JPH05502728A - 体液中のグルコースの検出および定量の方法ならびに用具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 体液中のグルコースの検出および定量の方法ならびに用具発明の背景 グルコース濃度の測定法は、例えばグルコース恒常性が維持されない患者（例え ば糖尿病または低血糖症）のグルコースレベルを毎日監督するためのような臨床 的設！、ならびに生物医学的研究に応用を有する。

グルコース濃度決定法の最近の方法は種々の発色反応を含み、解糖カスケードに おけるいかなる数の生成物の性質の分光光度的変化をも測定し、または電気分解 自記法的グルコースセンサーを使用してグルコースの酸化を測定する。例えば米 国特許第４、４０１、１２２ではグル：−スのｉｎ　ｖｉｖｏ測定法を開示し、 これは酵素（例えばグルコースオキ／ダーゼ）を皮膚の中または下において酵素 反応生成物（例えば酸素）を電気分解自記法または酵素電極を使用して直接皮膚 を通して検出する。検出された酵素反応生成物の量は基質量の計量法である。

従来のアソセイは信頼できると証明されているが信頼している試薬はグルコース の存在で消耗される。それゆえにこれらのアソセイは使い捨て棒（ｓｔｉｃｋｓ ）または交換可能なカートリッジが必要とされ、これは実際の使用者にとって高 価であり、不便である。

ＭｅａｃｌｏｖおよびＳｃｈｕｌｔｚは血液グルコースレベルを視覚的手段によ って測定できるもうひとつの方法を開示する。彼らはグルコースとフル才ロセイ ン標識デキストラン（ＦＩＴＣ−デキストラン）のローダミンー標識コンカナバ リン＾（Ｒｈ−ＣｏｎＡ）に対する拮抗結合に基づいたファイバー光学グルコー スセンサーを開示する、ＭｅａｄｏｗＳＤ．およびＪ．　Ｓ．　Ｓｃｈｕｌｔｚ ．　Ｔａｌａｎｔａ．　３５：１４５−１５０（１９８ｇ）。

このｌｉｅａｄｏｗおよびＳｃｈｕｌｔｚの光学センサーは多《の問題を伴う、 それは臨床的設置または患者の血液グルコースレベルの監督の日常的使用が限定 されることを意味する。第一に、文献に述べられているようにセンサーは２．　 ＯＯｍｇｓ／ｍｌまでのグルコース濃度しか検出できない。しかし人の正常な血 液グルコースレベル濃度は約１．ＯＱｍｇ／ｍｌであり、糖尿病血液中のグルコ ースレベルはしばしば３．　００−４．　００１１ｇ／＋ａｌを越え、これは開 示されたセンサーの上限を易々と越える。

第二にｉｌｅａｄｏｗおよびＳｃｈｕｌｔｚのセンサーは使用寿命が短い、何故 ならば文献にも述べられているように、デキストランが凝集して沈殿するように なるからである。

第三にＭｅａｄｏｗおよびＳｃｈｕｌｔｚの光学センサーを使用して蛍光のわず か約４５％が消滅される。この結果は検出されるのには劇的に十分ではない。

最後に光学ファイバーの功」１四使用は臨床的に現実的ではない、なぜなら測定 するために皮膚に差し通さなければならないからである。それゆえに侵襲性の技 術が要求され、轡者を重症な感染を引き起こす重大な危険にさらす。これは特に 感染に対して抵抗力が減少した糖尿病患者にとっては重大である。

理想的なグルコースセンサーは広範なグルコース濃度（たとえば０．５から５． 　ＯＯｍｇ／ｍｌ）を検出できるべきであるいそれは信頼でき再使用できならび に使い易いべきである。加えてｉｎ　ｖｉｖｏセンサーは非侵襲性であるべきで ある。このようなセンサーは糖尿病患者の治療の向上に明らかに価値あるものと なろう。これはまた他の多くの研究および臨床的応用も有するであろう。

発明の要約 本発明は非一放射性蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を使用する体液中のグ ルコースの検出および定量方法、ならびに本発明のグルコース検出および測定法 を実行するために使用する用具に関する。

本発明の方法において、体液は特別な結合対、標識リガントおよび該リガンドに グルコースと拮抗して特異的に結合する標識炭水化物一含有レセプター（標識糖 複合体という）の二つの部材、と接触させられる。結合対のそれぞれは光一吸収 物質で標識される。一般的に、重複する励起状態エネルギーレベルを有するふた つの光一吸収物賃が使用され、ひとつはりガンドにおよびひとつは糖複合体に固 定される。

特に、本発明において、二つの蛍光的〜標識基買、リガンド（例えばレクチン、 モノクローナル抗体）およびグルコースと拮抗してリガンに特異的に結合する炭 水化物一含有レセプターまたは糖複合体は、体内で、または常法によって得た試 料として体液と接触させられる。特異的結合対の各々の部材は、発蛍光団で標識 され；一般的にはそれらは二つの異なる発蛍光団で標識される。ＦＲＥＴの目的 のために、リガンドは供与又は受容分子のいずれかで標識できる。もしリガンド が供与体で標識されるならば、糖複合体は一般的に受容体で標識される。もしリ ガンドが受容体で標識されるならば、糖結合体は一般的に供与体で標識される。

ＦＲＥＴは供与体と受容体とが互いに十分に近接している時に起こる（一般的に １００オングストローム以内）。本発明の方法において、Ｆ　Ｒ．　Ｅ　Ｔはり ガンドと試料中の糖複合体が結合するときに起こる。しかし、グルコースが存在 すると、これらの分子は競合し（即ち、グルコースは糖複合体とリガンドの結合 を競合する）。故に試料中のグルコースの存在と濃度は、工不ルギー転移の効率 において減少として示される。グルコースとの競合は投与一依存様式で起こり、 それは可逆的である。加えて糖複合体は安定であるため、本発明の器具は長期間 に渡り再使用可できる。

