JPH05501713A - 活性化化合物および核酸の失活方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 活性化化合物および核酸の失活方法 発明の分野 本発明は、活性化化合物と、ｌ）核酸に活性化化合物を結合する、およびｉｉ） 核酸の失活を含む、核酸の鋳型依存性酵素的合成を阻害するために活性化化合物 を使用する、ための方法に関する。

背景 核酸手法により、潜在的に非常に多数の真核、原核およびウィルス遺伝子の操作 、増幅、選択および特性決定が可能となってきている。最も著しくは、核酸手法 の適用により、複合体ゲノム内のあらゆる核酸配列の単離、配列の修飾および分 岐種への配列の導入が可能となっている。

注意して、または不注意に、ａ）修飾されているが正常な宿主種に存在する、ま たはｂ）正常であるが異種宿主種に存在する、核酸配列を自然界に放出すると、 核酸手法により人体の健康に危険が生じる心配がある。この危険を規制する方法 として、異種のまたは修飾した核酸配列を含む生物の物理的または生化学的汚染 に注意が集中されてきた。Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈ ｅａｌｔｈ、　Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｒｅｇｉｓｔｅｒ　４１：２７９０２　（１９ ７６）　、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ、　 Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｒｅｇｉｓｔｅｒ　４３：６０１０８（１９７８）。このよう な方法は、未封入生物の発生率と程度に対する、異なる実験室プロトコールと種 々の型の人的間違いおよび器具の破損の影響を評価する研究により支持されてい る。Ｅ、Ｆｉｓｈｅｒ　ａｎｄ　Ｄ、Ｒ，Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｒｅｃｏｍｂ、ＤＮ Ａ　Ｔｅｃｈ、　Ｂｕｌｌ、　７；ｉ　（１９８４）、。

生物体中の核酸に向けられたこの努力にもかかわらず、裸の核酸、すなわち宿主 生物から遊離した核酸、の問題にはほとんど注意が払われてこなかった。特別な 状況によっては、裸の核酸は感染または形質転換物質と成り得る。ＲＩＶ、　０ １ｄａｎｄ　Ｓ、Ｂ、　Ｐｒｉｍｒｏｓｅ、　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｇ ｅｎｅ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、　ＰＰ、１６７−１６８　（Ｕｎｉｖ、ｏ ｆ　Ｃａ１．　Ｐｒｅｓｓ、　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　１９８１）、。さらに 裸の核酸は、キャリオーバーのために他の実験室反応を妨害し得る。

キャリオーバー キャリオーバー（ｃａｒｒｙｏｖｅｒ）とは、ここでは反応混合物−・の核酸の 偶発的導入と広く定義される。もちろん、偶発的導入の型は非常に多い。液体を こぼしている間に、または貧弱な実験室手法（例えば、同一の反応容器または同 一のピペットを２回使用する）のために、核酸が導入される。しかしなから、さ らに重大な問題は、汚染された手袋からの不注意な転移を含む、正常な実験室手 順の間でさえ生しる核酸の導入である。修飾された生物体を用いるとき、この型 の事故の最も厄介な原因はエーロゾル化ヒである。

エーロゾルは霧状の微細な液体または固体粒子の分散体である。エーロゾルは液 体をかき乱すことによりる生じ得る（例えば、エーロゾルはこほしている間に生 じる）か、沖に、容器の面上の少量の物質をかき乱すことによってもまた生しる （例えば、プラスチック管のキャップの内面上の残留物は、管を開く時、しばし 、ばエーロゾル化される。）。後者により、高濃度量の核酸を含むいずれの容器 も核酸のキャリオーバーの起源と成り得る。

キャリオーバーがあるかとうかという問題は、このようなキャリオーバーが後続 の反応を妨害するので重大であることをｒ＃摘しなければならない。一般に、非 常に多量の核酸の中で興味のある核酸配列の検出および／または増幅を目的とす る、実験室の反応はいずれも核酸のキャリオーバーによる妨害を受けやすい。

増幅手法 近代の実験室において　ａ）高濃度量の核酸か入っている容器か存在する、およ びｂ）核酸配列の増幅を目的とする反応を実施する、場合の両方の環境は比較的 共通している。単一コピー遺伝子のためのゲノムＤＮＡのスクリーニングは、お そらく濃縮核酸と増幅の両方を含む手順の最も良い例であろう。

ｌ）溶菌増殖を介する組換えファージの複製、２）組換えＲＮＡハイブリダイゼ ーションプローブの増幅、および３）ポリメラーゼ・チェイン・リアクション、 を含む５数の核酸増殖変法がある。

１、組換えベクター。殆どのクローニングベクターはゲノムサイズか２から、お よそ５０キロベース（ｋｂ）のＤＮＡウィルスまたは細菌プラスミドである。ウ ィルスまたはプラスミドライブラリーへのゲノムＤＮＡの増幅は通常、１）ウィ ルスまたはプラスミドＤＮＡ０単離と調製、ｉｉ）ベクターＤＮＡへの消化ゲノ ムＤＮＡの連結、１ｉｉ）ウィルスＤＮＡのパッケージング、ｉｖ）許容宿主の 感染（選択的に、宿主の形質転換）、およびＶ）ウィルスまたはプラスミドの増 殖を介したゲノムＤＮＡの増幅、を含む。この慨において、標的配列を保有して いる相換えウィルスまたはプラスミドか同定される。Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　 ｅｔ　ａｌ、、λ（Ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ｐｐ、　２３−２４　 （Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８２） 。標的配列を保有している組換えウィルスまたはブラスミｌ’の同定は、しばし ばプラスミド由来プローブを使用した核酸ハイブリダイゼーションにより実施す ることかできる。

細菌ウィルス（バクテリオファージ）は宿主細菌に感染し、複製し、成熟し、そ して細菌細胞を溶菌させることかできる。

バクテリオファージＤＮＡは、このようにして、何回も複製し多量の核酸を生み 出すことができる。

プラスミドは、種々の細菌中に自然界で見られる染色体外因子である。バクテリ オファージと同様、それらは二本鎖で、細菌内での複製のために異種ＤＮＡを組 み入れることができる。

このようにして、多量のプローブを作ることかできる。

ハイブリダイゼーション反応でのファージライブラリーのスクリーニングのため にプラスミド由来プローブを使用すると、ベクターＤＮＡのハイブリダイゼーシ ョンの問題（例えば、ファージ−ファージ、プラスミド−プラスミド）が回避さ れる。ウィルスライブラリーの構築では、それ故ファージーゲノムＤＮＡ混合物 へのプラスミドＤＮＡのキャリオーバーが起こらないことがきわめて重要である 。例えば、クローン化できるプラスミドＤＮＡ　１０ピコグラムをゲノムＤＮＡ 　１マイクログラムを含むウィルス−ゲノム混合物にキャリオーバーしたとじた ら（重量あたり０．００１％のキャリオーバー）、１×ｌＯｓの挿入物中に１の 標的挿入物か含まれる頻度と仮定して、標的配列を含んでいると評価される１１ クローンごとに、平均で１．１０の偽陽性（すなわちプラスミド＝プラスミドハ イブリダイゼーション）とただ１つの真の陽性（ブローブー標的ハイブリダイゼ ーション）か現れるであろう。

２、組換えＲＮＮジブーブ。Ｐ、Ｍ、　Ｌｉｚａｒｄｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｏＬｏｌｙ　６：１１９７（１９８８）に、ＱＢレプリカーゼによる 指数的増幅のための、ハイブリダイゼーションプローブおよび鋳型の両方として 機能する絹換えＲＮＡ分子が記載されている。それぞれの組換え体はＭＤＶ−Ｉ 　ＲＮ、Ａの配列内の特異配列（すなわち″内部プローブ″）から成る。ＭＤＶ −Ｉ　ＲＮＡはレプリカーゼのための天然の鋳型である。Ｄ、Ｌ、　Ｋａｅｉａ ｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ　ＬＩＳＡ　 ６９：３０３８　（１９７２）　、　’ＩＡ換え体は、内部プローブに相補的で あり、かつ核酸混合物中に存在する標的配列にハイブリダイズすることかできる 。次に、種々の単離法（例えば、洗浄）を使用して、ハイブリダイズした組換え 体／標的複合体を、ａ）非結合組換え体およびｂ）内部プローブと非相補性であ る核酸から分離することかできる。Ｂ、Ｃ，Ｆ、　Ｃｈｕ　ｅｔ　ａ、１．、　 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：５５９１　（１９８６）、Ｂ　 ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７：６０９（１９８９）を参照。複合体の単離後、 ＱＢ１ノブリカーゼを添加する。

数分間のうちに、組換え体のＩＯ意倍の増幅（すなわち組換えＲＮＡプローブ増 幅′）が起こり、標的配列との特異的ハイブリダイゼーションか生じたことを示 唆している。

一方、期待される手法、組換えＲＮＡプローブ増襠か良好に働くので、キャリオ ーバーは特に関心事項である。わずか１分子の鋳型ＲＮＡでさえ、原則として、 複製を開始することができる。このように、１分子の増幅組換えＲＮＡプローブ を新しい反応容器に持ち込むことにより非常に大量のＲＮＡが合成され、それ自 身、さらに先のキャリオーバーの起源となり得る。

（本頁以下余白） ３、ポリメラーゼ・チェイン・リアクションに、Ｂ、　Ｍｕｌｌｉｓらの米国特 許第４．６８３．１９５号および同第４．６８３．２０２号には、クローニング や精製することなくゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメントの濃度を高 める方法が開示されている。

標的配列を増幅するためのこの方法は、目的とする標的配列を含むＤＮＡ混合物 に大過剰の２種のオリゴヌクレオチドブライマーを導入し、続いてＤＮＡポリメ ラーゼの存在下で一連の熱循環を行うことから成っている。２種のプライマーは 二本鎖標的配列の各鎖に相補的である。増幅を行わせるために、ＤＮＡ混合物を 変性し、次いで標的配列内の相補配列にプライマーをアニーリングさせる。

アニーリング後、ポリメラーゼによりプライマーを伸長させて、新しい相補鎖の 対を形成させる。変性、ブライマーアニーリングおよびポリメラーゼ伸長の各段 階を多数回繰り返して（すなわち、変性とアニーリングと伸長反応が１つの“サ イクル”を構成し、多数の“サイクル”を行う）、目的の標的配列の増幅セグメ ントを高濃度で得ることができる。目的の標的配列の増幅セグメントの鎖長は互 いに対するプライマーの相対位置で決まり、かくしてこの長さは調節可能なパラ メーターである。この方法は、繰り返しから成るために、発明者によって“ポリ メラーゼ・チェイン・リアクション”　（以後ＰＣＲと呼ぶ）と命名された。目 的とする標的配列の増幅セグメントが混合物中で（濃度の点で）主要な配列とな るので、それらは“ＰＣＲ増幅された”と呼ばれる。

ＰＣＲを使用すると、ゲノムＤＮＡ中の単一コピーの特定の標的配列を、いくつ かの異なる方法（例えば、標識プローブとのハイブリダイゼーション；ビオチニ ル化プライマーの使用とその後のアビジン−酵素複合体の検出；３２Ｐ標識デオ キシヌクレオチドトリホスフエート、例えばｄＣＴＰまたはｄＡＴＰの増幅セグ メントへの組込み）によって検出できるレベルにまで、増幅することか可能であ る。ゲノムＤＮＡのほかに、適当な組のプライマー分子を使ってオリゴヌクレオ チド配列を増幅することもできる。特に、ＰＣＲ法により作製された増幅セグメ ントは、それら自体が後続のＰＣＲ増幅のための効果的な鋳型となる。

ＰＣＲ増幅法は約１０−”　Ｍの特定の標的配列のプラトー濃度に達することが 知られている。代表的な反応容量は１００μｌてあり、これは６　Ｘ　１０”の 二本鎖生成物分子の収量に相当する。この濃度では、わずか１フエムトリツトル （Ｉ０１マイクロリットル）程度の増幅ＰＣＲ反応混合物がその後の３０サイク ルのＰＣＲ増幅で検出可能なシグナルを発するのに十分な生成物分子を含んでい る。前のＰＣＲからの生成物分子が新たなＰＣＲ増幅に持ち込まれる場合、それ は新たなＰＣＲ反応の検出段階において偽陽性のシグナルを発生しつる。

ＰＣＲ増幅増幅度応混合物の取扱いは、後続のＰＣＲ増幅が偽陽性のシグナルを 発するのに十分な前の生成物分子を含むので、キャリオーバーをもたらす。Ｓ、 　Ｋｗｏｋ　ａｎｄ　Ｒ，Ｈｉｇｕｃｈｉ、　Ｎａｔｕｒｅ　３３９゜２８６　 （１９８９）。ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｈ，Ａ、　Ｅｒ１ｉｃｈ　（ｅ ｄ、）　（Ｓｔｏ’ｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ　１９８９）。これは、他のタイプ のキャリオーバーについて上述したように、エーロゾルによって又は直接導入に よって起こりうる。

キャリオーバーの制御 現在、キャリオーバーを制御するために３つの手法がある。これらは、ｌ）封じ 込め、２）排除、および／または３）阻止に大別される。封じ込めの手法を使用 する場合は、閉鎖系で増幅を行う。通常、これは他の全ての空間から密閉された 実験室の指定区域を意味する。もちろん、指定区域は特定の増幅検定に適合する ように作らねばならない。溶菌増殖による組み換えファージの複製の場合には、 その区域はウィルスまたはプラスミドの増殖を介してゲノムＤＮＡの増幅を可能 にすべきである。さらに、この区域は標的配列の増幅と増幅セグメントの検出に 必要な器具および試薬類をすべて提供すべきである。

封じ込めに伴う問題は、それが非常に不便であるということである。全ての増幅 段階に適する条件をもたらすように封じ込め区域を作るためには、実験室に別個 の器具類を備える必要がある。

その上、この二通りの器具類もキャリオーバーを受けやすい。時の経過とともに 、それは使用できなくなる。

キャリオーバーがすでに起こってしまった場合には、排除の手法を用いる。増幅 を行う実験室区域を完全にかつ徹底的に洗浄すると共に、酵素、緩衝液、他の試 薬類の新しいストックを供給する。全ての面をきれいに洗い、使い捨ての供給物 を全部取り替える。疑わしい実験室器具は処分するか、またはその区域から取り 除く。

排除の手法も満足のゆくものではない。第一に、その区域がキャリオーバーから 完全には解放されない。実際、洗浄法は、それ自体、エーロゾルを発生させる。

第二に、洗浄において要求される完全性の度合に多くの時間がかかりすぎる。最 後に、絶えず実験室器具を処分したり、除去したりすることは実際的でない。

ファージライブラリー中のプラスミドキャリオーバーを処理するための１つの阻 止法はプローブの精製である。本質的にプラスミドＤＮＡを含まないようにプロ ーブを精製すると、ブラスミトーブラスミドハイプリダイゼーションの発生率を 低下させることかできる。

この手法にも多くの問題がある。第一に、プラスミド−プラスミドハイブリダイ ゼーションの発生率を低下させる一方で、この方法はライブラリー中にキャリオ ーバーを残す。第二に、精製は決して１００％ではない：すなわち、この方法は この問題を軽減させるだけて、排除できない。このキャリオーバーは細菌のウィ ルスとプラスミドばかりてなく、動物や植物のウィルスとプラスミドさらに酵母 染色体ベクターのような最近の技法を含めて、あらゆるクローニングベクターに 本来備わっている問題である。

現在、組み換えＲＮＡプローブのキャリオーバーを処理するために、１つの阻止 法かある。これはＲＮ、Ａキャリオーバーを破壊するための塩基処理を含む。こ の手法はＤＮＡ標的に傷をつけないだろう。しかしなから、明らかに、それはＲ ＮＡ標的の処理として不適当である。

今までに考えられたＰＣＲキャリオーバーの唯一の阻止法は内部プライマー（ｎ ｅｓｔｅｄ　ｐｒｉｍｅｒ）の使用を伴う。もともと特異性を改良するためにＰ ＣＲて使用されたものであるか、キャリオーツ（−の問題を軽減させる手段とし て内部プライマーの手法をＰＣＲに応用することもてきる。内部プライマーとは 、ＰＣＲを開始させるために使用した２つのプライマーのアニーリング境界の内 側の領域で標的配列にアニーリングするプライマーのことである。Ｋ、Ｂ、　Ｍ ｕｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ ｏｓｉａ、Ｖｏｌ、Ｌｌ、ｐｐ、２６３−２７３　（１９８６）。キャリオーバ ーの問題に適用するときは、開始プライマーと重なり合わない配列をもつ内部プ ライマーを使用する。

内部プライマーは開始プライマーのアニーリング境界の内側て標的にアニーリン グするので、開始ブライン−の主要なＰＣＲ−増幅産物は、内部プライマーのア ニーリング境界によって定められるものよりも必然的に長い配列どなる。内部プ ライマーのＰＣＲ−増幅産物は、かくして、開始プライマーとアニーリングでき ない標的配列の増幅セグメンＩ・である。内部プライマーのこのＰＣＲ〜増幅産 物か後続のＰＣＲ増幅に持ち込まれる核酸である場合、開始プライマーの使用に より、このキャリオーバーは増幅されないだろう。

ＰＣＲ反応中のキャリオーバーに対して内部プライマー溶液を使うことには少な くとも２つの問題かある。第一に、キャリオーバーは除去されないし、失活もさ れない（失活とはＰＣＲて核酸を増幅できなくすることと定義される）。第二に 、内部プライマーの増幅産物は、後続のＰＣＲて同し内部プライマーを使うとき 、増幅されるだろう。

もちろん、後続のＰＣＲ増幅でのキャリオーバーに対する別の溶液は全く異なる プライマーを使用すべきである。しかしながら、これは実際的な溶液ではない。

第一に、新たなＰＣＲ増幅ごとに新たなプライマーを作るには非常に時間かかか り、経費もかかるだろう。第二に、それぞれのプライマー対によるＰＣＲ増幅反 応を個々に最適化する必要かある。第三に、所定の長さの標的配列の場合、作製 しうる非重複プライマーの数に制限かある。

本発明はキャリオーバーを制限するための最初の決定的な方法を提供する。これ らの方法はブソラレンとイソブソラレンを含む化合物の使用を伴うものである。

ブソラし・ン：　ブソラレンはフラン環とクマリンとの線状縮合により形成され る三環式化合物である。ブソラレンは二本鎖核酸の塩基対の間に入り、長波紫外 線の吸収の際にピリミジン塩基と共有結合付加物を形成することがてきる。Ｇ、 　Ｄ、　Ｃ１ｍ１ｎｏ　ｅｔ　ａｔ、　、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、　５４：１１５１　（１９８５’）　ｏ　Ｈｅａｒｓｔ　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｑｕａｒｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　１７：Ｉ　（１９８４）　。ブソ ラレンービリミジンモノ付加物に隣接して反対の鎖上に第二のピリミジンか存在 すると、第二フォトンの吸収により、錫量架橋として機能するジ付加物が形成さ れうる。Ｓ、Ｔ、ｌ５ａａｃｓ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 １６：１０５８　（１９７７）。

Ｓ、Ｔ、ｌ５ａａｃｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　円〕ｏｔｏｂｉｏ ｌｏｇｙ　（Ｐｌｅｎｕｍ）ｐｐ、２７９−２９４　（１９Ｆ１２）　ｏ　Ｊ、 　Ｔｅｓｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｅｈｅｎ＋、　２４：１６６９　（ １９８５）。

ｆ（ｅａｒｓ　ｔらの米国特許第４．１２４．５８９号（＋９７８）。Ｈｅａｒ Ｓｔらの米国特許第４．１６９．２０４号（１９８０）。１（ｅａｒＳｔらの米 国特許第４．１９６．２８１号（１９８０）。

イソブソラレン：　イソブソラレンは、ブソラレンと同様に、フラン環とクマリ ンとの縮合により形成される三環式化合物である。

Ｂａｅｃｉｃｈｅｔｔｉ　らの米国特許第４．３１２．８８３号；　Ｆ、　Ｂｏ ｒｄｉｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ　３５：１５６７　（１９７９）；　Ｆ、　Ｄａｌｌ’ Ａｃｑｕａ　ｅｔ　ａｌ、、　ＭｅｄｅｌｉｎｅＲｉｏｌｏｇｉｅ　Ｅｎｖｉｒ 、　９：３０３　（１９８１）；　Ｓ、Ｃａｆｆ１ｅｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅ ｄｅｃｉｎｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅ　Ｅｎｖｉｒ、　ＩＩ：３８６　（１９８３） ；　Ｆ、　ＤａｌＦＡｃｑｕａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｈ。

ｔｏｃｈｅｍ　Ｐｈｏｔｏｂｉｏ、　３７：３７３　（１９８３）；　Ｇ、　Ｇ ｕｉｏｔｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｍ−Ｃｈｉｍ、　Ｔｈｅｒ、　１６：４８９　（１９８１）； 　Ｆ、　Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｍ、　２４：１７８　（１９８４）を参照されたい。ブ ソラレンと違って、イソブソラ［ノンの環は線状の環構造をとらない。二本鎖核 酸の塩基対の間に入り、長波紫外線の吸収の際に核酸塩基と共有結合付加物を形 成することかできるか、イソブソラレンは、それらの角張った形状のために、通 常はＤＮＡとの架橋を形成することかできない。一般的には、Ｇ、Ｄ、　Ｃ１ｍ １ｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。５４：１１５ １　（１９８５）を参照されたい。

本発明の目的および利点は、添付図面と関連させて読むとき、以下の説明から明 らかになるだろう。

発明の要約 本発明は、活性化化合物と、ｉ）核酸に活性化化合物を結合する、および１１） 核酸の失活を含む、核酸の鋳型依存性酵素的合成の阻止に活性化化合物を使用す る、ための方法に関する。

活性化化合物に関して、本発明は、５−メチルイソブソラレンを合成するための 新規な方法を提供する。一実施態様において、本方法は次の工程：ａ）７−ヒド ロキシ−５−メチルクマリンを供給すること：およびｂ）　７−ヒドロキシ−５ −メチルクマリンを処理して５−メチルイソブソラレンを製造すること；から成 っている。他の実施態様では、本方法は次の工程：ａ）７−　ヒドロキシ−５− メチルクマリンを供給すること；ｈ）７−ヒドロキシ−５−メチルクマリンを処 理して７−（２，２−ジェトキシエチルオキシ）−５−メチルクマリンを製造す ること；およびｃ）　７−（２，２−ジェトキシエチルオキシ）−５−メチルク マリンを処理して５−メチルイソブソラレンを製造すること；から成っている。

本発明はさらに、４．５′−ジメチルイソブソラレンを合成するだめの新規な方 法を提供する。この方法は次の工程：ａ）７−アルキルカルボニルオキシ−６− （β−ハロアリル）−４−メチルクマリンを供給すること；およびｂ）　７−ア ルキルカルボニルオキシ−６−（β−ハロアリル）−４−メチルクマリンを処理 して４．５′−ジメチルイソブソラレンを製造すること；から成っている。

本発明はさらに、４′−アミノメチル−４，５′−ジメチルイソブソラレンの新 規合成方法を提供する。一実施態様において、この方法は次の工程：ａ）７−ア ルキルカルボニルオキシ−６−（β−ハロアリル）−４−メチルクマリンを供給 すること；ｂ）７−アルキルカルボニルオキシ〜６−（β−ハロアリル）−４− メチルクマリンを処理して４．５′−ジメチルイソブソラレンを製造すること； およびｃ）４．５′−ジメチルイソプソラレンを処理して４′−アミノメチル− ４，５′−ジメチルイソブソラレンを製造すること：から成っている。

他の実施態様では、この方法は次の工程：ａ）４．５’−ジメチルイソブソラレ ンを供給すること；およびｂ）４．５’−ジメチルイソブソラレンを窒素供与体 と反応させて４′−アミノメチル−４，５’−ジメチルイソブソラレンを製造す ること：から成っている。窒素供与体はフタルイミド塩、Ｎ−ヒドロキシメチル フタルイミドおよびヘキサメチレンテトラミンより成る群から選ばれる。さらに 他の実施態様では、この方法は次の工程：ａ）４’−ヒドロキシメチル−４，５ ′−ジメチルイソブソラレンを供給すること；　ｂ）　４’−ヒドロキシメチル −４，５′−ジメチルイソブソラレンを処理して４′−ハロメチル−４，５′− ジメチルイソブソラレンを製造すること；ｃ）４′−ハロメチル−４，５′−ジ メチルイソプソラレンを処理して４′−フタルイミドメチル−４，５′−ジメチ ルイソブソラレンを製造すること；およびｄ）４′−フタルイミドメチル−４， ５′−ジメチルイソブソラレンを処理して４′−アミノメチル−４，５′−ジメ チルイソブソラレンを製造すること；から成っている。

本発明は、式： ［式中、Ｒ１は−０１（、−Ｂｒ　、　−ＣＩ　、−１、−Ｎ）Ｉ、、または− ＮＨ２”　Ｘ−であり、ここでＸ−はＢｒ−、ＣＦまたは■−であり、そしてＲ ２、Ｒ３およびＲ４は同一であっても異なっていてもよく、−Ｈまたは一１Ｈで あるｊを存する化合物を包含する。

本発明はさらに式： ［式中、Ｒ１は−Ｂｒまたは＝■であり、Ｒ２とＲ２は同一であっても異なって いてもよく、−Ｈまたは一３Ｈである］を有する新規化合物を包含する。

本発明はさらに式： ％式％） てあり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同一てあっても異なっていてもよく、−Ｈまた は一３Ｈであり、Ｒ，＝　Ｒ，＝−ＣＨ，、−Ｃ２１（１，−Ｃ２Ｈ７または− Ｃ４Ｈ９であり、そしてＲ１は式−Ｈまたは：を有する１を有する新規化合物ま たはその塩を包含する。

本発明はさらに式： てあり、Ｒ２とＲ１は同一であっても異なっていてもよく、−Ｈまたは３Ｈてあ り、Ｒ，＝　Ｒ，＝−ＣＨ，、−ＣＪｓ　、−ＣＪ７または−Ｃ−Ｈ＊であり、 そしてＲ５は式−Ｈまたは： （本頁以下余白） または を有する１を有する新規化合物またはその塩を包含する。

本発明はさらに式・ ［式中、Ｒ１とＲ２は同一であっても異なっていてもよく、−Ｈまたは３Ｈであ る１を有する化合物を包含する。

本発明はさらに式： ［式中、Ｒは−Ｈまたは”Ｈである］を有する化合物を包含する。

本発明はさらに式 ［式中、Ｒ１とＲ２は同一てあっても異なっていてもよく、−ＣＨ，、−Ｃ２Ｈ ，、−Ｃ，Ｈ，または−Ｃ，Ｈ，である］を有する化合物を包含する。

本発明はさらに式： ［式中、Ｘは−Ｃ１、−Ｂｒ　、または＝Ｉである］を存する化合物を包含する 。

本発明はさらに式： ［式中、χは−Ｃｌ　、−Ｂｒ　、または−Ｉてあり、Ｒは−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ ５、−Ｃ３Ｈ，または−Ｃ４Ｈ、である１を有する化合物を包含する。

［式中、Ｒ３、Ｒ２およびＲ１は同一てあっても異なっていてもよく、−）（ま たは’Ｈである１を有する化合物を包含する。

本発明はさらに次の工程：ａ）５−ハロメチルイソプソラレンを供給すること、 および１））５−ハロメチルイソブソラレンを処理して５−アミノメチルイソブ ソラレンを製造する。ことから成る５−一了ミノメチルイソブソラレンの合成方 法を包含する。一実施態様において、５−ハロメチルイソブソラｌ／ンの供給は 、５−メチルイソブソラレンから５−ブロモメチルイソブソラレンを合成するこ とから成る。別の実施態様ては、５−ハロメチルイソブソラレンの処理は、５− ハ［７メチルイソブソラレンをヘキサメチレンテトラミンと反応させることから 成る。

本発明はさらに次の工程′ａ）ホルミルイソブソラレンを供給すること：および ｂ）前記ホルミルイソブソラし・ンを処理して放射能標識５−アミノメチルイソ ブソラレンを製造する；ことから成る放射能標識５−アミノメチルイソブソラレ ンの合成方法を包含する。

本発明は前記化合物の核酸への結合を包含する。一実施態様において、本発明は 、核酸に結合した１以上の前記化合物から成る複合体を包含する。別の実施態様 では、本発明は、核酸に結合した（その際の結合は非共有結合である）１以上の 前記化合物から成る複合体を包含する。さらに別の実施態様では、本発明は、核 酸に結合した（その際の結合は共有結合である）１以上の前記化合物から成る複 合体を包含する。

本発明は、高レベル付加での新呪および既知化合物の核酸への結合を包含する。

一実施態様において、本発明は、５０の核酸塩基対あたり１．より多い５−アミ ノメチルイソブソラレン分子の付加１ノベルで、核酸に結合した５−アミノメチ ルイソブソラＩ／ンから成る複合体を包含する。別の実施態様では、本発明は、 ５０の核酸塩基対あたり１より多い４′−アミノメチル−４，５′−ジメチルイ ソブソラレン分子の付加レベルで、核酸に結合した４′−アミノメチル−４，５ ′−ジメチルイソブソラレンから成る複合体を包含する。

一実施態様において、本発明は、次の工程：ａ）５−　アミノメチルイソブソラ レンと核酸を供給すること、およびｂ）　５−アミノメチルイソブソラｌノンを 前記核酸に結合させること；から成る５−アミノメチルイソブソラレン／核酸複 合体の製造方法を包含する。

一実施態様において、二の方法は共有結合を与える。一実施態様において、本発 明は、共有結合を５−了ミノメチルイソブソラ１ノンの光活性化により達成する ことを包含する。一実施態様ては、光活性化は前記５−アミノメチルイソブソラ レンの電磁線への暴露により達成される。

本発明は結合した核酸の性質によって制限されるものではない。

本発明はあらゆる形態および起源のＲＮＡおよびＤＮＡを意図している。一実施 態様では、核酸は真核生物ＤＮＡおよび原核生物ＤＮＡより成る群から選ばれる 。別の実施態様では、前記複合体の核酸はヒト免疫不全ウィルス核酸である。別 の実施態様において、前記複合体の核酸はヒト核酸である。さらに別の実施態様 において、核酸はウィルス、細菌、真菌、マイコプラズマおよび原生動物の核酸 より成る群から選ばれる。

本発明はさらに核酸の標識方法を包含する。一実施態様では、この方法は次の工 程：ａ）標識５−アミノメチルイソブソラレンと核酸を供給すること；およびｂ ）前記５−アミノメチルイソブソラレンを前記核酸に結合させること：から成っ ている。

本発明はさらに、次の工程：ａ）１以上のフロクマリンと核酸を供給すること； およびｂ）　１以上のフロクマリンを前記核酸にカップリングして、Ｔａｑポリ メラーゼによる核酸の複製を阻止すること；から成る、核酸の鋳型依存性酵素的 合成を阻止する方法を包含する。

別の実施態様において、本発明さらに、次の工程：ａ）５−メチルイソブソラレ ンと核酸を供給すること；およびｂ）前記５−メチルイソブソラレンを前記核酸 に結合させて、逆転写酵素による核酸の複製を阻止すること；から成る、核酸の 鋳型依存性酵素的合成を阻止する方法を包含する。

本発明はさらに、次の工程：ａ）５−メチルイソブソラレンと核酸を供給するこ と；およびｂ）前記５−メチルイソブソラレンを前記核酸に結合させて、Ｔａｑ ポリメラーゼによる核酸の複製を阻止すること：から成る、核酸の鋳型依存性酵 素的合成を阻止する方法を包含する。

本発明はさらに、次の工程：ａ）５−メチルイソプソラレンと核酸を供給するこ と；およびｂ）前記５−メチルイソプソラレンを前記核酸に結合させて、Ｔ４ポ リメラーゼによる核酸の複製を阻止すること；から成る、核酸の鋳型依存性酵素 的合成を阻止する方法を包含する。

本発明はさらに、次の工程：ａ）５−アミノメチルイソブソラレンと核酸を供給 すること；およびｂ）前記５−アミノメチルイソブソラレンを前記核酸に結合さ せて、逆転写酵素による核酸の複製を阻止すること；から成る、核酸の鋳型依存 性酵素的合成を阻止する方法を包含する。

本発明はさらに、次の工程：ａ）５−アミノメチルイソブソラレンと核酸を供給 すること；およびｂ）前記５−アミノメチルイソブソラレンを前記核酸に結合さ せて、Ｔａｑポリメラーゼによる核酸の複製を阻止すること：から成る、核酸の 鋳型依存性酵素的合成を阻止する方法を包含する。

本発明はさらに、次の工程：ａ）５−アミノメチルイソブソラレンと核酸を供給 すること；およびｂ）前記５−アミノメチルイソブソラレンを前記核酸に結合さ せて、Ｔ４ポリメラーゼによる核酸の複製を阻止すること；から成る、核酸の鋳 型依存性酵素的合成を阻止する方法を包含する。

本発明はさらに、次の工程：ａ）４’−アミノメチル−４，５′−ジメチルイソ ブソラレンと核酸を供給すること；およびｂ）前記４′〜アミノメチル−４，５ ′−ジメチルイソブソラレンを前記核酸に結合させて、逆転写酵素による核酸の 複製を阻止すること；から成る、核酸の鋳型依存性酵素的合成を阻止する方法を 包含する。

本発明はさらに、次の工程：ａ）’４’−アミノメチルー４，５′−ジメチルイ ソブソラレンと核酸を供給すること；およびｂ）前記４′−アミノメチル−４， ５′−ジメチルイソプソラレンを前記核酸に結合させて、Ｔａｑポリメラーゼに よる核酸の複製を阻止すること；から成る、核酸の鋳型依存性酵素的合成を阻止 する方法を包含する。

本発明はさらに、次の工程：ａ）４’−アミノメチル−４，５′−ジメチルイソ プソラレンと核酸を供給すること、およびｂ）前記４′−アミノメチル−４，５ ′−ジメチルイソブソラレンを前記核酸に結合させて、Ｔ４ポリメラーゼによる 核酸の複製を阻止すること；から成る、核酸の鋳型依存性酵素的合成を阻止する 方法を包含する。

本発明はさらに、次の工程：ａ）４’−アミノメチル−４，５′−ジメチルイソ ブソラレンと核酸を供給すること：およびｂ）前記４′−アミノメチル−４，５ ′−ジメチルイソブソラレンを前記核酸に結合させて、大腸菌ＤＮＡポリメラー ゼＩによる核酸の複製を阻止すること：から成る、核酸の鋳型依存性酵素的合成 を阻止する方法を包含する。

本発明はさらに、次の工程：ａ）４’−アミノメチル−４，５′−ジメチルイソ ブソラレンと核酸を供給すること；およびｂ）前記４′−アミノメチル−４，５ ′−ジメチルイソブソラレンを前記核酸に結合させて、Ｋｌｅｎｏｗポリメラー ゼによる核酸の複製を阻止すること；から成る、核酸の鋳型依存性酵素的合成を 阻止する方法を包含する。

本発明はまた、核酸が、増幅後に、続いて増幅できないように、増幅すべき核酸 を処理する方法を包含する。一般に、この核酸処理法は：ａ）任意の順序で、１ ）核酸、ｉｌ）増幅試薬、１ｉｉ）　１種またはそれ以上の増幅酵素、１ｖ）１ 種またはそれ以上の失活用化合物、およびＶ）反応物を収容する手段を供給する こと；ｂ）反応物収容手段に、任意の順序で、核酸と増幅試薬を加えて反応混合 物をつくること：およびＣ）この反応混合物に、時間的順序を特定せずに、１） １種またはそれ以上の増幅酵素と、１ｉ）１種またはそれ以上の失活用化合物を 加えること；から成っている。好適な実施態様では、この方法はさらに、反応混 合物に１種またはそれ以上の増幅酵素を添加した後で直ちに反応物収容手段を閉 鎖することから成っている。

一実施態様において、核酸は１またはそれ以上のセグメントを有する標的配列を 含む。反応混合物に１種またはそれ以上の増幅酵素を添加した後で、工またはそ れ以上のセグメントが増幅される。工程Ｃ）の後、増幅セグメントは実質的に非 増幅性である。この方法は、一実施態様において、次の追加工程：ｄ）増幅した 、実質的に非増幅性のセグメントを検出すること：を含む。検出はハイブリダイ ゼーションにより行うことができる。

別の実施態様において、核酸は１またはそれ以上の内部プローブを含む。１種ま たはそれ以上の増幅酵素を添加した後で、■またはそれ以上の内部プローブが増 幅される。工程Ｃ）の後、増幅した内部プローブは実質的に非増幅性である。こ の方法は、一実施態様において、次の追加工程：ｄ）増幅した、実質的に非増幅 性の内部プローブを検出すること；を含む。

別の実施態様において、増幅試薬はＰＣＲ試薬である。増幅酵素はＴａｑポリメ ラーゼのような熱安定性ポリメラーゼである。

本発明は核酸の性質によって限定されない。一実施態様において、核酸はデオキ シリボ核酸である。他の実施態様では、核酸はリボ核酸である。

一実施態様において、１種またはそれ以上の失活用化合物は活性化化合物である 。別の実施態様では、失活用活性化化合物は光反応性化合物である。

一実施態様において、反応混合物に１種またはそれ以北の増幅酵素を添加した後 で、失活用光反応性活性化化合物を活性化する３３別の実施態様では、反応混合 物に１種またはそれ以北の失活用光反応性活性化化合物を添加した後で、失活用 光反応性活性化化合物を活性化する。好適な実施態様では、反応混合物を紫外線 に砧露することにより、失活用光反応性活性化化合物を活性化する。

一実施態様では、反応混合物を紫外線の蛍光源に暴露することにより、失活用光 反応性活性化化合物を活性化する。一実施態様では、反応混合物に１種またはそ れ以上の失活用光反応性活性化化合物を添加する前に、失活用光反応性活性化化 合物を活性化する。

この方法の一実施態様では、１種またはそれ以上の失活用化合物は光生成物であ る。

さらに別の実施態様では、失活用光反応性活性化化合物はブソラレンやイソブソ ラレンのようなフロクマリン誘導体である。好適な実施態様において、失活用イ ソブソラレンは５−メチルイソブソラレン、５−アミノメチルイソブソラレン、 ４．５′−ジメチル、イソブソラレン、４′−アミノメチル−４，５′−ジメチ ルイソブソラレン、およびそれらの放射能標識誘導体より成る群から選ばれる。

図面の説明 図１は、出発物質として５−メチルレゾルシノールを用いた本発明化合物の合成 図式を示す。

図２は、出発物質としてレゾルシノールを用いた本発明化合物の合成図式を示す 。

図３は、失活用化合物についての活性化化合物のスクリーニングに伴う工程を模 式的に示す。

図４は、特定の増幅系による核酸の増幅に伴う工程を模式的に示す。

図５は、化合物の溶解性を測定する方法を模式的に示す。

図６は、本発明の光活性化デバイスの具体例（ＣＥ−Ｉ）の透視図である。

図７は、図６のう、インａ−−−−ａに沿ったＣＥ−１の断面図である。

図８は、図６のラインｂ−−ｂに沿ったＣＥ−１の断面図である。

図９は、本発明の光活性化デバイスの別の具体例（ＣＥ−１１）の透視図である 。

図１０は、図９のラインＣ−−Ｃに沿ったＣＥ−ＩＩの断面図である。

図１１は、本発明の光活性化デバイスのさらに別の具体例（ＣＥ−［１１）の透 視図である。

図１２は、図１１のラインｄ−−ｄに沿ったＣＥ−Ｉ　Ｉ　Ｉの断面図である。

図１３は、図１１のラインｅ−−ｅに沿ったＣＥ−ＩＩＩの断面図である。

図１４は、多数の試料を処理するための着脱可能な試料１−レーの透視図である 。

図１５は、試料の温度に対する照射時間の影響を示す。

図１６は、本発明デバイスの別の具体例の相対エネルギー出力を示す。

図１７は、結合の測定法を模式的に示すフローチャートである。

図１８は、本発明の光活性化デバイスの特定具体例による共有結合を示す。

図１９は、試料位置に対する本発明デバイスの具体例の光度を示す。

図２０は、試料位置に対する共存結合を示す。

図２１は、光生成物の製造の測定法を模式的に示す。

図：２２は、時間に対する光生成物の製造を示す。

図２３は、本発明の光活性化デバイスの具体例による光生成物の製造を示す。

図２４は、本発明の新規化合物からの光生成物の製造を示す。

図２５は、濃度の関数としての結合を示す。

図２６は、単一のモノ付加物を含む７１−ｍｅｒの合成と伸長に使用したすりゴ ヌクレオチド系を示す。

図２７は、モノ付加鋳型の合成法を示す。

図２８は、プライマー伸長の測定法を示す。

図２９は、ＭＩＰによるポリメラーゼ阻害結果を示すゲル電気泳動後のオー　ト ラジオグラフである。

図３０は、ＡＭＩＰによるポリメラーゼ阻害結果を示すゲル電気泳動後のオート ラジオグラフである。

図３１は、ＡＭＤＭＩＰによるポリメラーゼ阻害結果を示すゲル電気泳動後のオ ートラジオグラフである。

図３２は、ＡＭＩＰ、　ＡＭＤＭＩＰ、およびＭＩＰ　７１−ｍｅｒモノ付加物 によるポリメラーゼ阻害結果を示すゲル電気泳動後のオートラジオグラフである 。

図３３は、反復サイクル後のＡＭＩＰ、　ＡＭＤＭＩＰ、およびＭＩＰ　７１− ｍｅｒモノ付加物によるＴａｑポリメラーゼ阻害結果を示すゲル電気泳動後のオ ートラジオグラフである。

図３４は、１（ＰＬＣ−再精製した５−Ｍ［Ｐモノ付加物の阻害結果を示すゲル 電気泳動後のオートラジオグラフである。

図３５は、Ｈ！１ｉＴ　７１−ｍｅｒモノ付加物によるＴａｑポリメラーゼ阻害 結果を示すゲル電気泳動後のオートラジオグラフである。

図３６は、　Ｈ［Ｖ　ＤＮ、Ａの増幅とその後の検出のためのオリゴヌクレオチ ド系を示す。

図３７は、光生成物によるＰＣＲの失活を示すゲル電気泳動後のオートラジオグ ラフである。

図３８は、光生成物の濃度に対するＰＣＲの失活を示すゲル電気泳動後のバンド 切り出しからのカウント数（ＣＰＭ）のプロットである。

図３９は、使用した光活性化デバイスによるＰＣＲの失活を示すゲル電気泳動後 のオートラジオグラフである。

図４０は、サイクル数によるＰＣＲ失活の測定法を模式的に示す。

図４１は、サイクル数によるＰＣＲ失活の測定法を模式的に示す。

図４２は、ＰＣＲ失活の好適な測定法を模式的に示す。

図４３は、ＰＣＲの失活を示すゲル電気泳動後のオートラジ才グラフである。

図４４は、失活に対する修飾密度と標的長さの影響を示す、オートラジオグラフ ィーで視覚化し、切り出し、液体シンチレーションカウンターで計数したＰＣＲ 生成物バンドのプロットしたカウント数を示す。

図４５は、２つの異なるハイブリダイゼーションフォーマツ　′ト１）オリゴヌ クレオチドハイブリダイゼーション（ＯＨ）と２）架橋性オリゴヌクレオチドプ ローブ分析（ＣＯＰ）を模式的に示す。

図４６は、架橋性オリゴヌクレオチドプローブ分析（ＣＯＰ）による失活後のハ イブリダイゼーションを示す、ゲル電気泳動後のオートラジオグラフである。

図４７は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＯＨ）による失活後の ハイブリダイゼーションを示す、ゲル電気泳動後のオートラジオグラフである。

図４８は、ＨＬＡ　ＤＮＡ系のＰＣＲ失活を示すゲル電気泳動後のオートラジオ グラフである。

図４９は、非フロクマリン化合物によるＰＣＲの阻害を示すゲル電気泳動後のオ ートラジオグラフである。

（本頁以下余白） 発明の説明 本発明は、活性化化合物と、ｌ）核酸に活性化化合物を結合する、および自）核 酸の失活を含む、核酸の鋳型依存性酵素的合成の阻止に活性化化合物を使用する 、ための方法に関する。

■、化合物の合成 “活性化化合物”とは、トリガー（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ：開始させる）刺激に 応答して化学変化を受ける化合物のファミリーと定義される。トリガー刺激には 熱刺激、化学的刺激および電磁刺激が含まれるが、これらに限定されない。“光 反応性活性化化合物”（または単に“光反応性化合物”）とは、電磁線に応答し て化学変化を受ける活性化化合物ファミリー中のある属の化合物と定義される（ 表１）。

表１．光反応性化合物 アクナノマイシン類 アントラサイクリノン類 フルオレン類およびフルオレノン類 フロクマリン類 マイトマイシン モノストノル・ファースト・ブルー ノルフィリンＡ 有機染料 ここて、中央の芳香族部分に結合した２個の酸素残基は１，３配向多環式炭化水 素類 キノリン類 を有し、そしてフラン環部分は二環クマリン系の８位に結合している。ブソラレ ン誘導体は線状フロクマリンの３．４．５．８．４′または５′位での置換から 誘導され、一方イソプソラレン誘導体は角張ったフロクマリンの３．４．５．６ ．４′または５′表２．フロクマリン誘導体ＣＭＩＰ系列）＃　化合物　略号 １７−ヒドロキシ−５−メチルクマリン　８５ＭＣ２７−（２，２−ジェトキシ エチルオキシ）−５−メチルクマリン　ＤＥ！１ｔｃ ３５−メチルイソブソラレン　ＶＩＰ ４　［４’　、　５’　−Ｈｚ］−４’　、　５’−ジヒドロ−５−メチルーイ ソプソラレン　ＤＩ（ＶＩＰ ５５−ハロメチルイソブソラレン　ＸＭＩＰ５−ブロモメチルイソブソラレン　 ＢＭＩＰＳ−クロロメチルイソブソラレン　ＣＭｊＰ６５−ヒドロキシメチルイ ソブソラレン　）ＩＭＩＰ７５−ホルミルイソブソラレン　ＦｊＰ８５−ヨード メチルイソブソラレン　ＩＭＩＰ９５−ヘキサメチレンテトラミノ ーメチルイソブソラレン　ＨＭＴＡＭＩＰｌｏ　５−アミノメチルイソブソラレ ン　ＡＭＩＰｌｌ　５−Ｎ’（Ｎ、Ｎ’−ジメチル−１，６−ヘキサンジアミン ）−メチルーイソブソラレン　Ｄ＼（ＨＭＩＰ１２ａ　５−Ｎ−［Ｎ、Ｎ’−ジ メチル−（６−［ビオチンアミド］−ヘキサノエート）−１，６−ヘキサンジア ミン１−メチルーイソブソラレン　ＢＩＯＭｉＰ１２ｂ　５−Ｎ−［Ｎ、Ｎ’− ジメチル−Ｎ’　−（２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３−ジチオプロピ オネート）−１，６−ヘキサンジアミン１−メチルイソブソラレンＤＩＴＨＩＯ ＼（ＩＰ−ジメチルイソブソラレン　ＰＨＩＭＤ）ＪＩＰ１２ｃ　５−Ｎ−［Ｎ 、Ｎ’−ジメチル−Ｎ′−（カルボキシフルオレセインエステル）−１，６−ヘ キサンジアミン）−メチルーイソブソラレン　ＦＬＵＯＲＭＩＰ表３．フロクマ リン誘導体（ＤＭ＋Ｐ系列）１３　７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン　８４ ＭＣ１４７−（β−ハロアリルオキシ）−４−メチルクマリン　ＸＡＭＣ７−（ β−クロロアリルオキシ）−４−メチルクマリン　ＣＡＭＣ１５７−アリルオキ シ−６−（β−ハロアリル）＝４−メチルクマリン　ＲＸＡＭＣ ７−プチルオキシー６−（β−クロロアリル）＝４−メチルクマリン　ＢＣＡＭ Ｃ １６４，５’−ジメチルイソブソラレン　ＤＭＩＰ１７　［４’、５’−’Ｈ２ ］−４’、５’−ジヒドロー４，５′−ジメチルイソブソラレン　ＤＨＤＭＩＰ １８　４′−ハロメチル−４，５′−ジメチルーイソブソラレン　ＸＭＤＭＩＰ ４′−クロロメチル−４，５′−ジメチルーイソプソラレン　ＣＭＤＭＩＰ ４′−ブロモメチル−４，５′−ジメチルーイソブソラレン　ＢＭＤＭＩＰ １９　４′−ヒドロキシメチル−４，５′−ジメチルーイソブソラレン　ＨＭＤ ＭＩＰ ２０　４′−ホルミル−４，５′−ジメチルーイソブソラレン　ＦＤＭ［Ｐ ２１　４′−フタルイミドメチル−４，５′本発明は使用する標識の性質によっ て限定されるものではない。

２２　４′−アミノメチル−４，５′−ジメチルーイソブソラレン　ＡＭＤＭＩ Ｐ ２３　４′−ヨードメチル−４，５′−ジメチルーイソブソラレン　ＩＭＤＶＩ Ｐ ２４　４’−Ｎ−（Ｎ、Ｎ’−ジメチル−１，６−ヘキサンジアミン）−メチル ー４．５′−ジメチルイソブソラレン　ＨＤＡＭＤＭＩＰ２５ａ　４　’　−Ｎ −［Ｎ、Ｎ　’−ジメチルーＮ’　−（６−（ビオチンアミド）−ヘキサノニー ）　）−１，６−ヘキサンジアミン］−メチル−４，５′−ジメチルイソブソラ レン　ＢｊＯＤＭＩＰ２５ｂ　４　’　−Ｎ−［Ｎ、Ｎ　’−ジメチルーＮ’　 −（２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３−ジチオプロピオネ−）　）−１ ，６−ヘキサンジアミン１−メチル−４，５′−ジメチルイソブソラレン　Ｄ＋ ＴＨＩＯＤＭＩＰ２５ｃ　４’−Ｎ−［Ｎ、Ｎ’−ジメチル−Ｎ’　−（６−カ ルボキシ−フルオレセインエステル）−１，６−ヘキサンジアミン１−メチル− ４，５′−ジメチルイソブソラレン　ＦＬＵＯＲＤＭＩＰ（本頁以下余白） 本発明は単−標識付け（例えば、放射能標識、蛍光団なと）と二重標識付け（例 えば、２個の放射能標識、１個の放射能標識と蛍光団なと）を包含する。

竹定の標識に限定するものではないか、化合物の検出を容易にする本発明の好適 な標識はトリチウム（３Ｈ）である。化合物に結合した分子の検出を容易にする 本発明の好適な標識はビオチンである。図１および２はこれらの好適な標識（並 びにいくつかの他の標識）を示すために作成されたものであり、これにより本発 明は限定されない。

図１および２に示すように、本発明化合物の合成経路は式＝［式中、Ｒは−ＣＨ ，または−Ｈである］の化合物から出発する。

Ｒか−ＣＨ３である場合（図１；表２）、出発化合物は５−メチルレゾルシノー ルである。Ｒが−Ｈである場合（図２：表３）、出発化合物はレゾルシノールで ある。従って、本発明化合物の合成法の記載は２つのバートで進行する。

Ａ、バート１：Ｒか−ＣＨ，に等しい Ｒか−ＣＨ，である場合（図１：表２）、合成は既知化合物であるＶＩＰ　（化 合物＃３）への２つの新しい合成法の１つを経て進行する。これらの新規ＶＩＰ 合成法の１つは新規化合物ＤＥＭＣ（化合物＃２）を経て進行する。

ＶＩＰの製造後、この合成を続けることにより、ｉ）新規化合物ＸＭＩＰ（化合 物＃５）、ＨＭＴＰ（化合物＃６）、ＦＭＩＰ（化合物＃７）、ＩＭＩＰ（化合 物＃８）、ＨＭＴＡＭＩＰ（化合物＃９）、ＡＭＩＰ（化合物＃１０）　、ＤＭ ＨＭＩＰ（化合物＃１１）　、８１０ＶＩＰ（化合物＃１２ａ）、ＤＩＴＨｒＯ ＭＩＰ（化合物＃１２ｂ）、および／またはＦＬＵＯＲＭＩＰ（化合物＃１２ｃ ）、あるいはｉｉ）放射能標識化合物を製造することかできる。（図１では、未 標識型と標識型の両方の化合物を合成しつる場合、放射能標識をかっこ内に示し である。）図１に示すトリチウム標識化合物のほかに、類似の１４０誘導体、＋ ４０標識５−メチルレゾルシノールも製造することができる。

新規化合物ＡＭＩＰ　、　ＢｒＯＭＩＰ、　ＤＩＴＨＩＯＭＩＰおよびＦＬＵＯ ＲＭ［Ｐの合成法はすべて新規化合物中間体ＸＭ［Ｐを経て進行する。ＸＭＩＰ はＣＭＩＰまたはＢＶＩＰとして定義される。ＡＭＩＰ、　ＢＩＯＭＩＰ、　Ｄ ＩＴＨＩＯＭＩＰおよびＦＬ［ＪＯＲＭＩＰの合成法の一部は、ＸＭＩＰから新 規化合物ＩＭＩＰ（化合物＃８）を経て進行する。

Ｒが−ＣＨ１に等しい場合の本発明合成法は新規ＶＩＰ合成法から開始する。

１）　ＶＩＰの合成 本発明は、新規ＶＩＰ誘導体の合成に先立って、ＭＩＰおよび／または標識ＶＩ Ｐを合成するだめの新規手法を包含する。

ＶＩＰを合成するために２つの新しい方法を提供する（図１）。

第一のＶＩＰ合成法の第一工程は、５−メチルレゾルシノールとリンゴ酸を反応 させて８５ＭＣ（化合物Ｈ）を生成することから成る。第−法の第二工程は、Ｈ ５ＭＣをハロアセトアルデヒドジエチルアセタールを反応させて８５ＭＣのジェ トキシエチルエーテル、ＤＥＭＣ（化合物＃２）を製造することを含む。ハロア セトアルデヒドジエチルアセタールはクロロ−、ヨード−またはプロモーアセト アルデヒドジエチルアセタールでありうる。第−法の第三工程では、ＤＥＭＣを 閉環処理して２つの異性体、５−メチルプソラレンとＶＩＰ　、を得、これらを 分離して純粋なＭｒＰ（化合物＃３）を単離する。

第二のＭＩＰ合成法の第一工程は第−法の第一工程と同じである。

しかしながら、第二法の第二工程は、ハロエチレンカーボネートにより、Ｈ５Ｍ Ｃから直接ＶＩＰ　（すなわち、化合物＃２から＃３）を合成することから成る 。

１°）放射能標識ＭＩＰの合成 放射能標識ＶＩＰの合成法を提供する（図１）。これらの方法は追加の既知工程 を伴う２つのＭＩＰ合成法に基づいている：すなわち、１））リチウムガスを用 いて４’、５’（フラン側）二重結合を接触水素化してトリチウム標識化合物Ｄ ＨＭＩＰを製造し、その後２）水素供与体を用いてこの結合を接触再酸化してト リチウム標識ＶＩＰ　（２Ｈ−ＭＩＰ）を製造する。Ｓ、　ｌ５ａａｃｓ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｎａｔ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ。

Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ　Ｎｏ、　６６　（１９８５）　。また、この反応は、３． ４（ピロン側）二重結合を接触水素化して、３．４．４’　、５’−テトラヒド ロ−［’Ｈ，］−５−メチルイソブソラレン（ＴＨＶＩＰ）を形成するまで続け てもよい。ＴＨＭＩＰはより高い比活性の化合物を与える利点と、ＤＨＭＩＰと 比べて低い収量を与える欠点をもうている（便宜上、図１にはＤＨＶＩＰのみを 示しである）。

本発明は、触媒をパラジウム／炭素、パラジウム／硫酸バリウム、アダムス触媒 ［（ＮＨｔ）ｉＰｔｃｌｓｌ　、Ｐｔ０ｉ、ロジウム、ルテニウム、亜クロム酸 銅およびラネーニッケルより成る群から選ぶことを意図している。本発明は、再 酸化工程における水素供与体をジフェニルエーテルとシクロヘキセンより成る群 から選ぶことを意図し一上記のように、新規化合物ＡＭＩＰ　、　Ｂ＋ＯＭＩＰ 、　Ｄ、ＩＴＩＬＩＯＶＩＰおよびＦＬｔＪＯＲＭＩＰの合成法はすべて中間体 として新規化合物ＸＭＩＰを経て進行する。ＸＩＪｒＰはブロモメチルイソブソ ラレン（ＢＭＩＰ）とクロロメチルイソブソラレン（ＣＭＩＰ）より成る群から 選ばれるノλ１ロメチルイソブソラレン定義される。

本発明のＸＭＩＰの合成法はＮ−ハロスクシンイミドと過酸化物開始剤によるＶ ＩＰの遊離基ハロゲン化から成る。好適なＮ−７１口スクシンイミドはＮ−ブロ モスクシンイミドであるが、本発明はＮ−クロロスクシンイミドの使用も包含す る。

２°）放射能標識ＸＭＩＰの合成 本発明は放射能標識ＸＭＩＰを意図するものである。放射能標識ＸＭＩＰの合成 法を提供する（図１）。一実施態様において、この方法は放射能標識ＶＩＰの合 成法を土台としている（例えば、＃３から＃４＄　、＃４本から４３本、および ４３本から４５本、ここで本は放射能標識化合物を示す）。別の実施態様ては、 この方法は新規化合物ＨＭＩＰとＦＭＩＰを経て進行する（例えば、＃５から＃ ６、＃６から＃７、＃７から＃６本、および＃昨から４５本、ここてネは放射能 標識化合物を示す）。ＭＩＰの放射能標識工程とＨＶＩＰ／　ＦＭＩＰ放射能標 識法を組み合わせると、ＸＭＩＰの二重放射能標識が得られる（例えば、＃３か ら＃４本、＃４才から＃３＊、および４３本から４５本、４５本から＃６本、＃ ６本から４７本、４７本から＃６本才、および＃６６ネネら＃５ネネ、ここで本 体は二重放射能標識化合物を示す）。

３）　ＡＭＩＰの合成 図１に示すように、出発物質としての新規化合物中間体ＸＭＩＰから新規化合物 ＡＭＪＰを合成する場合には、４つの合成法がある。

１つの方法はＸＭＩＰから新規化合物ＡＭＩＰへ新規化合物中間体ＨＭＩＰを経 て４工程で進行する（例えば、化合物＃５から＃６、＃６から＃５、＃５から＃ ９、および＃９から＃１０）。他の方法はＸＭＩＰから新規化合物ＡＭＩＰへ新 規化合物中間体ＨＭＩＰとＩＭＩＰを経て５工程で進行する（すなわち、＃５か ら＃６、＃６から＃５、＃５から＃８、＃８から＃９、および＃９から＃ｌＯ） 。さらに他の方法はＸＭＩＰから新規化合物Ａ！ｉ［Ｐへ２工程で進行する（す なわち、＃５から＃９、および＃９から＃１０）。さらに他の方法はＸＶＩＰか ら新規化合物ＡＭＩＰへ新規化合物中間体ｒＭｒＰを経て３工程で進行する（す なわち、＃５から＃８、＃８から＃９、および＃９から＃ｌＯ）。

方法１と２によれば、分解せずに無期限に貯蔵しつる安定した新規化合物中間体 ＨＭＩＰのところで合成を中断することができる。

方法３（好適な方法）はＸＭＩＰから新規化合物ＡＭＩＰへ２工程で進行する。

この方法３は新規化合物ＡＭＩＰへの最も直接的な経路であるが、完結に先立っ て一連の合成を中止したいときには不適切である。これはＸＭＩＰの加水分解不 安定性のためであり、ＸＭＩＰは加水分解を防ぐために厳格な不活性環境下に維 持しなければならない。ＸＭＩＰはこの場合もブロモメチルイソブソラレン（Ｂ ＶＩＰ）とクロロメチルイソブソラレン（ＣＶＩＰ）より成る群から選ばれる（ 不安定性はＢＶＩＰ＞ＣＭＩＰの順に増加する）。

４工程法と５工程法では、ＸＭＴＰは同一のハロメチルイソブソラレンであって も、異なるイソブソラレンであってもよい。（一般に、ＸＭＩＰの反応性は、Ｘ かクロロからブロモへ変わる場合に増加するだろう：より高い反応性の利点は、 ＸＭＩＰ　−ＨＭＩＰのような変換の反応時間か対応して短縮されることである 。）ＡＭＩＰを合成するための方法４ては、合成かＩＭ、ＩＰを経て進行する。

この点に関して、ヨウ化ベンジルは対応する臭化物や塩化物よりも反応性である ことか知られており、これはＳＮ　２（二次求核置換）反応において離脱基とし て作用する各ハロゲン化物の相対能力により起こる。従って、ヨウ化ベンジル類 似体によりもたらされる高反応性と、これに対応した短い反応時間を利用するた めに、本発明方法では、新規化合物ＩＶＩＰをフィンケルスタイン（Ｆｉｎｋｅ ｌｓｔｅｉｎ）反応により製造する。

２つのＶＩＰ製造法と組み合わせると、本発明は５−メチルレゾルシノールから ＡＭＩＰを合成するための８つの方法を提供する二重１には、さらに出発物質と しての新規化合物中間体ＸＭＩＰから新規化合物放射能標識ＡＭＩＰへ至る２つ の方法か示しである。

出発物質としての新規化合物中間体ＸＭＩＰから新規化合物放射能標識ＡＭＩＰ へ至る方法は両方とも、ＨＭ［Ｐと新規化合物ＦＭＩＰを経て進行する。１つの 方法は６エ程法であり（すなわち、化合物＃５からＲ６、Ｒ６からＲ７、Ｒ７か ら＃６＊　、Ｒ６零から４５本、４５本から４９本、および４９本からＲ１屹） ；他方は７エ程法である（すなわち、化合物＃５からＲ６、Ｒ６からＲ７、Ｒ７ から４６本、４６本から４５本、４５本から＃８＊　、４８本から４９本、およ び４９本からＲ１０ｔ）。

２つのＶＩＰ製造法と組み合わせると、本発明は５−メチルレゾルシノールから 放射能源ｍ　ＡＭＪＰを合成するための２つの追加方法（合計４つの方法）を提 供する。放射能標識ＭＩＰの２つの製造法と組み合わせると、本発明は放射能源 ｍ　ＡＭＩＰの８つの追加方法を提供し、全部で１２の方法を提供する：（本頁 以下余白） 二こで、本は標識化合物を示す。方法Ｖ、ＶＬＩＸおよびＸか好適である。

本発明はさらに二重標識付けを包含する。一実施態様において、本発明の二重標 識法はＭＩＰの標識工程（化合物＃３から化合物＃４）とＡＭＩＰの標識工程の 組合わせから成る。標識か放射能標識である場合、これは、他の利点もあるが、 とりわけ本発明化合物の比活性を高めるという利点を与える。本発明は次の二重 放射能標識法を包含する（ここで、零オは二重標識化合物を示す）：方法Ｉおよ びＩＩが好適である。

化合物ｔｆ１２ａ　、１２ｂおよび１２Ｃ）は、それぞれ、一般に次の３つの単 位： ＭＩＰ−一一スペーサーーーー標識 から成る３部分化合物として記載することができる。

本発明によって意図されるスペーサーは一般式：　Ｒ，ＨＮ−（ＣＨ２）。

−ＮＨＲ２を有する。一般に、Ｒ，−−Ｈ、−ＣＨ，、、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ−Ｈ ｔまたは−Ｃ４Ｈ−、Ｒ２・−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ−Ｈｔまたは− Ｃ４Ｈｓ　、およびｎ　＝　６−１６である。ＢＩＯＶＩＰ化合物を他の分子（ 例えば、核醜）に結合させる場合、ｎ≧６のとき他の分子の結合部位とアビジン 結合部位との間に十分な長さがビオチン成分に付与されると考えられる。ビオチ ン結合部位はアビジン分子の面より９人下であると報じられているので［Ｇｒｅ ｅｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１２５ニア８１　（１９７１ ）］、それより短いスペーサ−［例えば、Ｊ、Ｐ、　Ａｌｂａｒｅｌｌａ　ｅｔ 　ａｔ、。

Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１７：４２９３　（１９８３）を参照 ］はビオチン−アビジンの形成を妨害するかもしれない。適切な鎖長はアビジン −ビオチン相互作用と関連した立体障害を少なくするのに役立ち、かくしてアビ ジン−ビオチン複合体の安定性は、適当な鎖長を使用するとき増加するはずであ る。

ＭＩＰのＢ１叶、ＤＩＴＨＩＯ−およびＦＬＵＯＲ−誘導体の好適なスペーサー を考えるとき、化学的（合成的）問題を考慮する必要がある。スペーサーＲ，Ｈ Ｎ−（ＣＨ２）　、−ＮＨＲｔにおいて、Ｒ１は−Ｈ、−ＣＨ，、−Ｃ，Ｈｓ　 、−Ｃ−Ｈｔまたは−Ｃ−Ｈａで、Ｒ３は−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＪｓ　、−Ｃｓ Ｉｈ　または−Ｃ，Ｈ，でありうるが、最も好ましくはＲ，とＲ２は両方とも− ＣＨ，、−ＣＪｓ　、−Ｃ３Ｈ７または−Ｃ，Ｈ，である。いかなる特定の理論 によっても拘束されないが、ＸＭＩＰ（またはＩＭＩＰ）からＤＭＨＭＩＰを製 造する反応において、Ｒ，とＲ２か両方とも−Ｃ１（、である場合、スペーサー 窒素はそれぞれの窒素で１または２当量のＸＭＩＰ（またはＩＭＴＰ）と反応す ることができる。

目的のモノ−Ｎ−置換生成物（すなわち、ＤＭＨＶＩＰ）が有利であるために、 本発明はこの反応でスペーサー対ＸＭ！Ｐ、（またはｌ１ｉｌＩＰ）の高比率を 採用することを意図している。それにもかかわらず、１）Ｒ１とＲ２が両方とも −ＣＨ，、−ＣＪｓ　、−Ｃ３１ｈまたは一〇、ｌ（、であり、かつ２）スペー サー対ＸＭＩＰ（またはＩＶＩＰ）の高比率を採用する場合でさえ、本発明では １より多いＸＭＩＰ（またはＩＭＩＰ）とスペーサーとの反応から生ずる副生物 か予想される。これらの副生物にはジーＮ、Ｎ−置換生成物（すなわち、スペー サー上の同一窒素に２個のイソプソラレン）、ジーＮ、Ｎ’−置換生成物（すな わち、スペーサー窒素のそれぞれに２個のイソブソラレン）、トリーＮ、Ｎ、Ｎ ’−置換生成物およびテトラ−Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−置換生成物が含まれる。

上で述べたように、本発明はＲ２とＲ２か−Ｈである場合も包含する。このスペ ーサーも使用てきるが、多重−置換スペーサー副生物の数が増加し、目的のモノ −Ｎ−置換生成物（すなわち、ＤＭＨＭＩＰ）のその後の精製か−Ｎ難しくなる 。

本発明のＶＩＰの８１０−１ＤＩＴ）ＩＩ叶およびＦＬＬＩＯＲ−誘導体上の標 識は２つの要素：１）リポータ−成分と、２）リポータ−成分をスペーサーに結 合するリンキングアームと、から構成される。２種類のリポータ−成分か図１に 示しである。第一の、ビオチンは、あとてシグナル発生系（例えば、ＢｌｕＧＥ ＮＥ：　ＢＲＬ）に結合されるアビジンを結合するように機能するので、間接的 リポータ−成分である。

第二の、フルオレセインは、適当な波長の光で励起した際に強い蛍光シグナルを 与えるので、直接的リポータ−成分である。ビオチンもフルオレセインも共にア ミド結合を介してスペーサーに結合し、その際０−７個の架橋原子がスペーサー アミドカルボニルとリポータ−成分間にリンキングアームを構成する。いくつか の場合（例えば、ＤＩＴＨ■０ＶＩＰ　）　、リンキングアームはジスルフィド 結合を含んでいてもよく、これはイソプソラレンからリポータ−成分をあとて切 断するのに有利である。

スペーサー窒素と標識カルボニル間にアミド結合を形成する反応は活性型エステ ル、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用する。しかしなが ら、他の活性エステル、例えばイミダゾリド（Ｎ、Ｎ’−カルボニルジイミダゾ ールから）やスルホスクシンイミジルエステルも使用できる。

ａ）　ＢＩＯＶＩＰの合成 図１に示すように、本発明は新規化合物中間体ＸＶＩＰを経て新規化合物ＢＩＯ ！ＪＩＰ　（化合物＃１２ａ）へ至る４つの異なる合成法を意図している。４つ の方法のうち２つはＨＭＩＰを経て進む；１つはＨＭＩＰからＩＭＩＰを経て進 み（すなわち、Ｒ５からＲ６、Ｒ６がらＲ５、Ｒ５からＲ８、Ｒ８からＲ１１、 および＃ｌｌから＃１２ａ）　、もう１つはＨＭＩＰからＤＭＨＭＩＰを経て進 む（すなわち、Ｒ５からＲ６、Ｒ６からＲ５、Ｒ５から＃ＩＩ、および＃１！か ら＃１２ａ）　、他の２つの方法はＸ！１４１Ｐから直接（すなわち）ＩＭＩＰ を通らずに）進む；１つはＸＭＴＰからＩＭＩＰを経て進み（すなわち、Ｒ５か らＲ８、Ｒ８からＲ１１、およびＲ１１がら＃１２ａ）　、もう１つはＸＭＩＰ からＤＭＨＭＩＰを経て進む（すなわち、Ｒ５からＲ１１、および＃ｌｌから＃ １２ａ）。後者の方法が好適である。

ＡＭＩＰの合成について上記したように、ＨＶＩＰを通る経路はＨＶＩＰの安定 性のために合成を中断し得る（しばしば製造施設にとって必要である）という利 点を与える。ＸＭＩＰ経路はより直接的であるが、連続した合成が可能である場 合に採用すべきである。

ＶＩＰを合成するための２つの方法と組み合わせると、本発明は８つのＢＩＯＶ ＩＰ合成法を提供する（方法ｒｒＩおよびｒｖが好適であ本発明はさらに新規化 合物中間体ＸＭＩＰから放射能標識Ｂｒ０ＶＩＰへ至る合成法を意図している。

両方法ともＨＭｒＰと標識Ｉ（ＭＩＰの合成を包含する。１つは［ＶＩＰを経て 進み（すなわち、Ｒ５からＲ６、Ｒ６からＲ７、Ｒ７からＲ６木、４６本から＃ ５＊　、Ｒ５本から３８本、３８本からＲ１１本、およびＲ１１＊がら＃Ｉ２ａ ＊）、もう１つは直接ＤＭＨＭＩＰを経て進む（すなわち、Ｒ５カ）らＲ６、Ｒ ６からＲ７、Ｒ７から４６本、４６本からｆｆ５＊　、Ｒ５ネからＲ１１ネ、お よびＲ１１ネから＃Ｉ２ａ＊）。

２つのＶＩＰ製造法および２つの標識５ＩＩＰ製造法と組み合わせると、本発明 は放射能標識ＢＩＯＭＩＰを合成するための１２の方法を提供する（方法■、Ｖ Ｉ、ＩＸおよびＸが好適である）：これら１２のＢＩＯＶＩＰ標識法は１つの二 重標識法をもたらす（化合物は２Ｈとビオチンの両方を保有する）。標識ＡＭＩ Ｐの場合と同様に、本発明はまたＢＩＯＭＩＰの二重放射能標識付けを包含する （しかし、この場合は三重標識化合物を生成する）。この二重放射能標識法はＭ ｒＰの放射能標識工程をＢＩＯＭＩＰの放射能標識工程と組み合わせる。

ｂ’）　ＤＩＴＨＩＯＶＩＰの合成 図１に示すように、本発明は新規化合物中間体ＸＭＩＰから新規化合物ＤＩＴＨ ＩＯＶＩＰ　（化合物１ｎ２ｂ）へ至る４つの異なる合成法を意図している。Ｂ ＩＯＭＩＰの合成の場合と同様に、４つの方法のうち２つはＨＭＩＰを経て進む ；１つはＨＭＩＰからＩＭＩＰを経て進み（すなわち、＃５から＃６、＃６から ＃５、＃５から＃８、＃８から＃１１　、および＃ｌＩから＃Ｉ２１））　、も う１つはＨＭＩＰからＤＭＨＭＩＰを経て進む（すなわち、＃５から＃６、＃６ から＃５、＃５から＃１１、および＃１１から＃ｌ２ｂ）。

他の２一つの方法はＩＭＩＰから直接（すなわちＨＶＩＰを通らずに）進む、１ つはＸＭＩＰからＩＭＩＰを経て進み（すなわち、＃５から＃８、＃８から＃１ １　、および＃１１から１１２１１）　、もう１つ（好適な方法）はＸＭＩＰか らＤＭＨＭＩＰを経て進む（すなわち、＃５から＃１１、および＃１１から＃１ ２ｂ）。この場合も上で論じたＨＶＩＰ経路の利点をより直接的な経路と比べて みる必要かある。

ＭＩＰを合成するための２つの方法と組み合わせると、本発明は８つのＤｆＴＨ ＩＯＭＩＰ合成法を提供する（方法ＩＩＩおよびＩＶか好適である）： ｂ’）放射能標識Ｄ［ＴＨＩＯＭＩＰの合成本発明はさらに新規化合物中間体Ｘ ＭＩＰから放射能標識ＤＩＴＨｒＯＭＩＰへ至る合成法を意図している。両方法 ともＨＭＩＰと標識ＨＭＩＰの合成を包含する。１つはＩＶＩＰを経て進み（す なわぢ、＃５から＃６、＃６から＃７、＃７から４６本、４６本から＃５太、＃ ５本から４８本、＃８童から＃１１本、および＃１１＊から＃Ｉ２ｂ本）、もう １つは直接ＤｌｉｌＨＶＩＰを経て進む（すなわち、＃５から＃６、＃６から＃ ７、＃７から４６本、４６本から＃５丈、＃５太から１１１１本、およこＦｅ１ ２ネから＃１２ｂネ）。

２つのＶＩＰ製造法および２つの標ｍＭＩＰ　ｖ適法と組み合わせるど、本発明 は放射能標識Ｄ＋ＴＨＩＯＭｒＰを合成するための１２の方法を提供する（方法 Ｖ　、Ｖｉ、　ＩＸおよびＸか好適である）：これらの１２のＤＩＴＨＩＯＶＩ Ｐ放射能桿識法は１つの二重標識法をもたらす（化合物は３Ｈと切断可能なビオ チンの両方を保有する）。

標識ＢＩＯＶＩＰの場合と同様に、本発明はまたＤＩＴＨＩＯＶＩＰの二重放射 能標識付け（三重標識化合物を生成する）を包含する。この二重放射能標識法は ＭｒＰの放射能標識工程をＤＩＴＨＩＯＶＩＰの放射能標識工程と組み合わせる 。

ｃ）　ＦＬＩＪＯＲＭＩＰの合成 図１に示すように、本発明は新規化合物中間体ＸＭＩＰから新規化合物ＦＬｔＪ ＯＲＭＩＰ　（化合物＃１２Ｃ）へ至る４つの異なる合成法を急回している。Ｂ ＩＯＭＩＰおよびＤ　ｒＴＩ（ｆＯＭ　ＩＰの場合と同様に、４つの方法のうち ２つはＨＶＩＰを経て進む：他の２つの方法はＩＭＩＰから直接進む。２つのＭ ＩＰ合成法と組み合わせると、本発明は８つの本発明はさらに新規化合物中間体 ＸＭＩＰから放射能標識ＦＬｔＪＯＲＭＩＰへ至る合成法を意図している。ＢＩ ＯＭＩＰおよびＤＩＴＨＩＯＭＪＰの場合と同様に、両方法ともＨＭＩＰと標識 ＨＭＩＰの合成を包含する。

２つのＭＡＰ製造法および２つの標識ＶＩＰ製造法と組み合わせると、本発明は 放射能標識ＦＬＵＯＲＭＩＰを合成するための１２の方法をたらす（化合物は３ Ｈとフルオレセインの両方を保有する）。本発明はまた三重標識化合物を生成す るＦＬＵＯＲＭＩＰの二重放射能標識付けを包含する。この二重放射能標識法は ＭＩＰの放射能標識工程をＦＬＬＩＯＲＭＩＰの放射能標識工程と組み合わせる 。

（本頁以下余白） ７−アセトキシ−８−（２’　、３’−エポキシプロビル）−５−メチル−新規 化合物ＡＭＩＰ　５ＢＩＯＶＩＰ、　ＤＩＴＨＩＯＭＩＰ　、　ＦＬＵＯＲＭＩ Ｐ　（および新規化合物中間体）並びに上記の放射能標識化合物を合成するため の本発明方法の１つの利点は、これらの合成法が毒性化合物を使わないという点 である。以下で論するように、いくつかのイソブソラレン誘導体の製造にはクロ ロメチルメチルエーテルを使用する必要がある。この化合物は非常に揮発性で、 極めて毒性であり、周知の発癌物質である（　０３ＨＡ調節される発癌物質ＣＦ Ｒタイトル２９、パー）１９１０．１００６；　１．　Ｂｒｅｔｈｅｒｉｃｋ、 　Ｈａｚａｒｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　（Ｒｏ ｙａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、　Ｌｏｎｄｏｎ　１９８１）　ｐ、２４７）　ｏその 使用には作業者への暴露と環境への放出を避けるための特殊な装置や予防策を必 要とする。ＶＩＰ誘導体を提供するための本発明合成法はこの危険な化合物を必 要としない。

ＭＶＰ誘導体を合成するための本発明方法の他の利点は、ｉ〉合成の簡便性（工 程数が少ない）と、ｉｉ）優れた縮収率である。この事に関して、新規化合物の 製造は最初にＭｔＰの合成を必要とし、ＭｒＰはＢａｃｃｉｃｈｅｔｔｉらの米 国特許第４．３１２．８８３号により以前に報告されている。Ｅｕｒ、　Ｊ、　 Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｍ、　１６：４８９　（１９８１）。本発明方法は、Ｂａｃｃ ｉｃｈｅｔｔｉの２つの方法が４工程法：５−メチルレゾルシノール→Ｈ５ＭＣ →７−アリルオキシ−５−メチルクマリン→８−アリル−７−ヒドロキシ−５− メチル−クマリン→ＶｒＰ および７エ程法： ５−メチルレゾルシノール→Ｈ５ＭＣ→７−アリルオキシ−５−メチルクマリン →８−アリル−７−ヒドロキシ−５−メチル−クマリン→７−アセトキシー８− アリル−５−メチルクマリン→Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、　４４：２１７６　（１９ ７９）；　Ｄ、Ｒ，Ｂｅｎｄｅｒらの米国特許第４．３９８．０クマリン→８− （７−アセトキシ−５−メチル）クマリニルーアセトアルデヒド→ＭＡＰ を含む点て、Ｂａｃｃｉｃｈｅｔｔｉの報告した方法と相違している。Ｂａｃｃ ｉｃｈｅｔｔｉのこれら２つの方法の縮収率はそれぞれ約３．８χと２．８％て ３１号を参照されたい。

Ｂａｃｃｉｃｈｅｔｔｉ　らは７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンからのＤＭ ＩＰの５工程合成法を報告している。これらの研究者らは５工程変換：すなわち １）臭化アリルによる叶アルキル化、２）混合異性体を使用し、これは閉環工程 前に行う臭素化の必要性を回避する。

０−アリル成分と同様に、０−（２−ハロ）アルケンは主にクマリンの８位でク ライゼン転位を受けるか、アリル成分とは相違して、転位されたハロアルケンは 実際上はマスクされたケトンである。酸性条件下で、ハロアルケンのケトンへの 変換はアルキルエステルの酸触媒開裂と同時に起こる。生成するフェノール性ケ トンは続いて閉環化合物への変換を受ける。新規合成法の第三の利点は、全工程 でアルカリ性条件を回避できる点にあり、これはクマリンる生成物の損失を排除 する。

１°）放射能標識ＤＭＩＰ 本発明はさらに標識したＤりＩＩＰを意図している。２工程法を提供する：すな わちｌ）　ＤＭＩＰを触媒、酢酸およびトリチウム気体と混合してトリチウム標 識化合物ＤＩ（ＤＭＩＰを得、そして２）ＤＩ（ＤＭＩＰを触媒およびジフェニ ルエーテルと混合してトリチウム標識ＤＭＩＰ（３Ｈ−ＤＭＩＰ）を生成する。

本発明は、触媒をパラジウム／炭素、パラジウム／硫酸バリウム、アダムス触媒 ［（ＮＨ４）２Ｐｔｃｌｓｌ　、ＰｔＯ□、ロジウム、ルテニウム、亜クロム酸 銅およびラネーニッケルより成る群から選ぶことを意本発明は既知化合物ＡＭＤ ＭＩＰおよび新規化合物”Ｈ−ＡＭＤＭＩＰの新規合成法を包含する。この方法 は上記したＤＭＩＰの新規合成法を土台にしている。その後、ＡＭＤＭＩＰは２ つの方法：すなわち１）ノ＼ロメチル化工程を含む方法、またはｉｉ）ハロメチ ル化工程を含まない方法、の一方により製造される。

ａ）ハロメチル化工程を経るＡＭＤＭＩＰＡＭＤ＼＋ＩＰを合成するための本発 明の１つの方法ては、ＤＭＩＰをＬ記の新規合成法により製造し、その後ＤＭＩ Ｐを誘導体化してハロメチル誘導体となし、次いでＦ、　Ｄａｌｌ’Ａｅｑｕａ 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｍ、　２４：１７８　（１９８１） に記載の方法によりヒドラジン水和物を用いて対応フタルイミドメチル誘導体（ ガブリエル合成により製造）をヒドラジン分解することにより製造する。

本発明の新規ＤＭＩＰ合成法のために、本発明方法は他のＡＭＤ〜（ＩＰ合成法 と比べて有利である。例えば、Ｂａｃｃｉｃｈｅｔｔｉ　ら（米国特許第４．３ １２．８８３号）により報告されたＡＭＤＭ！Ｐ合成法は、上で論じたように、 あまり効率的でないＤＭＩＰ合成法を土台にしている。

図２に示すように、本発明はハロメチル化工程を用いる多くの変法を包含する。

ＸＭＤＭＩＰ　（化合物＃１８）の合成後、合成はＨＭＤＭＩＰ（化合物＃１９ ）を経て２つの方法で進行する：ＸＭＤＭＩＰ→ＨＭＤＭＩＰ→ＸＭＤＭＩＰ→ ＰＨＩＭＤＭＩＰ・→ＡＭＤＭＩＰまたは ＸＭＤ！ｔ＋ＩＰ　４ＨＭＤＭＩＰ　→ＸＭＤＭＩＰ　−１！１１０〜ｌｉＰ− Ｐ）ＩＩＭＤＭＩＰ−ＡＭＤＭＩＰ他方、本発明はさらにＨＭＤ！、ｌＩＰを通 らずにＡＭＤＭＩＰへ至る２つの方法を包含する： ＸＭＤＭＩＰ−ＰＨＩＭＤ！、ＩＩＰ−＋ＡＭＤＭ［Ｐまたは ＸＭＤＭＩＰ→ＩＭＤＭ＋Ｐ→円（ＩＭＤＭＩＰ→Ａ＼ｆＤＭＩＰＭＩＰのヒド ロキシ誘導体ＨＭＩＰに関して論じたように、ＤＭＩＰのヒドロキシ誘導体ＨＭ ＤＭＩＰも安定しており、貯蔵することか可能である。これは合成を中断し得る という利点を与える。しかしなから、非−ＨＭＤＭＩＰ経路がより直接的であり 、合成の中断を予想していない場合に好適である。

ａ’）ハロメチル化工程を経る放射能標識ＡλＩＤＭＩＰＡＭＤＭＩＰを合成す るためのハロメチル化経路はさらに標識ＡＭＤ〜ｉｌＰを合成する際にも使用で きる。本発明の一方法では、放射能標識ＡＭＤＭＩＰを新規化合物ＦＤＶＩＰ　 （化合物＃２０）を経て合成する。本発明はこの方法の変法である２つの方法を 包含する：ＸＭＤＭｆＰ　、４Ｆ（ＭＤＭｒＰ　→ＦＭＤＭＩＰ→＊Ｉ（ＭＤＭ ＩＰ　→本ＸＭＤＭＩＰ　→オＰＨＩＭＤＭＩＰ　→本ＡＭＤＭＩＰおよび ＸＭＤＭＩＰ−ＨＭＤＭＩＰ−Ｆ！ＩＩＤＭＩＰ　→＊Ｆ（ＭＤＭＩＰ　→ネＸ ＭＤＭＩＰ　→本ＩＭＤＭＩＰ　→本ＰＨＩＭＤＭＩＰ　−＊ＡＭＤＭＩＰここ で（＊）は放射能標識化合物を示す。

本発明の新規ＤＭＩＰ放射能標識法と組み合わせると、本発明は以下の４つのＡ ＭＤＭｒＰ（単一）放射能標識法を提供する（方法ＩおよびＩＩＩが好適である ）： 本発明はさらに二重放射能標識付けを含めて、二重標識付けを包含する。図２に は、二重放射能標識ＡＭＤＭＩＰを合成するための２つの方法が示しである。

ｂ）ハロメチル化を行わないＡＭＤ＼ｉＩＰ本発明のＡＭＤＭＩＰ前駆体の新規 合成法と組み合わせた、上記のハロメチル化経路は、ＡＭＤＭＩＰの新規かつ有 効な合成法を提供するか、ハロメチル化には毒性化合物が必要である。例えば、 クロロメチル化はクロロメチルメチルエーテルの使用を必要とする。この化合物 は、先に論じたように、非常に揮発性で、極め°Ｃ毒性であり、しかもよく知ら れた発癌物質である（　０Ｓ）（Ａ調節される発癌物質ＣＦＲタイトル２９、バ ー）　１９１０．１００６　＞。その使用には作業者への暴露と環境への放出を 避けるために特殊な装置や予防策が必要である。クロロメチルメチルエーテルの 使用に伴う危険性と不便を回避するために、本発明はハロメチル化を行わないＡ ＭＤＭＩＰの新規合成法を提供する。

本発明は、窒素供与体を用いた４′フラン位置の直接フタルイミドメチル化によ るＤＭＩＰのＰＨＩＭＤＭＩＰへの変換を包含する。本発明は窒素供与体をＮ− ヒドロキシメチルフタルイミドとその誘導体より成る群から選ぶことを意図して いる。

ＤＭＩＰを直接ＰＨＩＭＤＭＩＰへ変換する方法において、本発明は、ブソラレ ンに以前に使用されたことのある方法を改変・修正した。

Ｎ、Ｄ、　Ｈｅ１ｎｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｈｅｔｅｒｏ、　Ｃｈｅｍ 、　２２ニア３　（１９８５）。この改変・修正した方法は、ａ）４位にメチル 基を含まない、およびｂ）ポリ置換をもたらすヒドロキシ、アミノまたは他の類 似の置換基を含まない、イソブソラレンに適していると予想される。

この方法は、】）発癌物質を使わない、２）２工程ではなく１工程を要する、お よび３）より高い収率で生成物（ＰＨＩＭＤＭＩＰ）が得られるという点て、報 告されたＰＨＩＭＤＭｒＰ合成法の改良法である。ＰＨＩＭＤＭＩＰから、この 方法は上記のようにＡＩＪＤＭＩＰへ進む。

ｂ’）ハロメチル化を行わない放射能標識ＡＭＤＭＩＰハロメチル化を行わない ＡＭＤＭＩＰの合成経路はさらに、放射能標識ＤＭＩＰを経て放射能標識ＡＭＤ ＭＩＰを合成するために使用することができる。

零ＤＭＩＰ　−＊Ｐｌ（ｒＭＤＭ［Ｐ　→零ＡＭＤＭｒＰここで（ネ）は放射能 標識化合物を示す。

本発明の新規ＤＭＩＰ放射能標識法と組み合わせると、本発明はハロメチル化を 行わないＡＭＤＭｒＰの以下の単−放射能標識法を提本発明のＤＭＩＰのＢＩＯ −１ＤＩＴＨＩＯ−およびＦＬＵＯＲ−誘導体（それぞれ化合物＃２５ａ　、２ ５ｂおよび２５Ｃ）は、一般に次の３つの単位＝ＤＭＩＰ−−−スペーサーーー ー標識 から成る３部分化合物として記載することがてきる。

本発明によって意図されるスペーサーは一般式：　Ｒ，ＨＮ−（ＣＨ２）。

−Ｎｌ（Ｒ，を有する。一般に、Ｒ，＝　−Ｈ、−ＣＬ、−ＣｔＨｓ　、−ＣＩ Ｈ７または−Ｃ，Ｈ，、Ｒ２＝　−Ｈ、−ＣＨ，、−ＣＪ−、−Ｃ３Ｈ７または −Ｃ４Ｈ，、およびｎ　＝６−１６である。ＢＩＯＤＭＩＰ化合物を他の分子（ 例えば核酸）に結合させる場合、ｎ≧６のとき他の分子の結合部位とアビジン結 合部位との間に十分な長さがビオチン成分に付与されると考えられる。先に記載 したように、より短いスペーサー〔例えば、Ｊ。

Ｐ、　Ａｌｂａｒｅｌｌａ　ｅｔ　ａｌ、、　１７：４２９３　（１９８９）を 参照〕はビオチン−アビジン複合体の形成を妨害するかもしれない。適切な鎖長 はアビジン−ビオチン相互作用と関連した立体障害を少なくするのに役立ち、か くしてアビジン−ビオチン複合体の安定性は、適当な鎖長を使用するとき増加す るはずである。

ＤＭＩＰのＢＩＯ−１ＤＩＴＨＩＯ−およびＦＬＵＯＲ−誘導体の好適なスペー サーを考えるとき、化学的（合成的）問題を考慮する必要がある。

スペーサーＲ＋ＨＮ−（ＣＨ２）　−−ＮＨＲ２において、Ｒ２は−Ｈ、−ＣＨ ，、−ＣＪｓ　、−Ｃ３Ｈ７または−Ｃ４Ｈ９で、Ｒ１は−Ｈ、−ＣＨ，、−ｃ ２Ｈｓ　、−ＣＩＨ。

または−Ｃ，Ｈ，であり得るが、最も好ましくはＲ３とＲ２は両方とも−ＣＨ３ 、−Ｃ２ＨＩ　、−ＣＪ７または−Ｃ，Ｈ，である。いかなる特定の理論によッ テも拘束されないが、ＸＭ［１ＭＩＰ（まりＩｔ　ＩＭＤＭｒＰ）カラＨＤＡＭ ＤＭＩＰを製造する反応において、Ｒ１とＲ２が両方とも−ＣＨｓ、−ＣＪｓ、 −ＣｉＬまたは−Ｃ４Ｈｍである場合、スペーサー窒素はそれぞれの窒素で１ま たは２当量のＸＭＤＭＩＰ（またはｒＭＤＶＩＰ）と反応することができる。

目的のモノ−Ｎ−置換生成物（すなわち、ＨＤＡＭＤＭＩＰ）が有利であるため に、本発明はこの反応においてスペーサー対ＸＭＤＭＩＰ（またはＩＭＤＭｒＰ ）の高比率を採用することを意図している。それにもかかわらず、１）Ｒ２とＲ ７が両方とも−ＣＨ３、−Ｃ，Ｈ，、−Ｃ，Ｈ，または−Ｃ４Ｈ＊であり、かつ ２）スペーサー対ＸＭＤＶＩＰ（またはＩＭＤＭＩＰ）の高比率を採用する場合 でさえ、本発明ては、ｌより多いＸＭＤＭＩＰ（またはＩＭＤＭＩＰ）とスペー サーとの反応から生ずる副生物が予想される。これらの副生物にはジーＮ、Ｎ− 置換生成物（すなわち、スペーサーの同一窒素に２個のイソブソラレン）、ジー Ｎ、Ｎ’−置換生成物（すなわち、スペーサー窒素のそれぞれに２個のイソブソ ラレン）、トリーＮ、　Ｎ、　Ｎ’−置換生成物およびテトラ−Ｎ、Ｎ、Ｎ’　 、Ｎ’−置換生成物か含まれる。

すでに述べたように、本発明はＲ，とＲ２が−Ｈである場合も包含する。このス ペーサーを使用することもできるが、多重−置換スペーサー副生物の数か増加し 、目的のモノ−Ｎ−置換生成物（すなわち、ＨＤＡＭＤＭＩＰ）のその後の精製 が−ｌ１ｉｉｉｌ、くなる。

本発明ノＤＭｒＰ　（７）ＢＩＯ−１ＤＩＴＨＩＯ−およびＦＬＬＩＯＲ−誘導 体上の標識は２つの要素＝１）リポータ−成分と、２）リポータ−成分をスペー サーに結合するリンキングアームと、から構成される。図２には、２種類のリポ ータ−成分：ｉ）ビオチンおよびｉｉ）フルオレセインが示しである。ビオチン もフルオレセインも共にアミド結合を介してスペーサーに結合し、その際０−７ 個の架橋原子がスペーサーアミドカルボニルとリポータ−成分間にリンキングア ームを構成する。いくつかの場合（例えば、ＤＩＴＨＩＯＤＭＩＰ）　、リンキ ングアームはジスルフィド結合を含んでいてもよく、これはイソプソラレンから リポータ−成分をあとて切断するのに有利である。

スペーサー窒素と標識カルボニル間にアミド結合を形成する反応は活性型エステ ル、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用する。しかしなが ら、他の活性エステル、例えばイミダゾリド（Ｎ、Ｎ’−力ルボニルジイミダゾ ールから）やスルホスクシンイミジルエステルも使用できる。

（本頁以下余白） ａ）　ＢＩＯＤＭＩＰの合成 図２に示すように、本発明は新規化合物中間体ＸＭＤＭＩＰを経て新規化合物Ｂ ＩＯＤＭｒＰ　（化合物＃２５ａ）に至る４つの異なる合成法を包含する。４つ の方法のうち２つはＨＭＤＶＩＰを経て進む：ＸＭＤＭＩＰ　→）ＩＭＤＭＩＰ 　→ＸＭＤＭＴＰ　→）ＩＤＡＭＩ）ＭＩＰ−ＢＩＯＤ！ＬＩＰまたは ＡＭＤＭＩＰ−ＨＭＤＭＩＰ−ＸＭＤＭＩＰ→ＩＭＤＭＩＰ→ＨＤＡＭＤＭＩＰ →ＢＩＯＤＭＩＰ他の２つの方法（これらのうち最初のものが好適である）はＸ ＭＤＭＩＰから直接進む： Ｘ！ｉｌＤＭＩＰ−ＨＤＡＭＤＭＩＰ−ＢＩＯＤＭＩＰまたは ＸＭＤＭＩＰ→ｒＭＤＭＩＰ→ＨＤＡＭＤＭＩＰ→ＢｒＯＤＭＩＰａ’）放射能 標識ＢｒＯＤＭＩＰの合成本発明はさらにＢＩＯＤＭＩＰの放射能標識法を提供 する。ＤＭＩＰから放射能標識ＢＩＯＤＭＩＰを合成するために２つの方法があ り、さらに放射能標識ＤＭ［Ｐから（単一）放射能標識ＢＩＯＤＭＩＰを合成す るために２つの方法があり、全部で４つの（単一）放射能標識法があるコ ここでネは標識化合物を示す。方法ＩおよびＩＩＩが好適である。

本発明はさらにＢＩＯＤＭＩＰの二重放射能標識付けを包含する。図２には２つ のＢＩＯＤＭＩＰ二重放射能漂識法が示しである。一実施態様において、本発明 の二重放射能標識法はＤＭＩＰの放射能標識工程（化合物＃１６から化合物＃Ｉ ７１　）とＢＩＯＤＭＩＰの放射能標識工程（上記）を組み合わせて成る。上で 述べたように、これは、他の利点もあるが、特に本発明化合物の比活性を高める という利点をもたらす。本発明は以下の二重放射能標識法を包含する（ここでキ ネは二重標識化合物を示す）： 図２に示すように、本究明は新規化合物中間体χＭＤＶＩＰを経て新規化合物Ｄ ＩＴＨＩＯＤＭＩＰ　（化合物＃２５ｂ）に至る４つの異なる合成法を包含する 。４つの方法のうち２つはＨＭＤＭＩＰを経て進む：Ｘへ＋Ｄｌ、ＩＩＰ→ｌ］ ＦＪＤＭ［Ｐ−＋ＸＭＤＭＩＰ−庫ＨＤＡ！、ｌＤＭＩＰ→Ｄ　ＩＴＨＩＯＤＭ 　ＩＰまたは ＸＭＤＭＩＰ−ＨＭＤＭＩＰ→ＸＭＤＭＩＰ　−ＩＭＤＭＩＰ→ＨＤＡＭＤＭＩ Ｐ→Ｄ　ｊＴＨＩＯＤＭ　ＩＰ他の２つの方法（これらのうち最初のものか好適 である）はＸＭＤＭＡＰから直接進む： Ｘ＼＋ＤＭ＋Ｐ→ＨＤＡＭＤＭ［Ｐ−ＤＩＴＨＩＯＤＭＩＰまたは ＸＭＤ！、ＩＩＰ　−ＩＭＤＶＩＰ−ＨＤＡＭＤＩ［Ｐ→ＤＩＴＨＩＯＤＭＩＰ ｂ’）放射能標識ＤＩＴＨｒＯＤＭ［Ｐ本発明はさらにＤＩＴＨＩＯＤＭＩＰの 放射能標識法を提供する。ＤＭＩＰから放射能標識Ｄ　ＩＴＨＩＯＤＭ　ＩＰを 合成するために２つの方法があり、さらに放射能標識ＤＭＩＰから（単一）放射 能標識ＤＩＴＨＩＯＤＭＩＰを合成するために２つの方法があり、全部で４つの （単一）放射能標識法がある： ここでネは標識化合物を示す。方法１およびＩＩＩが好適である。

本発明はさらにＤ［ＴＨＩＯＤＭＩＰの二重放射能標識付けを包含する。

図２には２つのＤ　ＩＴＨＩＯＤＭ　ｒＰ二重放射能標識法が示しである。一実 施態様において、本発明の二重放射能標識法はＤＭｒＰの放射能ｆｆｉ！工程（ 化合物＃１６カラ化合物＃１７＊　’）とＤＩＴＨＩＯＤＭＩＰ　（７）　（単 一）放射能標識工程（上記）を組み合わせて成る。上で述べたように、これは、 他の利点もあるが、特に本発明化合物の比活性を高めるという利点をもたらす。

本発明は以下の二重放射能標識法を包含する（ここで零ネは二重標識化合物を示 す）：図２に示すように、本発明は新規化合物中間体ＸＭＤＭＩＰを経て新規化 合物ＦＬＵＯＲＤＭＩＰ　（化合物＃２５Ｃ）に至る４つの異なる合成法を包含 する。４つの方法のうち２つはＨＭＤＭＩＰを経て進む：ＸＭＤＭｆＰ−ＰＨＭ ＤＭＩＰ−４−ＸＳＩＤＭＩＰ　→ｌ（ＤＡＭＤＭＩＰ　→ＦＬＬ１０１？ＤＩ ＪＩＰまたは ＸＭＤＭＩＰ−＋ＨＭＤＭＩＰ−ＸＭＤＭＩＰ　−ＩＭＤＭＩＰ−ＨＤＡＭＤ！ ＩＩＩＰ→ＦＬＵＯＲＤＭＩＰ他の２つの方法（これらのうち最初のものが好適 である）はＸＭＤＭＩＰから直接進む： ＸＭＤＭＩＰ−ＨＤＡＭＤＭＩＰ−ＦＬＵＯＲＤＭＩＰまたは ＸＭＤＭＩＰ→ＩＭＤＭＩＰ−ＨＤＡＭＤＭＩＰ→ＦＬＵＯＲＤＭＩＰｃ’）放 射能標識ＦＬＵ（］Ｒ［１ＭｆＰ）合成本発明はさらにＦＬＵＯＲＤＭＩＰの放 射能標識法を提供する。ＤＭＩＰから放射能標識ＦＬＵＯＲＤＭ［Ｐを合成する ために２つの方法があり、さらに放射能標識ＤＭＩＰから（単一）放射能標識Ｆ Ｌ［ＪＯＲＤＭＩＰを合成するために２つの方法があり、全部で４つの（単一） 放射能標識ここてネは標識化合物を示す。方法ＩおよびＩＩＩが好適である。

本発明はさらにＦＬＵＯＲＤＭＩＰの二重放射能標識付けを包含する。

図２には２つのＦＬＵＯＲＤＭｒＰ二重放射能標識法二重放射能標識一実施態様 において、本発明の二重放射能標識法はＤＭＩＰの放射能標識工程（化合物＃１ ６から化合物＃１７本）とＦＬＵＯＲＴ）ＭＩＰの放射能標識工程（上記）を組 み合わせて成る。本発明は以下の二重放射能標識法を包含する（ここで本月ま二 重標識化合物を示す）：（本頁以下余白） ＋＋、光活性化デバイス及び光活性化法本発明は光活性化デバイス及び光活性化 法、詳しくは光反応性化合物の活性化のためのデバイス及び方法に関する。好ま しいデバイスは、ユニットに組み込まれる電磁線の安価な源を有する。加えて、 好ましいデバイスは、電磁線の源と固定の関係にある複数の試料容器を支持する ための手段を有するだけでなく、活性化中に所望の温度範囲内に試料容器の温度 を維持するための手段を有する。

好ましい電磁線は紫外線である。紫外線の好ましい源は蛍光源である。本明細書 に使用される固定の関係は、試料の照射中に試料と光源の間に一定の距離及び形 状寸法を含むものと定義される。距離は、その源とそれが支持される際の試料と の間の距離に関係する。

点源からの光の強さは点源からの距離の二乗に反比例することが知られている。

こうして、その源からの距離の小さな変化は強さに著しい影響を有することかあ る。強さの変化は光活性化の結果に影響し得るので、距離の変化は本発明の実施 に使用されるデバイス中で避けられるべきである。これは再現性及び反復可能性 を与える。

形状寸法は光源の位置に関係する。例えば、光源は多くの方法で試料ホルダーの まわりにＣｇｉＱ面、底部、周囲、等に）配置し得ることか考えられる。好まし いデバイスの形状寸法は、単一の点源とは反対に線形ランプの多数の源を含む。

加えて、幾つかの反射表面および幾つかの吸収表面か存在してもよい。照射され る試料の位置に対するランプの位置または数の変化は、このような変化か強さの 変化を生じる点て避けられるべきである。

好ましい光源は迅速な光活性化、例えば１５分の露光時間を可能にすべきである 。１５分の露光は、その便利さに加えて、再現性のある結果を与える。これに関 して、ポリヌクレオチドへの光活性化合物の結合レベルは活性光線への暴露を増 大するにつれて増加することか注目されるべきである。結合密度のプラトーが最 終的に得られる。

このプラトーは競合光化学反応に起因する。また、核酸の塩基部分への付加反応 を受ける殆どの光反応性化合物は、溶液中で遊離の場合に光分解反応を受ける。

所定の強度フラックス（ワット／ｃｍりに関して、これらの競合反応の相対速度 は、照射プロセスの経過中に、プラトーレベルが得られる時点を決定する。再現 性の結合に関して、結合のプラトーレベルを生じる照射プロトコルを有すること が望ましい。結合のプラトーレベルは、試料の位置の小さな相違から生じ得る小 さな強度の差異を回避するだろう（即ち、試料容器を支持するための手段が照射 の源と固定の関係にあり得るが、多数の試料中の夫々の試料はその源に対して空 間中の同じ位置を正確に占有することができない）。プラトー結合が使用される 場合、異なる位置の同じ反応混合物は同じ結合レベルを示す。

注目されるように、本発明を実施するのに使用される光活性化デバイスの重要な 特徴の一つは温度制御である。光への暴露の時点の試料容器中の試料の温度は結 果に著しく影響し得るので、温度制御は重要である。例えば、核酸中の二次構造 を促進する条件はまた核酸に対する多くのプソラレン誘導体の親和性定数を高め る。ＨｙｄｅおよびＨｅａｒｓｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１７．１２ ５１　（１９７８）を参照のこと。これらの条件は溶媒の組成と温度の両方の組 み合わせである。−重鎖５ＳリポソームＲＮＡでは、低温に於ける照射は、２０ ’Ｃに較べて４°Ｃで５Ｓ　ｒＲＮＡへのｌ（ＭＴの共有結合付加を２倍増大す る。Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ、Ｍｏ１．ＢｊＯＩ。

１４７・４１７（１９８１）を参照のこと。更にブソラレン結合の温度誘導増大 が合成ポリヌクレオチドで報告されていた。Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ−ｉｓｔｒｙ　２１：１３６３（１９８２）を参照のこと。

また、温度制祁は、対立遺伝子特異的核酸標的を検出するハイブリダイゼーショ ンアッセイに重要な因子である。特異的標的核酸の対立変異体は単一塩基により 異なることがある。錐状細胞貧血は、ヒトβグロビン分子の遺伝子中の単一塩基 の変化（ＡからＴへの変化）に起因するヒト遺伝疾患の例である。単一塩基のみ か異なる二つの対立変異体の一つへの単一オリゴヌクレオチドプローブの特異的 ハイブリダイゼーションは非常に正確な温度制御を必要とする。

Ｗｏｏｄら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃ５ｄ、　Ｓｃｉ、　８２：１５８５（ １９８５）を参照のこと。ハイブリダイゼーション平衡条件下のブソラレンモノ 付加オリゴヌクレオチドプローブの照射は、それらの標的へのこれらのプローブ の共有結合を生じる。単一塩基の変化の対立遺伝子特異的識別はこれらの架橋性 プローブで可能である。しかしながら、識別は温度に鋭敏に左右される。照射操 作中の２°Ｃの変化は、観察される識別のレベルに劇的な影響を及ぼすだろう。

上記の望ましい特徴はＨＲＩ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ 、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ。

ＵＳＡ）及びＵＬＴＲＡ−ＬＵＭ、　ＩＮＣ，（Ｃａｒｓｏｎ、　Ｃａ１ｉｆｏ ｒｎｉａ、　ＵＳＡ）により市販されるデバイス（“ＨＲＩ−１００“）に見ら れる。

ＩＩｌ、核酸への化合物の結合 本発明は、ａ）核酸標的配列、プローブ、およびプライマー、並びにｂ）鋳型と して使用される核酸、およびＣ）増幅核酸を含むが、これらに限定されない核酸 に新規化合物および既知化合物を結合することを意図している。標的配列は、既 知の塩基配列の一つ以上のセグメントを存する核酸の領域である。標的配列は、 それらか検出される（即ち、その他の核酸からえり分けられる）ことをめられる 意味で“標的′である。検出はプローブによるハイブリダイゼーションにより頻 繁に行われる。プローブは、標的配列の全部または一部と部分的に、または完全 に相補性である塩基配列を有する核酸である。

幾つかの分子生物学的技術は鋳型およびプライマーを使用する。

鋳型は、酵素合成のための基質である核酸として単に定義される。

頻繁には、それは一つ以上の標的配列を含むと考えられる核酸である。プライマ ーは、それらが鋳型中に存在する場合に標的配列の合成の開始の位置を調節する ように作用する。その他の分子生物学的技術は鋳型および複製プローブを使用す る。

本発明は、全てのこれらの形態の核酸（並びにその他の核酸）への結合が非共有 結合および／または共存結合であり得ることを意図している。本発明は、暗結合 および光結合を含むが、これらに限定されない結合の特定の実施態様を意図して いる。

Ａ、暗結合 本発明の結合の一つの実施態様は暗結合を含む。“暗結合″は、光活性化波長の 電磁線の不在下で生じる核酸への結合と定義される。

暗結合は共有結合または非共有結合であり得る。“暗結合化合物″゛は、暗結合 し得る化合物と定義される。一つの実施態様では、本発明の暗結合は、ａ）暗結 合化合物を用意する工程、およびｂ）光活性化波長の光の不在下で暗結合化合物 を核酸と混合する工程を含む。

更に、本発明は暗結合の生成物、即ち暗結合化合物：核酸複合体を意図している 。

また、本発明は光生成物の暗結合を意図している。“光生成物′は、化合物と光 活性化波長の電磁線の反応の生成物と定義され、その生成物は、一旦生成される と、その後、電磁線の不在下で核酸に結合し得る。

光生成物結合について考える際に、フロクマリンによる核酸の修飾に関する以前 の研究は、時間の経過順の工程＝１）特定のフロクマリン誘導体を用意する工程 、２）特定の核酸または核酸配列を用意する工程、および３）活性化波長の電磁 線の存在下でフロクマリンを核酸と混合する工程を有する方法により歴史的に進 行していたことが注目されるべきである。特別なフロクマリン誘導体、照射源、 照射時間、緩衝液、温度およびその操作に使用されるその池の要因を含む特別な 反応の詳細に応じて、殆ど専らシクロブチル型２＋２フオトシクロ付加生成物に よる共存結合修飾の所定のレベルが生じた。

一つの実施態様に於いて、本発明は光結合に関するこの歴史的な方法からの劇的 な逸脱を意図している。本発明の方法の一〇の実施態様に於いて、時間経過の順 序は以下の通りである。１）一種板トのフロクマリン誘導体を用意し、２）一種 以上のフロクマリン誘導体を活性化波長の電磁線に！Ｉ露し、３）特別な核酸試 料または核酸配列を用意し、モして４）照射された一種以上のフロクマリン誘導 体を活性化波長の電磁線の不在下で核酸と混合する。この実施態様ては、フロク マリン誘導体は核酸と混合する前に照射される。この新規な時間経過の順序の実 験研究はフロクマリン光生成物の存在を立証した。新規な時間経過の順序の適用 は有益な適用を有するか、フロクマリンに関する化学文献または生化学文献から 予測されなうへったし、また予想されなかった。

“光生成物”は、活性化波長の電磁線に暴露される場合の光反応性化合物の起こ りつる反応を考えることにより最も良く理解される。正確な機構に限定されない が、基底状態の光反応性化合物（“Ｃ”）と活性化波長の電磁線の反応は短命な 励起種（“Ｃ′″′）を生じると考えられる。

