JPH05501407A - 抗菌性の微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗菌性の微生物 技術分野 本発明は抗菌性の微生物に関し、特に新規な菌株の螢光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｇ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）に関し且つ菌による侵食作用から植物を保護す るのにその使用に関する。

背景技術 意図した用途に有用な活性があるかを調べるため土壌からの多数の典型的には幾 千の単離物を選別する（スクリーンする）ことにより有用な特性を有する微生物 を探求するのは普通の微生物学的な実施法である。

か＼る１つの用途は、選択した植物病原菌に対して活性である生物学的な調節剤 （ＢＣＡ、　）の単離である。か＼るＢＣＡ、は病原菌調節用の化学薬剤に対す る別の手段又は補足的な手段を提供する。

通常の実施法においては、興味の対象となる病害が抑圧されていると思われる野 外の場所から土壌試料を取出し、それ故これによって土壌それ自体中の微生物が 発病を阻止しつ＼あることを示し得るからである。

次いで根から洗浄し且つ微生物の生育に最適な温度、通常２５〜３０°Ｃに典型 的である【回又は２回の温度範囲で寒天上で生育させることによシ実験室で微生 物を個々の試料から単離する。次いで２重培養法を用いて一連のハトリ皿中で寒 天中の種々の病原菌に対して単離物を最初選別する。この操作は一次選別（スク リーン）を表わす。次いで一次スクリーンからの有望な単離物を、土壌を用いる 一連の二次スクリーンでより精密に検査する。

本発明者の経験によれば、従来の伝統的な一次スクリーンは、結局は次後の選別 試験（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｔｅｓｔ　）及び野外試験に向って合格する単離物 について適当な程に且つ十分な程に選択的ではない。従来の一次スクリーンは見 込みのある多数の単離物（典型的には２０チ付近）を合格させるが、これらの単 離物の大部分は次後の試験で拒絶される。更に、本発明者が知る所によれば一次 スクリーンは有用な活性が不足していることが次後に示される単離物を合格させ るのく加えて、本発明者が知っている通り次後の選別試験に完全に合格し得る成 る単離物を落第させる。これの結果は従来の伝統的な試験が発病の不十分な阻止 剤である単離物を合格させ且つ発病の良好な阻止剤である単離物を落第させるこ とである。

多数の潜在的に良好な単離物を回収し且つ不十分な活性の物質を出来るだけ多数 拒絶するように土壌単離物を選別する新規な方法に対する必要性が明らかにある 。

発明の開示 本発明によると、潜在的な抗菌剤の阻止効果を２回の試験で試験し即ちピチウム （Ｐｙｔｈｉｕｍ　ａｐｐ）の菌糸体が蔓延した殺菌済み土壌中で病害の発生を 阻止する第【の試験と、立枯れ病の複合歯（ｃｏｍｐｌｅｘ）の存在下に該複合 博からの病害を受け易い生長中の植物で病害の発生を再び阻止する第２の試験と で試験し、対照と比較して第【と第２との両方の試験で潜在的な阻止効果を与え る抗菌剤を同定し、該抗菌剤を更なる別の試験にかけることからなる、潜在的な 抗菌剤を選別する方法が提供される。

本発明は専らこれに限定されるものではないが、潜在的な（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ）　ＢＣＡＩＩ用の土壌試料から微生物の選別に特に有用であるが、何故本発明 の同じ方法が何らの応用なしに化学的薬剤に使用されないかという固有の理由は ない。

前述した如く、微生物を単離し得る伝統的な要領はそれ自体選択的ではなく；そ れ故本発明はまた密閉性の容器内に湿った無沼の砂の１層を装入し、その上に湿 った状態の土壌試料を配置し、土壌試料中に興味の対象となる病害を受け易い植 物の種子をまき、容器を密閉し、病害を発生させ易い環境条件下に容器を配置し 、釉子を発芽させ且つその根を土壌層から砂層中に伸長させ、両層を縦方向に通 して管容器を切開し、砂ｊ−のみから根を採取し、且つ採取した根から微生物を 単離することからなる、土壌試料から微生物を単離する予備選別方法を提供する 。