本発明の方法は、重複した励起状態エネルギーレベルのふたつの光一吸収物質が 十分に接近しているとき、共鳴双極子一誘導双極子相互反応が起こり、結果とし て供与体分子の励起状態エネルギーが受容体分子に転移し、供与体の蛍光を消滅 させ受容体の増感された発光が起こるという事実を利用する。

このような物質は、それは特異的結合対の部材中に接着または組み込まれ（即ち 、リガンドおよび糖複合体）本発明の方法に使用されるが、例えばフルオロセイ ンおよびローダミンのような蛍光性物質で有り得る。択一的には、ひとつ（供与 体）が現実に蛍光であり、もうひとつが（受容体）非蛍光で有り得る。この逆も 可能である（即ち、非蛍光性の供与体、蛍光性の受容体）。

ｉｎ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏで本発明の方法を使用して多くの用具が 血液または他の試料中のグルコース濃度を検出するために構築および使用できる （例えば尿又は細胞外液）。より広い観点から本発明の功」１四の態様ではグル コースの測定は反応物質（例えば蛍光的一標識リガンドおよび第二発蛍光団で標 識された糖複合体）を体液中に存在するグルコースと連絡させて（例えば接触） 配置することによるグルコース測定法に関する。例えば反応物質を皮膚の中、上 または下に置くことができ、モしてグルコースの皮膚測定を行う。またはふたつ の反応物質は器官または静脈に導入され、そこでグルコースと反応物質の連絡が 可能である。反応物質が配！された場所である、皮膚中、上または下での態様で は、皮膚を照射することにより（例えば供与体の励起波長で）グルコースが検出 される。エネルギー転移の測定は、蛍光光度計により検出され、つぎにグルコー ス濃度の関数として二つの発光最大波長における蛍光強度または最大発光での供 与体消光の割合により検出される。

グルコースとの連絡において、反応物質の配買の多様な様式は、本発明のｉｎ　 ｖｉｖ９態様の原理に従って採用できる。加えて、グルコースとの連絡において 反応物質のいかなる配置もインスリンボンブのフィードバックを提供するために 変更できる。

広範な観点から本発明のｉｎ　ｖｉｔｒｏの態様は、グルコースを含有する体液 試料（例えば、血液、尿、細胞外体液）との連絡における反応物質の配置に関し 、例えば該液を反応物質が上に固定されているディスクチップと接触させること などである。

グルコースはグルコースを含有する体液との関連で反応物質を配置させることに より蛍光光度測定計中で検出および定量される。ｉｎ　ｖｉν０態様として、グ ルコースに連絡する反応物質の種々の配置様式が採用できる。

本発明の方法および用具は、広範なグルコース濃度（例えば０．５からｌｂｇ／ ｍｌ）の検出に使用できる。加えて、この方法は信頼できる、なぜならば供与体 および／受容体の発光最大波長で測定された蛍光強度の割合として、またはグル コースの関数として供与体の発光最大での消光として測定された反応物質は凝集 および生成物の大きさにより測定を妨害しないからである。

また反応物質は消費されないので、用具は長期間再使用可能である。最後に、虱 図ＩＡは供与体および受容体分子の吸収および発光スペクトルを図式的に表す。

図ＩＢは非一放射性エネルギー転移を表す。

図２は試料中のグルコース濃度を測定するためのＦＲＥＴの使用を図式的に表す 。

図３は、蛍光的標識リガンド、ローダミンーＣｏｎＡ　（ＲＣ）と蛍光的標識糖 複合体．フルオロセインＢＳＡ−グルコース（Ｆ　Ｂ　Ｇ）との間のＦＲＥＴに 関しグルコース濃度の増加が有する効果を時間にわたり表すグラフである。

図４はハンクス緩衝化塩溶液（ＨＢＳＳ）中の種々の濃度のグルコースに対し透 析されたＦＲＥＴおよびＦＢＧ間を表すグラフである。

図５は以下の種々のグルコース濃度に対して連続的に透析されたＦＢＧおよび常 ウマ血清＋１０ｍＭグルコース、（ＨＳ）ウマ血清、（Ｏ）ハンクス平衡化塩溶 液。

図６Ａはグルコースが存在しない（対照）ＦＢＧとＲＣ間を表すグラフである。

図６Ｂは３．２Ｂ／■１のグルコースを含有する血液、これは糖尿病患者のもの と同様である、に対して微透析したＦＢＧとＲＣの間のＦＲＥＴをを表すグラフ である。

図７は種々のグルコース濃度を含をする血液に対して微透析したＲＣおよびＦＢ Ｇの混合物１５０ｕｌｓに応答する　ＦＲＥＴを表すグラフである。

聚町Δ葭凱矢脱朋 本発明は体液中のグルコースを検出し定量する方法および本発明のグルコース検 出および定量を行うために有用な用具に関する。本方法はグルコースによって競 合的に減少させられた特異結合対の部材間の結合の発生および量を測定するため の非−放射性蛍光共鳴工率ルギー転移（ＦＲＥＴ）の工程に基づく。結合対の部 材はリガンド（例えばレクチン、モノクローナル抗体）および炭水化物含有レセ プター（糖複合体という）であり、これらはグルコースと競合してリガンドに特 異的に結合する。リガンドおよびＷ複合体の双方とも蛍光的に１！！識されてお り、しかし典型的には同一の発蛍光団で標識されない。それらは試料と接触させ られ（例えば血液、尿、細胞外液）その中グルコース濃度が測定される。