ｃ−＞ｃ” 次に何か起こるかは主としてとのような潜在的な反応体か励起種に対して作動で あるかということに関係する。それは短命であるので、この化学種と核酸（“Ｎ Ａ”）の反応は、励起種が発生される時点で核酸が存在する場合にのみ可能であ ると考えられる。こうして、反応は、操作に関して、活性化波長の電磁線の存在 下にある必要かあり、即ち、それは“光結合゛てあり、暗結合てはない。その反 応は以下のように表し得る。

Ｃ”　＋ＮＡ−＞ＮＡ：に の反応の生成物は、以下、“光付加生成物′と称され、“光生成物′とは区別さ れるべきである。

上記の、二の反応では、化合物か活性化波長の電磁線に暴露される時点て核酸か 結合に利用できない状況を考えることができる。励起種は短命であり、反応する 核酸を有しないので、励起種は簡単にその基底状態に戻ることかできる。

ｃ　”　−＞　ｃ 一方、励起種は、それ自体（即ち、基底状態または励起種）と反応して基底状態 複合体（“ＣＴＣ”）を生じることかある。二つの化合物が反応するこれらの自 己反応の生成物は“光二量体“または単に“二量体”と称される。しかしながら 、自己反応は二つの化合物に限定されない。種々の多量体（三量体、等）か生成 されることかある。

励起種はそれ自体と反応することに限定されない。それは溶媒の要素（“Ｅ“） （例えば、イオン、ガス、等）の如きその環境と反応してその他の生成物を生成 することがある。

Ｃ”＋Ｅ−＞Ｅ：Ｃ 更に、それは簡単に基底状態誘導体（“【″）に内部で転移する（“異性化する ）ことかある。

Ｃ”−＞［ 最後に、励起種は、ここに記載された以外のその他の反応を受けることかある。

本発明および“光生成物”の理解は、これらの反応のうちのとの反応か実際に起 こるのかということに無関係である。“光生成物”は、その性質がどのようなも のであろうとも、化合物と活性化波長の電磁線の反応に続いて、その後に電磁線 の不在下で核酸と結合でき、即ち、暗結合（非共有暗結合または共有時結合）で きる生成物か生成される場合には存在すると考えられる。

“光生成物”の定義は、電磁線への！露により一旦生成されると、その生成物か 電磁線の不在下で核酸に結合“し得る”ことを要するか、生成物か暗所でのみ結 合する必要はないことに注目することが重要である。光生成物は、電磁線に暴露 される条件下で結合し得る。

それは平易に結合の条件を要求しない。このような定義は、核酸への“光結合” および“光生成物結合″の両方か同時に起こる、ことを可能にする。また、この ような定義は、単一化合物か“光生成物“および“光結合化合物“であることを 可能にする。

一つの実施態様では、本発明はブソラレン光生成物およびイソブソラレン光生成 物の両方の暗結合を意図している。４′−ヒドロキシメチル−４，５’、８−　 ）リメチルブソラレン（ＨＭＴ）の如きブソラレンでは、本発明は、ＨＭＴが活 性化波長の電磁線に暴露される場合に幾つかの生成物が生成されることを意図し ている。本発明は、ＡＭＩＰおよびＡＭＤＭＩＰの如きイソブソラレンが活性化 波長の電磁線に暴露される場合（特にＨＲＩ−１００デバイスで照射される場合 ）に、幾つかの生成物か同様に生成されることを意図している。ＨＭＴの主要な 生成物は二つのシクロブチル光二量体である。二量体の一つでは、２個のピロン 環がｃｉｓ−ｓｙｎ配置で結合され、一方、その他の二量体では、結合か１分子 のフラン末端とその他の分子のピロン末端の間で、再度ｅｉｓ−ｓｙｎ配置て生 じる。ＨＭＴの第三の生成物は単量体のＩｉＭＴ光異性体である。この異性体で は、中央の環酸素は通常の１．３配向ではなく１．４配向をとる。二つの光二量 体は幾何学上の観点から挿入活性を存すると予想されないが、光異性体は平面状 のままであり、それ故、それは二本鎖核酸と明確な挿入会合を有すると考えられ る。同様に、ＡＭＩＰおよびＡＭＩ”１ＶＩＰの生成物の幾つかはまた核酸と明 確な挿入会合を有すると考えられる。特別な理論に制限されないが、単量体異性 体が生成される場合、特に、正電荷のアミノメチル部分がその構造中に保持され る場合に、非共有暗結合が予想される。

Ｂ、光結合 活性化化合物を核酸に結合する本発明の一つの方法は光結合である。光結合は、 上記のように、光活性化波長の光の存在下に於１ノる光結合化合物の結合と定義 される。光結合化合物は、光活性化波長の光の存在下で核酸に結合する化合物で ある。本発明は、ｌ）本発明の光結合化合物による光結合、２）新規化合物およ び既知化合物による高度の光結合、および３）核酸に標識を付けるための光結合 を含む幾つかの光結合方法を意図している。

１）新規化合物による光結合 本発明の光結合方法の一つの実施態様は、ａ）光結合化合物を用意する工程、お よびｂ）光活性化波長の電磁線の存在下で光結合化合物を核酸と混合する工程を 伴い、この場合、光結合化合物はＤＥＭＣ（化合物＃２）　、ＸＭＩＰ（化合物 ＃５）　、ＨＶＩＰ（化合物＃６）　、　ＦＭＩＰ（化合物＃７）、ＩＭＩＰ（ 化合物＃８）　、ＨＭＴＡＭＩＰ（化合物＄９）　、ＡＭＩＰ（化合物＃１０） 、ＤＭＨＭＩＰ（化合物＃１１）、ＢＩＯＭＩＰ（化合物＃１２ａ）　、ＤＩＴ ＨＩＯＭＩＰ（化合物１２ｂ）、ＦＬＵＯＲＭＩＰ（化合物１２Ｃ）、ＸＡＭＣ （化合物＃１４）、ＲＸＡＭＣＣ化合物＃１５）、ＢＭＤＭＩＰ（化合物＃１８ 、この場合Ｘ＝Ｂｒ）　、ＦＤＭＩＰ（化合物＃２０）、ＩＭＤＭＩＰ（化合物 ＃２３）、ＨＤＭＡＤＭＩＰ（化合物＃２４）、ＢＩＯＤＭＩＰ（化合物＃２５ ａ）、ＤＩＴＨＩＯＤＭＩＰ（化合物＃２５ｂ）　、　ＦＬＵＯＲＤＭＩＰ（化 合物＃２５ｃ）　、およびそれらの放射能標識誘導体より成る群から選ばれる。

別の実施態様では、その方法の工程は、ａ）光結合化合物を用意し、ｂ）一つ以 上の核酸標的配列を用意し、そしてＣ）光活性化波長の電磁線の存在下で光結合 化合物を核酸標的配列と混合することを含む。

再度、一つの実施態様では、光結合化合物はＤＥＭＣ（化合物＃２）　、ＸＭＩ Ｐ（化合物＃５）　、）ＩＭＩＰ（化合物＃６）　、ＦＭＩＰ（化合物＃７）　 、ＩＶＩＰ（化合物＃８）　、ＨＭＴＡＭＩＰ（化合物＃９）　、ＡＭＩＰ（化 合物＃ｌＯ）、ＤＭＨＭＩＰ（化合物＃１１）、ＢＩＯＭＩＰ（化合物＃１２ａ ）　、ＤＩ’ＴＨＩＯＭＩＰ（化合物１２ｂ）、ＦＬＵＯＲＭＩＰ（化合物］２ ｃ）、ＸＡＭＣ（化合物＃１４）、ＲＸＡＭＣ（化合物＃１５）、ＢＭＤＭＩＰ （化合物＃１８、この場合Ｘ＝Ｂｒ）　、ＦＤＭＩＰ（化合物＃２０）、ｒＭＤ ＶＩＰ（化合物＃２３）　、ＨＤＭＡＤＭＩＰ（化合物＃２４）、ＢＩＯＤＶＩ Ｐ（化合物＃２５ａ）　、Ｄ［ＴＨｒＯＤ［Ｐ（化合物＃２５ｂ）　、ＦＬＵＯ ＲＤＭＩＰ（化合物＃２５ｃ）　、およびそれらの放射能標識誘導体より成る群 から選ばれる。更に、本発明は光結合の生成物、即ち、光結合化合物：核酸複合 体を意図している。

更に、本発明は、ａ）光結合化合物および核酸を用意する工程、およびｂ）光結 合化合物を核酸に光結合し、その結果、化合物：核酸複合体を生成する工程を含 む核酸の修飾方法を含む。本発明の光結合方法の好ましい実施態様は、ａ）光結 合化合物を用意する工程、およびｂ）光活性化波長の電磁線の存在下で光結合化 合物を核酸と混合する工程を伴う。

別の好ましい実施態様では、その方法の工程は、ａ）光結合化合物を用意し、ｂ ）一つ以上の核酸標的配列を用意し、そしてＣ）光活性化波長の電磁線の存在下 で光結合化合物を核酸標的配列と混合することを含む。

更に別の好ましい実施態様では、本発明は、ａ）光結合化合物および核酸を用意 する工程、およびｂ）光結合化合物を核酸に光結合し、その結果、化合物：核酸 複合体を生成する工程を含む核酸の修飾方法を意図している。

２）高度の光結合 本発明は、高い光結合親和性を有するイソブソラレンおよびイソブソラレンを使 用して高度の光結合を与える条件を提供する。高度の光結合は、既知化合物ＡＭ ＤＭＩＰに関して報告されたものよりもかなり高い付加のレベルを生じる核酸へ の光結合と本明細書で定義される。

Ｂａｃｃｉｃｈｅｔｔｉ　ら、およびＤａｌＦＡｃｑｕａらはＡＭＤＭＩＰの核 酸結合特性を既に報告していた。Ｂａｃｃｉｃｈｅｔｔｉ　らの米国特許第４． ３１２．８８３号明細書、Ｄａ　ｌ　ｌ’　Ａｃｑｕａら、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅ ｍ、２４：１７８（１９８１）を参照のこと。これらの研究者らは、ＡＭＤＭＩ ＰがＤＮＡに対して高い暗結合親和性を有するが、ＡＭＤＭＩＰによる光結合が 核酸への付加の低レベルを生じることを報告していた。実際に、ＡＭＤＭＩＰは 親化合物、ＤＭｒＰよりも少なく　ＤＮＡに光結合することがわかった。（ＡＭ ＤＭＩＰに関するＲＮＡ結合データは示されなかった）。

本発明は、ｉ）既知のイソブソラレン、および１１）新規イソプソラレンに関す る光結合方法を提供する。既知のイソブソラレンに関する方法に関して、本発明 は、１５塩基対当たり１の光結合ＡＭＤＭＩＰより大きいレベルでのＤＮＡへの ＡＭＤＭＩＰの光結合、および２０ＲＮＡ塩基当たりｌの光結合ＡＭＤＭＩＰよ り大きいレベルでのＲＮＡへのＡＭＤＭｒＰの光結合を可能にするＡＭＤ［Ｐの 光結合方法を提供する。新規イソプソラレンに関する光結合方法に関して、本発 明は、ＤＮＡの１５塩基対当たりｌの光結合ＡＭＩＰより大きいレベル、および ＲＮＡの２０塩基当たり１の光結合ＡＭｒＰより大きいレベルの光結合を可能に する新規化合物ＡＭＩＰの光結合方法を提供する。

特別な理論に制限されないが、本発明の光結合方法は、二つの概念、ａ）核酸塩 基対／化合物の比、およびｂ）イソプソラレン構造を考慮する。何となれば、そ れらは光結合能力に関係するからである。

ａ）核酸塩基対／化合物の比 Ｄａｌｌ’　ＡｃｑｕａらはＡＭＤＭＩＰ光結合を親化合物、ＤＭＩＰの光結合 と比較した。親化合物（並びにその他の化合物）をその溶解度の限界付近の濃度 で試験した。（即ち、ＤＭＩＰを１０．１　ｕ　ｇ／ｍｌて試験した。Ｄａｌｌ ’ＡｃｑＵａらにより報告された最大の水溶解度は８μｇ／ｍｌである）。比較 の目的で、ＡＭＤＭＩＰを同様にこの濃度範囲で（特に、１３．１Ｍｇ／ｍｌて ）試験した。この濃度範囲と仮定して、ＤＭＩＰおよびＡＭＤＭｒＰの両方の光 結合をＤＮＡ塩基対：イソブソラレンの比２４．３対１（１，１４ｘｌＯ−３Ｍ の　ＤＮＡ：４．７ｘｌＯ−’Ｍのイソブソラレン）で測定した。この比で、Ａ ＭＤＭＩＰの光結合は１５１のＤＮＡ塩基対当たりｌの光結合ＡＭＤＭＩＰを生 じ、これは親化合物、ＤＭＩＰに関して観察されたものよりも低い光結合であっ た、　Ｄａ１１’Ａｃｑｕａら、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、２４：１７８（１９８ １）を参照のこと。こうして、ＤＭＩＰの濃度とＡＭＤＭ［Ｐの濃度がほぼ等し い場合には、ＤＭＩＰは良好な光結合剤と報告された。

本発明の光結合方法は核酸塩基対／化合物の比を考慮する。本発明の光結合方法 は、イソブソラレン濃度が核酸塩基対の濃度に対して増加されるような条件下で 光結合工程を行うことを伴う。重要なことに、イソブソラレン濃度を増大するこ とはイソプソラレンの溶解性を利用する。高い水溶解性を有するイソブソラレン では、高濃度を得ることか可能である。

核酸に対してＡＭＤＭＩＰの濃度を増大することにより、本発明は親化合物、Ｄ ＭＩＰと較べてＡＭＤＭＩＰの非常に良好な溶解性を考慮する。ＤＭｒＰはＡＭ ＤＭＩＰよりも良好な固有の光結合剤であると報告されるが、核酸への付加のレ ベルは光結合化合物の濃度（核酸に対して）により支配され、この濃度は（一定 の核酸の濃度で）光結合化合物の溶解度により支配される。こうして、ＤＭＩＰ は良好な開存の光結合剤であるが、ＤＭ［Ｐの不充分な溶解性は核酸への付加の 比較的低いレベル（塩基対当たりの付加物）をもたらす。

ＡＭＩ）ＭｒＰの高い溶解性を利用することにより、高濃度のＡＭＤＭＩＰが使 用でき、こうして照射の前に光結合化合物対核酸塩基対の高い比を与えることが できる。ＡＭＤＭＩＰはＤＭ［Ｐよりも前動ではない光結合剤であると報告され るが、本発明は、核酸への高レベルの光付加、即ち、高度の光結合か得られるよ うにＡＭＤＭＩＰの濃度を増大することを意図している。

本発明の光結合方法の核酸塩基対／化合物の比は３：１未満であることが好まし い。この比で、本発明の方法は１５の塩基対当たりｌの光結合ＡＭＤＭＩＰより 大きいｌノベルのＤＮＡへのＡＭＤＭＩＰの光結合、および２０のＲＮＡＮ基塩 たり１の光結合ＡＭＤＭＩＰより大きいレベルのＲＮＡへのＡＭＤＭ［Ｐの光結 合を可能にする。

ｂ）イソブソラレン構造 本発明は核酸塩基対／化合物の比を考慮するが、本発明の方法は更にイソブソラ レン構造を考慮する。ＡＭＤＭＩＰの分子構造（第２図）の精査は４および５゛ の炭素て２個のメチル基を示し、そして４゛の炭素てアミノメチル部分を示す。

メチル化は核酸に光結合するブソラレンまたはイソブソラレンの能力を改善する ことが知られている。

トリアルキルイソブソラレン、特にトリメチルイソブソラレンは相当するジアル キル化合物よりも良好なりＮＡ光結合リガンドであり、ぞして同様に、ジアルキ ル化合物はモノアルギル類縁体よりも良好な光結合剤であることか報告されてい た。ＧｕｉＯｔｔＯら、Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｍ。

２７：９５９　（１９８４）を参照のこと。特に、イソブソラレン系の４．４° 、５．５゛および６位のメチル基は光結合活性を増大する。

４゛、５．５゛、または８位にアミノアルキル部分を含むブソラレンは帯電され 、そして未帯電の類縁体に対して増強された暗結合および増強された光反応性を 示す。特に、４′および５′アミノアルキル−トリメチルブソラレンは核酸への 増強された光結合を示す。Ｓ、　［−５ａａＣｔＳら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ　１６：１０５８（１９７７）並びに［、ｗｉｌｌｉｓおよびＪ、　Ｍ、　Ｍ ｅｎｔｅｒ、Ｎａｔ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ　６６（＋ ９８５）を参照のこと。

特別な理論に制限されないが、本発明の方法はこれらの構造上の関係を考慮し、 これらの関係はＡＭＤＭＩＰ中のアミノメチル部分の位置か高い光結合活性に最 適ではないかもしれないことを示唆する。４−アミノメチル部分は、外部のホス フェート基との会合により、４°、５“二重結合および／または３．４二重結合 と５゜６ピリミジ二ノ二重結合の間の重要なアラインメントか軽視されるように 挿入複合体をゆがめることかでき、シクロブタン環を形成する２＋２フオトシク ロ付加の量子効率のかなりの低下をもたらす。

本発明は、アミノメチル部分か５位にある新規化合物（例えば、ＡＭＩＰ）を提 供する。本発明の、：のような化合物は違った、そして潜在的に更に有利な二重 結合幾何学的形状を促し、ＡＭＤＭＩＰか与えるよりも高度の光結合をもたらし 得ることが望まれた。この新しい幾何学的形状か、環系に存在する付加的なメチ ル基を持たない化合物の欠へを解消し得ることは予測できなりかったか、本発明 の新規化合物は高度の光結合を示す。これに関して、既知化合物ＡＭＤＭｒＰは 全ての報告されたイソブソラレンのうちで最高のに、（ＤＮＡ会合定数）を有し ５、そして本発明の新規化合物ＡＭＩＰはわずかに２８％の強さのＫ。

を有するが、ＡＭＩＰはＡＭＤＭＩＰにより与えられる修飾密度の４３％を与え ることかできる。ｉ）二つの化合物の溶解度は実質的に同じであり、モして１１ ）試験を同じ濃度で行った（光結合）ので、アミノメチル部分を４゛位ではなく ５位に配置することは暗結合に対して光結合を増強するように見える。ＡＭＤＭ ＩＰが最高のイソブソラレン結合数を与えるとしても、ＡＭｒＰはイソブソラレ ン分子に対する良好な光結合剤である。

３）核酸の標識付は 上記のように、化合物の一つの実用性は核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡ）に結合する それらの能力である。更に、これらの化合物は核酸を結合するので、それらはま た核酸標的配列を結合する。標的配列は通常核酸の混合物中に存在するか、それ らは均一になるまで精製でき、そして本発明の光反応性化合物と反応させること かできる。

未標識化合物は核酸に結合するか、標識化合物は核酸への結合レベルを測定する のに特に有益である。何となれば、上記のように、標識は化合物の検出を容易に するだけてなく、核酸の如き化合物および核酸標的配列に結合された分子の検出 を容易にするからである。また、１：のようにして、結合反応体から未結合反応 体を分離すること（例えば、結合イソブソラレンから未結合イソブソラレンを分 離すること）が一層容易である。更に、結合か行われる場合、結合反応体の分離 および単離が実質的に純粋な結合生成物の生成を可能にする。

本発明は種々の条件下て上記の化合物を全ての型の核酸に結合し、それにより核 酸を標識付けすることを意図している。勿論、結合の程度は、特別な化合物、特 別な核酸、および使用される条件に応して変化する。本発明のイソブ′ノラＬ・ ンの如き・イソブソラレンを使用することの特別な利点は、標識付けかその後の ハイブリダイゼーシ９ンを妨害しないで行い得ることである。

本発明は、１）本発明の方法により合成された標識化合物および２）本発明の方 法により合成された本発明の標識化合物による核酸および核酸標的配列の標識付 けを意図している。

一つの実施態様では、本発明はＢＩＯＶＩＰおよびＢ［ＯＤＭＩＰを使用して核 酸標的に付加ビオチンを与え、次にその標識核酸をその後の検出工程で使用する ことを意図している。例えば、本発明はＢＩＯＶＩＰまたはＢｒＯＤＭＩＰをウ ィルスを含むと疑われている血液試料から抽出された全ＤＮＡと混合することを 意図している。その混合物の照射はＢＩＯＭＩＰまたはＢＩＯＤ！１ｌＩＰを核 酸に光結合させる。本発明は、その方法の次の工程かウィルスの核酸配列に特異 的な（即ち、相補性の）核酸プローブの使用を伴うことを意図している。これら のプローブは、ＢＩＯＭＩＰ（またはＢＩＯＤＶＩＰ）で処理された核酸に添加 される。プローブはポリスチレンビーズの如き固体担体に導入することか意図さ れる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後に、固体担体（プローブ／標的−ビ オチン複合体を含む）は結合の検出のだめのシグナル発生系（例えば、アビジン −１（ＲＰ複合体）で処理される。

厳密に同様にして、新規化合物ＦＬＩＪＯＲＭＩＰおよびＦＬＬＩＯＲＤＭＩＰ か標識核酸を与えるのに使用し得る。これらの化合物により、核酸が蛍光技術に より検出し得る。

本発明の光化学標識方法はその他の核酸標識技術よりも利点を有する。第一に、 上記のように、イソブソラレンによる標識付けはその後のハイブリダイゼーショ ンを妨害しない。第二に、光化学標識は全核酸標的配列の標識付けを可能にする 。これはＢＩＯ−１，ＩＴＰ系の如き酵素的標識方法と対照的である。Ｐ、　Ｒ ，Ｌａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　７８：６６３３（１９８１）を参照のこと。更に 、酵素的標識付け（例えば、ニックトランスレーション）は通常長さがわずかに 約２００の塩基対である標識生成物を生じる。最後に、イソブソラレンによる核 酸の標識付けは反復可能性および低コストの追加の利点を与える。

本発明の標識方法は核酸の性質により制限されることは意図されない。一つの実 施態様では、本発明は、核酸がヒトゲノムＤＮＡおよびヒトＲＮＡより成る群か ら選ばれることを意図している。別の実施態様では、本発明は、核酸配列がウィ ルスＤＮＡの配列およびウィルスＲＮＡの配列より成る群から選ばれることを意 図している。更に別の実施態様では、本発明は、核酸かウィルス核酸、細菌核酸 、菌類核酸、マイコプラズマ核酸および原生動物核酸より成る群から選ばれるこ とを意図している。

Ｖｌ、核酸の捕獲 本発明は、本発明の化合物が核酸および核酸配列を標識付けし、捕獲するのに使 用されることを意図している。一つの実施態様では、プローブＤＮＡがＤＩＴＨ ｒＯＭＩＰおよびＤｒＴＨｒＯＤＭＩＰｆ７）如き開裂可能なビオチンーイソブ ソラレンと反応させられてビオチニル化（プローブ）ＤＮＡを生じる。次に、こ のビオチンーイソブソラレン／核酸複合体はＤＮＡの混合物中の標的ＤＮＡにハ イブリダイズされる。ハイブリダイゼーション後に、ビオチン−ブローブー標的 複合体はアビジン−アガロースカラムに通される。アビジン−ビオチン−ブロー ブー標的複合体はカラムに保持され、一方、ハイブリッドされなかった（非標的 ）　ＤＮＡは洗い流される。洗浄後、ブローブー標的ＩＩＮＡハイブリッドはＤ ｒＴＨＩＯＭＩＰまたはＤＩＴＨＩＯＤＭＩＰのジスルフィド結合の還元により ビオチンをイソブソラレンから開裂することにより回収される。還元はジチオス レイトールまたはホウ水素化ナトリウムの如き試薬を用いて容易に行われる。

また、本発明はＢＩＯＭＩＰおよびＢＩＯＤＭＩＰの如き開裂し得ないビオチン ーイソブソラレンによる捕獲を意図している。一つの実施態様では、プローブＤ ＮＡがＢＩＯＶＩＰまたはＢＩＯＤＭＩＰと反応させられる。その後のハイブリ ダイゼーション工程、捕獲工程および洗浄工程は開裂可能な化合物に関して記載 されたものと同じである。しかしながら、洗浄後に、本発明は、全プローブ−標 的複合体がビオチン−アビジン相互作用を崩壊する試薬（例えば８Ｍのグアニジ ニウムクロリド）の添加によりアビジンカラムから除去されるか、または捕獲標 的配列がハイブリダイズされた核酸の変性によりプローブ−標的複合体から特異 的に放出されることを意図している。この最後の操作はカラムに結合されたプロ ーブを残し、標的をカラムから洗い流す。一つの実施態様では、この工程はカラ ムマトリックス内で変性条件を与える溶液（例えば、６０％のホルムアミド）に よる溶離により行われる。

■、鋳型依存性酵素的合成の抑制 鋳型として単独で核酸を伴う酵素的合成（例えば、翻訳はポリペプチドをつくる ために鋳型として核酸の使用を伴う）または鋳型および生成物の両方として核酸 を伴う酵素的合成（例えば、複製および転写は核酸を生成するために鋳型として 核酸を使用する）は、以後、“鋳型依存性酵素的合成”と称される。

複製の場合、核酸ポリメラーゼは核酸分子（“鋳型”）を複製して相補性（“娘 ”）核酸分子を生じる。例えば、ε、ｃｏｌｉから単離されたＤＮＡポリメラー ゼＩは、鋳型鎖にハイブリダイズされたＤＮＡの短いセグメント（“プライマー ”）の３゛末端へのデオキシリポヌクレオシドトリホスフェートの付加を触媒作 用して、前駆体ヌクレオチドの混合物（ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、お よびｄＴＴＰ）から出発して鋳型の娘を生じる。この５゛から３′への鋳型依存 性酵素的合成はまた“プライマー伸長“と称される。その反応は鋳型の不在下で は起こらない。一種以上の前駆体ヌクレオチドか標識付けされる（通常、それら は３２Ｐて放射能標識付けされる）場合には、その反応は測定し得る。

鋳型依存性酵素的合成を阻害する幾つかの既知のＤＮＡ修飾方法がある。例えば 、Ｅ、ｃｏｌｉポリメラーゼＩは、紫外線により誘発されたピリミジン塩基体（ Ｐ、　Ｄ、　Ｍｏｏｒｅら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７８：１ １０（１９８１））　、発癌物質付加物（Ｐ、　Ｄ、　Ｍｏｏｒｅら、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７９７１６６（１９８２））　、およびプ ロフラビン媒介グアニン残基光酸化（Ｊ、　Ｇ。

ＰｉｅｔｔｅおよびＰ、　Ｄ、　Ｍｏｏｒｅ、　Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ、　Ｐｈｏ ｔｏｂｉｏｌ、　３５　ニア０５（１９８２））のようなりＮＡの損傷に出会う 前の一本鎖ＤＮＡの一〇のヌクレオチドをコピーすることを停止する。

Ｃ，Ｍ、　Ｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７：１０４７（１９７８）は 、Ｅ、ｃｏｌｉからのＤＮＡポリメラーゼＩによるＤＮＡ複製が共有結合された ８−メトキシブソラレン（８−ＭＯＰ）または５．７−シメトキシクマリン（Ｄ ＭＣ）により抑制し得るか否かを研究した。８−ＭｏＰはブソラレンであり、Ｄ ＮＡを架橋するのに使用された。ＤＭＣは、ＤＮＡのピリミジン塩基への光付加 に必要なフリル炭素−炭素二重結合を欠くクマリン誘導体である。ＤＭＣは架橋 を形成できない。架橋されたＤＮＡ（８−ＭＯＰで修飾されたもの）は使用され た酵素に関してその鋳型活性の９７％を失うことかわかった。

ＤＭＣで修飾された（未架橋の）ＤＮＡはその鋳型活性のわずかに５０％を失っ た。ＤＮＡの架橋は鋳型活性の抑制の相違の原因となることか提案された。

Ｊ、　Ｇ、　ＰｉｅｔｔｅおよびＪ、　Ｅ、　Ｈｅａｒｓ　ｔ、　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　８ｏ　：　５５４O（１９８３） は、Ｅ、ｃｏｌｉポリメラーゼ■が、二本鎖鋳型をニックトランスレーションす る場合に、共有結合プソラレン［４′−ヒドロキシメチル−４，５′。

８−トリメチルブソラレン（Ｈ！ＪＴ）　］モノ付加物またはイソブソラレン（ ５−メチルイソブソラレン）モノ付加物により抑制されないことを報告していた 。しかしなから、その酵素はブソラレン架橋により有効に阻止される。

Ｊ、　Ｇ、　Ｐｉｅｔ　ｔｅおよびＪ、　Ｅ、　Ｈｅａｒｓｔ、　Ｉｎｔ、　Ｊ 、　Ｒａｄｉａｔ、　Ｂｉｏｌ、　４８　：３８１（１９８T） は、Ｅ、ｃｏｌｉポリメラーゼＩが、−重鎖鋳型（−重鎖バクテリオファージＤ ＮＡ）で鋳型依存性酵素的合成を行う場合に、ＨＭＴモノ付加物により抑制され ることをその後報告していた。ＤＮＡ構造（−重鎖対二本鎖）が異なる結果の原 因であるに違いないことが結論された。

Ｇ、　Ｅｒ１ｃｓｏｎおよびＰ、Ｗｏｌｌｅｎｚｉｅｎ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７４：２１５（１９８８）はＲＮＡに関するブソラレン架 橋および逆転写酵素を阻止するそれらの能力を調べた。彼らは、ブソラレン架橋 が鳥類の骨髄芽球症ウィルス逆転写酵素の絶対の停止点であることを報告してい た。

ブソラレンモノ付加物は酵素の抑制を殆ど示さなかった。

これらの実験は、核酸の酵素的合成の阻止がブソラレン架橋で行うことができ、 成る場合には、阻止がブソラレンモノ付加物で行うことができることを示した。

重要なことに、イソブソラレンで酵素的合成を阻止しようとする一つの試みは抑 制を示さなかった。

本発明は、核酸の鋳型依存性酵素的合成が一種以上の“阻害剤”（阻害剤はイソ ブソラレンおよび光生成物より成る群から選ばれる化合物である）で有効に抑制 し得るという驚くべき結果を与える。

先に注目されるように、イソブソラレンは架橋を形成できない。

（“光生成物″は包括的に定義され、そして先に説明された）。

本発明は、Ａ）部位特異的共存結合付加、Ｂ）ランダム共有結合付加、およびＣ ）光生成物付加により鋳型依存性酵素的合成を抑制することを意図しており、そ してＤ）化合物／酵素特異性を明らかにする。

Ａ、部位特異的付加 本発明は、核酸への新規イソブソラレンおよび既知イソプソラレンの部位特異的 結合による鋳型依存性伸長の抑制を意図している。一つの実施態様では、特異的 に配置されたイソブソラ１／ン付加物の構築のための本発明の方法は、互いに相 補性であるか、長さの異なる二つの短いオリゴヌクレオチドで開始する。これら のオリゴヌクし・オチドは１、イソブソラレンと共に、オリゴヌクレオチドか二 本鎖分子として塩基対合されるような条件下に一緒に置かれる。この非共有結合 複合体は照射されてオリゴヌク１ノオ千ドへのイソブソラレン（３２０−４００ ｎｍ）またはブソラレン（＞３８０ｎｍ）の付加を生じる。照射後に、モノ付加 オリゴヌクレオチドはＨＰＬＣまたは変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐ ＡＧＥ）により単離される。

もとの短いオリゴヌクレオチドの異なる長さのために、夫々の鎖に特異的なモノ 付加オリゴヌク１．・オチドが単離される。更に、本発明は、短いモノ付加オリ ゴヌクレオチドか結合反応および相補的スプリンｌ−（副木）分子の使用により 長いオリゴヌクレオチドに付加シ１．得ることを意図している（その長い結合分 子はＰＡＧＥにより精製される）。

このような特異的につくられたモノ付加オリゴヌクレオチドは光反応性化合物の 異なる部位特異性を決定するのに仔益であるっ本発明は異なる部位特異性に関し て異なる化合物の使用を意図している。例えば、ＡＭＩＰはＡＭＤＭＩＰと異な る部位特異性を存する。

Ｂ、ランダム付加 また、本発明はイソブソラレンをランダムに付加してイソブノラレンと核酸の共 存結合複合体を生成することを意図している。

ランダムは、特定のイソブソラレンか優先的な配置を示さないことを意味しない 。ランダムは、付加のレベル（一つ、二つまたは三つの付加物、等）か鎖に対し 一つの付加物に限定されないことを意味する。その化合物は多数の部位に接近す る。更に、本発明は、イソブソラレンを混合してランダム付加のための“カクテ ル”をつくることを意図している。ランダムに付加されたカクテルを使用するこ とかでき、この場合、鎖あたりに多数の付加物が所望され、そして優先的な配置 かめられる。本発明は、ランダム付加のために単一混合物およびカクテルの両方 を選択する際に核酸の性質（Ａ：Ｔ豊富、ＡＴ不充分）か考慮されることを意図 している。

Ｃ１光生成物付加 フロクマリンによる核酸の複製の阻止に関する従来の研究は、時間の経過順の工 程ｌ）特定のブソラレン誘導体を用意する工程、２）特別な核酸または一種以上 の核酸標的配列を用意する工程、３）活性化波長の電磁線の存在下でブソラレン を核酸と混合する工程を有する方法により歴史的に先行していた。一つの実施態 様ては、本発明は阻止に対するこの従来の試みからの劇的な逸脱を意図している 。本発明の方法の一つの実施態様では、時間経過の順序は以下の通りである。１ ）一種以上のフロクマリン誘導体を用意し、２）一種以上のフロクマリン誘導体 を活性化波長の電磁線に暴露し、３）特別な核酸または一種以上の核酸標的配列 を用意し、４）一種以上の照射フロクマリン誘導体を核酸と混合する。この実施 態様ては、フロクマリンは核酸と混合する前に照射される。この新規な時間経過 の順序の実験上の研究は、フロクマリン光生成物か存在すること、そして光生成 物か鋳型依存性酵素的合成、例えばブラ、イマー伸長を抑制し得ることを立証し た。

一つの実施態様では、本発明はＡＭＤＭＩＰ光生成物およびＡＭＩＰ光生成物（ “光生成物カクテル”）を使用してポリメラーゼ活性を阻害することを意図し１ ている。阻害に関する特別な分子機構に制限されないが、阻害は光生成物と核酸 の相互作用のために特異的であると考えられる。一つの実施態様では、本発明の 方法は、ａ）前照射されたＡＭＩＰおよびＡＭＤＭＩＰを用意し、ｂ）一種以上 の核酸標的配列を用意し、モしてＣ）前照射されたＡＭＩＰおよびＡＭＤＭＩＰ を一種以上の核酸配列に付加すること（その結果、一種以上の配列かポリメラー ゼにより伸長し７得ない）を含む。再度、特別な分子機構に制限されないが、そ の後の核酸への熱付加を受ける光生成物か生成されると考えられる。光生成物： 核酸複合体はポリメラーゼの鋳３”ｊとして利用できないと考えられる。

本発明の光生成物カクテルの利点は、標的の不在下で阻害剤を予備生成する能力 を含む。次に光生成物をその方法の適当な時点（例えば、ポリメラーゼ阻害部分 が核酸または核酸配列に付加させるために必要とされる時へ）で用意することか できる。この前照射は、特に熱感受性試薬か阻害のために使用される場合に考え られる。例えば、熱感受性である化合物は幾つかの型の鋳型依存性酵素的合成に 適さない。このような化合物は光活性化の前に熱分解のためにそれらの実用性を 失う。本発明の光生成物阻害の方法の新規な時間経過の順序により、熱安定性の 必要性かなくされる。何となれば、光生成物は予備生成でき、そして熱サイクル の終了時に添加し得るからである。

Ｄ、化合物／酵素特異性 本発明は、成る種の化合物／酵素特異性かあることを示唆する結果、例えばイソ ブソラレンかその他のイソブソラレンよりも良好に特別なポリメラーゼを阻害す るという結果を与える。例えば、ＭＩＰ付加物およびＡＭＩＰ付加物はＴａｑポ リメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼおよび逆転写酵素によるプライマー伸長を抑制す る。しかしなから、ＭｉＰ付加物およびＡＭＩＰ付加物はＥ、ｃｏｌｉポリメラ ーゼまたはフレノウ断片によるプライマー伸長において同じ抑制レベルを示さな い。対照的に、ＡＭＤＭＩＰ付加物は全てのこれらの酵素によるプライマー伸長 において同じ抑制レベルを示す。

■１．失活 本発明は、その他の用途の中でも、核酸の増幅に関連するキャリオーバー問題を 解決するのに有益である失活方法を意図している。その方法の総合のアプローチ は、キャリオーバーの現象か起こる前に、増幅後の核酸を実質的に増幅不能にす ること（それ故、“増幅後失活“）を伴う。

増幅後失活はキャリオーバーを調節するように設計される。試薬調節を同時に行 ってキャリオーバーが最初の場所に存在しないことを確実にすることが望ましい 。

標的配列は、それらがその他の核酸からえり分けられることをめられている意味 で“標的”であることが先に注目された。増幅技術は主としてこのえり分けのた めに設計されていた。“増幅“は鋳型特異性を伴う複製の特別な場合である。そ れは非特異的鋳壓複製（即ち、鋳Ｖ依存性であるが、特異的鋳型に依存しない復 製）と対比されるべきである。鋳型特異性は、本明細畜では、複製の適合性（即 ち、適当なポリヌクレオチド配列の合成）およびヌクレオチド（リボヌクレオチ ドまたはデオキシリボヌクレオチド）特異性とは区別される。

鋳型特異性は酵素の選択により殆どの増幅技術で得られる。増幅酵素は、それら が使用される条件下で、核酸の不均一な混合物中の核酸の特定の配列のみを処理 する酵素である。例えば、Ｑβレプリカーゼの場合、ＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡがレブ リカーゼの特異的鋳型である。Ｄ、　Ｌ、　Ｋａｃｉａｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ 、Ａｃａｄ、５ｃｉＵＳＡ　６９：３０３８（１９７２）を参照のこと。その他 の核酸はこの増幅酵素により複製されない。同様に、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ の場合、この増幅酵素はそれ自体のプロモーターに対してストリンジェント特異 性を有する。Ｍ、　Ｃｈａｍｂ−ｅｒｌｉｎ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　２２８：２２ ７（＋９７０）を参照のこと。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼの場合、酵素は二つのオリ ゴヌクレオチドを連結せず、この場合には連結接合部でオリゴヌクレオチド基質 と鋳型の間にミスマツチがある。Ｄ、　Ｙ、　ＷｕおよびＲ，Ｂ、Ｗａｌｌａｃ ｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４：５６０　（１９８９）を参照のこと。最後に、Ｔａ ｑポリメラーゼは、高温で機能するその能力のために、プライマーにより結合さ れかつ規定された配列に対して高い特異性を示すことが知られている。高温は、 標的配列とのブライマーハイブリダイゼーションに有利であるか、非標的配列と のハイブリダイゼーションには有利でない熱力学的条件を生じる。ＰＣＲＴｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈ，Ａ、Ｅｒ１ｉｃｈ（ｅｄ、Ｘ５ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓ ｓ　１９８９）を参照のこと。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩおよびフレノウの如き酵素は特異的酵素で はない。実際に、それらの活性の範囲（温度、ｐｌ（、等）内で、それらは無差 別なものである。それらは３′ヒドロキシル残基および突き出している５°鋳型 を露出している短い二本鎖セグメントを育するあらゆる核酸を伸長する。これは 、勿論、これらの酵素が増幅プロトコルに使用し得ないことを言うのてはない。

例えば、これらの酵素は同種核酸と共に使用されて特異的標的を生成し得る。

本発明の失活方法は、失活される核酸を生成する特別な増幅系の性質により制限 されることは意図されない。幾つかの増幅技術は、増幅し、次に標的を検出する というアプローチをとる。その他の増幅技術は標的を検出し、次にプローブを増 幅する。そのアプローチにかかわらず、増幅核酸は新しい反応に持ち越され、続 いて増幅し得る。本発明は、この増幅核酸を、それがキャリオーバーとして持ち 越される前に、失活させることを意図している。

Ａ、一般の失活 成るものは、それが複製し得なくされる場合に“失活される”。

“失活（ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ）”という用語は典型的には生きている生 物のみに関係して適用されていたが、本明細書ではポリヌクレオチドの生体外増 幅プロトコルに適用されることが意味され、この場合、鋳型ポリヌクレオチドは 発芽種子の性質に於いてそれの更なる繁殖のために機能する。

失活“感度”は、操作上定義される用語である。それは“失活方法“および鋳型 （または生物）を測定するのに使用される特別な検出方法のみに関係して定義さ れる。失活感度は、成る失活方法および規定された検出アッセイで測定可能なシ グナルを生じる発芽種子（例えば、生存可能な細菌細胞またはポリヌクレオチド 鋳型）の数である。

“失活方法”か“失活”を得ることができるか、否かを理解するために、特別の 例を考えることが存益である。培養菌のアリコートが新しい培養プレートに移さ れ、そして増殖させられる場合に、成る期間後に検出できない場合に、培養菌は 失活されると言われる。その期間および増殖条件（例えば、温度）は“増幅ファ クター“を規定する。この増幅ファクターは、検出法（細菌コロニーの外観に関 する培養プレートの目視検査）の限界と共に、失活方法の感度を規定する。最小 数の生存可能な細菌が、シグナルが検出できるためにプレートに塗布される必要 がある。最適の検出法では、この最小数は１個の細菌細胞である。準最適の検出 法ては、シグナルが観察されるように塗布される細菌細胞の最小数は１より非常 に大きくてもよい。検出法は“閾値“　（この値より下では、“失活方法”は完 全に有効であることが明らかであり、この値より上では、“失活“は実際にわず かに部分的に有効である）を測定する。アッセイの増幅ファクターと、検出法が 規定する閾値の間のこの相互作用を説明することができる。表４を参照して、細 菌細胞か二つの異なる組の条件下でプレートに塗布される。

一つの場合には、増殖条件および時間は、１０’の全増幅が生じたようなもので ある。他の場合には、増殖条件および時間は、１０８の全増幅が生じたようなも のである。

（本頁以下余白） 表４ プレートに塗布された 増幅ファクター生存可能な細菌細胞数 １０’　１０’　１０’　１０“　１０７　増幅後の細菌細胞数−一＋＋十　検 出（＋／−） １０’　１０＠ｌ（１”　１０”　１０”　増１１１ａｉ後）細菌細胞数＋＋　 ＋＋＋　＋＋＋　＋＋＋十検比検出／−）その検出法は目視検査であるように任 意に選ばれる。検出できるシグナルは増幅後に実際に存在する細菌細胞の数に比 例する。計算目的のため、検出閾値は１０’の細胞であるようにとられる。１０ ６より少ない細胞が増幅後に存在する場合には、細胞コロニーは目視て検出てき す、失活方法は有効であることが明らかである。１０’の増幅ファクターおよび １０’の検出閾値と仮定すると、失活感度限界は１００の細菌細胞である。失活 方法が行われた後に１００より少ない生存可能な細菌細胞か細菌培養液の最初の アリコート中に存在した場合には、その培養菌か失活されることが明らかである 。

また、時間および増殖条件が１０８の増幅を可能にした場合には、失活感度限界 （同じ検出閾値と仮定する）は１の細菌細胞である。

最後の条件下で、失活方法は、失活が完全であることが明らかであるためには全 ての細菌細胞が実際に複製できないように充分にストリンジェントである必要が ある（即ち、失活方法は失活を生しることを要するが、かなりの失活を生じるこ とを要しない）。

Ｂ、潜在的なキャリオーバーの失活 核酸の失活方法の感度限界を測定する場合には、検出閾値および増幅ファクター の同じ考慮か存する。再度、“失活”は、核酸か複製し得なくされ、詳しくは増 幅し得なくされることを意味する。

本発明の増幅後失活方法は核酸を実質的に増幅し７得なくする。っ一つの実施態 様では、増幅後失活方法は増幅核酸を増幅し得なくするが、検出可能にする。更 に別の実施態様では、本発明の増幅後失活方法は、生じた増幅可能な核酸のキャ リオーバー分子の数か充分に小さく、その結果、その後の増幅で、増幅生成物か 試料中の真の標的の存在を反映することを意図している。好ましい実施態様では 、本発明の増幅後失活方法は標的配列の増幅セグメントを実質的に増幅し得なく するか、キャリオーバー現象の前に検出可能にする。

本発明の増幅後失活方法は核酸の性質により制限されることか意図されない。増 幅後失活方法は全ての形態の核酸（ＤＮＡ、　ｍＲＮＡ、等）を実質的に増幅し 得なくすると考えられる。

“鋳型”は、核酸か一種以上の標的配列の一種以上のセグメントを含む状況、お よび核酸か標的配列を含まない（それ故、標的配列のセグメントを含まない）状 況の両方を包含する。また、″鋳型”は、核酸が一種以上のｖｉ製可能なプロー ブを含む状況、および核酸か複製可能なプローブを含まない状況の両方を包含す る。鋳型か増幅に使用され、そして増幅か行われる場合には、“増幅生成物“か ある。“鋳型”は、標的またはプローブか存在しない状況を包含するので、″増 幅生成物“は、増幅された標的またはプローブか存在しない状況を包含する。

本発明は、“失活用化合物“および“失活用化合物′を使用する方法を提供する 。“失活用化合物゛は、本発明の失活方法により核酸を処理するのに使用される 場合に、核酸か実質的に増幅し得なくされ、即ち、実質的に失活されるようなも のと定義される。

本発明の好ましい失活用化合物は活性化化合物である。

本発明は、核酸かこれらの方法および化合物により実質的に増幅し得なくされる という理論に制限されることを意図していないが、失活かｌ）核酸の修飾、また は２）増幅酵素それ自体の阻害により生じることか推測される。再度、いかなる 機構にも制限されないか、核酸の修飾か失活用化合物で生じる場合にはそれかお そらく起こることか予測される。何となわば、これらの化合物は増幅核酸と反応 して塩基に対して充分な付加物（即ち、充分な“修飾密度”）を生じ、その結果 、統計上、全ての鎖か１）増幅用鋳型として一本鎖の形態の変性核酸のその後の 使用または２）二本鎖形態の核酸の一本鎖への解離を妨げられ、それにより、そ れがその後の増幅の鋳型として作用するのを防止するからである。一方、増幅酵 素の直接の阻害が生じる場合には、それがおそらく起こることか予測される。何 となれば、失活用化合物か１）疎水性および親水性の相互作用、または２）立体 障害により作用するからである。

核酸を修飾する失活用化合物の場合には、核酸（ＤＮＡ、　ｍＲＮＡ、等）と失 活用化合物の相互作用か増幅酵素に実際の標的配列とキャリオーバー核酸とを区 別させることか好まし２く、その結果、増幅核酸かその後の増幅にキャリオーバ ーとして持ち越される場合には、それは増幅されない。

Ｃ１選択的失活 本発明の失活方法は、キャリオーバー問題に関係なく、増幅と連係するのに育苗 であることか更に考えられる。一つの実施態様では、核酸の混合物に関して、増 幅し得なくされることか所望される核酸か実質的に増幅し得なくされるか、増幅 可能のままであることか所望される核酸（以下、“ジェルタート核酸“と称する ）か増幅可能のままであるような選択的な方法て失活が行われることか考えられ る。本発明は、この選択的失活（およびその後の選択的増幅）について三つの一 般のアプローチを意図している。

第一に、本発明は活性化化合物、特に光反応性の活性化化合物の部位特異性を利 用することを意図している。このアプローチでは、核酸に対して既知の部位特異 性（例えば、ＴｐＡ部位特異性）（または部位優先性）を有する活性化化合物が 選ばれる。部位特異性はジェルタート核酸の配列の知識により選ばれることか好 ましい。このようにして、活性化化合物が非失活修飾密度でジェルタート核酸に 結合する　（または全く結合しない）か、失活修飾密度で残りの核酸に結合する ような部位特異性を選ぶことかできる。

第二に、本発明は、核酸との結合のために幾つかの活性化化合物の特異な二次お よび三次の構造上の要件を利用することを意図している。この場合、ジェルター ト核酸は、残りの核酸と異なる二次構造または三次構造を有する必要がある。ジ ェルタート核酸に欠けている二次構造または三次構造を必要とする活性化化合物 か選ばれ、そして核酸混合物に添加される。その活性化化合物は非失活修飾密度 でジェルタート核酸と結合し、失活修飾密度で残りの核酸と結合する。

最後に、本発明は多重増幅プロトコルに於ける多重失活を意図している。第一増 幅か第一ポリメラーゼにより行われ、続いて第二増幅か第二ポリメラーゼにより 行われるような多重増幅系か示唆されていた。例えば、第一増幅は第二増幅の酵 素のためのプロモータ一部位を導入するのに使用し得る。Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏ １ｄ　ＳｐｒｉｎｇｓＨａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉａ、　Ｖｏｌ、　Ｌｌ、　 ｐ２６３　（１９８６）並びにＧ、　Ｊ、　Ｍｕｒａｋａｗａら、ＤＮＡ７：２ ８７　（１９８８）を参照のこと。これらの多重増幅系への失活アプローチに於 いて、本発明は活性化化合物、特に光反応性活性化化合物の特異なポリメラーゼ 特異性を利用する。核酸に結合された場合に、第一増幅で第一ポリメラーゼによ る増幅を抑制するか、第二増幅で第二ポリメラーゼを抑制しないような第一活性 化化合物か選ばれる。増幅後失活は、この第一活性化化合物による第−増幅後に 行われる。このようにして処理された増幅核酸は第一ポリメラーゼにより増幅さ れないが、第二ポリメラーゼにより増幅し得る。その後、増幅後失活は、第二活 性化化合物（これは、核酸に結合された場合に、第二ポリメラーゼによる増幅を 抑制する）による第二増幅の後に行い得る。

Ｄ、失活のための活性化化合物の選択 上記のように、本発明の好ましい失活用化合物は活性化化合物である。第３図は 、活性化化合物が失活用化合物としての使用のためにスクリーニングし得る方法 を略図で示す。四つの“失活方法”が、夫々の方法の潜在性の反応体か増幅系に 添加される時屯と共に示される（増幅系は全ての増幅方法、例えば、標的増幅ま たはプローブ増幅を包含すると考えられる）。

失活方法は下記の時間の経過類の工程からなる。

方法■、活性化化合物を添加し、次に試料を増幅し、続いて活性化化合物の活性 化（“トリガー“）を行う。

方法■Ｉ：試料を増幅し、次に活性化化合物を添加し、続いて活性化化合物の活 性化（“トリガー”）を行う。

方法ＩＩＩ：前活性化した（“トリガーした″）活性化化合物を添加し、次に試 料を増幅する。

方法Ｉ■、試料を増幅し、次に前活性化した（“トリガーし７た”）活性化化合 物を添加する。

一般的な場合には、活性化化合物は活性形態に“トリガーされる”。この形態は その系に失活活性を与える。必要とされるトリガーの型は失活用化合物の性質に 依存する。例えば、熱反応性化合物は、正確な温度を与えることによりトリガー され、一方、光反応性化合物は、適当な活性化波長の電磁線を与えることにより トリガーされる。第３図の充分な考慮は、活性化化合物が潜在性の失活用化合物 として分析されることを可能にし、その適当な適用方法を規定する。

新規化合物（“Ｘ”）は可能性のある失活用化合物として評価し得る。Ｘは最初 に方法Ｉの工程Ａで評価される。工程Ａでは、Ｘか増幅の前に試料調製工程中に 試料に添加される。増幅法が行われ、増幅生成物の収率がＸを使用しないで増幅 された同し試料と比較される。増幅収率が両方の試料で同様である場合には、Ｘ の失活活性は方法ｒの工程Ｂて評価される。工程Ｂては、増幅が起こった後に、 適当な“トリガー”が発射されてＸを活性化する。

例えば、Ｘが熱試薬である場合には、適当な温度が与えられて活性化形態の化合 物（Ｘ”・一般的に活性化されたＸ）を生じる。

次に、増幅生成物に関するＸｏの失活効果が、処理後の増幅生成物の再増幅によ り測定される。許容できるレベルの失活が実現される場合には、別の評価が行わ れて修飾標的分子のその後の検出に関してＸｏにより与えられた修飾の効果を測 定する。このようにして、方法■の失活試薬としてのＸの有効性およびその後の 検出フォーマットと修飾増幅標的の適合性の両方か評価される。

また、Ｘは方法■、工程Ａで増幅方法を抑制することがある。

このイベントでは、Ｘは方法■で有効に使用できない。その後、Ｘは方法［１の 失活試薬として評価される。方法ＩＩでは、増幅、化合物添加およびトリが−の 時間的順序が方法■に対して変化される。方法ＩＩでは、Ｘが添加され、続いて 増幅され、それにより方法Ｉで検出される増幅抑制を避ける。この方法ては、増 幅生成物に関するＸｏの失活効果が、増幅に関するＸの負の効果とは独立に測定 し得る。方法１１の失活活性の評価は方法Ｉ、工程Ｂと同じ方法で行われる。

失活のためにＸを使用する二つの別の方法は、方法ＩＩＩおよび方法ＩＶである 。これらの方法の両方に於いて、Ｘは試料への添加の前にトリガーされてＸｌを 与える。次に、Ｘ＃が増幅の前（方法ＩＩ＋）またはその後（方法Ｉｖ）にその 系に添加される。

方法ＩＩＩては、Ｘｏが与えられて、次に増幅の前に試料に添加されてもよい。

Ｘが光反応性化合物である場合には、Ｘ９は活性化波長の電磁線への光反応性化 合物の暴露の生成物である。増幅がこの生成物で抑制される場合には、活性化波 長の電磁線へのＸの暴露か光生成物を生じると疑うことが妥当であり得る。

方法ＩＶでは、Ｘｏが与えられて、次にその系に添加され、続いて増幅され、そ れにより、増幅法との適合性の問題を避ける。Ｘ。

は、方法＋Ｖに従って与えられ、使用される場合に、熱活性化されようと、また は光活性化されようとも、一つ以上の機構により有効な失活を与えることができ る。Ｘｏは、その系の増幅標的、非核酸成分、またはその両方と反応し得る。

