JPH05503077A - 抗腫瘍剤としてのイルージンアナログ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗、剤としてのイルージンアナログ ｌ肌二生見 多剤化学療法はいくつかの血液悪性腫瘍、および急速に増殖する進行性の腫瘍塊 （ｓｏｌｉｄ　ｔｕｍｏｒｓ）に対して、治療の可能性を有する。化学療法によ る治療法は、新しい、相対的に非交叉耐性の薬剤の発見、および既存薬剤の更に 効果的な使用の慝恵を被った。通常用いられている薬剤の効力を増大させる介入 法には、多剤投与、薬剤の毒性の最小限化、およびアジュバント、外科療法、あ るいは放射線療法の使用の増大が、更に効果的な治療法として含まれる。

近年の進歩にもかかわらず、多くの型の悪性腫瘍の患者は、再発および死亡とい った重大な危機にさらされている。再発後、幾人かの患者は初期の治療法で再び 緩解し得る。しかしながら、初期の化学療法剤を高投与量、あるいは他の薬剤の 使用がしばしば要求され、このことは少なくとも部分的に薬剤耐性へと進展して いることを示している。最近では、薬剤耐性は患者に投与されない薬剤を含む、 いくつかの薬剤に対して同時に進展し得ることを証拠づけている。多剤耐性（ｍ ａｒ）の腫瘍の生育したものは、腫瘍塊の機能を有し得、治療弊害の大きな原因 を作るものである。このような薬剤耐性を克服するために、放射線あるいは非放 射線高投与量化学療法、および同種あるいは自己骨髄移植が用いられる。この高 投与量化学療法は最初の薬剤を用いるか、あるいは薬剤を追加するように変えら れる。この治療法の可能性は、造血腫瘍および膿瘍塊で証明された。ｍａｒ表現 型を有する新しい非交叉耐性薬剤の開発には、前に治療を受けた巴者に対して、 現在の治療法を治癒可能なものとし、治療介入を促進することが要求される。

近年、本明細書中に参考として援用されている、Ｋｅｌｎｅｒ。

Ｍ、ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４７：３１８６　（１９Ｂ？）では、イル− ジン（１ｌｌｕｄｉｎ）と呼ばれる新しいクラスの天然物のインビトロにおける 抗腫瘍活性が検査された。イル−ジンＳおよびイル−ジンＭは、既存のイル−ジ ン類の中の二つの型である。イル−ジンは、他の化学療法剤とは全く異なる化学 構造を有する。イル−ジン化合物は、以前に精製されていて、国立癌研究所の癌 治療ｇ門（ＮＣＩ　ＤＣＴ）のインビボの薬剤スクリーニングプログラムに付託 し、評価されたが、ＭＣＩ研究に従った他の実験腫瘍系では治療係数は低かった 。イル−ジンの毒性が非常に強いため、ヒトの腫瘍療法への如何なる使用も妨げ られた。

従って、腫瘍、特にｍａｒ腫瘍に対して毒性があり、そしてインビボの治療に有 効である適当な治療係数を有する化学療法剤が必要になる。本発明はこの必要性 を充足し、そして関連する利点を提供する。

良肌立翌１ 患者における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法は、腫瘍を下記の構造を有するイル −ジンＳあるいはイル−ジンＭのアナログの治療量と接触させる工程により、提 供される：ここで、該アナログは、患者へ毒性を過度に与えることな（腫瘍細胞 の増殖を阻害し得る。ここで、Ｒ，＝アルキルあるいは水素であり、 Ｒ２：アルキルであり、および、 Ｒ３＝アルコールあるいはエステルである。

Ｍユ１星ユ五班 図１は、胸部腫瘍および骨髄性白血病細胞のイル−ジンＳに対する感受性の、他 の腫瘍との比較を示す。

図２は、イル−ジンＳの活性部位を示す。

図３は、酸中で短期間作用する中間体の存在を証明する、ＮＭＩＩＩスペクトル を示す。シグナルＡは、５員環（イル−ジンＭ）の二重結合の水素にもとづく。

シグナルＢは、シクロプロパンが開環して短期間存在する中間体の水素原子にも とづく（しかし、二重結合が反応する前）。Ｃのシグナルは、二重結合が反応し た時に生じる生成物にもとづく。やがて、イル−ジンＭからのシグナルのピーク は消失し、Ｃのピークは強いシグナルになる。シグナルＢはシグナルＡと同時に 消失することから、イル−ジンＭから発生する短期間に存在する中間体であるこ とが確認される。

図４は、無胸腺マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）のＭｏ１ｔ−４腫瘍の増殖に対するイル −ジンＳの効果を示す。

図５は、腫瘍の増殖に対するデヒドロイル−ジンＭの効果を示す。

図６は、デヒドロイル−ジンＭへのＨＬ６０／ＭＲＩ異種移植片の反応を示す。

図７は、比較的感受性のＦＩＬ６０細胞、および耐性のＢ細胞を用いたイル−ジ ンＳの取り込みを示す。

図８は、ＨＬ６０細胞によるイル−ジンＳの急速な細胞内蓄積が高濃度に飽和さ れたことを示す。

図９は、Ｍｉｃｈａｅｌ　ｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎの飽和定数に従って濃度を変化さ せて、ＨＬ６０細胞によるイル−ジンＳの初期の取り込みを分析したものである 。

Ｒ朋コと１用」己１阻 患者における１１瘍細胞の増殖を阻害する方法は、該腫瘍を、下記の構造を有す るイル−ジンＳあるいはイル−ジンＭのアナログの治療量と接触させる工程を包 含して、提供される。

ここで、該アナログは患者に対して毒性を過度に作用させることな（、腫瘍細胞 の増殖を阻害し得る。ここで、Ｒ３・アルキルあるいは水素であり、 Ｒ２＝アルキルであり、および Ｒ３＝アルコールあるいはエステルである。