本発明により規定した２回の試験に合格する化学的又は微生物学的薬剤は、次い で１回又はそれ以上の追加の試験で次の感染； （ａ）　１２〜１５’ｃの温度でアファノミセス　コクリオイ感染； （ｅ）　１８〜２じＣの温度でフーザリウム　クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　 ｃｕｌｍｏｒｕｍ）による小麦の感染；（ｆ）　２０〜２４６Ｃの温度でフィト フトラ　メガスはルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ）に よる大豆の感染；（ｇ）　２０〜２４６Ｃの温度でフーザリウム　モニリホルメ （Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）による馬鈴薯スライスの感染； （ｈ）　２０〜２４°Ｃの温度でフーザリウム　サムブシナム（Ｆｕｓａｒｉｕ ｍ　ｓａｍｂｕｓｉｎｕｍ）による馬鈴薯スライスの感染；及び （ｉ）　１５〜１９°Ｃの温度でホー？　（Ｐｈｏｍａ　５ｐｐ）によるテンサ イの感染 から選んだ菌による感染を阻止するため更に選別できる。

即し本発明のあらゆる可能な要素を一緒に組合せて、潜在的なりＣＡＩ］は、根 活性の微生物を採取するのみに意図される方法によって単離でき、高活性潜在力 を有する微生物を同定する２回の最初の試験で選別でき、次いで種々の野外条件 下で試験した時に高度に丈夫であると次後に判明する薬剤を同定する一連の厳正 な試験で選別する。この操作法によると前述した如く、本発明の試験に合格する 微生物を却下する傾向がありしかも本発明の試験が十分に不活性であるか又は対 照よりも余り活性でないことを示すきわめて多数の微生物を合格させる傾向があ る従来の伝統的方法よりも優れた大きな利点を示す。

次いで本発明は本発明の前記選別試験によって示される如く匹敵し得る化学薬剤 と同じ又はそれより良い菌感染阻止率を示す抗菌４１を包含する。

本発明の方法によって、本発明者は４棟の微生物を嚇離且つ評価し、本発明者が 見出した所によればこれらの微生物は一般に立枯れ病（ｄａｒｎｐｉｎｇ−ｏｆ ｆ）に関連して田による種々の病害に対して特に活性であり、しかもそれ故本発 明はまた螢光沼（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓ−竺旺）の微生物を 含有する抗菌剤を包含し、該微生物の培養物はブタにスト条約により受理番号第 ４０１８６号。

ｒｆｊ４０１８７号、第４０１８８号及び第４Ｏ＋９Ｏ号として菌寄託機関であ る英国のナショナル　コレクション　オプ　イノタストリプル　アンド　マリー ンバクテリア　リミテッド（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　 Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　ＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａ　Ｌｉｍ１ｔｅ ｄ　；以下ＮＣＩ　Ｂと称す）に１９８９年９月１日に寄託された。

本発明はまた農業用途に許容しうる担体組成物と混合して前記微生物の何れか１ 穐又はそれ以上を有効成分として含有する抗菌性の農薬組成物を包含する。

使用し得る農薬組成物の種類の例は種子の被覆用組成物、根又は土壌の浸漬用液 体及び顆粒状又は粉末状組成物である。これらの組成物の基剤物質は技術的に周 知である。

本発明の選別効率の例として、本発明者は約７０００の単離物を選別する従来の 伝統的な”試験管内“方法を使用し、約２０−の合格率を見出した。然るに本発 明の方法を使用すると約４〜５チのみの単離物を合格させたに過ぎない。然しな から重要な点は本発明の最低で２回の試験の各々に合格した採取微生物はきわめ て同様であるが、然るに従来の寒天選別では全く異なる採取微生物を合格させた 。従来の伝統的な選別法に依存したならば廃棄されたかもしれない微生物の若干 は次後の選別試験及び野外試験で高活性を示した。これは本発明の重要な利点で ある：最初の選別は別段の選別処理を必要とする微生物の全体数を低下させ、別 段の選別処理に処方される微生物の大きな割合は野外で探求した活性を示すこと が次後に見出される。本発明者が思うにその理由は次の如くである。従来法の試 験パラメーター例えば温度及び栄養組成物は寒天中で微生物を生育させるのを促 進させるために最適とされる：か＼る養育は微生物の意図した使用がなされる条 件の可酷な環境−ヒの現実とはずつとかけ離れている。