本方法はグルコース恒常性が弱まった（例えば糖尿病または低血糖症患者）個体 のグルコース濃度を日常的に監督するためおよび生物医学的研究に特に有用であ る。

ＦＲＥＴの ＦＲＥＴは一般的に二つの発蛍光団間のエネルギーの非−放射性転移、ひとつは エネルギー供与体（Ｄ）およびもう一方はエネルギー受容体（Ａ）が関与する。

供与体の発光が受容体の励起スペクトルと重複し、かつ双方の部材がひとつの波 長で光エネルギーを吸収し、異なる波長の光を発光するならば任意の適当に選択 された供与体−受容体対が利用できる。

以下に説明する方法は特定の供与体−受容体対としてフルオロセインとローダミ ンに関する。ここで使用される、フルオロセインという用語は種々の関連する化 合物およびそれらの誘導体を含む種類をいう。同様にここで使用される、ロー長 で光エネルギーを吸収し、異なる波長の光を発光するならば任意の適当に選択さ れた供与体−受容体対が利用できる。

以下に説明する方法は特定の供与体−受容体対としてフルオロセインとローダミ ンに関する。ここで使用される、フルオロセインという用語は種々の関連する化 合物およびそれらの誘導体を含む種類をいう。同様にここで使用される、ローダ ミンは種々に関連した化合物対およびそれらの誘導体をいう。その他の供与体− 受容体対の例はローダミンに対するＮＢＤ　Ｎ　（７−ニドロベンズー２−オキ ソ−１，３−ジアゾール−４−イル）、エオシンまたはエリトロノス（ｅｒｙｔ ｈｒｏｓｊｓ）に対するＮＢＤ、または蛍光、ローダミンに対するダンンル、ロ ーダミンに対するアクリノンオレンジなどである。

択一的にひとつの分子が（供与体）が蛍光性でもう一方が（受容体）非蛍光性で あることができる。また、（蛍光性）供与体を励起するために使用する波長では 通常は励起しない受容体との供与体−受容体対を使用することも可能である。

しかし非−放射性Ｆ　Ｒ，Ｅ　Ｔは受容体励起を引き起こす。

供与体および受容体はここで”対”と呼ばれるが、二つの”部材“の対は実際間 −基貫でありうる。一般的には二つの部材は異なるであろう（例えばフルオロセ インとローダミン）。一つの分子（例えばフルオロセイン、ローダミン）を供与 体および受容体の両方に使用することは可能である：この場合、エネルギー転移 は蛍光の偏光の偏りの度合いの減少によって測定される。

ＦＲＥＴは図１に表される。供与体の吸収および発光は、それぞれＡ　（Ｄ）　 。

Ｅ　（Ｄ）と呼ばれ、受容体の吸収および発光は、それぞれＡ　（Ａ）、Ｅ　（ Ａ）と呼ばれ３図ＩＡに図式的に示される。供与体発光と受容体吸収スペクトル の重複した面積が（それは重複積分）重要である。もし励起が波長Ｉで起こるな らば、供与体による光は波長■で発光するであろう、しかし受容体は光を波長Ｉ では吸収しないので受容体による波長■ではない。

生じる非−放射性転移の過程は図ＩＢに表される。０分子は光子を吸収し、その 電場ベクターをＥにより表す。Ｄの励起状態は一方の側に正電荷を、もう一方の 側に負電荷を有する双極子として表される。もし受容体分子（Ａ）が十分にＤに 近づけば（例えば典型的には１００オングストローム）、反対に荷電した双極子 はその上に誘導される（励起状態に上昇する）。この双極子−誘導双極子の相互 反応は、供与体−受容体分子間の第６カとして逆に減少する。

古典的には、部分的エネルギー転移が起こり得る。しかし、これはＦＲＥＴで生 じるものとは異なり、１００かＯかの量子力学的出来事である。これは供与体は そのエネルギーの一部を受容体に与えることができない。すべてのエネルギーは 転移されなければならず、エネルギー転移は、エネルギーレベルが（即ちスペク トル）重複するときにのみ起こる。Ａが励起状態から脱する時、放出光は入射光 に関して回転させられるかまたは入射光偏光の偏りの度合いを減少させられる。

結果として、Ｆ　Ｒ，Ｅ　Ｔは■でそれ自体の蛍光強度の減少（！Ｉ］ち供与体 発光の減少）、■での蛍光強度の出現（即ち増感した発光の増加）および入射光 に関連した蛍光の偏光の偏りの度合いの現象として明らかになる。

最終的なＰＲＥＴの顕在化は、励起状態寿命中にある。蛍光は平衡化過程として 見ることができ、その中で分子が励起状態に留まる期間の長さは、入射光により 分子がこの状態に入った時の速度とこの状態から脱した時の速度の和との間の競 合の結果である（蛍光および非−放射過程）。さらに非放射過程、ＦＲＥＴ、が 加えられれば（すべてを非電荷とし）、崩壊が好ましく、これは■での供与体寿 命が短縮される。

二つの発蛍光団の励起状態および発光スペクトル重複が十分に接近している時、 供与体分子の励起状態エネルギーは共鳴双極子−誘導双極子相互反応により隣に ある受容体発蛍光団へ転移される。ＦＲＥＴにおいて、試料または混合物は、供 与体を励起するが受容体分子を直接励起しない波長で照らされる。試料は次に２ 種類の波長で監督される。それは供与体発光および受容体発光である。もし供与 体と受容体とが十分に接近していなければＰＲＥＴは起こらず供与体波長でのみ 発光がおこる。もし供与体と受容体とが十分に接近していればＦＲＥＴが起こる 。

