JP2003517285A

JP2003517285A - 核酸中のミスマッチおよび変異の検出方法および修飾方法

Info

Publication number: JP2003517285A
Application number: JP2000612745A
Authority: JP
Inventors: 雅式後藤; ウィッティア，ロバート・エフ
Original assignee: アマシャムバイオサイエンス株式会社
Priority date: 1999-04-19
Filing date: 2000-04-19
Publication date: 2003-05-27
Also published as: CA2369470A1; JP2000300265A; DE60007990D1; WO2000063691A2; DE60007990T2; AU3982900A; WO2000063691A3; AU773590B2; EP1192273A2; ATE258606T1; EP1192273B1

Abstract

(57)【要約】この発明の目的は、MutMタンパク質を用いて核酸中のミスマッチまたは変異を効率よく検出する方法およびMutMタンパク質を用いてミスマッチを有する核酸を効率よく分離する方法を提供することである。MutMタンパク質が、核酸中のシトシンを含む全てのミスマッチに対して認識能力を有することを見出した。このMutMタンパク質の性質を利用して、２本鎖核酸中のミスマッチを効率的に検出することができること、および、２本鎖核酸試料からミスマッチを有する２本鎖核酸を分離することができることを見出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、MutMタンパク質を用いる、２本鎖核酸中のミスマッチ検出方法およ
び変異を有する核酸の検出方法、並びにミスマッチを有する２本鎖核酸の分離方
法に関する。

【０００２】背景技術大腸菌MutSは、ミスマッチを認識、結合するタンパク質である（S-S Su et al
., J. Biol. Chem., 263, 6829-6835 (1988)）。近年、MutSを用いたミスマッチ
検出、遺伝子診断法が開発されている（M. Gotoh et al., Genet. Anal., 14, 4
7-50 (1997)）。MutSはミスマッチ塩基（ｂａｓｅｍｉｓｍａｔｃｈ）の種類
によって結合の強さが異なることが知られている。特に、ピリミジン−ピリミジ
ンのミスマッチに対する結合は弱い（M. Gotoh et al., Genet. Anal., 14, 47-
50 (1997)）。よって、遺伝子診断に応用した場合、変異を見落とす可能性が大
きかった。

【０００３】一方、大腸菌MutMはグアニン/シトシン→チミン/アデニンのトランスバージョ
ン変異（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎｍｕｔａｔｉｏｎ）を抑制するタンパク質
である（M. Cabrera et al., J. Bacteriol., 170, 5405-5407 (1988)）。この
ようなトランスバージョン変異の抑制は、大腸菌MutMがDNA中の酸化された塩基
である8-オキソグアニンとシトシンのミスペアを認識し、除去することにより行
なわれている（M. L. Michaels et al., Biochemistry, 31, 10964-10968 (1992
)）。ミスマッチの生じた塩基対（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄｂａｓｅｐａｉｒ）に
おける開裂（ｃｌｅａｖａｇｅ）に関しては、セロリ（ｃｅｌｅｒｙ）ヌクレア
ーゼＣＥＬＩ（Ｃ．Ａ．Ｏｌｅｙｌｏｗｓｋｉｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２６，４５９７−４６０２（１９９８））および
Ｔ４ファージエンドヌクレアーゼＶＩＩ（Ｒ．Ｙｏｕｉｌｅｔａｌ．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，８９−９１（１９９５））
がミスマッチを開裂する（ｃｌｅａｖｅ）ことが知られている。これらはほとん
どすべてのミスマッチを開裂するので、違う種類の塩基対ミスマッチ（ｂａｓｅ
ｐａｉｒｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）の間における識別力はかなり低い。

【０００４】発明が解決しようとする課題本発明の目的は、（１）核酸中のミスマッチまたは変異を効率よく検出する方
法、（２）ミスマッチの存在または不存在に基づき、核酸分子の集団（ｐｏｐｕ
ｌａｔｉｏｎ）を効率よく分離する方法、および（３）ミスマッチを有する核酸
を効率よく修飾する（ｍｏｄｉｆｙ）方法であって、３つのすべての方法におい
てＭｕｔＭを使用する方法を提供することである。特に、本発明の方法は従来の
MutSタンパク質を利用した方法では困難であった、ピリミジン同士のミスマッチ
を効率よく検出することを可能にするものである。また、本発明は、ミスマッチ
の存在または不存在に基づき核酸を分離する方法およびそのようなミスマッチで
核酸を修飾する方法をも提供する。

【０００５】一つの態様として、本発明は、MutMタンパク質によるミスマッチの認識能力を
利用した遺伝子診断方法、DNA増幅産物の精製方法および変異核酸の識別方法を
提供する。

【０００６】

【課題を解決するための手段】

本発明者らは、大腸菌MutMタンパク質のDNA中におけるミスマッチ認識能力に
つき鋭意検討を行った結果、該MutMタンパク質が、シトシンを含む全ての種類の
ミスマッチに対して認識能力を有することを見出した（図１）。さらに、１つの
ミスマッチのみならず、複数の連続したミスマッチに対しても、MutMタンパク質
が結合することを見出した（図２）。また、1塩基対1塩基のミスマッチのみなら
ず、2本鎖核酸の片側の鎖にさらに複数の塩基が挿入された形態である、1塩基対
複数塩基のミスマッチに対しても、MutMタンパク質は結合することが判明した（
図３）。そして、2本鎖核酸の片側の鎖に１または複数の塩基の欠失または挿入
によって生じるミスマッチに対しても、MutMタンパク質が結合することを見出し
た（図４）。

【０００７】さらに、本発明者らは、大腸菌MutMタンパク質を用いて、ポリメラーゼ連鎖反
応産物中からミスマッチを含むDNAとミスマッチを含まないDNAとを分離すること
に成功した。即ち、本発明者らは、MutMタンパク質を用いて、DNA中のミスマッ
チの検出やミスマッチを有するDNAの分離を行うことが可能であることを見出し
た。

【０００８】さらに、本発明者らは、このようなMutMタンパク質の能力を遺伝子診断などへ
応用しうることを見出した。さらに、本発明者らは、２本鎖核酸をミスマッチにおいて開裂することに成功
した。即ち、本発明者らは、２本鎖核酸試料から２本鎖核酸を分離することおよ
び２本鎖核酸をミスマッチにおいて修飾することが可能であることを見出した。