従ってこの最初の選別で生存する微生物の多数は一般に弱く、寒天培地の閉じ込 めた環境でのみ生存し得るものであり、次後に落第する。何故ならばより可酷な 二次選別及び別設の選別は実際の野外環境により親密に近接し始めるからである 。他方、１回分の単離物内には、例えば温度が低いか又は栄養分が余り豊富でな く又は異なった組成を有する野外条件に好ましい微生物の菌株が存在するもので ありしかも本発明者の経験ではこれは真実であると示している。か＼る微生物は 尊大試験では十分に培養されず、普通廃棄されるものである。本発明者の証拠で は、本発明の要点である２回の選別は野外条件により近い試験環境を提供し且つ こうして微生物を使用しようとする環境中で微生物が増殖する能力についてより 実際的な指示を与えるものである。

本発明はまた植物における菌による病害を阻止する方法を提供するものであり、 植物、その種子又は植物の生育媒質に本発明の抗隋剤を有効投与量で施用するこ とからなる。

更には、本発明は植物、植物の根又は種子あるいは植物を包囲している土壌に対 して前記の螢光菌（ハ！ト殺菌有効量で施用することからなる、農作物を菌によ る感染から保護する方法を提供する。

菌株ＮＣＩＢ第４０１８７号は英国ウィルトシャイヤ州（Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ　 ）、５ｗ１ｎｄｏｎ、　ＣｈｉａｅｌｄｏｎのＤｒａｙｃｏｔｔＦａｒｍ、　Ｂ ａｄｂｕｒｙ　２として知られる農場の畑地で生長させた小麦から採取した根か ら単離された。

菌株ＮＣＩＢ第４０１８６号及び第４旧８８号は（ルギーのＪｏｄｏｉｇｎｅの ５ｔｏｃｋｏｙ　Ｆｉｅｌｄとして知られる畑地から採取した土壌から単離され た。

菌株ＮＣＩＢ第４０１９０号は英国ニューベリー州（Ｎｅｗｂｕｒｙ　）＋　Ｌ ｏｗｅｒ　Ｇａｒｓｔｏｎ　ｆｉｅｌｄから小麦幼苗の根から単離された。

農作物に感染する若干の菌又はカビに対する活性を調べるために細菌性単離物の 単離、特性表示及び選別を以下に記載する。きわめて多数の微生物を以下に記載 した要領で単離し、同定し且つ選別した。本発明の４つの菌株は選別試験でその 顕著な性能故に選択された。

微生物の単離 【端から５〜７αの所に節を作りながら深さ３５傭、幅５．５ｏｎの透析管から １本の管体を作成した。微細な砂を洗浄し、乾燥させ、管体に１２ｃｒｎの深さ にまでそ＼ぎ、２０−の蒸留水で湿らせた。砂入りの管体を、支持用のガラス管 （直径７ｃＩｎ、深さ３０　ｃｍ　）内部に配置した。次いで管体はその底部で アルミニウム箔で被横したゴム栓により閉鎖しその頂部で主線の栓によシ閉鎖し 、次いでアルミニウム箔で包装した。かくして管体組立て体を１２１°Ｃで６０ 分間２回オートクレーブ処理した。

土壌試料を目標の土壌場所から採取し、採取してから２日以内に使用するまで４ ″Ｃで４０゛チの湿度に維持した。土壌試料を４朋の篩に通して篩分し、砂の頂 部に３漂の深さとなるまで前記の管体に装入した。種子（エントウ、小麦、テン サイ、ヒマワリ、トウモロコシ又は大豆）を播種し、全体で６ｔｙｎの深さとな るまで土壌で被徨した。管体を金網のカゴに直立して配置し、次いで空気の交換 を可能とし且つ蒸発による損失を最小とする開孔を有するプラスチック容器に収 容した。

次いでカゴを生長室に配置し、１６時間の昼間／８時間の夜間のサイクルで１０ 〜２４６Ｃの温度で７０チの相対湿度で４週間生長させた。

４週間の生長後にプラスチックの透析管を、予じめ殺菌したメスで切開した。各 々の植物の根から土壌及び砂を撞き払い、植物を白色のプラスチック浅皿に配置 した。供試植物の刷上及び頂点領域を切断し、滅菌水で別個に洗浄した。

