JPH05503011A - 高特異性分子集成体の促進 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 高特異性分子集成体の促進 米国政府は、国立衛生研究所により与えられた許可ＮｃｔＧＭＩ３２３５の約定 により定められた合理的な期間、この発明に支払い済みのライセンスと、一定の 条件の下で他人にライセンスを許諾するようこの特許権者に要求する権利とを有 する。

この出願は１９８９年１２月１日出願で継続中の米国特許出願０７／４４４゜１ ７９の一部継続出願である１９９０年７月２４日出願の米国特許出願０７１５５ ７．２２７の一部継続出願である。

発明の背景 発明の分野 本発明は、各種の工業、研究及び医療用途に使用される高特異性結合対の会合速 度を促進する方法に関する。これらの対には、酵素／基質、相補ポリヌクレオチ ド及び抗体／抗原の組合せがある。１つの具体的な実施態様において、本発明は 、異種の核リボ核蛋白１１ｒ［ｈｎＲＦＪＰｓ］による核酸ハイブリダイゼーシ ョンの促進に関する。もう１つの具体的な実施態様において、本発明は、カチオ ン性洗剤による核酸ハイブリダイゼーションの促進に関する。

情報の開示 相補核酸間のアニーリングを促進することが報告されている。Ｃｈｒｉｓｔｉａ ｎｓｅｎ。

Ｃ，ａｎｄ　Ｂａｌｄｗｉｏ、　Ｒ，Ｌ、、　１９７７、大腸菌ＤＮＡ結合蛋白 質によるＤＮＡ再結合の触媒（Ｃａｔａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　Ｒｅａｓｓ ｏｃｉａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　ＤＮＡ 　Ｂｉ獅р奄獅■@Ｐｒ ｏｔｅｉｎ）、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１１５＋４４１−４５４；　１ ｌｅｉｎｓｔｏｃｋ、　ＧＪＬ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７８D大腸菌の ｒｅｃ＾蛋白質が触媒するＤＮＡのＡＴＰ依存復元（ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎ ｔ　ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆＤＮＡ　ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｔｈ ｅ　ｒｅｃＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、 　Ｂｉｏｃｈｅｍ奄唐狽窒凵@７６ ：１２６−１３０；　Ｃａｒ、　ＭＪＬ　ａｎｄ　Ｌｅｈｍｎ、　１．え、　１ ９８１．　ＤＮＡの復元：ヒストンの新規な反応（Ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ　 ｏｆ　ＤＮＡ：　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｆｓｔｏｎｅｓ ）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ@Ａｃ１ｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ　９：３８９−３９９；　Ｋｅｅｎｅｒ、　Ｓ、Ｌ、　ａｎｄ 　ＭｃＥｎｔｒｅｅ、　Ｋ、、　１９８４．ｒｅｅＡ蛋白質■G媒 する一本鎖環状ＤＮＡの同種結合（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｐａｉｒｉｎｇ　ｏ ｆ　ｓｉｎｇｌｅ：５ｔｒａｎｄｅｄ　ａｉｒｃｕｌａｒ　ＤＮＡ５　ｃａｔａ ｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｒｅｃＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１Q：６１２７−６１ ３９；及びＢｒｙａｎｔ、　Ｆ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．相補ＤＮＡ鎖 のｒｅｃＡ蛋白質促進復元の動力学モデル（Ｋｉｎｅｔｉｃ　Ｍｏｄｅｌｉｎｇ 　ｏｆ　ｔｈｅ　ＲｅｃＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｒｏｍｏｔｅｄ　Ｒｅｎａｔｕ ｒａｔｉｏ氏@ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ　５ｔｒａｎｄｓ）、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ　２８：１０６２−１０６９゜異種核粒子が知られ、レビューされてい るｏ　Ｄｒｅｙｆｕｓｓ、　Ｇ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍａｒｃｈ　１９８８、 異種核リポ核蛋白質粒子とｍ１ＩＡ形成の経路（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ　 ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｉｂｏｎｕｃＩｅｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　 ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｆ　ｍＲＮＡ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、　 ＴｌＢ５１３F８６−９０及 びＢａｎｄｚｉｕｌｉｓ、　Ｒ，Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．発現レギュ レーターとしてのＲＮＡ結合蛋白質（ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ ｓ　ａｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）、　Ｇｅｎｅ ｓ　＆　Ｄｅ魔■戟A　３：４ ３１−４３７゜ Ａｌコア蛋白質はヘリックスの不安定化に関係がある。Ｗｔｌｌｉａｍｓ、　Ｋ 、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、。

１９８５、　ＵＰＩ子牛胸腺ヘリックス不安定化蛋白質のアミノ酸配列と、マウ スミエローマ由来類似蛋白質との相同性（Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎ ｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＵＰＩ　ｃａｌｆ　ｔｈｙｍｕｓｈｅｌｉｘ−ｄｅｓｔａ ｂｉｌｉｚｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｔｏ 　ａｎ　ａｎａｌｏｇｏｕｓ　ｐｒ盾狽■奄氏@ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ　ｍｙｅｌｏＩＩｌａ）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　８２：５６６６−５６７０゜ラットから`ｌ ｈ＃をコードするｃＤＮＡがクローニングされ、発現されている。Ｃｏｂｉａｎ ｃｈｉ、　Ｆ。

ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　ｃＤＮＡクローニングにより発現された纂歯類ヘ リックスー不安定化蛋白質（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｒｏｄｅｎｔ　Ｈｅｌ ｉｘ−ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｂｙ @ｃＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ　２６１：３５３６−３５４ ３．ヒト細胞内３１Ｑ１−が単離、精製されている。Ｋｕｍａｒ、んｅｔ　ａｌ 、、　１９８６　コア蛋白質ＡＩ及びＡ２の精製とドメイン構造及び−水路ＤＮ Ａ−結合蛋白質に対する関係（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＤｏＩＩａ ｉｎ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｃｏｒｅ　ｈｎＲＮＰ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　 Ａｌ　ａｎｄ　Ａ２　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｒｅ１ａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｔｏ@ Ｓｉｎｇｌｅ− ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、　Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６１：１１２６６−１１２７３．@Ｋｕｍａｒら はまた、合成ポリヌクレオチド間の二本鎖形成を媒介するＡｌ　ｈ＃の能力に関 して報告している。

哺乳類Ｍｈ＃の特性は、Ｃｏｂｉａｎｃｈｉ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、　１９８８ ．　ＤＩ乳類異種核リボ核蛋白質複合蛋白質Ａｔ（Ｍａａｏａｌｉａｎ　Ｈｅｔ ｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ 　Ｃｏ撃撃P ｐｌｅｘ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｌ）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｅｍ　２６３： １０６３−１０７１及（ｆｆｉｅｒｒｉｌｌ　Ｂ、ｌｔ　ｅ煤@ａｌ、、　１ ９８８、数種のＲＮＡ−結合蛋白質問に保存されるフェニルアラニンがＡＩ異種 核リボ核蛋白質の核酸−結合ポケットの一部を形成する（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎ ｉｎｅｓ　Ｔｈａｔ　Ａｒｅ　Ｃｏｎ５ｅｒｖｅｄ　ａｍｎｇ　５ｅｖｅｒａｌ 　ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｆｏｒｍ　Ｐａｒｔ　ｏｆ　Ａ 　Ｎｕｃｌｅ奄メ@Ａｃｉｄ− ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｏｃｋｅｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＡＩ　Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏ ｕｓ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉ氏j。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅｒＬ２６３：３３０７−３３１３に記載されている。

発明の要約 本発明は、主結合対による集合体形成をともなうことなく、主結合対の要素の会 合速度定数を促進する方法に関する。この方法は、（ａ）　副結合対の相補要素 を主結合対の要素に結合する工程、この際、副結合対は主結合対のに、より大き なに、を有する、；及びら）これらの要素を、主結合対の要素間で結合が起こる ような条件で溶液中に置（工程を含む。会合速度の増大は好ましくは少なくとも 約１０倍、より好ましくは少なくとも約１００倍である。好ましい主結合対は、 相補ポリヌクレオチド：抗体及び対応する抗原；及び酵素とその基質からなる群 から選択される。副結合対は好ましくは、長鎖アルキル基又は疏水性基を有する ポリペプチドのような疏水性ポリマー、複数のグルタミン酸又はアスパラギン酸 及びリシン又はアルギニン残基を有する酸性及び塩基性ポリマー、核酸及び繰り 返し単位を含む核酸結合性蛋白質のような酸性及び塩基性ポリマーからなる群か ら選択される。相補側結合対の要素は、共有又は非共有（例えば、イオン結合又 は疏水性結合）相互作用により主結合対の要素に結合することができる。

好ましい実施態様において、相補側結合対は逆符号に帯電したポリマーからなり 、主結合対は抗体と対応する抗原からなる。他の実施態様において、相補側結合 対は、異種リボ核蛋白質とＤＮＡ主鎖であり、主結合対は相補ポリヌクレオチド である。他の好ましい実施態様において、主結合対は相補核酸であり、副結合パ ートナ−は核酸主鎖に非共有結合したカチオン性洗剤である。さらに他の好まし い実施態様において、相補側結合対は、複数の正に帯電した基を有するポリペプ チドセグメント及び、負に帯電した基を有するポリペプチドセグメントからなる 。これらのポリペプチドセグメントは、複数のアルギニン、リシン、グルタミン 酸又はアスパラギン酸残基を含んでいてもよい。これらのポリペプチドセグメン トは一般に長さが約１００〜約５００人であり、さらに典型的には約ｌＯ〜約１ ００人である。