この相互反応の結果、供与体の寿命の減少、供与体蛍光の消光、受容体蛍光強度 の増強および蛍光強度の偏光の偏りの度合いの減少がおこる。エネルギー転移の 効率、Ｒ４、は供与体および受容体分子間距離、Ｒの上昇に伴って急激に低下す る。単離された供与体受容体対に関して、エネルギー転移の効率はＥ　ｔ＝１／ １　［１＋　（Ｒ／Ｒｏ）　’コ　（１）として表され、Ｒは供与体と受容体の 間の分離距離であり、ならびにＲ６は半転移のための距離である。ＲＯは供与体 発光および受容体励起の重複積分、屈折率、供与体の量子生産、ならびに供与体 発光および受容体吸収モーメントの配向に依ｐｅｃｔｒｐｓｃｏｐｉｃ　ｒｕｌ ｅｒ）”とあだ名をつけられて来たｏ　（ｓｔｒｙｅｒ、　Ｌ、　、およびＲ， Ｐ、、　Ｐｒ。

ｃ　ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　９８ニア１９（１９６７） 。例えば、この技術はタンパク質および核酸を含む種々の重合体において内因性 および外因性の双方の発蛍光団についての供与体および重合体間距離を測定する ために有用であった。Ｃａｒｄｕｌｌｏ　ｅｔ　ａｌ、は二つのオリゴヌクレオ チドのハイブリダイゼーションはＦＲＥＴの使用により監督できることを示した （Ｃａｒｄｕｌｌｏ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　８５　：８７９O−８７９４（１９ ８８）。

グルコース濃度測定に関してＦＲＥＴを使用する概念溶液中のグルコース濃度を 測定するためにＦＥＲＴを使用する概念は、図２に表される。ひとつの巨大分子 （Ｍという）は多くの共有的−結合発蛍光団およびグルコース残基を含み、なら びに糖複合体と呼ばれる。第二巨大分子（Ｌという）はグルコースに対し高度な 特異性を有するリガンド（例えばコンカナバリン＾）および通常は第−巨大分子 上の発蛍光団と同一でない発蛍光団を含む。これらの発蛍光団のひとつは前述の ように供与体、他の一つは受容体となるべぐ選択される。

この説明の目的のために、供与体分子は糖複合体上に配置され、受容体はリガン ド上に配置される。その会合は次ぎのように図式される。

ＤＭＧ＋ＡＬ−−−−−−ＤＭＧ−ＬＡＤＭＧは供与体−巨大分子−グルコース を、ＡＬは受容体−リガントを表象し、およびＤＭＧ−ＬＡは第一複合体中に存 在するグルコースと第二複合体に存在するりガントとの間の会合を表す。会合す るとふたつの巨大分子は全供与体と受容体との間で十分に接近しエネルギー転移 が起こる。

遊離グルコースの存在は、遊離グルコースが複合体グルコースとりガントを競合 するために式に競合阻害を導入する。このようにグルコース濃度の増加は糖複合 体に結合するりガント量の減少を産する。比較的グルコース濃度が低い場合は少 量の巨大分子会合が起こるので転移効率は高く留まる。高濃度グルコースでは、 転移効率は低く、これはグルコースがうまく相補的巨大分子のりガントを落とす 。

以下の童で説明するように、グルコース濃度が正常個体およびグルコース恒常性 が変化した個体中（例えば糖尿病および低血糖症）に典型的に見いだされるグル コース濃度を含有する試料のグルコースの、信頼性のある反復可能な測定を得る ことが可能であることが示された。さらに使用された反応物（即ち蛍光的−標識 リガントおよび糖複合体）は安定で再使用できる。

ハンクス緩衝化塩溶液（ＨＢＳＳ）中の種々のグルコース１度に関してＦＲＥＴ が測定される競合実験を行った。これらの実験は実施例３に詳細に説明されてい る。スペクトルは４７２ｎｍでの励起蛍光で集められ、発光を５００−６５０ｎ ｒｒ＋からスキャンニングした。典型的には、蛍光強度はフルオロセイン（約５ ２０ｎｍ）およびローダミン（約５９６ｎｍ）の発光最大で監督された。これら の研究におけるエネルギー転移の測定は、グルコース濃度の関数として５２０ｎ ｍおよび５９６ｎｍでの比（即ちＦＩ５２０／ＦＩ５９６）がまたは５２０ｎｍ でのフルオロセインの消光であった。

これらの試みの間多くの観察がなされ、それは本発明の方法が広範囲（即ち正常 、低血糖症及び糖尿病患者に見いだされるグルコース濃度）にわたって信頼性の あるグルコース検出手段を提供することを示している。最終的に化合物は２−４ 週間にわたって室温で安定であった。図３では化合物がフルオロセインの同一の 性質を二週間の期間にわたってグルコース濃度に対応し示した。グラフ中のデー タは５２０ｎｍにおけるフルオロセイン強度の変化をＯｍＭからのグルコース濃 度に反応して反映する。

第二にＦＲＥＴで測定されたグルコース濃度は他のメーターを使用しての測定と 一致する。二重盲検において、ＦＲＥＴは５０−３００ｍｇ／ｄＬの範囲テＤｉ ｒｅｃｔ３０／３０グルコメーターを使用して測定したグルコース濃度の±１０ ％内のグルコース濃度を予言できた。

加えて、図４はＦＲＥＴ法はグルコース濃度を正確に３１ｍＭグルコース（〜６ ００ｍｇ／ｄＬ）まで予言することができ、所望する範囲内およびそれ以上であ る。正常グルコース濃度は通常８０から１２０ｍｇ／ｄＬの間で、ならびに糖尿 病レベルでは５００ｍｇ／ｄＬを越えることができる。Ｏがら３１ｍＭのグルコ ース範囲では、ＦＲＥＴは（ｒ２）が０．９８３の測定係数である直線に近い。

