el plásmido pMP247 y ? ? en carácter de inductor de genes nod (Spaink y col, 1994). Los LCO se extrajeron del medio de cultivo de la manera que se describiera arriba. La purificación por HPLC se llevó a cabo con la misma columna de fase inversa C18 que para los LCO sulfatados, con una fase ¡socrática de 20 minutos con acetonitrilo 26,5%, a lo que siguió un gradiente lineal acetonitrilo-agua que iba desde acetonitrilo 26,5% hasta 100% durante 40 minutos, a una velocidad de flujo de 2ml/min. Los picos correspondientes a LCO no sulfatados se recogieron a alrededor de 50% de acetonitrilo y se analizaron por espectrometría de masas. Una mayoría de los LCO era tetrámera y una minoría, pentámera, al igual que para los factores Myc. La acilación en N fue con ácidos grasos C18: 1 y C16:0. No se pudo detectar sustituciones en acetilo en O o sulfato en O.

La estructura de los principales LCO sulfatados y no sulfatados producidos por las cepas mutantes rizobianas, Sinorhizobium meliloti GM1 6629 y Rhizobium leguminosarum bv. trifolii LPR5045 (pMP247), respectivamente, se representa abajo. Son imitaciones perfectas de los factores Myc producidos por el hongo MA Glomus intraradices (véase Ejemplo 2).

R2 = H or S03H = C15:0, C15:1 or C17:0, C17:1 n = 2 or 3 Estos factores Myc, preparados a partir de cultivos de mutantes risóbvianos, se sometieron a prueba para establecer su actividad biológica . El ejemplo 7 muestra que una mezcla de estos factores Myc sulfatados y no sulfatados estimula en gran medida la formación de micorriza (Figura 14A), demostrando que estas moléculas actúan como leg ítimas señales para micorrización. (ii) Producción de factores Mvc por parte del enfoque de fábrica de células.

Estos factores Myc sintéticos fueron gentilmente proporcionados por Eduardo Andrés Martínez y Hugues Driguez del laboratorio CERMAV CNRS en Grenoble, Francia. El procedimiento que utilizaron fue, en lo esencial, tal como se describe en la bibliografía (Samain y col,. 1999): cultivos de alta densidad celular de cepas recombinantes de E. coli que albergan los genes nodBC o nodBCH provenientes de Sinorhizobium meliloti aportaron V''"'"'-triacetil-quitintetraosa y 60'-sulfatada-/V''"'"'-triacetil-quitintetraosa como compuestos principales, juntamente con cantidades pequeñas de sus correspondientes pentámeros.

Después de la extracción y la purificación de estos compuestos, se condujo una acilación en N selectiva, utilizándose cloruros de ácido hexadecanoico u oleico en diversos solventes hidroorgánicos o utilizándose los ácidos libres y el procedimiento de acilación en N previamente desarrollado para la preparación de factores de nodulación para lipoquito oligosacáridos (Ohsten Rasmussen y col., 2004).

Se preparó los cuatro lipoquitosacáridos siquientes LCO IV (contaminado con » 10% de LCO V) C16:0 LCO IV (contaminado con * 1 0% de LCO V) S C16:0 LCO IV (contaminado con * 1 0% de LCO V) C18: 1 LCO IV (contaminado con * 10% de LCO V) S C18: 1 RESU LTADOS EJ EM PLO 1 : PU RIFICACIÓN D E FACTORES MYC A PARTI R D E EXU DADOS D E RAÍCES MICORRIZADAS Y DE EXU DADOS DE ESPORAS EN GERMINACIÓN Estrategia general La cepa DAOM 1 971 98 de Glomus intraradices se util izó como fuente de factores Myc factors , debido a que esta cepa tiene una amplia gama de huéspedes y se la emplea para la producción ind ustrial en g ran escala de inoculantes de hongos MA. Esta cepa está bien caracterizada y se está obteniendo la secuencia de su genoma . Dos fuentes de factores Myc se utilizaron de manera complementaria. Los exudados provenientes de ra íces micorrizadas tienen la ventaja de permitir la extracción a , partir de volú menes grandes, con la posibilidad de obtener cantidades significativas de factores Myc. La desventaja de esta fuente es que los exudados contienen una mezcla de com puestos, tanto de origen vegetal como fúngico . Ésta es la razón de que también usáramos otra fuente, exudados provenientes de esporas purificadas en germinación , que únicamente contienen compuestos de origen fúngico MA, pero presentan la desventaja de producir concentraciones extremadamente bajas de factores Myc.

Los compuestos biológicamente activos presentes en exudados de hongos MA son anfifílicos Exudados de ra íz micorrizada se extrajeron por primera vez mediante un procedimiento líquido-líquido, con butanol y acetato de etilo. Se revisó fases acuosa, de butanol y de acetato de etilo en busca de actividad biológica, con los bioensayos MtENOD11 y VsHab: se halló actividad en la fracción butanol, lo que indicaba que los factores Myc eran compuestos anfifílicos. Tal como se muestra en la figura 1, un compuesto activo se podría detectar con el ensayo MtENOD11 mediante una tinción azul que aparece en las raíces en crecimiento y con el ensayo VsHab, mediante la aparición de ramas claras próximas a la punta de los pelos radiculares de veza.

Después, el extracto de butanol se sometió a una Extracción en Fase Sólida (SPE) con una columna C18 en fase inversa y se lo elidió sucesivamente con solvente de acetonitrilo al 20%, 50% y100%. Se halló actividad biológica en la fracción eluida por acetonitrilo al 50%, en ensayos MtENODH y VsHab que confirman que el(los) compuesto(s) activo(s) es(son) anfifílico(s). Resultados similares se obtuvieron con más de cinco muestras independientes de exudados de raíz micorrizada. Una muy leve actividad en VsHab también se podía observar a veces en el eluado de acetonitrilo 100%, lo que sugiere que diferentes compuestos podrían ser responsables por las respuestas en los MtENODH y VsHab, siendo el compuesto actuante en el ensayo VsHab levemente más hidrófobo que el compuesto actuante en el ensayo MtENODU.

Exudados de esporas en germinación se extrajeron mediante el mismo procedimiento líquido-líquido con butanol y acetato de etilo. La actividad , tanto en el ensayo MtENODH como n el VsHab solamente estaba presente en la fase butanol. Los mismos resultados se obtuvieron con cinco muestras independientes de esporas en germinación. Así, pues, podemos llegar a la conclusión de que el(los) compuesto(s) anfifílicos(s) activo(s) en los ensayos MtENODH y VsHab tienen su origen en hongos A.