本発明はさらに、副結合対の要素に共有結合した主結合対の要素からなる組成物 であり、副結合対の要素が相互に引力を及ぼし、その引力は、主結合対の相補的 要素の単一の結合部位に対して２以上の要素が競合するような距離で主結合対が 相互に及ぼす力よりも大きい。同様の実施態様において、この組成物は、別の副 結合対の要素により改質されていない第二の相補主結合対の要素を引き寄せる機 能を有する副結合対の要素に共有結合した第一の主結合対を有する。この引力は 、その主結合対の要素の天然の又は先注する高い確率の結合部位又はドメインに よるものでありうる。あるいは、この主結合対の要素は、それ自身と、第一の主 結合対の要素に共有結合した副結合対の要素との間に相互引力をはたらかせる単 一電荷のドメイン又は部分を含みうる。これは、両方の主結合対の要素を改質し なければならないことを回避する。副結合対の要素又は要素部位は、主結合対の 会合速度定数より大きい会合速度定数を有することが好ましい。好ましい実施態 様は、複数の正に帯電した基を有するポリペプチドセグメント及び複数の負に帯 電した基を有するポリペプチドセグメントを含む副結合対を包含する。好ましい 主結合対は、抗体とその対応する抗原、酵素とその基質、及び相補ポリヌクレオ チドを含む。

本発明はさらに、主結合対による集合を形成することな（主結合対の要素の会合 速度定数を促進する方法を提供する。この方法は、（ａ）　前記要素を含む水溶 液を、相互に及び／又は結合対の２以上の要素と物理的に結合する能力を有する 多価会合速度エンハンサ−と接触させる工程と、（′ｂ）この結合対を、この結 合対と前記多価会合速度エンハンサ−が会合するような条件でインキュベートす る工程を含む。好ましい実施態様は、主結合対として相補ポリヌクレオチドを、 多価会合速度エンハンサ−としてＡｔ　ｈ＃又はポリリシンを含む。

さらに具体的な実施態様において、本発明はインビトロの核酸ハイブリダイゼー ションアッセイにおいて２つの相補核酸配列間のハイブリダイゼーション速度を 促進する方法を提供する。この方法は、（ａ）　ハイブリダイゼーション反応混 合物中の２つの相補核酸配列を核酸ハイブリダイゼーションが可能な条件でハイ ブリダイズする工程、この際、該反応混合物は核酸：　ｈｎＲＮＰ　／核酸＝ｈ ＃相互作用が可能なカルボキン末端を有する異種核リポ核蛋白質（ｈｎＲＮＰ　 ）を含み、該リボ核蛋白質は、ハイブリダイゼーション速度を、該リボ核蛋白質 が存在しないときのハイブリダイゼーション速度よりも大幅に促進するのに十分 な量で存在し、及・ヒｂ）２つの相補核酸配列のハイブリダイゼーションを検出 する工程、を含む。第２実施態様において、検出される核酸配列のいずれもが、 ポリリボウリジル酸ではないことは任意の条件である。好ましい実施態様におい て、リボ核蛋白質は、ＡＩココア白質又はＵＰＩであることができる。ラットの ような哺乳類のリボ核蛋白質が好ましい。リボ核蛋白質のカルボキシ末端はグリ シンに富んでいることが好ましい。異種リボ核蛋白質の量は、反応混合物中に存 在する核酸の全重量の少なくとも約５倍過剰とすべきである。この核酸は好まし くは２５塩基よりも長（、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。

さらに他の実施態様において、本発明は酵素反応における主結合対の要素の会合 速度定数を促進する方法を提供する。この方法は、（ａ）　ポリマーを前記酵素 に結合する工程、ただし、該ポリマーは基質に高確率で結合し、該ポリマーと基 質は該酵素と基質のに、よりも大きなに、を有しており、（ｂｌ　これらの要素 を主結合対の要素間で結合が可能となるような条件で水溶液中に置く工程、を含 む。好ましい実施態様においてこのポリマーは複数のりシン残基のような複数の 正に帯電した基を含み、該酵素はヌクレアーゼであり、該基質はポリヌクレオチ ドである。好ましいヌクレアーゼには制限エンドヌクレアーゼ及びリボザイムが 含まれる。

他の実施態様において、本発明は、目的の核酸とプローブ核酸を含む高温核酸ハ イブリダイゼーションアッセイを実施する方法を提供する。この方法は、（ａｌ 約４５℃又はそれ以上の温度で、核酸ハイブリダイゼーションが可能な条件で、 ハイブリダイゼーション反応混合物中の２つの相補核酸配列をハイブリダイズす る工程、ただし、この反応混合物は、−水路核酸結合性化合物を含み、該化合物 は、ハイブリダイゼーション速度を、該化合物が存在しない場合の／％＜プリダ イゼーション速度よりも大幅に促進するのに十分な量で存在し、目的の核酸に対 するプローブ核酸の数はＩ・Ｉの比に近づくことはなく、（ｂ）２つの相補核酸 配列のハイブリダイゼーションを検出する工程、を含む。好ましい実施態様にお いてこの化合物は異種リボ核蛋白質であり、高温は好ましくは約６５℃であり、 核酸はＤＮＡである。

本発明はまた、ここに説明した本発明を実施するのに必要な種々の試薬の複数の 区分けを有するキットを提供する。これらには、核酸又は抗体のような主結合対 を有する区画、ハイブリダイゼーション試薬を有する区画、及びグリシンに富ん だカルボキン末端を有する異種核リボ核蛋白質のような副結合対を有する区画を 含むキットがある。このキットがさらに主結合対として核酸を含む場合、その核 酸は酵素や蛍光物質のようなリポータ−でラベルすることができる。

定義 “主結合対の相補要素の単一の結合部位に対して２以上の要素が競合するような 距離で主結合対が相互に及ぼす力よりも大きい相互の引力”とは、請求の範囲記 載の方法を使用するのに必要な引力の最小の大きさを機能的に述べたものである 。実際の力は一般にここに記載した方法により実験的に決定される。

“ＡＩココア白質”とは、真核生物細胞の核においてｈｎＲＮＡと会合すること が発見され、かつ２個の共通核酸結合ドメインとグリシンに富んだのカルボキン 末端から構成される約３４ｋＤの蛋白質を意味する。

“集合体形成”とは、主結合対が結合して、十分に過剰の２種の要素の安定な複 合体になる反応を意味する。一般にこの反応は、自発的に析出するか、濾過又は 遠心分離により除去可能な不溶性粒子の存在により検出される。

“抗体と対応する抗原”とは、抗体及びそれが結合する抗原を意味する。

“会合速度定数”とは、結合対の相補要素が複合体を形成する速度を意味する。

これは、１秒あたり、モルあたり、複合体形成のリットルで測定される。２分子 が会合し１つの複合体を形成する場合、（例えば、Ａ＋Ｂ＜＝＝＝＞ＡＢ）の場 合、形成速度はに、　［ＡＩ［Ｂ］に等しい。［ＡＩは溶液中のＡの濃度、［Ｂ ］は溶液中のＢの濃度、ｋ、は会合速度定数である。かなりの距離においても相 互の引力がほとんどなく、かつ複合体形成が起こる前に複合体形成が要素間の複 数のランダム衝突を平均する場合、会合速度は低い。飄の低い結合要素はファン デルワールス力又は水素結合の形成に依存して複合体形成のエネルギを与える。

要素が相互に引き寄せあって複合体形成の機会を多くする多数の接触をもたらす 場合、高い会合速度が存在する。このような結合要素は静電気相互作用及び疏水 性相互作用に依存する。

“カルボキシ末端２とは、遊離のα−カルボキシ基を有するポリペプチドの半分 を意味する。

“カチオン性洗剤”とは、正に帯電した基と疏水性の基を有する洗剤を意味する 。例としては、セチルピリジニウムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウム クロリド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド及びテトラデシルトリ メチルアンモニウムプロミドが挙げられる。

“相補要素”とは、相互に結合することができる任意の２個の分子を意味し、特 に断らないかぎり、高特異性及び低特異性結合対並びに高確率及び低確率結合対 の両者を含む。

“共有結合”とは、一対の電子を共有する２個の原子間の結合を意味する。

“ＤＮＡ主鎖”とは、一般的に核酸に全体に負の電荷を付与する燐酸基を意味す る。

“ヌクレアーゼとは、核酸のホスホジエステル結合を開裂する酵素を意味する。

この用語はりボザイム及び制限エンドヌクレアーゼを包含する。

“グリシンに富んだ”とは、約２０〜８０％のグリシン残基を含むポリペプチド 又はポリペプチドの領域を意味する。

“疏水性ポリマー”とは、水よりも極性の低い単位を含み、水性環境において他 の疏水性ポリマーと会合する傾向を有するポリマーを意味する。

“実質的に促進するのに十分な量で”とは、ここで説明した方法により実験的に 決定される量を意味し、“実質的に促進“とは、統計的に有意の増加を意味する 。

“多価会合速度エンハンサ−”とは、高い確率で他の多価会合速度エンハンサ− 及び／又は主結合パートナ−に結合できる複数の部位を持つＡｌｔｕ＃ＪＰのよ うなマクロ分子を意味する。これらのマクロ分子も、ここに説明するように、主 結合パートナ−の会合速度を強化ないし増加する。

“負又は正帯電基”とは、カルボキシル、燐酸又はアミン基のような、ポリマー の一部分を意味する。

“核酸配列”とは、ポリマー形態の核酸を意味する。一般的には、これは天然に 存在する５′−３°　リボース燐酸主鎖である。本発明では、天然及び合成ポリ マーの両者を使用することができる。このような合成ポリマーは、天然の５°− ３°結合に、非天然塩基及び変異を含むことがある。配列の大きさは臨界的では ない。一般的にこれらのポリマーは、アッセイにおいてうまく機能し、かつ非目 的物に対して非特異的な結合をしない、十分に特異的なハイブリダイゼーション を行うことができる大きさのものである。好ましくは、これらのポリマーは、約 ２５ヌクレオチドから数ｋｂまでのものである。鏡開の正確な相補性は要求され ない。ハイブリダイゼーション混合物の厳重さくｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）を変え ることにより相互に正確な相補物ではない核酸鎖を使用して満足すべき結果を得 ることができる。

