JPH05504054A - 入れ子コーン式分離器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞を培地内に懸濁させる細胞培養系は、細胞産生物の生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ ）製造に替わるコスト効率の良い方法である。

懸濁細胞培養物（ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ　ｃｅｌ、ｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ）の挙動 は細胞濃度に依存することが多い。高細胞濃度に対する制限としては、廃棄物、 毒素、死細胞、および細胞産生物を細胞培養系から除去する能力が挙げられる。

例えば、細胞培養物中に生成した毒素の蓄積は、細胞産生を止めてしまう可能性 かある。

また、上記系を長期間維持しなければならない場合、細胞産生物は細胞培養物内 の条件を乱さない方法によって採取しなければならない。

懸濁細胞培養物から流体（ｆｌｕｉｄｓ）を除去する従来法にともなう問題に共 通するのは、懸濁細胞がその支持体となっている培地よりほんのわずかに高濃度 であることか多いということである。このような細胞の懸濁は、培地と細胞を撹 拌することによって維持される。培養物中の大量の細胞を系内の酸素源または栄 養源から除去または単離する分離技術は、特に潅流および還流細胞培養系（ｐｅ ｒｆｕｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｉｒｃｕｍｆｕｓｉｏｎ　ｃｅｌ、ｌ　ｃｕｌｔｕ ｒｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ）の生産性を低下させることか多い。さらに、細胞分裂に よって再生する能力を有する培養物中の細胞の割合として定義することができる 細胞生存性（ｃｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）は、細胞、細胞産生物、および廃 棄物含有潅流液の迅速除去に依存することがある。

一つの分離方法は、細胞を潅流液から沈降させるための懸濁容器に合った容量を 単離することであった。沈降装置としては、カラムやロートなどが挙げられる。

例えば、ムラカミＨｅｔｅｒｏｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、’　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　２４２８２ −２８６　（１９８５））　、およびタベラら（Ｊ、　Ｔａｂｅｒａ　ｅｔｏｌ ｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　３３：　１２９６−１３０ ５　（１９８９））参照。

ムラカミら（Ｍｕｒａｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ、）は、細胞培養系内に一部浸漬さ せる沈降カラムについて述べている。インペラー（ｉｍｐｅｌＩｅｒ）を浸漬末 端に固定し、そこで潅流液と懸濁細胞はカラムに入り、カラム内壁に沿って沈降 する。細胞培養物の上方の胞沈降器（ｃｅｌｌ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｏｒ）に ついて述べている。この沈降器は下部ロート部分と上部カラム部分を育する。細 胞は沈降器内で沈降し発酵器に戻るが、潅流液はポンプによって沈降器の上部か ら引き込まれる。タベラら（Ｔａｂｅｒａ　ｅｔ　ａｔ、）が述へている別の分 離器は、水平面に対して鋭角に配置された複数の平行プレートを育するチャンバ ーである。発酵器からの細胞培養培地はこれらのプレートから流入する。プレー ト間の層流が細胞をプレート表面に沿って蓄積させるとともに、チャンバーの底 に連続的に堆積させて発酵器にポンプ返送させる。

これらの従来の手法にもかかわらず、細胞培養物からの高速除去の影響およびそ れにともなう細胞生存性に及はす影響は、潅流および還流細胞培養系の育用性を 制限してきた。また、細胞の連続的沈降は、一般に細胞培養系の大部分を占める ため、大量の細胞をその細胞培養系から単離する必要かあり、生産性が制限され ることか多かった。

したがって、高レベルの細胞生存性を維持しつつ有害な副生成物を細胞培養系か ら迅速に除去することができる、潅流液を細胞から分離するためのシステムがめ られている。

発明の要旨 本発明は、細胞培養系、入れ子コーン式分離器（ｎｅｓｔｅｄ−ｃｏｎｅ　５ｅ ｐａｒａｔｏｒ）、および潅流液を細胞培養物から分離するための方法に関する 。入れ子コーン式分離器は、外側コーン（Ｏｕｔｅｒ　ｃｏｎｅ）および該外側 コーン内に入れ込んだ内側コーン（１ｎｎｅｒ　ｃｏｎｅ）を育する。外側コー ンの最も狭い部分は細胞培養物中に浸漬される入口孔（ｉｎｌｅｔ　ｐｏｒｔ） をなしている。外側および内側コーンは、入口からの距離の増大にともない流れ 断面積（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎａｌ　ａｒｅａ　ｆｏｒ　ｆｌｏｗ）を増 大させる環（ａｎｎｕｌｕｓ）をなしている。入口孔の上方のヘット空間（ｈｅ ａｄ　５ｐａｃｅ）に入口孔の上部に設けられた出口孔（ｏｕｔｌｅｔ　ｐｏｒ ｔ）かある。環は、入口孔と出口孔の間の流体の連絡を行う。

潅流液を細胞培養物から分離する方法は、潅流液と細胞を細胞培養物から入れ子 コーン式分離器に通す工程を含む。潅流液は、外側コーンと内側コーンによって 形成されている拡大した流れ環（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ　ａｎｎｕｌｕｓ　ｏｆ　 ｆｌｏｗ）を通して送られる。潅流液の「見掛け」流速（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａ ｌ　ｖｅｌｏｃｉｔｙ）または垂直流速は環中で低下し、その結果、潅流液内の 細胞は潅流液流の経路に対して横断方向に沈降し、外側コーンの内壁に蓄積する 。