Dos tipos de compuestos activos en exudados de raíz micorrizada Para resolver más los compuestos activos en MtENODH y VsHab y obtener información sobre sus propiedades cromatográficas, a la fracción butanol hubo que analizarla por HPLC. Sin embargo, al estar los exudados de raíz micorrizada sumamente contaminados por compuestos de la raíz de la planta y por Phytagel, a la fracción butanol se la pretrató por SPE antes de la etapa de HPLC, como se describiera en el párrafo precedente. A la fracción SPE eluida por acetonitrilo 50%, y activa en los dos bioensayos, después se la analizó en una HPLC semipreparativa con una columna C18 de fase inversa y un gradiente acetonitrilo-agua. Catorce fracciones se recogieron cada dos minutos. Un perfil típico se da en la figura 2. A cada fracción se la sometió a prueba para hallar actividad en MtENODH y VsHab. Se encontró que las fracciones eluidas al 30 - 48% de acetonitrilo (ACN) (fracción A) eran activas en MtENODH y las fracciones eluidas al 64-72% de ACN (fracción B) eran activas en el bioensayos VsHab. Estos datos muestran que no es el mismo compuesto el que está activo en ambos bioensayos.

El(los) compuesto(s) activo(s) en MtENOD H es(son) más hidrófilo(s) que el(los) activo(s) en VsHab.

Resulta interesante observar que las características de elución de la fracción activa en MtENODH se corresponden bien con las que se observara en factores Nod sulfatados de Sinorhízobium meliloti y Rhizobium tropici (33-45%), que también pueden exhibir actividad con el bioensayo MtENODU . Por otra parte, las características de elución de la fracción activa en VsHab se corresponden bien con las que se observara con factores Nod no sulfatados de R. leguminosarum bv. viciae (67%) y factores Nod no acetilados de Rhizobium meliloti nodHnodL (66%), que también pueden exhibir actividad con el bioensayos de veza. Estos datos son compatibles con la hipótesis de que los exudados de raíz micorrizada contienen una mezcla de LCO sulfatados y no sulfatados.

Dos tipos de compuestos activos en exudados de esporas en germinación A extractos en butanol provenientes de exudados de esporas en germinación se analizaron en una HPLC semipreparativa en las mismas condiciones que las descriptas arriba. Tal como se ve en la figura 3, los exudados de esporas también contenían dos tipos de compuestos activos, uno con mayor actividad hidrófila en MtENODU (fracción A) y una con mayor actividad hidrófoba en VsHab (fracción B). las características de elución de los dos compuestos son idénticas a las que se observara con los dos compuestos activos provenientes de los exudados de ra íz m icorrizada . Estos resultados indican que los dos compuestos activos presentes en los exudados de ra íz micorrizada tienen su origen en hongos MA. Su comporta miento cromatog ráfico y sus actividades biológ icas son compatibles con la hipótesis de q ue podría n corresponder a LCO sulfatados y no sulfatados .

Mod ificación de la actividad relacionada con la dessulfatación de la fracción A Se demostró que una leve hidrólisis meta nólica de LCO sulfatados, como los factores Nod de S. meliloti, elim ina el grupo sulfato sin causar otras modificaciones estructurales (Roche y col . , 1 991 b). Para comprobar si la actividad biológica en MtENODH de la fracción A recogida después de la H PLC de extractos en butanol , provenientes d e exudados de esporas en germinación , se podría deber a un LCO sulfatado, una muestra de la fracción A se sometió a este tratamiento de hidrólisis leve: la fracción tratada perdió totalmente su actividad en MtENOD H (véase figura. 4). Lo interesante es que en tanto que la fracción A no era originariamente activa en el bioensayos VsHa b, la fracción tratada exhibió una clara actividad en VsHab (figura 4). Que la fracción A pueda, después de una hidrólisis leve, ganar una función , la actividad en VsHab, demuestra que esta muy leve hidrólisis metanólica no degradó de manera d rástica el compuesto activo de la fracción A, sino que, sencillamente, la modificó, probablemente por la eliminación del grupo sulfato, que es una muy lábil sustitución en O en los LCO. Estos datos indican que la actividad de la fracción A en MtENOD1 1 se podría deber a LCO sulfatados y que la actividad de la más hidrófoba fracción B en VsHab se podría deber a LCO no sulfatados.

EJEMPLO 2: CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA DE LOS FACTORES MYC LC/MS v UPLC/MS Las diferentes fracciones que se obtuvo después de la HPLC semipreparativa en fase inversa de extractos de raíz micorrizada se cromatografiaron en forma individual sobre una columna analítica de fase inversa, bajo presión ultraalta (UPLC). La detección tuvo lugar a través de ES1-MS.

Los resultados se muestran en las figuras 5 a 8. Estas figuras presentan las corrientes iónicas correspondientes a LCO que se supone que están presentes en las muestras, de acuerdo con los tiempos de retención de la HPLC y la UPLC, y la actividad biológica. Si hay compuestos que exhiban la masa requerida dentro de su distribución isotópica, entonces aparecen en el cromatograma como picos. Como los picos obtenidos de esta manera podrían ser artefactuales (los picos podrían corresponder a un componente de menor importancia del perfil isotópico), también se da los espectros correspondientes en la parte inferior de cada figura.

Las primeras ocho fracciones de HPLC, para las cuales el comportamiento cromatográfico y las actividades biológicas sugirieron la presencia de LCO sulfatados, se analizaron en la modalidad negativa.