酸性又は塩基性として記載される“ポリマー”は、少なくとも１個のプロトン放 出性（酸性）又はプロトン受容性（塩基性）の基を有する、均−又は少なくとも 約１０％の単位の繰り返し単位の分子を包含する。

“基質に対して高い確率で結合するポリマー”とは、繰り厚し構造を有し、その 各単位が、静電気相互作用及び／又は疏水性相互作用により、低親和力の基質に 独立して結合することができるようなポリマーを意味する。

“ポリペプチドセグメント”とは、ペプチド結合により結合されたアミノ酸鎖を 意味する。

“主結合対”とは、リガンド／レセプターの組合せであって、有意の相互長距離 引力なしに要素が高度に特異的に相互作用し、要素が平均距離をもって離れてい るような濃度で、複数の要素が所定の１つの反対要素に対して競争する場合、任 意の要素が特定の相補要素に結合する確率よりも無作為運動の方が優先するよう な組合せを意味する。

“蛋白質要素”とは、少なくとも７０％のアミノ酸残基を含む結合対パートナ− を意味する。

“逆帯電ポリマー”とは、正及び負イオン力により相互に引き合うことができる ポリマーを意味する。

“リポータ−”とは、結合アッセイにおいてシグナル又はラベルとして働き、物 の存在又は不存在のアッセイを可能とする、検出可能な置換基又は部分を意味す る。これらには酵素ラベル、放射性ラベル及び蛍光ラベルが含まれる。

“残基”とは、アミノ酸残基、例えば、リシン残基を意味する場合、ペプチド鎖 の一部であってもその特定のアミノ酸を包含する。

“剛結合対”とは、リガンド／レセプターの組合せであって、要素が比較的に非 特異的に相互作用し、要素が相互に有意の長距離相互作用を及ぼすような組合せ を意味する。

“−水路核酸結合性化合物”とは、任意の配列の核酸と会合し、剛結合対要素と して働くことができる物質を意味する。これらには、カチオン性洗剤及び−水路 核酸結合蛋白質（ｈ＃）が含まれる。

“固体支持体”とは、結合要素が依然としてその相補パートナ−に結合できるよ うな形で付着できる不溶性物を意味する。

詳細な説明 本発明は、高特異性結合対（主結合対）の２つの要素についての会合速度定数を 大きくする価値のある手段を提供する。結合対の会合速度を大きくする手段は工 業、医学及び研究において非常に重要である。

本発明の目的は、高度に特異的な生物学的結合パートナ−の会合速度を大きくす ることである。主結合パートナ−は、その結合半径を越える距離以上に相互に強 い相互引力を及ぼさないリガンド／レセプター対である。主結合対間の最初の相 互作用は、主として媒体（一般的には緩衝水溶液）中での不規則運動による。

２個の結合パートナ−が十分に接近して強い分子間引力を形成すると、結合が確 実になる。主結合対の例としては、ＤＮＡ／ＤＮＡ相補結合対、酵素／基質結合 対、抗体／抗原結合対及びホルモン／レセプター結合対が挙げられる。

高特異性結合対間の相互作用に対する依存が必要な操作の例としては、（ａｍ酸 ハイブリダイゼーションアッセイ、例えばサザン及びノーザンアッセイ、サブト ラクションハイブリダイゼーション、ポリメラーゼチェーンリアクションアッセ イ、リガーゼ増幅アブセイ、リゲーション媒介検出アッセイ及３Ａａｓｅ保護ア ッセイ、　（ｂｌ　ＥＬＩＺＡアッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、ウ ェスタンプロット、及び癌化学療法のための抗体／抗原複合体形成：及ヒＣ）酵 素媒介触媒反応、例えばヌクレオリティック（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）攻撃、 蛋白質分解、及び低分子転換の触媒、が挙げられる。

溶液中の分子の相互作用は、相互作用成分が、結合相互作用を起こすのに十分な 距離内に拡散する速度によって制限される。この距離は、その分子が相互作用す る結合部位の性質と大きさの関数である。

大抵のマクロ分子の結合部位はそのリガンドに対して高度に特異的である。これ らの部位は、静電気力、水素結合、ファンデルワールス力、及び疏水性相互作用 をはじめとする種々の物理的な力を利用する。

■、　会合速度定数 分子の結合のための会合速度定数は、関与する相互作用の種類及び相互作用する 成分の拡散速度によって変化しうる。高特異性相互作用は一般的にすべての力を 利用する。しかし、静電気力と疏水性相互作用は、溶液中でより長距離にわたっ て作用し、しばしば、結合対間の距離が短くなるに従い親和力が増加する、特異 性結合相互作用につながる要素間の最初の引力の原因となる。結合対の複合体形 成は、すべての物理的な力（例えば、水素結合、静電気、疏水性及びファンデル ワールス力）により媒介される特異的接触の形成に起因する。この２相プロセス は次のように概説される。

ｋｌ　ｋ２ Ｐ＋Ａ　＜＝＝＝＞　（Ｐ−−Ａ＋　＜＝＝＝＞　ＰＡｋ−１ｋ−２ 遭遇複合体の形成速度だけが、溶液中の反応体の濃度、Ｐ及びＡに依存する。

大抵の相互作用において、反応は溶液中で成分が相互に遭遇する速度、すなわち ｋｌ（ＰＸＡ）により制限される。ｋ２かに１より速く、初期解離定数に−１よ り大きいと、複合体形成が起こる速度は、次のように、拡散速度により決定され る。

ｋｎ　□　４　ｐｉ　ＮＡ　（Ｄｐ　＋　ＤＡ　）ｒｐＡＮＡ＝アボガドロ数 Ｄｐ及びＤＡ・拡散係数 分子が相互作用する距離、「ＰＡは、溶液中、最大の距離で起こる結合相互作用 の関数であり、高親和性複合体の形成を導くことができる。溶液中の２個の大き な分子（蛋白質、ＤＮＡ）の会合のためのｋＤは、一般的に１０　’　／ｌｉｌ ／ｓである。大きな分子と小さな分子（酵素二基質）の相互作用について、その 速度は１０’／！ｉｌ／ｓである。成分間の初期相互作用が、ある距離をおいて 作用する力（例えば相補静電気相互作用又は疏水性力）を含まず、その代わりに 、短い距離で媒介される力（例えば水素結合又はファンデルワールス力）に依存 する場合、ｒｐ＾、従ってこの会合のｋＤはかなり小さい。これらの分子が相互 作用できる距離を大きくすると、ある距離における相互作用がより特異的な会合 を導（ことができることを条件として、会合速度の対応する増大をもたらすこと が期待できる。蛋白質（ｐｒｏｔｅ囲、　Ｔｈｏｍｓ　Ｅ、　Ｃｒｅｉｇｈｔｏ ｎ　（１９８３）　Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、　Ｃｈａｐｔｅｒ ｓ　４．８　は■ 合速度定数の優れた概念図を提示している。

本発明は、種々の結合対の会合速度定数を大きくすることに関するものであるの でこのような会合速度の測定はアッセイ条件を最適化するのに有用である。会合 速度定数は種々の認められた良く知られた方法で計算することかできる。

■）　核酸ハイブリダイゼーション　−　鎖の溶融が殆ど起こらない（すなわち 核酸の融点以下の）条件下では、アニーリング速度は、−重鎖基質の経時的な減 量を測定することにより、又は二本鎖生成物の生成量を測定することにより、計 算することができる。−重鎖の量はＳ１ヌクレアーゼ感受性アツセイにより測定 することができる。二本鎖材料の量はハイドロキシアパタイト結合により測定す ることができる。光学的ハイパークロミシティも使用できる。また、−重鎖は、 その移動度の違いを利用してゲル電気泳動により二本鎖から分離できる。決まっ た末端を持つＤＮＡ分子について、アニーリングの会合速度定数は次の式から導 くことができる。

Ｈ＝　Ｃ１４ｋ、ｃ、ｔ）−’ 式中Ｈ・残存する一本鎖の画分 に、＝会合速度定数 Ｃ０＝ヌクレオチドの初濃度 ｔ　・インキュベーション時間（秒） （Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　［（ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｅｄ、　Ｈａｍ ｅｓ　Ｂ、Ｄ、、　Ｈｉｇｇｉｎｓ　Ｓｊ、　ＩＲＬ　Ｐｒ■唐■ ２）　抗体　抗原相互作用　−抗体：抗原相互作用は一般に１０’ｔ’ｓ−’の 会合速度定数を持っている。これらは、緩和又は停止フローのような方法を用い て吸収分光器により計算された。抗体：抗原相互作用の平衡会合速度定数は、弱 い会合についての１０’からＩＯ’Ｍ−’以上まで変化しうる（ＣＲＣＣｒ１ｔ ｉｃａｌ　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（１９８６）　６：（１）　Ｉ） ｌ−４６）。

３）　酵素二基質相互作用　−酵素が基質で飽和されていない（基質を追加する と生成物の生成速度がさらに速（なる）反応について、酵素と基質の会合速度の 増加は生成物の生成速度の増加をもたらすことが期待される。酵素：基質相互作 用は一般的に速く、１０７〜１０’の会合速度定数を持っている。このため、速 度定数を計算するデータをめるのに優れた方法が使用される。これらは以下のも のを含む。

（ａ）　連続フロー装置 停止−フロー分光分析 反応を停止する高速冷却 を用いた高速ミキシング法 （ｂｌ　予備混合溶液中で基質を生成するフラッシュ光分解（Ｃ）　温度ジャン プ実験 のような緩和法 （酵素の構造と機構（Ｅｎｚｙｍｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｅｃｈａ ｎｉｓｍ）　Ａｌａｎ　Ｆｅｒｓｈｔ、　１．）Ｌ　Ｆｒｅｅｍａｎ　（１９８ ５）） 本発明は、高確率結合部位と呼ばれる特殊クラスの結合対を利用する。これらの 結合要素は、静電気及び疏水性相互作用を利用して距離のある結合対間により大 きな引力を与える。このような分子が、相互に高度の特異性をもつ結合対の要素 に直接又は間接的に付着すると、この高特異性結合相互作用の会合速度定数の著 しい増大を起こす。