上記の切断断片を、脱イオン水２０−とガラスピーズ層とを入れである滅菌エル シンマイヤーフラスコ中に入れた。次いでこのフラスコを旋回培養器（ｏｒｂｉ ｔａｌｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で１２Ｏｒｐｍで３０ｆ＋間振盪した。根（ｒｏｏ ｔ）の純粋（ｎｅａｔ　）溶液と、上記フラスコから得た根及び刷上（ｃｒｏｖ ｎ）洗液とを用いて、１．９希釈液を滅菌リンゲル（Ｒｉｎｇｅｔ　）溶液中で 調製して１０−３希釈液とした。

次いで各溶液からの標本試料１００μｔを、王妃の各組成をもつ３種類の寒天培 地の表面に塗抹移植した（ａｐｒｅｎｄトリプトンンイブロス　３．０ｚ 細菌学的寒天　１７．５　Ｐ 脱イオン水　ｔｏｏｏ− 〔この培地を１２　＋　６Ｃで１５分間高圧滅菌した〕新鮮な小麦の根　１０２ 寒天風３　１７．５１ｉ’ 脱イオン水　ｔｏｏｏ　− 〔上記の小麦の新鮮な根を秤量し、食品配合機を使用して少量の脱イオン水と混 合した。次いで得られた濃厚懸濁液を小さなメツシュのモスリ／の４層の袋の中 に入れ、次いで２ぶビーカー中の脱イオン水の残部に懸濁し、２０’Ｃで４日Ｖ Ｊ装置（１ｎｃｕｂａｔｅ　）　した。次いでモスリン袋を取り除いて、得られ た根細出液に寒天を加えた。次いで得られた培地を１２ピＣで１５分間高圧滅菌 した。〕土壌抽出液・寒天培地 土壌試料　【０１ 寒天ｒ載３　ｔ７．５ｇ 脱イオン水　ｔｏｏｏ　− 〔上記土壌を秤量し、２Ｊ！ビーカーに入れた脱イオン水中に入れた。この土壌 懸濁物にふたをし、２０″Ｃで４日間製置し、その後にそれを小さなメツシュの モスリンの４層を通して流出させた。次いで寒天を加え、得られた培地を１２ピ Ｃで１５分間高圧滅菌した。〕 各希釈液あたり同じものを３１８！！　（ｔｈｒｅｅ　ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ） 調製した。前記の寒天平板を１２°Ｃで最大で５日間迄装置し、その後に各寒天 平板上のコロニー数を数えて配録した。可能な場合には、各植物と生態条件（ｎ ｉｃｈｅ）と寒天混合物とから得た平板であって５０個以下のコロニーを含む平 板を選択した。このことが可能でない場合には、５０個の交点をもつ網目（ｇｒ ｉｄ）を、ヒ記平板−ヒに引いて、この交点の上に又は最も近い所にあるコロニ ーを取った。このようにしてコロニーの選択は全く不規則（ｒａｎｄｏｍ　）で あった。

個々のコロニーを滅菌ループ（１ｏｏｐ　）を用いて平板から取り、次いで１／ １０　）　ＩＪプトン・ンイ・寒天培地（１／１０ＴＳＡ）を入れた直径５ｔＭ のはトリ皿上で継代培養した。次いでこの平板を【２°Ｃで５日間製置した。

次いでこの分離株の純度を調べた。混合培養株である場合には、該分離株を１／ ｌ０ＴＳＡ培地斜面−ヒに画線して単一のコロニーを得た。１個のコロニーを選 択し、１／１０　ＴＳＡ培地上で継代培養した。得られた培養株コレクション（ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　）を４’Ｃで保存した。

微生物の形態学的特性 本発明の微生物の形態学的特徴は下記の通りであるＯＮＣＩ　Ｂ　４０１８６　 ：灰白色１円形、規則的である、完全である（ｅｎｔｉｒｅ）、低い凸状、平滑 。