De acuerdo con los tiempos de retención medidos en la U PLC utilizándose LCO tetrámeros ( DP4) y pentámeros (DP5)) standard , se investigó masas exactas (error menor que 10 ppm) correspondientes a entidades sulfatadas DP4 y DP5 en la fracción 4, lo que demostró q ue la actividad máxima en el ensayo MtEN OD 1 1 . En esta fracción, masas correspondientes a DP4 sulfatados q ue llevan acilos C 16 se pod rían detectar con facilidad (figura 5). En concordancia con los respectivos tiempos de retención en HPLC de los DP, en la fracción anterior (fracción 3) pudi mos detectar los correspondientes DP5 (fig ura 7) y en la siguiente (fracción 5), DP4 sulfatados q ue llevaban cadenas C1 8 (figu ra 6). En las fracciones siguientes (6 a 8), se investigó en busca de entidades DP3 , aunq ue si n éxito. A los compuestos se los caracterizó, primero, utilizándose diferentes corrientes de iones (que encajara n entre las llamadas masas exactas y los tiempos esperados de retención ) y, segundo, en relación con el perfil isotópico de los espectros correspond ientes. La figura 8 ilustra la eficiencia del método para detectar la presencia o la ausencia de un compuesto dado que tuviera una masa específica . La m/z 1 332 , 6 de la corriente iónica, correspondiente a un LCO putativo LCO (V, C18:2 , S) sólo produjo la amplificación del ruido de fondo (no un pico individual bien definido) , en tanto que la m/z 1 334,6 de la coriente iónica correspondiente a un LCO putativo (V, C1 8: 1 , S) demostró con claridad la presenciare un pico de UPLC que contenía un compuesto q ue exhibía la masa esperada (datos confirmados por el espectro grabado de masas). Así, los extractos de Myc contienen el LCO pentámero sulfatado acilado en N por C 1 8: 1 , pero no el derivado adiado por C18:2.

Mediante el empleo de este procedimiento no fue posible detectar entidades DP4 o DP5 sulfatadas que llevaran sustituciones en O tales como grupos acetilo, carbamoilo o fucosilo o sustitución en N, tal como un grupo metilo, que se hallan con mucha frecuencia en los factores lipoquito oligosacarídicos de Nod producidos por diversas cepas rizobianas.

Las fracciones 7 a 1 1 se analizaron después en UPLC, pero la detección tuvo lugar en la modalidad positiva ESI-MS. Se aplicó la misma estrategia: llamada iónica, a la que siguió el análisis de los correspondientes espectros.

Los extractos de raíz micorrizada también se analizaron mediante LC/MS. Las fracciones que eluían entre 20 y 23 minutos en la HPLC semipreparativa se mancomunaron, secaron bajo corriente de nitrógeno y volvieron a disolver en 150 µ? de ACN 50% en agua y ácido acético 1 % . Las soluciones se infundieron directamente dentro de la fuente ESI de un espectrómetro Q-Tof Ultima (Waters, US). El capilar se fijó en 3 kV; el voltaje del cono, en 70V, la lente Rf, en 35V. En la modalidad positiva se pudo detectar los iones moleculares de dos compuestos de menor importancia a m/z 1045,5 y 1047.5, que correspondían a LCO tetrámeros catonizados con sodio que llevaban un acilo C16:1 o uno C16:2 y ninguna sustitución en O. las masas y los perfiles isotópicos confirmaron las estructuras propuestas.

Como cantidades importantes de contaminantes (e.g. PEG) coeluyendo con los compuestos buscados de LCO no sulfatados, en las fracciones 9 - 1 1 , evitaban su detección en MS, se llevó a cabo una purificación suplementaria por HPLC. Se reunió las fracciones 9 y 10 de la HPLC semipreparativa y se las inyectó en una columna analítica C8; se las elidió utilizándose un gradiente que empezaba con MeOH 30% en agua y terminaba con MeOH 100%. Los contaminantes hicieron elusión de 1 a 1 5 minutos. Los compuestos de LCO esperados fueron aguardados alrededor de 20 minutos. Las fracciones que se recogieron entre 15 y 23 minutos se analizaron por separado en U PLC-MS y la detección de iones específicos se llevó a cabo sobre la base de las correspondientes especies sulfatadas que se observó (DP4 y DP5; cadenas acilo C16:0 y C18:1 ). La m/z 1027, 56 (DP4, C16: 1 ) de la llamada iónica de la masa exacta dio una respuesta en elución de fracciones entre 1 8 y 19 minutos. El tiempo de retención, comparado con los standards sintéticos y la masa exacta y el perfil isotópico, correspondieron al compuesto investigado. A la estructura la confirmó de manera definitiva el espectro de masa grabado, que exhibía la clásica fragmentación en B a m/z 400,2, 603,3; 806,4 MS/MS Demostrar la presencia de compuestos que tienen la masa adecuada en el tiempo de retención esperado de HPLC o UPLC no es suficiente para confirmar su estructura. Por consiguiente llevamos a cabo un análisis MS/MS de uno de los compuestos putativos de LCO. La figura 9 presenta la comparación entre el DP4 C16:2 del factor Nod sulfatado de S. meliloti en la modalidad negativa S/ S y el registrado en el candidato a factor Myc presente en la muestra, LCO (IV, C1 6:0, S). Iones característicos del extremo reductor en m/z 503 (Y2), 605 yd 706 (Y3) se detectan con claridad en ambos casos, así como la característica pérdida neutra de 101 amu (ruptura intracíciica) que empieza a partir del ion molecular. El encaje perfecto entre los dos patrones de fragmentación indica la filiación estructural de las dos moléculas e indica que el grupo sulfato está situado en el residuo reductor de glucosamina, en tanto que la sustitución de acilo graso se localiza en el residuo no reductor terminal de la glucosamina. Dado que la fragmentación no produce iones de eliminación beta (iones de ácidos grasos) es muy probable que la sustitución del acilo graso sea una amida en el átomo N del residuo de glucosamina.

EJEMPLO 3: ESTIMULACIÓN DE LA FORMACIÓN DE RAMAS LATERALES POR PARTE DE FACTORES MYC FACTORS Un extracto de butanol proveniente de exudados de raíz micorrizada, después de una mayor purificación por extracción en fase sólida (SPE) y elución por acetonitrilo 50%, se incorporó en placas y se lo sometió a prueba para determinar el crecimiento de plántulas de M. truncatula A17. Este extracto purificado de Myc indujo una estimulación significativa de la formación de raíces laterales (P = 0,05). Cuando se lo sometió a prueba sobre un muíante dmil (Y6) de M. truncatula, este extracto de Myc no estimulaba la formación de raíces laterales, lo que indicó que este extracto semipurificado contenía una señal de Myc que activas la formación de raíces laterales (LRF) a través del sendero de señalización simbiótica de DM I (figura 1 0 A).

Se extrajo exudados de espora con acetato de etilo y butanol. Después, a los tres extractos (acuoso, acetato de etilo y butanol) se los revisó para determinar la estimulación LRF sobre plántulas de M. truncatula A17. El extracto de butanol estimuló de manera significativa la LRF (P = 0,05), en tanto que los extractos acuoso y de acetato de etilo no fueran activos (Fig .l OB). Este experimento confirma el origen fúngico MA del (de los) compuesto(s) anfifílicos(s) que disparan la estimulación de la LRF.