Ｉｌ、副結合対 結合対間の複合体形成の上記説明とともに、高特異性結合対すなわぢ主結合対の 見掛は会合速度定数を太き（する作用を有する結合対（副結合対）の選択のため のガイドとして以下の定義を提示する。この議論の目的のために、副結合対は好 ましくは、比較的長い距離で静電気又は疏水性相互作用によりその相補要素と相 互作用する要素であり、複合体形成は比較的非特異的であり、最初の接触の際に 高度の確率で起こる。

その高確率結合部位とともに、副結合対を特定する性質としては、１つの結合部 位の任意の部分が対応する結合部位の任意の部分と反応することができるような 、相互作用する化学基の種類に関して比較的同質である結合部位、が挙げられる 。同質の結合部位を持つ結合パートナ−の例は、複数の正電荷を持つポリマーと 複数の負電荷を持つ相補パートナ−とからなる結合要素である。他の可能性とし ては、副結合対要素の両者が疏水性である場合がある。疏水性結合パートナ−は 、ロイシンやイソロイシンのような複数の疏水性アミノ酸残基から構成すること ができる。これらには、二次構造を不安定化させて伸長した、フレキシブルなコ ンフィギユレーションを促進するようなアミノ酸を散在させることができる。

また、静電気成分と疏水性成分を含む繰り返し単位を構築することもできる。こ のように、複合体形成は、比較的非特異的であり、１つの結合対がその相補結合 対の任意の部分と接触すると起こる。

副結合対の結合が作用して、近接した主結合対の要素を相互に空間的に配置する 。これが、確率を高くし、従って、比較的長い距離で副結合対より一般的に相互 に小さい相互作用しか及ぼさない主結合対間の結合発生速度を高くする。“比較 的長い距離”とは、主結合が安定に形成されず、不規則な熱運動により分裂して しまうような距離を意味する。換言すれば、この距離は、２以上の要素が対応す るパートナ−の特定の結合部位について競争することができる十分に大きな半径 を意味する。主結合部位が次第に近づくにしたがって、それらを互いに引き寄せ る結合力が副結合相互作用の結合力より太き（なってくる。これは一般的に数人 のオーダーで起こる。副結合対は、主結合部位が数十人離れている場合でも相互 作用できるように設計されている。

副結合対の要素の結合部位は物理的に大きくなければならない。比較的大きな部 位は副結合対間の結合発生の確率を高くする。結合部位の大きさを拡大すること は、結合部位にさらに繰り返し単位を付加することを含む。結合部位の拡大の例 としては、ポリリシン及びポリグルタメートを含む副結合対の長さをトリペプチ ドからデカペプチドまで大きくすることがある。一旦副結合相互作用が生じたら 、主結合相互作用の形成速度を最大にするために剛結合部位の大きさを最適化す ることができることに留意すべきである。この大きさは、副結合対か互いに相互 作用をしているときに、溶液中で相互作用をしていない主結合対の間に存在する 平均距離を越えて主結合対が離れるのを許すものであってはならない。

副結合要素は好ましくはフレキシブルな尾で構成されている。フレキシブルな構 造にはいくつかの利点がある。これらの尾は、対応する結合部位が溶液中任意の 配向から相互作用できるようにする。もしも結合部位が球形蛋白質の一つの面に 存在したとすると、その面だけが潜在的結合パートナ−となる。更に、フレキシ ブルな副結合対は、その副結合対の解離を必要とすることなく、ブラウン運動に より、高特異性結合要素の配向及び解離を可能とする。フレキシブルな尾は、そ れ自身フレキシブルな、又は球状構造に折り畳まれることのない、化学構成成分 を導入することにより確実なものとすることができる。この性質を有する副結合 要素には、グリシン及びプロリンを含むポリペプチド、長鎖アルキル（約５〜約 ２０炭素）、及びデキストラン硫酸のような合成ポリマーがある。

副結合対は、できるだけ長距離にわたって且つ任意の方向に作用する相互引力を 持つべきである。これは、電荷：電荷相互作用又は疏水性成分を使用することに より達成できる。電荷：電荷相互作用は、モノ又はポリプロトン塩基のような正 電荷を有する部分（例えば、アミノ基又は金属イオン）及びモノ又はポリプロト ン酸のような負電荷部分を必要とする。帯電領域は、帯電アミノ酸から均一に構 成することができ、又はこのようなアミノ酸を不規則に挿入して、相互作用ドメ インが相互に結合できるようにすることができる。疏水性相互作用は長いアルキ ル鎖により例示される。この種の相互作用は本質的に比較的広い範囲にわたって 相互作用を与えるが、これらを長い、フレキシブルな尾に導入すると、長距離に わたって相互にひ引き寄せあう能力がさらに大きくなる。帯電しているアミノ酸 又は疏水性を有するアミノ酸は良く知られている。

主結合対の各要素に結合した複数の高確率結合要素の使用は主結合対の要素間の 複合体形成を促進することができる。これは、結合パートナ−が高特異性結合を 行うことの見込みを向上させる。例えば、核酸アニーリングのようなプロセスに ついては、ＤＮＡ分子に沿って付着した複数のＡｌ　ｈｎＲＮＰのような複数の 高確率結合パートナ−は、高確率相互作用を可能とし、それによって生産性核形 成作用の見込みを向上させる。この場合、それ自身フレキシブルな、ポリマー上 の複数の副結合対の効果が、分子全体が副結合パートナ−として作用するのを可 能にするので、個々の副結合対の長さは、短くすることができる。

以下に説明する方法を用いて、一旦高確率反応が起きたら主結合対の高親和性結 合部位の接近を増加させるように、高確率結合部位の特定の配置を設計すること ができる。例えば、高確率結合部位を酵素の活性部位近傍に結合して基質をその 活性部位に導くことができる。

１つの大きな高確率結合パートナ−を核酸鎖の末端に有するよりも、いくつかの 小さな高確率結合パートナ−を核酸鎖の主鎖に沿って付着した方が好ましい。

というのは、このような配置は、初期の解離が起こった後に、核酸鎖の整列をよ り起こしやすくし、それによって対向鎖のヌクレオチドの接近を増加させ、特定 の解離の速度を太き（するからである。主結合対の初期結合は剛結合対要素の完 全な解離を伴うことなく行われることが好ましい。

一定の条件下で、高確率相互作用は、高特異性結合ポテンシャルなしに、剛結合 対間で起こりつる。この例は、非相補的Ａｔ　ｈ＃をコートした核酸鎖が溶液中 で互いに相互作用するときである。もしも、非相補鎖が相互に余りにも安定に会 合すると、それらはその相補パートナ−と会合できなくなる。従って、互いに相 互作用して余りにも安定な複合体を形成するようなことのない副結合対を使用す ることが重要である。副結合要素を高い確率で、しかし比較的低い安定度で互い に相互作用させることが好ましい。

これらの副結合パートナ−の相互作用の安定性を低くするのに、２つの一般的な アプローチが特に有用である。一方は、副結合パートナ−の化学的性質を変える ことであり、他方は水性環境を変えることである。例えば、副結合要素の大きさ を小さくすることができ、これがこれらの相互作用の安定性を低（する。これは 結合発生の確率も低くするので好ましくない。より良い方法は、相互作用を不安 定化する化学成分を導入することである。これは例えば、帯電した基を中性の基 で置換することにより行われる。ポリリシンからなる副結合要素は、リシン残基 のいくつかがグリシン又はプロリンで置換されている。更に、反応がインビトロ で行われる場合、緩衝条件を変えて、高確率結合反応の強さを増大又は減少させ ることができる。増大したイオン強度は帯電した残基からなる副結合パートナー 間の相互作用の安定性を低くする。温度の変化も反応の性質に影響する。高確率 相互作用は、高確率相互作用が一旦起こると高特異性結合相互作用の見込みが大 きいが、高特異性結合ポテンシャルが存在しないと十分に一過性であって解離が 起こるようなものであるべきである。大抵の副結合要素は、作用を行うのに特定 の安定な構造を必要としないので、一般的に高温は高速の会合を促進する能力を 阻害しない。最大速度は、主結合相互作用が不安定になる温度より僅かに低い温 度で達成されやすい。

例えば、アルキルトリメチルアンモニウムプロミドのようなカチオン性洗剤を用 いて核酸のハイブリダイゼーションを促進する場合、当業者は、約Ｏ℃の低温が 集合を起こしうろことを認識するであろう。（！１ｌａｎｔｉｏｌｅｔｔｉ、　 Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８゜Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６：２ ８７３−２８８４）。非特異的集合は望ましくなく高温のインキュベーション温 度（好ましくは６０〜９０℃）の使用により避けることができる。

以下のものは、高確率結合部位を有する副結合対の例である。

偉）負帯電、デキストラン硫酸、ポリ燐酸塩、ポリグルタミン酸及びポリアスパ ラギン酸： （ｂｌ　正帯電：ポリリシン、ポリアルギニン及びポリエチレンイミン；（Ｃ１ 疏水性　ポリフェニルアラニン、ポリトリプトファン及びポリアルカン。

高確率結合部位は化学的に合成することができ、適当なマクロ分子に付着するこ とができる。また、天然に存在する又は上記性質を利用して設計された、ポリペ プチドをコードする配列は、その産物が高特異性結合部位を有する遺伝子に導入 することができる。更に、高確率結合部位は高特異性結合パートナ−に非共有的 に結合することができる。