該アナログは、記載された構造を有する化合物であり得る。

有効な二つのアナログの例は、下記のとおりである：患者における膿瘍細胞の増 殖を阻害する方法はまた、該腫瘍をイル−ジンＳあるいはイル−ジンＭのアナロ グの治療量と接触させる工程を包含して提供される：ここで、該アナログは患者 に対して毒性を過度に与えることな（、腫瘍細胞の増殖を阻害し得る。ここで、 Ｒ，＝アルキル、アルコキシルあるいは水素であり；Ｒ２冨アルキルであり；お よび Ｒ３＝アルコールあるいはエステルである。

該アナログは、記載した構造を有する化合物のいずれかである。有効なアナログ の２つの例は、下記のとおりである。

「阻害する」とは、処置なしで生じる速度から腫瘍細胞の増殖速度を減退させる か、あるいは膿瘍細胞塊の大きさを減少させることを意味する。「阻害する」は また、完全な腫瘍の緩解を含む。このように、アナログは、腫瘍細胞に対して細 胞増殖抑制性あるいは細胞毒性のいずれかであり得る。

患者は、腫瘍を有する任意の動物であり得る。該アナログは、インビボでのヒト 腫瘍に対して、およびインビトロでのヒトＩｌｌ瘍細胞株に対して有効である。

該腫瘍は、当該分野では周知である多くの有効な方法によってアナログと接触さ せられ得る。該患者への投与経路は、静脈内、経口、腹腔内、および口腔および 鼻腔からの吸入を含み得る。好ましい投与経路は、患者および発生した腫瘍の型 に依存する。

出願人は、イル−ジンＳおよびイル−ノンＭのアナログを作り得、これは、イル −ジンＳおよびイル−ジンＭよりも毒性は弱いが、インビボではより有効な化学 療法剤であるという、驚異的な発明をなし得た。上述したように、イル−ジンＳ およびイル−ジンＭは毒性が非常に強いために低い治療係数を有する。従ってヒ トに対しては治療上は用い得ない。出願人は、イル−ノンＳおよびイル−ジンＭ を種々に改変することで請求核試薬がこの化合物に反応することを阻害すること を発見した。このことは、シクロプロパン環が容易に開環せず、高い治療係数は 維持したまま、インビボでの化合物の毒性を軽減している。

アナログの核反応性には影響を及ぼさない限定領域の種々のＲ基は、いろいろな 種類の置換基であり得る。このように、出願人が記載したいろいろなＲ基は広く 解釈されて、例えばアルキルには、アルキル基に結合した任意の構造、すなわち アルキルフルペンが含まれる。

アナログの治療上有効な量は患者によって変化する。しかしながら、イル−ジン Ｓおよびイル−ジンＭより毒性が軽減されたことによって、アナログは比較的高 い投与量で投与され得ることがわかった。腹腔的投与の場合には、体重１ｋｇ当 り３００から６０．０００あるいは１．２００．０００μｇが有効であるのに対 して、静脈内投与では３０から１０００μｇの治療量が特に有効であることがわ かった。当該分野では認識されているが、この治療量は投与方法により一様であ り得ない。さらに、アナログが毒性物質と結合していると治療量も変わり得る。

アナログは、腫瘍関連抗原に結合した複合体を形成するための試薬に結合し得る 。このような方法は当該分野では周知であり、試薬をアナログに結合させるリン カ−を含有し得る。

このような結合は、例えば共有結合のような、なんらかの化学結合を含有し得る 。薬剤は、腫瘍細胞の腫瘍関連抗原、あるいは腫瘍細胞領域に特異的に結合する 任意の薬剤であり得る。このような薬剤は典型的には、抗体であり、ポリクロー ナルかあるいはモノクローナルのいずれかである。次に、これらの複合体は治癒 に用い得る。本発明の方法は任意の腫瘍細胞に対して実行され得るが、特に骨髄 性白血病、類表皮白血病、Ｔ−細胞白血病の腫瘍細胞、および肺癌、卵巣癌、お よび胸部癌に対して有効である。

さらに、次の構造を有する化合物も開示される。

ここで、Ｒ−メチルあるいは水酸基であり；そして、ＲＩ％　Ｒ２およびＲ３＝ メチルあるいはアルキルである。

さらに、次の構造を有する化合物も開示される。

ここで、Ｒ＝Ｈあるいはメチルであり；そして、ＲＩ、Ｒ２およびＲ３＝メチル あるいはアルキルである。

Ｋ里！口。

デヒドロイル−ジンＭのム 乾燥ジクロロメタン（６０ｍｌ）中のイル−ジンＭ　（２００ｍｇ）とピリジニ ウムジクロメート（１ｇ）との混合物を、ゴム隔壁の付いたフラスコ内申で室温 で攪拌した。２０時間後、反応混合物をジエチルエーテル（２０ｉＬ）で希釈し 、短いシリカゲルカラムで濾過した。カラムを更に、ジエチルエーテルで溶出し 、集めた濾過物を濃縮１−１残査を、溶出剤としてヘキサン−酢酸エチル（１０ ：１）を用いて、シリカゲル上にクロマトグラフした。所望の化合物をクロマト グラフィーの初期のフラクションに得た。６４−６５’Ｃで融解する白色の結晶 物質を１４０ｍｇの収量で得た。この化合物に対してＮＭＲスペクトルデータを 記録した。

寒１■ＬＬ 二上ご」」と［戊 イル−シフＳ（５０ｍｇ）を水（２ｍＬ）で溶解し、３Ｎ塩酸（２ｍＬ）をこの 溶液に加えた。得られた溶液は直ちに濁り（３０分以内）、黄色の沈澱物を生成 した。混合物を冷凍庫に一装置いた；次にクロロホルム（１０ｉＬ）で抽出した 。黄色いクロロホルム溶液を乾燥（ＭｇＳＱ４）　Ｌ、そして溶媒を減圧下で除 去し、オレンジ−黄色のゴムを得た。この物質を、溶媒としてヘキサン：酢酸エ チル（６：Ｌ）を用いてシリカゲル上でクロマトグラフし、フルペン（２０＋ｎ ｇ）およびビスフルベン（１０ｍｇ）を得た。