Al extracto de butanol proveniente de exudados de raíz micorrizada, después de la SPE se lo purificó más mediante HPLC semipreparativa y las fracciones correspondientes a LCO sulfatados (fracción A, activa en el ensayo MtENODH ) y a LCO no sulfatados (fracción B, activa en el ensayo VsHab) se recogieron por separado y se las sometió a prueba sobre plántulas de M. truncatula A1 7. Se halló que las dos fracciones estimulan de manera significativa la LRF (Fig. 10C). Estos datos indican que los factores Myc están constituidos por una mezcla de LCO simples sulfatados y no sulfatados y que ambos tienen la capacidad de estimular la formación de raíces laterales en plantas.

EJEMPLO 4: EFECTO DE FACTORES MYC SOBRE LA FORMACIÓN DE MA EN LA LEGUMBRE MODELO M. TRUNCA TULA Factores sintéticos de Myc producidos por el enfoque de fábrica de células, tal como se describe en Materiales y Métodos, fueron utilizados para estudiar la posible influencia de los factores Myc sobre la micorrización de raíces de la legumbre modelo Medicago truncatula por parte del hongo MA Glomus intraradices.

En una primera serie de experimentos, plántulas de M. truncatula se cultivaron en condiciones axénicas, en tubos de ensayo sobre un medio gelificado dispuesto en pico de flauta y pobre en fósforo y nitrógeno, en el que se agregaron factores Myc en una concentración de 1 0"8 M. A cada plántula se la inoculó con 500 esporas fúngicas esterilizadas (Olah y col. , 2005). La cantidad de unidades de infección (zonas que contienen arbúsculos, vesículas y redes de hifas internas) por planta se contó mirando por una lupa estereoscópica, seis semanas después de la inoculación. El tratamiento por factores Myc aumentó la cantidad de unidades de infección por planta en un 148% (véase la figura 11 a).

En una segunda serie de experimentos, plántulas de M. truncatula se cultivaron sobre un sustrato constituido por granulados de arcilla calcinada en condiciones no estériles y a cada plántula se la inoculó con 50 esporas de hongo. Al medio se le agregó factores Myc en una concentración de 10'8 M. El porcentaje de colonización radicular se midió por el método de intersección de cuadrículas, tres semanas después de la inoculación. El porcentaje de raíces micorrizadas en las plantas tratadas por factores Myc fue 28,5% mayor que en las plantas control (Fig . 1 1 b).

Conclusiones: en bajas concentraciones (10~8 M), los factores Myc sintéticos estimulan la formación de MA en la legumbre modelo M. truncatula, lo que brinda ulteriores pruebas de que los factores Myc que hemos identificado son legítimas señales micorrítícas.

El hecho de que los factores Myc estimulen con eficiencia la formación de MA en legumbres abre el camino para vastas aplicaciones en horticultura (por ejemplo, poroto, garbanzo, lenteja), agricultura (por ejemplo, soja, arveja, haba, alfalfa, y en silvicultura (por ejemplo, robinia negra).

EJEMPLO 5: EFECTO DE LOS FACTORES MYC SOBRE EL DESARROLLO DE RAÍCES DE LEGUMBRES Los hongos MA secretan compuestos difundibles que estimulan la formación de raíces laterales (LRF) en la legumbre modelo Medicago truncatula (Olah y col., 2005). Hemos demostrado (véase ejemplo 3) que las fracciones de HPLC que contienen LCO fungióos sulfatados y no sulfatados disparan esta estimulación de LRF. Para demostrar que esta estimulación de la LRF realmente se le debe a los LCO y no a compuestos fúngicos contaminantes que posiblemente estuvieran presentes en estas fracciones de HPLC, utilizamos los LCO sintéticos sulfatados y no sulfatados que tienen la misma estructura que los detectados en exudados fúngicos ((véase Ejemplo 4 y Materiales y Métodos).

En una concentración de 1 0"8 M, tanto los factores Myc puros sintéticos sulfatados, o los factores puros no sulfatados, así como una mezcla de sulfatados y no sulfatados, claramente estimulaban el crecimiento de LRF (véase figura 12a), lo que demuestra que ambos tipos de compuestos actúan como reguiadores del crecimiento vegetal. En contraste, en una concentración de 10"10 M, la mezcla de factores Myc sulfatados y no sulfatados seguía siendo activa en extremo, en tanto que los compuestos puros, sulfatados o no, no eran activos. Estos datos demuestran q ue una mezcla de factores Myc sulfatados o no sulfatados es, claramente, más activa que los factores Myc puros sulfatados o no sulfatados.

Así, los factores Myc no sólo son señales simbióticas que activan el programa simbiótico de la planta hospedante durante las primeras etapas de la micorrización, sino que también pueden actuar como legítimos reguladores de las plantas, , estimular la formación de raíces laterales e influir en la arquitectura de las raíces.

Desde el punto de vista de la agricultura era importante atender la cuestión de la posible influencia de los factores Myc, no sólo sobre la ramificación de las raíces sino, también, sobre el desarrollo global del sistema radicular. Después de cultivar plántulas durante 8 días sobre un medio de cultivo que contenía una mezcla, o no la contenía, de factores Myc sulfatados y no sulfatados, se cortó las raíces, se las exploró y al sistema radicular se lo analizó con el soporte lógico WinRhizo. El tratamiento con factores Myc dio por resultado un aumento del 13,16% en la longitud total de las raíces (Fig. 12b). Asi, pues, el tratamiento con factores Myc tiene la capacidad de estimular el desarrollo de todo el sistema radicular..

Conclusiones: Tanto los factores Myc sulfatados como no sulfatados son señales activas, que actúan en baja concentración (10"8 M), pero una mezcla de factores Myc sulfatados o no sulfatados es, claramente, más activa (tan baja como de 10"10 M).

Estimulan de manera efectiva la formación de raíces laterales y el desarrollo del sistema radicular y, en consecuencia, no sólo son señales simbióticas sino, también, poderosos reguladores del crecimiento vegetal..

Estos hallazgos abren el camino de la utilización de estas moléculas en horticultura, agricultura y silvicultura, para estimular el desarrollo de las raíces y el crecimiento de las plantas.