本発明は３つの異なる実施態様で実施することができる。第１実施態様は、２つ の異なる要素を含む副結合対を使用する。これら２つの要素は、互いに相互作用 を及ぼし、ポリグルタメート及びポリリシン要素により例示される。第２実施態 様は、相互に引き寄せあう２つの同じ要素を使用する。長鎖炭化水素（例えばペ ンタン、オクタン等）のような疏水性のポリマーは、ミセル体形成に似た方法で 相互に引き寄せあう。第３実施悪様は、主結合パートナ−の１つに結合し、見掛 けの会合速度定数を大きくする、高確率結合可能な単一の多価マクロ分子を使用 する。この結合は、共有結合により行うことができる。核酸に共有結合する場合 、帯電ポリペプチドがこの第３実施悪様を例示する。第３実施態様はまた、抗原 がウィルス粒子であり、抗体が、それにウィルスコートの繰り返し構造に対して 高確率結合親和力を有する副結合パートナ−を結合した、抗体と抗原からなる主 結合パートナ−により例示される。主結合対及び副結合対の要素は、相互に共有 結合により、又は非共有結合により結合することができる。共有結合の場合、結 合は直接でもよ（、結合剤を介してもよい。直接結合はアミン／カルボキシル基 間のペプチド結合、アルデヒドとアミンの間のシッフ塩基形成、アルコール基と 酸の間のエステル化、システィン残基間におけるようなジスルフィド結合の形成 等、相互に反応する利用可能な基を利用して行われる。結合剤は、グルタルアル デヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル（ＮＨＳ）エステル又はα−ブロモアセ タミドのような、ホモ２官能性化合物又はへテロ２官能性化合物である。これら の試薬は種々のルートで商業的に入手可能である。その使用は良く知られている 。

例えば、引用によりここに導入された米国特許第４，１５２，４１１号及び４゜ ６８７．７３２号を参照されたい。これらの２つの特許は、主結合対の要素をラ ベルに共有結合的に結合する手段を例示している。この一般的な教示及び方法は 主結合対の要素を副結合対の要素に共有結合するのに適用できる。

主結合と副結合の要素が非共有結合手段により結合される場合、その結合の強さ は、少なくとも１つの副結合要素が殆どいつも主結合要素に結合していることを 確実なものとするのに十分なものでなければならない。

ＩＩｌ、主結合対の会合速度定数を増大するための副結合対の使用副結合対の使 用は、溶液中の分散した分子の結合に関与する化学反応の動力学が速度を制限す るプロセスに広く利用されている。これらには、核酸アニーリングのような結合 反応、並びに化学反応速度の増大が含まれる。本発明はインビボ及びインビトロ で応用できる。以下のものは、例示のみを目的とした短いリストである。成分の 集合により制限されるいかなる反応も、本発明により促進することかできるであ ろう。

ｌ）　核酸アニーリング 核酸アニルリングは溶液中で起こる核形成の速度により制限される。高確率結合 部位を有する副結合要素が核酸鎖に結合し、１つの畝上の結合部位が相補鎖上の 相補パートナ−を有すると、溶液中の相補核酸鎖の会合速度の増大が達成される 。この会合が、正しい核形成の確率を増加させるものであると、アニーリングの 速度が増大する。Ａｌ　ｈｎＲＮＰ蛋白質は、一部分、このようにしてアニーリ ングを促進する。一旦高確率結合が起こると相補鎖が相互に移動することができ 、相補鎖上の多数の異なる塩基対の可能な会合を可能とし、正しい会合の見込み が増大することは重要である。安定な、高親和性塩基対が存在しないと、複合体 は解離する。

核酸アニーリングの第２の例は、正に帯電した高確率結合部位をプローブ核酸に 直接結合することである。これは、急速な、し力）しフレキシブルな、プローブ と目的の核酸の会合を起こし、それによって特定の会合の速度が増大する。

２）　抗体　抗原相互作用 抗体に高確率結合部位を結合し、対応する抗原に相補高確率結合部位を結合する とその抗体：抗原結合の発生が促進される。更に、第１抗体への高確率結合部位 の結合を利用して、相補高確率結合部位を持つ第２抗体の同一抗原の異なる抗原 決定基への会合速度を増大することができる。第１抗体が高濃度で存在し第２抗 体が低濃度で存在しつる。ラベルするか、毒性化合物を保持したこの第２抗体は 次に、第１抗体がすでに結合している任意の抗原に迅速に結合することができる 。この抗原は、それぞれの抗体に対する２つの異なる抗原決定基を有する蛋白質 であることができる。また、この抗原は、それぞれ２つの抗体の一方に対する抗 原決定基を有する２種の異なる蛋白質をその表面に有する細胞であることができ る。

抗原自身が繰り返し単位で構成されでいる場合、高確率結合パートナ−を単独で 、相互作用する抗体分子に結合することができる。高確率結合パートナ−は、高 確率であるが低特異性の抗原と相互作用し、それによって高特異性抗体分子が抗 原と会合する速度を増大する。抗原は、その表面に複数の同一のコート蛋白質を 持つウィルス粒子又はアク・ブンのよ・）な、Ｆリマー蛋白質であることができ る。

高確率結合パートナ−は、抗原に対する天然に存在する結合部位の小さな繰り返 し単位であることができ、又は合成高確率結合パートナ−であることができる。

エイズウィルス（ＨＩｆ）の場合、高確率結合パートナ−は、ＣＤ４レセプター に対するＨＩＶの結合に関与しているアミノ酸配列［Ｐｈｅ、　Ｌｅｕ、　Ｔｈ ｒ、　Ｌｙｓ、　Ｇｌｙ、　Ｐｒｏ］の繰り返し単位から構成することができる （Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、　Ａ、　ａｎｄ　５ｅｅｄ、　Ｂ、　（１９８８）　Ｃｅ １１５４、６５−７２）。高特異性結合パートナ−は、抗体、又は高特異性結合 ポテンシャルを持つ他の均等なレセプター分子であることができる。Ｈｆｆの場 合、高特異性結合パートナ−は、細胞レセプターＣＤ４　、又はその可溶性変異 種であることができる。

３）　核酸変性酵素 高確率結合部位を持つ副結合要素は、制限酵素、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼの ような核酸を変性する酵素、又は他のＤＮＡ変性酵素に結合される。高確率結合 部位は、核酸変性酵素が核酸と相互作用してその効率を増大する頻度を高くする 。ポリリシン又はポリアルギニンのような正に帯電した、高確率結合性の尾はＤ ＮＡの負に帯電した主鎖と相互作用することが期待される。同じ尾を、ＲＮＡを 変性する酵素に使用することができる。この実施態様では、核酸基質に対応する 高確率結合部位を結合する必要がない。この核酸燐酸塩主鎖は、天然の高確率結 合部位である。

４）　プロテアーゼ 蛋白質の共通の化学成分と相互作用することができる高確率結合パートナ−を使 用してプロテアーゼのその基質に対する会合速度を増大することができる。また 、高確率結合パートナ−を疏水性にして、洗剤変性蛋白質と相互作用するように することができる。この洗剤が帯電している場合、高確率の尾も相補的な電荷を 保持し、相互作用の速度を増大することができる。こうして、プロテアーゼは変 性蛋白質に見られるように、高濃度の洗剤と会合する。この場合、自己分解を避 けるため、それ自身がポリペプチド鎖ではない高確率結合パートナ−を設計する ことが重要である。

５）　酵素、小基質相互作用 高確率結合部位を持つ副結合要素は、ＤＮＡかカチオンを捕捉するのと同じよう に基質に結合するように、酵素に結合させることができる。帯電した基質は次に 高確率結合性の尾に沿って拡散し、酵素の活性部位と遭遇する。これは、帯電し た基質にとって便利であり、疏水性の基質にとっても有用である。

好ましい実施態様は、相補核酸の会合速度定数の促進を包含する。次にこの実施 態様の詳細を説明する。

ＴＶ、核酸の復元 ん　異種リボ核蛋白質［ｈｎＲＮＰ］を用いた核酸の復元ｈｎＲＮＰは、直径約 ２０側、沈降係数約４０Ｓのリボ核コア粒子中に見出される、天然に存在する蛋 白質である。このコア粒子は、ミバエ、藁歯類及びヒトをはじめとする各種の真 核生物に見出されている。このコア粒子は、リボ核酸と多数のコア蛋白質とから 構成されている。この粒子の正確な目的又はｈ＃の役割は現在のところわかって いない。これらの粒子は、新しく転写されたメツセンジャーＲＮＡと一般に会合 することが知られている。これらはこのメツセージのスプライシングに一定の役 割を果たしているものと考えられている。

本発明において使用するｈｎＲＮＰは、異種核蛋白質粒子のコア蛋白質から得ら れる。この粒子は一般に３２．０００〜４２．０００ダルトンの数種類の異なる コア蛋白質で構成されている。本発明に使用するこのコア蛋白質は、この群の最 小蛋白質、及び核酸：ｈ＃／核酸：ｈｎＲＮＰ分子間引力を可能とするカルボキ シ末端によって識別される。核酸：　ｈｎＲＮＰ　／核酸：ｈｎＲＮＰ相互作用 の測定は、アニーリングの促進を測定するルーチンの滴定実験により行われる（ 実施例の部参照）。

蛋白質抽出物１本鎖ＤＮＡカラムに通し、カラムに結合した蛋白質を塩濃度を高 （しながら溶出することにより、本発明で使用するｈｎＲＮＰ蛋白質を同定する ことができる。この溶出物はハイブリダイゼーションを促進し、Ａｌ−蛋白質は 特に効果が高い。円偏光二色性測定により重大な二次構造を欠落している蛋白質 も特に有用であると期待される。また、グリシンに富んだ（約４０％）　ＣＯＯ 味端を同定することにより、ハイブリダイゼーションを促進する幾つかのｈ−コ ア蛋白質を予測することができる。グリシンに富んだ末端の測定は、その蛋白質 の前半に存在するグリシンの数を後半のそれと比較することにより行う（Ｊ、　 Ｂｉａｌ。