【０００９】即ち、本発明は、MutMタンパク質を用いた２本鎖核酸中のミスマッチの検出方
法および変異を有する核酸の検出方法、並びにMutMタンパク質を用いたミスマッ
チを有する２本鎖核酸の分離方法および変異を有する核酸の分離方法に関する。
より具体的には、本発明は、（１）２本鎖核酸中のミスマッチを検出する方法であって、（ａ）被検２本鎖核酸をMutMタンパク質に接触させること、および（ｂ）該２本鎖核酸と該タンパク質との結合を検出すること、を含む方法；（２） MutMタンパク質が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来である、（１）に記載の
方法；（３）被検２本鎖核酸が支持体に結合しているかまたは支持体に結合可能に標
識されている、（１）または（２）に記載の方法；（４） MutMタンパク質が支持体に結合しているかまたは支持体に結合可能に標
識されている、（１）または（２）に記載の方法；（５）被検２本鎖核酸が検出可能に標識されている、（１）、（２）または（
４）に記載の方法；（６） MutMタンパク質が検出可能に標識されている、（１）から（３）のいず
れかに記載の方法；（７）核酸中の変異を検出する方法であって、（ａ）被検核酸および対照核酸を提供すること、（ｂ）該被検核酸と対照核酸をハイブリダイズさせること、（ｃ）ハイブリダイズにより形成した２本鎖核酸をMutMタンパク質に接触させ
ること、および（ｄ）該２本鎖核酸中のヘテロ2本鎖核酸（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘｎｕ
ｃｌｅｉｃａｃｉｄ）と該タンパク質との複合体を検出すること、を含む方法
；（８） MutMタンパク質が大腸菌由来である、（７）に記載の方法；（９）被検核酸または対照核酸が支持体に結合しているかまたは支持体に結合
可能に標識されている、（７）または（８）に記載の方法；（１０） MutMタンパク質が支持体に結合しているかまたは支持体に結合可能に
標識されている、（７）または（８）に記載の方法；（１１）被検核酸または対照核酸が検出可能に標識されている、（７）、（８
）または（１０）に記載の方法；（１２） MutMタンパク質が検出可能に標識されている、（７）から（９）のい
ずれかに記載の方法；（１３） 2本鎖核酸試料からミスマッチを含む2本鎖核酸を分離する方法であっ
て、（ａ） 2本鎖核酸試料をMutMタンパク質に接触させること、および（ｂ） 2本鎖核酸試料からMutMタンパク質と複合体を形成する2本鎖核酸を回収
すること、を含む方法；（１４） 2本鎖核酸試料からミスマッチを含まない2本鎖核酸を分離する方法で
あって、（ａ） 2本鎖核酸試料をMutMタンパク質に接触させること、および（ｂ） 2本鎖核酸試料からMutMタンパク質と結合しない2本鎖核酸を回収するこ
と、を含む方法、（１５） MutMタンパク質が大腸菌由来である、（１３）または（１４）に記載
の方法；（１６）２本鎖核酸がDNA増幅産物である、（１３）から（１５）のいずれか
に記載の方法、（１７） MutMタンパク質が支持体に結合しているかまたは支持体に結合可能に
標識されている、（１３）から（１６）のいずれかに記載の方法、に関する。

【００１０】本発明において「ミスマッチ」とは、アデニン（A）、グアニン(G)、シトシン
（C）、チミン（T）（RNAの場合はウラシル（U））から選択される一組の塩基対
が正常な塩基対（A／TまたはG／C）ではないことを指す。本発明において「ミス
マッチ」には、1つのミスマッチのみならず、複数の連続したミスマッチ、1また
は複数の塩基の挿入および／または欠失により生じるミスマッチ、ならびにそれ
らの組み合わせが含まれる。

【００１１】本発明において「変異」とは、対照核酸と比較した場合における被検核酸中の
異なる塩基（２本鎖核酸の場合には塩基対）を指す。したがって、この「変異」
の定義には、多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）（天然の集団（ｎａｔｕｒａ
ｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）において１％より大きい頻度で生ずる特異的な配
列変異型（ｓｅｑｕｅｎｃｅｖａｒｉａｎｔｓ）も含まれる。

【００１２】本発明において「核酸」とは、DNAおよびRNA、例えば、cDNA、ゲノムDNA、mRN
A、または合成ポリヌクレオチドを含む。また、本発明において「核酸」とは、
１本鎖核酸および２本鎖核酸、並びに直鎖状核酸および環状核酸をも含む。

【００１３】本発明において「対照核酸」とは、変異を有しない核酸を指す。塩基配列中に
天然の多型が存在する場合には、最も一般的な配列変異型が参照用として選択さ
れる。「被検核酸」とは、対照核酸と異なる塩基（変異）を有することが疑われ
る核酸を指す。被検核酸は、変異を有しなければ対照核酸と同一の核酸である。
即ち、「被検核酸」は変異を有すれば、該変異部位のみにおいて対照核酸と異な
る核酸である。例えば、遺伝子病が疑われる患者の遺伝子における変異を検出す
る場合において、変異を有することが疑われる患者の遺伝子は被検核酸であり、
この遺伝子に対応する健常者の遺伝子は対照核酸である。

【００１４】また、本発明において「ヘテロ２本鎖核酸」とは、実質的には相補的な２本鎖
核酸であるが、１または複数のミスマッチを有することにより非相補的な領域を
含んでいる２本鎖核酸を指す。「被検核酸」は対照核酸と試料核酸を一緒に融解
しアニーリング（ｒｅ−ａｎｎｅａｌｉｎｇ）することによって形成され、その
結果、対照核酸および試料核酸から各々由来する１本鎖よりなる２本鎖核酸分子
が生成する。したがって、もし試料核酸が変異を含む場合は、それから誘導され
る被検核酸はヘテロ２本鎖核酸を含むことになる。

【００１５】

【発明の実施の形態】

本発明は、第一に、MutMタンパク質を利用した２本鎖核酸中のミスマッチを検
出する方法に関する。本発明の方法は、２本鎖中のミスマッチに対するMutMタン
パク質の認識能力を利用する。この方法において、ミスマッチはMutMタンパク質
の被検２本鎖核酸への結合によって検出される。従って、本発明の方法は、（ａ
）被検２本鎖核酸をMutMタンパク質に接触させること、および（ｂ）該２本鎖核
酸と該タンパク質との結合を検出すること、を含む。

【００１６】本発明の方法は、シトシンを含むミスマッチ塩基対（C／A、C／T、C／C）の検
出に特に好適である。また、本発明の方法は、複数の連続したミスマッチの検出
や、1塩基対複数塩基間のミスマッチ、さらには2本鎖核酸の少なくとも片側の鎖
における１または複数の塩基の欠失および／または挿入によって生じるミスマッ
チの検出にも好適に適用することができる。特に本発明の方法は、シトシンを含
むミスマッチの検出に好適に用いられうる。