これらの化合物に対してＮＭＲスペクトルデータを記録した。

あるいは、フルベンの全合成を次の方法でも得られる：σＨＰ−テトラｃｙ口ご ）ユ一り 示されているように既知の１．１−ジアセチルシクロプロバンとシクロペンタジ ェン誘導体のジアニオンとの反応により、ジオールが得られる。このジオールを 酸でおだやかに処置し、第二級水酸基を酸化して、ジオールケトンを得る。第三 級水酸基を選択的に除去して所望のフルペンを得る。

１皿皿主 立乙竺二三二二旦叉 細胞毒性効果を評価するために、種々のａ　ｒＸのイル−ジンを細胞培養物に４ ８時間加えて、次に細胞の増殖／生存率をトリパンブルー排除試験で測定した。

４８時間連続暴露研究の代わりとして、細胞を９６ウエルプレートの液体培地に 蒔いて、種々の濃度のイル−ジンに２時間曝して、［３）１１−チミジンを１時 間から２時間パルスし、ガラスフィルター上に収めた。フィルターペーパーをシ ンチレーション流体の入ったバイアルに加え、残りの放射能をβ（シンチレーシ ョン）カウンターで測定した。

イル−ジンＳに対する他の腫瘍塊の細胞株の感受性をスクリーニングすると、胸 部細胞株、ＭＣＦ−７は非常に感受性が高かった（図１）。我々の研究室で維持 している他の胸部細胞株、ＭＤＡ−２３１もまた、イル−ジンＳに対して非常に 感受性が高いことがわかった（図１）。

デヒドロイル−ジンＭを用いた研究では、さらにこのアナログの、骨髄性白血球 細胞および胸部腫瘍株、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−２３１への選択的毒性が示さ れたく表１）。

（以下余白） 表１＝毒素（Ｎ−３）に２時間暴露後、チミジンの阻害によって証明されたイル −ジンＳおよびデヒドロイル−ジンＭの組織特異的細胞毒性。

ＩＣ５９（ｎＭ／Ｌ） ±主車　イル−ジンＳ　デヒドロイル−ジンＭＨＬ６０、骨髄性　７±　１２４ ６±　１９８３９２、Ｂ−細胞　２３６　±　３１　＞　３８，０００８４０２ 、Ｔ−細胞　６６９　±　１９６　＞　３８，０００２４２、メラノーマ　６０ ７±７０　＞　３８，０００５４７、卵巣　６０７±　１１０　＞　３８，００ ０ＳＬ−２、ネズミ（胸腺）１４２±１５　５．２３５±２７７ＭＣＦ−７、胸 部　５８±５６５３±６５ＭＤＡ−２３１胸部　２．０±０．２　１１２±　１ ７従来の研究では、ＣＥＭ　ｍｄｒ変異体はイル−ジンＳに対して耐性がないこ とを示したので、他のｎ＋ｄｒ細胞型細胞−て、イル−ジンＳおよびデヒドロイ ル−ジンＭに対する感受性を研究した。

これらのｍａｒ娘細胞株では、通常用いられている多重化学療法剤に対する耐性 が２００から８００倍増加したことが証明されたが、イル−ジンＳあるいはデヒ ドロイル−ジンＭに対しては耐性がないことが示された（表２）。従って、ｇｐ １７０タンパク質と関連する、あるいは関連しないｍａｒ細胞は依然としてイル −ジンの毒性に対して感受性であった。これらの研究は、イル−ジンの新規な構 造が、多重薬剤に抵抗性のある造血細胞株に非交叉性耐性を与えることを示して いる。イル−ジンの誘導体、デヒドロイル−ジンＭは、親イルージン化合物より もあまり効果がないが、結果（表２）は、この化合物に対する種々のｒｅｄｒ細 胞株の交叉耐性がないことを示している。

Ｌ１２１０、不ズミ骨Ｕ　ＣＦＵ−ｇｍおよびＣ１４９８（ＡＭＬ細胞株）に対 するイル−ジンＳおよびデヒドロイル−ジンＭの効果を研究した。

イル−ジンＳは、今までこのアッセイで試験した薬剤の中で最も効果があった。

そしてＬ１２１０およびＡＭＬ白血球株およびＣＦＵ−ｇｍのゾーンに今までに 注目されていたのとは異なる最も大きな効果を示した（表３）。この誘導体、デ ヒドロイル−ジンＭは毒性が低く、ＡＭＬ株に対して非常に選択的であった。こ の化合物は、ＣＦＵ−ｇｍ細胞に対して効果がない濃度でＡＭＬのコロニーの形 成を阻害した（表４）。