光沢あり、半透明、直径１．５〜２　ｍｍＮＣｌＢ４Ｏ１８７；灰白色２円形、 規則的である、完全である、持し上がった状態（ｒａｉｓｅｄ）。

平滑、光沢あり、半透明、直径１Ｏ ＮＣＩＢ４０１８８：灰白色１円形、規則的である、完全である、低い凸状１円 滑、光沢あり。

半透明、直径【、５〜２　ｍｍ ＮＣｌＢ４Ｏ１９０：灰白色２円形、規則的である、完全である、平坦１円滑、 光沢あり、半 透明、直径【顛 生育温度； 上記の菌株全部について　３７°Ｃ＋ｖｅ螢　光　上Ｐ己の菌株全部について　 ＋ｖｅグルコースＯＦ 硝酸塩の還元 インドールの産生 グルコースからの酸の生成 アルギニン・デヒドロラーゼ＋　＋　＋　十ウレアーゼ エスクリンの加水分解 ゼラチンの加水分解　＋　＋＋＋ β−ガラクトシダーゼ グルコースの資化（ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ）　＋　十＋　＋アラビノースの 資化　＋　＋＋＋ マンノースの資化　十　＋＋＋ マンニトールの資化　＋　＋＋＋ Ｎ−アセチルグルコサミンの資化　＋　＋−＋マルトースの資化　−−一＋ グルコン酸塩の資化　＋　＋＋＋ カプリン酸塩の資化　＋　＋＋＋ アジピン酸塩の資化　−−一＋ マレン酸塩の資化　＋　＋＋＋ クエン酸塩の資化　＋　＋＋＋ フェニル酢酸塩の資化　−−−＋ １次スクリーニング 複数個のハトリ皿（５ｃｍ　）それぞれにジャガイモ・デキストラーゼ寒天（Ｐ ＤＡ）Ｉ　Ｏ−を入れた。あらかじめピチウム・ウルチマム（Ｐｙｔｈｉｕｍ　 ｕｌｔｉｍｕｍ）病原菌を２０°Ｃで生育させた７日間培養物から得た寒天プラ グ（ｐｌｕｇ）　（５ｍｍ　）を、前トビＰＤＡ培地上の中心に置いた。

この寒天平板を２００Ｃで５日間製置した（ｉｎｃｕｂａｔｅｄ）。

その間にピチウム・ウルチマム（ｐ、　ｕｌｔｉｍｕｍ）病原菌が寒天平板でコ ロニーを形成した（ｃｏｌｏｎｉｓｅｄ）。

ミニスター−メンディップ・ローム（Ｍｉｎｓｔｅｒ　Ｍｅｎ−ｄｉｐ　Ｌｏａ ｍ）を【２０°Ｃで６０分間高圧滅菌した。この土壌に小麦胚芽（１重量チ）を 加えて、十分に混合した。

−ヒ記供試菌を１／ｌ０ＴＳＢ培地中で又は１／ｌ０ＴＳＡ平板上で１２’ｃで ４８時間生育させた。

ベトリ皿の各々に、上記培養物２−を施用した。同じ平板を２重に（ｄｕｐｌｉ ｃａｔｅ）　１ｉｌｉｌ製した。

処理剤（ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ）：　１／ｌ０ＴＳＢ単独殺菌剤メタラキシル（ １００ｐｐｍ） 供試微生物 ピチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）を移植していないＰＤＡ上の土壌に加えられた １／ＩＯＴＳＢ 前記平板を［０°Ｃで４日間製置した。

活性を、０〜３の尺度で評価し、前記土壌中におけるＷ４（ｆｕｎｇａｌ　）の 生育完全阻止を基準として選別した。

フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）菌・ジャガイモによる選別試験（３ｅｒｅｅｎ ）滅菌円盤状Ｐ紙（直径９ぼ）を水で十分に湿し、次いで滅菌ハトリ皿の底に置 いた。各処理用に２枚の平板を調製した。

ために明るい所で（ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｉｇｈｔ　）　２０°Ｃで１４日間生育さ せた。次いで、生成した分生胞子を滅菌食塩水（０，８５％）中に懸濁させ、４ ２０ｎｍの分光光度計で２０チの透過率に調整した。

普通房天（Ｏｘｏｉｄ）上で２０″Ｃで２４時間生育させた供試細圃の接種用ル ープの１／２量を、滅菌食塩水２．５−に怒濁させた。対照としてｚ、（１／− ｅの殺菌剤キャブタン（Ｃａｐｔａｎ　）を調製した。対照として、食塩水のみ のものも調製した。