【００１７】本発明の方法に用いられる「MutMタンパク質」としては、大腸菌由来のMutMタ
ンパク質が好適である。しかし、２本鎖核酸中のミスマッチを認識しうる限りそ
の由来に制限はない。現在までに知られている大腸菌以外のMutMホモログタンパ
ク質としては、酵母Ogg1およびOgg2 （P.A. van der Kemp et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 93, 5197-5202 (1996)）、マウスOgg1（T.A. Rosenquist et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7429-7434 (1997)）、サーマス・サー
モフィラス（Thermus thermophilus）MutM（T. Mikawa et al., Nucleic Acids
Res. 26, 903-910 (1998)）、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thalian
a）AtMMH1 および AtMMH2（T. Ohtsubo et al., Mol. Gen. Genet., 259, 577-5
90 (1998)）、ヒトOgg1（K. Arai et al., Oncogene, 14, 2857-2861 (1997)）
等が知られている。また、２本鎖核酸中のミスマッチを認識しうる限り、これら
タンパク質の部分ペプチドを使用することもできる。

【００１８】また、２本鎖核酸中のミスマッチを認識しうる限り、天然型のタンパク質のア
ミノ酸配列中、１つ若しくは複数のアミノ酸を置換、欠失、付加、および／また
は挿入を行うことによって生じるタンパク質（変異体）を使用することができる
。このような変異体は、自然界において生じることもあるが、人為的に調製する
ことも可能である。タンパク質にアミノ酸変異を導入する方法としては、多くの
方法が周知である。例えば、部位特異的変異導入法として W.P. DengとJ.A. Nic
koloffの方法（Anal. Biochem., 200, 81 (1992)）や、K.L. MakamayaとF. Ecks
teinの方法（Nucleic Adids Res., 14, 9679-9698 (1986)）、ランダム変異導入
法としては、基本的な修復系を欠損した大腸菌 XL1-Red 株（Stratagene社）を
用いる方法、亜硝酸ナトリウム等を用い化学的に塩基を修飾する方法（J.-J. Di
az et al., BioTechnique, 11, 204-211 (1991)）等が知られている。

【００１９】また、MutMタンパク質はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等、他のタン
パク質との融合タンパク質等であってもよい。

【００２０】 MutMタンパク質は、天然のタンパク質として、または組換えタンパク質として
、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、ゲル濾過カラムクロマトグラフィ
ー、硫酸アンモニウム分画等を組み合わせた公知の方法（S. Boiteux et al., E
MBO J., 6, 3177-3183 (1987)）により調製することが可能である。また、組換
えタンパク質で発現量が多い場合には、陽イオン交換カラムおよびゲル濾過カラ
ムを用いたクロマトグラフィーのみにより容易に調製することも可能である。

【００２１】本発明における２本鎖核酸としては、ミスマッチを有するか否かを検出したい
所望の２本鎖核酸を用いることが可能である。２本鎖核酸は、２本鎖DNA、２本
鎖RNA、またはDNA／RNAのいずれであってもよい。２本鎖核酸は、直接検査に用
いることもできれば、ファージやプラスミドを含むベクターで増幅されたものを
用いてもよい。また、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）等で増幅された２本鎖核酸
を用いることもできる。

【００２２】本発明の方法における被検２本鎖核酸とMutMタンパク質との接触は、該タンパ
ク質が被検２本鎖核酸中のミスマッチ領域に結合しうる条件（例えば、適当なpH
、溶媒、イオン環境、温度）で行なうことができる。例えば、バッファーの組成
の例として、50 mM Hepes-KOH (pH 7.2), 100 mM KCl, 1 mM EDTA, および1 mM
DTTが挙げられる。温度は、例えば25℃、反応時間は、例えば約1分〜10分程度で
行うことができる。上記の条件は単なる例にすぎず、反応温度や塩濃度、イオン
の種類、バッファーのpH等の詳細な条件は適宜選択することができる。

【００２３】２本鎖核酸を形成させる過程で１本鎖核酸が残っていると予想される場合には
、例えばMicroSpin S-300 HR カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社
）を用いて１本鎖核酸を除去するか、または予め大腸菌SSBタンパク質などで１
本鎖核酸をブロックする必要がある。

【００２４】被検２本鎖核酸とMutMタンパク質との結合を検出するための方法には、特に制
限はない。例えば、以下のような検出系が考えられる。

【００２５】（１）被検２本鎖核酸を支持体に固定、または支持体に固定可能に標識し、Mu
tMタンパク質は標識せずに使用する。核酸を支持体に固定可能に標識するには、
互いに親和性を有する物質の一方を核酸へ、他の一方を支持体に結合させればよ
い。このような物質としては、例えば、ビオチン−アビジン系、抗体−抗原系（
抗ジゴキシゲニン抗体（ａｎｔｉ−ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ
）およびシゴキシゲニンなど）を用いればよい。例えば、水晶発振子や表面プラ
ズモン共鳴、多孔質シリコンを利用したセンサーを有する検出系を用いて直接Mu
tMタンパク質を検出することができる。支持体の例としては、水晶発振子上の金
や表面プラズモンセンサーの検出素子上の金、多孔質シリコンセンサーが挙げら
れる。物質は支持体上に直接、またはデキストラン等のマトリックスを介して固
定することができる（K. Bondeson et al., FEBS Letter, 423, 307-313 (1993)
）。

【００２６】（２）被検２本鎖核酸を支持体に固定、または支持体に固定可能に標識する。
MutMタンパク質を該被検２本鎖核酸と反応後、該核酸と結合しなかったMutMタン
パク質を除去し、次いで残ったMutMタンパク質を検出する。核酸を支持体に固定
可能にするためには、ビオチンや、抗体で認識され得る化合物を用いて標識する
ことができる。MutMタンパク質は、例えば³⁵S、³H等の放射線標識、FITC等の蛍
光物質、ビオチン、またはFITC等抗体で認識され得る化合物を含む検出可能な化
合物で標識してもよい。また、MutMタンパク質に対する抗体を用いれば、MutMタ
ンパク質を標識しなくても検出することが可能である。抗体とMutMタンパク質と
の複合体に対し、さらに別の抗体を結合させて該複合体を検出することも可能で
ある。抗体は、アルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダー
ゼ（HRP)、またはβ-ガラクトシダーゼ等が結合したものを用いることができる
。このような場合、検出は、アルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュペ
ルオキシダーゼ（HRP)、β-ガラクトシダーゼなどの活性を利用した公知の発色
法または化学発光法により行うことができる。放射性物質や蛍光物質による標識
は直接検出が可能である。支持体としては、メンブレンフィルター、マイクロタ
イタープレート、クロマトグラフィー担体、磁気ビーズ等の固液分離可能な任意
の支持体を使用することができる。ビオチンを検出すべき場合は、アビジンまた
はストレプトアビジンを支持体に固定化させる。抗体で認識されうる化合物を検
出すべき場合は、抗体を支持体に固定化させる。抗体の固定化は、物理的な吸着
や架橋剤を用いる化学的な結合により、直接的にまたはプロテインAやプロテイ
ンGを介して行うことができる。