EJEMPLO 6: LOS FACTORES MYC DISPARAN RESPUESTAS DE LAS PLANTAS, A TRAVÉS DEL SENDERO DE SEÑALIZACIÓN SIMBIÓTICA DMI Se identificó un sendero de señalización simbiótica en M. truncatula, con codificación de genes para la percepción del factor Nod (?/ P), para la señalización del calcio (DM11, DM12 y DM13) y un activador de transcripción específica de la nodulación (NSP1) (Catoira y col., 2000; Smit y col., 2005). Mutaciones en los genes DM11, DM12 y DM13 dan por resultado la alteración de la formación de nodulos pero, también, de la formación de la micorriza, lo que indica que estos tres genes DMI intervienen en un sendero de señalización común a la nodulación y la micorrización (Catoira y col., 2000). En contraste, las mutaciones en el gen NSP1 dan por resultado un defecto en la nodulación, pero la micorrización no se ve afectada (Catoira y col., 2000). Este descubrimiento condujo a la hipótesis de que las señales simbióticas micorríticos, los factores Myc, están activando el programa micorríticos de la planta, a través del sendero de DMI (Catoira y col., 2000). Resulta imposible determinar si los genes DMI intervienen en la estimulación de la formación de MA por parte de los factores Myc, porque los mutantes de dmi son defectuosos para la formación de micorriza. Para atender la cuestión de la posible intervención de los genes simbióticos vegetales en la respuesta a los factores Myc, hemos utilizado, pues, el ensayo para la formación de raíces laterales (LRF) de M. truncatula, que se describe en los Ejemplos 3 y 5.

Los factores Myc sulfatados exhiben algunas similitudes estructurales con los factores Nod de Sinorhizobium melüoti. Para evitar una posible diafonía entre la señalización del factor Nod y el factor Myc utilizamos factores Myc sintéticos no sulfatados. Estudiamos la respuesta a la estimulación de LRF en la línea del tipo silvestre A 17 de M. truncatula como control y en los mutantes dmil (Y6), dm¡2 (TR25), dm¡3 (TRV25) y nsp1 (B85).

Tal como ya se describió en el Ejemplo 5, el tratamiento de la línea del tipo silvestre con factores Myc no sulfatados en una concentración de 10"8M dio como resultado una clara estimulación de la formación lateral de raíces. En contraste, en mutantes defectuosos dmil , dm¡2 y dmi3 de la micorriza , los factores Myc no disparaban la estimulación LRF (véase figura 1 3). En el muíante nsp 1, que es defectuoso para la nodulación pero tiene un fenotipo normal para la micorriza y en el cual los factores Nod no tienen la capacidad de estimular la LRF, los factores Myc dispararon una estimulación muy clara de la LRF (Fig. 1 3). Estos datos demuestran que los factores Myc desencadenan respuestas de las plantas en sentido descendente respecto de los genes DMI, a través de un sendero de señalización específica para la micorriza, que es distinto del sendero para señalización de los factores Nod (NSP1).

Conclusiones: La capacidad de los factores Myc para estimular la LRF queda abolida en los mutantes dmil , dm¡2 y dm¡3. Esto demuestra que las respuestas de desarrollo que los factores Myc inducen se disparan a través del sendero simbiótico de DMI, lo que demuestra, además, que los factores Myc son legítimas señales simbióticas.

Al gen específico para la nodulación, NSP1, no se lo necesita para la respuesta de estimulación de la LRF, lo que indica que los factores Myc disparan esta respuesta de desarrollo a través de un sendero específico para los Myc que actúa a través, y en sentido descendente respecto, de los genes DMI y es independiente del sendero específico para nodulación (NSP1). Esto es la prueba adicional de que los factores Myc que hemos identificado son legítimas señales de micorrización.

EJEMPLO 7: ESTIMULACIÓN DE LA FORMACIÓN DE MA EN RAÍCES DE ZANAHORA TRANSFORMADAS Y ESCINDIDAS, SISTEMA QUE SE UTILIZA PARA LA PRODUCCIÓN DE INOCULANTES INDUSTRIALES DE MICORRIZA Los hongos son simbiontes obligatorios: no se pueden propagar ni formar esporas en medio puro de cultivo. Para su crecimiento necesitan colonizar las raices de las plantas huéspedes. Este requisito estricto obstaculizó tanto las investigaciones básicas sobre la simbiosis de AM , como la posibilidad de producir inoculantes fúngicos de AM en gran escala, para fines de horticultura y agricultura. Un importante avance se logró mediante el empleo de cultivos de ra íces transformadas escindidas, para cultivar hongos AM, lo que hace posible la producción de grandes cantidades de esporas esterilizadas de hongo (Bécard y Fortín, 1988). Un sistema que se ha utilizado durante muchos años (Chabot y col. , 1992) es el cocultivo de la cepa DAOM 1 971 98 del hongo MA Glomus intraradices con un clon de raíz escindida de zanahoria, clon transformado por Agrobacterium rhizogenes. Este sistema de cocultivo lo usa, específicamente, la compañía PremierTech (Québec) de Biotech, para la producción de inoculantes comerciales de hongos MA. Hemos atendido la cuestión de si el empleo de factores Myc en concentraciones bajas, como aditivo en los medios de cultivo, podría estimular la micorrización de ra íces escindidas.

Primero utilizamos una mezcla de factores My sulfatados y no sulfatados, producidos mediante los mutantes rizobianos adecuados (véase Materiales y Métodos), que se agregó al medio de cultivo en una concentración de 10"8 M . raíces axénicas escindidas de zanahoria se inocularon con esporas esterilizadas de G. intraradices. El porcentaje de longitud de raíz colonizada por el hongo MA se estimó medíante el método de intersección de l íneas de cuadrícula (Giovannetti y Mosse (1980). Se empleó cinco repeticiones. La lectura se llevó a cabo con una lupa estereoscópica al cabo de ocho semanas, en un estudio de doble ciego.

En la figura 14 a se puede ver que el agregado de una mezcla de factores Myc sulfatados y no sulfatados, en una concentración de 10"8 M en el medio de cultivo, dio por resultado un aumento muy fuerte del porcentaje de colonización (+ 68.6%).

En un segundo experimento, al medio de cultivo se añadió una mezcla de factores Myc sintéticos sulfatados y no sulfatados, en una concentración de 10"8 M. se utilizó 15 repeticiones. Tal como se muestra en la figura 14b, al cabo de ocho semanas el efecto de los factores Myc sobre la estimulación de la formación de MA era muy significativa (+ 20.5%).