（以下余白） 表２：それぞれのＭｄｒ株のイル−ジノＳに対する感受性ＬＡＭＤＲ１皇！　イ ル−ツノＳ　デヒドロイル−ツノーＣＥＩＩ変興体　ＩＩ　８３±　２，６　な しマ１１−１　１６．２±　６４　なし マＬＢ１００（ｇｐ１７０＋）　３．７　ｆ　Ｏ，７なしＤｏｔ（ｔｐ１７０＋ ）　＋４ ＭＤＡ−２３１（胸部）　ＩＩ　０１ｓｔｈ０．２ｆｆ　５４ｆ　フト１（ｇｐ １７０＋）　ｏ、ｇｓ　ｆ　Ｏ，３８５Ｂ±Ｉ＋４１ｃＦ７−ｖｔ（胸部１　１ 　０．Ｈｆ　Ｏ，＋１　９２ｆ　ｌ５ＡＤＲ（ＧＳＩＩ−）ニア２７ｚラーｔ’ １　３．７　±　０４　６８ｆ：　１ｓ１１Ｌ−６０親　３１　±　１．１　１ ６３　±　１１ＡＩ＋１＋１９１５０４）　１．９　ｆ　Ｏ，８１９１ｆ　４４ ＩＢＫ具体　ＩＩ　Ｏ，５８ｔ　Ｏ，＋２　１２５　＋　１４ｃｍ１（ｚｐ＋７ ０４）　０．６９　＋　０．１５　８０　＋　１８ＶＢＬ（１ｐ１７Ｇ＋）　０ ．６９　±　０．１１　７８　±　１９Ｌ１２１０　ｇ　０．４２１　Ｇ、ｌ） ８　６２　±　６１１１ＤＰｔ（／スブｆチ／ｌ　Ｏ，４６ｆ　Ｇ、ＩＺ　ＩＩ ｇｆ　３９ＢＣＮＩＩ　Ｏ，５８ｆ　Ｏ，０１１１００＋　３１ＰＡＭ（ｅｅｌ ｐｈａｌａｎ）　０．６２　±　０．１５　７３　±　３１ＣＰＡ（ｅｙｃｌｏ ｐｈｏｇ）　０．４６土　０．１２　３８±１５表３ニイルージンＳによる生育 阻害 ２．５０　５００　２４０　３０ １．２５　４００　７０　０ ０．６３　３２０　３０　０ 表４ニイル−ジンのコロニー形成に対する効果イル−；　７Ｓ　ｌ／１．０００ 　８５０　４００　＞　１０００１／４．０００　６００　２００　８００１／ １６．０００　５５０　０　５５０１／６４．０００　３００　０　２５０デヒ ドロイル−ノアＭ　ｌ／２５　４００　２００　＞　１０００１／ｌ　２５　（ 繰り返し＞３００　５０　Ｔｏ。

ｌ／６２５　ｔｏｏ　Ｏ４００ 叉１１１土 匡Ａ」１１１式 構造研究は、イル−ノンの誘導体を合成し、それらの）ＩＬ６０白血球細胞に対 するインビトロでの毒性を検査して行った（表５）。この研究では、イル−ジン の毒性に対する３個の重大な部位を同定した。これらにはシクロプロパン環（ｉ 位Ａ）、α／β不飽和結合部位（部位Ｂ）、および７−ケトン基（部位Ｃ）か含 まれる（図２）。これらの部位の全てを変化させると、毒性は対数で４まで減少 した。これとは対照的に、環状でない第一級水酸基（図２、部位Ｄンは毒性には 影響しなかった。種々の大きさの化学基が毒性を変化させることなく、この部位 に結合され得る。毒性で顕著な減少を有する多くの誘導体（イル−ジンＳあるい はイル−ジンＭに比較して）は、通常用いられる化学治療剤、例えばＢＣＮＵあ るいはシスプラチンよりもまだ、より効果がある（表５）。

（以下余白） 表５　：　ＨＬ−６０細胞における種々のイル−ジン誘導体のＩｃ５８の他の薬 剤との比較 良會惣　叱 イルーノンＳあるいはＭ　１゜ ジヒドロイル−ジンＳあるいはＭ　１００．０００アンルブルペン　５００ デヒドロイル−ジンＭ（ジケトン）４６インイル一ジンＭ　３，８００ ブタキロサイド（Ｐｔａｑｕｉｌｏｓｉｄｅ）　７．７００プテロンンＣ（Ｐｔ ｅｒｏｓｉｎ）　１２，５００２、５．６．７−チトラメチルインデノン　４７ ５イル−ジンドアレート３８ ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、アフィドコリン　２．１００（Ａｐｈｉｄｏｃｏｌ ｉｎ） アルキル化剤：ＢＣＮＵ　２３．３００架橋剤、シスプラチン　１７，０００ アルキル化剤：ＭＮＮＧ　ｔｓ、ｏｏ。

タンパク賃合成阻害剤：リシン　０．２実施例５ 構造機゛１研究・化学的 イル−ジノＭは、容易に、細胞培養の研究では１．０００倍以上毒性が低い、安 定な芳香族化合物に変換される（希塩酸で処置すると）。塩素−炭素結合の形成 、／クロプロパン環の開裂および第３級水酸基（水として）の除去は同時に発生 する。

この中間生成物は反応混合物のＮＭＲスペクトルで検出し得る（図３）。しかし ながら、この中間体は反応性が高く、第二の核分子、すなわち水によって直ちに フェノールとなる。従って、酸性条件下ではイルー／ノＭは明かに官能性である 。

上述の研究は、イル−ジンの毒性は第三級水酸基を容易に除去して／クロプロパ ノ環を開裂し得ることを示している。

イル−ジノの毒性は、イル−ノン分子中の電子共鳴（あるいは非局在化）に対し て、／クロプロパノ基（部位Ａ、図２）、二つの二重結合（共役ツエン）（部位 Ｂ）、および７−ケトン（部位Ｃ）の組み合わされたＡｈ果に依存することがわ かった。

５員環中の第三級３−水酸基を酸化してケトンにすることは、分子内で更に電子 を非局在化させることによって分子の潜在力、あるいは選択力を替えると仮定さ れた。あたらしいケトン基は「エレクトロ／の／ツク、′として作用し、その結 果、ノクロブロバンのＣ−Ｃ結合の電子は、第三級水酸基を有する炭素原子上よ りはむＬろ、ケトンに列して非局在化する。これは、炭素−酸素結合をこわして 形成される初期のカルボカチオンは、イル−ジノＭの場合と同様に安定でないこ とを示している。従って、炭素−酸素結合をこわすことはあまり好ましいもので はなく、反応性が低下する。デヒドロイル−ジンＭと呼ハレる、このケトン誘導 体を合成したが、イル−ジンＳあるいはイル−ツノＭよりもインビトロではＨＬ −６０細胞に対しては毒性が低かった（表４）。上述したように、デヒドロイル −ジンＭの毒性は、イノビトロでは骨髄性腫瘍細胞および胸部腫瘍細胞に対して かなり選択的であるように思われたく図１および表１）。