環の壁の間の適当な幅および入口孔と出口孔の間の距離は、それ釡下回ると細胞 が潅流液から沈降する潅流液流の垂直流速として定義される細胞の「ストークス 則の終速（５ｊｏｋｅ“ｓ　Ｌａ１ｖ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｖｅｌｏｃｉｔｙ） Ｊによって、および懸濁細胞培養物中の潅流液が新鮮培地と置換される速度とし て定義される「潅流速度（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｒａｔｅ）Ｊによって決定する ことかできる。拡大する環を通る入口孔からの潅流液流路は拡張的（ｄｉｖｅｒ ｇｅｎｔ）であり、それにより入口からの潅流液の距離か大きくなるのにともな い見掛は流速が低下する。環中に生じた潅流液流のパターンは、細胞を潅流液流 の経路に対して横断方向に沈降させるものである。潅流液中の細胞は、このよう にして外側コーンの内壁に沿って蓄積する。目的生成物、細胞、望ましくない廃 棄物、および毒素からなる潅流液は細胞培養物に返送されるべき細胞からこのよ うにして分離され、出口孔にて環から取り出される。外側コーンの内壁に蓄積し た細胞は、重力によって内壁沿いに潅流液流と逆の方向に向けられ、入口孔にて 再び細胞培養物中に導かれる。

本発明の入れ子コーン式分離器は、マイクロキャリヤー（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉ ｅｒｓ）上で成長させた付着依存性細胞（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅ ｎｔ　ｃｅｌｌｓ）の培養物から潅流液を分離するのに特に存利である。付着依 存性細胞のストークス則終速は、該細胞をマイクロキャリヤーに付着させること によって増大させることかできる。同じ効果は、凝集（ｆｌｏｃｃｕｌｅｎｃｅ ）の場合のように付着依存性細胞か互いに付着し合う場合にも生じる。付着依存 性細胞又は凝集のいずれの場合でも、本発明による細胞からの潅流液の分離効率 が上がる。

本発明の懸濁細胞培養系は、様々な細胞培養物から潅流液を効果的かつ制御的に 分離することかできる。本発明は、例えばモノクローナル抗体、ウィルス、５ｐ ２１０由来トランスフエクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）細胞、ホルモン およびその他の細胞由来高分子体、およびヒトおよびその他の生物に使用するた めの細胞の製造に使うことができる。本発明はまた、細胞の反復サンプリングの ための細胞培養物の維持、抗生物質発酵、および下水処理における沈降法に替わ る方法としても用いることができる。

入れ子コーン式分離器は、細胞は垂直導管内より傾斜導管内でより速く沈降する というボイコット効果（Ｂｏｙｃｏｔｔ　ｅｆｆｅｃｔ）を強化するものである 。拡大する環によって減速された見掛は流速とボイコット効果が、細胞培養物内 に保持されるべき細胞を潅流液流の経路に対して横断する方向に沈降させ、分離 器の内壁に蓄積させて細胞培養物に返送させる。さらに、潅流液から細胞培養物 に返送されるべき細胞を分離器中で迅速に分離することで、細胞培養系の培養物 と栄養供給源および酸素供給源から細胞を単離する期間か実質的に短縮される。

したがって、より大規模な細胞培養系を維持することができる。また、潅流液は １日当たり大容量を処理する速度での置換か可能である。これにより、高い細胞 濃度を有する懸濁細胞培養物中ての細胞保持が可能となる。本発明の細胞培養系 によって潅流速度を調整して、系内の細胞生存性を変えることもできる。本発明 の入れ子コーン式分離器は、死細胞か比較的小型であること、およびストークス 則終速は細胞の直径の平方に反比例することから、死細胞を選択的に除去するこ とができる。これにより、細胞濃度、細胞生存性、細胞培養物中の細胞保持、お よび細胞培養物中の細胞サイズを、本発明の細胞培養系が可能ならしめる様々な 条件によって調整することができる。したがって、本発明の潅流液からの細胞分 離方法は、細胞および細胞産生物の製造に存用な条件において細胞培養物を長期 間高い信頼性をもって維持する簡便かつコスト効率の高い手段を提供するもので ある。

本発明の上記特徴およびその他の詳細について、方法の工程としてまたは本発明 の部分の組み合わせとして、添付されている図面を参照しなからさらに具体的に 説明するとともに、請求項に記載する。本発明の特定の態様を図によって説明す るが、これらは本発明を制限するものではない。本発明の主な特徴は、本発明の 範囲を逸脱しない限り様々な態様において適用できる。

図面の簡単な説明 図１は、潅流細胞培養系に適用した本発明の一態様を示す側面図である。

図２は、図１に示す態様の断面図である。

図３は、図２に示す態様の３−３線の断面図である。

図４は、本発明の第二の態様を示す断面図である。

図５は、本発明の第三の態様を示す断面図である。

図６は、本発明の第四の態様を示す断面図である。

図７は、本発明の第五の態様を示す断面図である。

図８は、本発明の第六の態様を示す断面図である。

図９は、実施例１に記載の通り約６２ｍｍと約１００ｍｍの外径を育する本発明 の第六の態様の２つの分離器から異なる見掛は流速（ｃｍ／秒）で取り出した、 潅流液中に保持されている細胞の割合で表した細胞保持率をプロットしたもので ある。

図１０は、実施例２に記載の通り本発明の第四の態様の細胞分離器を用いた場合 の１日当たり約３．５容量の潅流速度における潅流細胞培養系中の細胞濃度（細 胞／ｍ１）と生存性百分率の経時変化（時間）をプロットしたものである。