Ｃｈｅｒｎ、、　２６３：３３０７−３３１３）。

好ましいｈｎＲＮＰは、一般にＡｌ　ｈｎＲＮＦと呼ばれるヒトのコア蛋白質で ある。それは、ＨｅＬａ細胞から精製した天然に存在する蛋白質として、又はＡ ｌ　ｈｎＲＮＰ遺伝子又はｃＤＮＡを発現する遺伝子組換え細胞から単離した外 来発現産物として、得ることかできる。

天然に存在するｈｎＲＮＰを単離する好ましい方法は、Ｋｕｍａｒ　ｅｔ　ａｌ 、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅａ　２６１：１１２６６−１１２７３．１９８６に詳細に記載されている 。要するにこの方法は精製した核から２Ｏ−ｒｕｎの単粒子の単離を含むもので ある。この単粒子は、蔗糖密度勾配で単離される。コア蛋白質Ａ１は、他のコア 蛋白質が集合して多形となる固有の傾向に依存した一工程のクロマトグラフィ操 作により得られる。４０３粒子は、２、０　Ｍ　ＮａＣ１の緩衝液に透析すると その粒子を解離する。抽出物をゲル濾過カラムに通し、ＳＨ−試薬を含む高置緩 衝液で溶出し、適当な画分を集めることにより、さらにＡ１リッチとなる。

またラットのＡｌ　ｈ＃遺伝子をコードするｃＤＮＡがクローン化され、Ｃｏｂ 　１ｎａｎｃｈ　ｉ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅｆｌＬ２６１：３５３６−３５４３ ．１９８６に従って、天然の蛋白質がマウスミエローマ細胞から精製されている 。Ｃｏｂｉｎａｎｃｈｉの文献はラットＡｌ　ｈｎＲＮＰのヌクレオチド配列も 示している。

ｈｎＲＦＪＰ（約０．５　ｍｇ／ｍｌ　）はかなり安定であり、１０　ｍＭ　Ｔ ｒｉｓ　ｐＨ８，０，０，１０１＋１４　ＥＤＴＡ。

０．１ｍ　ジチオスレイトール及びｌ　Ｍ　ＮａＣｌ中、−８０℃で保存できる 。繰り返しの凍結解凍サイクルも可能であるが、薦められない。

本発明に使用するｈｎＲＮＰは、核酸に結合することにより、そして特定されな い方法で相互作用して相補核酸配列のハイブリダイゼーションを促進することに より機能する。これらの蛋白質のカルボキシ末端は、アニーリングを最高に促進 するため、及び分子間相互作用（ｈｎＲＮＰＡｎＲＮＰ相互作用）のため、必要 とされる。

ｈｎＲＮＰは分類学上の属及び科の全体で実質的に保存される。更に、遺伝子組 換えにより、ｈｎＲＩｌｌＰの二本鎖形成促進能力を阻害することなく種々のア ミノ酸を導入し、置換し、又は欠失させることができる。例えば、グリシン−リ ッチなドメインをプロリンのような等価アミノ酸に富んだものとすることができ る。本発明及びｈｎＲＮＰという用語は核酸間のアニーリングを促進する機能を 有するすべての蛋白質を包含することを意味する。これらの蛋白質は、天然に存 在する形態及び合成により改質した形態の両者を包含する。

Ｂ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション速度の促進 核酸ハイブリダイゼーションアッセイはこの技術分野で良く知られている。本発 明は、これらのアッセイを実施するいかなる特定のモードにも限定されない。

ハイブリダイゼーション技術は、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚ ａｔｉｏｎ　ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、　Ｅｄ、　ＨＭｌｅｓ 、　Ｂ、Ｄ、　ａｎｄ　Ｈｉｇｇｉｎｓ、　Ｓ、Ｊ、、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　 １９８７に包括的■■ 明されている。ハイブリダイゼーション技術においてなされる改良は、容易に本 発明に適用できる。

核酸アニーリングの促進は、多くの用途を持っている。これらの用途には、ノー ザン及びサザン分析、サブトラクティブハイブリダイゼーション、核酸プローブ を用いたプラークコロニースクリーニング、及びポリメラーゼチェーンリアクシ ョン増幅プロセスが含まれる。臨床応用には、病原菌、及び病気の状態の診断ア ッセイ、並びに医学又は法廷用途の遺伝子プロフィールの作成が含まれる。

ハイブリダイゼーション条件 この反応混合物には種々のハイブリダイゼーション溶液を使用することができる 。標準的なハイブリダイゼーション溶液は、しばしば、洗剤のような蛋白質変性 剤、ホルムアミドのような極性有機溶媒又はグアニジン塩を含んでいる。このよ うな溶液は、蛋白質媒介アッセイには薦められない。本発明において好ましい溶 液は、約４．０〜約ｌＯ１最も好ましくは約６〜８のｐＨを持つ。ＥＤＴＡをこ のハイブリダイゼーション溶液に含ませることもできる。

ハイブリダイゼーションアッセイの標準的な塩条件では、１僅の塩（例えば、カ リウム又はナトリウム）を１モル以上の濃度で使用する。以下に示す実施例で使 用するような条件では、アニーリングの一媒介促進を阻害するものとして高濃度 の１価カチオンが注目された。ハイブリダイゼーション条件を変えて、高塩濃度 条件でもアニーリングの促進をすることはできるが、１価の全塩濃度は約８０〜 １２０　ｍに保持することが薦められる。

ハイブリダイゼーション溶液は、任意に、少量のマグネシウム塩、非特異的ブロ ッキング剤、例えばウシ血清アルブミン、ラベルしていないキャリアー核酸、約 ０．Ｏ１■／ｍ１以上の断片化核酸、ＤＮＡ、例えば、断片化したウシ胸腺ＤＮ Ａ又はサケ精子ＤＮＡ、又はイーストｔＲＮＡ又はイーストＲＮＡを含んでいて もよい。

ｈｎＲＮＰの推奨される量は、反応混合物中に存在する核酸の量に依存している 。

ｈｎＲＮＰは、核酸をコートし、各鎖に複数のｈｒＩＲＮＰが結合すると考えら れている。

アニーリングを効果的に促進するために、反応混合物中に存在する核酸の全重量 の最小限５倍過剰のｈｎＲＰＪＰが薦められる。さらに好ましくは、全核酸の１ ０〜２０倍過剰の蛋白質が薦められる。核酸条件が非常に低い場合、さらに多量 のｈｎＲＩｌｆＰが必要になる。

反応温度は、−の存在下でもハイブリダイゼーション速度に影響する。反応温度 条件は、２０〜１００℃、好ましい温度は３７〜６５℃である。温度の上昇とと もにアニーリングの促進に顕著な増大が見られ、６５℃がハイブリダイゼーショ ンのための好ましい反応温度である。

ハイブリダイゼーションアッセイの方法核酸ハイブリダイゼーションは種々の方 法で行うことができる。当業者は核酸ハイブリダイゼーションアッセイに通じて おり、この技術分野の研究者が利用できる種々の方法をここで詳細に説明する必 要はないと考えられる。ｈｎＲＮＰによるアニーリングの促進は、同種及び異種 核酸ハイブリダイゼーションアッセイの両者で達成できる。

同種核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、相補核酸の両者が溶液中で遊離し ているアッセイを含む。異種アッセイは、少なくとも一方の核酸ポリマーを固体 支持体に固定化することを含む。これらの支持体としては、限定されるものでは ないが、濾紙、ゲル、ナイロン、磁気ビーズ、ガラス、カルボキシ及びアミン活 性化不活性固体、例えばテフロン又はプラスチック、が挙げられる。固定化はイ オン結合又は水素結合相互作用による非共有結合、又は共有結合により行うこと ができる。異種アッセイはこの技術分野において周知である。

反応のモードは、限定されるものではないが、二元、三元又は四元レベルである 。二元モードは、２種の異なる核酸間のアニーリングにのみ依存する反応であり 、その一方は一般的にラベルされている。三元及び四元モードは、複数の核酸ポ リマーを相互にアニーリングするサンドイッチアッセイを含む。

ハイブリダイゼーションの検出 ｈｎＲＦＪＰ媒介アニーリングは、ハイブリダイゼーションの検出手段に影響を 与えるものではない。全ての標準的な方法が使用できる。これらは、リポータ− 又はラベルとして、ラジオアイソトープ、蛍光物質及び酵素（例えば、セイヨウ ワサビパーオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）を含む。リポータ−は核 酸ポリマーの一方に直接結合することも、またリガンド／レセプターコンフィギ ユレーションを介して間接的に結合することもできる。検出方法はこの技術分野 で良く知られており、変更及び改良は本発明の範囲内である。

Ｃ０他の変性化合物 本発明はまた、高温（４５℃以上）でハイブリダイゼーションを促進する方法を 提供するものである。この方法に使用する化合物は、−水路核酸結合性蛋白質を 含む。これらの蛋白質は、ｈｍ伊及びポリリシンを含む。このような蛋白質はこ の技術分野で、核酸アニーリングの媒介物として知られている。（例えば、Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１１５：４４１；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２：５６６６−５６７０；及′ｃeＢｉｏｃｈｅｍ。

２８：１０６２−１０６９参照）。他の化合物としては、ヘキサデシルトリメチ ルアンモニウムプロミド及びドデシルトリメチルアンモニウムプロミドのような カチオン性洗剤が挙げられる。

上記反応条件はそのままｈｎＲＮＰに適用できる。最適反応条件は幾つかのルー チンの滴定実験を必要とすることがある。非特異的集合形成や無促進ハイブリダ イゼーションをもたらす条件は、好ましくない結果を反映する。このような結果 は当業者に既知のルーチンの方法で容易にモニターされる。