表５は、以上のことを要約する。

第３図で注目されるように、増幅後失活に適した活性化化合物の選択はまた使用 される検出法に一部依存する。検出操作か増幅核酸配列によるハイブリダイゼー ション工程を伴う場合には、増幅配列は利用可能でハイブリッド形成可能である ことか所望される。即ち、それらは不可逆的に二本鎖を形成すべきではない。検 出操作がハイブリダイゼーションを伴う必要がない場合（例えば、標識核酸前駆 体のとり込み、またはビオチニル化プライマー（これらはその後検出される）の 使用）、増幅配列は通常二本鎖のままであり得る。失活の好ましい方法では、失 活操作により生じた修飾がその後の検出工程を妨害しないことが所望される。増 幅標的配列に対する増幅後修飾の場合、標的分子の増幅セグメントのハイブリダ イゼーションまたは検出に影響がないことが好まし表５ 可能性のある失活試薬の評価 方法／工程　糀愚°　説明７次の工程 １／Ａ　＋ａｍｐｌ　化合物は増幅と適合性である／方法Ｉ、工程Ｂで評価する ｒ／Ａ　−ａｍｐｌ　化合物は増幅と不適合である／方法ＩＩ、工程ＡおよびＢ で評価する １／Ａ＋Ｂ　＋５ｔｅｒ　化合物は方法■て有効な失活試薬である／検出を評価 する １／Ａ＋Ｂ　−５ｔｅｒ　化合物は方法Ｉで失活試薬として有効てはない／方法 ＩＩ、　ＩＩＩおよびＩＶて評価する Ｉｆ　＋５ｔｅｒ　化合物は方法ＩＴで失活に有効である／検出を評価する ＩＩ　−５ｔｅｒ　化合物は方法１１で失活試薬として有効でではない／方法Ｉ ＩＩおよびＩＶで評価するＩＩＩ　−ａｍｐｌ　化合物は方法ＩＶで有効であり 得るＩＩＩ　＋ａｍｐｌ　化合物は増幅と適合性であるが、定義により失活に有 効ではない ＩＶ　＋５ｔｅｒ　化合物は方法！■で有効な失活試薬である／検出を評価する ＩＶ　−５ｔｅｒ　化合物は方法ＩＶで失活試薬として有効ではない ＊　＋／−ａｍｐｌ＝増幅を抑制した／増幅を抑制しなかった＋７−ｓｔｅｒ＝ 失活有効／失活無効 環境因子は特に試料調製において重要な考慮事項である。好ましい化合物は、通 常の実験室／臨床環境（このような環境中に見られる通常の白熱または蛍光照明 を含む）に対する感受性または毒性のための特別な取扱を必要としない。使用者 に毒性であり、且つ／′または部屋の光に敏感である化合物は、使用のために特 別な環境を特徴とする特別な環境は、本来、そのアッセイを更に煩雑、複雑１＝ シ、従って更に誤動作を受けやすくする。このようなアッセイのための支持装置 は同様に更に複雑になる。

増幅核酸は、それらか失活されるまで環境に暴露されないことか所望されるので 、本発明の好ましい実施態様は失活のために光反応性化合物の使用を意図してい る。先に注目されたように、“光反応性化合物”は、適当な波長の電磁線に応答 して化学変化を受ける化合物と定義される。光反応性化合物は、反応容器を開け ないで（適当な反応容器か使用される場合）、失活を可能にするという利点を有 する。更に、増幅核酸の修飾かその後の工程を妨害しないことか所望されるので 、本発明は検出を妨害し、ない光反応性化合物の使用を意図している。

（重置以下余白） 好ましい実施態様では、本発明は、閉鎖系（すなわち増幅核酸は修飾されるまで 外界にさらされない）において、増幅および失活することを意図する。１つの実 施態様では、本発明は増幅の間、光反応性化合物か反応混合物中に存在すること を意図する。この方法では、失活化合物を導入するために反応容器を開く必要は ない。

閉鎖容器内で光反応性化合物を使用するには、適切な波長の十分な光か容器を通 過することか必要である。それ故、試料を照射するために、光器具を本発明と連 係して使用しなければならない。上記のように（’　Ｉｌ、光活性化デバイス″ ′）、これらの特徴を備えた器具か本発明により意図される。

一般に、本発明の失活方法は、ａ）反［ｔ、成分どして、ｌ）核酸、１１）増幅 試薬、１ｉｉ）１以上の増幅酵素、１ｖ）１以上の失活化合物、およびＶ）反応 物を収容する手段を、いずれかの順序で供給する；ｂ）前記の反応物収容手段に 、いずれかの順序で、前記核酸ど前記増幅試薬を加え、反応混合物を作る：そし てＣ）前記反応混合物に、時間的順序の条件熱して、ｉ）前記の１以上の増幅酵 素と、１１）前記の１以上の失活化合物を付加する；ことから成る、核酸を処理 するための方法である。

好ましい実施態様では、失活は、連続工程：ａ）　ｉ）１以上の光反応性化合物 、自）核酸、１ｉｉ）増幅試薬、１ｖ）１以上の増幅酵素、およびＶ）反応物を 収容する手段を、いずれかの順序で供給すること、ｂ）前記の反応物収容手段に 、いずれかの順序で、１以上の光反応性化合物、核酸、および増幅試薬を添加し 、反応混合物を作ること、ｃ）前記の１以上の増幅酵素を前記反応混合物に添加 すること、そしてｄ）前記光反応性化合物を光活性化するために適切な波長の電 磁線を用いて前記混合物を処理すること：から成っている″増幅試薬′は、核酸 と増幅酵素以外の増幅に必要な試薬（プライマー、デオキシリポヌクレオシト用 ・リホスフエート、等）として定義される　。１つの実施態様ては、収容するた めの手段は反応容器（試験管、マイクロウェル等）である。

もう１つの実施態様では、失活は連続工程ａ）ｉ）１以上の光反応性化合物、１ １）核酸、１ｉｉ）増幅試薬、１ｖ）１以上−の増幅酵素、およびＶ）反応物を 収容する手段、をいずれかの順序で供給すること。

ｂ）前記の反応物収容手段に、前記核酸と前記増幅試薬を添加し、その後１以上 の増幅酵素を加えて反応混合物を作ること、Ｃ）前記の１以上の光反応性化合物 を前記反応混合物に添加すること、ｄ）前記光反応性化合物を光活性化するため に、適切な波長の電磁線を用いて、前記混合物を処理すること：から成っている 。

種々の実施態様により、光反応性化合物、増幅試薬、核酸および増幅酵素の混合 は、いずれの順序でもてきると説明しているか、光反応性化合物は、増幅の開始 前に添加するのが好ましい（注・増幅試薬と核酸を含む反応混合物に増幅酵素を 添加すると増幅か開始される）。本発明の方法は、増幅核酸を検知する追加工程 を有することかできる。

１つの実施態様では、光反応性化合物はブソラレンおよびイソブソラレンから成 る群から選ばれる。好ましい光反応性化合物はイソブソラレンである。１つの実 施態様では、イソブソラレンのカクテルを使用する。もう１つの実施態様では、 イソプソラレンは、５〜メチルイソブソラレン、５−ブロモメチルイソブソラレ ン、５−クロロメチルイソブソラレン、５−ヒドロキシメチルイソブソラレン、 ５−ホルミルイソブソラレン、５−ヨードメチルイソブソラレン、５−へキザメ チレンテトラアミノメチルイソプソラレン、５−アミノメチルイソプソラレン、 ５−Ｎ−（Ｎ、　Ｎ’−ジメチル−１，６−ヘキサンジアミン）−メチルイソブ ソラレン、５−Ｎ−［Ｎ、−Ｎ　’−ジメチルー（６−［ビオチンアミド］−へ 、キサノエー１１．６〜ヘキサンジアミン］）−メチルイソブソラレン、５−Ｎ −［Ｎ、Ｎ’−ジメチル−Ｎ’　−（２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３ −ジチオプロピオネート）−１，６−へヤザンジアミン１−メチルイソブソラレ ン、５−Ｎ−［Ｎ、Ｎ’−ジメチル−Ｎ′−（カルボキン−フルオレセインエス テル）−１，６−ヘキサンジアミン）−メチルイソブソラレン、およびその放射 能標識誘導体、から成る群から選ばれる。さらにもう１つの実施態様では、イソ ブソラレンは、４．５′−ジメチルイソブソラレン、４′−クロロメチル−４， ５’−ジメチルイソブソラレン、４′−ブロモメチル−４，５’−ジメチルイソ ブソラレン、４′−ヒドロキシメチル−４，５′〜ジメチルイソブソラレン、４ ′−ホルミル−４，５′−ジメチルイソプソラレン、４′−フタルイミドメチル −４，５′−ジメチルイソブソラレン　、４′−アミノメチル−４，５′〜　ノ メチルイソブソラレン、４′−ヨードメチル−４，５′−ジメチルイソブソラレ ン、４’　−Ｎ−（Ｎ、Ｎ’−ジメチル−１，６−ヘキサンジアミン）−メチル −４，５′−ジメチルイソブソラレン、４’　−Ｎ−［Ｎ、　Ｎ’−ジメチル− Ｎ’　−（６−（ビオチンアミド）−／＼キサノエート）−１，６−ヘキサンジ アミン１−メチル−４，５’　ジメチルイソプソラレン、４’　−Ｎ−ＥＮ、　 Ｎ’−ジメチル−Ｎ′−（２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３−ジチオプ ロピオネート）−１．６−ヘキサンジアミン１−メチル−４，５′−ジメチルイ ソブソラレン、４’　−Ｎ−［Ｎ、　Ｎ’−ジメチル−Ｎ’　−（６−カルボキ シフルオレセインエステル）−１，６−ヘキサンジアミン）−メチル−４，５′ −ジメチルイソブソラレン、およびその放射能標識誘導体、から成る群から選ば れる。

本発明の方法による、キャリオーバーを制御するための好ましい化合物はイソブ ソラレンであるが、本発明は、ブソラレンを用いた失活も同様に意図する。１つ の実施態様では、線状フロクマリン４′−アミノメチル−４，５’　、　８−） リメチルプソラレン（ＡＭＴ）を増幅後失活試薬として使用する。

本発明は、失活のために光生成物の使用を意図する。この実施態様では、失活は 連続工程：ａ）ｉ）光生成物、ｌｉ）核酸、１ｉｉ）　増幅試薬、ｉｖ）　］以 上の増幅酵素、およびＶ）反応物を収容するための手段を、任意の順序で供給す ること、；ｂ）前記反応物収容手段に、任意の順序で、前記核酸と前記増幅試薬 を添加し、反応混合物を作ること：Ｃ）前記反応混合物に前記の１以上の増幅酵 素を添加すること；そしてｄ）前記光生成物を前記反応混合物に添加すること： から成っている。

この実施態様において、光生成物は増幅の前に作られるか増幅後に導入される。

もう１つの実施態様では、光生成物は増幅後に作られ、そして増幅後に導入され る。それ故、光生成物は、増幅核酸との混合前の任意の時点に作られる。しかし ながら、両方の実施態様において、光生成物は増幅の間は、反応混合物中に存在 しない。

光生成物は、手動で、またはオートメイションシステムにより供給及び添加の両 方をすることができる。例えば、光生成物を反応容器中の区画室で作り、区画室 から導入することか意図される。区画室は、管理された方法で可動の遮断壁（例 えば、膜）により残りの容器から分離されている。可動遮断壁アプローチでは、 ［光反応性化合物を封入した区画室の付いた］反応容器全体を適切な波長の電磁 線にさらすことにより、光生成物が作られる。光生成物を添加しようとする場合 は、次に、遮断壁を移動させ、そして新しく形成された光生成物を、増幅生成物 に付加する。

もう１つの実施態様では、光生成物を第一の反応容器内で別個に作り、次いで、 第二の反応容器を開かないで、核酸を入れた第二の反応容器に注入する。注入は 小さな針により行う；所望により、針は容器の側壁に常置して固定することがで きる。

さらにもう１つの実施態様では、光生成物を第一の反応容器で作り、核酸を入れ た第二の反応容器にピペットで分注する。他の配置が可能であるが、第一の反応 容器と第二の反応容器を収容するのに十分大きい、機械のハウジングで、オート メーション方法でピペットでの分注を、実施することが好ましい。ハウジングが 、反応容器を開いている間の、あらゆるキャリオーバーを封入するのに役立つ。

光生成物を利用する失活方法は、検知工程のような付加工程を含む。１つの実施 態様では、検知工程は増幅標的の検知を含む。

もう１つの実施態様では、検知工程は、増幅プローブの検知を含む。

Ｅ、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション１つの実施態様では、本発明はＰＣ Ｒに伴うキャリオーバーの制御を意図する。この実施態様は、広義にはＰＣＲか らの標的の増幅機失活“または”　ＰＣＲ後′と称される。この意味において、 ′標的配列９とは、ＰＣＲに使用したプライマーが結合する核酸の領域として、 さらに定義される。′セグメント“は、標的配列内の核酸領域として、定義され る。上記のように、増幅のために調製された試料が、増幅され得る標的配列のセ グメントを含んでいても、いなくても、本発明は、失活を意図する。増幅され得 る標的配列のセグメントが存在しても、しなくても、’　ＰＣＲ生成物　″か存 在する。定義のためには、’　ＰＣＲ生成物″とは、変性、アニーリング、およ び伸長のＰＣＲ工程が２サイクル以上完了した後、結果として生じる化合物の混 合物を指す。’　ＰＣＲ生成物′は、１以上の標的配列の１以上のセグメントの 増幅があった場合と、増幅がなかった場合の両方を含む。

ＰＣＲ増福を含む一般的核酸スクリーニングプロトコールを、図４で模式的に説 明する。工程は、１）試料の調製、２）増幅、および３）検知として広く特徴付 けられる。図４の下側の時間を表す線は、本発明方法の好ましい実施態様による 、ａ）失活用化合物の添加、およびｂ）失活用化合物の活性化のための、時間的 配列を模式的に例示したものである。

増幅サイクルは’　ＰＣＲ試薬“を必要とする。″ＰＣＲ試薬″とは、ここでは 、ポリメラーゼと鋳型以外の、増幅を実施するために必要な全ての試薬として定 義される。ＰＣＲ試薬は、通常、緩衝液中の核酸前駆体（ｄＣＴＰ　、　ｄＴＴ Ｐ等）とプライマーを含む。Ｋ、Ｂ、　Ｍｕｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許 第４．６８３．１９５号、および同第４．６８３．２０２号を参照されたい。両 者を参照によりここに引用する。

ＰＣＲはポリヌクレオチド増幅プロトコールである。観察される増幅因子は、生 じたＰＣＲのサイクル数（ｎ）と各サイクルでの複製効率（Ｅ）に関係し、複製 効率は各サイクルにおけるブライミングおよび伸長効率の関数である。増幅は、 高濃度のＰＣＲ生成物かできるまでは、Ｅ″形式従うことが観察されている。こ れらの高濃度（およそ１０−”Ｍ　／ｌ）では、複製効率が急激に低下する。お そらくこれは、短いオリゴヌクレオチドブライマーが、ＰＣＲ生成物のより長い 相補鎖により置き換えられたためである。１０−”Ｍ以上の濃度では、プライミ ング反応中に互いを見い出す２つの相補的ＰＣＲ増幅生成物鎖の反応速度が充分 速くなるので、ＰＣＲ手順の伸長工程の前、あるいはそれと同時にそれらが生じ る。このことは、結局ブライミング効率の低下となり、そしてそれ故、サイクル 効率の低下となる。ＰＣＲサイクルを継続すると、ＰＣＲ生成物分子の増加が次 第に減衰する。ＰＣＲ生成物は結局、平坦濃度に到達する。

表６には、出発標的分子（初期コピー数）の広範囲の関数として作られた、ＰＣ Ｒサイクル数のＰＣＲ生成生成物−数する関係を示しである。増幅効率は、本発 明方法を、５Ｋ３８／５Ｋ３９プライマーを用いたＨＩＶ系に使用したときに測 定した値、サイクルあたり１．８５とした。表６は、ＰＣＲ反応を体積１００ｕ ｌで行ったときに観察されるＰＣＲ生成物濃度を含む。影を付けた部分は、１０ −”Ｍ／１以上のＰＣＲ生成物が生じる条件を示す。これらの影を付けた部分で は、ＰＣＲ生成物が平坦段階に近づいていると思われる。ＰＣＲ生成物の存在を 検知するために使用するハイブリダイゼーション検定のシグナル（ＣＰＭ）も又 、表６に示す。このシグナルは、′！Ｐ標識プローブ（３０００Ｃｉ／ｍＭ）が 、ＰＣＲ反応混合物１００μｍの２０μｍアリコートに対して１０％のハイブリ ダイゼーション効率を有することを基準にして計算する。

（重責以下余白） 表６ ”ｌｕｇゲノムＤＮＡ いかなる特定の理論によっても限定されないか、プライマー配列か結合する標的 配列のセグメント内のＰＣＲ標的配列トに、付加物が存在する場合は、ＰＣＲ方 法の伸長工程か、ＰＣＲ方法の後続のサイクルで複製され得ない末端切断型の相 補的績をもたらすことを本発明は意図する。上述のように（″Ｖ、鋳型依存性酵 素的合成の阻害“）、ＤＮＡポリマーに結合しているイソブソラレンはＴａｑポ リメラーゼ伸長反応の停止を表す。１つの実施態様では、出発標的分子分画を、 Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ方法によって増幅不能とするのに、このよう なイソブソラレンが有効であることを、本発明は意図する。重大なのは、一部の 標的分子か光化学修飾方法による修飾を免れた場合は、失活プロトコールが不十 分になることてあろう。この方法は、その性質から、統計的方法である。この方 法は、ＤＮＡ鎖あたりの付加物の平均数（ａ）を測定する点に特徴がある。全て の鎖か、鎖あたりａ個の付加物を有するとは限らない。付加反応がポアソンの統 計学に支配される場合は、平均ａ個の修飾を有する分子の大集団中のｎ個の修飾 を有する分子フラクションは、ｆ　、　（ｎ）により与えられる（表７を参照） 。

分子フラクション、ｆ　、　（０）は修飾かなく、それ故、失活されないと考え られる。

（重責以下余白） 表７ 失活に適用したポアソン統計学 ３　０．０５０　５．ＯＸ　１０’ ４　０．０１８　１．８　Ｘ　１０’ ５　０．００７　６゜７ＸｌＯ’ ６　０．００２５　２．５　Ｘ　１．０３７　０．０００９　９．Ｉ　Ｘ２０２ ８　０．０００３　３．３　Ｘ　１０２９　０．０００１２　１．２　Ｘ　１０ ２１０　０．００００４５　４５．０ １１　０．００００１７　１７．０ ＋２　０．０００００６１　６．１ １３　０．０００００２３　２．２ １４　０．００００００８３　．８ １５　０．００００００３０　．３ １６　０．００００００１１　．１ １７　０．０００００００４　０．０４ａ　＝鎖あたりの平均付加物数 ｆ、（０）＝−あたりの平均付加物数がａであるときの、付加物ａの鎖のフラク ション Ｎｆ、（０）＝ｆ、（０）全体で１０１分子（Ｎ＝１０’）として計算した非失 活分子数 表７は、鎖あたり平均ａ個の修飾が存在する場合、期待されるＤＭＡ鎖の非失活 フラクションを評価する。ａの全ての値に対して、修飾のない分子のフラクショ ンは小さいが、失活が多数の分子（Ｎ）に適応された場合は、非失活分子の期待 数は大きい。例えば、キャリオーバーがｌＯ“生成物鎖から成る場合は、ＰＣＲ 生成物の鎖あたり平均６個の有効付加物があると、２．５　ＸＩＯ”個の非失活 標的分子が期待されることを、表７は示す。有効付加物とは、プライマー配列が 結合している標的分子のセグメントに生じる付加物である。ＨＩＶ系では、これ は１１５−ｍｅｒ標的分子上のプライマー配列の間の５６塩基の長さのセグメン ト中の６個の付加物に相当する。有効付加物のこの値は、９．３塩基あたり１個 の付加物の平均修飾密度に相当する。

平坦濃度Ｉ　Ｘｌ０−”ＭのＰＣＲ生成物を含むＰＣＲ試料混合物１００μｌは 、６　ＸＩＯ”の相補的ＰＣＲ生成物鎖を含む。この試料を、非失活性標的分子 の期待数かＩより小である水準まで失活させるには、ｆ、（０戸６　ＸＩＯ”が １より小である必要かある（ここては、″失活標的分子″とは、少なくとも１個 の付加物を含む標的分子を意味する）。表７のデータを発展させ、反応体積を１ ００ｕｌ　と仮定することにより、失活の統計的見地では、ＰＣＲ生成物の鎖あ たり２８個の付加物で、この失活水準を達成するのに充分であると予想される。

ＰＣＲ手法により作られる標的鎖の数が増加または減少する場合は、この失活水 準を達成するために必要な、鎖あたりの付加物の平均数は、それに応じて変化す る。生成物の平坦濃度（６ｘｌＱｌ＋分子）に達した８ｍ１５−ｍｅｒ系ては、 平均修飾密度か２塩基あたり１個の付加物に増加するときに、この失活水準か生 しる（鎖あたり２８個の平均有効付加物）。

修飾密度の変化が、異なる光反応性化合物の使用、または同じ光反応性化合物を 一異なる濃度で使用することを介して期待できる。特に、同じ光化学剤を、より 高濃度で使用し、その光学的特性が共有結合を強化するデバイスからの活性光線 を照射して光化学剤を結合させることにより、修飾密度の増加が期待される。

一定した修飾密度の場合は、失活感度限界を改善する別の方法かある。失活感度 の重要な統計的パラメーターは、ＰＣＲ鎖あたりの平均付加物数である。ＰＣＲ プライマーを慎重に選ぶことにより、ＰＣＲ生成物の長さを変えることができ、 そしてそれ故、鎖あたりの付加物の平均数を変えることができる。表８は、２つ の異なる修飾密度に対する、この効果を説明する。ケースＡでは、５塩基あたり １個の付加物の修飾密度と仮定する。このような条件下で、２００塩基長のＰＣ Ｒ生成物オリゴヌクレオチドは鎖あたり約３０の有効付加物をもつはずである。

この水準の修飾では、１００μ１ＰＣＲ反応チューブ中に１未満のＰＣＲ生成物 分子が、鎖あたり付加物を全くもたないと期待され、そしてそれ故、本質的に反 応チューブ中の全ての分子が失活されると期待されるであろう。表８のケースＢ は、修飾密度が９塩基当たり１個の付加物に低下する状況を考察する。これらの 条件下で、同様の失活水準に達するには、ＰＣＲ生成物は、それぞれの組上に充 分数の有効付加物を存在させるために、少なくとも３００塩基の長さである必要 がある。

（装置以下余白） 表８ ＰＣＲ生成物の長さの関数としての 非失活性標的分子の期待数 ケースＡ：（５塩基あたり１個の付加物）ＰＣＲ生成物　ネ平均有効　６　ＸＩ Ｏ”出発分子の長さ　付加物／鎖　あたりの非−失活分子３００　５０　＜＜１ 本有効であるためには、プライマーが結合するＰＣＲ生成物のセグメント内に、 付加物が存在しなければならなし）。計算の目的のために、プライマーの長さは それぞれ２５塩基とした。

実験 以下の実施例は、本発明のいくつかの好ましい実施態様と見地を説明するために 役立ち、その範囲の制限と解釈されるべきでない。

以下の実験の開示において、以下の略字を適用する：　ｅｑ　（当量）：Ｍ（モ ル濃度）；　８Ｍ（マイクロモル濃度）；Ｎ（規定）；ｍｏｌ　（モル）；　ｍ ｍｏｌ　（ミリモル）：μｍ０１（マイクロモル）；　ｎｍｏｌ　（ナノモル） ；ｇｍ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）：　Ｍｇ（マイクログラム）：Ｌ（リッ トル）；ｍｌ（ミリリットル）；　μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センナメ ートル）５市（ミリメートル）；　μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメー トル）；　℃（摂氏の度）、Ｃ！（キュリー）；ｎ＋ｐ（融点）；　ｍ／ｅ　（ イオン質量）；ＭＷ（分子量）；ＯＤ（光学密度）；ＥＤＴＡ　（エチレンジア ミン四酢酸）；Ｉ　ＸＴＥ　（緩衝液：１０ｍＭ　）リス／１ｍＭ　ＥＤＴＡ、 　ｐＨ７，５）；　ｌ　ＸＴａｑ　（緩衝液：　５０ｍＭ　ＫＣＬ　２．５ｍＭ 　ＭｇＣ１，，１０ｍＭ１−リス、ｐＨ８，５，２００ｕｇ／ｍＭ　ゼラチン） ；　Ｃ／Ｍ　（クロロホルム／メタノール）；　Ｃ／Ｅ／Ｔ　（クロロホルム／ エタノール／トリエチルアミン）；　Ｃ／Ｂ／Ａ／Ｆ　（クロロホルム／ｎ−ブ タノール／アセトン／蟻酸）；　ＤＭＦ　（Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド）； ＰＡＧＥ　（、ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ＬＩＶ（紫外線）；Ｖ（ボ ルト）；Ｗ（ワット）；ｍＡ（ミリアンペア）；　ｂｐ　（塩基対）；　ＣＰＭ 　（１分間あたりのカウント数）：　ＤＰＭ　（１分間あたりの崩壊）；　’ｒ ｔ、ｃ　Ｃ薄層クロマトグラフィー）：　ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィ ー’）：　ＦＡＢＭＳ　（高速原子ボンバード質量分析−Ｋｒａｔｏｓ　ＭＳ　 ５０計器で得たスペクトル−Ｋｒａｔｏｓ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、英国、マン チェスター）；ＥＩＭＳ　（エレクトロン衝撃質量分析−ＡＥＩ　ＭＳ−１２Ｓ 質量分析計で得られたスベク１゛ルーＡｓ５ｏｃｉａｔｅｄ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ 　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　、英国、マンチェスター）；ＮＭＲ（核磁気共鳴；室 温で、２００　ＭＨｚまたは２５０　Ｍｌ＋２フーリエ変換分析計のいずれかで 得られるスペクトル）；　Ａｌｄｒｉｃｈ　（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｃｏ、、ライスコンシー州、ミルウォーキー）；　Ｂａｋｅｒ　（Ｊ、Ｔ、 Ｂａｋｅｒ　、テネシー州、ジャクソン）；　Ｂｅｃｋｍａｎ　（ＢＰｃｋｍａ ｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、カリフォルニア州、サンラモン）；ＢＲＩ、（Ｂｅ ｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーランド州 、ガイサースバーグ）；　Ｃｙｒｏ　（Ｃｙｒｏ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ニコ ージャー・ジー州、ウッドクリラフレイク）；　ＤＮＥＮ　（Ｄｕｐｏｎｔ−Ｎ ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｏｃｌｅａｒ　、プラウエア州、ウイミントン＋９８ ０５）；　Ｇｅｌｍａｎ　（Ｇｅｌｍａｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、ミシガン州、ア ンーアーバー）；　Ｅａｓｔｍａｎ　（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　、　＝ニ ーヨーク州、ロチニスター）；　Ｅａｓｔｍａｎ　ＴＬＣプレー１−（Ｈ３１８ １蛍光指示薬付きＴＬＣブレー１〜、Ｅａｓｔｍａｎ）；　ＥＭ　（ＥＭ　５ｅ ｉｅｎｃｅ、ニューシャーシー州、チェリーヒル）；　Ｌａｗｒｅｎｃｅ（Ｌａ ｗｒｅｎｃｅ　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カリフｆ）レニア州 、バークレー）；　Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ　（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、 ミズーリ州、セント；ルイス）；Ｐｉｅｒｃｅ　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ　Ｃ。

１、イリノイ州、ロックフォード）；　Ｐｏ１ｙｃａｓｔ　（Ｐｏｌｙｃａｓｔ 　Ｔｅｅｈｎ。

１ｏｇｙ　Ｃｏｒｐ、、コネティカット州、スタンフォード）；　Ｒｏｈｍ　ａ ｎｄ　Ｈａａｓ（Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　ｔ（ａｓｓ　Ｃｏ、、カリフォルニア州、 ロスアンゼルス）、Ｓｉｇｍａ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、ミ ズーリ州、セント−ルイス）；　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｍｅ ｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　、カリフォルトニア州、ロスアンゼルス） 。

本発明のデバイスを特徴づけるために、特注光装置（以後″ＰＴｌデバイス″と 呼ぶ）を市販の利用できる部品（費用は、およそ１万ドル）から組み立て、対照 として利用した。二のデバイスは記載されたデバイスの改良型である。Ｇ、Ｄ、 　Ｃ１ｍ１ｎｏ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５．３０１３ 　（１９８６）。市販の部品のいくつかを取り付け、特殊アダプターとホルダー を作るために、多少の機械加工が必要であった。

市販のランプハウジング中の楕円形の鏡の焦点に置いた、５００ワット１４ｇ／ Ｘｅアークランプ（Ｍｏｄｅｌ　Ａ３０００、Ｐｈｏｔｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ　Ｉｎｔｅｒｎａｔ　１ｏｎａｌ）は、ＰＴＩデバイスに光を供給する。ラ ンプハウジングからの放射は５．光学的付属機器の物理的な支えを提供しかつ、 有害な迷ＵＶ線か実験室中に放散するのを防ぐアダプター管に入る。鏡は、光線 が他の光学部品を通過するように、光線をアダプター管の中に屈折させる。

２つの水冷液体フィルターを使用する。フロクマリン光化学に適切な波長の電磁 線を提供するように、これらのフィルターか選ばれてきている。（他の光反応性 化合物は、フロクマリンとは全く異なる波長の必要条件を有しても良い）。第一 のフィルターは、スブラシル（ｓｕｐｒａｓｉｌ）窓を取り付け、１（２０を満 たし、赤外線（ＩＲ）を濾光するのに使用する。フロクマリンの核酸への付加か 昇温て減少するので、照射中に試料室が必要以上に加熱されるのを防ぐために、 ＩＲの除外か必要となる。第二の液体フィルターは、フロクマリン光化学反応で 使用するための３２０−４００　ｎｍ光の窓を提供する。この特別な波長窓（３ ２０−４００ｎｍ）は、フロクマリン光化学に不適当な、短か過ぎる波長と長過 ぎる波長の両方を除外する。例えば、フロクマリン：核酸複合体は、３１３　ｎ ｍ以下の波長で、光化学反転を受ける。フロクマリンの不可逆光結合を起こさせ るために、これらの波長の除外か必要である。このフィルター（長さ９ｃｍ）に 、０．６ｃｍのパイレックスの窓を取り付け、０ｏ８５％硝酸コバルト（ＩＩ） 　、２％塩化ナトリウムの水溶液を満たす。第一と第二のフィルターの間の光拡 散器は光線の全幅にわたって均質な照明を提供する。この拡散器はレンズホルダ ーに取り付けた研磨スブラシルプレート（０，６ｃｍ）から成っている。

光線の強度が制御できるように、第一のフィルターを出た光は絞りを通過する。

２枚のレンズが、光線を、最初にシャッター系を、次いてアダプター管の出口を 、最後に２番目の鏡を横切って通過させることにより、試料ホルダー内に光線を 集中させる。シャッター系は、アダプター管の出口穴と第二アルミニウムブレー トの同様の穴の間を通っている金属刃に接続された回転ソレノイドから成ってい る。この第ニブレートは、アダプター管の出口に隣接して設置され、ソレノイド の取付台としても役立つ。ソレノイドへの電力は、タイマーに接続されたリレー により制御する。

試料ホルダーは、長方形の黄銅から成り、側面と上部のいずれから７も照射でき る。それには液体の流出通路を機減加工しである。試料の温度調節は、このホル ダーを温度調節循環水浴に接続することにより達成する。試料ホルダーは、試料 容器の表面（すなわち、キュベツト表面等）上にガスを流して、低温での照射中 に１、これらの表面上で水が凝縮するのを防ぐようにするための通路をさらに含 む。試料ホルダー内の試料容器の開口部は、１インチ×１インチ×２．５インチ である。黄銅アダプターは、光か通過するためのスロットが付いていて、標準キ ュベツトが使用てきるようにしてあり、１３ｍｍ試験管とエツペンドルフ管も同 様に使用できる。試料ホルダーの底は、小型モーターに取り付けられた棒状の磁 石が試料容器の真下に挿入され、磁石スタ・−ラーとして機能できるように、く ぼんでいる。これとは別に、ボルダ−を実験室攪拌プレートの最上部に設置して 攪拌性能を達成することもてきる。この照射デバイスでは、光線は焦点て直径約 ０．８ｅｍでＭｏｄｅｌ　、１２２１　ＵＶ　ｍｅｔｅｒ（ＵＶ　Ｐｒｏｄｕｃ ｔｓ、カリフォル７ニア州　サンガフ′リニル）を用いて測定すると、光度３４ ０　ｍＷ／ｃ＋＋＋”である。

ＰＴＩデバイスは、高価なＰＴＩデバイスの性能特性に対する、本発明デバイス の性能特性を比較を可能にする。以下のいく・つかの実施例において調べた性能 特性には、Ａ）熱安定性、Ｂ）スペクトル出力、Ｃ）照射強度、Ｄ）照射均等性 、Ｅ）光活性化効率、か含まわる。

特筆しない限り、照射用に調製した試料溶液の全ては、エッペンドルフ管の中に 入れ、管の側面から（ＣＥ−１，ＣＢ−ｆＩおよびＣＥ−１ｉｆ）　、または管 の上部から（ＰＴＩ）照射した。（ＣＥ４１１は先に記載した市販のＨＲＩ−０ １００と等しい）。エッペンドルフ管は、３００　ｎｍ−４０Ｏｒ＋ｍの範囲の 波長では、わずか８−１５％の透過率である（データは示していない）。それ故 、約９０％の活性光線が、これらの試料容器の使用により失われる。エッペンド ルフ管は、生化学および分子生物学的手法にとって、最も便利な試料容器である か、良好な透過特性を有する他のＭの照射容器も使用できる（例えば、石英、パ イレックス、ポリカーボネート等）。

光生成物の濃度は未照射出発物質（その後の照射を核酸の不在下で実施する）の 量に基づいて与えられる。例えば、５０　μｇ／ｍｌの未照射出発物質が、その 後ＤＮＡの不在下で照射される場合は、結果として生じる光生成物の濃度は５０ 　μｇ／＋ｎｌとして与えられる光生成物について言及するとき、しばしば光生 成物の出発化合物（未照射化合物）が示される。例えば、ＡＭＤＭＩＰの照射後 に生成される光生成物をＡＭＤＭＩＰ光生成物と呼ぶ。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を使用する場合は、変性（７また は８Ｍ　尿素）ポリアクリルアミドゲル（２８ｃｍ　ｘ３５ｃｍｘＯ。

４ｍｍ）を注入し、２０００ボルト、５０ワツト、２５ミリアンペアで、３ｏ− ６０分間、予備電気泳動した。１２％ゲルを、長さが４０−２００塩基対の間の オリゴヌクレオチドに使用し；８％　ゲルを、それより長い配列に使用した。分 析するＤＮＡの長さにより、試料を、０．０２５％追跡染料（ブロモフェノール ブルーとキシレンシアツール）を含む８Ｍ尿素、あるいは８幅ホルムアミド、１ ０％グリセロール、０．０２５％追跡染料のいずれかの中に負荷し、次いで２０ ００ボルト、５０ワツト、２５ミリアンペアで２−４時間、電気泳動した。ＰＡ ＧＥに続いて、多くの場合、個々のバンドをオートラジオグラフィーで視覚化し た。

オートラジオグラフィーは、増強スクリーンを用いてＫｏｄａｋ　ＸＡＲ−５フ イルムに一７０°Ｃで一夜、露光した。いくつかの場合は、視覚化バンドをゲル から切り出し、シンチレーション計測のために集めた。シンチレーション計測に は、シンチレーション液と市販のシンチレーションカウンター（Ｓｅａｒｌｅ　 Ａｎａｌｙｔｉｃ　９２　、Ｍｏｄｅｌ　＃　０（１０００６８９３）を使用し た。

一般に、ＰＣＲは、１７５−２００ＨＭ　ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオノド ５′−トリホスフエート）と０．５−１．０ＨＭプライマーを使用して実施した 。５単位／１００μｌのＴａｑポリメラーゼを使用した。ＰＣＲ反応は、３叶１ ００μ＋の軽鉱油で覆った。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡ　 Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（製品番号Ｎ８０１０１５０）を使用するＨＩＶ 増幅の典型的ＰＣＲサイクルは：９３℃で３０秒間の変性；５５℃で３０秒間の アニーリング；および７２°Ｃで１分間の伸長、であった。ＰＣＲサイクルは、 通常、この方法で３０サイクル実施し、続いて７２°Ｃ，７分実施した。

多くの場合、ＰＣＲはＨＩＶ系で実施した。この系は、ＨＲＩ　４６：と称する １１５−ｍａｒ生成物と、）ＩＲｒ　４７：と称するその相補鎖を供給する。こ れらの配列は、Ｃ，Ｙ、　ｎｕ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：２ ９５　（１９８８）により使用された。

以下の多くの実施例では、化合物を、その略字（表２および３を参照）および／ または番号（図１または２を参照）で呼ぶことにする。例えば、’　（ＶＩＰ、 ３）“は、化合物が５−メチルイソブソラレン（表２）でありかつ図１の化合物 ３であることを示す。

実施例１ ５−メチルイソプソラレン（ＶＩＰ、　３）の合成方法１（３工程） 工程１：５−メチルレゾルシノールモノハイドレイト（２８４１ｍ　、　２゜０ ｍｏｌ；　Ａｌｄｒｉｃｈ）をリンゴ酸（２８０ｇｍ　、　２．１０　ｍｏｌ； 　Ａｌｄｒｉｃｈ）と完全に混ぜ、次いで、硫酸（６００ｍｌ）と痕跡量の亜硫 酸水素ナトリウム（ｌ。Ｏｇｍ；　Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む反応フラスコに入れ た。反応混合物を、二酸化炭素の発生がおさまるまで機械で攪拌しなから９０° Ｃに加熱した（約５時間）。得られた赤橙色の溶液を充分量の氷に注ぎ（激しく 攪拌しながら）、ｉ　リットルにした。受ける方のフラスコを、反応混合物の添 加が完了するまで、外部冷却により０°Ｃに保った。得られた薄橙色の沈殿生成 物を吸引濾過で集め、水で完全に洗った。粗生成物をフィルター上で自然乾燥し 、次いてテトラメチレングリコール（１８００［［＋１）から２度再結晶し純粋 な７−ヒドロキシ−５−メチルクマリン（８５ＭＣ，ｌ）を生成物として生じた （２２０　ｇｍ１収率６２％、融点２５２−２５５℃）。

工程２：　Ｈ５ＭＣ（１７７ｇｍ　、１．０　ｍｏｌ）、ブロモアセトアルデヒ ドジエチルアセタール（２０７ｇｍ　Ｓｌ、０５　ｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）、 炭酸カリウム（１００ｇｍ）および新しく蒸留したジメチルホルムアミド（１２ ５ｍｌ）を、機械的攪拌とアルゴン導管を取り付けた３つ口反応フラスコで混合 した。反応混合物を加熱し、１００°Ｃで４３時間攪拌し、その後、全ての出発 物質が、高Ｒｆ　ＴＬＣスポット（Ｅａｓｔｍａｎ　ＴＬＣプレート；　Ｃ／Ｍ 　９８：２で展開；　２６０　ｎｍ　紫外線光）に転換された。未反応アセター ルと溶媒減圧下で蒸留により除去した。水（１５００ｍｌ）を残留物に添加し、 続いてクロロホルム（１０００ｍｌ）で抽出した。次いでクロロホルムを、繰り 返しＩＮ　水酸化ナトリウムで色か無くなるまで洗った。溶媒を蒸発させ、生成 物である油状の７−ヒドロキシ−５−メチルクマリンのジェトキシエチルエーテ ル（ＤＥＭＣ，２）を生じた（２１７　ｇｍ；　収率８２．４％）。

工程３：氷酢酸（３１０ｍｌ）と塩化亜鉛（９８ｇｍ、０．７２　、ｍｏｌ）を 内部温度計を取り付けたフラスコに入れ、次いで、１００と１１４°Ｃの間に加 熱した。ＤＥＭＣ（５０ｇｍ、０．１７　ｍｏｌ）を高温溶液に添加し、その温 度で１７分間激しく攪拌した。次いで、高温溶液を氷（１０００ｍｌ）とＣＨＣ ｌ３（５００ｍｌ）の混合物の上に、全ての氷が溶解するまで続けて激しく攪拌 しながら注いた。次いで、ＣＨＣ１，層を分離しく乳濁）、続いて水（５００ｍ ｌずつ）で繰り返し洗った。水のｐＨが中性になるまで洗浄を続けた。最後に、 ＣＨＣｌ２層を飽和食塩水（５００ｍｌ）で洗い、乾燥（ＭｇＳＯ，）　Ｉ、、 そして溶媒を蒸留により除去した。暗黒色の粗生成物（７，７ｇｍ）（５−メチ ルイソプソラレンと５−メチルブソラレンの混合物）を少量のクロロホルムに溶 解し、ＩＮ　ＮａＣＨで洗い（フェノールを除去する）、水、次いで塩性溶液で 洗い、次いてフラッシュカラムでクロマトグラフィー（ＥＭシリカゲル、２００ −４００メツシユ）にかけ、酢酸エチル／ヘキサン７０　：３０で溶出し、純粋 生成物、５−メチルイソブソラレン（ＭｒＰＸ４．７　ｇｍ、１３．８％；　融 点１８９．５−１９１．５°Ｃ）を生じた。ＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）　ｄ　２．５ ９　（３Ｈ，ｓ）、６゜３７　（Ｉ　Ｈ，ｄ）、７．０５　（１８，ｄ）　７． ２３　（ＩＨ，ｓ）　７．５９　（ＩＨ，ｄ）　、７．９６　（１）（、ｄ）。

実施例２ ＭｒＰの合成：方法２（２工程） 工程１：　Ｈ５ＭＣを５−メチルレゾルシノール水和物から、方法ｌの工程ｌ（ 実施例１）に記載した通りに製造した。

工程２：　）１５Ｍｃ（１，７６ｇｍ　、　１０　ｍｍｏｌ）と炭化クロロエチ レン（６，１３ｇｍ、５０　ｍｍｏｌ　、　Ａｌｄｒｉｃｈ）を１５０−１６５ °Ｃの間で１．５時間加熱した。個の期間に続いて、暗黒色の反応混合物を氷の 上に注いだ。これをクロロホルムで抽出し、このクロロホルムを塩基（０，５Ｎ 　Ｎａ０Ｈ）および水で洗い、それから乾燥した（ＮａｚＳＯ４）。減圧下で溶 媒を除去して、茶色のシロップ（０，７ｇｍ）を得、それから純粋生成物、ＭＩ Ｐ、をフラッシュクロマトグラフィー（ＥＭシリカゲル、２００−４００メツシ ユ）にかけ、Ｃ／Ｍ９８：２で溶出して単離した。この２番目の方法によるＭＩ Ｐの収量は２７０　ｍｇ（１３，５％）であった。

実施例３ 放射能標識ＭＩＰ合成 工程１：ＭＩＰ（５８ｍｇ；　０．２９　ｍｍｏｌ）、１０％パラジウム／炭素 （２９ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ）、氷酢酸（７，０ｍ１）を小さな丸底フラスコに 入れ、減圧管に接続し、液体窒素で凍らせ、次いで、反応容器を排気した。キャ リアーを含まないトリチウムガス（Ｌａｗｒｅｎｃｅ；　６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ） を、１気圧よりやや低くなるまで添加し、ＭＩＰを再溶解するために、丸底フラ スコを短時間、６０゛Ｃの湯浴中で温めた。不均質混合物を室温で１時間攪拌し た後、約０．３１　ｍｍｏｌのトリチウムガスが消費されていた。混合物を凍ら せ、トリチウムガスを排気し、メタノール（１０ｍｌ）を添加し、スラリーを遠 心して触媒を除去した。上澄みをデカントし、凍らせ、次いで凍結乾燥した。凍 結乾燥に続いて、残留物のＴＬＣ（クロロホルム）により、未反応の出発物質、 ［４’　、５’　−”Ｈ□］−４’　、５’−ジヒドロ−５−ＭＩＰに相当する 、低いＲｆの青い蛍光スポットと［３，４，４’　、５’　−３Ｈ，］−３，４ ，４’　、５’−テＩ・ジヒドロ−５−Ｍ［Ｐに相当する、低いＲｆの蛍光のな いスポットか現れた。

［４’　、　５’　−３８２］−４’　、　５’−ジヒドロ−５−ＭＩＰを、０ ．５！８インチ、シリカカラム（６０−２００メツシユ、Ｂａｋｅｒ）でカラム クロマトグラフィーにかけ、ＣＨ，Ｃ１，て溶出して単離した。３０−４０ｍｇ 回収した。この化合物を、工程２での標識ＭＩＰの製造に直接、使用した。

工程２　工程１の［４’　、５’　−”Ｈｚ］−４’　、５’−ジヒドロ−５− ＶＩＰ（３０−４０ｍｇ）、１０％パラジウム／炭素（３２ｍｇ、　Ａｌｄｒｉ ｃｈ）およびジフェニルエーテル（５，Ｏｍｌ　、　Ａｌｄｒｉｃｈ）を、アル ゴン導管を接続した小さな丸底フラスコに入れ、次いで２８時間還流した。この 期間に続いて、ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃ１２）により、出発物質のほとんどが［４’　 、５’　−３Ｈ２］−５−ＭＩＰに変換したことか示された（オーセンティック ＭＩＰを用いた同時クロマトグラフィーにより決定）。生成物を２個のシリカカ ラムを用いたクロマトグラフィー（６０−２００メツシユ、Ｂａｋｅｒ　。

Ｃ１２Ｃ１２で溶出）により精製した。純粋生成物を含む分画を合わせ、減圧下 で溶媒を蒸発させ、残留物を無水アルコールに溶解した。

化合物の比活性を、原液の光学密度の測定して、その濃度を決め、次いで原液の 適当なアリコートをカウントすることにより確立した。このようにして、トリチ ウム標識［４’　、５’　−”Ｈ２１−５−ＭＩＰ（“トリチウム標識ＶＩＰ　 ’　）生成物の比放射能を７．４　Ｃｉ／ｍｍｏｌ　と決定した。

ＨＰＬＣにより放射化学純度を決定した。約１０’ｃＰＭのトリチウム標識Ｍｉ Ｐを５０　ｕｌのエタノール（１００％）中で１０　ｕｇの未標識ＭＩＰと混合 した。試料を、ＣＩ８オクタデカシリル逆相クロマトグラフィーカラム（Ｂｅｃ ｋｍａｎ　）に注入し、そして以下の、水／メタノール勾配で溶出した：０−１ ０分、１００％Ｈ２０；　１０−７０分、１００％Ｈ２Ｏ−１００％ＣＨ３０１ イ；　７０−８０分、１００％　ＣＩ（３０Ｈ０８０の１．Ｏｍ１分画を集め、 各分画の４０ｕｌをカウントした。９９％以上の放射能か、トリチウム標識ＭＡ Ｐに相当する光学ビークで同時クロマトグラフィーされた。

実施例４ ハロメチルイソブソラレン合成 この実施例はハロメチルイソブソラレンの合成を含み、この場合はＭＩＰから５ −ブロモメチルイソプソラレン（ＢＭＩＰ、　５）の合成である。ＭＩＰ（１， ８０ｇｍ　、９ｍｍｏｌ）を、ＣＣ１４（１９３ｍｌ）に溶解して還流した。

Ｎ−ブロモスクシンイミド（１，６５ｇｍ、　９　ｍｍｏｌ、　Ａｌｄｒｉｅｈ ）と過酸化ベンゾイル（０，２２ｇｍ、０．９　ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を 沸騰溶液に添加し、ＴＩ、Ｃ（Ｅａｓｔｍａ、ｎ　ＴＬＣブレート；　Ｃ／Ｍ　 ９８：２で展開；　２６０　ｎｍ紫外線光て検知）で監視しながら、混合物を４ 時間、還流した。この期間に続いて、沸騰混合物を熱いうちに濾過し、濾液をわ きに置いて冷却し、次いて２４時ｒＷＩｏ’ｃに保った。得られた結晶（淡黄色 針状晶）を濾過により集め、ＣＨＣｌ＊（１４０ｍｌ）に溶解し、次いで水（１ ４０ｍｌ×４）で洗った。ＣＨＣｌ＊溶液を乾燥しく無水Ｍｇ５Ｏ４）、次いで 減圧下で回転蒸発により濃縮し、生成物、ＢＭＩＰを黄色の結晶（１，７５ｇｍ 、６８．７％、分解融点２０１．−２０４°Ｃ）として得た。ＮＡＬＲ（ＣＤＣ ｌ２）　ｄ　８．０６（ｄ、　Ｈ−４）　、７．６４　（ｄ、　Ｈ−５’　）　 、７．４１　（ｓ、　Ｈ−６）　、７．０５　（ｍ、　Ｈ−４’　）　、６．４ ３　（ｄ、　Ｈ−３）　、４．７２　（ｓ、　ＣＨＪｒ）。

実施例５ ５−アミノメチルイソブソラレン（ＡＭＩＰ、　１０）の合成方法１（４工程） 工程１・ＸＭＩＰからＡＭＩＰを合成する本発明の第１番目の方法の第１工程は 、５−ヒドロキシメチルイソブソラレン（ＨＶＩＰ、　６）の合成を含む。ＸＭ ＩＰとしては、この工程の目的のために、ＢＭｒＰを選ぶ。

ＴＬＣ（Ｅａｓｔｎ＋ａｎ　ＴＬＣブレー）　；　Ｃ／Ｍ　９８：２で展開、２ ６０　ｎｍ紫外線光で検知）で監視しながら、ＢＶＩＰ（０，２ｇｍｓ、０．７ １　ｍｍｏｌ）を蒸留水（２０ｍｌ）中で還流した。３時間後、出発物質は全く 残らず、新しい、低いＩ？ｆのスポットが現れた。反応混合物を冷却すると、生 成物、）ＩＭＩＰか、淡黄色の針状晶として沈殿し、吸引濾過により集めた（０ ．１５８ｍ；　９６．８％；　融点１８４−１８７°Ｃ）。

工程２＋　ＡＭＩＰの合成の本発明の第１番目の方法の第２工程は、ＨＭＩＰか らＸＭＩＰの合成を含む。ＸＭＩＰとしては、この工程の目的のために５−クロ ロメチルイソブソラレン（ＣＭＩＰ、　５）を選ぶ。

ＨＭＩＰ（８５８ｍｇ　、　４．０　ｍｍｏｌ；工程１を多数回合わせて得た） を、新たに蒸留したクロロホルム（６０［１１１，４Ａ　モｌノキュラーシーブ て乾燥させた）に溶解する。塩化子オニル（１，４９ｇｍ、　１２．６　＋ｕ＋ ｏｌ　。

Ａｌｄｒｉｅｈ）を添加し、続いて、室温で攪拌する。塩化チオニルを１時間後 （９９０ｍｇ　、８．４　ｍｍｏｌ）と１６時間後（９９０ｍｇ　、８．４　ｍ ｍｏｌ）をさらに添加する。合計２５時間後に、出発物質が全く残らなくなり（ ＴＬＣ，ＣＨ２Ｃｌ、、）　、そして新しい高いＲｆスポットが現れる。新しい スポットを、数種の異なる溶媒系（ＣＨ２Ｃ１！；　ＣＨＣｌ、；　ＥｔＯＡＣ ：ヘキサン１：３）を用いて、オーセンティックＣＭＩＰと共にＴＬＣで同時ク ロマトグラフィーにかける。

工程３：　ＡＭＩＰ合成の本発明の第１番目の方法の第３工程は、ＸＭＩＰ（こ の場合はＣＭＩＰ）から５−へキサメチレンテトラミノメチルイソブソラレン（ ＨＭＴＡＭＩＰ、　９）の合成を含む。

工程２の生成物、ＣＭＩＰを３Ｏｎｉｌのシーブで乾燥したクロロホルムに入れ 、ヘキサメチレンテトラミン（６８０ｍｇ　、４．９　ｍｍｏｌ）を添加する。

混合物を５５℃で４３時間攪拌し、その後さらにヘキサメチレンテトラミン（６ ８０ｍｇ　、　４．９　ｍ＋ｎｏｌ）を添加する。混合物を５５゛Ｃでさらに４ ８時間、攪拌を続け、その後、ＨＣＩ（０，Ｉ　Ｎ　、６０　ｍｌ）とりロロホ ルム（３０ｍｌ）を添加する。次いで、クロロホルムを除去し、水相をクロロホ ルム（３０ｍｌ）でさらに３回洗う。水相を減圧下で蒸発させ固体生成物、ＨＭ ＴＡＭＩＰを得る。生成物は、数種の異なる溶媒系（Ｃ１Ｍ　９８：２；　Ｃ１ Ｍ　９５：５；　Ｃ１Ｍ　９０：１０）を用いたＴＬＣてオーセンティックＨＭ ＴＡＭＩＰと共に同時クロマトグラフィーを行うことにより同定する。

工程４：次の工程は、ＨＭＴＡＭＩＰからＡＭＩＰの合成を含む。工程３の固体 を１２　ｍｌエタノール；濃ＨＣＩ（３：１）に室温で７２時間懸濁し、次いで 真空濃縮した。残留物を希ＮａＯＨに添加し、ＣＨＣｌ、で抽出し水で洗った。

次いでＣＨＣｌ、抽出物を、さらにＨＣｌ、（０，ＩＮ）で抽出した。

次いで、水相を分離し、Ｎａ１ｌでｐＨを１２−１３に調製し、ＣＨＣ１，で抽 出した。ＣＨＣｌ　ｓ抽出物を水で洗い、乾燥しくＭｇ５Ｏ，）　、減圧下で溶 媒を除去し遊離の塩基として生成物を得、それをＨＣＩガスで塩酸塩に変えた（ ３１０　＋ｎｇ　、　ＨＭＩＰを基にして収率３１％）。マススペクトルｍ／ｅ 　（相対強度）　２１５　（Ｍ＋、１００％）。

実施例６ ＡＭＩＰの合成：方法２（５工程） 工程１：第２番目の方法の第１工程（ＸＭｒＰからＨＭｒＰの合成）は、第１番 目の方法の第１工程と同じである、というのは、両者とも、ＸＭＩＰとしてＢＶ ＩＰを選んでいるからである。それ故、第１工程は、実施例５の工程ｌに従って 進める。

工程２：両方の実施例で、ＸＡＭＩＰとしてＣｌ１ｌｌＰを選んでいるので、Ａ ＭＩＰを合成する本発明の第２番目の方法の第２工程（ＨＭＩＰからＸＭＩＰの 合成）は、第１番目の方法の第２工程と同じである。それ故、第２工程は、実施 例５の工程２のように進める。

工程３：　ＡＭＩＰ合成の本発明の第２番目の方法の第３工程は、ＸＭＩＰ（こ の場合はＣＭｒＰ）から５−ヨードメチルイソブソラレン（ＩＭＩＰ、８）の合 成を含む。

ＣＭＩＰ（５７７ｍｇ；　２．２５　ｍｍｏｌ）　、ヨー化ナトリウム（１，７ ７ｇｍ、　１１．５３　ｍｍｏｌ；　Ｂａｋｅｒ；１２０℃で一夜乾燥）および アセトン（２５ｍｌ　Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）を４８時間、還流する。この 期間に続いて、反応混合物を濾過して、無機塩（ＮａＣ１とＮａＩの混合物）を 除去し、濾液を減圧下で蒸発させ、残留粗生成物をクロロホルムに溶解し、１／ ２″×２０＃シリカゲルカラム（６０−２００メツシユ、Ｂａｋｅｒ）に負荷し 、そして同じ溶媒で溶出する。生成物（ＩＭＩＰ）を含む分画をＴＬＣで同定し 、合わせ、溶媒を減圧下で除去する（４８９　ｍ；　６６．７％）。