図１１は、実施例２に記載の通り本発明の第四の態様の細胞分離器を用いた場合 の１日当たり約ＩＯ容量の潅流速度における潅流細胞培養系中の細胞濃度（細胞 ／ｍ１）と生存性率の経時変化（時間）をプロットしたものである。

図１２は、実施例２に示した通り１日当たり約３．５および約１０容量の潅流速 度における潅流細胞培養系から取り出された潅流液中の細胞保持と細胞サイズの 関係をプロットしたものである。

図１３は、実施例２に示した通り１日当たり約３．５および約１０容量の潅流速 度における潅流細胞培養物中の細胞保持と細胞サイズの関係をプロットしたもの である。

発明の詳細な説明 図１に示す細胞培養系１０は、潅流または還流細胞培養物１４を発酵器１６の内 部に支持する。細胞培養物１４はインペラー１８によって撹拌され、それによっ て細胞を細胞培養物１４中に懸濁させる。本発明における懸濁液中での増殖に適 した哺乳動物細胞種の例としては、ＨｅＬａ−３３細胞（ヒト）、ＢＨＫ細胞（ 仔ハムスター腎臓）、Ｌ細胞（マウス）、ヒトリンパ芽球様細胞（ｈｕｍａｎ　 ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ　ｃｅｌｌｓ）、ハイブリドーマ、およびトラン スフエフトーマ（ｔｒａｎｆｅｃｔｏｍａＳ）などが挙げられる。本発明はまた 、細菌細胞、酵母細胞、遺伝子操作細胞、およびその他の潅流または還流系中で 培養可能ないずれの細胞の培養にも適する。マイクロキャリヤーを使用して本発 明により培養することができる付着依存性細胞の例としては、ＨｅＬａ細胞（ヒ ト）、３Ｔ３マウス繊維芽細胞（ｆ　１ｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、マウス骨髄上皮 細胞（ｍｏｕｓｅ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ ｓ）、ネズミ白血病ウィルス産生性マウス繊維芽細胞系（Ｍｕｒｉｎｅ　Ｌｅｕ ｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　５ｔｒａｉｎｓｏｆ　ｍｏｕｓ ｅ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、−次および二次ニワトリ繊維芽細胞（ｃｈｉｃ ｋ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、ＷＩ−３８ヒト繊維芽細胞、および正常ヒト胚 肺（ｅｍｂｒｙｏ　ｌｕｎｇ）繊維芽細胞なとか挙げられる入れ子コーン式分離 器１２は、テフロン［Ｆ］ポリテトラフルオロエチレン被覆磁石１３を支持する アダプター１１に取り付は可能な入口孔３８を有する。図示していないかモータ ーか磁石１３を駆動させることによってインペラー１８を回転させる。アダプタ ー１１にある穿孔（ｐｅｒｆｏｒａｔｉｏｎｓ）　Ｉ　５か細胞培養物１４と入 口孔３８の間の流体連絡を可能にする。アダプター１１は細胞培養物１４中に浸 漬される。

図２に示す通り、外側コーン３０と内側コーン３２は環２８をなし、入口孔３８ から流れ断面積を拡大するよう形成する。ヘッドプレート（ｈｅａｄ　ｐｌａｔ ｅ）３４は環２８を大気から遮断する。出口孔３６はヘッドプレート３４の中に あって、図１に示すように環２８とポンプ２０の間の流体連絡を行なう。細胞培 養物１４からの潅流液と細胞はポンプ２０によって入口孔３８にて入れ子コーン 式分離器１２に導入される。潅流液は入れ子コーン式分離器１２中で細胞から分 離された後、ポンプ２０によって出口導管（ｏｕｔｌｅｔ　ｃｏｎｄｕｉｔ）２ ２を通って入れ子コーン式分離器１２から引き出される。細胞は分離器１２中で 潅流液から分離され、続いて入口孔３８にて発酵器１６に戻される。新鮮培地か フィード導管（ｆｅｅｄ　ｃｏｎｄｕｉｔ）２４を通って新鮮培地源２６から細 胞培養物１４に供給され、細胞培養物１４から分離された潅流液と置換される。

図３に示したように、内側コーン３２と外側コーン３０は実質的に同心状てあり 、実質的に一定の幅を取ることかできる環２８を形成する。外側コーン３２は円 錐台（ｆｒｕｓｔｒｕｍ）を形成するように切断されており、最も狭い部分は入 口孔３８をなす。潅流液と細胞が環２８に沿って導かれるのにともない、流路は 拡張（ｄｉｖｅｒｇｅ）　Ｌ／、流れ断面積が拡大する。内側コーン３０は内部 人口５２を形成するように切断されている。発酵器１６から入れ子コーン式分離 器１２に導入された潅流液と細胞（図１）は、内部人口５２と内部チャンバー４ ０を通過するように導かれる。環２８中および内部チャンバー４０中の潅流液は ヘッド空間４２にて一体となり、続いて出口孔３６を通って入れ子コーン式分離 器１２から取り出される。

潅流液流は環２８に沿って拡張し、それによって外側コーン３０の内壁４６に対 して横断する方向の潅流液流速は入口孔３８からの距離の増大にともない低下す る。したがって、環２８内の潅流液の見掛は流速は入口孔３８からの距離の増大 にともない低下する。さらに環２８は、細胞か垂直チューブ中よりも速く潅流液 から沈降するというボイコット効果をもたらす。