イル−ノアＭおよびデヒドロイル−ジンＭの希塩酸との反応速度論の結果は上述 の仮設と一致している。希塩酸では、イル−シンＩＣ；！偽−次反応をｔ６　（ ｋ　・４．７　Ｘ　１０−３／分、ｔｌ／２　＝１４８分）。デヒドロイル−ジ ンＭはまた一次速度論を証明したが、コノ反応はかなり遅かった（ｋ　＝　２　 Ｘ　ｔｏ−’／分、ｔｌ／２　＝２７６５分）。このデヒドロイル−ジンＭとの 反応では、中間体はＮＭＲスペクトルによって検出されなかった。おそらく、検 出するにはかなり反応か遅（、そして短期間しか存在していなかったためである 。デヒドロイル−ジノＭによって示された反応性の低下は次のことを示している 。すなわち請求核分子との反応はかなり選択的であり、従って、イル−ジンＭと 比較すると毒性か低い。

イル−ツノとの犬吠に存在する核性分子であるグルタチオノとの反応についてさ らに研究された。ｐＨ３からｐＨ９までの広Ｂ囲のｐＨで、グルタチオノは自炊 にイル−ジンＭ、イル−ジノＳ５　あるいはデヒドロイルー／）Ｍと反応し、イ ル−ジンＭと塩酸との反応生成物と類似する生成物を生じる。この反２速度は、 ｐＨ６，１から７０が最適であり、このことは、この反応が細胞内で起こり得る ことを示している。

イル−ジンの胸部細泡呻瘍株ＭＣＦ７−ｗｔおよびそのＭＤＲ耐性の娘細胞様Ｍ ＣＦ／Ａｄｒに対する毒性を次に研究した。ｇｐ１７０陰性の娘細胞様はグルタ チオノトランスフェラーゼに５いテ５０倍増の薬剤１ｔＩ性であり、このことは 通常用いられている化学療法剤に対して２００から８００倍の感受性の減少を生 じる。この細抱株はまた、グルタチオノ量が４１（＠減少している。この娘細胞 はイル−ノンＳに対する感受性が４２倍減少していた（親のＩｃ５Ｂは０．８８ ｒ＋ｍｏｌｅｓ／１　；娘細胞様は３．７０ｎａｎｏｍｏｌｅｓ／ｌ）が、他の 薬剤では２００から８００倍であった。グルタチオントランスフェラーゼを阻害 するイル−ノンの能力に関する速度論的研究は、酵素活性の直接阻害がないこと を示していた。これらの所見は、イル−ジンの毒性が細胞内グルタチオン量に逆 比例するが、グルタチオ／トランスフェラーゼ活性とは比例することを示してい る。

支三五旦 動物を用いた研究 本明細書中では参考として組み込まれている、Ｌｅｏｎａｒｄ、　ＪＥら、Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４７：２１１９９−０２　（１９８７）およびＤｉｌｌｉａ ｎ、　Ｒ，０ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４５：５６３２−３６　（１９８５ ）に開示されている方法を用いて、Ｍｏ１ｔ−４（ヒトＴ−細胞白血球）の異種 移植片を４週令の無胸腺Ｂａ１ｂ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウスに樹立させた。毎週３ 回全身に放射線を＝　１１しだ後（６００ｃＧｙ）、放射線を照射した（　６０ ００　ｃＧｙ）ＨＴ−１０８０家畜都胞と一緒にＭＩＯｔ−４細胞をマウスの牌 腹に皮下注射した。これらの細胞を確保するために放射線を照射したＩＴ−１０ ８０家畜細胞のみを投与した２匹の動物は、腫瘍を形成しなかった。Ｍｏ１ｔ− ４の腫瘍の発育を観察するために動物をモニターシ１こ。そして、腫瘍が触知可 能になったとき（５ヨから７ＥＩて約４Ｘ４画）、マウスを前述のようにランタ ムに一部５匹に分けた。コントロールマウスには生理食塩水を腹腔内投与し、処 置マウスには３ＱＯμｇ／ｋｇあるいは３０μｇ／ｋｇのイル−ジンＳのいずれ か、あるいは３０μｇ／ｋｇのデヒドロイル−ジンＭを毎週２回腹腔内（ＩＰ） 投与した。イル−ジンＳを投与したマウスには、腫瘍の増殖の遅延が見られた（ 図４）。

これとは対、照的に、低投与量の３０μｇ／ｋｇのデヒドロイル−ジンＭを投与 したヌードマウスでは（後に、毎週２回の１０００μｇ／−のＩＰでは、この化 合物はマウスに対して毒性がないことがわかった）、５個中３個の腫瘍が完全に 緩解したが、２個の腫瘍は応答しなかった（図５）。２個は明かに耐性腫瘍であ ったので、イノビトロでイル−ジンＳおよびデヒドロイル−シフＭに対する耐性 を試験した。いずれの化合物にも耐性は見られなかった。この２個の完全な耐性 腫瘍は１２週間にわたって、腫瘍の緩解がみられなかった。

起源の異なる無胸腺ヌードマウスを用いて、これらの実験を繰り返した。この実 験では、イル−ジンの腫瘍の増殖に対する効果はほとんど見られなかった。Ｍｏ １ｔ−４の異種移植片に対する応答の変化の理由としてはおそらく、低投与量の デヒドロイル−ジンＭ、グルタチオン代謝の動物的変化、あるいは薬剤分布が関 係している。

次に、デヒドロイル−ジンＭの有効性を、マウスの５Ｌ−２細胞を用いて同系モ デルにおいてスクリーニングした。５Ｌ−２白血球、／リンパ球細胞を皮内注射 し、そしてリンパ節、肺臓、および肺に転移させた。そして、このモデルの薬剤 の有効性を生存期間（ＩＬｓ）の増加で判定した。５Ｌ−２細胞を動物当り２． ５百万細胞投与した。そして腫瘍が触知可能になるまで、治療を７日間延ばした 。これは樹立した腫瘍に対する相対的なストリン／エンドテストであり、そして 通常０５百万細胞しか使用しないで、３回目に薬剤治療を開始する５Ｌ−２モデ ルにおける通常の薬剤スクリーニング法とは対照的である。デヒドロイル−ジン Ｍは、１週間に２回の３０ｍｇ／ｋｇのＩＰではＩＬＳが５％、そして１週間に ２回の６ｏｍｇ／ｋｇのＩＰではＩＬｓが１８％と、はとんど効果が見られなか った。０．０３ｍｇ／ｋｇを１週間に２回静脈内（ＩＶ）投与すると、ＩＬｓは ３８％に増加した。これは薬剤が肝臓で代謝され、ＩＶ投与によってより有効と なり得ることを示唆している。