Conclusiones: Una mezcla de factores Myc sulfatados y no sulfatados estimula de manera activa la formación de MA en las raíces de la zanahoria , que no es una leguminosa. Esta es otra prueba más de que los factores Myc q ue hemos identificado y que se ha sintetizado son legítimas señales para micorrización.

Tanto los factores Myc sintéticos preparados mediante un procedimiento bioqu ímico como los factores Myc preparados a partir de cepas rizobianas mutantes, son eficaces para estimular la formación de micorriza, lo que demuestra que estos dos tipos de estrategias son adecuadas para la producción en gran escala de factores Myc.

Estos datos abrir el camino a la utilización de los factores Myc como aditivos en los medios de cultivo que se utilizare para la producción de inoculantes de MA por parte de la industria biotecnológica, empleándose ra íces escindidas transformadas.

EJEMPLO 8: EFECTO DE LOS FACTORES MYC SOBRE LA FORMACIÓN DE MA EN TAGETES PA TULA, QUE NO ES UNA LEGUMINOSA Tagetes patula, miembro de la familia Asteraceae, fue elegida como planta hospedante no leguminosa. T. patula (damasquina) es una planta de jardín muy conocida. A esta especie se la utiliza en la plantación con acompañantes para muchos cultivos de hortaliza: hay informes de que las secreciones de su raíz matan los nemátodos del suelo y se dice que rechaza insectos dañinos, tales como la mosca blanca del tomate. Toda la planta se puede cosechar cuando está en flor y destilar para obtener su aceite esencial, que se utiliza en perfumería.

T. patula se usa para hacer pruebas de micorrización, porque es una planta de escaso porte, fácil de manejar y exhibe una rápida colonización radicular por parte de hongos de MA. Se utilizó la variedad "Légion d'honneur". Se llevaron a cabo ensayos de micorrización cultivando plántulas sobre un sustrato constituido por partículas de arcilla calcinada . A las plántulas se las inoculó con esporas esterilizadas de G. intraradices y se añadió factores de Myc en una concentración de 1 0'8 M.

En una primera serie de experimentos se utilizó una mezcla de factores Myc sintéticos sulfatados y no sulfatados. El grado de micorrización se estimó a las cuatro semanas de la inoculación, a través del recuento del número de unidades de infección: las plantitas tratadas con factores Myc tenían un aumento sumamente significativo (153. ,5%) en la cantidad de unidades de infección por planta (Fig. 15a1 ). Los factores Myc pudieron aumentar el número de sitios de infección, ya fuere estimulando el desarrollo del sistema radicular, ya fuere aumentando la densidad de la infección. En verdad, el tratamiento con factores Myc dio por resultado, tanto un aumento del 49,1 % en la longitud de la raíz (Fig. 15a2), como del 30,9% en la densidad de infección (Fig. 15a3).

En un segundo experimento, a plantas inoculadas se las tratño, o bien con factores Myc puros sulfatados o no sulfatados, o bien con una mezcla de ambos. Cuatro semanas después de la inoculación se estimó la velocidad de colonización mediante el método de intersección de cuadrículas . Los resultados se representan en la figura. 1 5b . El tratamiento con una mezcla de factores Myc s ulfatados y no sulfatados disparó una sign ificativa duplicación de la velocidad de colon ización rad icula r (+ 1 04.5% ), mientras que los factores Myc puros sulfatados y puros no sulfatados d ieron por resu ltado aumentos del 42 ,3% y del 75,4% , respectivamente.

Conclusiones: Los factores Myc estimulan la formación de MA en una planta no legum inosa , lo que es otra prueba más de que los facto res Myc q ue hemos identificado son leg íti mas señales para micorrización .

Tanto los factores Myc sulfatados como los no sulfatados son activos , pero la mezcla de ambos es netamente más activa .

El hecho de que los factores Myc estimulen de manera eficiente la formación de MA y el desarrollo de las raíces en una planta que no es leguminosa abre el camino para aplicaciones extremadamente amplias en horticultura , agricultura y silvicultura..

EJEMPLO 9: EFECTO DE LOS FACTORES MYC SOBRE LA GERMINACIÓN DE SEMILLAS DE UNA PLANTA QUE NO ES LEGUMBRE, TOMATE En ejemplos anteriores hemos demostrado que los factores Myc no son únicamente señales simbióticas que activan el programa de micorrización de las plantas sino, también , que actúan como reguladores del crecimiento de las plantas y estimulan el desarrollo del sistema radicular en una etapa muy temprana del desarrollo de la plántula. Así, pues, hemos investigado la posible influencia de factores Myc sobre la germinación de semillas de una planta que no fuera leguminosa. Se eligió la variedad Heinz 1706 de tomate porque esta línea está bien caracterizada y se la eligió para el proyecto de secuenciación del genoma de tomate estadounidense. Por añadidura hay asequibilidad de microarrays de Affymetrix, lo que hace posible los estudios de perfilado de la expresión de genes con esta línea de tomate.

Para estos estudios se emplearon factores Myc sintéticos purificados, ya fuere sulfatados o no sulfatados o una mezcla de ambos. Se añadió factores Myc al medio agárico de germinación y se los vertió en discos de Petri. Se sembró semillas en la superficie de placas de agar y se las incubó en la oscuridad a 14°C, 20°C y 28°C. El porcentaje de germinación se anotó todos los días.

Se llevó a cabo experimentos con semillas a las que se había verbalizado mediante el guardado a 4°C durante ocho semanas como mínimo. La presencia de factores Myc en el medio de germinación, en el ámbito de las 10"8 M a 10"10 dio por resultado una muy clara estimulación de la germinación a 14°C y 20°C (véase Fig.16). Cada tipo de factores Myc, sulfatados o no sulfatados, estaba activo pero, lo que era interesante, la mezcla de ambos tipos claramente era más activa. No se pudo establecer un efecto significativo de los factores Myc sobre la germinación a la temperatura más elevada, 28°C (no se muestra los datos). Estos datos sugieren que este efecto de estimulación opera a temperaturas que corresponden al .ámbito de las temperaturas comunes del suelo. Podemos plantear como hipótesis que las plantas y sus simbiontes fungióos de MA han evolucionado junto, no sólo para la formación de micorriza en las raíces en desarrollo sino, también, en una etapa muy temprana de sus interacciones, para la germinación. Ambos simbiontes pudieron haber tenido la ventaja de unir la eficiencia de la germinación de las semillas y el desarrollo temprano de las raíces, con la presencia del simbionte fúngico. La estimulación de la germinación se asoció con un ulterior desarrollo mejor de las plántulas, como se muestra en la figura 16b.