【００２７】（３）被検２本鎖核酸を検出可能に標識し、MutMタンパク質は支持体に固定化
、または支持体に固定可能に標識して使用する。核酸は、³⁵Sや³²P等の放射性物
質、FITCやCy5等の蛍光物質、HRP等の酵素、またはアビジン若しくはストレプト
アビジンで検出可能なビオチンあるいは抗体で検出可能なFITC若しくはジゴキシ
ゲニンのような化合物により標識することが可能である。MutMタンパク質は物理
的な吸着や化学的な架橋剤により直接支持体に固定化することができる。また、
ビオチンまたは抗体で認識可能な化合物（抗原）を用いて標識しておき、ビオチ
ンであればアビジンやストレプトアビジン、抗原であれば抗体等を介して支持体
に固定することができる。また、MutMのN−末端側、あるいはC−末端側に短いヒ
スチジン残基のタグを付け、当該タグのキレート作用を利用して、金属を介して
固定化することができる。検出系および用いられる支持体は、上記（２）と同様
である。

【００２８】（４）被検２本鎖核酸は、MutMタンパク質を標識せずに検出可能に標識する。
抗MutM抗体を用いて免疫沈降などによって固液分離を行う。MutMタンパク質に対
する抗体は、ビーズ等の支持体に結合させたプロテインAやプロテインGを介して
固定化することができる。核酸は、（３）に記載したようにして標識することが
できる。また、検出系および用いられる支持体は、上記（２）と同様である。

【００２９】（５）被検２本鎖核酸は標識せず、また、MutMタンパク質は支持体に固定、ま
たは支持体に固定可能に標識する。支持体へ固定可能な標識物質は、（３）と同
様である。２本鎖核酸は、（１）と同様に、例えば水晶発振子、表面プラズモン
共鳴、または多孔質シリコンを利用したセンサーで直接検出することができる。
支持体は（１）と同様である。タンパク質は、I. Chaikenの方法（Anal. Bioche
m., 201, 197-210 (1992)）によって表面プラズモン共鳴センサーの検出素子へ
固定法することができる。

【００３０】被検２本鎖核酸とMutMタンパク質との有意な結合が検出されれば、該２本鎖核
酸中にミスマッチが存在すると判定され、一方、被検２本鎖核酸とMutMタンパク
質との有意な結合が検出されなければ、該２本鎖核酸中にミスマッチは存在しな
いと判定される。

【００３１】本発明のミスマッチの検出方法は、ミスマッチの定量も含まれる。例えば、標
識したタンパク質や抗体を用いてミスマッチを有する核酸に結合したMutMタンパ
ク質量を測定することにより、核酸試料中に存在するミスマッチの量を決定する
ことが可能である。また、核酸試料全体を標識し、MutMタンパク質を結合させ、
核酸試料全体に占める複合体を形成した核酸の割合を測定することで、試料中に
存在するミスマッチDNAの割合を決定することも可能である。

【００３２】また、本発明は、MutMタンパク質を利用した核酸中の変異を検出する方法に関
する。この検出方法は、一つの態様として、患者由来の遺伝子と健常者の遺伝子
が同一の塩基配列を有するか否かを調べることによって、遺伝子病が疑われる患
者の特定の遺伝子が変異を有するか否かを調べるために利用することができる。
本発明の方法は、被検遺伝子中のいかなる位置に変異が存在しても検出すること
が可能である。また、本発明の方法は、遺伝子の変異部位や変異の種類が既知で
ある必要はない点でも優れている。

【００３３】この検出方法の原理は、以下の如くである。変異を有することが疑われる被検
核酸と対照核酸（変異を有しない核酸）とを調製し、これらを互いにハイブリダ
イズさせる。もし被検核酸が変異を有すれば、対照核酸とのハイブリダイズによ
りヘテロ２本鎖核酸（１個または複数個のミスマッチを有する核酸）が生じる。
一方、被検核酸に変異がなければ、ホモ２本鎖核酸のみが生じ、ヘテロ２本鎖核
酸は生じない。ハイブリダイズにより形成された２本鎖核酸に対し、MutMタンパ
ク質を接触させた場合、MutMタンパク質はミスマッチを有するヘテロ２本鎖核酸
には結合するが、ホモ２本鎖核酸には結合しない。従って、このMutMタンパク質
の２本鎖核酸への結合を検出することにより、被検核酸が変異を有するか否かを
判定できる。

【００３４】より具体的には、本発明の検出方法は、（ａ）被検核酸および対照核酸を提供すること、（ｂ）該被検核酸と対照核酸をハイブリダイズさせること、（ｃ）ハイブリダイズにより形成した２本鎖核酸をMutMタンパク質に接触させ
ること、および（ｄ）該２本鎖核酸中のヘテロ2本鎖核酸と該タンパク質との複合体を検出す
ること、を含む。

【００３５】用いられる被検核酸としては、特に制限はなく、変異を有するか否かを検出し
たい所望の核酸を用いることができる。対照核酸は、被検核酸に対応する核酸で
ある。換言すれば、もし被検核酸が変異を有しなければ、それは対照核酸と同一
の核酸である。この「同一」とは、両者が互いにハイブリダイズする領域内にお
いて同一であることを意味する。長さは相違してもよいが、可能であれば同一で
あることが望ましい。被検核酸および対照核酸は、１本鎖であっても２本鎖であ
ってもよい。両者が１本鎖の場合には、仮に被検核酸が変異を有しなければ、互
いに相補的である。

【００３６】本発明の方法においては、被検核酸と対照核酸をハイブリダイズさせる（もし
、これらが２本鎖である場合は、変性して一本鎖に解離させて、両者をハイブリ
ダイズさせる）。こうすることににより、２本鎖核酸を形成させる（もし被検核
酸に変異がある場合には、ヘテロ２本鎖核酸とホモ２本鎖核酸が形成され、もし
被検核酸に変異がない場合には、ホモ２本鎖核酸のみが形成される）。

【００３７】２本鎖核酸は、溶液のpHを酸性またはアルカリ性にすること、または溶液を高
温にすることにより変性することができる。pHを変化させる方法としては、例え
ば 0.1M NaOH、0.1M HCl溶液に置換する方法が挙げられる。また、温度を上げる
方法は、核酸の融解温度（Tm）以上にすればよいが、通常、95℃程度が用いられ
る。

【００３８】ハイブリダイズは、溶液のpHを中性に戻すこと、または温度を徐々に下げ Tm
以下にすることにより容易に行うことができる。例えば、２００塩基対の核酸の
場合、6×SSC溶液（90mM クエン酸ナトリウム（pH 7.2）, 0.9M NaCl）中で、被
検核酸と対照核酸を等モル数、またはどちらかの核酸を過剰に添加し、一度温度
を95℃に加温後、30分から2時間程度の時間をかけ徐々に室温まで冷やす。その
後、ハイブリダイズしなかった１本鎖核酸を除去する場合には、MicroSpin S-30
0 HRカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社）等で処理する。