フザリウム菌懸濁液（５０μｔ）を、各処理当りにつき１本の滅菌遠心・管に入 れた。

厚みがｌＯｘｍ未満のジャカイモのスライス（ｓｌｉｃｅ）であって、その中に ４個のウェル（ｗｅｌｌ）を直径【０順のコルクポーラを用いて切っである１枚 のジャカイモのスライスを各ｇトリ皿中に置いた。このジャガイモスライスの表 面をエタノールで滅菌し、次いで滅菌１紙を用いて乾燥した。このスライスは切 断してから３０分以内（又は４°Ｃで保存した場合には６０分以内）に使用した 。

フザリウム菌胞子の懸濁液（分生胞子１０６個／ｒｎｌ）の試料５０μｔを、１ 枚のジャガイモスライスの４個のウェルの内の３個のウェルに入れた。前記の供 試細菌の懸濁液試料（５０μｔ、１ｔｎ１．当り細胞約１０８個）を上記３．固 のウェルの内の１個のウェル中のフザリウム懸濁液と混合し、別のウェルにばＬ ＯＯｐｐｍの殺菌剤ベノミル（ｂｅｎｏｍｙｌ）を混合し、第３のウェルは薬剤 未接種の対照として働らく。

このハトリ皿をそれ用のふたで密閉し、２０°Ｃで３日間濃青した。

病気にかかった組織の量的水準（レベル）をＯ〜３の主観的尺度で評価した。

２．５　Ｘ　２．５　ｘ　１．５　ｍｔｉのサトウダイコン断片の複数個をサト ウダイコンの根の内部から切り取り、次いでプラスチック容器中で滅菌水約１３ −を用いて湿らせた。

サトウダイコンの苗立枯病原菌（Ｐｈｏｍａ　ｂｅｔａｅ）の培養株試料を、推 定されている（　ｐｕｔａｔｉｖｅ　）抗菌性微生物の試料と一緒に又はそれを 用いずに、上記サトウタイコン／土壌に注ぎ、次いで該断片を３週間培養した。

培養期間の終りに、上記サトウダイコン試料を腐敗（ｒｏｔ）について評価した 。

サトウタイコン／土壌・選別試験 サトウダイコンの立枯れ（”　ｄａｍｐ　ｉｎｇ−ｏ　ｆ　ｆ“）を引き起こす ことが知られている天然土壌を湿度４５チに状態調節した。むき出しの（ｎａｋ ｅｄ　）サトウダイコン種子及び供試菌で被覆した種子を上記土壌に播いた。次 いで、この試料を１５°Ｃで昼光照明１２時間で１０日間培養した。供試菌の抗 菌効力を、見苦した苗（ｓｅｅｄｌｊｎｇ　）の本数を基準として、殺菌剤タチ ガレン（Ｔａｃｈｊｇａｒｅｎ）／　ＴＭＴＤによる化学的防除（ｃｈｅｍｉｃ ａｌ　ｃｏｎｔｓｏｌ）と比較して評価した。

２次スクリーニング 選別した微生物の有効性を試験するために、２種類ＰＤＡ平板上で２０°Ｃで７ 日間培養した。シルバー・サンド（ｓｉｌｖｅｒ　５ａｎｄ）　２００　ｔ、コ ーンミール５５’、Ｂｅｅ−ｍａｘコムギ胚芽４ｇ及び水４０−の混合物をＩ　 ２０６Ｃで病原菌用に使用した。

前記のフラスコを２０°Ｃで７日間製置した。

細な砂と混合して最終重量を３００１にした。

メンディップ・ミニスター・ローム（Ｍｅｎｄｉｐ　Ｍｉｎｉ−ｓｔｅｒ　Ｌｏ ａｍ　）　８　Ａ中のＰｙｔｈｉｕｍ病原菌のｌフラスコ量＝２規定（Ｎ） これを病菌のない清浄な（ｃｌｅａｎ）　Ｍｅｎｄｉｐ土壌（ローム）で、必要 とする別の希釈物にまで希釈した。分離株（１ｇ０１ａｔｅ）をＮ／８及びＮ／ ３２の濃度で１２〜１５°Ｃで病原菌接種物の３／４フラスコ量＝１規定（Ｎ） Ｎ／４及びＮ／１６の濃度でスクリーニングに使用した。