El hecho de que las semillas respondan a factores Myc demuestra que los componentes vegetales necesarios para la percepción (receptores) y la transducción de factores Myc están presentes, y son funcionales, en las semillas. Este descubrimiento abre el camino para el tratamiento con factores Myc de las semillas de las plantas cultivadas en condiciones de agricultura. La observación de que factores Myc están activos en la germinación de semillas en concentraciones extremadamente bajas (10" ° M) abre el camino a la tecnología del tratamiento de semillas a bajo costo (pocas exigencias de material activo) y respeta el ambiente (utilización de concentraciones extremadamente bajas de compuestos naturales).

Conclusiones: Tanto los factores Myc sulfatados como no sulfatados estimulan la germinación de semillas de tomate, planta que no es leguminosa, pero la mezcla de ambos es claramente más activa. Estos dos tipos de factores Myc son, en consecuencia, no sólo señales simbióticas sino, también, poderosos reguladores del crecimiento vegetal que tanto actúan sobre legumbres como sobre plantas que no son legumbres.

Desde el punto de vista de la agricultura, estos resultados abren el camino para importantes aplicaciones en horticultura, agricultura y silvicultura: el tratamiento de semillas por parte de factores Myc, de preferencia una mezcla de factores tanto sulfatados como no sulfatados, podría mejorar el porcentaje y la velocidad de germinación y estimular el desarrollo de plántulas jóvenes en la mayor parte de las plantas cultivadas, la mayoría de las cuales tiene la capacidad de establecer esta simbiosis micorrítica.

REFERENCIAS Akiyama K, Matsuzaki K, Hayashi H (2005) Plant sesquiterpenes induce hyphal branching ¡n arbuscular mycorrhizal fungi. Nature, 435: 824-827.

Andriakaja A, Boisson-Dernier A, Francés L, Sauviac L, Jauneau A, Barker DG, Carvalho-Niebel F (2007) AP2-ERF transcription factors medíate Nod factor dependent Mt ENOD1 1 activation in root hairs via a novel cis-regulatory motif. Plant Cell, 19:2866-2885.

Ardourel M , Demont N, Debellé F, Maillet F, de Billy F, Promé JC, Dénarié J , Truchet G ( 1994) Rhizobium meliloti lipooligosaccharide nodulation factors: Different structural requirements for bacterial entry into target root hair cells and induction of plant symbiotic developmental responses. Plant Cell, 6: 1357-1374.

Bécard G , Fortin JA (1988) Early events of vesicular-arbuscular mycorrhiza formation in Ri T-DNA transformed roots. New Phytol. , 1 08:21 1 -218.

Benamor B, Shaw S, Oldroyd G, Maillet F, Penmetsa RV, Cook D, Long S, Dénarié J , Gough C (2003). The NFP locus of Medicago truncatula controls an early step of Nod factor signal transduction upstream of a rapid calcium flux and root hair deformation. Plant J., 34: 495-506.

Besserer A, Puech-Pagés V, Kiefer P, Gomez-Roldan V, Jauneau A, Roy S, Portáis JC, Roux C, Bécard G, Séjalon-Delmas N (2006) Strigolactones stimulate arbuscular mycorrh'izal fungi by activating mitochondria. PLoS Biol., 4(7):e226.

Catoira R, Galera C, De Bllly F, Penmetsa RV, Journet EP, Maillet F, Rosenberg C, Cook D, gough C, Dénarié J (2000) Four genes of Medicago truncatula controlling components of a Nod factor transduction pathway. Plant Cell, 12: 1647-1666.

Chabot S, Bécard G, Piché Y (1992) The life cycle of Glomus intraradices in root organ culture. Mycologia, 84: 315-321.

Demont N, Debellé F, Aurelle H, Dénarié J, Promé JC (1993) Role of the Rhizobium meliloti nodF and nodE genes in the biosynthesis of lipo-oligosaccharidic nodulation factors. J. Biol. Chem., 268 : 20134-20142.

Dénarié J, Debellé F, Promé JC (1996) Rhizobium lipo-chitooligosaccharide nodulation factors: signaling molecules mediating recognition and morphogenesis. Annu. Rev. Biochem., 65: 503-535.

D'Haeze W, Holsters M (2002) Nod factor structures, responses, and perceptlon during initiation of nodule development. Glycobiology, 12: 79R-105R.

Doner LW, Bécard G (1991) Solubilization of geilan gels by chelation of cations. Biotechnol Tech. , 1991 ; 5:25-28.

Giovanetti M , Mosse B (1980) An evaluation of techniques for measuring vesicular-arbuscular mycorrhizal infection in roots. New Phytologist, 84:489-500.

Grenouillat N , Vauzeilles B, Bono JJ , Samain E, Beau JM. (2004) Simple synthesis of nodulation-factor analogues exhibiting high affinity towards a specific binding protein. Angew Chem Int Ed Engl., 43:4644-4646.

Harrison (2005) Signaling in the arbuscular mycorrhizal symbiosis. Annu. Rev. Microbio!. , 59: 19-42.

Hewitt, E.J (1966) Sand and water culture methods used in the study of plant nutrition. Technical Communication No. 22 (revised 2nd edn). Com. Bur. of Horticul. and Plant Crops East Mailing, Maidstore, Kent, UK.

Journet EP, El-Gachtouli N, Vernoud V, de Billy F, Pichón , Dedieu A, Arnould C, Morandi D, Barker D, Gianinazzi-Pearson V (2001 ) Medicago truncatula ENOD1 1 : a novel RPRP-encoding early nodulin gene expressed during mycorrhization in arbuscule-containing cells. Mol. Plant Microbe Interact., 14: 737-748.

Kosuta S, Chabaud M, Lougnon G, Gough C, Dénarié J, Barker DG, Bécard G (2003) A diffusible factor from arbuscular mycorrhizal fungi induces symbiosis-specific MtENODH expression in roots of Medicago truncatula. Plant Physiol. , 1 31 : 952-962.