工程４：次の工程はＩＭＩＰからＨＭＴＡＭＩＰの合成を含む。ＩＭＩＰ（４８ ９ｒｎｇ；　１，５　ｍｍｏｌ）とへキサメチレンテトラミン（３６０ｍｇ；　 ２．６　ｍｍｏｌ）を、全ての出発ＩＭＩＰが消費されるまで（ＴＬＣで示され る）、乾燥ＣＨＣＩ　ｉ中で還流する。得られた沈殿を、吸引濾過で集め、希酸 （０，１ＮＨＣ１）に懸濁し、等容量のＣＩ（Ｃｌ３で数回洗い、次いで水相か ら蒸発により回収する。生成物（ＨＭＴＡＭＩＰ）は、数種の異なる溶媒系（Ｃ ／Ｍ９８・２；　Ｃ１Ｍ　９５：５；　Ｃ１Ｍ　９０：１０）での比較ＴＬＣに より同定する。

工程５：この第２番目の方法の最終工程は、ＨＭＴＡＭＩＰからＡＭＩＰの合成 を含む。これは、実施例５の工程４に記載のように実施した。

実施例７ ＡＭＩＰの合成：方法３（２工程） ２工程方法ても、ＸＭｒＰはＣＭＩＰまたはＢＭｒＰであり得る。この実施例の 場合、２工程方法を、以下の式： ％式％ に従って進める。

工程１：　ＡＭＩＰを合成する本発明の第２番目の第１工程は、ＸＭＩＰ（この 場合ＢＭｒＰ）からＨＭＴＡＭＩＰの合成を含む。

ＢＭＩＰ（５４０ｍｇ　、２，５　ｍｍｏｌ）とへキサメチレンテトラミン（６ １０ｍｇ　、　４．４　ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨＣ１，中で４０時間還流した。得 られた沈殿を吸引濾過により集め、工程２に直接使用した。

工程２：次の工程はＨＭＴＡＭＩＰからＡＭＩＰの合成を含む。工程１の固体を １２　ｍｌ　ｘタノール：濃ＨＣＩ（３：１）中に、室温で７２時間懸濁し、次 いて真空濃縮した。次いで、実施例５の工程４のように工程を進める。

実施例８ 放射能標識ＡＭＩＰの合成 上記のように、本発明はＭＶＰから放射能標識ＡＭＩＰを製造する１２の方法を 提供する。方法かトリチウム標識ＭｒＰを使用する場合は、最初に実施例３の工 程によりこの方法を進めて、トリチウム標識ＭＩＰを作り、その後実施例７の工 程により続ける。しかしながら、この実施例ではトリチウム標識ＭＩＰは使用し ない。この実施例の場合は、以下の式（９工程）： ５−メチルレゾル’、ｉ）　−４→Ｈ５ＭＣ−ＭｒＰ　４ＸＭＴＰ　−ＨＭＩＰ 　→　ＦＩＰ　→　本ＨＭＩＰ　→　本ＸＭＩＰ　−−ネＨＭＴＡＭｒＰ　→　 本ＡＭＩＰＦ式中、ネは標識化合物を示す〕により方法を進める。

工程１−２＝上記、実施例２に記載の２工程に従って、５−メチルレゾルシノー ルからＨ５ＡＭＣを経てＭＩＰを合成した。

工程３・この実施例では、最初のＸＭＩＰとして、ＢＭＩＰを選んだ（後で、Ｘ ＭＩＰは放射能標識ＣＭＩＰである；下の工程７の反応を参照）。

上記、実施例４に記載の方法に従ってＭＩＰからＢＭＩＰを合成した。

工程４１、実施例５の方法１の工程１に記載の方法に従ってＢＭＩＰからＨＭＩ Ｐを合成した。

工程５：新しい化合物、５−ホルミルイソブソラレン（ＦＩＰ、　７）をＩ（Ｍ ＩＰから合成した。３，５−ジメチルピラゾール（１８０ｍｇ；　１．９　ｍｍ ｏｌ；　Ａｌｄｒｉｃｈ）を、塩化メチレン（６ｍｌ）中の三酸化クロム（Ａｌ ｄｒｉｃｈ；　１９Ｑ　（Ｉｇ；　１．９　ｍｍｏｌ）の懸濁液に添加し、混合 物を室温でアルゴン下で１５分攪拌した。工程４からのＨＭＩＰ（１５０ｍｇ； 　０．６９　ｍｍｏｌ）を１部分添加し、反応混合物を室温で２．５時間攪拌し 、その後ＴＬＣ（ＣＨＣＩ、）により、反応が完了したことを確かめた。溶媒を 減圧下で除去し、残留物を少量のＣＨＣｌ３に溶解し、シリカゲルカラム（Ｂａ ｋｅｒ；６０−２００メツシユ）に負荷し、次いでＣＨＣｌ、で溶出した。生成 物を含む分画を合わせ、そして溶媒を除去し、アルデヒド（１２０ｍｇ；収率８ １％）を得た。９５％ＥｔＯＨから再結晶し、黄色の針状晶を得た。

工程６：トリチウム標識ＨＭＩＰをＰＩＰから合成した。工程５からのＦＩＰ（ ７１ｍｇ；　０．３５　ｍｍｏｌ）とｚＨ４−水素化ホウ素ナトリウム（ＤＮＥ Ｎ；　１．８ｍｇ；　０．０４７６　ｍｍｏｌ）を９５％エタノール（１０ｍｌ ）中で混合し、次いで室温で１時間攪拌した。この期間の後に、ＴＬＣにより、 全てのホルミル化合物が５−（ヒドロキシ−［２旧−メチル）イソブソラレン（ “’Ｈ−ＨＭＩＰ　”）に還元されたことが示された。溶媒を減圧下で除去し、 メタノール（１０ｍｌ）を添加し、次いで、蒸発させた。これを合計４回繰り返 した。次いで、残留固体を３　ｍＩ　Ｃ１Ｍ　（９９：１）に溶解し、Ｉ　ＣＯ ］Ｘ３０　ｃｍシリカゲルカラム（Ｂａｋｅｒ；　６０−２００メツシユ）に負 荷し、次いで、同じ溶媒混合物で溶出した。生成物分画を合わせ、溶媒を蒸発さ せ、標識アルコール、”Ｈ−ＨＭＩＰ（収率は決定していない）を得た。

工程７：工程６の”Ｈ−ＨＭＩＰを直接クロロメチル誘導体、５−（クロロ−［ ”Ｈ］−メチル）イソブソラレン（”　Ｈ−ＣＭＩＰ　”）への変換に使用した 。工程６からの”Ｈ−ＨＶＩＰを１０　ｍｌクロロホルム（４Ａモレキユラーシ ーブで乾燥）に溶解し、次いで塩化チオニル（２４８ｍｇ；　２．　ＩＨｏｌ； 　Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。反応混合物を室温でアルゴン下で攪拌した。１ 時間後に、塩化チオニルをさらに１６５　ｍｇ（１，４ｍｍｏｌ）添加した。こ れをさらにもう１６時間攪拌し、その時点で塩化チオニルの３番目の部分（１６ ５Ｂ；　１．４　ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を減圧下で蒸発させ、さらに５ 時間後に、生成物、”Ｈ−ＣＭＩＰ（収率は決定していない）を得た。

工程８：工程７の生成物を５ｍｌクロロホルム（シーブ乾燥）に入れ、ヘキサメ チレンテトラミン（８５ｍｇ、０．６１　ｍｍｏｌ；　Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加 した。これを、５５℃で４３時間攪拌し、その時点でさらにヘキサメチレンテト ラミン（９５ｍｇ；　０．６８　ｍｍｏｌ）を添加した。さらに４８時間加熱を 続け、その後、ＨＣＩ（０，１Ｎ；　１０　ｍｌ）とクロロホルム（５ｍｌ）を 添加した。クロロホルムを除去し、水層をクロロホルム（５ｍｌ）で３回以上洗 った。次いで、水層を減圧下で蒸発し、固体生成物、５−（ヘキサメチルテトラ ミノ−（３旧−メチル）イソブソラレン（’Ｈ−８ＭＴＡＭＩＰ”）を、次の反 応のためにエタノール　濃ＨＣ１（３：１）１２　ｍｌに入れた。

工程９：工程８からの’Ｈ−ＨＭＴＡＭ［Ｐを、室温でエタノール１４Ｃ１混合 物中で、攪拌した。追加の濃ＨＣ１２ｍｌを添加し、混合物を４０°Ｃて１５時 間攪拌した。この期間に続いて、ＮａＯＨでｐＨを７に調整し溶液を減圧下で蒸 発させた。固体を０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＯＨ１，Ｏｍｌに入れクロロホルム（５ｍ ｌ）で３回抽出した。クロロホルム洗浄物を合わせ、水（１０ｍｌ）で２回洗っ た。次いで、りｏロホルムをＨＣＩ　（０，１Ｎ；　１０ｍ１）で抽出し、次い で酸性水相をクロロホルム（５ｍｌ）で３回洗った。水層を減圧下で蒸発させ、 固体をエタノール（１０ｍｌ）に溶解した。この溶液の了りコートを取り出し計 測し、原液の濃度は、Ｕ■吸収で決定した。生成物、５−（アミノメチル−［坩 ］−メチル）イソブソラレン（”　Ｈ−ＡＭＩＰ　’　）を、３４７　ｕｇ／ｍ ｌおよび比活性３．１ｘ　ＩＱ’　ＣＰＭ／ｕｇ（１１７Ｃｉ／ｍｏｌ）と決定 した。全体回収量は１．６ｍＣ１，３，４７ｍｇ　、０．０１４　ｍｍｏｌ（収 率は３Ｈ４−ＮａＢＨ４を基にして７２％）であった。

実施例９ ＢｉＯＭＩＰの合成 以下の実施例でＢＩＯＶＩＰを合成する方法は、式：％式％ に従って進める。再びＸＭＩＰは、ＣＭ！ＰまたはＢＭＩＰのいずれかであり得 る。この実施例では、ＸＭｒＰはそれぞれＣＭｒＰとＢＭＩＰである。

工程１・ＶＩＰを反応させてＸＭＩＰを形成する。この工程では、ＸＭＩＰはＣ ＭｒＰである。ＭＶＰ（ｆ、８０　ｇｍ　、０．９　ｍｍｏｌ）をＣＣｌ４に溶 解して還流する。Ｎ−クロｏスクシンイミド（１，２０ｇｍ、９　ｍｍｏｌ　Ａ ｌｄｒｉｃｈ）と過酸化ジベンゾイル（０，２２ｇｍ、９　ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒ ｉｃｈ）を添加し、混合物を出発物質が残らなくなるまで（ＴＬＣて確認）沸騰 する。この期間に続いて、沸騰混合物を濾過（熱いうちに）し、濾液をＯ″Ｃで 静置する。得られた沈殿を、吸引濾過により集め、ＣＩ（ＣＩ３に溶解し、水で 洗い、乾燥（無水Ｍｇ５Ｏハし、減圧下で回転蒸発により濃縮し、生成物、ＣＭ ＩＰを得る。

工程２：次いで、ＨＭＩＰをＸＭＩＰ（この場合はＣＭＩＰ）から合成する。

ＴＬＣ（Ｅａｓｔｍａｎ　ＴＬＣプレート；クロロホルムで展開、２６０ｎｍ紫 外線光で検知）により監視しなから、ＣＭＩＰ（２３３ｍｇ　、　１．０　ｍｍ ｏｌ）を、蒸留水（５０ｍｌ）中で還流する。２時間後、出発物質はなくなり、 新しい、低いＲ′ｆスポットが現れる。反応混合物を冷却すると、生成物、ＨＭ ＩＰが白色の針状晶として沈殿し吸引濾過して集める。

工程　３：　次いで、ＸＭＩＰをＨＭＩＰから合成する。この場合、ＸＭＩＰは ＢＭＩＰである。ＨＭＩＰ（２７０ｍｇ；　１．２５　ｍｍｏｌ）を、新たに蒸 留したクロロホルム（２０ｍｌ、４Ａモレキユラーシーブで乾燥）に溶解する。

臭化チオニル（３８４ｍｇ；３．Ｏｍｍｏｌ；　Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、続 いて室温で攪拌する。さらに臭化チオニルを、１．５時間後（１２６ｍｇ　、１ ．０ｍｍｏｌ）と３．０時間後（１２６ｍｇ；　１．Ｏｍｍｏｌ）に添加する。

合計６．５時間後に出発物質がなくなり（Ｅａｓｔｍａｎ　ＴＬＣプレート；　 ＣＨ２Ｃｌ２）　、新しい高いＲｆスポットか現れる。減圧下で溶媒を除去し、 残留物を少量のＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、１／２　’　Ｘ２０７シリカゲルカラム （Ｂａｋｅｒ、６０−２００メツシユ）に負荷し、同じ溶媒で溶出する。生成物 を含む分画をＴＬＣにより同定し、合わせ、そして減圧下で溶媒を除去する。

工程４；次いで、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ反応によりＢＭ［Ｐから［ＭＩＰを合 成する。還流冷却器とアルゴン道管を取り付けた小さな丸底フラスコに、ＢＶＩ Ｐ（２７９ｍｇ：　１．Ｏｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム（７６７ｍｇ；　５． １５ｍｍｏｌ；Ｂａｋｅｒ；　１２０°Ｃで一夜乾燥）およびメチルエチルケト ン（１０ｍｌ　Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）の混合物を４８時間還流する。この 期間に続いて、反応混合物を濾過し無機塩（ＮａＩとＮａ、Ｂｒの混合）を除去 し、濾液を減圧下で蒸発させ、残留粗生成物をクロロホルムに溶解し、１／２　 ’　Ｘ２０Ｍシリカゲルカラム（６０−２００メツシユ、Ｂａｋｅｒ）に負荷し 、同じ溶媒で溶出する。生成物、ｆＭ＋Ｐを含む分画をＴＬＣて同定し、合わせ 、減圧下で溶媒を除去する。

工程６・次いで、５−Ｎ−（Ｎ、　Ｎ’−ジメチル−１，６−ヘキサンジアミン ）−メチルイソブソラレン（ＤＭＨＭＩＰ、　１１）をＩＭＩＰから合成する。

ＩＭＩＰ（９３５ｍｇ；　２．８５　ｍｍｏｌ；多数回の工程５の生成物を合わ せた）と新たに蒸留したＮ、　Ｎ’−ジメチル−１，６−ヘキサンジアミン（４ ，１ｇｍ；　２８．５　ｍｍｏｌ；　Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ＴＬＣで監視しなが ら、アルゴン下で乾燥トルエン（４５ｍｌ）中で還流する。短時間後、出発物質 はなくなり、新しい低いＲｆスポットが現れる。溶媒を減圧下で除去し固体残留 物をＨＣＩ（１，０Ｎ；　６０　ｍｌ）に溶解し、クロロホルム（３Ｘ２５ｍｌ ）で洗い、酸性水相を１．ＯＮ　Ｎａ０Ｈ（ｐＨ１２）で塩基性にし、塩基性水 相をクロロホルム（３Ｘ５０　ｍｌ）で抽出し、クロロホルム抽出物を水（２ｘ ４０　ｍｌ）、飽和食塩水（１ｘ　４０ｍ１）で洗い、最後に乾燥（ＭｇＳ０４ ）する。溶媒を減圧下で除去し、残留物を少量のＣ／Ｅ／Ｔ（９：　１　：０゜ ２５）に溶解し、０．５　’　Ｘ］、２′シリカゲルカラム（６０−２００メツ シユ、Ｂａｋｅｒ）に負荷し、Ｃ／Ｅ／Ｔで溶出する。純粋な生成物、ＤＭＨＭ ＩＰ、を含む分画を、ＴＬＣで同定し、合わせ、そして、蒸発させ、生成物を得 る。

工程７：　５−Ｎ［Ｎ、　Ｎ’〜ジメチル−（６−［ビオチンアミド１−ヘキサ ノエート）−１，６−ヘキサンジアミン］）メチルイソプソラレン（ＢＩＯＶＩ Ｐ。

１２ａ）をＤＭＨＭＩＰから製造した。ＤＭＨＭＩＰ（６３０ｍｇ；　１．８　 ｍｍｏｌ）、ビオチン−アミドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエス テル（Ｐｉｅｒｃｅ；　１００　ｍｇ；　０．２２　ｍｏｌ）およびＤＭＦ（２ ，７ｍｌ、４Ａシーブで新たに蒸留）を、アルゴン導管を取り付けた１０　ｍｌ 丸底フラスコに入れた。ＴＬＣ（Ｃ／Ｅ／Ｔ、　９：１：０．２５；生成物は、 出発物質に比べ高いＲｆスポットとなる）で監視しながら室温でマグネチックス ターラーで攪拌した。反応が完了した後、溶媒を真空で除去し、残留物を少量の ＣＨ，ＣＩ、：ＣＨ２０Ｈ（１０：１）に溶解し、シリカゲルカラム（６０−２ ００メツシユ、　０．５　’　Ｘ２０″）に負荷し、同じ溶媒で溶出した。

生成物を単離し、溶出溶媒を除去し、遊離アミンを１０　ｍｌエタノールに溶解 した。ＨＣＩガス、続いてアルゴンを溶液に通した。エタノールを除去し、生成 物、ＢＪＯＭＩＰ（ＨＣＩ塩）　（１９０ｒｎｇ；　ｌ収率］４，７％；　ＦＡ ＢＭＳ　ｍ／ｅ　６８２（ＭＨ＋、２５％））を得た。

（装置以下余白） 実施例ＩＯ ＢＩＯＭＩＰの合成 以下の実施例では合成方法は、式： ％式％ に従って進行する。この実施例で、ＸＭＩＰはＢＭＩＰである。

工程１：　ＢＭＩＰ（４００ｍｇ＋　１．４３　ｍｍｏｌ）　、新たに蒸留した Ｎ、　Ｎ’−ジメチル−１，６〜ヘキサンジアミン（３，１ｇｍ；　２１．５　 ｍｍｏｌ；　Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ＴＬＣで監視しながらアルゴン下で乾燥トル エン（４５ｍｌ）中で還流した。１．５時間後、出発物質は残らず、新しい低い Ｒｆスポットが現れた。溶媒を減圧下で除去し、固体残留物を１．０　Ｎ　ＨＣ Ｉ（６０ｍｌ）に溶解し、クロロホルム（３Ｘ２５　ｍｌ）で洗い、１．ＯＮ　 Ｎａ０Ｈ（ｐＨ１２）で酸性水相を塩基性にし、塩基性水相をクロロホルム（３ Ｘ５０　ｍｌ）で抽出し、クロロホルム抽出物を水（２ｘ４０　ｍｌ）、飽和食 塩水（ＩＸ４０　ｍｌ）で洗い、そして最後に乾燥（ＭｇＳ０４）シた。減圧下 で溶媒を除去し、残留物を少量のＣ／Ｅ／Ｔ　（９：ｌ：０．２５）に溶解し、 ０．５　”　ＸＩ２“シリカゲルカラム（Ｂａｋｅｒ、６０−２００メツシユ） に負荷し、次いでＣ／Ｅ／Ｔで溶出した。純粋生成物を含む分画をＴＬＣで同定 し、合わせ、蒸発して生成物、ＤＭＨＭＩＰを粘性のオイルとして得、これを放 置すると固形化した（３００　ｍｇ；　収率６１％）。

工程２：次いで、ＢＩＯＭＩＰ　（）ｔｃｌ塩）をＤＭＨＭＩＰから実施例９の 工程７の通りに合成した。

実施例１１ トリチウム標識ＢＩＯＶＩＰの合成 本発明はさらに、標識８４０ＭＩＰを合成する方法を提供する。１つの方法は、 以下の式： ％式％ によるＢＩＯＶＩＰの放射能標識付けを含む。この実施例では、３Ｈ−ＸＭＩＰ は３Ｈ−ＣＭＩＰである。

工程１：実施例８の工程７からの”Ｈ−ＣＭＩＰ（２４ｍｇ　、　０．１　ｍｍ ｏｌ）と新たに蒸留したＮ、　Ｎ’−ジメチル−１，６−ヘキサンジアミン（０ ，４７ｇｍ；　０．３２　ｍｍｏｌ）を、ＴＬＣで監視しながらアルゴン下で乾 燥トルエン（５ｍｌ）中で還流する。数時間後、出発物質は残らず、新しい低い Ｒｆスポットが現れる。溶媒を、減圧下で除去し、固体残留物をＨＣＩ　（１， ＯＮ）に溶解し、クロロホルムで抽出し、酸性水相を分離し、Ｎａ０Ｈ（１，Ｏ Ｎ）で塩基性にし、塩基性水相をクロロホルムで抽出し、クロロホルム抽出物を 水、飽和食塩水で洗い、次いで乾燥（ＭｇＳＯ＜）する。溶媒を減圧下で除去し 、残留物を少量のＣ／Ｅ／Ｔ　９：１：ｏ、２５に溶解し、０．５’Ｘ４’シリ カゲルカラム（６０−２００メツシュ；　Ｂａｋｅｒ）に負荷し、そしてＣ／Ｅ ／Ｔで溶出する。純粋生成物を含む分画をＴＬＣで同定し、合わせ、蒸発させ、 生成物を得る。生成物をさらにＵ■とＴＬＣ（数種の異なる溶媒系でオーセンテ ィック物質と同時クロマトグラフィー）により同定する。そのように製造した５ −Ｎ−（Ｎ、　Ｎ’−ジメチル−１，６−ヘキサンジアミン）−［言Ｈ］−メチ ルイソブソラレン（３Ｈ−ＤＭＨＭｒＰ）を工程２で［３Ｈ］−ＢＩＯＭＩＰ（ および他の化合物）の合成に直接使用する。

工程２：　’Ｈ−ＤＭ）ｌｌＪｒＰ（１７，５ｍｇ：　０．０５　ｍｍｏｌ）　 、ビオチンアミドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２５ｍ ｇ；　０．０５５ｍｍｏｌｅ；　Ｐｉｅｒｃｅ）、およびＤＭＦ（１，８ｍｌ、 新たに４Ａシーブで蒸留）をアルゴン道管を付けた５ｍｌ丸底フラスコに入れる 。ＴＬＣ（Ｃ／Ｅ／Ｔ；９：１：０．２５；生成物は、出発物質に比べ高いＲｆ スポットとなる）により監視しながら室温でマグネチックスターラーで攪拌する 。反応が完了した後、溶媒を減圧下で除去し、残留物を少量のＣＨ２Ｃｌ２：ｃ ＨｚＯＨ１０：Ｉに溶解し、シリカゲルカラム（６０−２００メツシユ、０．５ ”Ｘ５″）に負荷し、同じ溶媒で溶出する。生成物を遊離塩基として単離し、溶 出溶媒を除去し、次いで、無水エタノールに溶解する。ＨＣＩガス、続いてアル ゴンを溶液の中に通す。エタノールを除去し、５−Ｎ−［Ｎ、Ｎ’−ジメチル− Ｎ’−（６−ビオチンアミド）−ヘキサノニー）　）−１，６−ヘキサンジアミ ン］−［２劃−メチルイソプソラレン（’Ｈ−ＢｒＯＭＩＰ）を１塩酸塩として 得る。

実施例１２ ＤｒＴＨＴＯＶＩＰの合成 本発明はＤＩＴＨＩＯＶＩＰを合成する方法を提供する。この実施例では合成を 、以下の式： ％式％ ［式中、ＸＭＩＰはＢＭＩＰである］に従って進行する。

工程１；　ＤＭＨＭＩＰを、ＢＭＩＰから実施例１０の工程Ｉに記載の方法に従 って合成する。

工程２：工程１からのＤＭ）ＩＭＩＰ（４１ｍｇ；　１．２０　ｍｍｏｌ　Ｓｌ 、０当量）とスルホスクシンイミジル−２−（ビオチンアミド）−エチル−１， ３−ジチオプロピオネ−）（１０２ｍｇ；　０．１６８　ｍｍｏｌ；　１．４０ 当量）を、アルゴン道管を付けた小さな乾燥した丸底フラスコの中で新たに蒸留 したＤＭＦ　（３，０ｍｌ）に溶解し、次いで室温で５時間攪拌する。この期間 の後、ＤＭＦを減圧下で除去し、残留物をＮａ０Ｈ（１，ＯＮ）に懸濁し、クロ ロホルム／イソプロパツール３１で抽出し、有機抽出物を水（１０ｍ１ｘ２）で 洗い、次いで乾燥（ＭｇＳ０４）　Ｌ、濾過し、減圧下で蒸発させ粗生成物を得 る。これをエタノール原溶液に通す。エタノールを除去し、生成物、５−Ｎ−［ Ｎ、Ｎ’−ジメチル−Ｎ’　−（２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３−ジ チオプロピオネ−））−１，，６−ヘキサンジアミン］−メチルイソブソラレン （ＤＩＴＨＩＯＶＩＰ、　１２ｂ）（ＨＣＩ塩）を得る。これをエタノールに溶 解し、ホウ水素化ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）またはメルカプトエタノール（ Ａｌｄｒｉｃｈ）ての試料処理によりさらに特性決定する。これらの反応の生成 物を未処理の物質と比較して切断か期待通りに生じていることを確証する。

実施例１３ ３）１−Ｄ［ＴＨＩＯＶＩＰの合成 本発明は’Ｈ−ＤＩＴ）ＩＩＯＶＩＰを合成する方法を提供する。この実施例で は合成は、以下の式 ％式％ に従って進める。この実施例では、３）１−ＸＭＩＰは３Ｈ−ＣＭＩＰである。

工程］：　’Ｈ−ＤＭＨＭＩＰを実施例１１の工程ｌに記載の通りに製造する。

工程２：　’Ｈ−ＤＭＨＶＩＰ（２４ｍｇ　、０．０７　ｍｍｏｌ　、１．Ｏｅ Ｑ）とスルホスクシンイミジル−２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３−ジ チオプロピオネ−ト（６０ｍｇ；　０．１０　ｍｍｏｌ　、１．４当量）をアル ゴン道管を付けた小さな乾燥丸底フラスコで新たに蒸留したＤＭＦ　（１，５ｍ ｌ）に溶解し、次いて室温で５時間攪拌する。この期間の後、ＤＭＦを減圧下で 除去し、残留物を０．　Ｉ　Ｎ　Ｎａ０Ｈ（５ｍｌ）に懸濁し、クロロホルム／ イソプロパツール３：ｌ　（３ｘ５　ｍｌ）で抽出し、有機抽出物を水（５ｍ１ Ｘ２）で抽出し、次いで乾燥（ＭｇＳＯ４）　シ、濾過し、ストリッピングし、 生成物、’Ｈ−Ｄ［ＴＨＩＯＶＩＰを得る。次いで、生成物を紫外線吸収（オー センティック物質と比較）とＴＩ、Ｃ（数種の異なる溶媒系でオーセンティック 物質と同時クロマトグラフィー）により同定する。

放射化学純度をＨＰＬＣで決定する。約１０’ＣＰＭのトリチウム標識３１＋− ＤｉＴＨｌｏｌＪＩＰを５０ｕｌのエタノール（１００％）中で１０　ｕｇの未 標識ＤＩＴＨＩＯＭＩＰと混合する。試料をＣＩ８オクタデシルシリル逆相クロ マトグラフィーカラム（Ｂｅｃｋｍａｎ）に注入し、以下のアセ１〜ニトリル／ 酢酸アンモニウム（０，１Ｍ、　ｐ）１７）勾配・０−１０分、１００％酢酸ア ンモニウム；　１０−７０分、１００％酢酸アンモニウム　→１００％アセトニ トリル、　７０−８０分、１００％アセトニトリル；で溶出する。８０の１．Ｏ ｍ１分画を集め、次いで、各分画の４０　ｕｌを計測する。試料をエタノールに 溶解し、ホウ水素化ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）またはメルカプトエタノール （Ａｌｄｒｉｃｈ）のいずれかの処理により生成物を、さらに特性決定する。こ れらの反応の生成物を未処理の物質と比較し期待通りの切断が生じていることを 確認する。

実施例１４ ＦＬＵＯＲＭＩＰの合成 本発明はさらに、ＦＬＵＯＲＭＩＰを合成する方法を意図する。この実施例では 、以下の式・ ＸＭＩＰ　４ＤＭＨＭＩＰ→Ｆｌ、［ＪＯＲＭＩＰ［式中ＸＭ＋ＰはＢＭ＋Ｐで ある］、に従って合成を進める。

工程１：　ＤＭＨＭＩＰを、実施例１０の工程ｌに記載の方法に従って１３ＶＩ Ｐから合成する。

工程２：　ＤＭＦ（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ；　４Ａシーブて蒸留した１、０ ｍ１）中の、工程ｌからのＤＭＨＭＩＰ（１３，７ｍｇ、　０．０４　ｍｍｏｌ 　、１．Ｏｅｑ）と、ＤＭＦ（１゜０　ｍｌ）中の６−カルボキシフルオレセイ ン−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（Ｐｉｅｒｃｅ：　２０．７　ｍ ｇ、０．０４４　ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）をアルゴン道管を付けた５ｍｌ丸底フ ラスコて混合する。反応混合物を室温で数時間攪拌する。この期間後、ＤＭ）Ｉ ＭＩＰの殆とかＴＬＣ（Ｃ／Ｂ／Ａ／Ｆ、　４・ｌ：１：１：）により示された ように、消費される。減圧下で穏やかに加熱（＜５０°Ｃ）シなから溶媒を除去 する。残留物をＨＣＩ（０，Ｉ　Ｎ）に溶解しクロロホルム／イソプロパツール ３．Ｉて抽出する。次いて、有機抽出物の体積を小さくし、ガラス分取シリカゲ ルＴＬＣブ１／−ト（２０ｃｍｘ２０　ｃ＋＋＋　ｘ２　ｍｍ；　Ｂａｋｅｒ） に負荷し、Ｃ／Ｂ／Ａ／Ｆて溶出する。主要低Ｒｆバンドをプレートから削り取 り、Ｃ／Ｍ　（９０：１０）で溶出し、シリカを濾過して除去し、溶媒を減圧下 で蒸発させる。

生成物を少量のエタノールに溶解し、ＨＣＩガスを溶液の中を通す。

次いて、エタノールを蒸発させてｌ塩酸塩として５−ｈＬ−［Ｎ、　Ｎ　’−ジ メチルーＮ’　−（カルボキシフルオレセインエステル）−１，６−ヘキサンジ アミン）−メチルイソブソラレン（ＦＬｔｌＯＲＶＩＰ、　１２Ｃ）を得る。

実施例１５ ３Ｈ−ＦＬＵＯＲＭＩＰの合成 本発明は、３Ｈ−ＦＬＩＪＯＲＭＩＰの合成する方法も又、意図する。この実施 例では、以下の式 ％式％ に従って合成を進める。ＤＭＦ（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ；　４人シーブて蒸 留１゜０ｍ１）中の、実施例１１の工程１からの’Ｈ−ＤＭＨＭ［Ｐ（２，５ｍ ｇ；　０．００７＋ｎ＋ｎｏｌ；　１１７　Ｃｉ／ｍｍｏｌ；　１．０　当量） と、ＤＭＦ（１，０ｍｌ）中の６−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシ −スクシンイミドエステル（３，７ｍｇ＋　０．００８　ｍｍｏｌ；　１．１　 ｅｑ；　Ｐｉｅｒｃｅ）をアルゴン道管を取り付けた５ｍｌ丸底フラスコで混合 する。反応混合物を室温で数時間攪拌する。この期間の後、ＴＬＣ（Ｃ／Ｂ／Ａ ／Ｆ；　４：１：１：ｌ）て示されるように、大部分の３Ｈ−ＤＭＨＭＩＰが消 費される。減圧下で穏やかな加熱（〈５０”Ｃ）によりＤＭＦを除去する。粗生 成物をＨＣＩ（０，１Ｎ；　３　ｍｌ）に溶解し、クロロホルム／イソプロパツ ール３：１（３ｍｌ　Ｘ３）で抽出する。

次いで、有機抽出物を２ｍｌに減らし、ガラス分取シリカゲルＴＬＣプレート（ ２０ｃｍｘ２０　ｃｍ　Ｘ２　ｍｍ；　Ｂａｋｅｒ）に負荷し、そし２てＣ／Ｆ ３／Ａ／Ｆで溶出する。主要な低Ｒｆバンドをプレートから削り取り、メタノー ルで溶出する。シリカを濾過で除去し、溶媒を減圧下て蒸発させる。生成物を少 量のエタノールに溶解し、ＭＣＩガスを溶液の中に通す。次いて、エタノールを 蒸発させ、’　Ｈ−ＦＬＵＯＲＭ　ＩＰを１塩酸塩として得る。生成物を、紫外 線吸収（オーセンティック物質と比較）とＴＬＣ（数種の異なる溶媒系です一セ ンティック物質と同時クロマトグラフィー）により同定する。比活性を、化合物 のエタノール原液の光学密度の決定と、この溶液のアリコートのシンチレーショ ン計測（１１７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）により決定する。放射化学純度をＨＰＬＣで決 定する。約１０’ＣＰＭの’Ｈ−ＦＬＩＪＯＲＭＩＰを５０μＩエタノール（１ ００％）中の未標識ＦＬＵＯＲＭＩＰ　１０μｇと混合する。試料をＣＩ８オク タデカシリル逆相逆相クロマトラグラフイーカラムｅｃｋｍａｎ）に注入し、以 下のアセトニトリル／酢酸アンモニウム（０，１Ｍ；　ｐＨ７）勾配：　０−１ ０分、１００％酢酸アンモニウム、　１０−７０分、１００％酢酸アンモニウム →１００％アセトニトリル；　７０−８０分、１００％アセトニトリル、で溶出 する。８０の１．Ｏｍ１分画を集め、次いで、各分画の４０μｌをカウントする 。

実施例１６ ＤＭＩＰの合成 この実施例はＤＭＩＰを合成する本発明方法を記載する。方法はレゾルシノール から以下の式： ％式％ に従って４工程で進める。

工程１ニレゾルシノール（１１０ｇｍ；　１．Ｏｍｏｂ　Ａｌｄｒｉｃｈ）をア セト酢酸エチル（１３０ｇｍ　、　１．０　ｍｏｌ　、　Ａｌｄｒｉｃｈ）と混 合し、滴下漏斗に入れる。この混合物を、機械的スタークーと内部温度計を取り 付けた３つロフラスコで、冷却（１０°Ｃ）硫酸溶液（１０００ｍｌ）に滴下す る。添加速度は、内部温度がｌＯｏＣを越えない程度である。溶液を１２時間攪 拌し、次いでゆっくり２　Ｋｇの氷と３リツトルの水に注ぐ。

激しく攪拌後、沈殿を吸引濾過で集め、水で洗い、５％ＮａＯＨ水（１５００ｍ ｌ）に溶解し、次いで、激しく撹拌しながら希硫酸（６５０ｍｌ）を添加し再沈 殿させる。生成物、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン（Ｈ４ＭＣ，１３）を 濾過して集め、水で洗い、次いで自然乾燥する（　１４５　ｇｍ　収率４１％； 　融点１８５°Ｃ）。

工程２：　Ｈ４ＭＣ（１４５ｇｍ；　０．８２　ｍｏｌ；　Ａｌｄｒｉｃｈ）を 、炭酸カリウム（１５４ｇｍ；　１．１２　ｍｏｌ；　Ｂａｋｅｒ）と触媒量の ヨウ化カリウム（７，１ｇｍ；０．０５　ｍｍｏｌ；　Ｂａｋｅｒ）の存在下で ＤＭＦ（１１７８ｍｌ；　Ｍａｌｌｉｃｋｒｏｄｔ）／　トルエ：、ｚ（９３１ ｍｌ；　Ｍａｌｌｉｃｋｒｏｄｔ）中で、２．３−ジクロロ−１−プロペン（１ ０７，８ｇｍ；　０．９７　ｍａｔ；　Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した。混合物を 攪拌しながら１２時間、９５°Ｃに加熱し、その後ＴＬＣで、出発物質か残って いないことを確かめた。溶媒を減圧下で除去し、残留ペーストを加温クロロホル ムで抽出した。クロロホルムを水、飽和ＮａＣｌで洗い、乾燥（ＭｇＳＯ，）　 Ｌ、、次いで減圧下で溶媒を除去した。残留固体を無水エタノールに還流下で溶 解して（１２００ｍｌ）　、静置した。得られた結晶を吸引濾過で集め、冷エタ ノールで洗い、真空乾燥し、７−（β−クロロアリルオキシ）−４−メチルクマ リン（ＣＡＭＣ，１４）（１４３，５ｇｍ、収率７０％）を得た。ＭＮＲ（ＣＤ Ｃ１３）　ｄ　７．５　（ＩＨ，ｄ）　、６．８−６．９（２１（、ｍ）　、６ ．２（ＩＨ，ｄ）　、５．５−５．６（２Ｈ，Ｍ）　、４．２（２Ｈ，ｍ）　、 ２．４（３Ｈ，Ｍ）。

工程３：　ＣＡＭＣの転位を、工程２からのアリルエーテル（１４３，５ｇｍ； ０．５５　ｍｏｌ）を、ｐ−ジイソプロピルベンゼン（Ａｌｄｒｉｃｈ、１００ ０　ｍｌ）と無水酪酸（９６［１１１，９２，８ｇｍ；　０．５９　ｍｏｌ　、 　Ａｌｄｒｉｃｈ）の混合物中でアルゴン下で１８時間還流することにより、高 収率で達成した。冷却反応混合物をクロロホルムで希釈し、水、次いで飽和重炭 酸ナトリウムで洗い、乾燥（ＭｇＳ０４）シ、次いで減圧下で蒸発させた。

エタノールから再結晶して、７９．９　グラムの６−および８−（β−クロロア リル）−７−プチルオキシー４−メチルクマリン（ＢＣＡＭＣ，１５）を得た。

ＨＰＬＣ分析（Ｂｅｃｋｍａｎ；　Ｃ１８−０ＤＳ逆相カラム、６０％ＣＨ３０ Ｈ／４０％Ｈ２０でアイソクラチック溶出）により、混合物は、８５．７％の目 的の訃置換異性体を含むことが示され、その試料をカラムクロマトグラフィー（ ６０−２００メツシユシリカゲル、ＣＨｚｃｔ、で溶出）で精製した。２つの異 性体の構造はＮＭＲにより確証された。ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）　ｄ７．５６　（ ＩＨ，ｄ）、７．１１　（ＩＨ，ｄ）　、６．２６　（ｌｈ、ｄ）　、５．０５ −５．１９　（２Ｈ，ｍ）、３．８４　（２Ｈ，ｍ）　、２．５５−２．６２　 （２Ｈ，ｍ）、２．４３　（３Ｈ，ｄ）　、　１．７８−１．８２（２Ｈ，ｍ） 、１．０１−１．０９　（３Ｈ，ｔ）。

工程４：２０グラムの混合異性体を、５°Ｃで７０％硫酸で処理することにより 閉環を達成し、反応混合物を水と氷５０：５０の混合物（３０００ｍｌ）に添加 することにより生成物を沈殿させた。クロロホルムて抽出し、１２．５グラム（ ９４％）の混合異性体生成物、４．５′−ジメチルイソブソラレン（ＤＭＩＰ、 　１６）と４．５′〜ジメチルブソラレンを得た。目的の４．５′−ジメチルイ ソブソラレンの精製をエタノールから再結晶を繰り返すことにより達成しこ（収 率約８５％の純粋ＤＭＩＰを得た）。

実施例１７ 放射能標識ＤＭＩＰの合成 工程１：　ＤＭＩＰ（２１，４ｍｇ、０．１　ｍｍｏり　、１０％パラジウム／ 炭素（１５ｍｇ、　Ａｌｄｒｉｃｈ）および氷酢酸（Ｍａｉｌ　１ｎｋｒｏｄｔ 、２　ｍｌ）を２５　ｍｌの丸底フラスコに入れ、トリチウムがそれ以上吸収さ れなくなるまで、トリチウムガス（Ｌａｗｒｅｎｃｅ；　１５０　Ｃ４）と攪拌 する。触媒を遠心で除去し、上澄みを真空下で蒸発させる。残留固体を塩化メチ レン（Ｉ　ｍｌ）に溶解し、１／２　’　Ｘ５　’シリカゲルカラム（６０−２ ００メ・ノシュ、Ｂａｋｅｒ）に負荷し、塩化メチレンで溶出する。非蛍光［３ ，４，４’　、５’−’Ｈ４］−テトラヒドロー４．５′−ジメチルイソブソラ レン（”Ｈ−ＴＨＤＭＩＰ、　１７）を含むカラム分画をＴＬＣで同定し、合わ せ、そして減圧下で溶媒を除去する。この物質を、オーセンティ・ツク未標識化 合物（ＵＶ；　ＣＨＣｌ２；　Ｃ／Ｍ　９８：２でのＴＬＣの同時クロマトグラ フィー）と比較してさらに同定する。初期比活性２４．５　Ｃｉ／ｍｍｏｌに相 当する２、４５Ｃｉの物質を回収した。次いでこの物質を工程　２でトリチウム 標識ＤＭＩＰの製造に使用した。

工程２．上記の通りに製造した２Ｈ−ＴＨＤＭＩＰを、ジフェニルエーテル（５ ｍｌ）と１０％パラジウム／炭素（３０ｍｇ；　Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に２５　 ｍｌ丸底フラスコに入れる。窒素バブラーを取り付け、混合物を２４−３６時間 還流する。室温まで冷却後、無水エタノール（５ｍｌ）を添加し、触媒を遠心で 除去する。上澄みを一部蒸発させ　、１７２″×５“シリカゲルカラム（Ｂａｋ ｅｒ、６０−２００メツシユ）に負荷し、塩化メチレンで溶出する。生成物を含 む分画を合わせ、溶媒体積を減少させ、上記の１　／２’　ＸＩＯ’カラムでク ロマトグラフィーを繰り返す。生成物を含むカラム分画を合わせ、溶媒を除去す る。そのように得られた（３．４’　−［”Ｈ２］）−４，５’−ジメチルイソ ブソラレン（’Ｈ−ＤＭＩＰ）を放射線分解を防ぐためにエタノール中で保存す る。

”Ｈ−ＤＭ［Ｐの比活性を、原液の光学密度を測定しその濃度を決定し、次いで 原液の適当なアリコートを計測することにより確立する。

放射化学純度をＨＰＬＣで決定する。約１０”ＣＰＭの”Ｈ−ＤＭＩＰを、５０ 　ｕｌのエタノール（１００％）中で１０　ｕｇの未標識ＤＭ［Ｐと混合する。

試料をＣ１８オクタデカシリル逆相クロマトグラフィーカラム（Ｂｅｃｋｍａｎ ）に注入し、以下の水／メタノール勾配：　０−１０分、１００％Ｈ２０：１０ −７０分、１００％Ｈ，０→１００％ＣＨＪＨ；　７０−８０分、１００％ＣＨ ３０Ｈ，で溶出する。８０の、１．Ｏｍ１分画を集め、各分画の４０　ｕｌを計 測する。

９９％以上の放射能が、３Ｈ−ＤＭＴＰに相当する光学ピークで同時クロマトグ ラフィーされる。

実施例１８ ＣＭＤＭＩＰの合成 ４′−クロロメチル−４，５′−ジメチルイソブソラしン（ＣＭＤＭＪＰ。

＋８）を以下のようにＤＭＩＰから合成した：　ＤＭＩＰ（１１，９ｇｍ；　５ ５．６　ｍｍ。

ｌ）をＲ酸（６００ｍｌ）に溶解し、次いでクロロメチルメチルエーテル（４６ ｍｌ；　４８．７　ｇｍ：　６００　ｍ＋＋＋ｏｌ）を添加した。均質溶液を室 温で１６時間放置し、その後２番目の部分のクロロメチルメチルエーテル（４６ ｍｌ；　４８，７　ｇｍ；　６００　ｍｍｏｌ）を添加したう溶液をさらに５３ 時間室温に放置し、その後結晶か形成され始めた。反応フラスコを０°Ｃで７８ 時間冷却すると、白い沈殿の太きなかたまりか形成され、吸引濾過でそれを集め 、次いでフィルター上で乾燥した。収率は１０．９ｇｍ（７４，７％）であった 。生成物、ＣＭＤＭＩＰ、のＮＭＲスペクトルは、ＤａＩＩ’　Ａｃｑｕａ　ｅ ｔ　ａｔ、、、１．　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｍ　２４．１７８　（１９８１）による 記載と一致した。

実施例１９ 放射能標識ＣＭＤＭＩＰの合成 本発明は標識ＣＭＤＭＩＰもまた意図する。本実施例は４工程ＣＭＤＭＩＰ　→ ＨＭＤＭＩＰ　−ＦＤＭＩＰ　→’Ｈ−ＨＭＤＭＩＰ　→’Ｈ−ＣＭＤＭＩＰを 含む本発明の１方法を記載する。

工程１・４′−ヒドロキシメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレン（ＨＭＤ ＭＩＰ、　＋９）をＣＭＤＭＩＰから製造した。ＣＭＤＭＩＰ（１，０ｇｍ；　 ３．８　ｍｍ。

１）を２５０　ｍｌ丸底フラスコに入れ、水で４時間還流した。この後、ＴＬＣ （Ｃ／Ｍ　９５：５）によりすべての出発物質か単一の低いＲｆスポットに変わ ったことを確認した。反応混合物を２時間０℃に冷却し、次いて生成物を吸引濾 過により集めた。

工程２：新しい化合物４′−ホルミル−４，５′−ジメチルイソブソラレン（Ｆ ＤＭＩＰ、　２０）を、本発明の新規な合成方法により、ＨＭＤＭＩＰから製造 した。３．５−ジメチルピラゾール（８３０ｍｇ　、８．７　ｍｍｏｌ、Ａｌｄ ｒｉｃｈ）を、塩化メｆ−１，ン（２５ｍｌ）中の二酸化クロム（８４７ｍｇ　 、８．８Ｈｏｌ）懸濁液に添加し、混合物を室温で３０分アルゴン下で攪拌した 。工程ｌからのＨＭＤＭＩＰ（８００ｍｇ；　３．３　ｍｍｏ］）を１部分添加 し、反応混合物を室温で２．５時間攪拌した。ＴＬＣにより３時間後に反応が終 わったことを確認した（ＣＨＣＩｓ）　、、減圧下で溶媒を除去し、残留物を少 量のＣＨＣ１，に溶解し、シリカゲルカラム（６０−２００メツシユ、Ｂａｋｅ ｒ）に負荷し、次いてＣＨ，Ｃ’１２で溶出した。生成物を含んでいる分画をＴ ＬＣで決定し、合わせ、溶媒を除去し、ＦＤＭＩＰ（６４７ｍｇ、８１％）を得 た。９５％ＥｔＯＨから再結晶により、さらに精製を達成し黄色の針状晶を得た 。

■程３：４’−（ヒドロキシ−［３旧−メチル）−４，５’−ジメチルイソブソ ラレン（”Ｈ−ＨＭＤＭＩＰ）をＦＤＭＩＰから製造した。工程２のＦＤＭｔＰ （１８ｍｇ；　０．０７４３　ｍｍｏｌ）と［３Ｈ，］−ホウ水素化ナトリウム （ＤＮＥＮ　、、１゜８　Ｂ、０．０４７６　ｍｍｏｌ：　６０　Ｃｉ／ｍｍｏ ｌ）を９５％エタノール（８ｍｌ）中で室温で５時間攪拌した。この期間の後、 ＴＬＣにより、ＦＤＭＩＰ（ｌｉ’ｆ、　７）か完全に、３Ｈ−ＨＭＤＭＩＰ（ Ｒｆ、　１５）に還元されたことを確認した。溶媒を凍結乾燥で除去し、残留固 体をＣ／Ｍ（９９：Ｌ　１　ｍｌ）に溶解し、１ｃｍＸ３０ｃｍクロマトグラフ ィーカラム（６０−２００メツシュシリカゲル；　Ｂａｋｅｒ）に負荷し、モし てＣ／Ｍ　（９９１）で溶出した。ＴＬＣで、３日−ＨＭＤＭＩＰを含む分画を 同定し、合わせ、蒸発させた。生成物を直接、工程４で、４　’−（［’Ｈ］− クロロメチル）−４，５’−ジメチル１′ソブソラレン（３Ｈ−ＣＭＤＭＩＰ） の製造に使用した。

工程４１月（−ＣＭＤＭＩＰを塩化チオニルを用いて３Ｈ−ＨＭＤＭＩＰから製 造した。（これとは別に、４’−（［３旧−ブロモメチル）−４，５’−ジメチ ルイソブソラレンＣＨ−ＢＭＤＭＩＰ）を翳化チオニルを用いて’　Ｈ−ＨＭＤ ＭＩＰから製造てきる。ＢＭＤＭＩＰ　→Ｈｌ）ＡＭＤＭ　Ｉ　ＰおよびＢＭＤ ｌｉｔ［Ｐ　→ＰＨＩＭＤＭＩＰのようなＳＮ２置換反応での高い反応性故に、 ３Ｈ−凪（ＤＭＩＰか好才しい：従って、臭化チオニルは、Ｘ＝ＢｒであるＸＭ ＤＭＩＰを得るのに最適な試薬である。工程３に記載の通りに製造した３１（− ）ＩＭＤＶＩＰを小さな丸底フラスコに入れ、新たに蒸留したクロロホルム（５ ｍｌ　、４　Ａモレキュラーシーブで乾燥）に溶解した。塩化千オニル（４１ｍ ｇ；　００３５　ｍ＋ｎｎｌ＋　ＡＩｄｒｉｅｔ＋）を添加し、黄色の溶液を１ 時間攪拌した。この期間の後、ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌりで、全ての出発アルコ−・ ルか生成物に変化した、ことを確認した。溶媒を減圧下で除去し、ベンゼン（５ ｍｌ）を添加し、次いで減圧下で蒸発させた（２回）。

白い固体残留物を直接、追加標識化合物の製造に使用した。

実施例２０ ＡＭＤｌｉｌＩＰの合成 この実施例は以下の式 ％式％ に従。てＤＭＩＰからＡＭＤＭＩＰの合成を記載する。

工程１：　ＤＭＩＰ（５１ｇｍ、０．４１　ｍｏｌｅ）を加熱しなからＣＬＣｈ ｉ＝溶解し、次いで室温まで冷却する。Ｎ−１ニトロキシメチルフタルイミド（ ５９゜５　ｇｍ：　０．３４　ｍｏｌ）を添加し、混合物を８　”Ｃに冷却する 。ＣＦ＋５ＯｔＨ（１９，８ｍｌ；　３３．６　ｇｍ；　０．２２　ｍｏｌ）　 とＣＦ、Ｃ００Ｈ（２８０ｍｌ；　１８９　ｇｍ；　１．６６ｍｏｌ）の混合物 を滴下漏斗から４０−５０分にわたって添加し、その期間中、反応混合物の温度 を外部から冷却し８°Ｃ−１２°Ｃの間に維持する。添加後、反応フラスコを室 温にし、次いて全ての出発物質か消費されるまで（ＴＬＣ；　ＣＨ２Ｃｌ、）還 流する。反応か完了した後、２つの手法の１つを後処理のために使用する。最初 に、溶媒を減圧下で除去し、残留黄色固体をクロロホルムに溶解し、りｏｏホル ムを水、０．３　Ｍ　Ｎａ、ＯＨ１水て洗い、次いで乾燥（ＭｇＳ０４）する。

生成物をカラムクロマトグラフィー（６０−２００メツシユシリカゲル、１３ａ ｋｅｒ）で単離する。別法として、反応混合物の体積を半分にし、次いてメタノ ールを添加し粗生成物を沈殿させ、続いて濾過する。沈殿をメタノールで洗い、 次いてエタノール・クロロホルム（１１）から再結晶し、４′−フタルイミド− ４，５′−ジメチル１′ソブソラレン／　（ＰＨＩＭＤＭＩＰ、　２１）を得る 。

工程２：　ＰＨｒＭＤＭＩＰ（４０ｇｍ；　０．１１　ｍｏｌ）を９５％エタノ ール（１８００ｍｌ）に溶解し、続いて、ヒドラジン−水和物（１５ｍｌ：　８ ５％水溶液；　Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加する。溶液を攪拌しながら１７時間加熱 （６０゛Ｃ）シ、その後追加のヒドラジン（１５ａ＋Ｉ）を添加する。さらに４ 時間後、ＴＬＣ（Ｃ／Ｍ　９８：２）により、全ての出発物質が消費されること を確認した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残留固体を、クロロホルム（５００［＋ １１）と０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＯＨ（５００ｍｌ）の混合物に溶解する。クロロホ ルムを分離し塩基性水相をクロロホルム（２５０ｍｌ）でさらに２回抽出する。

合わせたクロロホルム抽出物を水（５００ｍｌ＞で２回洗い、次いで、０．１　 Ｍ　ＨＣＩ　（３ｘ２５０　ｍｌ）で逆抽出しプロ（・ン化゛アミンを形成する 。クロロホルムを除去し、酸性水相をさらに３回りｏロホルム（２５０ｍｌ）で 洗う。次いで、酸性水相をＮａ０ｆ（（１，ＯＮ）で塩基性にし、クロロホルム で３回抽出する。グロロホルｊ、抽出物を合わせ、水で洗い、乾燥（ＭｇＳＯ４ ）　Ｌ、次いで減圧下で蒸発させ、そして残留固体を１０００　ｍｌエタノール に溶解する。ＨＣＩガスを冷エタノール溶液に通し、４′−アミノエチル−４， ５′−ジメチルイソプソラレン（ＡＭＤＭｒＰ、　２２）の塩酸塩を得、これを 濾過し、エタノールで洗い、次いで真空で乾燥する（２３　ｇｍ；収率７５％） 。全ての分析データ（ＮＭＲ１元素分析）が公表結果と一致することを調べる。

実施例２１ 放射能標識ＡＭＤＭＩＰの合成 本発明は、標識ＰＨＩＭＤＭＩＰと標識ＡＭＤＭＩＰをも意図する。本発明の１ つの方法は、式： ％式％ 工程！＝上記の通りに製造した’Ｈ−ＣＭＤ！ＩＩＩＰを、４Ａモレキユラーシ ーブの存在下で新たに蒸留した２ｍｌのＤＭＦに溶解した。フタルイミドカリウ ム（４３ｍｇ、　０．２３　ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を４０°Ｃに加熱し、 ４２時間攪拌した。この期間に続いて、溶媒を除去し、残留固体をクロロホルム ：メタノール９８：２　（ｌ　［［ｌ＋）に溶解し、１ｃｍ　ｘ２０ｃｍシリカ ゲルカラム（６０−２００メツシユ）に負荷し、次いてＣ／Ｍ９８：２で溶出し た。生成物を含む分画をＴＬＣ（ＣＨ２ＣＩ２）で同定し、合わせ、そして減圧 下で蒸発させた。固体残留物、４′−（フタルイミド−［ゴ旧−メチル）−４， ５’−ジメチルイソブソラレンＣＨ−ＰＨＩＭＤＭＩＰ）をトリチウム標識ＡＭ ＤＭＩＰの製造に直接使用した。