【００３９】次いで、ハイブリダイズにより形成された２本鎖核酸をMutMタンパク質に接触
させる。用いられるMutMタンパク質は、上記ミスマッチの検出方法の場合と同様
である。次いで、該２本酸核酸とMutMタンパク質との結合を、前記の被検２本鎖
核酸とMutMタンパク質との結合の検出と同様にして検出する。

【００４０】検出系の例は前記と同様である。但し、核酸を支持体に固定または支持体に固
定可能に標識する場合、被検核酸を固定または標識してもよければ、対照核酸を
固定または標識してもよい。また、核酸を検出可能に標識する場合も、被検核酸
を標識するか、対照核酸を標識するかは問わない。

【００４１】この結果、ハイブリダイズにより形成した２本鎖核酸とMutMタンパク質との有
意な結合が検出されれば被検核酸中に変異が存在すると判定される。一方、２本
鎖核酸とMutMタンパク質との有意な結合が検出されなければ被検核酸中に変異が
存在しないと判定される。

【００４２】また、本発明は、MutMを利用した、2本鎖核酸試料からミスマッチを含む2本鎖
核酸またはミスマッチを含まない2本鎖核酸を分離する方法に関する。本発明の
方法の原理は以下の如くである。まず、ヘテロ２本鎖核酸を含むことが予想され
る２本鎖核酸試料を調製し、MutMタンパク質をこの試料に接触させる。MutMタン
パク質は、２本鎖核酸試料中のヘテロ２本鎖核酸にのみ結合するため、MutMタン
パク質を接触させた２本鎖核酸試料からMutMタンパク質を回収すれば、該タンパ
ク質に結合しているヘテロ２本鎖核酸も回収される。２本鎖核酸試料中からMutM
タンパク質およびこのタンパク質に結合する２本鎖核酸を除去することにより、
ホモ２本鎖核酸を回収することができる。

【００４３】より具体的には、本発明のミスマッチを含む2本鎖核酸の分離方法は、（ａ） 2本鎖核酸試料をMutMタンパク質に接触させること、および（ｂ） 2本鎖核酸試料からMutMタンパク質と複合体を形成する2本鎖核酸を回収
すること、を含む。

【００４４】一方、本発明のミスマッチを含まない2本鎖核酸の分離方法は、（ａ） 2本鎖核酸試料をMutMタンパク質に接触させること、および（ｂ） 2本鎖核酸試料からMutMタンパク質と結合しない2本鎖核酸を回収するこ
と、を含む。

【００４５】上記の方法において、必要に応じて工程（ａ）および（ｂ）を数回繰り返すこ
とにより、精製度を上昇させることもできる。 MutMタンパク質による被検２本鎖核酸の開裂を検出する方法は限定されない。
該検出系の１例は下記の通りである。（１）一方または両方の鎖（ｓｔｒａｎｄ）に蛍光色素または放射性同位元素
で標識した被検２本鎖核酸をMutMタンパク質によって開裂する。開裂した核酸を
変性条件下でマトリックス（ｍａｔｒｉｘ）によって電気泳動に付すと、ＤＮＡ
シーケンサー（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）におけると同様に、個々の鎖はその長さに
従って分離する。もし核酸の量が十分である場合は、非標識核酸を電気泳動のた
めに使用して、銀若しくはエチジウムブロミド（ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉ
ｄｅ）を用いる染色法によって検出することができる。（２）被検２本鎖核酸を支持体に固定、または支持体に固定可能に標識し、Mu
tMタンパク質を用いて該核酸中のミスマッチを開裂する。次に、試料の温度をゆ
っくり上昇させ、該２本鎖核酸を変性しかつ非固定化鎖を溶出させる。開裂した
核酸のような短い２本鎖核酸の融解温度は、より長い非開裂核酸の融解温度より
も低い。即ち、ミスマッチを有する２本鎖核酸の開裂した鎖がまず溶出し、一方
でミスマッチを有していない非開裂鎖は後で溶出するので、これらの核酸を効率
的に分離できる。感度を上げるために、ＦＩＴＣにような蛍光物質または³⁵Ｓ若
しくは³²Ｐのような放射性物質を使用することができる。あるいは、ホルムアミ
ドのような有機溶媒を利用して該２本鎖核酸を変性することもできる。被検２本鎖核酸からミスマッチを有していない２本鎖核酸をMutMタンパク質に
よって分離する方法は特に限定されない。該分離方法の１例は下記の通りである
。被検２本鎖核酸をMutMタンパク質で処理し、ミスマッチのある一方若しくは他
方の鎖に単一ヌクレオチドギャップ（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｇ
ａｐｓ）を導入し、次いで、Ｓ１ヌクレアーゼのようなヌクレアーゼを用いてそ
のような導入ギャップの反対側の無傷の鎖を開裂する。このようにして、これら
の２つの酵素のシーケンシャルアクション（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌａｃｔｉｏ
ｎ）によって、ミスマッチの部位は完全な２本鎖開裂（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａ
ｎｄｅｄｃｌｅａｖａｇｅｓ）となる。シーケンス処理された２本鎖核酸をポ
リメラーゼ連鎖反応用の鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として使用すると、非開裂配
列のみが増幅される。ミスマッチを有する２本鎖核酸をMutMタンパク質によって修飾する方法は特に
限定されない。該修飾方法の１例は下記の通りである。２本鎖核酸をMutMタンパク質で処理する。通常、開裂はミスマッチのある一方
の鎖に生じる。次いで、適当に標識されたヌクレオチド三リン酸ＤＮＡポリメラ
ーゼＩでニックトランスレーション反応（ｎｉｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うと、３２Ｐのような放射性物質、Ｃｙ５のような蛍光
物質またはビオチンのような親和性標識試薬（ａｆｆｉｎｉｔｙｌａｂｅｌ）
を、当初はミスマッチによって占められていた該２本鎖核酸の部位およびその付
近の部位に組み込むことができる。

【００４６】これらの方法は、種々の遺伝子クローニングに有用である。ミスマッチを含む
2本鎖核酸の分離方法は、例えば１塩基多型（single nucleotide polymorphism
；SNP）の回収のために用いることができる。近年、ヒトゲノム解析が進み、遺
伝子の変異と病気との関係を解明するため、世界中で様々なSNP収集が始められ
ている。本発明の方法は、ミスマッチ核酸のみを回収できるため、SNP収集に適
している。ミスマッチを含む2本鎖核酸の分離方法は、また、ある遺伝子のホモ
ログ遺伝子をクローニングするために有用である。例えば、ある生物由来の拘置
の遺伝子のホモログを異なる生物からクローニングしようとする場合、この方法
は、ある程度配列が似ており、かつ部分的に異なる遺伝子を選択することを可能
とする。また、同じ生物であっても、遺伝子配列が似ているが完全に同一ではな
い遺伝子を同じ生物から選択的にクローニングすることが可能である。