Navazio L, Moscatiello R, Genre A, Novero M, Baldan B, Bonfante P, Mariani P (2007) A diffusible signal from arbuscular mycorrhizal fungí elicits a transient cytosolic calcium elevation in host plant cells. Plant Physiol. 144: 673-681 .

Olah B, Briére C, Bécard G, Dénarié J, Gough C (2005) Nod factors and a diffusible factor from arbuscular mycorrhizal fungí stimulate lateral root formation in Medicago truncatula vía the DM I 1 /DM I2 signalling pathway. Plant J. , 44: 195-207.

Ohsten Rasmussen M, Hogg B, Bono JJ , Samain E, Driguez H (2004) New access to lípo-chítooligosaccharide nodulation factors. Org. Biomol. Chem., 2: 1908-1910.

Price NPJ, Relie B, Talmont F, Lewin A, Promé D, Pueppke SG, Maillet F, Dénarié J , Promé JC, Broughton WJ ( 1992) Broad-host-range Rhizobium species strain NGR234 secretes a family of carbamoylated, and fucosylated, nodulation signáis that are O-acetylated or sulphated. Mol. Microbiol. , 23: 3575-3584.

R Development Core Team (2009) R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051 -07-0, U RL http://www.R-project.org .

Remy W, Taylor TN, Hass H, Kerp H (1 994) Four hundred-million-year-old vesicular arbuscular mycorrhizae. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91 : 1 1 841 -43.

Roche P, Debellé F, Maillet F, Lerouge P, Faucher C, Truchet G, Dénarié J , Promé JC (1991 a) Molecular basis of symbiotic host specificity in Rhizobium meliloti: nodH and nodPQ genes encode the sulfation of lipo-oligosaccharide signáis. Cell, 67: 1 131 -1 143.

Roche P, Lerouge P, Ponthus C, Promé JC ( 1 991 b) Structural determination of bacterial nodulation factors involved in the Rhizobium me//7or/'-alfalfa symbiosis. J. Biol. Chem. , 266: 10933-10940.

Samain E, Drouillard S, Heyraud A, Driguez H, Gram-scale synthesis of recombinant chitooligosaccharides in Escherichia coli. Carbohydrate Research, 302: 35-42.

Samain E, Chazalet V, Geremia RA ( 1999), Production of O-acetylated and sulphated chitooligosaccharides by recombinant Escherichia coli strains harboring different combinations of nod genes. Journal of Biotechnology, 72: 33-47.

Smit P, Raedts J, Portyanko V, Debellé F, Gough C, Bisseling T, Geurts R (2005) NSP1 of the GRAS protein family is essential for rhizobial Nod factor-induced transcription. Science, 308: 1 789-91 .

Smith SE, Read DJ (2008) Mycorrhizal symbiosis. 787 pp. , Academic Press.

Stacey G, Libault M, Brechenmacher L, Wan J, May G (2006) Genetics and functional genomics of legume nodulation. Curr. Opin. Plant Biol. , 9: 1 10-121 .

Spaink HP, Wijfjes AHM , van der Drift KMGM, Haverkamp J, Thomas-Oates JE, Lugtenberg BJJ (1994) Structural Identification of metabolites produced by the NodB and NodC proteins of Rhizobium leguminosarum. Mol. Microbio!. , 13:821 -831 .

Spaink HP, Wijfjes AHM, Lugtenberg BJJ (1995) Rhizobium Nodl and NodJ proteins play a role in the efficiency of secretion of lipochitin oligosaccharides. J. Bacteriol., 177: 6276-6281 .

Vierheilig H , Coughlan AP, Wyss U, Piché Y (1998) Ink and vinegar, a simple staining technique for arbuscular-mycorrhizal fungi. Appl. Environm. Microbio!., 64:5004-5007.

Weidmann S, Sánchez L, Descombin J, Chatagnier O, Gianinazzi S, Gianinazzi-Pearson V (2004) Fungal elicitation of signal transduction-related plant genes precedes mycorrhiza establishment and requires the dmi3 gene in Medicago truncatula. Mol. Plant Microbe Interact., 1 7: 1385-1393.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. El uso de un lipoquito oligosacárido definido por la fórmula (I) siguiente: en donde n = 0, 1 , 2, 3, 4, o 5, R-, representa un sustituyente lipídico que contiene de 12 a 22 átomos de carbono, y R2 representa H o S03H para estimular micorrización de una planta.

2. El uso de un lipoquito oligosacárido de la fórmula (I) de acuerdo a lo definió en la reivindicación 1 , para estimular el desarrollo del sistema de raíces de una planta.

3. El uso de un lipoquito oligosacárido de la fórmula (I) de acuerdo a lo definido en la reivindicación 1 ,para mejorar mejora la germinación de una semilla de planta.

4. El uso de un lipoquito oligosacárido de la fórmula (I) de acuerdo a lo definido en la reivindicación como un aditivo para la producción de un inoculante arbuscular micorrizal.

5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el substituyente lipídico Ri es una cadena de ácido graso que comprende de 12 a 22 átomos de carbono, la cual puede ser saturada, mono-, di-, tri-, tetra-, penta-, o hexainsaturada.

6. El uso de la reivindicación 5, caracterizado porque dicho lipoquito oligosacárido de (la) fórmula (l) es seleccionado entre: - un lipoquito oligosacárido de la fórmula la (I) en donde n= 2 o 3, representa una cadena de ácido graso saturada o monoinsaturada que comprenden 16 átomos de carbono, y R2 representa H o S03H - un lipoquito oligosacárido de la fórmula (!) en donde n= 2 o 3, representa una cadena de ácido graso saturado o monoinsaturado que comprenden 18 átomos de carbono, y R2 representa H o S03H.

7. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se utiliza una mezcla de un lipoquito oligosacárido de la fórmula (I) en donde R2 representa H, con un lipoquito oligosacárido de fórmula la (I) en donde R2 representa S03H.

8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque dicho lipoquito oligosacárido de la fórmula (I) se utiliza a una concentración de 10"5 a 10"12 M.

9. Ei uso de la reivindicación 9, caracterizado porque dicho lipoquito oligosacárido de la fórmula (I) se utiliza a una concentración de 10-7 a 1 (r1 0 M.

10. Una mezcla de lipoquito oligosacáridos, caracterizada que comprende un lipoquito oligosacárido de la fórmula (I) en donde R2 representa H, con un lipoquito oligosacárido de la fórmula (I) en donde R2 representa S03H.