一つの細胞か沈降するストークス則終速は次のようにして算出することかできる 。

ここで、ｄ、＝粒径（ｃｍ） Δρ＝密度差（粒子−流体）（ｇ／ｃｍ’）ｇ＝重力加速度（９８１ｃｍ／秒２ ） μ＝流体速度（ｇ　／　ｃ　ｍ・秒） 及び　Ｖ　ｔ　”終速（ｃｍ／秒） 環２８内の潅流液の見掛は流速の低下とボイコット効果か細胞を潅流液流路に対 して横断方向に沈降させ潅流液から分離させる。好ましい態様においては、環２ ８内の見掛は流速を細胞培養物１４に返送される細胞のストークス則終速未膚ま で低下させる。細胞は沈降し続けながら外側コーン３０の内壁４６に沿って蓄積 し、内壁４６によって逆に入口孔３８に向けて導かれる。内壁４６にて近接して 蓄積した細胞４４は互いに付着し合うこともでき、それらの蓄積動能（ｃｏｌｌ ｅｃｔｉｖｅ　ｍｏｖｅｍｅｎｔ）は環２８に対して横断する方向に沈降する他 の細胞を取り込む下方流を発生し、潅流液からの細胞分Ｋｉｔの速度をさらに上 げることかできる。

環２８中で細胞を分離された潅流液はヘッド空間４２を通過する（図２）。ヘッ ド空間４２内の潅流液は出口孔３６に向けて導かれる。潅流液によってヘッド空 間４２に持ち込まれた残留細胞の一部はヘット空間４２中で潅流液からさらに分 離し、内部チャンバー４０中に沈降する。出口孔３６における潅流液は、適当な 潅流速度において細胞培養物内で保持されるべき細胞を実質的に含まない。ヘッ ド空間４２から沈降する細胞は、内部人口５２を通って内部チャンバー４０に運 び込まれた細胞と混じり合う。これらの残留細胞は内部チャンバー４０中で潅流 液から分離し、内側コーン３２の内壁５０に蓄積する。内壁５０は分離した細胞 を逆に内部人口５２に向けて導く。内壁５０に蓄積した残留細胞４８は内部人口 ５２にて環２８中で潅流液と合流させることかできる。次いで、これらの残留細 胞は環２８中で潅流液から分離して細胞培養物１４から直接引き離された他の細 胞と共に内壁４６に蓄積する（図工）。残留細胞４Ｂの一部を細胞培養物！４に 返送することもできる。

図４に示した別の態様においては、中間コーン５４が外側コーン３０と内側コー ン３２の間に入れ込まれている。中間コーン５４は円錐台を形成するように切断 されており、その最も狭い部分は中間入口（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　ｅｎｔ ｒａｎｃｅ）６２をなす。潅流された細胞培養物１４からの潅流液と細胞は中間 人口６２を通って、流れ断面積が拡大する内環（ｉｎｎｅｒ　ａｎｎｕｌｕＳ） ５６中に導かれる。潅流液流は中間人口６２からの距離の増大にともない内環５ ６内で拡張する。中間コーン５４の内壁６０に対して横断する方向の潅流液流速 は中間人口６２からの距離の増大にともない低下し、その結果潅流液の見掛は流 速を低下させ、低下した見掛は流速とボイコット効果の組み合わせによって細胞 培養物に返送されるべき細胞を内環５６に対して横断する方向に沈降させる。本 発明の好ましい態様においては、環５６内の見掛は流速を懸濁細胞培養物に返送 されるべき細胞のストークス則終速未膚に低下させる。このようにして、潅流液 の見掛は流速の減速によって、潅流液中の細胞を潅流液から分離させ、中間コー ンＳ４の内壁６０に沿って蓄積させる。蓄積した細胞５８は内壁６ｏによって中 間人口６２に向けて導かれる。

中間コーン５４の内壁６０に沿って移動する細胞５８は中間人口６２で環２８中 の潅流液と出会い一体となる。細胞５８の一部は入口孔５２を通って細胞培養物 に戻ることもてきる。中間コーン５４を操作して潅流液と細胞の逆円錐型の流れ の第二の層を加えることによって、入れ子コーン式分離器１２の効率が向上する 。環２８および内環５６中の潅流液はヘッド空間４２で合流し、そこで残留細胞 か内部チャンバー４０中の潅流液から分離して内側コーン３２の内壁５ｏに沿っ て蓄積する。蓄積した細胞４８は、内壁５ｏによって逆に内部人口５２に導かれ 、内環５６で潅流液の流れに入る。次いで、これらの細胞が潅流液から分離し、 内壁６ｏに蓄積する。

図５に示した第三の態様においては、細胞培養物から分離される潅流液は、円錐 台をなすように切断された外側コーン７８によって形成されている入口孔７４を 通って入れ子コーン式分離器６４中に導かれる。細胞と潅流液は、第一の外側コ ーン７８と第一の内側コーン８ｏによって形成され、流れ断面積を拡大する下履 （ｌｏｗｅｒ　ａｎｎｕｌｕｓ）　７６に沿って導かれる。下履７６内の潅流液 流は拡張し、これにより下履７６内の見掛は流速は入口孔７４からの距離の増大 にともない低下する。このようにして下履７６内の潅流液の見掛は流速を低下さ せる。好ましい態様においては、下履７６内の見掛は流速を細胞培養物に返送す べき細胞のストークス則終速未満に低下させる。ボイコット効果と見掛は流速の 減速によって、細胞を下履７６に対して横断する方向に沈降させ、外側コーン７ ８の内壁６８に沿って蓄積させる。蓄積した細胞６６は内壁６８によって逆に入 口孔７４に向けて導かれ、再び潅流された細胞培養物に入る。