これらの一連のイノビボ実験を通して、イル−ジノの組織特異性は、１舌発なエ ネルギー依存性ポツプの存在によることがイノビトロ実験から明瞭になった。５ Ｌ−２およびＭｏ１ｔ−４細胞を調へたことろ、このような取り込みの機構は存 在しないことかわかった。従って、本研究を骨髄系統の細胞を用いる異種移植片 モデルに向は直した。

Ｄｒ、　Ｔｈｅｏｄｏｒｅ　Ｂｒｉｇｈｔｍａｎ　（ＮＣＩ）は、放射線を用い ずにヌードマウスに異種移植片としてヒｌ−ＨＬ−６０細胞を増殖し得た。ＨＬ −６０ＭＲＩと呼ばれるこの細胞は、エネルギー依存性の取り込みポンプを有す ることが確認されたが、このことは親細胞がポンプを有するので予期された所見 であった。デヒドロイル−ジンＭを１週間に２回のスケジュールでＩＰ投与する と、投与量に相関して腫瘍の阻害か誘導された（図６）。デヒドロイル−ノンＭ のＩＰ投与によるＭＴＤは、１週間に２回のＩＰ投与スケジュールに基づくこれ らの研究で得られた。同様の腫瘍の緩解はデヒドロイル−ジンＭのＩＶで見られ た。

あわせて、デヒドロイル−ジンＭのインビボの効果を更に調べた。最初に、Ｌ１ ２１０細胞に対して調べた。５日間毎日２．５ｍｇ／−をＩＰ投与したところ、 ＩＬｓはわずか９％であった。次にデヒドロイル−シフＭを２４時間点？ａ投与 したところ（５，０ｍｇ／ｋｇ）　；　ＩＬＳは１１％であった。ヒト骨髄性細 胞においてエネルギー依存性の取り込みの存在が明かになったので、デヒドロイ ル−ジンＭについて、Ｃ１４９８細胞を用いて同系のＡＭＬマウスモデルに対す るインビボの有効性をスクリーニングした。イル−ジンＳの２５　ｍｇ　／　ｋ ｇの単回［Ｐ投与では、ＩＬｓは３５％であった。同一投与量を用いて２回目の 投与、５日間毎日のＩＰ投与により、ＩＬｓは４４％であった。マウスは体重減 少あるいは摂餌量５．・′摂水量が減少することなく、４週間にわたって１週間 に２回のスケジュールで３０　ｍｇ　／　′ＫｇのＩＰあるいはｉｍｇ／ｋｇの ＩＶ（尾静脈内）を許容し得るので、投与量と治療スケｉュールの両方を最も効 果的になし得失１日１Ｌ アフルフルベンおよびデヒドロイル−ジンＭを　いたＨＬ６０ＭＲヒ；’＋７． ９目（訣 ３０匹のマウスの肩に、５００．０００　ＨＬ６０／ＭＲＩ細胞（ヒト骨髄白血 球腫瘍細１ｔａ）を皮下注射した。治療は直後ではなく、投与１１１回目開始し た。治療の開始を引き延ばして、化合物が有効かどうかを決定するストリン／エ ンドテストである。治療を引き延ばすことによって、腫瘍細胞が堅固に樹立する 。

マウスを１群各５匹からなる計６群に分けた。１群はコントロール群とし、これ らのマウスには偽薬すなわち薬剤の希釈に用いた溶液を投与した。他の群には下 記の化合物および投与量を投与した：デヒドロイルージノＭ化合物を１．０ｍｇ ／ｋｇ。

デヒドロイル−ジンＭを３．０ｍｇ／ｋｇ、アンルフルペンを０．３ｍｇ／ｋｇ 、アンルフルペンをｌ　、　Ｏｍｇ　／　ｋｇ　、アンルフルペンを３．０Ｉｒ Ｉｇ／ｋｇ０全動物には偽薬あるいは薬剤を尾静脈内注射した。偽薬あるいは薬 剤は１週間に２回のスケジュールで投与した。

結果を添付の表６にまとめている。デヒドロイル−ジンＭおよびア／ルフルベン 化合物は両方とも腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効であり、投与量依存性の阻 害が証明されたく薬剤を多く投与すればするほど、腫瘍の増殖は小さくなる）。

どちらの薬剤も、最高量を投与した動物には、摂餌量／摂水量の減少、統計学的 に有意な体重減少などの明白な有害影響は見られなかった。これらの結果は、ど ちらの薬剤も高投与量を投与し得ることを示している。また、薬剤は１日１回を 基本とする、より有効な投与盟スケノニールに基づいて投与し得ることを示して いる。

表１ まとめ：　ＨＬ６０／ＭＲ＋実験、静脈内−＃ｌＮｏ　Ｄｒｕｇ　９９土）６　 ８４５±２８２　３２９９±１０８０　１０１６２±４１２３１６７４７士５０ ６１１　ｒａｑ／ｋｑ　５８土３２　５ｇ２土２９７　９６４±６８５　２３２ １”１４コ４　６２７５：２８６５コ　誼ｑ／ｋｑ　コ８まコＯコロ９±２５０ 　ココ６ま２１５　４コフ土２コ８　１２０１士５０１案」１号」− −９的なインビトロスクリーニング　法および細胞の取り久旦旦Ｚ イル−ノンの作用Ｒ構および組織特異性に関する前述の実施例での提案およびわ れわれの集中研究の続行で、他の骨髄白血球細胞株を用いてイル−ジンの急速な 取り込みをスクリーニングし得る（　ＫＧＩ、ＫＧｌａ、　ＨＥＬ、　Ｋ５６２ 、ＯＣＩ−ＭＬ、ＡＭＬ−１９３）。