Ｄ、　キット 本発明はまた、ここに説明した成分を使用した、上記方法を実施するための複数 に区分けされたキットを包含する。このキットは主結合パートナ−に結合した又 は結合していない剛結合パートナ−を含む。主結合要素も含まれつる。主結合要 素又は剛結合要素間の結合を検出又は測定する手段も、これらのキットに含まれ る。

全ての参考文献は、参照により、この明細書に含まれる。以下の実施例は例示の ためのものであり、限定のためのものではない。

実施例 制限酵素は分子生物学において広く使用されている道具である。制限酵素は、Ｄ ＮＡを特定の配列で認識し、次いで開裂する。制限酵素がその対応する結合部位 と会合することが見出される速度は、高確率結合パートナ−を添加することによ り促進することができる。Ｅｅｏ　Ｒ１制限酵素は周知である。この酵素をコー ドする遺伝子は、この蛋白質を改質し、過剰に生産し及び精製する方法と同様に 、入手可能である（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　７：１８５−１９７．１９９０ 　参照）　。Ｅｃｏ　Ｒ１の結晶構造も知られている。（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３ ４：１５２６−１５３４．１９８６）　。この実施例では、（グリシン３−リシ ンｌ）の繰り返し単位からなる高確率結合部位をコードするＤＮＡ配列を、Ｅｃ ｏ　Ｒ１遺伝子のアミン末端にクローニングする。繰り返し単位の数は１０であ る。この新規酵素をコードする遺伝子を発現し、蛋白質を精製する。次に、この 酵素を使用して、配列ＧＭＴＴＣを含むＤＮＡ断片に結合する。これらの断片は 長さが５０及び＋０００塩基対である。結合は既知の方法（ＰＮＡＳ　７９・４ ０１０−４０１４．１９８２）で測定する。この蛋白質と核酸の会合速度を最適 化するために、■価カチオン濃度を滴定する。ある条件下では、この会合速度は 高確率結合部位を含むＢｃｏ　Ｒ１酵素のそれより速い。反応にマグネシウムも 含めて、開裂を促進する。これは前述の第３実施態様の例である。

２、Ａｌ　ｈｎＲＮＰを用いた核酸ハイブリダイゼーションの促進Ａｌ　ｈｎＲ ＮＰ存在下と不存在下における核酸ハイブリダイゼーション速度を比較すると、 ハイブリダイゼーション速度がｈｎＲＮＦ媒介により劇的に向上することがわか る。このアッセイでは、プラスミドｐＳＶ２ｇｐｔのＨｉｎｄ　ＩＩＩ／Ｂｇｌ 　ＩＩ消化により得られた核酸を使用した（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２０９：１４２２ −１４２７．１９８０）。この二本鎖セグメントは鎖あたり１２０核酸塩基を持 っており、Ｅ、ｃｏｌｉ由来のキサンチン　グアニン　ホスホリボシル−トラン スフェラーゼ遺伝子に隣接したＤＮＡセグメントを含んでいる。二本鎖の両者の 末端を、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、、及びＳａ ｍｂｒｏｏｋ。

Ｊ、、　１９８２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ≠窒ｂ盾秩@Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ、　［Ｍａｎｉａｔｉｓ］　１１３頁に従って、凹んだ３°末端を満たすこと により３″Ｐでラベルした。カウントは核酸ｌμｇあたり、約１０’　ｃ四であ った。

この核酸を、１０ｍ　燐酸カリウムｐＨ７，０，１＋ｍ　ＥＤＴん１００　ｔｒ ｊＡ　ＮａＣ！、　１．２５　ｎｇ／ｍｌの末端ラベル相補核酸（反応混合物に 加えるまでに、１〇−燐酸カリウム緩衝液ハＩｆＭＥＤＴＡで９５℃、５分間加 熱し、氷水で急冷して予め一本鎖にしたもの）及び７１１　ｎｇ／ｍｌのＡｌ　 ｈｎＲＮＰ（実験混合物に最後に加えた）を含む２０μｌの／ゾブリダイゼーシ ョン反応混合物中に入れた。反応混合物を６５℃で０．１．２．４．８゜１６及 び３２分間インキュベートした。

反応混合物５μｌを、０．１％ＳＤＳ、　５０μｇ／ｍｌ　ｔＲＮＡ、　５％グ リセロール、及び０．０５％ブロムフェノールブルーを含む溶液に、最終容量２ ０μｌとなるように加えて希釈し、反応を停止した。次に反応生成物をフェノー ル：クロロホルム（１：ｌ）で抽出し、水相を１０％ポリアクリルアミドゲルに のせ、ＩＯＶ／ａｍで２時間、電気泳動した。このゲルをＭａｎｉａｔｉｓ（１ ’ｊ８２．　ｐ、４５４）に従って、Ｔｒｉｓ／はう酸塩緩衝液中で処理した。

次にこのゲルを乾燥しオートラジオグラフィにかけて、ハイブリダイゼーション の程度を測定した。ハイブリダイゼーションの程度はゲル上の各レーンの一本鎖 ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡの濃度を比較することにより容易に測定された。

この条件で、ＡＸｈｎＲＮＰを使用しないと、３２分後に、認識可能なアニーリ ングは検出されない。同じ条件でＡｌ　ｈｎＲＮＰが存在すると、アニーリング のハーフタイムは約１分未満である。

反応条件は、反応混合物Ａが、１２０−　塩化カリウムと４００　ｎｇ／ｍｌ　 Ａｌ　ｈｎＲＮＰを含んでいる他は、実施例２の反応条件と同じであった。反応 混合物Ｂは、標準的ハイブリダイゼーション条件を示すｌ　Ｍ　ＮａＣ１を含ん でいた。反応混合物Ａを６５℃で５分間インキュベートし、反応混合物Ｂを６８ ℃で５分間処理した。オートラジオグラフィの結果は、５分後、反応混合物Ａが 、１００％二本鎖の核酸を含み、−重鎖の核酸は検出できないことを示した。反 応混合物Ｂは、二本鎖の核酸が検出できなかった。ＡｌｈｎＲＮＰによる相対的 な促進は、少なくとも１００倍速いと評価された。

４、核酸ハイブリダイゼーション速度のＡｌｈｎＲＩｌｉＰ媒介促進に及ぼす温 度の影響反応条件は、混合物が４０００　ｎｇ／ｍｌのＡｌ　ｈｎＲＮＰを含ん でいた他は実施例２の反応条件と同じであった。反応混合物を、０℃、２３℃、 ３７℃、５０℃及び６５℃で５分間インキュベートした。結果は、高温で促進が 最適化されること、６５℃で５分後に、ラベルの１００％が二本鎖の核酸と会合 し、３７℃で５分後に、ラベルの約５０％が二本鎖の核酸中に見出されること、 を示した。

Ａｌ　ｈｎＲＮＰが、臨床試料中に見出されるような過剰の異種ＤＮＡ存在下に おいて核酸ハイブリダイゼーションを促進することを確立するために、Ｍ１３Ｍ Ｐ１８−水路ＤＮＡ（Ｍ２Ｓ−）又は上述の１２０ｂｐの目的配列をそれにクロ ーニングしたＭ１３ＭＰ１８−水路ＤＮＡ（Ｍ２Ｓ”　）の存在下で反応を行っ た。Ａｌ　ｈｎＲＦＪＰが１６．０００　ｎｇ、／ｍｌであった他は、実施例２ と同じ反応条件であった。各反応は、温度６５℃で５分間、ハイブリダイゼーシ ョンを行った。反応混合物Ａは異種ＤＮＡを含んでいなかった。

反応混合物Ｂは、Ｍ２Ｓ−（２５ｎｇ）のみ１０００倍過剰に含んでいた。反応 混合物Ｃは、Ｍ２Ｓ−（２２，５ｎｇ）及びＭ１３′″（２，５ｎｇ）を含んで いた。反応混合物りは、Ｍ１３＋のみ（２５ｎｇ）を含んでいた。６５℃で５分 径ハイブリダイゼーションを完了した。混合物Ａと比較して混合物Ｂにハイブリ ダイゼーションの有意の阻害は検出されなかった。混合物Ｃ及びＤにおいてもハ イブリダイゼーションの有意の阻害は検出されなかった。これは、フランキング 非相補配列中に目的の配列を置いても、ハイブリダイゼーション速度を効果的に 促進するＡｌｈｎＲＮＰの能力を阻害しないことを明瞭に示すものであった。Ｍ １３ＭＰ１８　ＤＮＡの代わりに煮沸したゲノムＤＮＡを使用しても同様の結果 が得られた。目的配列が短い断片すなわち大きな断片（Ｍ２Ｓ　ＤＮＡにクロー ニングされた）の一部であるかどうかにかかわらず、目的配列に比較して、短い 核酸（プローブ）のアニーリングについて強い選択性は認められなかった。さら に、この実験結果は、ハイブリダイゼーシヨンを３７℃で行った場合についても 、ハイブリダイゼーション速度は遅いものの、同様であった。

反応条件は、Ａｌ　ｈｎＲＮＦ’を最終濃度０．１％のＣＴＡＢに置き換え、反 応混合物を７０℃で１分間インキュベートした他は実施例２と同じであった。結 果は、この条件でＣＴＡＢ存在下の復元が約１０７（リットル）（モル　ヌクレ オチド−１）（秒−１）の速度で鎖を復元すること、及び副結合パートナ−の不 存在下で行った同様の反応より３００倍以上速いことを示している。

２ｎｇのＭ２Ｓ　”　ＤＮＡ　（実施例５参照）を２５■２のＮｙｔｒａｎ　（ 登録商標Ｘ５ｃｈｌ　１ｓｃｈｅｒ＆　５ｃｈｕｅｌｌ、　Ｋｅｅｎｅ、　ＮＨ ）フィルター上にスポットし、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃ Ａ）Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒからの紫外線を用いて固定した（ＵＶ照射量はこ の会社の薦めに従った）。このフィルターを予め水で湿らせた３枚のＴｈａｔｍ ａｎ　３ＭＭ濾紙の上に置き、フィルターの上部に水を加え、追加の乾燥紙を用 いて下層のＴｈａｔｍａｎ濾紙から溶液を除去することにより、フィルターを濯 いだ。この操作により、Ｎｙｔｒａｎフィルターの上部に加えた溶液が、フィル ターを通過するようにした。次に、１００　ｐｇの１２４　ｎｔラベルした一水 路プローブＤＮＡ、１０ｍ燐酸カリウム（ＫＰＯ３）（１）Ｈ７，Ｏ）。