【００４７】ミスマッチを含まない2本鎖核酸の分離方法は、DNA増幅産物の精製に有用であ
る。ある遺伝子をクローニングする場合、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増
幅したDNA断片をクローニングベクターに挿入することが多い。このとき、DNAポ
リメラーゼにより、PCR増幅産物に変異が導入されてしまう場合がある。本発明
の方法により、変異の導入されたDNA増幅産物を除去することが可能である。

【００４８】より具体的には、これらの分離を行うには、例えば溶液中でMutMタンパク質と
２本鎖核酸を反応させた後、抗MutM抗体を作用させる。その後、ビーズ等の支持
体に結合したプロテインAまたはプロテインGを作用させ、遠心分離により免疫複
合体を沈降させ、ミスマッチを含まない2本鎖核酸およびミスマッチを含む2本鎖
核酸を、それぞれ上清および沈殿に分離させ回収する。沈殿からミスマッチを含
む2本鎖核酸を精製するには、沈殿を TEバッファー（10mM Tris-HCl（pH 8.0）,
1mM EDTA）に懸濁した後、3倍量の3M グアニジン塩酸を加え、MutMタンパク質
を変性させ、２本鎖核酸を遊離させる。遠心分離後上清をDNA溶液として回収す
る。該溶液に含まれるDNAをクローニングに使用することができる。

【００４９】また、支持体に固定、または固定可能に標識したMutMタンパク質を使用して分
離を行うこともできる。用いられる標識や支持体に制限はない。支持体としては
、例えば液体クロマトグラフィー担体、磁気ビーズ、各種センサーの検出素子等
が考えられる。液体クロマトグラフィー担体としては、HiTrap NHS-activated（
アマシャムファルマシアバイオテク社）、磁気ビーズとしてはDynabeads M-45
0 Uncoated または M450-Tosylated（ダイナル社）、表面プラズモン共鳴センサ
ーの検出素子としてはセンサーチップ CM5（ビアコア社）等が挙げられる。Dyna
beads M-450 Uncoated はMutMタンパク質を物理的に、その他は化学的にそれぞ
れの支持体に結合することが可能である。例えば、HiTrap NHS-activated の場
合、担体である Sepharose のカルボキシル基が N−ヒドロキシスクシンイミド
（NHS)でエステル化されている。1mM HCl のような低い pH の溶液で保存塩基を
置換し、MutMタンパク質溶液を流すと、MutMタンパク質のアミノ酸との間に安定
なアミド結合が形成される。よって、２本鎖核酸と反応させ、ミスマッチを含む
2本鎖核酸のみをトラップさせ、ミスマッチを含まない2本鎖核酸を分離、回収で
きる。MutMタンパク質に結合したミスマッチを含む2本鎖核酸は、3M グアニジン
塩酸でMutMタンパク質を変性させることによって回収することができる。

【００５０】

【実施例】

次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は下記実施例
に限定されるものではない。

【００５１】実施例１配列番号Ｎｏ．１５のオリゴヌクレオチドを配列番号Ｎｏ．１６，Ｎｏ．１７
，Ｎｏ．１８またはＮｏ．１９のオリゴヌクレオチドを個々に用いてアニーリン
グすることによって、Ｃ含有ミスマッチを有する長さが４０塩基対の2本鎖ＤＮ
ＡおよびＣ含有ミスマッチを有しない長さが４０塩基対の2本鎖ＤＮＡを生成し
た。これらの配列は以下の通りであった。Ｎｏ．１５：tgctgagctaatcgacctgtcaagtcatgcgatacgtaac，Ｎｏ．１６：Ｃｙ５−gttacgtatcgcatgacttgacaagtcgattagctcagca，Ｎｏ．１７：Ｃｙ５−gttacgtatcgcatgacttgacacgtcgattagctcagca，Ｎｏ．１８：Ｃｙ５−gttacgtatcgcatgacttgacaggtcgattagctcagca，Ｎｏ．１９：Ｃｙ５−gttacgtatcgcatgacttgacatgtcgattagctcagca 上記2本鎖ＤＮＡをＭｉｃｒｏＳｐｉｎＳ−２００ＨＲカラム（アマシャ
ムファルマシアバイオテク社）を用いて精製し、精製したＤＮＡの濃度を測定
した。2本鎖ＤＮＡ（最終濃度２−１６ｎＭ）およびＭｕｔＭタンパク質（最終
濃度２μＭ）をＫＣｌバッファー中で混合し３７℃で１−３時間インキュベート
した。反応後、自動化ＤＮＡシーケンサー（ａｕｔｏｍａｔｅｄＤＮＡｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｒ）を用いてＤＮＡフラグメントの長さの解析によって開裂活性を
決定した。図５は、フラグメント解析の結果を示す。Ｃ／ＣおよびＣ／Ｔミスマ
ッチはＭｕｔＭによる開裂のための基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）であることがわ
かった。実施例２本実施例では、ミスマッチDNAと大腸菌MutMの結合解析にBIACORE社のアフィニ
ティーセンサーを用いた。合成したビオチン化オリゴヌクレオチド（B-gttggagc
angtggtgttgg／配列番号：１、Bはビオチンを表し、nはA、G、C、またはTを表す
）を、約1,300 RU（1 RUは約1pg/mm²の物質密度に相当する）固定化したセンサ
ーチップSA（BIACORE社）に、6×SSC（90mM クエン酸ナトリウム(pH7.2)、0.9M
塩化ナトリウム）中で第２の合成オリゴヌクレオチド（ccaacaccacntgctccaac／
配列番号：２）をアニーリングした。この過程で、約1,200 RUのオリゴヌクレオ
チドがアニーリングした。残った１本鎖オリゴヌクレオチドを90μg／mlのSSB（
１本鎖DNA結合タンパク質）を流してブロックした。そこに、約400nMの精製した
MutMを流し、各２本鎖オリゴヌクレオチドに対する結合をモニターした。なお、
ランニングバッファーとしてKCｌバッファー（50mM Hepes−KOH（pH7.2）, 100m
M KCl, 1mM EDTA, 1mM DTT, 5mM MgCl₂）を使用し、25℃で全ての操作を行った
。