内壁６８に沿って蓄積しない潅流液内細胞は、潅流液によって、流れ断面積を収 束（ｃｏｎｖｅｒｇ　ｉｎｇ）させる止環（ｕｐｐｅｒ　ａｎｎｕｌｕｓ）８２ に導入される。止環８２中の潅流液流は、第一の内側コーン８０と第一の外側コ ーン７８に対して逆向きの第二の内側コーン７０と第二の外側コーン８６によっ て形成される。第二の内側コーン７０と第二の外側コーン８６は、実質的に一定 の加速度を与えることで潅流液が出口孔９ｏに近づく際の潅流液の乱れを最小限 にとどめることができること、および入れ子コーン式分離器６４内で潅流液から 細胞を分離し続けることができるので有利である。したがって、下履７６で潅流 液から分離しない細胞は止環８２内で潅流液流の幅に対して横断する方向に沈降 することができる。これらの残留細胞は下履７６から止環８２に運び込まれ、第 二の内側コーン７０の壁８４で蓄積することができる。壁８４で蓄積した細胞８ ８は互いに付着し合うことかでき、止環８２の幅に対して横断する方向に沈降す る細胞を取り込むことかできる。下側コーン８０と上側コーン７ｏは出合ってリ ップ（ｌｉｐ）７２を形成する。リップ７２では、細胞８８が壁８４によって下 履７６に導かれる。次いで、止環８２からの細胞は下履７６内で潅流液から分離 し、第一の外側コーン７８の内壁６８に沿って蓄積する。蓄積した細胞６６は内 壁６８によって逆に入口孔７４に向けて導かれ、再び懸濁細胞培養物に入る。実 質的に細胞を含まない潅流液は出口孔９ｏを通って導かれ、さらに処理される。

図６は、中間コーン９２を外側コーン７８と内側コーン８００間に設けることが できる本発明の第四の態様を示している。流れ断面積を拡大させる２つの環がこ のようにして形成される。円錐台をなすように切断された中間コーン９２は最も 狭い部分で内部入口９６を形成する。上側コーン７ｏの壁８４に蓄積した細胞８ ８はリップ７２で内環（ｉｎｔｅｒｉｏｒ　ａｎｎｕｌｕｓ）９４に入ることが できる。内環９４内の細胞は潅流液流に対して横断する方向に沈降し、内壁１０ ２に蓄積する。蓄積した細胞１００の一部は潅流された細胞培養物に戻ることか できる。蓄積した細胞１００は、内部入口９６で下履７６に入る潅流液と一体と なることもできる。このようにして、止環８２から蓄積した細胞はリップ７２で 下履９４中の潅流液に導入される。入れ子コーン式分離器６４の効率は、蓄積し た細胞を下履９４の入口で供給することによって幾分向上する。

図７に示した第五の態様においては、入れ子コーン式分離器１０４は外側コーン １０６にて潅流された細胞培養物中に部分的に浸漬することかできる。内側コー ン１０８は外側コーン１０６内に入れ込まれている。外側コーン１０６と内側コ ーン１０８により環１１０をなし、それによって懸濁細胞培養物からの距離の増 大にともない流れ断面積を拡大している。懸濁細胞培養物からの潅流液は、円錐 台をなすように切断された外側コーン１０６の最も狭い部分によって形成されて いる入口孔＋１２にて環１１０に導入される。内側コーン１０８は円錐台をなす ように切断されており、その最も狭い部分は内部入口１２６を形成する。潅流液 と細胞の一部は内部入口１２６でヘッド空間１１８に入ることができる。細胞は 潅流液から分離し、外側コーン１０６の内壁１１６に沿って蓄積する。蓄積した 細胞１１４は内壁１１６によって逆に入口孔１１２に導かれる。潅流液は環１１ ０から内側コーン１０８と上側コーン１２０によって形成されているヘッド空間 １１８に導かれる。ヘッド空間１１８中の残留細胞は潅流液から分離し、内側コ ーン１０８の内壁１２’２に沿って蓄積する。蓄積した細胞１２４は内壁１２２ によって内部入口１２６に向けて導かれ、そこで細胞の一部が環１１０に入る。

細胞１２４の一部は懸濁細胞培養物に戻ることもできる。実質的に細胞を含まな い潅流液を出口孔１２８にて入れ子コーン式分離器１０４から取り出す。

本発明の第六の態様においては、図８に示したように中間コーン１３０を外側コ ーン１０６と内側コーン１０８の間に設けることができる。内側コーン１０８の 内壁１２２に蓄積した細胞１２４は内壁１２２に沿って蓄積し、中間入口１３８ で潅流液と一体となる。中間コーン１３０は円錐台をなすように切断されており 、それによって中間入口１３８を形成する。蓄積した細胞！３４は内壁＋３６に よって中間大０１３８に向けて導かれ、環１１０に入る潅流液と一体となる。

蓄積した細胞＋２４および１３４の一部は入口孔１１２を通って再び懸濁細胞培 養物に入ることかできる。入れ子コーン式分離器１０４の効率は、中間コーン１ ３０を用い、細胞か横断する方向に沈降しなければならない距離を減らすこと、 潅流液流の容積当たりの表面積を増大させること、および内環１３２中に蓄積し た細胞を隣接する環の入口に送ることによって向上される。