ｌ　ｍ　ＥＤＴＡ、　０．４　Ｍ　ＮａＣ１，及び０．１％ＣＴＡＢを含む溶液 を５０μｍフィルターの上部に加え、溶液がフィルターを通過するようにした。

次にこのフィルターを、　１０６１ＫＰＯ，、１ｄ　ＥＤＴＡ、及び下記のもの ：　１）　０．４　Ｍ　ＮａＣ１，Ｏ，１％ＣＴＡＢ、　２）　４．０　Ｍ　Ｎ ａＣ１゜０．１％３−［（３−クロロアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］− ２−ヒドロキシ＝１−プロパンスルホン酸（Ｃ）ｔＡＰｓ−ａ　両性イオン洗剤 ）、　３）　４．ＯＭ　ＮａＣ１，０，１％Ｃ）ＩＡＰＳ、　４）０、１　Ｍ　 ＮａＣ１，０，１％ＣＨＡＰＳ、を含む緩衝液中、６０℃で、４回連続して１０ 分間のインキュベーションにかけた。次にフィルターを乾燥し、オートラジオグ ラフィにかけた。この条件では、２時間後にシグナルが容易に検出できる。Ｍ２ Ｓ　ＤＮＡがこのプローブに相補的な配列を持っていない場合、シグナルは殆ど 検出できない。

本発明を、理解を明瞭にする目的で例示及び実施例により、やや詳細に説明した が、添付した請求の範囲内で一定の変更及び改良ができることは自明である。

国際！ＩＩＩＩＥ報告 ｌＡｍＡａＩｎ＋Ｒａ１Ａｅｅｈｒｓ畷ｍＮ１１Ｆ１〔：１［）メｕｌＥ１１０ ７０２）Ｗｙｅ拳ｂ１１−一１（＾＃Ｉｂ１ｌｌＨ＠ＡＮｓ、ｇＪ、〆ｍ町Ｘ） １０７０２０

Claims (41)

【特許請求の範囲】
1. １．主結合対による集合体形成をともなうことなく、主結合対の要素の会合速度 定数を促進する方法であって、 （ａ）副結合対の相補要素を主結合対の要素に結合する工程、この際、副結合対 は主結合対のｋａより大きなｋａを有する、；及び（ｂ）これらの要素を、主結 合対の要素間で結合が起こるような条件で溶液中に置く工程を含む上記方法。
2. ２．相補副結合対の要素が、主結合対の要素に共有結合している請求の範囲１記 載の方法。
3. ３．相補副結合対の要素が、逆符号に帯電したポリマーからなる請求の範囲１記 載の方法。
4. ４．相補副結合対の要素が、疏水性ポリマーからなる請求の範囲１記載の方法。
5. ５．副結合対が、蛋白質要素を含む請求の範囲１記載の方法。
6. ６．副結合対が、異種核リボ核蛋白質である請求の範囲１記載の方法。
7. ７．副結合対が、カチオン性洗剤である請求の範囲１記載の方法。
8. ８．相補副結合対が、異種核リボ核蛋白質及びＤＮＡ主鎖であり、主結合対が相 補ポリヌクレオチドである請求の範囲１記載の方法。
9. ９．主結合対が、相補ポリヌクレオチド；抗体と対応する抗原；及び酵素とその 基質からなる群から選択される請求の範囲１記載の方法。
10. １０．主結合対が、抗体と対応する抗原である請求の範囲１記載の方法。
11. １１．主結合対が、相補ポリヌクレオチドである請求の範囲１記載の方法。
12. １２．さらに、主結合対を固体支持体に固定する工程を含む請求の範囲１記載の 方法。
13. １３．副結合対の要素に共有結合した主結合対の要素からなる組成物であって、 該副結合対の要素が相互に引力を及ぼし、その引力は、主結合対の相補要素の単 一の結合部位に対して２以上の要素が競合するような距離で主結合対が相互に及 ぼす力よりも大きい、上記組成物。
14. １４．副結合対が主結合対の会合速度定数より大きい会合速度定数を有する請求 の範囲１３記載の組成物。
15. １５．副結合対の要素が逆符号に帯電したポリマーからなる請求の範囲１３記載 の組成物。
16. １６．主結合対の要素が抗体とその対応する抗原を含む請求の範囲１３記載の組 成物。
17. １７．主結合対の要素が相補ポリヌクレオチドである請求の範囲１３記載の組成 物。
18. １８．共有結合した副結合対の要素、第１要素が、副結合対の要素、第２要素に 結合し、第２要素が、主結合対の要素の天然に存在するドメインであり、該ドメ インか、共有結合した第１副結合対要素を持つ主結合対の要素に高い特異性をも って結合している請求の範囲１３記載の組成物。
19. １９．第１要素に結合した主結合対の要素が、酵素である請求の範囲１８記載の 組成物。
20. ２０．第１要素に結合した主結合対の要素が、ポリヌクレオチドである請求の範 囲１８記載の組成物。
21. ２１．第１要素に結合した主結合対の要素が、抗体である請求の範囲１８記載の 組成物。
22. ２２．主結合対による集合体形成をともなうことなく、主結合対の要素の会合速 度定数を促進する方法であって、 （ａ）前記要素を含む水溶液を、相互に及び／又は結合対の２以上の要素と物理 的に結合する能力を有する多価会合速度エンハンサーと接触させる工程；及び （ｂ）前記結合対と前記多価会合速度エンハンサーが会合するような条件で前記 結合対をインキュベートする工程を含む方法。
23. ２３．多価会合速度エンハンサーが、主結合対の要素の１つに共有結合している 請求の範囲２２記載の方法。
24. ２４．主結合対の要素が、抗体とその対応する抗原である請求の範囲２２記載の 方法。
25. ２５．主結合対の要素が、相補ポリヌクレオチドである請求の範囲２２記載の方 法。
26. ２６．主結合対の要素が、ウイルス粒子である請求の範囲２２記載の方法。
27. ２７．インビトロの核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて２つの相補核 酸配列間のハイブリダイゼーション速度を促進する方法であって、（ａ）ハイブ リダイゼーション反応混合物中の２つの相補核酸配列を核酸ハイブリダイゼーシ ョンが可能な条件でハイブリダイズする工程、この際、該反応混合物は核酸：ｈ ｎＲＮＰ／核酸：ｈｎＲＮＰ相互作用が可能なカルボキシ末端を有する異種核リ ボ核蛋白質（ｈｎＲＮＰ）を含み、該リボ核蛋白質は、ハイブリダイゼーション 速度を、該リボ核蛋白質が存在しないときのハイブリダイゼーション速度よりも 大幅に促進するのに十分な量で存在し、及び（ｂ）２つの相補核酸配列のハイブ リダイゼーションを検出する工程を含み、ただし、検出される核酸配列のいずれ もが、ポリリボウリジル酸ではない上記方法。
28. ２８．リボ核蛋白質が、Ａ１コア蛋白質である請求の範囲２７記載の方法。
29. ２９．酵素反応における主結合対の要素の会合速度定数を促進する方法であって 、（ａ）ポリマーを前記酵素に結合する工程、ただし、該ポリマーは基質に高確 率で結合し、該ポリマーと基質は該酵素と基質のｋａよりも大きなｋａを有して おり、 （ｂ）これらの要素を主結合対の要素間で結合が可能となるような条件で水溶液 中に置く工程、を含む方法。
30. ３０．酵素がヌクレアーゼである請求の範囲２９記載の方法。
31. ３１．酵素がプロテアーゼである請求の範囲２９記載の方法。
32. ３２．ポリマーと基質がイオン結合を介して結合している請求の範囲２９記載の 方法。
33. ３３．ポリマーと基質が疏水性結合を介して結合している請求の範囲２９記載の 方法。
34. ３４．目的の核酸とプローブ核酸を含む高温核酸ハイブリダイゼーションアッセ イを実施する方法であって、 （ａ）約４５℃又はそれ以上の温度で、核酸ハイブリダイゼーションが可能な条 件で、ハイブリダイゼーション反応混合物中の２つの相補核酸配列をハイブリダ イズする工程、ただし、この反応混合物は、一本鎖核酸結合性化合物を含み、該 化合物は、ハイブリダイゼーション速度を、該化合物が存在しない場合のハイブ リダイゼーション速度よりも大幅に促進するのに十分な量で存在し、目的の核酸 に対するプローブ核酸の数は１：１の比に近づくことはなく、 （ｂ）２つの相補核酸配列のハイブリダイゼーションを検出する工程、を含む上 記方法。
35. ３５．一本鎖核酸結合性化合物が疏水性ドメインを有するカチオン性化合物であ る請求の範囲３４記載の方法。
36. ３６．一本鎖核酸結合性化合物が疏水性ドメインを有するカチオン性洗剤である 請求の範囲３５記載の方法。
37. ３７．一本鎖核酸結合性化合物が異種核リボ核蛋白質である請求の範囲３４記載 の方法。
38. ３８．主結合対の要素間の結合を検出するためのキットであって、主結合対の少 なくとも１つの要素を含む区画と、副結合対の要素を含む区画とを含む上記キッ ト。
39. ３９．主結合対が核酸である請求の範囲３８記載のキット。
40. ４０．キット中の主結合対の要素が抗体である請求の範囲３８記載のキット。
41. ４１．キット中の主結合対の要素がリポーターでラベルされている請求の範囲３ ８記載のキット。