【００５２】その結果を図１に示す。A)はAとA、C、またはGのミスマッチおよびA/T相補２
本鎖に対するMutMの相互作用、B)はCとA、C、またはTのミスマッチおよびC/G相
補２本鎖に対するMutMの相互作用、C）はGとA、G、またはTのミスマッチおよびG
／C相補２本鎖に対するMutMの相互作用、D）はTとC、G、またはTのミスマッチお
よびT／A相補２本鎖に対するMutMの相互作用を示している。図では25秒から1分
間、MutMを流しつづけ、85秒からKClバッファーに切換え非特異的な吸着物を洗
い流した。図から明らかなように、MutMはC／C、C／TおよびT／C、ならびにC／A
およびA／Cに対する強い結合活性を示した。これに対して、A／T、C／G、G／C、
T／Aといった相補２本鎖オリゴヌクレオチドには結合が見られなかった。

【００５３】実施例３本実施例では、大腸菌MutMをDNA増幅産物の精製に使用した。５本のPCR Beads
（アマシャムファルマシアバイオテク社）に各25pmolの２種類のPCRプライマ
ー（GTAGTTGAAGAATTCCTGAATGAGCCATTTATC／配列番号：３; 下線部はEcoRI切断部
位、およびAGCGCCTGCAGCGGGGTGAGTGAATCCGGAT／配列番号：４; 下線部はPstI切
断部位）を添加し、全量25μlになるよう滅菌水を加えた。この溶液に1白金耳の
大腸菌を懸濁し、アニーリング温度55℃で30サイクルのPCR反応を行った。この
反応で870塩基対のDNA断片が増幅された。反応後、25μlのTEバッファー（10mM
Tris−HCl（pH8.0）, 1mM EDTA）を添加し、マイクロスピンカラム（MicroSpin
S-400 HR アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いて未反応プライマー
を除去した。精製したPCR産物溶液50μlに21μlの20×SSCバッファーを添加し、
95℃に加熱し、徐々に温度を下げることによりアニーリングを行った。再度、マ
イクロスピンカラムでアニーリングしなかった１本鎖DNAを除去し、等量の2×KC
lバッファーを添加した後、5本分まとめ、以下に述べるMutM固定化アフィニティ
ーカラムに通した。

【００５４】 HiTrap NHS−活性化カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社）に、プ
ロトコールに従い、100μMのMutM溶液1mlを固定化した。ブロッキング後、KClバ
ッファーを流し平衡化した。このMutM固定化カラムにDNA溶液を通過させた。通
過したDNA溶液を回収し、エタノール沈殿により10μlに濃縮した。制限酵素付属
のOPAバッファー（アマシャムファルマシアバイオテク社）を3μl、制限酵素E
coRIを10ユニット、PstIを10ユニット添加し、滅菌水で全量を20μlにした。37
℃で2時間反応し、予めEcoRIとPstIで切断しておいた100ngの大腸菌ベクターpTr
c99A（アマシャムファルマシアバイオテク社）と混ぜ、エタノール沈殿により
全量を10μlとした。ライゲーション反応により、ベクターとPCR断片を連結し、
大腸菌XL1−Blueに導入した。出現した17株の形質転換体に含まれるベクターの
挿入ＤＮＡ（ＤＮＡｉｎｓｅｒｔ）を増幅するため、最初の反応に用いた同じ
PCRプライマーを使用し、コロニーPCRを行った。

【００５５】挿入DNA中の変異導入効率の評価は、シーケンシングプライマー（Cy5−ACCGGT
CCGAACATGGGCGGTAAA／配列番号：５）を使用し、約３００ｂｐのヌクレオチド配
列を解析することにより行った。その結果、ヌクレオチド配列を解析した17株中
には、変異が導入された挿入ＤＮＡは存在しなかった。

【００５６】実施例４本実施例では、MutMを変異のある遺伝子クローニングに利用した。実施例３で
使用した、DNAを通過させたMutM固定化カラムに1mMの3Ｍグアニジン塩酸を流し
て、結合したＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡフラクションをエタノール沈殿
により10μlに濃縮した後、実施例３と同様の方法でDNAベクターpTrc99Aを形質
転換するために使用した。出現した３株の形質転換体中に含まれるベクターの挿
入DNAのヌクレオチド配列を解析したところ、１株にG→Cの変異が見られた。

【００５７】実施例５本実施例では、連続する異なる長さのミスマッチを有するDNAと大腸菌MutMの
結合解析にアフィニティーセンサーを用いた。合成したビオチン化オリゴヌクレ
オチド（B-tggtggttggagcaggtggtgttgggaaaa／配列番号：６、B-tggtggttggagca c gtggtgttgggaaaa／配列番号：７、B-tggtggttggagcaccgtggtgttgggaaaa／配列
番号：８、B-tggtggttggagcacccgtggtgttgggaaaa／配列番号：９、あるいはB-tg
gtggttggagcaccccgtggtgttgggaaaa／配列番号：１０、Bはビオチンを表し、下線
部はミスマッチを表す）を、約 700RU 固定化したセンサーチップSAに、6xSSC中
で第２のオリゴヌクレオチド（配列番号：６および７に対してはttttcccaacacca
cctgctccaaccacca／配列番号：１１、配列番号：８に対してはttttcccaacaccac cc tgctccaaccacca／配列番号：１２、配列番号：９に対してはttttcccaacaccacc cc tgctccaaccacca／配列番号：１３、配列番号：１０に対してはttttcccaacacca
ccccctgctccaaccacca／配列番号：１４、下線部はミスマッチを表す）をアニー
リングした。ランニングバッファーをKClバッファーにしたのち、精製した200nM
のMutMを流し、実施例２と同様に各２本鎖オリゴヌクレオチドに対する結合をモ
ニターした。温度はすべて25℃で行った。

【００５８】その結果を図２に示す。連続するミスマッチの長さが長くなるにつれて結合す
るMutMの量は減少する傾向は見られたものの、コントロールとして用いた相補２
本鎖に比較し、明らかに高い結合活性を示した。

【００５９】実施例６本実施例では、C／Cミスマッチおよび片側の鎖に数塩基のCが挿入されたDNAと
大腸菌MutMの結合解析にアフィニティーセンサーを用いた。合成したビオチン化
オリゴヌクレオチド（配列番号：７）を、約700RU固定化したセンサーチップSA
に、実施例５と同様の条件で配列番号：１１、１２、１３あるいは１４をアニー
リングし、実施例５と同様の方法でMutMの結合をモニターした。

【００６０】その結果を図３に示す。挿入されたCの数が多くなるにつれて、結合するMutM
の量は減少する傾向は見られたものの、250秒時点でも400RU以上の結合が見られ
、このような変異もMutMにより検出できることが明らかになった。

【００６１】実施例７挿入あるいは欠失変異DNAと大腸菌MutMの結合解析にアフィニティーセンサー
を用いた。合成したビオチン化オリゴヌクレオチド（配列番号：６）を約700RU
固定化したセンサーチップSAに、実施例５と同様の条件で配列番号：１１、１２
、１３あるいは１４をアニーリングし、実施例５と同様の方法でMutMの結合をモ
ニターした。