それゆえにグルコース濃度の感知するセンサーは全生理範囲の個体わたって信頼 性がある（即ち正常及び低血糖症（糖尿病））。

本発明の構成要素は再使用できることが分かった。ＦＢＧおよびＲＣは８−１１ ｋＤカツトオフ透析チユーブに置かれ、溶液研究に従って正確に測定されたこれ ら、血清およびＦＲＥＴの異なるグルコース濃度に対して透析された。ＨＢＳＳ 中のＦＢＧおよびＲＣの初期容量は２ｍｌであり、５０ｒｒ＋］容量の種々のグ ルコース濃度に対して透析された。一般的に、Ｆ　ｌ５２０／Ｆ　Ｉ、。。比に おいてプラトゥレベルに達するまでに約３０分を要した。図５に示されるように 、透析チューブを種々のグルコース濃度に変えた時反応は可逆的である。ウマ血 清において反応は透析構成要素により影響されなかったが、光分散のためベース ラインにソフトしなかった。

本発明の方法は患者から適切に得られた大きさの試料中のグルコースを感知また は定量するために使用できる（例えば１０−１００μｍ）。正常ヒト血液のこれ ら微量試料を使用して行う評価では、グルコース濃度は本質的に同時に行われた 従来法のグルコースメーターでの測定と同じであることが分かった。

本方法の低血糖症のグルコース濃度を測定するための能力（則ち糖尿病患者で観 察されたグルコースレベルを作るためにグルコースを増された正常血液試料）も 評価された。図６はこの実験の生データ−スキャンを表す。第一（図６Ａ）はグ ルコースを含有しない、４７２ｎｍで励起された試料の５００ｎｍからの発光ス キャンである。これは二つの発光ピークの比による証拠からかなりのエネルギー 転移を表す。ローダミン（第二）ピークは実際フルオロセイン（第一）ピークよ りも高い。

図６Ｂに描かれた第ニスキャンでは、グルコースの低血糖レベル、ここでは３１ ７ｍｇ／ｄＬ、の血液試料に対する透析効果を表す。エネルギー転移はフルオロ セイン発光ピークの増加および同時に起こる増感ローダミン発光の減少の双方が 見られる時に減少する。

本方法は血液中のグルコースレベルの評価に効果的であり、以下のような低血糖 範囲で感度がよい　Ｒｈ−ＣａｎＡおよびＦＢＧの混合物］５０μｍを１５００ μｌの低血糖試料に対して１５分間微透析した。図７は、初期のフルオルゼイン ／ローダミン蛍光比は１６よりも少し上であり、このフルオルゼイン／ローダミ ン蛍光比はグルコース濃度の関数として増加し、約４０ｍＭグルコースで飽和し た。

本発明の方法に基づき、ｉｎ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏで血液中のグル コース濃度を検出する多くの用具を構成できる。これらの用具は、交換されるま で長期間にわたり（例えば１力月以上）活性を保つ。

本発明のｉｎ　ｖｉｖ□の態様では反応物（即ち蛍光的に標識されたりガントお よび第二発蛍光団て標識された糖複合体）をグルコースと連絡させて配置しく例 えば接触）皮膚でのグルコースの測定に関する。反応物は皮膚の中、上または下 に置くことができる。別の方法として反応物を器官および血管（例えば静脈また は動脈）に置くことができ、そこでそれらはグルコースと連絡して、次に本方法 により測定できる。皮膚の中、上または下に位置する態様では、グルコースは皮 膚を供与体励起波長で照らし、二つの蛍光物質について波長を監督すことにより 検出される。例えば、蛍光物質がフルオルセインおよびローダミンであれば、蛍 光強度は５２０ｎｍおよび５９６ｎｍ（即ちそれぞれの発光最大波長）で監督さ れる。

蛍光光度計により検出されたエネルギー転移の測定は、次に二つの発光最大波長 （例えばＦＩ５２０／ＦＩ５９６）での蛍光強度の比、またはグルコース濃度の 関数としての発光最大での供与体（即ちフルオロセイン）蛍光の消光である。

グルコースと連絡して反応物を置く種々の態様は本発明の胡」１四態様の原理に 従って採用できる。反応物は反応物を所望する場所に保持する任意の型の支持お よび包囲物質中で体内に導入され、グルコースが測定できる（即ち本発明で測定 できるその濃度）ように接触または連絡させることができる。例えば、反応物は 微透析管、または内径的１ｍｍおよび壁厚５Ｏ−１００８ｍで末端密閉された球 にカプセル化できる。カプセル化されたグルコースセンサーは体内の任意の皮肉 に取り付けられる。もうひとつの態様としては。反応物はシリコーンまたはフル オロカーボン油と混合して皮下に注入できる。反応物はまた皮膚上に刻み込まれ たり（ｔａｔｔｏｏｅｄ）または経皮肉経路に含有されつる。択一的に、反応物 は皮下料またはすでに体から分取るされた体液（例えば尿、細胞外液）と連絡さ せて反応物を設置することに関する。グルコースは蛍光光度計中に反応物をグル コース含有体液と連絡させて置くことにより検出および定量される。

反応物をグルコースと連絡させて配置する種々の様式は、本発明のｉｌ　ｖｉｔ ｒｏ態様に従って採用できる。例えば、反応物は固体基質に付く　（例えば棒） か、または容器（例えば微透析管）中に含有され得る。反応物を、適当量の反応 物を血液またはグルコースを含有する他の体液基質中で消耗させるペンカートリ ッジ内にも含有できる。

合本発明は以下の実施例で説明されるが、いずれにしても限定とはされない。

伊Ｉ　ＦＢＧおよびＲＣの シグマ（Ｓｉｇｍａ）から購入したフルオロセインーＢＳ＾−グルコース（ＦＢ Ｇ）およびモレキュラープローブ（Ｉｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）から 購入したローダミン−ＣａｎＡ（ＲＣ）をギブコ（Ｇｉｂｃｏ）からのハンクス 緩衝化塩溶液（ＨＢＳＳ）に最終濃度２■ｇ／腸ｌで溶解した。溶液を次に１０ ．　ＯＱＯｇで３０分遠心し大粒子を除去した。上澄みを次に回収し１０゜００ ０Ｍ夏アミコン限界濾過容器に置き、限界濾過が膜を通過するまで２．０００ｇ で遠心した。残った物質を２璽１ｓのＨＢＳＳに再溶解し、この手順を限界濾過 物中に遊離のフルオロセインまたはローダミンが検出されなくなるまで繰り返し た。