実施例１ 図８に示した態様の２つの入れ子コーン式分離器を、ＴＫ６ヒトＢリンパ芽球様 細胞の懸濁液を約ｌＯ″細胞／ｍｌの濃度で食前する２５０ｍ１発酵器に入れた 。一方の分離器は約６２ｍｍの外径を有し、外側コーンと内側コーンと中間コー ンの間隔は約１７８インチであった。もう一方の分離器は約ＩＱＯｍｍの外径を 有し、外側コーンと内側コーンと中間コーンの間隔は約１／４インチであった。

二つの分離器のコーンの間の環流は水平面に対して約６０°の流れ角を育してい た。分離器に取り付けた較正された（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）ポンプが小さい方 の分離器については１日当たり約０．８〜５２リツトルの流速で、大きい方の分 離器については１日当たり約４〜２０リツトルの流速で潅流された細胞培養物か ら潅流液を引き込んだ。コールタ−カウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ　ｃｏｕｎｔｅ ｒ）を用いて、分離器を出る潅流液中の細胞の濃度を測定した。細胞は直径か約 １２μｍであり、約３．９　ｘ　ｌ　Ｏ−’ｃｍ／秒の最終沈降速度を有してい た。図９は、分離器の入口における潅流液の細胞濃度に対する分離器の上部から 出る細胞の濃度の比である分離効率εをプロットしたものである。図９でわかる ように、大小いずれの入れ子コーン式分離器も、約８Ｘ１０−“ｃｍ／秒までの 見掛は流速を有する潅流細胞培養系中では潅流液中の細胞損失率は２０％未満で あった。

実施例２ 図６に示したような入れ子コーン式分離器を、２５０ｍ１の容量および約９ｘ２ ０’細胞／ｍｌの初期細胞濃度を有する５ｐ２１０由来トランスフエクトーマ細 胞の潅流細胞培養物中に入れた。内側コーンと外側コーンと中間コーンの間隔は 約１／８インチであった。入口孔と出口孔は直径か約１／２インチであった。下 履と内環の流れは水平面に対する角度か約６０’であった。入口孔と出口孔は約 １／２インチの直径を有していた。

図１０は、１日当たり約１０容量の潅流速度における細胞培養物の成長速度と生 存性の経時変化（日）を示している。

最大細胞濃度は約２ｘｌＯ’細胞／ｍｌであった。細胞濃度は約１週間にわたり １ｘｌＯ？細胞／ｍ１以上に維持された。図１１は、１日当たり約３．５容量の 潅流速度における細胞培養物の成長速度と生存性の経時変化（日）を示している 。最大細胞濃度は約１週間にわたり約１ｘｌＯ”細胞／ｍｌであった。■日当た り１０容量の潅流速度における細胞培養物の細胞生存性は１６日を越える期間に わたり約８０９６を越えていた。１日当たり約３．５容量の潅流速度における細 胞生存性は約１１日を越える期間にわたり約７０％を越えていた。したがって、 細胞濃度と細胞生存性は細胞培養物の潅流速度を調節することによって本発明に より制御することができることがわかる。

１日当たり約３．５容量および約ｌＯ容量の潅流速度について細胞損失を細胞直 径の関数として測定し、図１２に示した。潅流速度が１日当たり約３．５容量で は、潅流液内に保持された細胞サイズの分布は１日当たり約１０容量の潅流速度 でみられたものと異なっていた。したかって、潅流された細胞培養物から取り出 した細胞サイズの分布は潅流速度を変えることによって変更できることがわかる 。さらに、図１３でわかるように、懸濁細胞培養物中の細胞サイズの分布は１日 当たり約３．５容量と約１０容量の潅流速度で異なっていた。したがって、潅流 された細胞培養物中の細胞サイズの分布も懸濁細胞培養系中の潅流速度を変える ことによって変更することができる。

同等性 本発明のコーンは必ずしも同心状でなくてもよく、また、本発明の範囲を逸脱し ない限りにおいて本発明の流れ環（ａｎｎｕｌｉ　ｏｆ　ｆｌｏｗ）は入口孔と 出口孔の間で幅を変えることができるものとする。また、本発明を説明するため に使用する場合の「コーンＪという用語は、３面以上の面を有する角錐および角 台（ｐｒｉｓｍａｔｏｉｄｓ）を含み、また、該角錐と角台を切断することによ って、最も狭い部分が入口孔、内部入口、および中間入口を形成する円錐台をな すことができるものとする。

さらに、入れ子コーン式分離器の既存のコーンの間に追加のコーンをはさむこと で、流れ断面積を追加して拡大するとともに、細胞から潅流液を分離する能力を 高めることもできる。コーンの数と流速を変更して潅流および還流細胞培養物を 制御することができる。

また、本発明を用いて例えば懸濁液やコロイド状態の液体から固体を分離するな ど他の操作系中で流体から懸濁固体粒子や非混和性液体を分離することもできる ものとする。

好ましい態様について本明細書で具体的に記載、説明したが、上記説明に照らし 、本発明の精神と範囲から逸脱しない限り下記の請求項の範囲内で本発明に様々 な修正や変更を加えることが可能であるものとする。