工程２：上記の通りに製造した、’Ｉ（−ＰＨＩＭＤＭＩＰを９５％エタノール （３ｍｌ）に溶解した。ヒドラジン−水和物（５ｍｇ　、０．１　ｍｍｏｌ）を 添加し、そして溶液を加熱（６０°Ｃ）　Ｌ、１７時間攪拌し、その後、追加の ヒドラジン（０，０４ｍｍｏｌ）を添加した。さらに４時間後、ＴＬＣにより、 全ての出発物質が消費されたことを確認した。減圧下で溶媒を蒸発させ、そして 、残留固体をクロロホルム（５ｍｌ）とＮａ０Ｈ（０，１Ｎ；　５　ｍｌ）の混 合物に溶解した。クロロホルムを分離し、塩基性水相をクロロホルム（５ｍｌ） でさらに２回抽出した。合わせたクロロホルム抽出物を水（１０ｍｌ）で２回洗 い、次いで、ＨＣＩ（０，１Ｎ；　１０　ｍｌ）で逆抽出し、プロトン化アミン を形成した。クロロホルムを除去し、そして、酸性水相をクロロホルム（５ｍｌ ）でさらに３回洗った。次いて、水相を減圧下で蒸発させ、そして、残留固体を エタノール（１０ｍｌ）に溶解した。原液を適当に希釈し、計測し、そして、光 学密度で濃度を決定した。生成物の全体回収は、４．５７　ｍｇ（’Ｈ−ＣＭＤ ＭＩＰを基にして１６．８％）。比活性は、２．２　ＸＩＯ５ＣＰＭ／μｇ　（ ９３ｍｃｉ／ｍｍｏｌ）であった　。

実施例２２ Ｂ［ＯＤＭＩＰの合成 この実施例は、以下の式： ％式％ に従ってＢＩＯＤＭＩＰを合成する本発明の１方法を記載する。

工程１：　ＣＭＤＭＩＰ　（２５０ｍｇ、　０．９　ｍｍｏｌｅ　、　１．０当 量）　、Ｎ、　Ｎ’−ジメチル−１，６−ヘキサン−ジアミン（１，８３ｇｍ； 　１２．７　ｍｍｏｌ；１４．０当量；　Ａｌｄｒｉｃｈ）およびトルエン（２ ８ｍｌ、新たに４Ａシーブて蒸留）を、還流冷却器とアルゴン導管を取り付けた ５０　ｍｌ丸底フラスコに入れた。反応混合物を、マグネチックスターラーで攪 拌しながら加熱マントルで還流した。１時間後ＴＬＣ（ベンゼン／メタノール１ ＝１）により、出発物質の約８０％か単一の低いＲｆスポットに変わったことを 確認した。合計の還流時間は１７時間で、その後、本質的に出発物質は残らなか った。回転蒸発器で減圧下でトルエンを除去し、残留の黄色の油を少量のクロロ ホルムに溶解した。この溶液を小さな（０，５’　Ｘ５　”）クロマトグラフィ ーカラム（６０−２００メツシュシリカゲル；　Ｂａｋｅｒ）に負荷し、次いで 、９５％エタノール・ａＮＩ（，０１（（４：Ｉ）で溶出し、１５のｌ　ｍ１分 画を集めた。生成物を含む分画をＴＬＣで同定し、合わせ、減圧下で溶媒を除去 し、そして残留物を２番目のシリカカラム（０，５’　Ｘ２０’　）に再負荷し 、そして、Ｃ／Ｅ／Ｔ（９：］：０．２５）で再溶出した。この溶媒系は、未反 応Ｎ、Ｎ’　ジメチル−１，６−ヘキサンジアミンから生成物を分離するのに効 果があった。溶出に続いて、ＴＬＣプレートをヨウ素またはニンヒドリン（０， ５％エタノール溶液）で展開して分離を確認した。純粋生成物を含む分画を合わ せ、減圧下で溶媒を除去し、残留油を高圧下で一定の重量にした。４’　−Ｎ− （Ｎ、　Ｎ’−ジメチル−１，６−ヘキサンジアミン）−メチル−４，５′−ジ メチルイソプソラレン（ＨＤＡＭＤＭＩＰ、　２４）の収率は約５０％であった 。質量スペクトルｍ／ｅ（相対的同位体存在比）３７０　、（Ｍ＋、１．０９） 　；　吸収スペクトル最大値（ｎｍ）：　２５２．３０３゜ 工程２：　ＨＤＡＭＤＭｒＰ　（１８，４ｍｇ　、　０．５　ｍｍｏｌ、１゜０ 当量）、ビオチンアミドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ ４５，５ｍｇ；　０．１０　ｍｍｏｌ；　２．０当量；　Ｐｉｅｒｃｅ）および ＤＭＦ　（１，５ｍｌ　、新たに４Ａシーブで蒸留した）をアルゴン導管を取り 付けた１０ｍ１丸底フラスコに入れた。反応物を室温でマグネチックスターラー で攪拌した。１時間後、ＴＬＣ（Ｃ／Ｅ／Ｔ　９：１：０．２５）により高いＲ ｆ生成物スポットを確認した。５時間の反応時間後、さらに２０　ｍｇのビオチ ン出発物質を添加し、反応をさらに１時間続けた。溶媒を真空で除去し、残留物 を合計１０　ｍｌ　クロロホルム：イソプロパツール３：１に溶解し、分離漏斗 に移した。ＨＣＩ（０，１Ｎ；　１０　ｍｌ）を添加し、層を完全に混ぜ、次い て、分離させた。有機相を除去し、水相をｐＨ１３に調整し、次いで、クロロホ ルム：イソロバノール３：１で再び抽出した。有機抽出物を合わせ１、そして減 圧下で溶媒を除去した。残留固体（３９，４ｍｇ）を、Ｃ／Ｅ／Ｔに溶解し、シ リカゲルカラム（６０−２００メツシユ、０．５“Ｉ２０“）に負荷し、同じ溶 媒で溶出した。生成物を単離（遊離アミンとして）し、溶出溶媒を除去し、遊離 アミンをエタノール（１０ｍｌ）に溶解した。ＨＣＩガス、続いてアルゴンを溶 液の中に通した。エタノールを除去し、３１．７ｍｇの４’　−Ｎ−［Ｎ、Ｎ　 ’−ジメチルーＮ’　−（６−（ビオチンアミド）−ヘキサノエート）−１，６ −ヘキサンジアミン１−メチル−４，５′−ジメチルイソブソラレン（ＢＩＯＤ ＭＩＰ、　２５ａＸＨＣ１塩）（収率８５％）を得た。ＦＡＢＭＳ　ｍ／ｅ　（ 相対存在量）　７１０　（Ｍｌ　十、６０％）。

（本質以下余白） 実施例２３ 放射能標識ＢＩＯＤＶＩＰの合成 この実施例は、以下の式： ％式％ に従って放射能標識ＣＭＤＭＩＰから、放射能標識ＨＤＡＭＤＭＩＰどＢＩＯＤ ＭＩＰの合成を記載する。

工程Ｉ　上記の通りに製造した’Ｈ−ＣＭＤＭＩＰ（７０ｍｇ；　０．２７　ｍ ｍｏｌ）、およびＮ、　Ｎ’−ジメチル−１，６−ヘキサンジアミン（５００ｍ ｇ、　３．５　ｍｍｏｌｅ）および新たに蒸留したトルーｒ−〉（８ｍｌ）を５ ０ｍ１丸底フラスコで混合した。溶液を、−夜攪拌した。ＴＬＣ（クロロホルム ／ベンゼン／了セトン／ギ酸４：１：１：１）によＩ］、生成物か形成され、本 質的に全ての出発物質か消費されたことを確認した。トルエ゛／を減圧下で除去 し、残留固体を１−２１Ｔ］ｌのＣ／Ｅ／Ｔ　（９・ｌ：０．２５）に溶解した 。１％、れをシリカゲルカラム（０，５″×２″、　６０−２００メツシユ、Ｂ ａｋｅｒ）に負荷し同し溶媒で溶出した。生成物（ヘキづンノアミンから分離さ ｔ］ない）を含む分画を合わせ、減圧下で溶媒を除去した。固体を同じ溶媒１− ２ｍ１に溶解し、大きいカラム（０，５″×２０″）に負荷し、同し溶媒で溶出 した。ヘキサンジアミン化合物の存在を、ＴＬＣ上でエタノール中の１％ニンヒ ドリンを使用して（溶液をＴＬＣブレー１−Ｊ二に散布し、ブし・−トを７０− ８０°Ｃに加熱した）検出した。純粋な４’　−Ｎ−（Ｎ、　Ｎ’−ジメチル− １，６−ヘキサンンアミン）−［’Ｈ］−メヂルー４．５′−ジメチルイソプソ ラレン（３Ｈ−ＨＤＡＭＤＭＩＰ）を含むカラム分画をこのように同定し、合わ せ、溶媒を減圧下で除去し、５３．７　ｍｇ　（収率５８％）を得た。

工程２３Ｈ−ＨＤＡＭＤＭＩＰ　（２ｍｇ；　０．００５　ｍｍｏｌ；　１　ｅ ｑ）とビオチンアミドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（６ ゜２　ｎ＋ｇ；　０．０１４　ｍｍｎ１；　２．８　ｅｑ）およびＤＭＦ（１， ０ｍｌ、シーブにかける）を１０　ｍｌ丸底フラスコで混合した。１反応と後処 理手法は未標識化合物の製造と同じであった。比活性２．６Ｘ　１１０７ＣＰ、 ／　ｕｍｏｌ　（３，５ＸＩＯ’　ＣＰＭ／μｇ）の生成物１．８ｍｇ（収率４ ７％）を回収した。

実施例２４ ＤＩＴ）ＩＩＯＤＭＩＰの合成 この実施例は、以下の式： ％式％ に従ってＤ［ＴＨＩＯＤＭＩＰを合成する本発明の１方法を記載する。

ＨＤＡＭＤＭＩＰ（３０ｍｇ；　０．８０　ｍｍｏｌ；　１．０当量）とスルホ スクシンイミジル−２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３−ジチオプロピオ ネート（６８ｍｇ；　０．１１２　ｍｍｏｌ：　１．４０　ｅｑ）を、アルゴン 導管を取り付けた乾燥した小さな丸底フラスコで、新たに蒸留し、たＤＭＦ（１ ，５ｍｌ）に溶解し、次いて室温で３時間攪拌した。この期間の後、減圧下でＤ ＭＦを除去し、残留物を０．　ｌ　Ｎ　Ｎａ０ｔ（（７ｍｌ）に懸濁し、クロロ ホルム／イソプロパツール３：１　（２０ｍｌ　Ｘ２）で抽出し、有機抽出物を ０．５　Ｎ　ＨＣＩ（２０ｍｌ　Ｘ２）、水（１０ｍｌＸ２）で洗い、次いて乾 燥（ＭｇＳＯ，）　Ｉ、、濾過し、ストリッピングして、黄色の油として粗生成 物（５，４ｍｇ）を得た。有機洗浄物からの酸性抽出物を１．ＯＮ　ＮａＯＨ（ ３０ｍｌ）を添加して塩基性にし、次いでクロロホルム（２５ｍｌＸ２）で抽出 した。クロロホルムを乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）　ｔ、、濾過し、スＩ・リッピング して追加の生成物（２４ｍｇ）を得た。生成物４’　−Ｎ（Ｎ、　Ｎ’−ジメチ ル−Ｎ′−（２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３−ジチオプロピオネ−１ −）−１，６−ヘキサジジアミン］−メチル−４，５′−ジメチルイソプソラレ ン（ＤＩＴＨＩＯＤＭＩＰ、　２５ｂ）（遊離塩基）をさらに特性決定するため に、原液（エタノール溶液）の少量のアリコートをホウ水素化すトリウム（Ａｌ ｄｒｉｃｈ）またはメルカプ）・エタノール（Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理し、次い でこれらの反応の生成物を未処理物質と比較した。どの場合も、生成物は期待通 り開裂していた。

実施例２５ 放射能標識Ｄ　ＩＴＨＩＯＤＭ　ＩＰの合成この実施例は、以下の式・ ”Ｈ−ＣＭＤ［Ｐ−”Ｆ（−ｒＭＤＭＩＰ−３Ｈ−ＨＤＡＭＤＭＩＰ　−’Ｈ− ＤＩＴＨＩＯＤＭＩＰに従って’Ｈ−ＤＩＴＨＩＯＤＭＩＰを合成する本発明方 法の１つの実施態様を記載する。

工程ｌ　実施例１９の工程４に記載の通りに製造し、た’ｌ（−ＣＭＤＭＩＰ（ ２０ｍｇ：　０．７５　ｍｍｏｌ）とヨウ化ナトリウム（５７ｍｇ；　０．３８ 　ｍｍｏｌ；　１２０”Ｃて一夜乾燥）とアセｌ−ン（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄ ｔ）を４８時間還流する。この期間に続い”Ｃ１反ＬＬ、混合物を濾過し、結果 として生じたＮａＣｌを除去し、濾液を減圧下で蒸発させ、そして残留粗生成物 をクロロホル１４に溶解し、１／４　Ｘ５　’シリカゲルカラム（６０−２００ メツシユＢａｋｅｒ）に負荷し、次いてクロロホルムて溶出する。生成物、４′ −（ヨード−［’Ｈ］−メチル）−４゜５′−ジメチルーイソブソラレン（３Ｈ −ＩＭＤＭＩＰ、　２３）、を含む分画を、ＴＬＣて同定し、合わせ、溶媒を減 圧下で除去する。生成物を工程２で直接使用する。

工程２・工程１で製造したコｌ（−ＩＭＤＭＩＰを使用して、３Ｈ−ＨＤＡＭＤ ＭＩＰを製造する。合成と後処理は、３Ｈ−ＣＭＤＭＩＰが３Ｈ−ＩＭＤＭＩＰ に変わり、使用する試薬濃度が３分の２になること以外は、実施例２３の工程ｌ に記載の手法と同じである。得られた粗’Ｈ−ＨＤＡＭＤＭＩＰを記載の通りに カラムクロマトグラフィーでさらに精製し、’Ｈ−ＤｒＴＩ（［ＯＤ［Ｐの製造 に直接使用する。

工程３　工程２で製造した’Ｈ−ＨＤＡＭＩＩＩＪＩＰを使用して、３Ｈ−ＤＩ ＴＨＩＯＤＭＩＰを製造する。３Ｈ−ＨＤＡＭＤＭＩＰ（５ｍｇ；　０．０１３ 　ｍｍｏｌ；　１．０ｅｑ）とスルホスクシンイミジル−２−（ビオチンアミド ）−エチル−１，３−ジチオプロピオネ−）（ＩＩ　ｍｇ；　０．０１９　ｍｍ ｏｌ；　１．５　ｅｑ）を、アルゴン導管を取り付けた小さい乾燥した丸底フラ スコで、新たに蒸留したＤＭＦ（１，５ｍｌ）に溶解し、次いで室温で３時間攪 拌する。この期間の後、減圧下でＤＭＦを除去し、残留物をＮａＯＨ（０，１Ｎ ；　３　ｍｌ）に懸濁し、クロロホルム／イソプロパツール３：１　（７ｍ１ｘ ２）で抽出し、有機抽出物をＨＣＩ　（０，５Ｎ；　７　ｍ１Ｘ２）、水（５ｍ ｌ　Ｘ２）で洗い、次いで乾燥（ＭｇＳＯ，）　Ｌ、、濾過し、ストリッピング し黄色のオイルとして粗生成物を得る。生成物を紫外線吸収（オーセンティック 物質と比較）とＴｉ、Ｃ（数種の異なる溶媒系で同時クロマトグラフィー）によ り同定する。放射化学純度をＨＰＬＣで決定する。約１０’ＣＰＭのトリチウム 標識３Ｈ−ＤＩＴＨＩＯＤＭＩＰを５０μｌのエタノール（１００％）中で、１ ０℃ｇの未標識ＤＩＴＨＩＯＤＭＴＰと混合する。試料をＣ１８オクタデシルシ リル逆相クロマトグラフィーカラム（１３ｅｃｋｍａｎ）に注入し、以下のアセ トニトリル／酢酸アンモニウム（０，１Ｍ；ｐＨ７）勾配：　０−１０分、１０ ０％酢酸アンモニウム；　１０−７０分、１００％酢酸アンモニウム→ｌＯＯ％ アセトニトリル、　７０−８０分、１００％アセトニトリル、で溶出した。８０ の１．Ｏｍ１分画を集め、次いで各分画の４０μＩを計測する。試料をエタノー ルに溶解しホウ水素化ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）またはメルカプトエタノー ル（Ａｌｄｒｉｃｈ）のいずれかで処理し、生成物をさらに特性決定する。これ らの反応の生成物を未処理の物質と比較し期待通りの開裂が起こっていることを 確かめる。

実施例２６ ＦＬＵＯＲＤＭＩＰの合成 この実施例は、以下の式： ％式％ に従ってＦＬＵＯＲＤＭＩＰを合成する本発明の１方法を記載する。

工程１：　ＨＤＡＭＡＭＩＰを、実施例２２の工程１に記載の通りにＣＭＤＭＩ Ｐから合成する。

工程２：　ＤＭＦ（１，０ｍｌ、４Ａシーブて蒸留、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ ）中の工程ｌからの、ＨＤＡＤＡＭＩＰ（１０ｍｇ；　０．０２７　ｍｍｏｌ＋ 　１．０当量）と、ＤＭＦ（１，０ｍｌ、４Ａシーブで蒸留、Ｍａｌｌｉｎｃｋ ｒｏｄｔ）中の６−カルボキジフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステル（１５，１ｍｇ；　０．０３２　ｍｍｏｌ；　１．１　ｅｑ；　Ｐｉｅ ｒｃｅ）を、アルゴン導管を取り付けた５ｍｌ丸底フラスコで混合した。反応混 合物を室温で数時間攪拌し、その後、ＴＬＣ（Ｃ／Ｂ／Ａ／Ｆ−４：ｌ：１：１ ）で示されたように、出発物質の大半が消費されていた。溶媒を減圧下で穏やか に加熱（〈５０°Ｃ）シて除去した。残留物をＨＣＩ（５ｍｌ；０、ＩＮ）に溶 解し、次いで、クロロホルム／イソプロピルアルコール（３１）で抽出した。次 いで、有機抽出物の体積を減らし、ガラス分取シリカゲルＴＬＣプレート（２０ ｃｍ　ｘ２０　ｃｍ　ｘ２　ｍｍ；　Ｂａｋｅｒ）に負荷し、次いて、Ｃ／Ｂ／ Ａ／Ｆで溶出した。主要なＲｆバンドを削り取り、クロロホルム／イソプロパツ ール（３：１）で溶出し、シリカを濾過で除去し、減圧下で溶媒を蒸発させた。

生成物を少量のエタノールに溶解し、溶液の中にＨＣＩガスを通した。次いで、 エタノールを蒸発させ、４′−Ｎ−［Ｎ、　Ｎ’　ジメチル−Ｎ’　−（６−カ ルボキシフルオレセインエステル）−１，６−ヘキサンジアミン）−メチル−４ ，５′−ジメチルイソブソラレン（ＦＬＵＯＲＤＭＩＰ、　２５ｃ）を１塩酸塩 として得た。ＦＡＢＭＳ（遊離塩基）　ｍ／ｅ　７２９、Ｍ＋：吸収スペクトル 相対最大値（ｎｍ）　４４７゜ 実施例２７ 放射能標識ＦＬＯＵＲＤＭＩＰの合成 この実施例は、以下の式： ％式％ に従って放射能標識ＦＬＵＯＲＤＭＩＰを合成する本発明方法の１つの実施態様 を記載する。

工程１：　’Ｈ−ＨＭＤＭＩＰを、実施例１９の工程３に記載の通りにＦＤＭＩ Ｐから製造した。

工程２：　’Ｈ−ＣＭＤＭｒＰを、実施例１９の工程４に記載の通りに’Ｈ−Ｈ ＭＤＭ■Ｐから合成した。

工程３・’　Ｈ−ＨＤＡＭＤＭ　ｒＰを実施例２３の工程ｌに記載の通りに’Ｈ −ＣＭＤＭＩＰから合成した。

工程４：　’Ｈ−ＦＬＵＯＲＤＭＩＰを、”　Ｈ−ＨＤＡＭＤＭ　ＩＰから製造 した。ＤＭＦ（１，７ｍｌ、４Ａ　シーブで蒸留）中の’Ｆｆ−ＨＤＡＭＤＭｒ Ｐ　（３，１ｍｇ；　０．００８４　ｍｍｏｌ；　１．０当量）と、ＤＭＦ（１ ，０ｍｌ）中の６−カルボキシ−フルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ ド（４，０ｍｇ；　０．００８４　ｍｍｏｌ；　１．０当量）を、アルゴン導管 を取り付けた５ｍｌ丸底フラスコで混合した。この混合物を一夜攪拌した。後処 理は、分取ＴＬＣプレートをＣ／Ｂ／Ａ／Ｆ　（５：に１：ｌ：　この溶媒系で は、やや高いＲｆとなり、生成物が良く分離された）で溶出した以実施例２８ 光反応性化合物の溶解度 ＡＭＩＰ、　ＡＭＤＭＩＰ、　ＤＭＩＰ、　ＭｒＰおよびイソブソラレン（ＩＰ ）の溶解度を、図５に説明する式により実験的に決定した。溶解度測定を実施す るために、最初に、各化合物のｌμｇ／ｍｌ溶液の既知の光学密度を確立する必 要があった。これらは、ＩＸＴＥ中の既知の濃度で各化合物のエタノールまたは 水溶液のいずれかの原液を製造し、次いで、各溶液の光学密度を測定して決定し た。この情報から、ｌμｇ／ｍｌ溶液の吸収を計算した。

これとは別に、吸光係数を同様に決定でき使用できる。この方法で、以下の吸収 データを集めた： ０、Ｄ、　１Ｍｇ／ｍｌ 化合物　波長（ｎｍ）　（ＩＸＴＥ）　ＥｍａｘＡＭＩＰ　２４９　０．０８７ 　２．１９Ｘ１０’ＡＭＤＭＩＰ　２４９．５　０．０８２　２．２９ｘ　１０ ’ＤＭ［Ｐ　２５０．５　０．１０２　２．１８Ｘ１０’ＭＩＰ　２４９　０． ０９２　１．９７Ｘ１０’ＩＰ　２４７　０．１０５　１．９５Ｘ１０’各化合 物の溶解度を決定するために、各化合物（ＡＭＤＭＩＰ以外；下記参照）の過剰 量（２−２５ｍｇ）をＩ　ＸＴＥ（０，３７−２ｍｌ）に入れ、次いで数時間加 熱（５０°−７０℃）した。この後、各混合物を室温で数時間、未溶解固体の存 在下で攪拌した（この手法では過飽和は生じないものとした）。この工程に続い て、未溶解の化合物を、０．２ｕナイロン−６６シリンジフイルター（Ａｒｃｏ 　ＬＣ１３；　Ｇｅｌｍａｎ）で濾過して除去した。次いで、残留可溶性化合物 の濃度を、濾液の光学密度の測定と、その化合物の１Ｍｇ／ｍｌ溶液の既知の光 学密度から溶解度を計算し、決定した。化合物の溶解度を、以下のようにこうし て決定した：化合物　ＩＸＴＥ　中の溶解度（μｇ／ｍｌ）ＡＭＩＰ　２１．０ ００ ＡＮＤＶＩＰ　＞２２，７００本 ＤＭＩＰ　ｎｄ本ネ ＭＩＰ　ｎｄ ＩＰ　２ 本化合物の最初の混合が、使用したＩＸＴＥ量に完全に溶解Ｉ。

た時、ＡＭＤＭＩＰの溶解度は最小量の２２．７００　ｕ　ｇ／ｍｌであったｕ ｎｄ・検出不可能（溶解度かｌμｇ／ｍｌより小）実施例２９ 光反応性化合物の暗結合 ウシ胸腺ＤＮＡとのＡＭＩＰ、　ＡＭＤＭＩＰおよびＭＩＰの結合（′暗結合″ ）定数を決定するために、平衡透析を使用した。トリチウム標識イソブソラレン を実験に使用した。方法はＴｓａａｅｓ　ｅｔ　ａｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒＹ　１６．１０５８−１０６６　（１９７７）の方法の改良法であった。

スペクトラボア（ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ）２　透析管（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を飽 和重炭酸ナトリウム中で沸騰して前処理し、次いで、二重蒸留水で完全に洗った 。ウシ胸腺ＤＮＡ　（Ｓｉｇｍａ）は、ＩＸＴＥ中に５０μｇ／ｍｌの濃度で調 製した。１．０　ｍｌ　ＤＮＡ溶液を袋の中に入れ、充分量のイソブソラレンを 使用して、イソブソラレン、ＤＮＡ塩基対比ｌ・１５となるように試料を調製し た。トリチウム標識イソブソラレン（″薬剤″）を用いて試料を調製し、透析袋 の内側または外側に入れた（各試料を小さな電磁攪拌捧を含むシンチレーシｊン バイアルに入れた）。試料を４°Ｃて５日間、暗所で攪拌した。この期間の後、 袋を取り出し７、開き、シンチレーショ〉・計測で袋の内側と外側の放射能を決 定した。ＤＮＡの濃度を２６０　ｎｍでの光学密度を測定して決定した。

この情報から解離定数（Ｋ、）を計算した（表９）。透析袋の内側と外側の両方 にイソブソラレンを含む２通りの試料を調製することにより、系が透析期間の最 終時点で平衡に達したかどうかを調べることができた（平衡時の内側と外側のイ ソブソラ１／ンの量は、両方とも同じであるべきであり、また同しであった。） 結合定数、Ｋ、をここては、 Ｐ　＋ＤＮＡ　ｒ’：ＤＮＡの反応では、Ｋ、＝［肛照り［Ｐ］［ＤＮＡ］ ［式中、Ｐ・溶液中の遊離の薬剤、ＤＮＡ・薬剤とのＤＮＡ結合部位、およびＰ ：ＤＮＡ＝ＤＮＡと結合している薬剤］、として定義する。

以下に化合物について決定したに、値を総括する試料　−ち。

ＡＭＩＰ中　２．９６Ｘ１０’ ＡＭＩＰ外　２．２１　Ｘ　ＩＱ’ ＡＭＤＭＩＰ中　７．６６Ｘ１０’ ＡＭＤＭＩＰ外　１．０７Ｘ１０’ ＭＩＰ　中　９．０８Ｘ１０’ ＭＩＰ　外　２．０７Ｘ　１０３ 実施例３０ 光活性化デバイス 本発明の光活性化デバイスの一つの具体例は、“ＣＥ−Ｉ′と称される。ＣＥ− Ｉは次の特徴を有する照射デバイスである・ｌ）安価な電磁線源、２）試料の温 度制御、３）多試料ホルダー、４）多試料照射フォーマット、及び５）最小の卓 上空間を必要とするコンパクトデザイン。

第６図は上記の特徴を組み込んだＣＥ−Ｉの透視図である。図は、ハウジングの 残部がとりはずされた（図示されていない）ハウジングの底板（１００）を示し ており、これは複数の試料容器（１０９）を支持するための複数の押込部（１０ ８）を有する室（１０７）の周辺に配置された電力源（図示されていない）に接 続可能な６個のバルブ（１０１〜１０６）を有する。バルブは電磁線源として、 １つの態様においては紫外線源として作用する。特定のバルブの型に限定される ものではないが、具体例は工業標準のＦ８Ｔ５ＢＬホットカソードデュアルバイ ピンランブ（ｈｏｔ　ｃａｔｈｏｄｅ　ｄｕａｌ　ｂｉｐｉｎ　ｌａｍｐ）を受 け入れるような形状である。

室（１０７）は、試料容器（１０９）を保持することに加えて、温度制御液体（ 示されていない）を保持し、そのことにより試料容器（１０９）の温度を制御す るための手段として作用する。

第７図は、第６図のａ−ａの線に沿ったＣＥ−Ｉの横断面図である。第７図は室 （１０７）のまわりの源（１０１−１０６）の配置を示している。第７図はまた 、室（＋０７）が試料容器（１０９）を収納するようにデザインさねた寸法の試 料ボルダ−押込部（１０８）で中断されでいることを示している。

本発明は室（１０７）を形成するのに使用される材料の性質によって限定される ことは意図していない。１具体例において、これはガラスにより形成される。他 の具体例においてはプラスチックで形成される。好適な具体例においては、アク リリック−ＵＶＴ　（ＡＣＲＹＬＩＣ−ＵＶＴ　：　Ｐｏ１ｙｃａｓｔ）　、プ レキシグラス１１−　ＵＶＴ　（ＰＬＥＸ［ＧＬＡＳｌｌＬＩＶＴ　：　Ｒｏｈ ｍ　＆　１（ａａｓ）、プレキシグラスＧ−ＵＶＴ　（ＰＬＥＸＩＧＬＡＳ　Ｇ −［ＪＶＴ：　Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ）及びアクリリットＯＰ　−４（ＡＣＲ ＹＬＩＴＥ　０Ｐ−４：Ｃｙｒｏ）から成る市販のアクリル樹脂のグループより 選ばれるＵＶ透過性アクリル樹脂から形成される。

同様に、本発明は室（１０７）を形成するために使用される方法の性質により限 定されることを意図していない。−の具体例において、これは一つの製品として 成形される。他の具体例においては、これは別個の部品として成形され、次いで 組み立てられる。

第６図は、温度制御液体が液体引入口（１１１）を通して導入され、液体流出口 から排出されることを示している。液体引入口（Ｉｌｌ）と液体排出口（＋１２ ）は、液体源（図示されていない）にチューブ（１１３と１１４）を介して接続 されることか好ましい。液体源は液体の再循環を可能とすることか好ましい。温 度制御を改善するために、静止温度制御液体（図示されない）を押入部（＋０８ ）に置くことかできる。

本発明は、特定の温度制御液体に限定することを意図していない。本発明により 企図される安価な温度制御液体は水である。

第８図は、引入口（１１１）と流出口（＋１２）により定義される領域内に置か れる７個の押入部（１０８）をもつＣＥ−Ｉの具体例を示している。押入部（＋ ０８）の数とその配置は使用者の便宜に合わせて選択しつるが、成る配置は照射 効率に影響を与える。

第６図及び第７図は、反射板（１１５，１１６，１１７）の配置をも示している 。反射板はＵＶ反射金属から形成されることが好ましい。

特定の大きさに限定されるものではないが（図面はスケールどおりに記載されて いない）、押入部（＋０８）は約４ｃｍの深さで、押入部は約３ｃｍ離して置か れ、ハウジングの頂部表面から押入部の開口までの距離は約６．５　ｃｍである ことが好適である。このような配置において、底部のバルブ（１０３，１０４） はそれぞれの中心から測定したとき好ましくは′２．３ｃｍ離される（それぞれ の中心は反射板１１７の表面から測定したときハウジングの上方約１．２　ｃｍ のところにある）。こうすると下部のバルブ（１０３，１０４）は反応容器（１ ０９）の底部から１．５　Ｃｍ未満の距離となることを可能にする。

他のバルブは２つのセット（１０１，１０２及び１０５．１０６）としてみるこ とができる（すべて２個のバルブのセットから成り、合計３組）。一つのセット 内で、バルブはその中心から測定して２．３ｃｍ互いに離れるのが好ましい（そ れらの中心は反射板１１５．１１６の表面から好ましくは１．２ｃｍ離れている ）。反射板１１５及び１１６はその側部から測定して約１１ｃｍ離れるのが好ま しい。

バルブ（＋０ｌ−１０６）の長さく“Ｂし”）及び反射板（１１５，１１６，１ １７）の長さく“ＲＬ”）に対する室（１０７）の長さく“ＣＬ“）の関係は次 のとおりであるのが好ましい： ＲＬ　＞　ＢＬ　＞　ＣＬ 好適な長さは、ＲＬ＝２９．５ｃｍ、　ＢＬ＝２６ｃｍと２９ｃｍの間、及びＣ Ｌ＝約２５ｃｍである。

実施例３１ 光活性化デバイス 本発明の光活性化デバイスの１つの具体例は“ＣＥ−ＩＩ”と称される。　ＣＥ −Ｉｎは次の特徴を有し、好適な光活性化デバイスとして使用するために設計さ れた照射デバイスである＝１）安価な電磁線源、２）試料の温度制御、３）多試 料ホルダー、４）多試料照射フォーマット、５）使用者を迷電磁線から保護する ハウジング、及び、６）最小の卓上空間を必要とするコンパクトデザイン。

第９図は上記の特徴を組み込んだＣＥ−ＩＩの透視図であり、取はずし可能な室 （２０７）のまわりに配置された電源（示されていない）に接続可能な６個のバ ルブ（２０１−２０６）を含むハウジング（２００）を示している。第１Ｏ図は 室（２０７）が複数の試料容器（図示されていない）を保持するための複数の押 入部（２０８）をもっていることを示している。

バルブは電磁線として、成る場合には紫外線源として作用する。

特定のバルブの型に限定されるものではないが、具体的な例は工業標準のＦ８Ｔ ５ＢＬホット　カソード　デュアル　バイピン　ランプを受け入れるように形成 される。

ハウジング（２００）は、また、幾つかの電子部品のための取付台としても作用 する。主電源スイッチ（２０９）は交流電源（示されていない）からの流入電流 を制御する。便宜上、この電源スィッチ（２０９）は秒読みタイマー（２１０） に配線され、続いて時間メーター（２１１）と電磁線源のコイル（示されていな い）に並列に配線される。秒読みタイマー（２１０）は試料露出を使用者の希望 のレベルへ照射時間を設定可能としている。時間メーター（２１１）は電磁線源 により提供される照射時間の合計量を記録、維持する。この特徴はバルブの出力 が急速光活性化のために必要な最小レベル以下に減する前にバルブ（２１０−２ ０６）をモニターし、変化させることを可能とする。

室（２０７）は、試料容器を保持することに加えて、温度制御液体（示されてい ない）を保持し、そのことにより試料容器の温度を制御するための手段としての 役目を果たす。

本発明は、室（２０７）を形成するために使用される材料の性質により限定され ることを意図しない。−の具体例においてこれはガラスで形成される。他の具体 例において、これはプラスチックで形成される。好適な態様において、これは、 アクリリック−ＵＶＴ（ＡＣＲＹＬＩＣ−ＵＶＴ、　Ｐｏ１ｙｃａｓｔ）　、プ レキシグーｙ　ス１１−　ＬＩＶＴ　（ＰＬＥＸｒＧＬＡＳＩｔ−ＵＶＴ、　Ｒ ｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ）、プレキシグラスＧ−ｔｌＶＴ　（ＰＬＥＸＩＧＬＡＳ 　Ｇ−ＵＶＴ、　Ｒｏｈｍ　＆Ｈａａｓ）及びアクリリットＯＰ　−４（ＡＣＲ ＹＬＩＴＥ　０Ｐ−４，ＣｙｒＯ）から成る市販のアクリル樹脂の群から選ばれ るＵ■透過性樹脂で形成される。

同様に、本発明は室（２０７）を形成するのに使用される方法の性質により限定 されることを意図しない。１の具体例においてこれは一つの製品として成形され る。他の態様において、これは別個の部品として成形され、次いで組み立てられ る。

第９図は、温度制御液体は液体源（示されていない）からチューブ（２１２，２ １２）を介して導入され、引入口と流出口（示されていない）を介して循環され ることを示している。本発明はいかなる特定の温度制御液体に限定されることを 意図するものではない。

本発明により企図される安価な温度制御液体は水である。

第１０図は反射板（２１４，２１５）の位置を示している。反射板はＵＶ反耐金 属で形成されるのか好ましい。

第９図は、チューブ（２１２，２１３）により限定された領域内に置かれた２０ 個の押入部（２０８）を有するＣＥ−ＩＦを示している。押入部（２０８）の数 及びその配置は、使用者の便宜にあわせて選択することができる一方で、照射効 率に十分なインバク）・を与えることかできる。この態様において、押入部（２ ０８）は２列に配置され、一つの列の押入部（２０８）か他の列の押入部（２０ ８）の反対側に整列された。このデザインにより得られた作業データは、押入部 （２０８）の配置か電磁線の部分的ブロックを起こすこと、即ち、１一つの列の 押入部（２０８）はデバ・イスの一方の側から来る電磁線をブロックし、その結 果、他の列の対向する押入部（２０８）はより少ない電磁線を受け取る。

第１Ｏ図は、室（２０７）に関連してこの態様のバルブ（２０１−２０６）配置 の“Ｖ−型”の形状を示Ｌ−Ｃいる。■−型の形状は、多くの場合、押入部（２ ０８）の二列配置のために室（２０７）に対して要求される寸法から必要となる 。１一つの列の１つの押入部（２０８）の中心から他の列の対向する押入部（２ ０８）の中心までの距離は５．５　ｃｍよりも大きい。このため、上部のバルブ （２０１，２０６）は（中心から中心まで測定して）約１３．５ｃｍ離れて賞か オ］、中間部位のバルブ（２０２＋２０５）は（中心から中心まで測定して）約 １１．５ｃｍ離して配置され、そして、下部のバルブ（２０３，２０４）は（中 心から中心まで測定して）約４．０　ｃｍＭれて配置されることとなる。

バルブ（２０＋−２０６）の長さく“ＢＬ”）及び反射板（２１４，２１５）の 長さく°“ＲＬ“）に対する室（２０７）の長さく“ＣＬ”）の関係は次のよう になる二とか好ましい ＲＬ　＞　ＢＬ　＞　ＣＬ この態様において、ＣＬは約３７ｃｍである。

実施例３２ 光活性化デバイス 本発明の光活性化デバ・イスの好適な具体例は“ＣＥ−ＩＩＩ”と称される。Ｃ Ｅ−］］’［は次の特徴を有する急速光活性化を最適に行うために設けられた照 射デバイスである：１）安価な電磁線源、２）試１の温度制御、３）照射時間の 制御、４）多試料ホルダー、５）多試料照射フナ−マット、６）迷電磁線から使 用者を保護するハウジング、及び７）ｉ＆小の甲上空間を必要とするコンパクト デザイン。

第１１図、１２図及び１３図は、上記の特徴を組み込んだＣＥ−ＩＩＩの図てあ り、内壁（３１０）及び外壁（３１１）を有する取りはずし可能な室（３０９） のまわりに配置された電源（示されていない）に接続可能な８個のバルブ（３０ １−３０８）を有するハウジング（３００）を示している。内壁（３１０）は槽 （３１２）を形成する。第１１図及び１３図は、変換可能で、取りはずし可能な 試料ラック（３１３Ａ）の具体例である。試料ラック（３１３Ａ）は槽（３１２ ）の上部のハウジング（３００）に取りはずし可能に結合される。試料容器（３ １５）は試料ラック（３１３Ａ）に嵌合（７、そのことにより槽（３１２）中に 直線状に配列される。試料の上掛け（３１４）は交換可能な試料ラック（３１３ Ａ）の上方に配置され、ユニットを密閉し、デバイスを操作する時の電磁線から 使用者を保護する。

第１４図は、交換可能で取りはずし可能な試料ラック（３１３Ｂ）の代替物の態 様である。この態様においては、試料容器の２列の配置は、電磁線のブロックを 避けるためにジグサグであることに注意されたい（前記のＣＥ−ＩＩと比較）。

第１２図は、デバイスのすへてのバルブ（３０１１０８）のまわりに広がる単一 の反射板（３１６）を示す。反射板（３１６）はＵ■反射材料で形成されること か好ましい。

室（３０９）は内壁（３１０）と外壁（３１１）の間に循環する温度制御液体（ ３１７）を保持しており、これは試料容器の温度を制御する手段どして作用する 。第１３図は、循環する温度制御液体（３１７）か液体引入口（３１８）を通じ て液体源（示していない）から導入され、液体流出口より流出し、この液体が再 循環可能であることを示している。温度制御を改善するため（ご、静止温度制御 液体（示されていない）を槽に配置しうる。本発明は特定の温度制御液体に限定 されることを意図しない。本発明で企図される安価な温度制御液体は水である。

本発明は、室（３０９）を形成するために使用される材料の性質により限定する ことを意図しない。−の具体例において、これはガラスで形成される。他の具体 例において、これはプラスチックで形成される。好ましい態様において、これは アクリリック−ＵＶＴ（ＡＣＲＹＬＩＣ−１，ＩＶＴ、　Ｐｏ１ｙｃａｓｔ）　 、ブｌ／　キ：／　’Ｉ　ラス１１−　ＵＶＴ　（ＰＬＥＸＩＧＬＡＳｌｌ−Ｌ ＩＶＴ、　Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ）、ブｌ、キシグラスＧ　−ＵＶＴ　（ＰＬ ＥＸＩＧＬＡＳ　Ｇ−ＩＪＶＴ、　Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ）及びアクリリット ＯＰ　−４（ＡＣＲＹＩ、ＩＴＥ　０Ｐ−４、ＣｙｒＯ）から成る市販のアクリ ル樹脂の一群から選ばれるＵＶ透過性アクリル樹脂で形成される。

同様に、本発明は室（３０９）を形成するために使用される方法の性質により限 定されることを意図しない。−の具体例においてこれは一つの製品として成形さ れる。他の具体例においては、別個の部品として成形され、次いて組み立てられ る。

ハウジング（３００）は、又、幾つかのエレクトロニクス成分のための取付台と して機能する。主電源スイッチ（３２０）は交流電源（示されていない）からの 流入電流を制御する。便宜上、この電源スィッチはタイマー作動スイッチ（３２ １）に配線される。“オン“の位置において、タイマー作動スイッチ（３２１） は秒読みタイマー（３２２）に電力を供給する。続いて、秒読みタイマー（３２ ２）は時間メーター（３２３）への電流及び電磁線源のコイル（示されていない ）への電流を制御する。秒読みタイマー（３２２）は試料の露出を希望のレベル へ照射時間を使用者か予めセットすることを可能とする。時間メーター（３２３ ）は電磁線源により提供される照射時間の合計数の記録を維持する。この特徴は 、アウトプットか急速光活性化を達成するのに必要なレベル以下に減じる前に、 バルブ（３０１−３０８）をモニターし、変化させることを可能とする。“オフ ′の位置において、タイマー作動スイッチ（３２１）は、それか秒読みタイマー （３２２）を迂回して、時間メーター（３２３）と電磁線源のコイル（示されて いない）に連続的に電力を供給するように配線される。

第１２図は、室（３０９）に関連して、この実例のバルブ（３０１−３０８）の 配置か“Ｕ−型”形状であるものを示し２ている。ｃｒ、ｅ−ｙのＶ型形状と比 較されたい。）Ｕ型形状は、槽（３１２）　デザインのために室（２０７）のよ り小さな寸法によって可能どなる。

特定の寸法により限定されるものではないが、槽（３１２）の幅は、底部外壁（ ３１１）の長さによって測定した時には、６ｃｍである。Ｊ二部バルブ（３０１ ，３０８）は９ｃｍ未満離して置かれる（中心から中心で測定）。

再び、室（３０９）長さく“ＣＬ”）、バルブ（３０１−３０８）長さく“ＢＬ “）及び反射板（３１７）長さく“ＲＬ”）は次の関係に従う：　ＲＬ＞　ＢＬ ＞　ＣＬ。

実施例３３ 光活性化デバイス：温度制御 温度変化は光活性化学において劇的な影響をもち得る。本発明のデバイスでは、 光活性化の結果に対して、制御されていない変化が起こりうることを限定するた めの温度制御が提供されることが望ましい。第１５図は本発明のデバイスのため の温度制御の欠除の問題を示している。ＣＥ−１，ＣＥ−Ｉ［及びＰＴＩデバイ スは、本発明の試料容器の温度制御手段を使用することなく、１．５ｍｌのエッ ペンドルフ管を照射することが可能であった。温度制御液体の温度が経時的に測 定された。測定は、１００μｌのｄＨ２０を含有する０゜５［０１のエッペンド ルフ管に浸したＴ型サーモカップル（ｔｈｅｒｍｏｃｏｕｐｌｅ）で行った。エ ッペンドルフ管は各デバイスで照射された。ＰＴｒデバイスでの照射に対しては 、管はキ＋１プを閉じたまま、頂部から下方に照射した。温度はオメガ温度制御 計（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　Ｃ。

ｎｔｒｏｌｌｅｒ）　、モデル１４８（Ｏｍｅｇａ　Ｅｎｇｉｅｅｒｉｎｇ社、 スタンフォート、ＣＴ）にてモニターした。

結果（第１５Ａ図）は、試料容器の温度が温度制御なしては急速に温度を上昇さ せることを示している。これに対して、温度制御を行って照射すると一定の温度 を示す（第１５Ｂ図）。

実施例３４ 光活性化デバイス、エネルギー出力 この実施例では、エネルギー出力が最適の光結合動力学と関係するので、エネル ギー出力を研究する。第１６図は本発明のデバイスの相対エネルギー出力を示し ている。ＰＴＩはＣＥ−ＩＩ［に比べて非常に強い強度を有する。相対強度出力 から、紫外線照射の蛍光源は急速な光活性化のためには十分な放射線束ではない ように思われる。少なくとも光結合の動力学における劇的な差異が二つの機械に 対して期待された。結合に関するこの差異の影響は、第１７図に示すようにして 研究した。’Ｈ−ＨＭＴがウシ胸腺ＤＮＡへの結合を測定するために使用された 。’　Ｈ−ＨＭＴがＤＮＡと混合され、照射された。

次いで、生成物は結合していない２Ｈ−ＨＭＴを分離するためにクロロホルムで 抽出した。核酸が沈澱し、溶解された。結合ＨＭＴはＤＮＡ溶液の光学密度を測 定しつつ、シンチレーション計測により測定した。

結果は第１８図に示されている。驚くべきことに、ＣＥ−Ｉ［Ｉデバイスの動力 学は本質的に、費用のかかるＰＴＩデバイスと同一である。

ＣＥ−ＩとＰＴＩ機に関する結合のプラトーは５分以内に達成された。

興味あることには、ＣＥ−Ｉ［はこの実験条件下では結合のプラトーには到達し なかった（ＣＥ−ＩＩデバイスに関しては結合のプラトーは２つの方法の１つで 到達しうる：１）追加の照射時間、又は２）ポリカーボネート管のようなよりす ぐれたＵｖ透過特性をもつ試料容器の使用）。

実施例３５ 光活性化デバイス：試料の位置 光活性化デバイス内の試料の位置の小さな差異による影響を検討した。第１９図 は試料位置による槽（第１２図、部材３１２）の表面におけるＣＢ−Ｈの光の強 度を示す。試料ラック（第１１図、部材３１３Ａ）の中心位置及び末端位置から の試料について、第１７図に示された態様にて光結合を検討した。結果は第２０ 図に示されている。照射時間が２分以下であるときは、光結合動力学において差 異か存在することは明らかである。これは、かかる小さな位置による差異を帳消 しにする結合のプラトーの重要性を示している（第２０図と第１８図とを対照さ せる）。

実施例３６ 光活性化デバイス：光生成物 この実施例の前半部においては、本発明の光活性化デノくイスの種々の態様が、 光生成物を創製する能力に関して調査された。後半部においては、光生成物が核 酸に結合することか示されている。

第２１図は、光生成物が製造される態様の概略を示している。

第２２図は、既知化合物ＡＭＤＭｒＰについて、ＣＢ−Ｉ［［デノくイスでの時 間ごとの光生成物の製造が示されている。ＡＭＤＭＩＰ標準（非照射化合物）は ＨＰＬＣで１個のピークを示しているが（第２２Ａ図）、２分（第２２Ｂ図）、 ５分（第２２Ｃ図）及び１５分（第２２Ｄ図）ではＡＭＤＭＩＰ光生成物のピー クが増加し、ＡＭＤＭＩＰピークは減少している。

第２３図は、既知化合物ＡＭＤＭＩＰに対して使用される光活性化デノくイスに よる光生成物の製造を示している。ＡＭＤＭＩＰ標準では、ＨＰＬＣにおいて１ 個のピークが存在する（第２３Ａ図）。これに対し、ＣＥ−■で１５分間照射す ると光生成物のピークが増加し、ＡＭＤＭ［Ｐピークが減少することを示してい る（第２３図、ＡとＢを比較し、スケールの変化に注意する）。しかしながら、 ＰＴＩデノくイスで同じ時間照射すると、ＡＭＤＭＩＰピークでは極めてわずか な減少が示され、光生成物ピークの極めてわずかな製造が示される（第２３図、 ＡとＣを比較し、スケールの変化に注意する）。明らかに、ＣＥ−Ｉ［デバイス はＰＴＩデバイスよりも多くのＡＭＤＭＩＰ光生成物を製造する。

第２４図は、新規化合物ＡＭＩＰに対して使用した光活性化デバイスによる光生 成物の製造を示している。ＡＭＩＰ標準は主としてＨＰＬＣにおいて１個のピー クが存在する（第２４Ａ図）。これに対して、ＣＢ−■デバイスにより１５分間 照射すると、光生成物ピークの出現とＡＭＩＰピークの減少を示す（第２４図、 ＡとＢを比較し、スケールの変化に注意する）。同様に、ＣＥ−ＩＩ［デバイス で１５分間照射すると、光生成物ピークの出現及びＡＭＩＰピークの減少を示す （第２４図、ＡとＣを比較し、スケールの変化に注意する）。興味あることは、 ＰＴＩデバイスで同時間ＡＭＩＰを照射すると、ＣＢ−Ｉ及びＣＥ−ＩＩＩデバ イスのときと概ね同じ量の光生成物の生成を示す。

光生成物の核酸結合特性をウシ胸腺ＤＮＡを使用して研究した。

Ｔａｑ緩衝液中の２００μｇ／ｍｌの”Ｈ−ＡＭＤＭＩＰ　（１ｘ　１０’ＣＰ Ｍ／ｍｌ）をＣＥ−ＩＩＩデバイス又はＰＴＩデバイスのいずれかで室温におい て照射した。

この照射は核酸の非存在下で１５分間実施された。照射の後、２００μｍの照射 溶液をＴａｑ緩衝液中の１０００μｇ／ｍｌ　ＤＮＡ溶液２００μｍと混合した 。幾つかの同一の試料をこのようにして調製した。１セツトの試料を室温で２時 間ＤＮＡと反応させた。他のセットの試料は試料をサーマルサイクラ−［Ｐｅｒ ｋｉｎ　−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　 （製品番号、　Ｎ８０１０１５０）　］に置くことにより加熱と冷却の３０サイ クルを行なった：各すイクルは９３°Ｃで３０秒間、５５°Ｃで３０秒間及び７ ２°Ｃで１分から成っていた。ＤＮＡ反応が完了したら、すべての試料は第１７ 図に概要を示したフローチャートに従ってＤＮＡ−会合トリチウムのカウント数 （ＣＰＭ）を分析した。

ＤＮＡ−会合カウンｌ−数は、第１０表の１００塩基対当たりの付加物（ａｄｄ ｕｃｔ）に関して与えらねる。計算の目的で、これらの付加物はそれらがあたか もＡＭＤＭＩＰのモノマーを表わすものとして報告される。この近似か正確であ るかどうかにかかわらず、’Ｈ−ＡＭＤＭＩＰを照射する方法は、明らかに、電 磁線の波長をその後活性化しなくても、ＤＮＡと会合する（即ち結合する）トリ チウム化生成物を生ずる。会合の度合は反応条件に依存することか第１０表に示 されている。

結合は、使用する光活性化デバイスにより影響される。ＣＥ−ＩＩＩデバイスで 照射された３Ｈ−ＡＭＤＭＩＰをＰＴＩデバイスで照射された３Ｈ−ＡＭＤＭＩ Ｐと比較するど、有意に大きな量の会合カウント数か観察される。これは、同じ 時間の露光の後でＣＥ−ＩＩＩで製造される光生成物はＰＴＩデバイスによるも のよりも多いという観察（第２３図）と一致していることかわかる。興味あるこ とには、熱す、イクルは（使用するデバイスの如何にかかわらず）室温での２時 間の反応よりも５倍以上の結合を生している。

未照射の結果から判るように、未結合の反応物を除くために１）ＮＡ試料に適用 された分離方法は、非共有的に会合した反応物の多くを除去する。未照射のＡＭ ＤＭＩＰか反応したときにみられるカウント数に比較して、照射したＡＭＤＭＩ ＰかＤＮＡと反応したときにみられるカウント数の増加は、それゆえ、光生成物 かＤＮＡと共有的な会合をしたことによるものであると考えられる。

しかしながら、カウント数は共有的な相互作用によらねばならないということて はない。光生成物は核酸と非常に高い非共有的な会合を有することができる。こ の会合は、苛酷な後処理の後でさえ光生成物がｒｌＮＡと非共有的に会合をする のに十分な程高いものとなりうる。

無　無　室　温　１．１ 無　無　熱的サイクル　０．９ ＣＥ−ＩＩ　１５分　室　温　４．４ ＣＥ−ＩＩＩ　１５分　熱的サイクル　２４．３ＰＴ１　１５分　室温　１．７ ＰＴＩ　１５分　熱的サイクル　５．７実施例３７ 核酸結合 ある場合（７−は、光活性化合物の核酸への結合レベルを正確にコントロールす ることが望ましいであろう。先に第１８図でみたように、結合レベルは照射時間 の関数である。もし照射時間かプラトーレベルに到達するのに十分であるときは 、一定の結合【ノベルか達成されうる。露光に加えて、光活性化合物の濃度もま た最終的な結合レベルに影響する。序章で論じたように、ブソラレンやイソブソ ラレンのような光活性化合物は活性光線を照射している間競合反応を行う。それ らはポリヌクレオチドに付加すると同時に光分解を受けるであろう。特定の光活 性化合物の構造的特性は光付加反応に対する光分解の相対速度を決定するか、化 合物の初期濃度は結合のプラトーレベルに影響する。この実施例は結合レベルを 濃度の関数とし゛Ｃ研究する。第１７図に概要を示した方法に従って、ウシ胸腺 ＤＮＡへの結合を測定するために３８−ＡＭＤＭＩＰを種々の濃度で使用した。

結果を第２５図に示す。明らかに、ＡＭＤＭＩＰの濃度はウシ胸腺ＤＮＡにより 達成される結合レベルに影響を与える。

照射かプラトーレベルを達成するのに十分な持続時間であるならば、所望の光結 合レベルに付加反応を正確にコントロールするために濃度依存性を使用しうる。

実施例３８ 核酸結合 再度、第１７図は、本発明の方法により合成される化合物について共有結合を測 定する方法を概略的に示すフローチャートとして言及され得る。ＩＸＴＥ緩衝液 中に３００μｌのウシ胸腺ＤＮＡ　（シグマ社）を含有するものに、３Ｈ−ＡＭ ＩＰ　（３，ｌｘ　１０’ｃｐｍ／μｇ）、３Ｈ−ＡＭＤＭＩＰ　（２，２ｘｌ Ｏ’ｃｐｍ／μｇ）及び’Ｈ−ＭＩＰ　（２゜Ｉ　Ｘ　１０’ｃｐｍ／μｇ）を 添加した。すべてのイソブソラレン化合物は１００μｇ／ｍｌの名目濃度で添加 された。しかしながら、実験的に得られる現実の濃度（室温で一晩放置後に計測 した）は次のものであったジＨ−ＡＭＩＰ　（１０５μｇ／ｍｌ）、’Ｈ−ＡＭ ＤＭＩＰ　（１１５μｇ／ｍｌ）及び’Ｈ−ＭＩＰ　（＜　１０μｇ／ｍｌ）。