最終的に残った物質を回収し２厘１０ＨＢＳＳに再溶解し、１０．０００ｇで３ ０分間もう一度遠心した。上澄みを回収し、エネルギー転移実験に使用するまで ４℃で保存した。

？２　フルオロセインーＢＳ＾−グルコースおよびローダミン−ＣｏｎＡの　適 ０迭２ マンノースおよびグルコースで競合実験を行う前に、フルオａセインーＢＳＡ　 −グルコース（Ｆ　Ｂ　Ｇ）およびローダミン−ＣｏｎＡ（ＲＣ）の至適濃度を 決定した。

エネルギー転移に使用する任意の溶液中において、ＦＲＥＴが単に分子同士が溶 液中で相互に十分に接近することによって起こることは避けなければならない。

このように、ＦＲＥＴｍ液実験は理想的には１ｍＭ以下の濃度で行われるべきで ある、なぜならその濃度では分子は１２０＾単位離れているからである（特異的 に反応するに十分離れている）。　逆に、これらの実験で、蛍光の濃度は検出さ れ得るに十分高くなければならず、ならびにふたつの種（ＦＢＧおよびＲＣ）は それらの結合定数（Ｋ、ｓ）より上でなければならない。

遠心した。上澄みを回収し、エネルギー転移実験に使用するまで４℃で保存した 。

実施例２　フルオロセインーＢＳ＾−グルコースおよびローダミン−ＣｏｎＡの 至適ｆｉｌＪＦの決定 マンノースおよびグルコースで競合実験を行う前に、フルオロセインーＢＳへ− グルコース（ＦＢＧ）およびローダミン−ＣｏｎＡ（ＲＣ）の至適濃度を決定し た。

エネルギー転移に使用する任意の溶液中において、ＦＲＥＴが単に分子同士が溶 液中で相互に十分に接近することによって起こることは避けなければならない。

このように、ＦＲＥＴ溶液実験は理想的には１ｍＭ以下の濃度で行われるべきで ある、なぜならその濃度では分子は１２０八単位離れているからである（特異的 に反応するに十分能れている）。　逆に、これらの実験で、蛍光の濃度は検出さ れ得るに十分高くなければならず、ならびにふたつの種（ＦＢＧおよびＲＣ）は それらの結合定数（Ｋ、Ｓ）より上でなければならない。

ＦＢＧおよびＲＣの初期濃度は約２　ｍｇ／ｍｌであった。最大転移はＦＢＧの 最終濃度が約２μｇ／ｍｌおよびＲＣの最終濃度が約１５０　ｕｇ／ｘ１の時起 こった。ＦＲＥＴの至適化は蛍光フルオロセインの消光により測定され、これは ３０　ｐｇ／ｍｌで５０％最これらの実験に使用した分光蛍光計は、温度台を装 備したパーキン−エルマー４１ＰＦ−２（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　ＭＰＦ− ２）で、アップルＩｌ［Ｅコンピュータに接続した。

コンカナバリンＡ、　（ＣｏｎＡ）はグルコースに特異的に結合するレクチンで ある。グルコースの連続的希釈は約２μｇ／ＩｌｌのＦＢＧおよび約１５０μｇ ／１１１のＲＣを使用して、ＨＢＳＳ中で０から５ｉグルコースである。グルコ ースの濃縮物である種々のグルコース濃度が増加すると、５２０ｎｍでの蛍光強 度は増加し、グルコースに対する１ノ′２最大反応は約１．８７ｍｇ／ロ１であ った。

均等物 当業者はここに特別に記載された多くの特別な態様に対する均等物を単に日常的 な実験を通して認識または確認できるであろう。そのような均等物は以下の請求 の範囲の観点に包含される。

ＦＩＧ、１ａ 波長 ＦＩＧ、２ １）　エネルギー転移なし 相対蛍光強度 （任意単位） ＦＬ５２０’”６００ 相対蛍光強度 （任意単位） 相対蛍光強度 （任意単位） Ｆ／Ｒ比 要約書 血液および他の体液中、ならびにそのような液に由来する試料中のグルコース濃 度を定量する方法および用具。王宮な生理的限界と思われるグルコース濃度に相 関する試料中のグルコース濃度の決定を可能とするように測定されるグルコース 濃度。この測定に利用される用具は固体支持体であり特異的結合対に結合される ０非放射的検出手段が採用される。ｉｎ　ｖｉｖｏ試験用の関連用具が開示され る。

国際調査報告

Claims (50)