【００６２】その結果を図４に示す。この場合には、挿入される塩基が少ないほど結合量は
減少する傾向が見られたが、いずれの場合にも、コントロールの相補DNAに比べ
ると高い結合性を示した。

【００６３】

【発明の効果】

本発明により、MutMタンパク質が、核酸中のシトシンを含む全てのミスマッチ
を認識する能力を有することが明らかにされた。このMutMタンパク質の性質を利
用して２本鎖核酸中のミスマッチを効率的に検出することが可能となった。また
、ミスマッチを含まない２本鎖核酸からミスマッチを含む２本鎖核酸を効率的に
分離することが可能となった。

【００６４】本発明の方法によれば、従来のMutSタンパク質を利用した方法では困難であっ
た、ピリミジン同士のミスマッチを効率よく検出し、またこのようなミスマッチ
を有する核酸を分離することが可能である。また、複数の連続したミスマッチの
検出や、1塩基対複数塩基のミスマッチ、さらには2本鎖核酸の片側の鎖に１また
は複数の塩基の欠失または挿入によって生じるミスマッチの検出にも好適に適用
することができる。本発明の方法は、遺伝子診断やDNA増幅産物の精製など幅広
い応用が可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、MutMの結合特性の評価に使用したオリゴヌクレオチドの配列、および
その結果を示す図である。各図とも、左が使用したオリゴヌクレオチドで、２本
鎖のうち上に書かれた配列が固定化したオリゴヌクレオチド、下の配列がアニー
リングした配列を示す。また、配列中の「N」は、A、C、G、またはTのうちいず
れかの塩基を表す。A）はAとNによるミスマッチを含む２本鎖あるいは相補2本鎖
オリゴヌクレオチドに対する結合、B）はCとNによるミスマッチを含む２本鎖あ
るいは相補2本鎖オリゴヌクレオチドに対する結合、C）はGとNによるミスマッチ
を含む２本鎖あるいは相補2本鎖オリゴヌクレオチドに対する結合、D）はTとNに
よるミスマッチを含む２本鎖あるいは相補2本鎖オリゴヌクレオチドに対する結
合を表す。

【図２】図２は、連続する異なる長さのミスマッチを有するＤＮＡに対するＭｕｔＭタ
ンパク質の結合解析の結果を示す図である。ミスマッチを含まないＤＮＡ（Ｇ／
Ｃ）およびＣ／Ｃミスマッチを 1〜4つ連続して含むＤＮＡ（Ｃ／Ｃ，ＣＣ／Ｃ
Ｃ，ＣＣＣ／ＣＣＣ，およびＣＣＣＣ／ＣＣＣＣ）に対するＭｕｔＭの結合を表
す。

【図３】図３は、Ｃ／Ｃミスマッチおよび片側の鎖に数塩基のＣが挿入されたＤＮＡと
MutMタンパク質の結合解析の結果を示す図である。

【図４】図４は、挿入あるいは欠失変異ＤＮＡとＭｕｔＭタンパク質の結合解析の結果
を示す図である。

【図５】図５は、フラグメント解析の結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】２本鎖核酸中のミスマッチを検出する方法であって、（ａ）被検２本鎖核酸をMutMタンパク質に接触させること、および（ｂ）該２本鎖核酸と該タンパク質との結合を検出すること、を含む方法。
【請求項２】 MutMタンパク質が大腸菌由来である、請求項１に記載の方法
。
【請求項３】被検２本鎖核酸が支持体に結合しているかまたは支持体に結
合可能に標識されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】 MutMタンパク質が支持体に結合しているかまたは支持体に結
合可能に標識されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】被検２本鎖核酸が検出可能に標識されている、請求項１、２
または４に記載の方法。
【請求項６】 MutMタンパク質が検出可能に標識されている、請求項１から
３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】核酸中の変異を検出する方法であって、（ａ）被検核酸および対照核酸を提供すること、（ｂ）該被検核酸と対照核酸をハイブリダイズさせること、（ｃ）ハイブリダイズにより形成した２本鎖核酸をMutMタンパク質に接触させ
ること、および（ｄ）該２本鎖核酸中のヘテロ2本鎖核酸と該タンパク質との複合体を検出す
ること、を含む方法。
【請求項８】 MutMタンパク質が大腸菌由来である、請求項７に記載の方法
。
【請求項９】被検核酸または対照核酸が支持体に結合しているかまたは支
持体に結合可能に標識されている、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】 MutMタンパク質が支持体に結合しているかまたは支持体に
結合可能に標識されている、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１１】被検核酸または対照核酸が検出可能に標識されている、請
求項７、８または１０に記載の方法。
【請求項１２】 MutMタンパク質が検出可能に標識されている、請求項７か
ら９のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】 2本鎖核酸試料からミスマッチを含む2本鎖核酸を分離する
方法であって、（ａ） 2本鎖核酸試料をMutMタンパク質に接触させること、および（ｂ） 2本鎖核酸試料からMutMタンパク質と複合体を形成する2本鎖核酸を回収
すること、を含む方法。
【請求項１４】 2本鎖核酸試料からミスマッチを含まない2本鎖核酸を分離
する方法であって、（ａ） 2本鎖核酸試料をMutMタンパク質に接触させること、および（ｂ） 2本鎖核酸試料からMutMタンパク質と結合しない2本鎖核酸を回収するこ
と、を含む方法。
【請求項１５】 MutMタンパク質が大腸菌由来である、請求項１３または１
４に記載の方法。
【請求項１６】２本鎖核酸がDNA増幅産物である、請求項１３から１５の
いずれかに記載の方法。
【請求項１７】 MutMタンパク質が支持体に結合しているかまたは支持体に
結合可能に標識されている、請求項１３から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】 2本鎖核酸中のミスマッチを検出する方法であって、（ａ）被検2本鎖核酸をMutMタンパク質に接触させること、および（ｂ）該2本鎖核酸の開裂を該タンパク質によって検出すること、を含む方法
。
【請求項１９】 2本鎖核酸試料からミスマッチを含まない2本鎖核酸を分離
する方法であって、（ａ） 2本鎖核酸試料をMutMタンパク質に接触させること、および（ｂ） 2本鎖核酸試料からMutMタンパク質によって開裂されない2本鎖核酸を回
収すること、を含む方法。
【請求項２０】ミスマッチを含む2本鎖核酸を修飾する方法であって、（ａ）該2本鎖核酸をMutMタンパク質に接触させること、および（ｂ） 2本鎖核酸試料中でMutMタンパク質によって開裂される2本鎖核酸をさら
に修飾すること、を含む方法。