１次慣のえ掛づ遣鬼　ｃｍ／ｓ　（に１０カブ聞（時間） 一ハ２ηＪＬ〒も、ミツロン ＆田月包のｔｉ往、ミ７０ン 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）１．特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０６５０９ ２、発明の名称 入れ子コーン式分離器 ３、特許出願人 住所　アメリカ合衆国　マサチューセッツ　０２１３９ケンブリツジ、マサチュ ーセッツ　アベニュー名称　マサチューセッツ　ィンスティチュート　オブ　テ クノロジー ４、代理人 住所　〒５４０　大阪市中央区谷町２丁目８番１号大手前Ｍ２ビル　細円国際特 許事務所 ６、添付書類の目録 （１）補正書の写しく翻訳文）　１通 １、細胞培養容器から潅流液を除去する間に潅流液が細胞より分離され、かつ該 細胞か蓄積され該細胞培養容器に戻される細胞培養系であって、 培地と細胞を含有する細胞培養容器と、細胞培養容器内に設けられた入れ子コー ン式分離器であって、入口孔から該入口孔よりも上部に設けられている出口孔ま での流れ断面積を拡大する環を形成する外側コーンおよび内側コーンを有し、該 細胞培養容器の直径よりも小さい直径を有する入口孔を該外側コーンの最も狭い 部分に形成し、そこを通じて潅流液と細胞を該細胞培養容器から取り出し数理の 中に入れることができ、該環中の潅流液から細胞を分離させ入口孔において該培 養容器に戻させる入れ子コーン式分離器と、 該入れ子コーン式分離器を用いることにより、細胞培養容器より潅流液および細 胞を取り出し、該入れ子コーン式分離器の出口孔を通して潅流液を細胞培養系よ り取り除く手段、および 新鮮培地を該細胞培養容器に導くための手段とからなる細胞培養系。