【特許請求の範囲】
1. １．体液試料中のグルコースを定量する方法であって；ａ）体液を第一光吸収物 質で標識されたグルコースー結合リガンドである第一部材および第二光吸収物質 で標識された糖複合体である第二部材から成る特異的結合対と接触させ，第一光 −吸収物質の励起状態エネルギーレベルは第二光−吸収物質の励起状態エネルギ ーレベルと重複し、 該リガンドおよび該糖複合体は体液中に見い出されるの生理的濃度のグルコース の存在中で、該体液中のグルコースが該糖複合体と置換し、可逆的に該リガンド と結合できるように互いに可逆的に結合し；ｂ）第一光−吸収と第二光−吸収物 質との間に起こる非−放射性蛍光共鳴エネルギー転移の程度を決定し； ｃ）工程（ｂ）の結果と、第一光−吸収物質と第二光−吸収物質との間の非−放 射性エネルギー転移の程度とカリブレーション工程で決定された体液中のグルコ ース濃度との関係とを比較する、工程から成る方法。
2. ２．上記体液試料が尿試料である請求項１記載の方法。
3. ３．上記体液試料が血液試料である請求項１記載の方法。
4. ４．上記リガンドがグルコースー結合レクチンである請求項１記載の方法。
5. ５．上記リガンドがコンカナバリンＡである請求項１記載の方法。
6. ６．上記糖複合体中に存在する炭水化物がグルコースー結合リガンドに結合でき る請求項１記載の方法。
7. ７．上記糖複合体がグルコースー結合リガンドに結合できるグリコシル化血清ア ルブミンである請求項１記載の方法。
8. ８．上記糖複合体がグルコースー結合リガンドに結合できるグリコシル化ウシ血 清アルブミンである請求項１記載の方法。
9. ９．上記第一および第二光−吸収物質が発蛍光団である請求項１記載の方法。
10. １０．上記発蛍光団の少なくともひとつがフルオロセインである請求項９記載の 方法。
11. １１．上記発蛍光団の少なくともひとつがローダミンである請求項９記載の方法 。
12. １２．非−放射性蛍光共鳴エネルギー転移過程において供与体である上記リガン ドが発蛍光団で標識され、ならびに受容体である上記糖複合体が発蛍光団で標識 されている請求項１に記載の方法。
13. １３．非−放射性蛍光共鳴エネルギー転移過程において受容体である上記リガン ドが発蛍光団で標識され、ならびに供与体である上記糖複合体が発蛍光団で標識 されている請求項１に記載の方法。
14. １４．非−放射性蛍光共鳴エネルギー転移が第一および第二光吸収分子に帰する 発光の比を測定することにより決定される請求項１記載の方法。
15. １５．特異的結合対の第一部材がローダミン−標識コンカナバリンＡ、特異的結 合対の第二部材がグルコースー結合リガンドに結合できるフルオロセイン−標識 グリコシル化血清アルブミンであり、ならびに非−放射性蛍光共鳴エネルギー転 移がローダミンおよびフルオロセインに帰する発光の比の測定により決定される 請求項１記載の方法。
16. １６．上記特異的結合対の少なくともひとつの部材が、体液試料と繰り返して接 触させ使用するために固体支持体に固定されている請求項１記載の方法。
17. １７．上記特異的結合対が該特異的結合対を被覆するように支持体上に配置され た膜を有する支持体上に提供され、該膜はグルコースが体液から支持体に通過で きるような細孔を有する、請求項１記載の方法。
18. １８．非−放射性蛍光共鳴エネルギー転移は、供与体寿命の減少、供与体蛍光消 失、受容体蛍光強度の増強、または励起に比例する偏光の偏りの度合いの減少、 が単独でまたは組合わされてあるかどうかを評価することにより測定される、請 求項１記載の方法。
19. １９．体液中のグルコースを測定する方法であって、ａ）体液試料を蛍光的に標 識したグルコースー結合レクチンおよび蛍光的に標識した相補的糖複合体と接触 させ、該レクチンおよび該糖複合体は体液中に見い出される生理的濃度のグルコ ースの存在中で、該体液中のグルコースが該糖複合体と置換し、可逆的に該レク チンと結合できるように互いに可逆的に結合し；ｂ）蛍光的標識レクチンと蛍光 的標識糖複合体の間に起こる非−放射性蛍光共鳴エネルギー転移の程度を測定し ；ｃ）工程（ｂ）でなされた決定と、非−放射性エネルギー転移の程度とカリブ レーション工程で測定された体液中のグルコース濃度との関係とを比較する、 工程から成る方法。
20. ２０．上記蛍光−標識レクチンがローダミン−標識コンカナバリンＡであり、上 記蛍光−標識糖複合体がグルコース結合リガンドに結合できる蛍光−標識グリコ シル化血清アルブミンである請求項１９記載の方法。
21. ２１．上記非−放射性蛍光共鳴エネルギー転移がふたつの蛍光性標識に帰する発 光の比の測定により決定される請求項１９記載の方法。
22. ２２．体液試料中のグルコースを測定する方法であって、ａ）体液試料を第一光 吸収物質で標識されたグルコースー結合リガンドである第一部材および第二光吸 収物質で標識された糖複合体である第二部材から成る特異的結合対と接触させ、 第一光−吸収物質の励起状態エネルギーレベルは第二光−吸収物質の励起状態エ ネルギーレベルと重複し、 該リガンドおよび該糖複合体は、体液中に見い出される生理的濃度のグルコース の存在中で該体液中のグルコースが該糖複合体と置換し、可逆的に該リガンドと 結合できるように互いに可逆的に結合するように選択されｂ）第一光−吸収と第 二光−吸収物質との間に起こる非−放射性蛍光共鳴エネルギー転移の程度を、第 一および第二光吸収分子に帰する発光の比を測定することにより決定し； ｃ）工程（ｂ）の結果と、第一光−吸収物質および第二光−吸収物質との間の非 −放射性エネルギー転移の程度とカリブレーション工程で測定された体液中のグ ルコース濃度との間の関係とを比較する、工程から成る方法。