結合を評価するために、各化合物について３個の試料を調製した。２個は照射さ れた（ＣＩＥ−Ｉデバイスで２５°Ｃにて１５分）のに対して、１個はコントロ ールとし７て未照射であった。照射後、試料はＣ）ＩＣ１，て４回抽出し、次い て２回沈澱させた。最終のべＬ・ツトを１ｍｌのＩＸＴＥ緩衝液にとり、４０° Ｃで１晩振とうして再懸濁させた。

各試料の５０μｍを水で０．５ｍｌに希釈した。ＤＮＡａ度はＵＶ吸収（Ａ、、 、、）で決定し、共有結合した・イソブソラレン（“付加物“）はシンチレーシ ョン計測（３Ｘ１００μｌアリコート）で決定した。これらの値から、次の結合 比（付加物：ＤＮＡ塩基対）か決定された：３Ｈ−化合物　比 ＡＭＩＰ　Ｉ　：　１６．７ ＡＭＤＭｒＰ　１　＋　７．２ ＭＩＰ　１　：　４４．２ これらの比から、ＡＭＤＭＩＰが最大の結合を存し、ＭｉＰか最低の結合である ことは明らかである。しかしながら、ＭＩＰの低い結合比がＤＮＡへの低い親和 性によるものであるということは明らかでない。実際、ＡＭＤＭＩＰが１００μ ｇ／ｍｌであるのとは対照的に、実験的に決定されたＭＩＰ濃度は１０μｇ／ｍ ｌ以下であるという事実から、低い比は第一義的にはＭＩＰの低い溶解性による ものと思われる。

これに対して、ＡＭＩＰとＡＭＤＭＩＰの濃度は概ね同じであるという事実から 、比の差異は親和性の差異を表わしていることを示唆するであろう。

実施例３９ 核酸結合 全量１００μｌの標準照射緩衝液（０，１Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　ｈリスｐｎ ｙ。

及び１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）又はＩＸＴａｑ緩衝液（５０ｍＭ　ＫＣＩ、　５０ｍ Ｍ　）リスｐｔ（８，５，２，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．２００μｇ／ｍｌゼラチン ）にそれぞれ５μ１ｇ（０，１ｍｍｏｌ）のＨＲＩ　４６及びＨＲｒ　４７（相 補的１１５−ｍｅｒ）を加えたものに、月（−ＡＭＩＰ（０゜０４μｍｏｌ）又 は’Ｈ−ＡＭＤＭＩＰ　（０，０３５μｍｏｌ）を添加した。結合を評価するた めに、各化合物について３個の試料を調製した。１つはＣＥ−Ｉ光活性化デバイ スにより２５°Ｃで１５分間照射した；１つはＰＴＩ光活性化デバイスにより２ ５°Ｃで１５分間照射した：１つは対照として未照射であった。試料はすべて１ ００μｌ　ＣＨＣｌ、で４回抽出し、（Ｌ　２　Ｍ　ＮａＣ１及び５　ｍＭ　Ｍ ｇＣ１ｔとし、そして、２０°Ｃで２５０μｍエタノールにて沈澱させた。ベレ ットを乾燥、再懸濁し、再沈澱させた。最終のベレットを０．５ｍｌの８２０に 加えた。ＤＮＡ濃度はＵＶ吸収（Ａ２６゜）にて測定し、付加物の量はシンチレ ーション計測により決定した（４Ｘ１００μｌアリコート）。分子量（ＡＭＩＰ ”　ＨＣＩ分子量＝２５１．５；ＡＭＤＭＩＰ”　ＨＣＩ分子量＝２７９，５； 　１１５−ｍａｒ複合体分子量＝７４８００）及び濃度（２６０μｍで１０Ｄ当 たり３０μｇ／ｍｌオリゴ）を用いて、結合を計算した。これらの数値から、次 の結合比（付加物：　ＤＮＡ塩基対）が決定された： ２Ｈ−化合物　デバイス　緩衝液　比 ＡＭＩＰ　ＣＢ−Ｉ　ＮａＣ１１：９．３ＡＭ［Ｐ　ＰＴＩ　ＮａＣ１ｌ　：　 １４．２ＡＭＩＰ　ＣＥ−Ｉ　Ｔａｑ　１　：　７．６ＡＭｒＰ　ＰＴＩ　Ｔａ ｑ　１　：　１２．５ＡＭＤＭＩＰ　ＣＥ−Ｉ　ＮａＣ１ｌ　：　２，７ＡＭＤ ＭＩＰ　ＰＴＩ　ＮａＣ１１：　３．９ＡＭＤＭＩＰ　ＣＥ−Ｉ　Ｔａｑ　１　 ：　２．５ＡＭＤＭＩＰ　ＰＴＩ　Ｔａｑ　１　：　４．２これらの比から、Ａ ＭＤＭＩＰが再び高度に結合することか明らかである。興味あることには、ＣＥ −ＩデバイスはＰＴＩデバイスよりも（使用された化合物の如何にかかわらず） 改良された比を示している。最も重要なことは、周到に用意されたウィルス性Ｄ ＮＡの配列の使用はウシ胸腺ゲノムＤＮＡよりも改善された結合を生ずることで ある。

この後者の点は、恐らくは使用した配列のＡ：Ｔに富んだ性質によるものであろ う。ＨＲＩ　４６及び４７はほぼ６０％のＡ：Ｔ配列を有する。イソプソラレン はこれらの部位において優先的にインターカレーションを行うと考えられるので 、ここで使用したようなＡ：Ｔに富んだ核酸はこれらの光活性化合物と増大した 結合を示すはずである。

この増大した結合は２つの要因による二ｌ）核酸に対してより高濃度のイソブソ ラレンを使用すること及び２）上述のように使用した配列がＡＣＴに富んでいる 性状のものであること。（核酸の濃度に比較して）光反応性化合物の濃度を増大 するとある程度結合を増大することが期待される。実施例３８の相対濃度に比べ て、ここではＤＮＡに対してより高いＡＭＩＰの相対濃度が使用され、そして、 共有結合の相応の増大が達成された（１　：１６．７に対しｌ・９．３）。

実施例４０ 核酸結合 ラムダＤＮＡのＨｉｎｄ−ＩＩ［制限断片２μｇを含む５００μｍ　１　ＸＴＥ 緩衝液中においてＰＴＩデバイスで室温にてＢＩＯＤＭＩＰ　（１００μｇ／＋ １１１）を３０分間照射した。最初の照射の後、この混合物を５０μｇの追加の ＢＩＯＤＭＩＰを含有する新しい管に移し、これを３７°Ｃで１時間インキュベ ートし、化合物を溶解した。次いで、ＰＴＩデノくイスて室温にて２回目の３０ 分間の照射を行った。この条件下で、２０塩基対当たりｌ共有結合したＢｒＯＤ ＭＩＰ（７）割合で、ＢＩＯＤＭＩＰかＤＮＡ１：付加しテシ）るのが観察され た。

実施例４１ 核酸結合 この実施例は、ＲＮＡに対する”Ｈ−ＡＭＩＰ、”Ｈ−ＡＭＤＭＩＰ及びＢｌｏ ｔ、ＩＩＰの光結合を記載する。Ｉ　Ｘ　ＴＥ／　ｌ０ｍＭ　ＮａＣ１中７６５ μｇ／ｍｌの濃度てｔ　ＲＮＡの原液を調製した。２００μｌのｔＲＮＡ溶液（ １５３μｇ）を添加して各化合物の最終濃度か１００μｇ／ｍｌになるようにし て、各化合物の相応の量を別個の反応管中で準備した。実験において’Ｈ−ＡＭ ＩＰ及び”Ｈ−ＡＭＩＰが使用された：使用されたＢＩＯＭＩＰはラベルされて Ｉ、ｚなかった。次いで、２５°Ｃで各反応管をＣＢ−Ｉ［［デノくイスにおい て３０分間照射した。同一の未照射の反応混合物は各化合物に対するコントロー ルとして使用した。照射した後で、各混合物はＣＨＣｌ３（４Ｘ２００μｌ）で 抽出し、沈澱させた（×２）。ベレットをＩＸＴＥ中に再懸濁し、次のようにし て結合レベルを測定した。２個のラベルされた化合物（’　Ｈ−ＡＭＤＭ　ＩＰ 及び”Ｈ−ＡＭＩＰ）に関して、核酸濃度は光学的に測定し、放射能は原液のア リコートをシンチレーション計測して測定した。化合物の結合は次のようにして 計算した：試　料　付加物：　ＲＮＡ塩基 ＡＭＩＰコントロール　１　：　５１０００ＡＭＩＰ　＋　ｈｖ　１　：　１８ ＡＭＤＭＩＰコントロール　１　：　１５０００ＡＭＤＭＩＰ　＋　ｈｖ　１　 ：　１８ＢＩＯＶＩＰのｔＲＮＡへの結合か生じたか否かを測定するためには、 化合物のビオチン基を検出する非放射性フォーマットを使用することが必要であ った。市販のキット（“ＢｌｕＧｅｎｅ”；　ＢＲＬ）をこの目的で使用した。

コントロールＤＮＡ　（キットとともに提供された）とＢｊＯＭＩＰ処理したｔ ＲＮＡの両方を検出するために、キットの使用説明書に従った。２０．１０．　 ５．　２又はＯｐｇのコントロールＤＮＡ及びｌμｇとｌＯμｇの間のＢＩＯＭ ＩＰ処理ｔＲＮＡ　（＋／−光線）を乾燥したニトロセルロース膜上にスポット し、８０°Ｃで２時間真空下に焼きつけて固定した。プロットを発現させ、次の 結果を確認した。すべてのコントロールＤＮＡ試料は予期された色パターンを与 え、２μｇの試料でさえプロット上で視覚できた。未照射のコントロールからは 何らのシグナルもなかったが、照射した試料に対してはシグナルの明白な増大（ １μｇ＜５μｇ＜１０μｇ）が見られた。このことはＢＩＯＭＩＰがｔＲＮＡに 共有結合したことを示していた。

実施例４２ 鋳型依存性酵素的合成 第２６図に示されている配列は、通常の７１−ｍａｒ又は部位特異的に置かれた ブソラレン又はイソプソラレンモノ付加物を含む同一の７１−ｍａｒのいずれか の合成において使用される数個のオリゴヌクレオチドを記載している。７１−ｍ ａｒはヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）配列のサブ配列である。（ＨＩＶ　ＤＮ Ａ系は継続中の出願第２２５．７２５号に記載されている。）ＳＫ−３９は７１ −ｍｅｒの３′末端に相補的である°プライマー　オリゴヌクレオチドである。

このプライマー　オリゴヌクレオチドは、７１−ｍｅｒの相補鎖を製造するため に７１−ｍｅｒ鋳型上で伸長されつる。

第２７図はモノ付加した鋳型が導かれる方法を示している。部位特異的なモノ付 加物を弧（ｆする７１−ｍｅｒの製造は、１）同じ非修飾の１５−ｍｅｒ（）Ｉ ＲＩ−４２）からの異なった１５−ｍｅｒモノ付加物の製造、及び２）副木（ｓ ｐｌｉｎｔ）とし２．て２５　ｍｃｌ’Ａ’リゴスクトオチド（ＨＲＩ−４５） を使用し２て同１；、５６−ｍｅｒ−伸長オリゴｌり１，２・オヂド”　（ＨＲ Ｉ　１０２）　！７異＝）だ１５−　ｍｅｒモノ付加物を連結反応さぺることを 含む。第２７図の矢印は合成の方向を示しこおり、モノ付加物はす１１ゴー、ク ーに垂直な短い線により示される。各’７］ｍｅｒ７ｌ付加物は５゛末端から１ ３６塩基Ｊヌトの塩基部位に５″Ｉの付加物を存するか、−亡、ノ付加物の正確 な部位を示Ｖことは意図されない。

＋５−ｍｅｒｔ・１加物を得イ）ため（−５１５−ｍｅｒはハ・イブリグイセ− ジノン条件下でブソラＬ・ン又はイソゴソラし〕・とどもに相補的の１０−ｍｅ ｒとインキュベートし７た。１次いで、モノ付加した１５−ｍｅｒをうるために 、５：の混合物を照射Ｉ７た。本発明は力・〕・ブプリンの正確な機序を知るこ とに左右さ才ｌないが、一般には、１０−ｍｅｒは１０−ｍｅｒ／　１５−ｍｅ ｒハイブリッドにより形成された一重鎖・うせん内の１一つのＴｐＡ部位にイソ ブソラＬノンを導くと考えろわる６　１ｕｌｌのブ゛ノラＬ・ンＺはイソブ゛ノ ラレンモ２．′付加物を・も一つ＋５−ｍｅｒを急有す゛ると思わわる＋（ｐｌ 、Ｃビーンの分離の後て１、−一オ］らの１５−ｍｅｒ千ノ付加物は、ｊご１ｊ ７！ラーゼ鋳撃として使用するｔ−めのモノ付加さね４−ｍ４−ｍ７ｌを得るた 、ｖ）に、５６−ｍｅｒ伸長物と連結反応させン”二っそわゆえ、連結反応は３ 個のオリゴヌクじオヂドを使用した　特定のプノラＬ、ン又はイソブソ→レンを モノ付加した１５−ｍｅｒ、５６−ｍｅｒ伸長物役び２５−ｍｅｒ副木。

連結反応複合物はハイブリ・・Ｚド形成され、次いて連結反応された。

この連結反応生成物は、次いて、変性ＰＡＧＥにより弔−の帯とし７て分離した 。

１個のモノ付加物を含有する高度に精製された７］−ｍｅｒを提供するためには 、連結反応丁Ｎｔ：’：先立ち高度に精製した１５−　ｍｅｒ　−ＦＥノ付加物 を提供することが必要であった。、ごれはＰＡＧＥによりＨＰＬ　Ｃ精製し、た 千７ノ付加された１５−ｔｎｅｔ−を再精製することにより達成されたつ５二の よう（ニジ、て、本質的に千７）付加さねていないすべての１．５−ｍｅｒを連 結反応前に除いた。　１５−ｍｅｒモノ付加物を非修飾の１５−ｍｅｔ−から分 離する、丁とはＰＡＧＥにより容易に達成された（一方、同一の手法は対応する 非修飾の７１−ｍｅｒとモ、／付加されｔ、＝７１−ｍｅｒ配列の分離に対］７ ては作動でない）、、二二のようにして、きわめて純粋なモ７ノ付加された７１ −ｍｅｒｔ−プライマー伸長反応のために製造した。−１−ノ付加さｒｔｆ：’ １１　ｍｅｒｉｔ　Ｃ非修１ｆｊ７１−ｍｑｒと同ｔＪ！＝’、）−１以下の実 施例４３−４７ｉ″おいて鋳型依存性酵素的伸長実験におい丁使用されろ、。

実施例４３ 鋳型依存性酵素的合成 二の実験に２　：、；いて、モノ付加された７１−ｍｅｒは（非修飾の７Ｌ−ｍ ｅｔ１！、−同様に）鋳型依存性酵素的伸長ｉ−おいで１ｆ用された。ＡＭＩＰ 、、　ＡＭＤＭＩＰ、＆びＭＩＰ　７１−ｍｅｒモノ付加物は実施例４２のよう に〔７］＝製造されｆ、為第２８図は、伸長が行われる態様を示しでいる。７１ ｍｅｒ　（）ｌＲＩ５５）の；３末端はプライマー（ＳＫ−３９）　（第２６図 を参照）に相補的である二、ｌ−そ注意さノーまたい。伸長実駁・のぞれぞれは ３７°Ｃ−ｒ　ｉｌ、５ヌは１５分実施された。それぞれの反応は鏡型とデオキ シリボヌク１、・オシド５−トリホスフェ−１−（ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄ ＣＴＰ及びｔｉＴＴＰは総称してｄＮＴＰとして略す）を供給し、最後に特定の ポリメラーゼを加える二とにより開始する。検出のために、ブラ、イマー伸長反 応は、５゛３２Ｐ−ラベル化ブラ、イマーを使用した。反応はＥＤＴＡを添加し て停止した。分析は変性ＰＡＧＥ続いてオートラジオグラフィーにより行った。

異ったポリメラーゼのそれぞれに対する反応条件は次のとおりてあった。

１）Ｅ、コリ　ＤＮＡポリメラーゼ： ５０ｍＭ　Ｉ−リス緩衝液（Ｉ）Ｈ７，５）　；　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２：　Ｉ 　ｍＭ　ＤＴＴ）　；　５０ｕｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　；　１ ００　μＭ　ｄＮＴＰ　：　３単位のポリメラーゼ（２５μｌ容積’）　：　Ｉ 　Ｘ　１０−’Ｍプライマー；　Ｉ　Ｘ　１ｏ＝ａ　７１（Ｅ、コリ　ポリメラ ーゼの代わりに３単位のフレノウを加えることを除きＥ、コリのときと同一）。

３）Ｔ４ポリメラーゼ ５０ｍＭ　トリス緩衝液（ｐＨ８，０）　＋　５ｄ　ＭｇＣ１ｚ　；　５ｍＭ　 ＤＴＴ；　５０ｍＭＫＣｌ　、　５０１１ｇ／ｍｌ　ＢＳＡ　＋　５単位のＴ４ ポリメラーゼ：４）逆転写酵素： ５０ｍＭ　ｌ・リス緩衝液（ｐＨ８，０）　；　５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　；　５ｍ Ｍ　ＤＴＴ；　５０ｍＭＫＣｌ　；　５０ｕ　ｇ／ｍｌ　ＢＳＡ　；　１００μ Ｍ　ｄＮＴＰ　；　２０単位の逆転写酵素。

ＭＩＰ、　ＡＭＩＰ及びＡＭＤＭｉＰの結果はそれぞれ第２９．３０及び３１図 に示されている。ＶＩＰとＡＭＩＰ付加物はいずれもＴ４ポリメラーぜに対して 完璧な停止剤のようにみえるか、Ｅ、コリＤＮＡポリメラーゼ及びフレノウに対 しては完璧な停止剤とは思われない。、ＡＭＤＭＩＰ付加物は試験したすべての ポリメラーゼに対して完全な停止剤であると思われる。

実施例４４ 鋳型依存性酵素的合成 この実験において、モノ付加された７１−ｍｅｒを（非修飾の７１−ｍｅｒと同 様）硫型−依存性酵素的伸長において使用した。ＡＭＩＰ、　ＡＭＤＭＩＰ、及 びＭＩＰ　７１−ｍｅｒモノ付加物は、実施例４２におけると同様にして製造し た。この実験においては、テルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａで４ｕ ａ−ｔ　１ｃｕｓ）から分離した熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑ　Ｉ 　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ ）イソブソラレンを過ぎて読み取る能力について調査した以外は、実施例４３と 同様にして伸長反応を実施した。

反応混合物は全量８０μｌてあり、これは、ｔｘ’ｒａｑ緩衝液、２００ＩＪＭ ずつのｄＮＴＰ、反応容量８ｌ当たり０．０５単位のＴａｑ　：　７１−ｍｅｒ ＭＡ　Ｉ　Ｘｌ０−’Ｍ；”Ｐ−ラベル化５Ｋ−３９１Ｘ　１０−”Ｍから成る ものであ−っだ。各反応はＴａｑポリメラーゼを除いてすべて同様にセットした 。最初に試料は９５℃で５分間加熱し、次いで、５５℃で３分間インキュベート した。伸長反応はＴａｑポリメラーゼを添加して開始した。指示された時刻（０ ，５，１，０，５，０分）において、反応を停止するために２０μｌの反応混合 物を０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　１μｍを含有する管に移した。すべての生成物は２０ ９６ポリアクリルアミド、′γＭ尿素ゲル、次いでオートラジオグラフィー上で 分析した。

結果は、第３２図に示されている。コントロール鋳型（ＨＲＩ　５５）をちつレ ーンは、全長７１−ｍｅｒ伸長生成物の位置を示し７ている。各時間は重複して 測定しｔ：。伸長反応は最も早い時報（３０秒）Ｔ完了するように思ｔ）れる。

イソブソラＩノン（ＭＩＰ、　ＡＭＩＰ、　及びＡＭＤＭＩＰ）を含有するター ゲットをもつレーンは、全長７１−ｍｅｒ生成物よりも短い位置で停止すること を示している。

予想外にも、各付加物は７１−ｍａｒの配列内で異なった位置にて停止を生ずる 。ＶＩＰ停止は、モノ付加物を生成するために使用された１０−ｍａｒにおける ＴｐＡ配列とほぼ同じ位置であるように思われる。

ＡＭＩＰは、ＶＩＰ停止に比較して異なった位置で、複数の停止を有する。ＡＭ ＤＭｒＰは全く異なった停止を有している。ＡＭＩＰとＡＭＤＭＩＰ停止を有す る最長の伸長生成物は、イソブソラレンが多分１０−ｍａｒ／＋５−ｍａｒ相互 作用領域の外側の最初の１５−ｍｅｒに存在することを示している。このことは イソブソラレンはブソラレン誘導体について轄告されている規則には必ずしも従 わないこと（即ち、挿入箇所か必要であり、更に、ＴｐＡ部位が好ましいこと） を示している。

実施例４５ 鋳型依存性酵素的合成 この実験では、モノ付加物によるＴａｑポリメラーゼの阻害は完全であるか、又 は、モノ付加物は酵素によりバイパスされうるか否かを検討した。

バイパス合成の方法をみるために、７１−ｍａｒ鋳型とプライマーの伸長反応を 循環させることか必要である。この場合の循環は、プライマーを７１−ｍａｒ鋳 型と混合すること、Ｔａｑポリメラーゼと相応の試薬を加えること、伸長するこ と、鎖分離を引き起こすために加熱すること、７１−ｍａｒ鋳型へのプライマー の再アニーリング、再度の伸長、及び続いての鎖分離を行うことから成る。この 方法は、必要に応じて繰り返すことができる。このプロセスの間、７１−ｍｅｒ 鋳型の相補鎖のみが合成されている。（両方の鎖が合成され、幾何級数的に蓄積 していくのに対比して）これは熱循環の数とともに直線的に蓄積している。

各々のモノ付加物に対して３個の試料が使用され、各試料は異なった条件で試験 されたことを除いて、鋳型と反応条件は前述の実施例４４と同様にして実施した ： 試料（１）：各モノ付加物に対する１つの試料は実施例４３と同じように５５℃ で伸長させるために使用した：試料（２）：各モノ付加物に対する１つの試料は 次の工程順で伸長を実施するために使用した＝９５°Ｃで変性させる；５５°Ｃ で３０秒間インキュベートする；５５℃にて３分間Ｔａｑポリメラーゼを添加す る；反応物を７°Ｃで１分間冷却する１９５°Ｃで１分間ＥＤＴＡにより反応を 停止させる： 試料（３）：各モノ付加物に対する１つの試料は、次の工程を９回繰り返すこと により伸長を実施するために使用した＝９５°Ｃで変性させる；５５℃で３０秒 間インキュベートする；５５°Ｃにて３分間Ｔａｑポリメラーゼを添加する；反 応物を７°Ｃで１分間冷却する。

最後に、反応は９５°Ｃで１分間ＥＤＴＡにて停止する。

結果は第３３図に示されている。５５°Ｃ又はｌサイクルの伸長において、読み 通しはないように思われる（即ち、Ｔａｑポリメラーゼは完全に阻害される）。

９サイクル後には、全長伸長生成物の証拠が存在する。しかしながら、これらの 結果が実際の読み通しを示すのか、又は、単にモノ付加されていない７１−ｍａ ｒ混入物の伸長であるのか、明らかでない。

実施例４６ 鋳型依存性酵素的合成 Ｔａｑポリメラーゼの阻害は完全であるか、又は、阻害は克服されるのかを検討 した。実施例４５に記載された結果はバイパスが生ずることを示しているが（イ ソブソラレンがモノ付加した７１〜ｍａｒ鋳型を使用すると、１０サイクル後に 全長伸長生成物が製造された）、この結果はモノ付加物の実際のバイパスによる ものなのか、又は、混入物として存在したモノ付加されていない７１−＋ｎｅｒ の伸長によるものであったのかは明らかでなかった。モノ付加されていない７１ −ｍａｒは、７１−ｍｅｒの調製中、連結反応前に非修飾の１５−　ｍｅｒから １５−ｍｅｒモノ付加物を不完全に分離したために存在し得たのかもしれない（ 実施例４２参照）。

この問題を更に検討するために、新しい５−ＭＩＰモノ付加された７１−ｍａｒ か、）ＩＰＬＣ精製５−ＭＩＰモノ付加された１５−ｍｅｒをＰＡＧＥで再精製 することにより製造された。このようにして、より多くの非修飾の１５−ｍａｒ を連結反応前に除いた。次いで、精製した７１−ｍａｒを実施例４５に記載され ているとおりにして、伸長実験において鋳型として使用した。ＩＯサイクル後に おいて、依然として伸長生成物の証拠があった（第３４図）。バンドを切りとっ てカウントすると、この全長伸長生成物が、伸長した全生成物の２．３％を構成 していることが見い出された（即ち、９７．７％の伸長生成物は末端切断型てあ った）。

実施例４７ 鋳型依存性酵素的合成 実施例４３．４４及び４５から、イソプソラレンはポリメラーゼ阻害のために使 用できることが明らかである。イソブソラレンは二重鎖核酸とモノ付加物を形成 するが、その角構造のゆえに架橋を生じないことに留意することも重要である。

このために、これらのイソブソラレン修飾−重鎖はハイブリダイゼーション方法 により検出しうる状態で留まっている。一方、ある状態では、ブソラレンにより 複製を阻止することも有用であるかもしれない。この実験は、ＨｒＶ鋳型におい てＴａｑポリメラーゼを阻害するＨＭＴ能力を試験する。

ＨＭＴを除き、モノ付加された７１−ｍａｒは記述したようにして構築された。

伸長が実施され、前述のようにしてＰＡＧＥで分析した。Ｔａｑポリメラーゼに 対する結果は第３５図に示されている。ＨＭＴモノ付加物は、明らかにＴａｑポ リメラーゼを停止する。全長７１−ｎ＋ｅｒは製造されず、かつ、ＨＭＴ付加物 の位置に相応する、より短かい鎖が製造された。

実施例４８ 鋳型依存性酵素的合成 この実験においては、ＡＭＩＰ、　ＡＭＤＭＩＰ及びＭＩＰが７１−ｍａｒの複 製を阻止する能力を、７１−ｍａｒに各々の化合物をランダムに付加することに より検討した。もちろん、付加は−又は複数の付加物か核酸のいずれか一方の鎖 と形成され得るという意味においてランダムでありうる。イソブソラレンの実際 の位置は、特定部位の優先的結合により（例えば、Ａ：Ｔ）、支配されつる。ラ ンダム付加物による阻止に加えて、種々のイソブソラレンの光生成物は抑制効果 を提供しているかもしれない。光生成物の作用と７１−ｍａｒ鋳型上の共有結合 付加物の作用とを区別する試みは、この実験系ではなされなかった。

これらの実験において、７１−ｍｅｒ鋳型（１０−”Ｍ）は２”Ｐ−ＳＫ−３９ （１０−っで開始し、全量２０μｌ中でＴａｑポリメラーゼで伸長させた。ｄＮ ＴＰ濃度は２００ＩＩＭであった。対照試料において７１−ｍｅｒ、プライマー 及びｄＮＴＰは全量１８μｌのＴａｑ緩衝液中で混合した。これらの試料は最初 に９５°Ｃて５分間変性し、次いで５５°Ｃで３分間平衡化させた。

Ｔａｑ酵素（０，５単位）を加え、伸長反応は５５°Ｃて５分間実施した。

反応はＥＤＴＡでｌｏｍＭの溶液を製造することにより停止した。他のセットの 試料では、１０μｌ中の７１−ｍｅｒをＡＭＩＰ（２００１１ｇ／ｍ１．）、Ａ ＭＤＭ［Ｐ（２００μｇ／ｍｌ）又はＭＩＰ（６０ｕ　ｇ／ｍｌ）のいずれがと 混合した。これらの試料の半分はＣＥ〜■デバイスで２５゛Ｃにて１５分間照射 した。他の半分は対照として暗室に保持した。これらの試料は前述のようにプラ イマー及びｄＮＴＰと混合し、前に述べた試料と同様にして熱プロフィール及び 伸長反応を行なった。結果はＰＡＧＥにより検討した。

伸長生成物バンドをオートラジオゲラフィーで確認し、切り取り、計測した（デ ータは示されていない）。

イソプ゛ノラレンを含有する未照射の対照は、全長伸長生成物を生じた。末端切 断型の生成物は観測さねなかった。これらの伸長生成物の定量によれば、イソブ ソラレンを含まない試料中て見らねた伸長生成物の量に等価であり、こねはプラ イマーの約８９６が伸長したものに相当した。

ＡＭＩＰ又はＡＭＤＭＩＰを含有しない照射試料は全く伸長しながった。

ＭＡＰを含有する照射試料は全長伸長生成物と少量の末端切断型の生成物を生し た。照々イされたＭＡＰを有する全長生成物の量は、対照試料の半分てあった。

実施例４９ 鋳型依存性酵素的合成 この実験においては、２一つの異な一つだフェニルアシド誘導体であるフすトビ オチン（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓ）及びモノアジドエチジウムクロリドについて 、それの７１−ｍｅｒの複製を阻止する能力を、各々の化合物を７１−ｍｅｒに ランダムに付加することにより検討した。再度、付加は、−又は複数の付加物か 核酸のいずれか一方の鎖と形成され得るという意味においてランダムであり得る 。これらの化合物の実際の配置は特定部位（例えば、ＡＣＴ）における優先的結 合により支配され得る。ランダム付加物の阻止に加えて、光生成物による阻止も あり得る。実施例４８と同様に、７１−ｍａｒに対する光反応性化合物の共有結 合の影響と光生成物の影響をわける試みは何もしなかった。

フォトビオチンとモノアジドエチジウムクロリドの２種の化合物は異なるスペク トル特性を有する。これらの化合物を活性化するために、単一光源を使用して２ つの異なった波長領域が選択された（ゼネラルエレクトリックサンランプ、Ｒ３ Ｍ型、２７５ワツト）。光源は、照射される試料を含むキャップのしていないエ ッペンドルフ管から約１０ｃｍのところに配置した。照射する間、試料は氷上に 保持した。ランプと試料の間にバイレックス皿を置いた。

フ才ｌ・ビチオンを含有する試料に対して、赤外線照射を除去するのを助けるた めにパイレックス皿に２．５ｃｍの水を添加した。試料は１５分間照射した。

モノアジドエチジウムクロリドを含有する試料に対しては、２．９ＭのＮａＮ０ ｚ水溶液２．５ｃｍを使用して４００μｍ以下の波長を濾光した。短波長（即ち 、４００μｍより短い波長）の除去は、モノアジトエチジウｊ４　クロリドを使 用するためには必要である。この化合物をより短波長で照射すると、非活性形− ＼の転換がおこる（データは示されていない）。従っ′ｒ：４００ｎｍ以下の波 長は、：の化合物とともに使用することは望ましくない。

この実験において、１ＯＩＩ中の７１−ｍｅｒ鋳型（２ＸＩＯ−’九（）を光反 応性化合物のフォトビオチン（６Ｘ　１０−＠Ｍ）又はモノアジトエチシウム（ １，４Ｘ　１０−’Ｍ）のいずれかと混合した。これらの試料の半分は、各々の 特定の光反応性化合物に相当する波長で１５分間氷上にて照射した。試料の他の 半分は、対照として暗室に保持した。光反応性化合物を全く含有しない試料は適 所の水フィルターにより露光した。”　Ｐ−３Ｋ−３９プライマー（Ｉ　Ｘ　１ ０−”Ｍ）、ｄＮＴＰ（２００μＭ）及び追加の緩衝液を加えて、１８Ｉｌｌの 容積とした。次いで試料は９５℃で５分間変性させ、５５°Ｃて３分間平衡化し また。Ｔａｑポリメラーゼを添加し、伸長は５５°Ｃで５分間行った。試料を１ ０ｍＭのＥＤＴＡにして反応を停止した。生成物はＰＡＧＥにより試験した（デ ータは示されていない）。光反応性化合物を含まない、光に加えて光反応性化合 物を含まない、及びフォトビオチン（暗対照）を含むず−・ての対照は同量の全 長さの伸長生成物を示しまた。これらの試料に関しては、末端切断型の生成物は 観察されなかった。モノアジドエチジウムクロリドを有する暗対照は伸長を阻ｌ Ｊ：ｔ、た。これに対Ｉ〜２で、フすトビオチンは照射の後においてのみ阻止を 示した。

実施例５０ 鋳型依存性酵素的合成 この実施例は、ＡＭ］’ｌｌｉ！ＩＰかプライマー伸長会阻止することを示して いる。この実施例は、ＡＭＤＭＩＰの存在下′Ｃ７１−ｍｅｒか照射され、次い で伸長されるとき、光生成物の阻止効果はすべての抑制を説明するのに十分ては ないことも示している。

Ｔａｑ緩衝液中で７１−ｍａｒを調製した。試料は次のようにして調製された＝ １）暗対照試料は活性光線に当てなかった；２）２００μｇ／ｍｌのＡＭＩＩＶ ＩＰの存在下で１０μ＋の７１−ｍｅｒ試料（２Ｘ　１０−’Ｍ）を照射した： および３　）　２００μｇ／ｍｌのＡＭＤＭＩＰ溶液の１０μｌの試料を７１− ｍｅｒの標的の不在下で照射した。照射はすへて２５°においてＣＢ−Ｉデバイ スて実施した。上記の試料を調製した後、１セツトの暗対照試料に未照射ＡＭｒ １ＭＩＰを添加した。他のセットの暗対照は照射したＡＭＤＭＩＰを受け取った 。次いで、”Ｐ−３Ｋ−３９プライマー及びｄＮＴＰをずべての試料に添加し、 容積を１８μｍに調節した。これらの試料は９５°Ｃで５分間変性させ、５５° Ｃで３分間平衡化させた。Ｔａｑポリメラーゼを添加し、伸長反応は５分間実施 した。試料をＥＤＴＡで１０ｍＭとして反応を停止させた。全ての反応剤の最終 製産は伸長反応の間板下のとおりであった： 緩衝液　１　ｘ　Ｔａｑ Ｔａｑポリメラーゼ　０．５単位 ｄＮＴＰ　２００μＭ ”Ｐ−８Ｋ　−３９プライマー　Ｉ　Ｘｌ０−”Ｍ７１−ｍｅｒ標的　ＩＸＩＯ ｌｌＭ ＡＭＤＭＩＰ　１００μｇ／　［１１１結果は、ＰＡＧＥにより分析した（デー タは示されていない）。オートラジオグラフを肉眼で確認したところ、暗対照は 全長伸長生成物を製造しｌ：ことか示された。ＡＭＤＭＩＰの存在下て照射した ７１ｍｅｒは伸長生成物を全く生成しなかった。ＡＭＤＭｆＰ光生成物と未照射 の７１−ｍｅｒを含有する試料は全長伸長生成物を生成したが、暗対照試料に見 られるレベルの約ｌＯ％であった。幾らかの伸長生成物が光生成物の存在下で製 造され、直接、照射した７１−ｍｅｒでは製造されないという観察は、光生成物 の作用とＡＭＤＭＩＰの鋳型オリゴヌクレオチドへの共有的付加は相乗的であり 得るということを示している。

実施例５１ 増幅後失活 第３６図は、ＰＣＲ増幅手法で使用できる一連のオリゴヌクレオチドを記載して いる。２種のプライマーはＨＩＶゲノムのセグメントに相補的であると記載され ている（ＳＫ−３８及び５Ｋ−３９）。各プライマーは、ＨＩＶゲノムの１１５ 塩基対の長さのセグメントの二本鎖の各一本の５゛末端の配列に相補的である。

第３６図は、　１１５−ｍｅｒ　ＲＣＲ生成物の一方の鎖にハイブリダイズ及び 架橋しうる架橋可能なプローブ分子を記載している。Ｔａｑポリメラーゼ、相応 の試薬及びＳＫ　−３８／ＳＫ　−３９が結合する少なくとも１１５−ｍｅｒセ グメントを含有する標的のポリヌクレオチドの存在下で５Ｋ−３８及び５Ｋ−３ ９を反復熱サイクルを実施すると、１１５−ｍａｒの両方の鎖の合成かなされる であろう。それゆえ、ＰＣＲ増幅は、１１５−ｍａｒの両方の鎖を幾何級数的に 蓄積しなから行われる。これは第２６図に記載されたオリゴヌクレオチドとは対 照的である。第２６図には、７１−ｍｅｒ標的オリゴヌクレオチド（ＨＲＩ−５ ５）の３−末端にハイブリダイズしうる唯一のプライマー（ＳＫ−３９）か記載 されている。第２６図に記載されているオリゴヌクレオチド系における第２のプ ライマーの欠除は、この系が幾何級数的に増幅されることを防止する。Ｔａｑポ リメラーゼ及び相応の試薬の存在下におけるＨＲｌ−５５及び５Ｋ−３９の反復 熱サイクルは、ＨＲＩ−５５の相補鎖の直線的蓄積を生ずるであろう。

第３６図においてＨＩＶ　ＤＮＡシステムに対して記載されたシステムかＰＣＲ 失活に対して使用された。第３６図において、矢印はプライマーに対するポリメ ラーゼ伸長方向を示す。ＳＫ−１９−ＭＡ上でのＨＭＴモノ付加物は（）により 示されている。ブロックはＨＩＶのＤＮＡ配列における天然の保存された５−Ｔ ｐＡ−３°架橋部位を表わす。

ＰＣＲ増幅は、多数の変性及び複製サイクルを必要とする。変性は多くの場合好 適には熱によりなされるから、理想的にはポリメラーゼは熱安定性である。Ｋ、 Ｂ、　Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４．６８３．１９５号及び第４．６８３．２ ０２号を参照されたい（参考として挿入される。）Ｔａｑ　Ｉ　ＤＮＡポリメラ ーゼ、即ちＴｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓから分離した熱安定性ＤＮＡポ リメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ社、Ｅｍｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、　ＣＡ）がすべての増幅 のために使用された。

他に示されていない場合、ＰＣＲ増幅方法は第４図の広範な時間の経過順の手順 に従う：ｌ）鋳型の製造、２）増幅サイクル、及び３）検出。

ＡＭＤＭＩＰ光生成物は別個の容器内の１ｘＴａｑ緩衝液（５０ｍＭ　ＫＣＩ。

２．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ　）リス、　ｐＨ８，５，２００μｇ／ｍｌ ゼラチン）中で、室温（ＲＴ）にて１５分間（ＣＥ−ＩＩ［デバイスを使用して ）照射することにより製造した。ＰＣＲ生成物のコピーの１０’希釈物の１μｌ の了りコートに、ＡＭＤＭＩ’Ｐ光生成物と未照射化合物のアリコートを（ピペ ットで）　５０．１００．２００及び３００μｇ／ｍｌで添加した。ＰＣＲ生成 物は、ａ）鋳型を製造すること、ｂ）鋳型を供給すること、Ｃ）ＰＣＲ試薬を供 給すること、ｄ）ポリメラーゼを供給すること、ｅ）ＰＣＲ試薬、鋳型及びポリ メラーゼを混合してＰＣＲを開始させること、ｆ）ＰＣＲ生成物を合成させるた めに循環させること、により提供される。

工程ａ）：鋳型製造。鋳型は実際の患者の試料に由来するものであった。フィコ ール−ヒバツク（Ｆｉｃｏｌ　１−Ｈｙｐａｑｕｅ）分離末梢血液単核細胞（Ｐ ＢＭＣ）を長期的なエイズ研究において登録された個人から調製した。１０％の ウシ胎児血清を含有するＲＰＭｒ　１０ｍ１に約１×１０１個の細胞を添加した 。細胞を５分間２００Ｘｇで遠心させてペレットとし、１０ｍ１のＰＢＳて２度 洗った。５０ｍＭ　ＫＣＩ、ｌ０ｍＭ　）リス−塩酸（＋’８８．３）、　２． ５ｍＭＭｇＣ１ｚの溶液に細胞ペレットを再懸濁し、次いで、０．５％のＴｗｅ ｅｎ　２０と０．５％のＮＰ４０を添加して溶解した。

試料は６０μｇ／ｍｌのブロティナーゼＫ（シグマ）により６０℃で１時間消化 した。プロティナーゼにの不活化は、試料を９５°Ｃで１０分間加熱することに より達成される。

工程ｂ）：鋳型の供給。反応のために、後の増幅用の反応容器（０，５ｍｌエッ ペンドルフ管）内にｌＯμｌの鋳型（約３Ｘ１０’個の細胞に相当する）を置く 。

工程Ｃ）、ｄ）、ｅ）及びｆ）。ＰＣＲ試薬か供給され、混合されて最終の容積 を２０μｌにし、前述のようにして循環させた。

失活用反応剤としての光生成物の効率を評価するために、後続のポリメラーゼ・ チェイン・リアクションをα−”Ｐ−ｄＣＴＰの存在下に３０サイクル実施した 。ＰＣＲ反応生成物は、１２％アクリルアミド／８Ｍ尿素ゲルで処理し、次いで 、オートラジオグラフィーにより視覚で試験した。結果は第３７図に示されてい る。照射された化合物（即ち、光生成物）は、５０μｇ／［１１１以上の濃度で 完全な失活化を示している（即ち、ＰＣＲ生成物の証拠は何もない）（レーン４ ．６及び８）；光生成物は５０μｇ／ｍｌでは、部分的な失活を示す（即ち、幾 分かのＰＣＲ生成物の証拠かある）（レーン２）。未照射の化合物は（即ち対照 ）、何らの失活も示さない（レーンｌ、３．５及び７）。

広範に定義されたＰＣＲの光生成物失活に対する濃度スペクトルに関して、ＰＣ Ｒの光生成物失活のためのカットオフをより特異的に示すために更なる実験を行 った。再度、１ＸＴａｑ緩衝液中でＡＭＤＭＩＰを室温において１５分間別々に 照射することにより、ＡＭＤＭＩＰ光生成物を製造した（ＣＥ−１［ｒデバイス による）。しかしなから、今回は、ＡＭＤＭＩＰ光生成物の了りコートは、０． ２５から５０μｇ／ｍｌの間の濃度を与えるためにＰＣＲ生成物に添加された。

再度、この方法による失活の効率を評価するために、後続のポリメラーゼ・チェ イン・リアクションはα−”Ｐ−ｄＣＴＰの存在下に３０サイクル実施した。次 いで、ＰＣＲ生成物をゲルにかけ（上述のとおり）、バンドを切り（オートラジ オグラフィーで検出した）、市販のシンチレーションカウンターでこのバンドを 計測することにより、定量した。結果は、第３８図にプロットされている。

第３８図は、５μｇ／ｍｌ程の少量の光生成物がＰＣＲ生成物の量において５０ ％もの減少を生じつるということを示している（ＤＰＭにより測定）。一方、０ ．２５μｇ／ｍｌては極めてわずかなＰＣＲ生成物の減少が見られる。０．２５ μｇ／ｍ１以下の光生成物の濃度では、ＰＣＲの光生成物失活は有意ではない。

実施例５２ 増幅後失活 ＰＣＲの光生成物失活は避けるのが望ましいかもしれない。他の失活化法−光生 成物失活よりも好ましい方法−は、１）光生成物失活が生じ得るよりも低い光反 応性化合物濃度で操作することにより、又は２）より少ない光生成物か産生され る濃度を選ぶことにより、光生成物失活の干渉なしに使用され得る。

この実験では、より少ない光生成物か産生された条件を選んだ。

これらの条件は、ＰＴｒ光源でのＡＭＤＭ［Ｐ照射を含む。より多くの無傷のＡ ＭＤＭＩＰはＰＴＩ光源ての照射後において残在している（ＣＥ−Ｉデバイスで のＡＭＤＭＩＰの照射に対比。第２３図参照）。

１ｘＴａｑ緩衝液中のＡＭＤＭＩＰをＰＴＩ光源において室温で１５分間照射し た。対照として、ＩＸＴａｑＸＴａ中のＡＭＤＭＩＰを室温でＣＥ−Ｉデバイス により１５分間照射した。両方の場合において、光生成物は、ＰＣＲ生成物の混 合物の１０１希釈物の１μｍアリコートに対して、最終濃度か１００μｌ／ｍｌ 光生成物となるように加えた。対照として、未照射ＡＭＤＭＩＰを光生成物と同 じ濃度で同様のＰＣＲ生成物の混合物に添加した。ＰＣＲ生成物は先に記載した とおりに供給された。

この失活方法の効率を評価するために、α−’　”Ｐ　−ｄＣＴＰの存在下で新 しいＰＣＲ反応を３０サイクル実施した。実施例５１（第３７図）のようにして ゲル上てＰＣＲ生成物を試験し、ゲルをオートラジオグラフィーにかけた。結果 は第３９図に示されている。

両方の場合に、未照射のＡＭＤＭＩＰか使用された場合には（第３９図、レーン １及び３）、ＰＣＲ生成物は明らかに存在している。ＣＥ−ＩＩＩデバイス内で 照射されたＡＭＤＭＩＰか使用される場合には、より多くの失活か観察される。

これに対して、ＰＴＩデバイス内で照射されたＡＭＤＭＩＰか使用される場合は 、はとんど失活は観察されない。

ＰＴＩ光源で照射されたＡＭＤＭＩＰは未照射のＡＭＤＭＩＰ（対照）　同様の 結果を示すが、これは、光生成物の効果かＰＣＲアッセイにより確認される以下 の濃度であることを示唆している。

２個の光源の間の結果の劇的な差異は、ＣＥ〜■源はＰＴＩ源（３２０μｍカッ トオフ）に比較してより短かい波長（３００μｍカットオフ）を有するという事 実によるのかもしれない、、、ＡＭＤＭＩＰの吸収スペクトルは、ＡＭＤＭｒＰ かＣＥ−Ｉ［［源により提供される一層幅広の光窓ではより反応性であるかもし れないことを示している。

実施例５３ 増幅後失活 ＰＣＲに対するイソブソラレンの増大する濃度が存在することの効果を体系的に 評価するために、鋳型としての１０７コピーの）ＩＩＶ１１５−ｍｅｒにＡＭＤ ＭＩＰ（０，１００，２００，４００μｇ／ｍｌ）を添加した。次いで、α−・ ３２Ｐ−ｄＣＴＰの存在下でＰＣＲを３０サイクル実施した。ＰＣＲ生成物は変 性ポリアクリルアミドゲル上で操作し、オートラジオグラフ処理した。その後、 バンドを切り取り、カウントした。結果は次のとおりであった： ［ＡＭＤＭＩＰ］　カランｌ−（ＣＰＭ）この結果は、未照射のイソブソラレン はＰＣＲ失活を起こさないことを示している。実際には、この特別のイソブソラ レン、ＡＭＤＭＩＰについては、ＰＣＲ生成物の増大かある。重要なことは、Ａ ＭＤＭＩＰの高濃度（４００μｇ／ｍｌ）でさえも増幅に対して明らかな影響を 示さないことである。

実施例５４ 増幅後失活 この実験では、失活方法は次のことを含む：Ｉ）ＰＣＲ試薬を供給すること、２ ）鋳型を供給すること、３）ポリメラーゼを供給すること、４）ＰＣＲを開始す るために、ＰＣＲ試薬、鋳型、及びポリメラーゼを混合すること、５）ＰＣＲ生 成物を得るために循環すること、６）イソブソラレンを供給すること、７）　Ｐ ＣＲ生成物にイソブソラレンを添加すること、及び８）　ＰＣＲ生成物を照射す ること。

イソブソラレンは照射の前であればい−）ても混合物に導入しうるか（例えば、 照射前に反応管を再度間［Ｊするのを防止するために鋳型か添加されるとき）１ 、二の態様では、イソブソラＩ／ンは増幅後に添加する。本発明の方法の有効性 を示すために、失活したキャリオー・く−は増幅し得ないことが示されなければ ならない。

これを測定するには、次の実験工程か含ま才〕る（第４０図）・ａ）鋳ｌ「ｌを 製造すること、ｂ）鋳型を供給する二と、ｃ）ＰＣＲ試藁を供給すること、ｄ） ポリメラーゼを供給すること、ｅ）ＰＣＲを開始するためにＰＣＲ試薬、鋳型及 びボリン５−ゼを混合すること、ｆ）ＰＣＲ生成物を得るために循環する二と、 ｇ）　ＰＣＲ生成物を新しい管にキャリオーバーとして持ち込む二と、ｈ）イソ ブソラレンを供給する、二と、ｉ）キャリオーバーにイソプソラレンを添加する こと、ｊ）照射すること、ｋ）新しいＰＣＲ試薬を添加すること、及び、Ｉ）後 続のＰＣＲｏ 工程ａ）、ｂ）、Ｃ）、ｄ）、ｅ）及びｆ）。ＰＣＲ生成物は前述のとおりにし て提供された。

工程ｇ）　ＰＣＲ生成物のキャリオーバーとしての持ち越し。ＰＣＲ生成物のア リコートを新しい反応管に背当たり１０”コピーで添加した。

工程ｈ）イソブソラレンの供給。ＡＭＤＭＩＰか前述のようにして合成され、希 釈された。

工程ｉ）イソブソラレンの添加。キャリオーバーを含有する反応管にＡＭＤＭＩ Ｐ（１００μｇ／ｍｌ、約１０−’Ｍ）を添加した。

工程ｊ）照射。光生成物を避けるために、照射はＰＴＩデバイスで実施した。３ 個の新しい反応管が照射され、他は対照として未照射のままてあった。照射は上 述のように室温で１５分間行った。

工程ｋ　）ＰＣＲ試薬及びＴａｑポリメラーゼが相応の濃度で添加された。

最終の容積が２倍に増加され、その結果ＡＭＤＭＩＰ光生成物は５０Ｐｇ／ｍ１ となった。

工程１）後続のＰＣＲ、増幅は、プライマー対のＳＫ　−３８／　３９を２０． ２５又は３０サイクル使用し、α−”　Ｐ　−ｄＣＴＰの存在下で前に述へた循 環のための温度プロフィールを使用して、閉１つだ反応管中で実施した。

結果はゲル電気泳動及びオ〜　トラジオグラフィーにより評価した（第４１図） 。ゲルレーンの右側に、出発物質及び生成物に相当するバンドが示されている１ 、予期されるように、キャリオーバーのない対照反応は（レーンｌ、５、及び９ ）、何らの増幅された生成物も示さない。一方、ＡＭＤＭＩＰなしに最初の増幅 で製造されたキャリオーバーを含む対照反応は（レーン２．６及び１０）増幅を 示す。ＡＭＤＭＩＰの存在下で最初の増幅において製造されたが光処理されなか ったキャリオーバーを含む対照反応物（レーン３．７及びＩｔ）も増幅を示す。

重要なことは、キャリオーバー、ＡＭＤＭＩＰ及び照射を受け取った反応物は（ レーン４．８及び１２）、サイクルに依存する程度にまでＰＣＲのイソブソラレ ン失活が起こることを示している。２０サイクルで失活は完了するように思われ る（即ち、２０サイクルの増幅は検出可能な生成物を提供しない）。２５サイク ルでは、ＰＣＲ生成物が対照（レーン６及び７）に比較して減少するが、検出可 能である（レーン８）。最後に、３０サイクルでは何らの有意の失活も観察され ない、ＰＣＢ生成物（レーン１２）は対照（レーンＩＯ及び１１）に比較してほ ぼ同じである。

バンドの視覚による検討によれば、ＡＭＤＭＩＰはキャリオーバーの存在下で光 活性化されると、２０サイクルで極めて有効であるように思われる。しかしなが ら、３０サイクルでは失活が圧倒されるように思われる。これは増幅要素と失活 感受性の相互作用を示している。

第旧図は第６表に関して解釈され得る。２０サイクルのＰＣＲて、失活は完全に 有効であるようにみえる（レーン３に対してレーン４）。もし１１００ＣＰかオ ートラジオグラフ上のバンドをみるための閾値であるとすると、第６表は、ＡＭ ＤＭＩＰによるこの実施例の失活のプロトコールＰＣＲ手法により複製可能であ った１０’個以下の標的分子を残存させることを示している。２５サイクルのＰ ＣＲにおいて、容易に測定可能なバンドが観察されるが（レーン８）、これは少 なくとも１０３個の標的分子が複製能力を保持していることを示唆している。３ ０サイクルのＰＣＲにおいては、対照シグナルと失活した試料から得られたシグ ナルとを区別することは困難である（レーン１１をレーン１２と比較する）。こ のことは、対照試料とＡＭＤＭＩＰ処理試料は両方ともＰＣＲ増幅方法のプラト ー領域に到達するということに合致する。

実施例５５ 増幅後失活 本発明の方法の有効性を示すために、失活したキャリオーバーは増幅し得ないこ とが再度示される。この実施例において、しかしながら、イソブソラレンは増幅 前に導入される。

これを測定するためには、次の実験工程が含まれる（第４２図を参照）：ａ）鋳 型の製造、ｂ）鋳型の供給、Ｃ）イソブソラレンを供給すること、ｄ）　ＰＣＲ 試薬を供給すること、ｅ）ポリメラーゼを供給すること、ｆ）ＰＣＲを開始する ためにＰＣＲ試薬、鋳型及びポリメラーゼを混合すること、ｇ）ＰＣＲ生成物を 提供するために循環させること、ｈ）照射すること、ｉ）特定のコピー数で新し い管にＰＣＲ生成物をキャリオーバーとして持ち越すこと、及びｊ）後続のＰＣ Ｒで増幅を行うこと。

工程ａ）・鋳型の製造。鋳型としてＨ［Ｖ　１１５−ｍｅｒが使用された。

工程ｂ）：鋳型の供給。反応を行うために、緩衝液中の鋳型（約１０７コピーに 相当する）を反応容器に供給した。

工程Ｃ）　イソブソラレンを供給すること。ＡＭＤＭＩＰ（４００μｇ／ｍりか イソブソラレンとして提供された。これは、これまでの実施例において使用され たものよりも高い濃度のＡＭＤＭＩＰである。

工程ｄ）、ｅ）、ｆ）及びｇ）。先に述べたようにして、ＰＣＲ試薬及びポリメ ラーゼが供給され、混合され、そして、循環された。

しかしながら、今回は、イソプソラレンは増幅前混合物の一部である。

工程ｈ）照射。照射はＣＥ−ＩＩＩデバイス上で２５°Ｃにて１５分間実施した 。

工程ｉ）　ＰＣＲ生成物をキャリオーバーとして持ち越すこと。ＰＣＲ生成物の アリコートを６個の新しい反応管各希釈物について２個の管に添加した。　＋０ ７．１０５及び１０’個のコピーが得られるまで希釈かなされた（希釈は約＋ｏ ＬＯｌコピー／μｌの濃度から実施されたことに留意されたい；こうして、光生 成物の失活を考慮するにはずっと低すぎる光生成物の濃度が希釈により得られる 。）工程ｊ）後続のＰＣＲ，新しいＰＣＲ試薬とポリメラーゼが供給され、混合 された。プライマー対の５Ｋ−３８／３９を３０サイクルの間使用し、α−′！ Ｐ−ｄＣＴＰの存在下で既に述べた循環のための熱プロフィールを使用して、閉 じた反応容器内で増幅を実施した。