国際調査報告 ＋ｅ＋、、ｓ＋ｍ＋ｎ１Ａｎ１．＋に＊Ｎ＋　ＰＣＴ／ＵＳ９０１０６５０９国 際調査報告 ＵＳ　９００６５０９ ＳＡ　４２４１３

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞培養容器から灌流液を除去する間に灌流液が細胞より分離され、かつ該 細胞が蓄積され該細胞培養容器に戻される細胞培養系であって、 培地と細胞を含有する細胞培養容器と、外側コーンおよび内側コーンを有し、該 外側コーンと該内側コーンとの距離は入口孔から該入口孔よりも上部に設けられ ている出口孔までの流れ断面積を拡大する環を形成し、灌流液と細胞を該細胞培 養容器から取り出し該環の中に入れることのできる入口孔を該外側コーンの最も 狭い部分に形成することにより、該環中の灌流液から細胞を分離させ入口孔にお いて該培養容器に戻させる入れ子コーン式分離器と、 入れ子コーン式分離器を用いることにより、細胞培養容器により灌流液および細 胞を取り出し、これにより該入れ子コーン式分離器の出口孔を通して灌流液を細 胞培養系より取り除く手段、および 新鮮培地を該細胞培養容器に導くための手段とからなる細胞培養系。
2. ２．細胞培養容器から灌流液を除去する間に灌流液が細胞より分離され、かつ該 分離細胞が蓄積され細胞培養容器に戻される入れ子コーン式分離器であって、細 胞培養物からの灌流液の流れ断面積を拡大する環を形成する、外側コーンおよび 該外側コーン内に入れ込んだ内側コーンと、 該外側コーンの狭い部分に形成され、灌流液を細胞培養物から取り出し該環に入 れ、細胞を該環から該細胞培養物に戻す入口孔と、 該内側コーンの狭い部分に形成されている内部入口、および 該細胞培養物から灌流液を除去するために該入口孔よりも上部に設けられている 出口孔とからなる入れ子コーン式分離器。
3. ３．内側コーンが外側コーンと実質的に同心状である請求項２記載の入れ子コー ン式分離器。
4. ４．さらに外側コーンと内側コーンとの間に少なくとも１つの中間コーンを設け 、該中間コーンは該中間コーンの狭い部分に形成されている中間入口をもってい る請求項２記載の入れ子コーン式分離器。
5. ５．細胞培養容器から灌流液を除去する間に灌流液が細胞より分離され、かつ該 細胞が蓄積され細胞培養容器に戻される入れ子コーン式分離器であって、 細胞培養物からの灌流液の流れ断面積を拡大する下環を形成する、第一外側コー ンおよび該第一外側コーン内に入れ込んだ第一内側コーンと、 該第一外側コーンの狭い部分に形成され、灌流液を細胞培養物から取り出し該環 に入れ、細胞を該環から懸濁細胞培養物に戻す入口孔、および 該細胞培養物から灌流液を除去するために該入口孔よりも上部に設けられている 出口孔とからなる入れ子コーン式分離器。
6. ６．第一内側コーンが第一外側コーンと実質的に同心状である請求項５記載の入 れ子コーン式分離器。
7. ７．さらに第一内側コーンに対して逆向きの第二内側コーンを設け、その底面の 直径を該第一内側コーンと等しくし、該第一内側コーンの底面において該第一内 側コーンに隣接されている請求項５記載の入れ子コーン式分離器。
8. ８．さらに第一外側コーンに隣接する第二外側コーンを設け、該第二外側コーン および第二内側コーンにより環を形成することにより、上環を通して灌流液の流 れ断面積を収束している請求項７記載の入れ子コーン式分離器。
9. ９．さらに第一外側コーンと第一内側コーンとの間に少なくとも１つの中間コー ンを設け、該中間コーンは該中間コーンの狭い部分に形成されている中間入口を もっている請求項５記載の入れ子コーン式分離器。
10. １０．環を形成する外側コーンおよび内側コーンの間に細胞培養物より灌流液と 細胞を導く工程からなり、これにより環中の灌流液流の速度を減少させるために 流れ断面積を拡大し、細胞を灌流液流路に対して横断する方向に該環を通って沈 降させて該外側コーンの内壁に蓄積させ、それによって灌流液を細胞より分離し 細胞培養物より除去し、一方該灌流液より分離された細胞を内壁により該細胞培 養物に戻すことからなる、細胞培養物から灌流液を分離する方法。
11. １１．下環を形成する第一外側コーンおよび第一内側コーンの間に細胞培養物よ り灌流液と細胞を導く工程からなり、これにより下環中の灌流液流の見掛け流速 を減少させるために流れ断面積を拡大し、細胞を下環に対して横断する方向に沈 降させて該第一外側コーンの内壁に蓄積させ、それによって灌流液を細胞より分 離し細胞培養物より除去し、一方該灌流液より分離された細胞を内壁により該細 胞培養物に戻すことからなる、細胞培養物から灌流液を分離する方法。
12. １２．さらに第二内側コーンおよび第二外側コーンにより灌流液流の上環を形成 することにより、該上環を通して灌流液の流れ断面積を収束し、第二内側コーン の底面は第一内側コーンの底面に隣接され、その底面の直径は第一内側コーンの ものと等しく、第一内側コーンに対して逆向きに設けられ、第二外側コーンの底 面は第一外側コーンの底面に隣接され、その底面の直径は第一外側コーンのもの と等しく、第一外側コーンに対して逆向きに設けられる工程と、該上環において 灌流液から残留細胞を分離させる工程、および残留細胞を第二内側コーンの壁に 沿って下環の方へ向けて導き、下環を通して細胞を灌流液流の経路に対して横断 する方向に沈降させることにより、細胞培養物に戻す工程とからなる請求項１１ 記載の方法。
13. １３．さらに第一内側コーンおよび第一外側コーンの間に中間コーンを設けるこ とにより、灌流液から生細胞を分離するための流れ断面積を拡大する内環を形成 し、そのような細胞を内環を通して灌流液流路に対して横断する方向に沈降させ 、該中間コーンの内壁に沿って蓄積させることによって中間コーンにより蓄積し た細胞を細胞培養物に戻す工程からなる請求項１１記載の方法。
14. １４．懸濁液容器から液体を除去する間に液体が固体から分離され、かつ固体が 蓄積され該懸濁液に再び戻される入れ子コーン式分離器であって、 懸濁液から液体を分離するために流れ断面積を拡大する環を形成する、外側コー ンおよび該外側コーン内に入れ込んだ内側コーンと、 該外側コーンの一部分に形成され、液体を固体から分離するために懸濁液を該環 に取り入れ、懸濁液容器に該環から固体を戻す入口孔と、 該内側コーンの一部分に形成される内部入口、および入れ子コーン式分離器から 該液体を運搬するために入口孔よりも上部に設けられている出口孔とからなる入 れ子コーン式分離器。
15. １５．第一液体をコロイドから除去する間に第一液体と実質的に混合されない（ ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ）第二液体から第一液体を分離させ、かつ該第二液体は蓄 積され該コロイドに戻される入れ子コーン式分離器において、 コロイドからの第一液体の流れ断面積を拡大する環を形成する、外側コーンおよ び該外側コーン内に入れ込んだ内側コーンと、 該外側コーンの一部分に形成され、第一液体を第二液体から分離するためにコロ イドを該環に取り入れることができ、コロイド容器に該環から第二液体を戻す入 口孔と、該内側コーンの一部分に形成される内部入口、および入れ子コーン式分 離器から該第一液体を運搬するために入口孔よりも上部に設けられている出口孔 とからなる入れ子コーン式分離器。
16. １６．細胞培養物中の細胞生存性を最大にし、細胞培養容器から灌流液を除去す る間に細胞から灌流液を分離させ、分離された細胞は蓄積され細胞培養物に戻さ れる入れ子コーン式分離器であって、 細胞培養物からの灌流液の流れ断面積を拡大する環を形成する、外側コーンおよ び該外側コーン内に入れ込んだ内側コーンと、 該外側コーンの狭い部分に形成され、灌流液を細胞培養物から取り出し該環に入 れることができ、細胞を該環から懸濁細胞培養物に戻す入口孔と、 該内側コーンの狭い部分に形成されている内部入口、および 該細胞培養物から灌流液を除去するために該入口孔よりも上部に設けられている 出口孔とからなる入れ子コーン式分離器。
17. １７．ａ）細胞を培地に接種して細胞培養物を形成し、ｂ）環を形成する外側コ ーンおよび内側コーンの間に細胞培養物から灌流液と細胞を導くことにより、該 環中の灌流液流の速度を減少させるために流れ断面積を拡大させ、細胞を該環を 通して灌流液流路に対して横断する方向に沈降させ、該外側コーンの内壁に蓄積 させ、それによって灌流液は細胞より分離され該細胞培養物より除去され、一方 該灌流液より分離された細胞を内壁により該細胞培養物に戻し、 ｃ）副生される細胞生育副産物（ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｂｙ−Ｐｒｏｄｕｃ ｔｓ）の産生を促す条件下に細胞培養物を維持し、および ｄ）副生される細胞生育副産物を採取することからなる細胞生育副産物の製造方 法。
18. １８．細胞生育副産物がウィルスからなる請求項１７記載の方法。
19. １９．細胞生育副産物がモノクローナル抗体からなる請求項１７記載の方法。
20. ２０．細胞生育副産物がホルモンからなる請求項１７記載の方法。
21. ２１．細胞生育副産物が細胞由来の高分子体からなる請求項１７記載の方法。