イル−ジン化合物のインビトロスクリーニングの方法は前述の実施例で詳述して いる。細胞株に対する新しいアナログの細胞毒性を、最初に、増殖あるいは半塊 コロニーを形成するアッセイ、およびチミジン取り込みの阻害によって対数で５ の範囲で評価した。初期の研究で、チミジン取り込みがイル−ジンによって選択 的に阻害され、細胞の死と密接に相関することが示されているので、チミジン取 り込みの阻害が用いられる。アナログは、正常な骨髄の起源および種々の白血球 （Ｂ細胞およびＴ細胞）、および腫瘍塊（黒色腫、卵巣）を包含する種々の細胞 株でスクリーニングする。

ＭＤＲ株を含む種々の細胞株に対するデヒドロイル−ジンＭのインビトロの試験 はまた、欠損細胞株および正常骨髄の起源のＤＮＡ修復を成し得る。種々の他の アナログを調製し得る。これらのアナログは既知の活性部位の変化を有するので 、同様に腫瘍を阻害させることが期待される。これらのアナログのスクリーニン グ研究は種々のｍａｒ細胞（交叉耐性を生じないことを保証する）、およびＤＮ Ａ修復欠損細胞株を含宵し得る。

インビトロの試験はまた、他の胸部細胞株の感受性を研究し、これらがまたイル −ジノＳ、デヒドロイル−ジンＭ、およびフルヘンアナログに選択的に感受性で あるかどうかもまた決定し得る。

大１１１１ 腫　細胞におけるイル−ジンの取り　みの評価ヒト骨髄腫瘍細胞はイル−ジンに 感受性であるが、これらの正常な前駆体、顆粒球／マクロファージを形成するユ ニットはイルージンに対数で１５から２０まで相対的に耐性である。

このことは、輸送系がいくつかの正常骨髄細胞を欠いており、安全な治療限界を 提供している。

イル−ジンＳの特異的な取り込みは相対的に感受性のＨＬ６０細胞および耐性の Ｂ細胞を用いてアッセイした。３７℃では、ＨＬ６０骨髄白血球細胞はイル−ジ ノＳの急速な取り込みを証明したが、相対的に感受性でない８３９２　Ｂ細胞は 比較的薬剤の取り込みが少なかった（図７）。Ｂ細胞株におけるイル−ジンの細 胞内蓄積は７時間にわたるゆるやかな直線性であり（ｒ　−０，９８４）、細胞 内濃度はインキュベー７ｇン混合物の濃度に近づいた。

これとは対照的に、１（Ｌ５０細胞は急速に毒素を蓄積し、細胞内蓄積は１時間 以内にプラトーに達した。１０　ｎＭのイル−ジンＳに曝したＨＬ６０細胞は毒 素を１９倍に蓄積したが、Ｂ細胞は毒素を活発に蓄積しなかった。ＨＬ６０細胞 によるイル−ジンＳの急速な細胞内の蓄積は高ａ度で飽和した（図８）。これと は対照的に、８３９２　Ｂ細胞のイルーノ／Ｓの蓄積はａ度依存性のままであっ た。

濃度を変えてＨＬ６０細胞によるイル−ジンＳの最初の取り込みを分析したとこ ろ、イル−ジンＳの流入はＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎの飽和速度論に従 うことを示した（図９）。ＨＬ６０細胞のＶｍａｘは２アビコモルア７分／ｍｇ タノバク質であり、Ｋｍは４２μＭであった。

イル−ジンのＶｍａｘは細胞要求性ビタミン、菓酸のＶｍａｘの５倍でアルタめ 、ＨＬ６０細胞がイル−ジンに対してかなり高い輸送能を有することを示してい る。

冷却下（４°Ｃ）、１％アジ化物、および代謝ブロッカ−１２−デオキシグルツ ースおよびアンチマイジンＡはすべてイル−ジンＳのＨＬ６０細胞への取り込み をブロックするが、非感受性の８３９２Ｂ細胞にはほとんど影響が見られない（ 表７）。これらの研究は、イル−ジンＳが輸送されて、エネルギー依存性輸送系 によってＨＬ６０細胞に蓄積されるが、非感受性のＢ細胞への輸送は拡散によっ てのみ生じることを示している（受動輸送あるいはエネルギー非要求性輸送）。

ＭＣＦ７胸部腫瘍細胞もまた、冷却下による取り込みの阻害を証明した。エネル ギー依存性輸送機構の発見は、骨髄性および胸部腫瘍細胞が短期間暴露でイル− ジンに非常に感受性であるが、Ｂ細胞は感受性でない理由を説明している。

（以下余白） ＨＬ６０骨髄による［３Ｈ］イル−ジンＳの取り込みの８３９２　Ｂ−細胞との 比較 １時間当りの最大取り込み（ピコモル）ａ４庄　ｌ　旺旦　口 ３７°Ｃ７５±　１６ｂ５．５±　１．４　２９±４４’Ｃ４，３±０．９　３ ．４±　１．０　４．０±２．１１％アジ化物　８．７　±　１．４　４．３　 ±　１．３　ＮＴｂ２−テ゛オキシク゛ル］−スおよび　１６．７　±　３．５ 　３．６　±　１．４　ＮＴアンチフィシンＡ 細胞を１時間、１１００ｎ／ａ＋１の［３旧標識イル−ジンＳに曝して、上述の 結果を収めた。結果を平均値上ＳＥで示した。実験を３回行った。

・１０百万細胞につき ｂＮＴ　＝　試験しない 最初に、二硫化炭素中１．２．３−　）リメチルベンゼンおよびメチルマロニル クロライドの溶液を調製して、２時間にわたって三塩化アルミニウムを滴下して 、２．４．６−ドリメチルー１．３−インダニオンを合成した。混合物を２時間 以上還流し、砕いた氷を加え、そしてクロロホルムで３回抽出した。この抽出物 を集めて塩水で洗い、乾燥した。そして、溶媒を除去し、得られた残査をベンゼ ン中１％酢酸エチルを用いたクロマトグラフィーで精製した。溶媒を除去し、昇 華による精製によって所望の生成物を得た。