結果は、ゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーにより評価した（第４３図） 。ＡＭＤＭＩＰの存在下で最初の増幅において製造されたが、光処理をされてい ないキャリオーバーを含有する対照の反応物（レーン］、３、及び５）は増幅を 示す。重要なことは、ＡＭＤＭＩＰの存在下で照射した後最初のＰＣＲからのキ ャリオーバーを受け取った反応物は（レーン２．４及び６）完全な、増幅後失活 を示す。

実施例５６ フォトビオチン及びモノアジドエチジウムクロリドについて、予め鋳型依存性酵 素的合成を阻止する能力を試験した（実施例４９を参照）。光生成物の作用はそ の時点では検討しなかった。

この実験では、フォトビオチン及びモノアジドエチジウムクロリドがＰＣＲ失活 試薬として試験された。（もしあれば）光生成物の作用を調べるために、時間の 経過順の工程が実行された。

フォトビオチンとモノアジドエチジウムクロリドの溶液は１ｘＴａｑ　Ｎｊ衝液 中で調製された。フォトビオチンの濃度の範囲は、７Ｘ　１０−’Ｍから７Ｘ１ ０−”Ｍであった：モノアジドエチジウムクロリドの濃度は３　Ｘ　ｔｏ−’Ｍ から３　Ｘ　１０−１０Ｍであった。この濃度系列の上端は、比較的高濃度のこ れらの化合物が暗結合によりＰＣＲを制止したことを示した先の実験に基づいて いた。各化合物の溶液は２つの部分に分けられたニ一方の部分はパイレックスフ ィルター（３００ｎｍカットオフ）を通してＧＥ太太陽ラン上下照射した：他方 の半分は２．９Ｍ　ＮａＮ０□液体フィルター（４００ｎｍカットーオフ）を通 してＧＥ太太陽ラン上下照射した。照射は氷上で１５分間実施した。照射後に、 容管のアリコートはＰＣＲ試薬及び標的（ＨＩＶ　１１５−ｍｅｒ）を含有する 管に移された；次いで、ＰＣＲはα−”Ｐ−ｄＣＴＰの存在下で３０サイクル実 施した。増幅後、アリコートは１２％アクリルアミド／８Ｍ尿素ゲルにて分析し た。

この結果は、こうして試験を行うと、モノアジドエチジウムクロリドはＰＣＲを 抑制しないことを示している　；　１１５−ｍａｒは高濃度点で増幅した。一方 、こうして使用するときは、フォトビオチンは使用された最高の濃度（７Ｘ　１ ０−’Ｍ）においてＰＣＲを制止する（１１５−ｍａｒはすべての低い濃度にお いて増幅した）。

これらの結果を考慮すると、モノアジドエチジウムクロリドに関して先にみられ たプライマーの伸長の抑制（実施例４９）は、恐らく光結合によるものであり、 光生成物の結合によらないものであると考えられる。しかしながら１、二：でフ オトビオチ：ノに関してみられた結果は、先の抑制か恐らくフォトビすチン光生 成物によるものである、ことを示唆する。

実施例５７ 増幅後失活 ＰＣＲ試料を次の変更を行って増幅のために調製し５た。ＡλｔＤＭＩＰの代わ りに、１００μｇ／ｍｌの濃度で増幅の前ｔ：ＩＡＭＴを加える。プライマー対 ５Ｋ−３８／３９の代わりに、ビオチンがテトラエチレングリコール架橋（ビオ チンへのエステル結合）を介在させてｌ又は両方のプライマーの５′末端に付加 したビオチニル化類似体を使用する。

３０サイクルのＰＣＲに続いて、反応容器はＣＥ−Ｉ［Ｉデバイスにおいて３゜ Ｏｏ−４００ｎ光線に露光する。照射に続いて、ＰＣＲ反応容器か開かれ、ＰＣ Ｒ生成物か除かれる。次いで、Ｍ離のプライマーはセントリコン１００　（Ｃｅ ｎｔｒｉｅｏｎ　：　Ａｍ１ｃ、ｏｎディビジョン、　Ｗ、　ＲＧｒａｃｅ　＆ 　Ｃ。

、デンバー、　ＭＡ）を通してＰＣＲ反応混合物をスピンすることにより除かれ る。セントリコンフィルターは、短かいオリゴヌクレオチドの通過は可能である か、長いオリゴヌクレオチドの通過は不可能な半透膜から成る。、ＰＣＲ生成物 は保持物として異って保持される。何回かの洗浄か必要である（これらの膜は遠 心機で２００Ｑ　ｘｇにて５分間スピンされる使い捨てのプラスチック管に好適 に取り付けられる）。最後の洗浄の後で、保持物はナイロン膜又はニトロセルロ ース膜」二に濾過により固定される。フィルターは８０°Ｃて２時間真空時に焼 き固める。固定した後、ＰＣＲ生成物は市販のビオチンの検出システムで検出す る（ＢｌｕＧｅｎｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ斗８１７９ 　ＳＡ；ＢＲＬ）。

代わりに、検出はＰＣＲ増幅工程の間にａ−３２ｐ−デオギシリポヌクレオシド 　トリボスフ１−トを導入することに、より達成され得る。

ここでの工程は、検出工程を除いて最初の方法と同じである。照射工程に続く固 定の代わりに、マーカー染料のブロモフＬノールブルーか頂度ゲルを離ｔするま で、失活試料の一部を８Ｍの尿濃（変性）１１％ポリアクリルアミドゲルに載置 し、５ｏワツ）　（２５ｍＡ／２０００Ｖ）で２〜３時間電気泳動させる。架橋 した二重鎖Ｉ）ＣＲ生成物はオートラジオグラフィー（ＸＡＲ−５Ｘ線フィルム 、コダソク）により視覚化する　：典Ｖ的な露光時間は１２−１６時間である。

ＡＭＴ処理した生成物か失活されることを示すために、　１０’から１０１０個 の１ビーのＰＣＲ生成物を含有するＡＭＴ処理されたＰＣＲ反応混合物のアリコ ートを新しい反応容器へ移す。ＰＣＲ試薬を添加し、試料は３０サイクルの間再 び増幅させ、増幅の間はα−３２Ｐ　−ｄＣＴＰを存在させる。ＰＣＲに続いて 、再増幅させた試料は前記したように変性１）ＡＧＨにより分析する。すべての 場合において、架橋した（ＡＭＴ処理した）ＰＣＲ生成物は再増幅しない。

第３の方法においては、ＡＭＴ溶液（１００μｇ／ｍｌ）を調整し、ＣＢ−ＩＩ Ｉデバイスで１５分間照射する。次いて、ＰＣＲのために必要なすへての試藁と 増幅のための標的ＤＮＡを含有するＰＣＲ反応物に、二の溶液を加える。この混 合物をα−”Ｐ−ｄＣＴＰの存在下で３０サイクル増幅し、次いて、すでに述へ たようにＰＡＧＥにより分析する。ＡＭＴ光生酸生成物れ自体ＰＣＲの有効な■ 止剤であるから、再増幅は何ら観察されなかった。光生成物の阻止の機序は今回 は解明されていないが、明らかに濃度依存性である。

実施例５８ 増幅後失活 失活について一般的に議論したとおり、失活感度は修飾密度及びＰＣＲ標的配列 の長さに依存する。この実験において、修飾密度と標的の長さの失活感度に対す る作用は、ＡＭ！Ｐ又はＡＭＤＭＩＰのいずれかて２種の異なる長さのＰＣＲ生 成物を失活させることにより検討した。各々のイソブソラレンはＰＣＲ標的に対 する異なる修飾密度を得るために、失活方法において２つの異なる濃度で使用し た。

この実験で使用された２種のＰＣＲ標的は、１１５−ｍｅｒ（ＳＫ−３８／　５ Ｋ−３９８ＩＶシステム）及び５００−ｍｅｒであった。５００−ｍｅｒ標的は 、プライマーＰＣＲ０１１０２でラムダプラスミドをＰＣＲ増幅して得られる。

このシステムは、ＰＣＲ試薬の市販のキットにおける対照としてシータス／パー キンエルマー（Ｃｅｔｕｓ／　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）社により提供される （カタログ番号、Ｎ８０１−００５５）。これらのシステムの双方に対して、各 標的の等量のコピー数を次のようにして調整した：最初の３０サイクルのＰＣＲ 反応は、各々のシステムに対して相応のプライマー及び標的を用いて実施した。

これらの反応の各々の了りコート（約１０’　−１０’標的コピー）を第２のセ ットのＰＣＲ反応物に移した。これらの第２のセットのＰＣＲ増幅は、α−”　 Ｐ　−ｄＣＴＰの存在下で再度３０サイクル行った。これらの反応のアリコート か取り出され、液体シン千１ノージョン計測によりカウントシた。５−れらの数 により、α−３２Ｐ　−ｄＣＴＰの比活性、及び各々のＰＣＲ生成物であるオリ ゴヌクレオチドの配列（１１５−ｍｅｒ及び５００−ｍｅｒ）、第２のセントの ＰＣＲ反応管中の各々２種のＰＣＲ生成物であるオリゴヌクし・オチドの濃度を 決定した。Ｈ５−ｍａｒと５００−ｍａｒの両方の濃度は、追加のＴａｑ緩衝液 を添加することにより正確にｌＸｌ０−’Ｍに調節した。

ＰＣＲ生成物の等コピー数のこれらの原液か、他の研究のために使用された。原 液の各々は次いで４個の反応管に分割された。反応管は次のものを含むように調 節した。管１．１００μｇ／ｍｌ　ＡＭＩＰ　；管２．４００μｇ／ｍｌ　ＡＭ ＩＰ　；管３．１００μｇ／ｍｌ　ＡＭＤＭＩＰ　；及び管４．４００μｇ／ｍ ｌ　ＡＭＤＭＩＰ、これらの試料の各々は再度２つの部分にわけ、一方はＣＥ− Ｉ［Ｉデバイスで室温において１５分間照射し、他方は暗室に保持した。照射し た、及び、未照射の標的の段階希釈物は、α−”Ｐ−ＣＴＰの存在下で３０サイ クル実施した。これらの試料のアリコートを変性ポリアクリルアミドゲル上で分 析した。ＰＣＲ生成物のバ：ノドをオートラジオグラフィーにより視覚可能とし 、切り取り、そして、液体シンチレーションカウンターでカラン［・シた。

１１５−ｍｅｒ　ＰＣＲ生成物に対する１００　μｇ／ｍｌのＡＭＩ！’の失活 効果は第４４（Ａ）図に示されている。６００のキャリオーバー分子に相当する 照射されたＰＣＲキャリオーバー生成物の１０１倍の希釈物は、未照射のコント ロールを３０サイクル増幅した後のものに比較して減少したＰＣＲシグナルを生 じた。ＰＣＲキャリオーバー生成物の１０ａ倍又はそれ以下の希釈物において、 照射した、及び未照射の試料は同様なシグナルを生ずる。１００　ｕ　ｇ／ｍｌ では明らかに、ＡＭＩＰは約１０．０００分子以上のキャリオーベーを効果的に 失活するのに、＋　１５−ｍｅｒにおいて不十分な修飾密度である。ＡＭＩＰの 濃度か４００μｇ／ｍｉに増加すると、失活感度は＋１５−ｍｅｒ標的に関して 改良された。第４４（Ｂ）図は、未照射ＰＣＲ生成物の６００．０００分子のキ ャリオーバーか、ＰＣＲ増幅のプラト−領域にあるＰＣＲ生成物の濃度に合致す る一／グナルを生ずることを示している。未照射のＰＣＲキャリオーバー生成物 の等量は、測定し得るＰＣＲシグナルを全く生じない。１００倍以上の照射した ＰＣＲキャリオーバー生成物は、この失活プロトコールを圧倒し始めるが、この ことは、４００μｇ／ｍｌ　ＡＭＩＰ及び１１５−ｍｅｒ　ＰＣＲ生成物の場合 の失活感度限界が約１０’キヤリオーバー分子であることを示している。

ＰＣＲ生成物の長さの影響は、第４４（Ｃ）図を第４４（Ａ）図と比較すること により示される。１００μｇ／ｍｌのＡＭＩＰにおいて、５００−ｍｅｒ　ＲＣ Ｒ生成物は明らかに１１５−ｍｅｒ　ＰＣＲ生成物よりも効果的に失活される。

４００μｇ／ｍｌ　ＡＭＩＰにおいて、照射した５００−ｍｅｒは６Ｘ１０’分 子のキャリオーバーになるまでは、いかなる希釈系列についても全く増幅しなか った（データは示されていない）。より多量のキャリオーバーは試験しなかった 。４００μｇ／ｍｌ　ＡＭＩＰを有する未照射の５００−ｍａｒは第４４（Ｃ） 図のものに匹敵するシグナルを生じた。

第４４（ｄ）図は、１１５−ｍｅｒ　ＰＣＲ生成物に関して、１００μｇ／ｍｌ のＡＭＤＭｒＰか同濃度のＡＭＩＰよりもすぐれた失活剤であることを示してい る（第４４（Ａ）図と比較）。４００　ｕ　ｇ／ｍｌでＡＭＤＭＩＰが使用され るとき、照射したキャリオーバー系列は１１５−ｍｅｒ　ＰＣＲ生成物に関して ６×１０９分子のキャリオーバーになるまでは全くシグナルを生しなかった。未 照射の対照はキャリオーバー分子から通常のレベルのＰＣＲシグナルを生しる。

５００−ｍｅｒ　ＰＣＲ生成物にＡＭＤＭＩＰが使用されたときは、照射した希 釈系列において１００μｇ／ｍｌ及び４００μｇ／ｍｌの両方の濃度ともシグナ ルを生しなかった。　１００μｇ／ｍｌてのＡＭＤＭＩＰは、　ＰＣＲ生成物に 対するα−３２Ｐアツセイで６Ｘ１０”キャリオーバー分子において失活されな い５００−ｍａｒか存在しないように思われるのに十分な程の、高い修飾密度を ５００−ｍａｒ標的に対して有している。

実施例５９ イソブソラレンは二重鎖核酸とモノ付加物を形成するか、その角構造のために架 橋を形成しないと考えられている。このため、これらのイソプソラレン修飾した 単鎖はノへイブリダイゼーション方法により検出可能であるはずである。次の実 験は、２つの異なるハイブリダイゼーションフォーマブトとの適合性によるイソ ブソラレンの特別の有用性を示す＝１）オリゴヌクレオチド／Ｓイブリダイゼー ション（ＯＨ）および２）架橋可能なオリゴヌクレオチドプローブ分析（ＣＯＰ ）（第４５図）。実験は、ＡＭＤＭＩＰ失活標的分子か依然としてＯＨ及びＣＯ Ｐ手法により検出可能状態にあることを示している。標的の１１５−ｍｅｒにＡ ＭＤＭＩＰが存在することはプローブ／％４ブリダイゼーションを阻害しないよ うに思われ、同様に、アツセイし、ゲル上で視覚により検査するときに、これら の失活標的分子の架橋性を減少させないように思われる。

試料の調製ニブライフ　−５Ｋ−３８／　５Ｋ−３９をもツＨ［Ｖ　１１５−ｍ ｅｒシステムか実験のために使用された（第３６図、“旧Ｖオリゴヌクレオチド システム″を参照）。２つの型の出発鋳型が使用された二ＨＩＶに感染したこと が知られている個人から分離し、予め増幅した１１５−ｍｅｒ又はゲノムＤＮＡ （ＭＡＣＳ試料）。予め増幅した１１５−ｍａｒについては、１０’ないし１０ ”　コピーが出発鋳型としてに使用された。

ゲノム（ＭＡＣＳ）試料については、約１μｇ（３Ｘ１０’コピー）のゲノムＤ ＮＡか使用された。２つのＰＣＲ試料が各々の型の鋳型に対して調整され、次い で増幅を２０又は３０サイクル実施した。２つのＰＣＲ試料のうち１つは２００ 　μｇ／ｍｌのＡＭＤＭＩＰを含み、他のものはＡＭＤＭＩＰを含有しなかった 。増幅に続いて、ＡＭＤＭＩＰ含有試料か分割され、半分が照射された。各サイ クル数に対して、各々のセット（ＡＭＤＭＩＰ不含、ＡＭＤＭＩＰ未照射及びＡ ＭＤＭＩＰ照射）から３個の試料について、分析（ＯＨ又はＣ０Ｐ）が実施され た。ＡＭＤＭＩＰ不含の試料は対照として使用され、ＡＭＤＭＩＰ未照射の試料 は検出に対する非共有結合ＡＭＤＭＩＰの作用が検討され、そして、ＡＭＤＭＩ Ｐ照射試料は検出に対する共有結合ＡＭＤＭ■Ｐの作用が検討された。

ＣＯＰ及びＯＨアッセイは、次のようにして実施した。１０μｌのＰＣＲ反応混 合物が３．３μｌの１プロ一ブ混合物”　［ＥＤＴＡ及び相応の塩混合物を含む １０−”Ｍの５°−標識５Ｋ−１９（通常のもの、又はモノ付加したもの）］に 加えられ、３０−４０μｌの軽鉱質油が上に置かれ、次いで、９５〜１００°Ｃ で５分間加熱した。ＣＯＰに対しては、ハイブリダイゼーション混合物が５６° ＣでＰＴＩデバイスに置かれ、１５分間照射された。これに続いて、泳動用染料 （尿素又はホルムアミドを含有する）が添加され、試料は９５−１００°Ｃで５ 分間加熱し、氷水上ですばやく冷却し、変性ＰＡＧＥゲルに配置し、続いて変性 条件下で電気泳動を行った。ＯＨ反応に対しては、ハイブリダイゼーション混合 物を５６゛Ｃで３０分間インキュベートし、泳動用染料を添加し、アリコートを 天然ＰＡＧＥゲルに直接配置し、続いて未変性条件下で電気泳動を行った。

１、ＣＯＰ結果：　ｃｏｐに関する結果は第４６図に示されている。試料１−６ は予め増幅され、さらに、２０（試料１．３．５）又は３０（試料２．４．６） サイクルのいずれかで再増幅された１１５−ｍａｒを含み、次いでＣＯＰて検出 した。試料ｌ及び２は対照である（ＡＭＤＭＩＰの不在下）；試料３及び４は失 活させた試料である（Ａ％ＡＤＭＩＰ及び光の存在下）；試料５及び６は（ＡＭ ＤＭ［Ｐの存在下で光の不在下）対照である。ラベルされた４１−ｍｅｒプロー ブ（ＳＫ　−１９ＭＡ）に架橋した増幅された１１５−ｍａｒに相当するバンド は第４６図の上方のノくンドである。試料１１−１６は同様の系列のものである が、鋳型としてＭＡＣ３試料が使用されていた。

第４６図を検討すると、３０倍に増幅された試料のみか有意なＰＣＲ生成物を生 じる（バンドを切りとり２０サイクルの試料を定量した：以下を参照）。３０サ イクルの系列においてはすべてのノーイブリットバンドの視覚強度は全く同じで あるように見える。３０サイクルの系列においては、（化合物のない）対照の増 幅（レーン２／１２）、試験増幅［ＡＭＤＭＩＰと光を用いたもの（レーン４／ １４）］　、Ｃ光を用いない）対照増幅（レーン６　／１６）の比較は、バンド 強度においてはほとんど差がないことを示している。より改良された定量は、／ くンドを切り取り、カウントすることにより得られたが、次の数を与えた： （装置以下余白） 試料　ＣＰＭ（％）　試料　ＣＰＭ（％）４　３６４５２（８３）　１４　４１ ７７７＜７８＞２０サイクルと３０サイクルの系列の傾向は同様である。（ＡＭ ＤＭＩＰと光を用いた）試料（３，４，１３，１１１）と（ＡＭＤＭＩＰを用い たか光を用いない）相応の試料（ｌ、２、ＩＬ　１２）との比較は、ハイブリダ イゼーションシグナルか５２〜８３％に低下することを示している。（ＡＭＤＭ ＩＰを用いたか光を用いない）対照との比較もハイブリダイゼーション　シグナ ルの減少を示す（試１４５を除く）。これら（光を用いない）試料は、ＡＭＤＭ ＩＰを含有するが、ＣＯＰ分析の前には失活されなかった試料であることか期待 される。しかしながら、光はＣＯＰ工程の間に加えられており、ＡＭＤＭＩＰか 存在するから、光付加はＣＯＰの間に生じている。

２．０１（結果　ＯＨに関する結果は第４７図に示されている。この実験は上述 の増幅した試料を使用した。これは検出かＯＨによるものであることを除き、Ｃ ＯＰ実験と同一である。試料１−６は、予め増幅された１１５−ｍｅｒであり、 さらに２０（試料１．３．５）又は３０（試料２．４．６）サイクル再増幅した ものを含み、続いてＯＨ分析された。試料ｌと２は（化合物も光も用いない）対 照である。試料３と４は（ＡＭＤＭＩＰ及び光を用いた）試料である：試料５及 び６は（ＡＭＤＭＩＰを用いたが光を用いない）対照である。ラベルされた４１ −ｍｅｒプローブ５Ｋ−１９にハイブリダイズした増幅１１５−ｍｅｒに相当す るバンドは、第４７図における上方のバンドである。レーン１１−１６は同一の 系列であるか、ＭＡＣ３試料か鋳型として使用された。中央部の試料はネガティ ブ（試薬）対照であり、”Ｍｌ”及び“Ｍ２”はプローブのみである（マーカー として）。

第４７図を視覚により検討すると、３０回増幅した試料のみか有意なＰＣＲ生成 物を提供する。３０サイクルの系列ては、バンド強度はすべて同じように見える 。対照増幅（し・−ン２　／＋２）を試験物（ＡＭＤＭＩＰと光を用いたもの、 レーン４　／＋４）及び対照（ＡＭＤＭＩＰを用いたか、光を用いないもの：レ ーン６　／１６）と比較すると、同様の強度か示されている。このゲルにおける バンドからは信頼しうるカウントを得ることかてきない（天然のゲルはバンドを 切り取る工程に耐えられるものではない）ので、これ以上の定量的比較はできな かった。ゲルの視覚によるシグナルによれば、（核酸に共有結合していようと、 非共有結合していようと）増幅された標的のその後の検出に対する光反応性化合 物の影響はないであろうと結論することかできる。（もし可能であれば）０１（ の定量はＣＯＰデータと同様の傾向を示すと仮定すれば、光反応性化合物の存在 により引き起こされるハイブリダイゼーションシグナルにおいて２因数以上の差 異か存在しつるかもしれない。

実施例６０ 増幅後失活 １μｇのＭａｌｔ−４ヒトゲノムＤＮＡ標的を含む４つの試料を、プライマーＫ Ｍ　２９　（５“−ＧＧＴＴＧＧＣＣＡＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＧ）及びＨＲ Ｉ−１２（５’　−ＧＧＣＡＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴ）を用いたＰＣ Ｒのために調整した。これらのプライマーはヒトのベータグロビン遺伝子内の１ ７４ｂｐ生成物を与える。４つの試料はすべて１００μｇ／ｍｌのＡＭＤＭＩＰ を含有しており、ＰＣＲ増幅前に０．５．１０又は１５分間照射した。ＡＭＤＭ ＩＰを含有しない対照資料も２セツト調製した。増幅は１×Ｔａｑ緩衝液（５０ ｍＭ　ＫＣＩ。

１０ｍＭ）リスｐＨ８，５，２，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．２００μｇ／ｍｌゼチラ ン）、１７５μＭずつのｄＮＴＰ、２０μＭのプライマー中で、増幅時にｚ５単 位のＴａｑポリメラーゼ及び１００μｇ／ｍｌのＡＭＤＭＩＰを存在させて実施 した。

ＰＣＲは３０サイクル行った：１サイクルー９４°Ｃて３０秒（変性）、５５° Ｃて３０秒（ブライマーアニーリング）及び７２°Ｃて６０秒（伸張）。

内部標識としてα−”　Ｐ　−ｄＣＴＰが使用された。増幅後、試料はＰＡＧＥ と、その後のす一トラジオグラフィーにより生成物を分析した。

第４８図に示されているように、ＡＭＤＭＩＰの存在下では、すべての時点にお いて（レーン５−８はそれぞれ０．５．１０及び１５分である）、射は失活した ゲノム標的の増幅を生じなかった。ＡＭＤＭＩＰの非存在下では、すべての時点 における（レー〕用−４は、それぞれ、０．５．１０及び１５分である）照射は ゲノムターゲヲトの増幅を生した。

ＡＭＤＭＩＰの濃度は１００μｇ／ｍｌになるように選ばれていることに注意さ れたい。未照射のＡＭＤＭＩＰのこの濃度は、増幅に有意な影響を及ぼさないこ とか決定された（データは示されていない）。失活させる化合物か同してあって も、各々の特定の増幅システム（この場合には、グロビン）に対して適当な濃度 を決定し、他のシステム（例えば、ＨＩＶ）に対して決定した濃度に依存しない ことか望ましい。一般には、本発明の結論は、増幅生成物の長さか長くなればな る程、増幅を阻止するために必要な未活性の化合物濃度が低くなることを示して いる（データは示されていない）。

実施例６１ 増幅後失活 この実施例は、光の非存在下て非ブソラレン化合物かＰＣＲを抑制する濃度を検 討した。試験化合物は次のものであった＝１）エチジウムプロミド（フエナント リジン、第１表参照）、２）キシレンシラノール（有機染料、第１表参照）、３ ）ブロモフェノールブルー（有機染料、第１表参照）、４）クマリン及び５）メ チレンブルー（フェンアザチオニウム塩、第１表参照）。

最初の暗室対照は化合物１−３に関してなされた。結果は第４９図に示されてい る。すべての化合物は、一層高い使用濃度においてＰＣＲの幾分かの抑制を示し た。

別の実験は、光の非存在下におけるクマリンとメチレンブルーに関するＰＣＲ阻 害を調べた。メチレンブルーについては、次の濃度か試験された：　４．３　Ｘ 　１０−”、４．３　Ｘ　１０−’、４．３　Ｘ　１０−’及び４．３ＸＩＯ− ’Ｍ　Ｏ試験したクマリン濃度は次のものである：　７　Ｘｌ０−’、７　Ｘ　 １０−’、７Ｘ１０−’及び７　Ｘ　１０−’Ｍ　Ｏ化合物はα−２２Ｐ−ｄＣ ＴＰと標的を入れたＰＣＲ管に添加した（　１　）ｔ　ｌ　１０”Ｘ希釈、ＰＣ Ｒはアッセイ点あたりＭＡＣＳ　１５５５を有していた）。ＰＣＲは３０サイク ル実施した。

試料は１２％／８Ｍ尿素ゲル上に置かれた。結果は、メチレンブルーが４．３　 Ｘ　１０−’Ｍ以上の濃度でＰＣＲを阻害することを示した。クマリンは試験し たいずれの濃度においてもＰＣＲを阻害しなかった。

実施例６２ 実施例６０において議論したように、１つのＰＣＲシステムに対して許容しつる 特定の失活用化合物の濃度は他ものに対して許容しうると仮定することができな い。ＰＣＲ増幅効率に対する失活用化合物の所定濃度の影響はシステムごとに決 定されなければならない。例えば、Ｈｎ’　１１５−ｍｅｒシステムは４００μ ｇ／ｍｌまでのＡＭＤＭＩＰ濃度と適合し、それゆえ、失活に対してはＡＭＤＭ ＩＰのこの濃度が使用しつる。しかしながら、ＡＭＤＭＩＰのこの濃度は他のＰ ＣＲシステムに関しては許容されない。実際に、一部のＰＣＲシステムの増幅効 率は失活用化合物の高濃度により低下することがある。

失活用化合物の高濃度はＰＣＲ生成物を安定化するように機能しく特に、ＧＣに 富んだＰＣＲ生成物、又は、特に長いＰＣＲ生成物）、その結果、より多量の二 重鎖生成物が各々のサイクルで変性されないであろう。これは、単鎖生成物の引 き続いてのブライミング及び伸長のための利用性を減じ、各ＰＣＲサイクルにお ける生成物の収率を減少させるであろう。多くのＰＣＲサイクルに対するこの減 少した効率は、ＰＣＲ生成物の収率において劇的な減少をもたらすであろう。

ＰＣＲ生成物の安定化を破壊する方法の１つは、ＰＣＲ生成物の融点を低下させ るようにＰＣＲ条件を改変することである。そうすることにより、より多くの二 重鎖ＰＣＲ生成物が変性され、そのことにより、各サイクルはより多くの単鎖標 的をその後のブライミング及び伸長のために提供する。改変したＰＣＲ条件の真 の結果はＰＣＲ生成物のより高い収率である。

変性された（単鎖の）　ＰＣＲ生成物を提供するＰＣＲ条件の１つの改変は、各 々のＰＣＲサイクルに対して予めセットした変性温度を９５°Ｃ以上に上げるこ とである。この改変は９５°Ｃ以上の温度ではＴａｑの不活性化が同時に生ずる という不利益がある。他の改変は、ＰＣＲ生成物の変性がより低い温度で生起可 能とする共溶媒をＰＣＲ緩衝液に添加することである。このような共溶媒の１つ はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。ある条件下では、ＤＭＳＯはＰＣ Ｒを促進することを示した。ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　、　Ｈ，Ａ、　Ｅｒ １ｉｃｈ（ｅｄ、）（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ　１９８９）。

この実施例において、高濃度の失活用化合物（ＡＭＤＭＩＰ）の存在下でのＤＭ ＳＯのＰＣＲ増輻に対する作用が検討された。１μｇのヒト胎盤ＤＮＡを含み、 （未照射の）ＡＭＤＭＩＰ（２００μｇ／ｍｌ）を含む又は含まない資料がＰＣ Ｒのために調製された。試料は、０％、１％、５％又は１０％のＤＭＳＯの存在 下で標準のＰＣＲ条件において３０サイクル増幅させた。反応混合物はα−”　 Ｐ　−ｄＣＴＰを含有していた。増幅後に、試料はＰＡＧＥにより分析した（デ ータは示されていない）。

この結果は、（未照射の）ＡＭＤＭＩＰは実質的に検出可能な増幅生成物か存在 しなくなる点まで２００μｇ／＋ｎｌの濃度で増幅を阻害するが、ＤＭＳＯをＰ ＣＲ共溶媒として添加するとＡＭＤＭＩＰの存在下において増幅を可能とするこ とを示している。生成物のバンドを切り取り、カウントすると、ＡＭＤＭＩＰ含 有試料に対して次の結果が得られる（％ＤＭＳＯ／ＣＰＭ）　：　Ｏ％／２５０ ０；１％／２８００　、５％／８６．０００　、　ｔｏ％／１０２、０００）。

対照（ＡＭＤＭＩＰ不合）のＰＣＲ試料を％ＤＭＳＯの関数として比較すると、 増幅収率において一定の減少を示した。生成物バンドの切除及び、　（重複試料 の平均として報告された）カウンティングにより、ＤＭＳＯの増大する濃度はＰ ＣＲの増大した阻害を示すという視覚による観察を確認できた（％ＤＭＳＯ／Ｃ ＰＭ　、　Ｏ％／１３９，０００　；　１％／１３７、０００　、５％／９４． ０００　；　１０％／７６、０００）。

Ｊ−（８５ＭＧ）　−一一一一− ２２　（ＡＭＤＭＩＰ） 殻（ＦＤＶＩＰ）　、ｉ、４　（ＨＤＡＭＤＭＩＰ）ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、７ −へ　寸 ○０゜ ＦＩＧ、　９ ＦＩＧ、　１０ 特表千５−５０１７１３　（＄８） 照射時間（分） ＦＩＧ、　１５Ａ 照射時間（分） ＦＩＧ、１５Ｂ 波長（ｎｍ） ＦＩＧ、　１６ 時間（分）　ＦＩＧ、ｉ８ ウシ胸腺ＤＮＡ （ＩＸＴＥ緩衝液ｐＨ＝　７．０中６００μｇ／ｍ１）ＴＥ中に溶解 ＦＩＧ、１７ 溶媒Ａ：Ｏ，ＩＭＮＨ，０１（；溶媒Ｂ：ＣＩ（、ＣＮ。

匂配：０−１０’　：　１００χＡ、ＩＯ’　−７０’　：１００％Ａ→１００ ％Ｂ；７０−８０’　：１００％Ｂ流速：４．０＋＋＋］／分；採取１．Ｏｎ＋ １画分ウルトラスフイア−（ベックフン）ＯＤＳ５μカラム（１０ｍｍｘ　２５ ｃｍ）ＦＩＧ、　２１ ＡＭＤＭＩＰ標準 ＦＩＧ、２２Ａ　画分 ＦＩＧ、　２２Ｂ　” ＡＭＤＭＩＰ　／　ＣＥ　−１１１ ＦＩＧ、　２２Ｃ” ＡＭＤＭＩＰ　／　ＣＥ　−ｌ　ｌ　１ＦＩＧ、　２２Ｄ　” ＦＩＧ、　２３Ａ　” ＦＩＧ、　２３Ｂ　” ＡＭＤＭＩＰ／ＰＴＩ ＦＩＧ、２３Ｃ画分 ＡＭＤＭＩＰ　標準 ＦＩＧ、２４Ａ　画分 ＡＭＩＰ／ＣＥ−１ ＦＩＧ、２４Ｂ　画分 ０’　１０　２０　３０　４０　５０　６０　７０　８０ＦＩＧ、　２４Ｃ“６ ０　１０　２０　３０　４０　５０　．６０　７０８０ＦＩＧ、　２４Ｄ　” ＡＭＤＭＩＰ二１０００塩基対 ｃ′）Ｖ′）ＣＰ）１７′） ｕ′）　い　の で の ・ の 伸長時間（分） ０．５　１．０　２．０　１．０　１０．０　０．５　１．０　２．０ＦＩＧ、 ３５ ＤＰＭ（１１５−ｍｅｒ　生成物Ｊ ａ）患者試料ＤＮＡのｍ製 立 Ｗｅ）成分を混合 警 標的　−＋＋＋−＋＋＋　−＋＋＋ ＡＭＤＭＩＰ　−−＋　＋　−−＋　＋　−−＋　＋ｈｖ　−−−＋　−−−＋ 　−−−＋ レーン　１　２　３　４　５　６　７　８　９　１０　１１　１２ＦＩＧ、　４ １ ａ）＋ＯフコピーのＨＩ　Ｖ　１１５−ｍｅｒの製造 Ｖ　？′）成分を混合 変性ＰＡＧＥで分析 一１ ＦＩＧ、　４３ ＦＩＧ、　４４Ａ ＨＩＶ　Ｓ　ｉｓ−ｍｅｔ　＠　４００　ｕｇ／ｍｌ　ＡＭＡＦＩＧ、４４Ｂ ＬＡＭＢＤＡ　５００−ｍｅＦ　＠　＋００　Ｕ９／ｍｌ　ＡＭＡＦＩＧ、　４ ４Ｃ 希釈の対数 ＦＩＧ、　４４　Ｄ ＡＭＤＭＩＰ−＋　＋　ＡＭＤＭＩＰ　−＋　＋１−一」乞ＭＷ仇−−−１１− 翌咀−辿一一一一一〜−２１欅的　＋　十＋＋＋十十十＋十十＋ ＃ＰＣＲザイクル２０　３０　２０　３０　２０　３０　２０　３０　２０　３ ０　２０　３０ＡＭＩ：ＬうＩＦ　−−＋　＋　＋　＋　−−＋　＋　＋　十ｈ Ｖ　−十　十　−−−−＋　＋　−−ＦＩＧ、　４６ −ユ空胆」鼾り一　−」５辷１江−− 標的　＋　＋＋＋　＋＋−＋　＋＋十十＋−＋＋−ｒりｌｌ／ＰＣ日２０３０　 ２０　３０　２０　３０３０　２０　３０　２０　３０　２０　３０ＡＭＤＭＩ Ｐ　−−十　＋　＋　＋　−−−＋　＋　十　＋ｈｖ　−−十＋　−−−−−＋ 　＋　−−Ｍ＋　１　２　３　４　５　６　１１　１２　１３　１４　４５　１ ６嘲 噌 ＦＩＧ、　４９ 補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法　第１８４条の８） 平成　４年　４月２４日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１は−ＯＨ、−Ｂｒ、−Ｃｌ、−Ｉ、−ＮＨ２、または−ＮＨ３＋Ｘ −であり、ここでＸ−はＢｒ−、Ｃｌ−またはＩ−であり、そしてＲ２、Ｒ３お よびＲ４は同一であっても異なっていてもよく、−Ｈまたは３Ｈである］を有す る化合物。 ２．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１は−Ｂｒまたは−Ｉであり、Ｒ２とＲ３は同一であっても異なって いてもよく、−Ｈまたは３Ｈである］を有する化合物。 ３．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１は▲数式、化学式、表等があります▼であり、ここでｎは６−１６ の整数であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同一であっても異なっていてもよく、− Ｈまたは３Ｈであり、Ｒ５＝Ｒ７＝−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７または− Ｃ４Ｈ９であり、そしてＲ６は式−Ｈまたは：▲数式、化学式、表等があります ▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ または ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する］を有する化合物またはその塩。 ４．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１は▲数式、化学式、表等があります▼であり、ここでｎは６−１６ の整数であり、Ｒ２とＲ３は同一であっても異なっていてもよく、−Ｈまたは３ Ｈであり、Ｒ４＝Ｒ６＝−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７または−Ｃ４Ｈ９で あり、そしてＲ５は式−Ｈまたは： ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ または ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する］を有する化合物またはその塩。 ５．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１とＲ２は同一であっても異なっていてもよく、−Ｈまたは３Ｈであ る〕を有する化合物。 ６．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１とＲ２は同一であっても異なっていてもよく、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ ５、−Ｃ３Ｈ７または−Ｃ４Ｈ９である］を有する化合物。 ７．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘは−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉである］を有する化合物。 ８．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘは−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉであり、Ｒは−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、− Ｃ３Ｈ７または−Ｃ４Ｈ９である］を有する化合物。 ９．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は同一であっても異なっていてもよく、−Ｈまた は３Ｈである］を有する化合物。 １０．核酸にカップリングされた、１つまたはそれ以上の請求項１、２、３、４ 、５、６、７、８または９記載の化合物から成る複合体。 １１．前記カップリングは非共有結合である、請求項１０の複合体。 １２．前記カップリングは共有結合である、請求項１０の複合体。 １３．前記核酸はウイルス、細菌、真菌、マイコプラズマおよび原生動物のＤＮ Ａより成る群から選ばれる、請求項１０の複合体。 １４．前記核酸はヒト核酸である、請求項１０の複合体。 １５．５０の核酸塩基対あたり１より多い５−アミノメチルイソプソラレン分子 の付加レベルで核酸にカップリングされた５−アミノメチルイソプソラレンから 成る複合体。 １６．５０の核酸塩基対あたり１より多い４′−アミノメチル−４，５′−ジメ チルイソプソラレン分子の付加レベルで核酸にカップリングされた４′−アミノ メチル−４，５′−ジメチルイソプソラレンから成る複合体。 １７．前記核酸はＤＮＡである、請求項１５または１６の複合体。 １８．前記核酸はＲＮＡである、請求項１５または１６の複合体。 １９．次の工程： ａ）７−ヒドロキシ−５−メチルクマリンを供給すること；およびｂ）７−ヒド ロキシ−５−メチルクマリンを処理して５−メチルイソプソラレンを製造するこ と； から成る５−メチルイソプソラレンの合成方法。 ２０．次の工種： ａ）７−ヒドロキシ−５−メチルクマリンを供給すること；ｂ）７−ヒドロキシ −５−メチルクマリンを処理して７−（２，２−ジエトキシエチルオキシ）−５ −メチルクマリンを製造すること；およびｃ）７−（２，２−ジエトキシエチル オキシ）−５−メチルクマリンを処理して５−メチルイソプソラレンを製造する こと；から成る５−メチルイソプソラレンの合成方法。 ２１．次の工程： ａ）７−アルキルカルボニルオキシ−６−（β−ハロアリル）−４−メチルクマ リンを供給すること；および ｂ）７−アルキルカルボニルオキシ−６−（β−ハロアリル）−４−メチルクマ リンを処理して４，５′−ジメチルイソプソラレンを製造すること； から成る４，５′−ジメチルイソプソラレンの合成方法。 ２２．次の工程： ａ）７−アルキルカルボニルオキシ−６−（β−ハロアリル）−４−メチルクマ リンを供給すること； ｂ）７−アルキルカルボニルオキシ−６−（β−ハロアリル）−４−メチルクマ リンを処理して４，５′−ジメチルイソプソラレンを製造すること；および ｃ）４，５′−ジメチルイソプソラレンを処理して４′−アミノメチル−４，５ ′−ジメチルイソプソラレンを製造すること；から成る４′−アミノメチル−４ ，５′−ジメチルイソプソラレンの合成方法。 ２３．次の工程： ａ）４，５′−ジメチルイソプソラレンを供給すること；およびｂ）４，５′− ジメチルイソプソラレンを窒素供与体と反応させて４′−アミノメチル−４，５ ′−ジメチルイソプソラレンを製造すること； から成る４′−アミノメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレンの合成方法。 ２４．前記窒素供与体はフタルイミド塩、Ｎ−ヒドロキシメチルフタルイミドお よびヘキサメチレンテトラミンより成る群から選ばれる、請求項２３の方法。 ２５．次の工程： ａ）４′−ヒドロキシメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレンを供給するこ と； ｂ）４′−ヒドロキシメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレンを処理して４ ′−ハロメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレンを製造すること； ｃ）４′−ハロメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレンを処理して４′−フ タルイミドメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレンを製造すること；および ｄ）４′−フタルイミドメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレンを処理して ４′−アミノメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレンを製造すること； から成る４′−アミノメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレンの合成方法。 ２６．次の工程： ａ）５−ハロメチルイソプソラレンを供給すること；およびｂ）５−ハロメチル イソプソラレンを処理して５−アミノメチルイソプソラレンを製造すること； から成る５−アミノメチルイソプソラレンの合成方法。 ２７．前記５−ハロメチルイソプソラレンの供給は５−メチルイソプソラレンか ら５−ブロモメチルイソプソラレンを合成することから成る、請求項２６の方法 。 ２８．前記５−ハロメチルイソプソラレンの処理は５−ハロメチルイソプソラレ ンをヘキサメチレンテトラミンと反応させることから成る、請求項２７の方法。 ２９．次の工程： ａ）ホルミルイソプソラレンを供給すること；およびｂ）前記ホルミルイソプソ ラレンを処理して放射能標識５−アミノメチルイソプソラレンを製造すること； から成る放射能標識５−アミノメチルイソプソラレンの合成方法。 ３０．次の工程： ａ）標識５−アミノメチルイソプソラレンと核酸を供給すること；および ｂ）前記標識５−アミノメチルイソプソラレンを前記核酸にカップリングするこ と； から成る核酸の標識法。 ３１．次の工程； ａ）１種またはそれ以上のフロクマリンと核酸を供給すること；および ｂ）Ｔａｑポリメラーゼによる前記核酸の複製を阻止すべく、前記１種またはそ れ以上のフロクマリンを前記核酸にカップリングすること； から成る核酸の鋳型依存性酵素的合成の阻止方法。 ３２．次の工程： ａ）１種またはそれ以上のフロクマリンと核酸を供給すること；および ｂ）Ｔ４ポリメラーゼによる前記核酸の複製を阻止すべく、前記１種またはそれ 以上のフロクマリンを前記核酸にカップリングすること； から成る核酸の鋳型依存性酵素的合成の阻止方法。 ３３．前記１種またはそれ以上のフロクマリンは５−メチルイソプソラレン、５ −アミノメチルイソプソラレンおよび４′−アミノメチル−４，５′−ジメチル イソプソラレンより成る群から選ばれる、請求項３１または３２の方法。 ３４．次の工程： ａ）１種またはそれ以上のイソプソラレンと核酸を供給すること；および ｂ）逆転写酵素による前記核酸の複製を阻止すべく、前記１種またはそれ以上の イソプソラレンを前記核酸にカップリングすること； から成る核酸の鋳型依存性酵素的合成の阻止方法。 ３５．前記１種またはそれ以上のイソプソラレンは５−メチルイソプソラレン、 ５−アミノメチルイソプソラレンおよび４′−アミノメチル−４，５′−ジメチ ルイソプソラレンより成る群から選ばれる、請求項３４の方法。 ３６．次の工程： ａ）４′−アミノメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレンと核酸を供給する こと；および ｂ）大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩによる前記核酸の複製を阻止すべく、前記４′ −アミノメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレンを前記核酸に結合すること ； から成る核酸の鋳型依存性酵素的合成の阻止方法。 ３７．次の工程： ａ）４′−アミノメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレンと核酸を供給する こと；および ｂ）Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼによる前記核酸の複製を阻止すべく、前記４′− アミノメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレンを前記核酸に結合すること； から成る核酸の鋳型依存性酵素的合成の阻止方法。 ３８．次の工程： ａ）標的配列を含む核酸を供給すること；ｂ）５−アミノメチルイソプソラレン を供給すること；およびｃ）前記５−アミノメチルイソプソラレンを前記標的配 列にカップリングすること； から成る標的配列の修飾方法。 ３９．次の工程： ａ）標的配列を含む核酸を供給すること；ｂ）５−アミノメチルイソプソラレン を供給すること；ｃ）前記５−アミノメチルイソプソラレンを前記標的配列にカ ップリングすること；および ｄ）前記標的配列を検出すること； から成る標的配列の検出方法。 ４０．次の工程： ａ）標的配列を含む核酸を供給すること；ｂ）４′−アミノメチル−４，５′− ジメチルイソプソラレンを供給すること； ｃ）前記４′−アミノメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレンを前記標的配 列にカップリングすること；およびｄ）前記標的配列を検出すること； から成る標的配列の検出方法。 ４．次の工程： ａ）１種またはそれ以上のフロクマリンと核酸を供給すること；および ｂ）前記１種またはそれ以上のフロクマリンを核酸の不在下で照射すること； から成る光生成物の合成方法。 ４２．前記１種またはそれ以上のフロクマリンは５−アミノメチルイソプソラレ ンおよび４′−アミノメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレンより成る群か ら選ばれる、請求項４１の方法。 ４３．次の連続工程： ａ）任意の順序で、 ｉ）１種またはそれ以上のフロクマリン誘導体、およびｉｉ）核酸 を供給すること； ｂ）前記フロクマリン誘導体に活性波長の電磁線を照射すること；および ｃ）活性波長の電磁線の不在下で前記照射フロクマリン誘導体を前記核酸と混合 すること； から成る核酸への光生成物の結合方法。 ４４．次の工程： ａ）任意の順序で反応成分として、 ｉ）核酸、 ｉｉ）増幅試薬、 ｉｉｉ）１種またはそれ以上の増幅酵素、ｉｖ）１種またはそれ以上の失活用化 合物、およびＶ）反応物を収容する手段 を供給すること； ｂ）前記反応物収容手段に、任意の順序で、前記核酸と前記増幅試薬を加えて反 応混合物を調製すること；およびｃ）前記反応混合物に、時間的順序を特定せず に、ｉ）前記１種またはそれ以上の増幅酵素、およびｉｌ）前記１種またはそれ 以上の失活用化合物を加えること； から成る核酸の処理方法。 ４５．前記反応混合物に前記１種またはそれ以上の増幅酵素を添加した直後に前 記反応物収容手段を閉鎖することをさらに含む、請求項４４の方法。 ４６．前記核酸は１つまたはそれ以上のセグメントをもつ標的配列を含む、請求 項４４の方法。 ４７．前記反応混合物に前記１種またはそれ以上の増幅酵素を添加した後、前記 １つまたはそれ以上のセグメントを増幅させる、請求項４６の方法。 ４８．工程ｃ）の後、前記増幅したセグメントは実質的に非増幅性である、請求 項４７の方法。 ４９．次の工程： ｄ）増幅した、実質的に非増幅性の前記セグメントを検出すること； をさらに含む、請求項４８の方法。 ５０．前記検出はハイブリダイゼーションから成る、請求項４９の方法。 ５１．前記核酸は１つまたはそれ以上の内部プローブを含む、請求項４４の方法 。 ５２．前記１種またはそれ以上の増幅酵素を添加した後、前記１つまたはそれ以 上の内部プローブを増幅させる、請求項５１の方法。 ５３．工程ｃ）の後、前記増幅した内部プローブは実質的に非増幅性である、請 求項５２の方法。 ５４．次の工程： ｄ）増幅した、実質的に非増幅性の前記内部プローブを検出すること； をさらに含む、請求項５３の方法。 ５５．前記増幅試薬はＰＣＲ試薬から成る、請求項４４の方法。 ５６．前記増幅酵素は熱安定性ポリメラーゼである、請求項５５の方法。 ５７．前記熱安定性ポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼである、請求項５６の方 法。 ５８．前記核酸はデオキシリボ核酸である、請求項４４の方法。 ５９．前記核酸はリボ核酸である、請求項４４の方法。 ６０．前記１種またはそれ以上の失活用化合物は活性化化合物である、請求項４ ４の方法。 ６１．前記失活用活性化化合物は光反応性化合物である、請求項６０の方法。 ６２．前記反応混合物に１種またはそれ以上の増幅酵素を添加した後で前記失活 用光反応性活性化化合物を活性化する、請求項６１の方法。 ６３．前記反応混合物に１種またはそれ以上の失活用光反応性活性化化合物を添 加した後で前記失活用光反応性活性化化合物を活性化する、請求項６１の方法。 ６４．前記反応混合物に紫外線を照射することにより前記失活用光反応性活性化 化合物を活性化する、請求項６３の方法。 ６５．前記反応混合物に紫外線の蛍光源を照射することにより前記失活用光反応 性活性化化合物を活性化する、請求項６３の方法。 ６６．前記反応混合物に１種またはそれ以上の失活用光反応性活性化化合物を添 加する前に前記失活用光反応性活性化化合物を活性化する、請求項６１の方法。 ６７．前記１種またはそれ以上の失活用化合物は光生成物である、請求項４４の 方法。 ６８．前記失活用光反応性活性化化合物はフロクマリン誘導体である、請求項６ １の方法。 ６９．前記失活用フロクマリン誘導体はプソラレンである、請求項６８の方法。 ７０．前記失活用フロクマリン誘導体はイソプソラレンである、請求項６８の方 法。 ７１．前記失活用イソプソラレンは７−（２，２−ジエトキシエチルオキシ）− ５−メチルクマリン、５−メチルイソプソラレン、５−ブロモメチルイソプソラ レン、５−クロロメチルイソプソラレン、５−ヒドロキシメチルイソプソラレン 、５−ホルミルイソプソラレン、５−ヨードメチルイソプソラレン、５−ヘキサ メチレンテトラミノメチルイソプソラレン、５−アミノメチルイソプソラレン、 ５−Ｎ−（Ｎ，Ｎ′−ジメチル−１，６−ヘキサンジアミン）−メチレン−イソ プソラレン、５−Ｎ−〔Ｎ，Ｎ′−ジメチル−（６−［ビオチンアミド］−ヘキ サノエート）−１，６−ヘキサン−ジアミン］）−メチレン−イソプソラレン、 ５−Ｎ−［Ｎ，Ｎ′−ジメチル−Ｎ′−（２−｛ビオチンアミド｝−エチル−１ ，３−ジチオプロピオネート）−１，６−ヘキサンジアミン］−メチレン−イソ ブソラレン、５−Ｎ−［Ｎ，Ｎ′−ジメチル−Ｎ′−（カルボキシ−フルオレセ インエステル）−１，６−ヘキサンジアミン）−メチレン−イソプソラレン、お よびそれらの放射能標識誘導体より成る群から選ばれる、請求項７０の方法。 ７２．前記失活用イソプソラレンは５−メチルイソプソラレン、５−アミノメチ ルイソプソラレン、５−Ｎ−［Ｎ，Ｎ′−ジメチル−（６−［ビオチンアミド］ −ヘキサノエート）−１，６−ヘキサン−ジアミン］）−メチレン−イソプソラ レン、５−Ｎ−［Ｎ，Ｎ′−ジメチル−Ｎ′−（２−｛ビオチンアミド｝−エチ ル−１，３−ジチオプロピオネート）−１，６−ヘキサンジアミン］−メチレン −イソプソラレン、５−Ｎ−［Ｎ，Ｎ′−ジメチル−Ｎ′−（カルボキシ−フル オレセインエステル）−１，６−ヘキサンジアミン）−メチレン−イソプソラレ ン、およびそれらの放射能標識誘導体より成る群から選ばれる、請求項７１の方 法。 ７３．前記失活用イソプソラレンは７−（Ｂ−ハロアリルオキシ）−４−メチル クマリン、７−アリルオキシ−６−（Ｂ−ハロアリル）−４−メチルクマリン、 ４，５′−ジメチルイソプソラレン、４′−クロロメチル−４，５′−ジメチル イソプソラレン、４′−ブロモメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレン、４ ′−ヒドロキシメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレン、４′−ホルミル− ４，５′−ジメチルイソプソラレン、４′−フタルイミドメチル−４，５′−ジ メチルイソプソラレン、４′−アミノメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレ ン、４′−ヨードメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレン、４′−Ｎ−（Ｎ ，Ｎ′−ジメチル−１，６−ヘキサンジアミン）−メチル−４，５′−ジメチル イソプソラレン、４′−Ｎ−［Ｎ，Ｎ′−ジメチル−Ｎ′−（６−｛ビオチンア ミド｝−ヘキサノエート）−１，６−ヘキサンジアミン］−メチレン−４，５′ −ジメチルイソプソラレン、４′−Ｎ−［Ｎ，Ｎ′−ジメチル−Ｎ′−（２−｛ ビオチンアミド｝−エチル−１，３−ジチオプロピオネート）−１，６−ヘキサ ンジアミン］−メチレン−４、５′−ジメチルイソプソラレン、４′−Ｎ−［Ｎ ，Ｎ′−ジメチル−Ｎ′−（６−カルボキシフルオレセインエステル）−１，６ −ヘキサンジアミン）−メチレン−４，５′−ジメチル−イソプソラレン、およ びそれらの放射能標識誘導体より成る群から選ばれる、請求項７０の方法。 ７４．前記失活用イソプソラレンは４，５′−ジメチルイソプソラレン、４′− アミノメチル−４，５′−ジメチルイソプソラレン、４′−Ｎ−［Ｎ，Ｎ′−ジ メチル−Ｎ′−（６−｛ビオチンアミド｝−ヘキサノエート）−１，６−ヘキサ ンジアミン］−メチレン−４，５′−ジメチルイソプソラレン、４′−Ｎ−［Ｎ ，Ｎ′−ジメチル−Ｎ′−（２−｛ビオチンアミド｝−エチル−１，３−ジチオ プロビオネート）−１，６−ヘキサンジアミン１−メチレン−４，５′−ジメチ ルイソプソラレン、４′−Ｎ−［Ｎ，Ｎ′−ジメチル−Ｎ′−（６−カルボキシ フルオレセインエステル）−１，６−ヘキサンジアミン）−メチレン−４，５′ −ジメチル−イソプソラレン、およびそれらの放射能標識誘導体より成る群から 選ばれる、請求項７０の方法。