23. ２３．個体のグルコース濃度を測定するｉｎ　ｖｉｖｏの方法であって、ａ）個 体の体液中に存在するグルコースと連絡するセンサーを、個体の体液中のグルコ ース濃度の非−侵襲的監督を可能とするために、いったん該センサーが個体の皮 膚から出ないように設置し、該センサーは第一光−吸収物質で標識したグルコー ス結合リガンドである第一部材および第二光−吸収物質で標識した糖複合体であ る第二部材からなる特異的結合対から成り、 第一光−吸収物質の励起状態エネルギーレベルは第二光−吸収物質の励起状態エ ネルギーレベルと重複し、 該リガンドおよび該糖複合体は、体液中の生理的濃度のグルコースの存在中で該 個体の体液中のグルコースが該糖複合体と置き換わり可逆的に該リガンドと結合 できるように互いに可逆的に結合するように選択され；ｂ）第一光−吸収物質と 第二光−吸収物質との間に起こる非−放射性蛍光エネルギー転移の程度を非−侵 襲的に監督し；そしてｃ）工程（ｂ）の結果と非−放射性エネルギー転移とカリ ブレーション工程で決定された個体の体液中のグルコース濃度との間の関係を比 較する、工程から成る方法。
24. ２４．上記方法が個体の皮下体液中のグルコース濃度を測定する請求項２３記載 の方法。
25. ２５．上記方法が個体の血液中のグルコース濃度を測定する請求項２３記載の方 法。
26. ２６．上記リガンドがグルコースー結合レクチンである請求項２３記載のリガン ド。
27. ２７．上記リガンドがコンカナバリンＡである請求項２３記載のリガンド。
28. ２８．上記糖複合体中に存在する炭水化物がグルコースー結合リガンドに結合で きる請求項２３記載の方法。
29. ２９．上記糖複合体がグルコースー結合リガンドに結合できるグリコシル化血清 アルブミンである請求項２３記載の方法。
30. ３０．上記糖複合体かグルコースー結合リガンドに結合できるグリコシル化ウシ 血清アルブミンである請求項２３記載の方法。
31. ３１．上記第一および第二光−吸収物質が発蛍光団である請求項２３記載の方法 。
32. ３２．少なくともひとつの上記発蛍光団がフルオロセインである請求項３１記載 の方法。
33. ３３．少なくともひとつの該発蛍光団がローダミンである請求項３１記載の方法 。
34. ３４．非−放射性蛍光共鳴エネルギー転移過程において、供与体である上記リガ ンドが発蛍光団で標識されており、および受容体である上記糖複合体が発蛍光団 で標識されている請求項２３記載の方法。
35. ３５．非−放射性蛍光共鳴エネルギー転移過程において、受容体である上記リガ ンドが発蛍光団で標識されており、および供与体である上記糖複合体が発蛍光団 で標識されている請求項２３記載の方法。
36. ３６．上記非−放射性蛍光共鳴エネルギー転移が第一および第二光吸収分子に帰 する発光の割合の測定により決定される請求項２３記載の方法。
37. ３７．上記特異的結合対の第一部材がローダミン−標識コンカナバリンＡであり 、該特異的結合対の第二部材がグルコース結合リガンドに結合できるフルオロセ イン−標識グリコシル化血清アルブミンであり、および非−放射性蛍光共鳴エネ ルギー転移がローダミンおよびフルオロセインに帰する発光の比の測定により決 定される請求項２３記載の方法。
38. ３８．上記センサーが個体の皮膚上、中または下に配置される請求項２３記載の 方法。
39. ３９．上記特異的結合対が徴透析管中に配置され、次に個体の皮下に設置される 請求項２３記載の方法。
40. ４０．上記特異的結合対がカプセル化され、次に個体の皮下に設置される請求項 ２３記載の方法。
41. ４１．上記特異的結合対がグルコースが通過できるシリコーンまたはフルオロカ ーボン油と混合され、次に個体の皮下に設置される請求項２３記載の方法。
42. ４２．上記特異的結合対が個体の皮膚に刻み込まれる請求項２３記載の方法。
43. ４３．上記特異的結合対の構成が個体の細胞に結合できるように化学的に変更さ れる請求項２３記載の方法。
44. ４４．上記結合対が、次に個体に設置される固体支持体に結合され、該支持体は 該特異的結合対を一度個体に設置すると所望の部位に保持する請求項２３記載の 方法。
45. ４５．上記グルコースセンサーをインスリンポンプと連絡して配置し、該グルコ ースセンサーにより決定されたグルコース濃度に基づいた適当量のインスリンを 個体に与える請求項２３記載の方法。
46. ４６．上記特異的結合対が照射され、個体の皮膚を通じて上記エネルギー転移が 監督される請求項２３記載の方法。
47. ４７．非−放射性蛍光共鳴エネルギー転移は、供与体寿命の減少、供与体蛍光消 失、受容体蛍光強度の増大または励起に比例する偏光の偏りの度合いの減少、が 単独でまたは組合わされてあるかどうかを評価することにより決定される、請求 項２３記載の方法。
48. ４８．個体中のグルコース濃度を非−侵襲的に監督するセンサーであって、第一 光−吸収物質で標識されたグルコースー結合リガンドである第一部材および第二 光−吸収物質で標識された糖複合体である第二部材から成る特異的結合対から成 り、 第一光−吸収物質の励起状態エネルギーレベルは第二光−吸収物質の励起状態エ ネルギーレベルと重複し、 上記リガンドおよび上記糖複合体は、個体体液中に見い出されるグルコースの生 理的濃度範囲で互いに可逆的に結合し、個体の体液中に存在するグルコースが該 糖複合体と置換して可逆的に該リガンドと結合できるようにし、該センサーの構 成要素は、いったん個体中に設置されると、該センサーは個体の皮膚には存在せ ずに個体の体液中のグルコース濃度を非−侵襲的に監督できるよう構成されてい る、センサー。
49. ４９．上記特異的結合対の第一部材は蛍光的に標識されたレクチンであり、およ び上記特異的結合対の第二部材は蛍光的に標識された糖複合体である請求項４８ 記載のセンサー。
50. ５０．上記特異的結合対の第一部材はローダミン−標識コンカナバリンＡであり 、および上記特異的結合対の第二部材はグルコースー結合リガンドに結合できる 蛍光−標識グリコシル化血清アルブミンである請求項４８記載のセンサー。