５０℃で、亜鉛末によって２．４．　Ｓ、　６−テトラメチル−１，３−インダ ニオンを還元して、２．５，６．７−テトラメチル−１−インデノンを調製した 。生成物をベンゼン中１％酢酸エチルを用いたクロマトグラフィーによって精製 し、二つの異性体を得た。主要な異性体を１０％水酸化カリウムで処置し、次に 昇華させて精製した。

化合物は次の構造を有する： デヒドロプテロ／ン０の合成：３−アセトキン−６（β−メトキシ）エチル−２ ，５，７−トリメチル−１−インダノンをテトラヒドロフランおよび１０％水酸 化カリウムに溶解し、そして２時間還流した。

次に、溶液をニーチルで３回抽出し、そして抽出物を集めて、ベンゼン中２％酢 酸エチルを用いてクロマトグラフィーを行い、デヒドロブチロノン０化合物を得 た。化合物は下記構造を有する： Ｒ＝ＨデヒドロブテロジンＯ Ｒ＝　ＣＨ３デヒドロブチロシンＢ 両方の化合物はインビトロでは細胞に対して毒性があり、抗菌性を有する。

本発明はまさに好ましい実施態様に関して記載しているが、種々の改変が本発明 の精神からはずれることなく、なし得ることは理解されるべきである。従って、 本発明は次の請求の範囲によってのみ限定される。

イｌレー；ン　Ｓ　（ｎｇ／ｍ１） ２時Ｍ鴎露　：Ｎ＝４ ＦＩＧ、　２ Ｈ ｉＧ　３ イルーレンＳ　の？ＪＩＪ　（ＪＪＭ）ＦＩＧ、９ 国際調査報告 一１ベゴ肩Ｎガｅ　−刷−ｍ網−−Ｏｎ−８４１Ｗａｌｌ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．患者における腫癌細胞の増殖を阻害する方法であって、該腫瘍を、下記の構 造を有するイルージンＳあるいはイルージンＭのアナログの治療量と接触させる 工程を包含し、▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、該アナログが該患者に対して毒性を過度に与えることなく腫瘍の増殖を 阻害し；そしてここで、Ｒ１がアルキル、アルコキシル、あるいは水素であり、 Ｒ２がアルキルであり、および Ｒ３がアルコールあるいはエステルである；方法。 ２．患者における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、該腫瘍細胞を、下記 の構造を有するイルージンＳあるいはイルージンＭのアナログの治療量と接触さ せる工程を包含し、▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、該アナログが該患者に対して毒性を過度に与えることなく腫瘍の増殖を 阻害し；そしてここで、Ｒ１がアルキル、あるいは水素であり、Ｒ２がアルキル であり、および Ｒ３がアルコール、あるいはエステルである；方法。 ３．前記化合物が、下記の化合物 ▲数式、化学式、表等があります▼デヒドロイル−ジンＭ▲数式、化学式、表等 があります▼からなる群から選択される、請求項１に記載のいずれかの方法。 ４．前記化合物が、下記の化合物 ▲数式、化学式、表等があります▼フルベン▲数式、化学式、表等があります▼ ビスフルベンからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。 ５．前記治療量が、体重１ｋｇあたり３０と１，２００，０００μｇとの間であ る、請求項１に記載の方法。 ６．前記治療量が、体量１ｋｇあたり３０と６０．０００μｇとの間である、請 求項２に記載の方法。 ７．前記アナログが、静脈内、経口、腹腔内、および吸入から選択される任意の 手段によって投与される、請求項１に記載の方法。 ８．前記アナログが、静脈内、経口、腹腔内、および吸入から選択される任意の 手段によって投与される、請求項２に記載の方法。 ９．下記の構造を有し、 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、該化合物が、腫瘍抗原に結合した複合体を形成する試薬に結合している 、イルージンＳあるいはイルージンＭのアナログ。 １０．下記の構造を有し、 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、該アナログが、腫瘍抗原に結合した複合体を形成する試薬に結合してい る、イルージンＳあるいはイルージンＭのアナログ。 １１．前記試薬が抗体である、請求項９に記載の複合体。 １２．前記試薬が抗体である、請求項１０に記載の複合体。 １３．患者における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、該腫瘍を請求項１ １に記載の複合体と接触させる工程を包含する、方法。 １４．患者における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、該腫瘍を請求項１ ２に記載の複合体と接触させる工程を包含する、方法。 １５．請求項１に記載の化合物の３０から１００ｍｇ、および薬剤的に許容し得 るキャリアーを含有する、治療組成物。 １６．請求項２に記載の化合物の３０から１００ｍｇ、および薬剤的に許容し得 るキャリアーを包含する、治療組成物。 １７．前記腫瘍細胞が、骨髄白血病、類上皮白血病、Ｔ細胞白血病、および、肺 腫瘍、卵巣腫瘍および胸部腫瘍からなる群から選択される、請求項１に記載の方 法。 １８．前記腫瘍細胞が、骨髄白血病、類上皮白血病、Ｔ細胞白血病、および肺胸 部腫瘍からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。 １９．フルベンを合成する方法であって；（１）１．１−ジアセチルシクロプロ パンとシクロペンタジエン誘導体のジアニオンとを反応させて、ジオールを生成 する工程； （２）該ジオールを酸で処置し、第二級水酸基を酸化して、ジオールケトンを生 成する工程；および（３）第三級水酸基を選択的に除去し、フルベンを生成する 工程； を包含する、方法。 ２０．下記の構造を有し、 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｒ２メチルあるいは水酸基であり、そしてＲ１，Ｒ２，Ｒ３＝メチルあ るいはアルキルである；化合物。 ２１．下記の構造を有し、 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｒ＝Ｈ、あるいはメチルであり、そしてＲ１，Ｒ２，Ｒ３＝メチルある いはアルキルである；化合物。