試験は３インチの鉢で行なった。鉢にはその３／４まで、病原菌を感染させた土 壌を入れた。エントウの種子５粒を各々の鉢に播き、病菌のない清浄な（ｃｌｅ ａｎ）土壌で覆った。水又は細菌懸濁液の３５−を、各々の鉢に浸液（ｄｒｅｎ ｃｈ　）として加えた。各処理用の反復試験（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）用の鉢とし て５鉢を調製した。ＢＣＡ（生物学的防除剤）選別試験においては、上記細菌を １／ｌ０ＴＳＢ中で、２０°Ｃで４８時間生育させた。懸濁液全部（３５ｍ）を 上記の鉢に加えた。対照は標準的には１／ｌ０ＴＳＢと化学物質（ｃｈｅｍｉｃ ａｌ　）であった。殺菌剤にンシクロンを１０，１００又は２００ｐｐｍの濃度 で浸液としてＲｈ１ｚｏｃｔｏｎｉａ病原菌選別物（５ｃｒｅｅｎ　）　Ｋ加え 、Ｐｙｔｈｉｕｍ病原ｄＭ選別物に対しては殺隋剤メタラキンルを浸液として１ ｏｏｐｐｒｎで加えた。

植物を、Ｒ，５ｏｌａｎｉ病原菌については２０〜２５°Ｃで７〜１４日間、Ｐ ｙｔｈｉｕｍ病原菌については１２−１５°Ｃで１４日間、それぞれ生育させて 試験した。苗（ｓｅｅｄｌｉｎｇ　）の発現（ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ　）を１週に Ｌ回観察した。供試植物には１日に１回水をやった。特別に注意を払って、上記 ２つの病原菌が立枯病を起こすように、試験期間中は土壌が湿潤状態を保つこと を確実にした。

Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ病原面に対するスクリーニン グ Ｐ、　ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ　病原菌の平板培養物から得た直径５朋のプラグ（ ｐｌｕｇ　）を、直径９ｃｎ１の平板の■−８培地−ヒで２５°Ｃで１３日間培 養した。ｖ−Ｂ培地は下記の組成をもつ。

ｖ−３キヤンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ　）ジュース　１８０　＋ｄＣａＣＯｓ　 ２．７９− 蒸留水　７２ｏ− Ｄｉｒｃｏ寒天　１３．５ｐ 〔ザ天以外の上記の各成分を混合し、３０分間蒸気加熱し、ｒ過し、…を７゜２ に調整し、上記寒天を加え、次いで得られた培地を１２０’ｃで２０分間滅菌し た〕湿潤キビ穀粒（ｍｉｌｌｅｔ、　）　（５０Ｐに蒸留水２ｏ−を加えたもの ）を１１０°Ｃで４５分間、２回滅菌した。

Ｐ、　ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ病原菌平板の１／４量を前記キビ穀粒の表面にひつ くり返して置き、暗所で２５’Ｃで２８日間温濃青た。Ｐ、　ｍｅｇａｓｐｅｒ ｍａ　病原菌を感染させたキビ穀粒（重量２２．５ｙ−）を滅繭土壌（ロア７． ５５’）及び水（口２．５５’）と、ミキサー中で十分に混合した。使用した土 壌は、５ｉｌｖｅｒ　５ａｎｄと、−１７の屋外（ｆｉｅｌｄ）土壌と、ｔｏｏ ’ｃで１時間滅菌しておいたモスピード（ｍｏｓｓ　ｐｅａｔ、　）の１：１： １（容量／容量）混合物であった。

病原菌を感染させたキビ穀粒／土壌混合物の５００　ｇ−の量をしｅｏｎａｒｄ ンヤーに秤量して入れ、該ジャーを必要になるまでプラスチック製クロージヤー （ｃｌｏｓｕｒｅ）板で榎った。このＬｅｏｎａｒｄジャーの下部の水受器は蒸 留水１００−で満たした。

上記のキビ穀粒／土壌混合物の表面に移植用の穴を４個調製し、その各々に大豆 （ｃ、ｖ、Ａｚｚｕｒｒａ　）を播き１覆い用（ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ）混合 物で覆った。

供試微生物の培養株を調製し、普通寒天平板上で２８°Ｃで２４時間培養し、２ ５０ｍｊ　ＮＢフラスコ（１５０ｍ７！ＮＢ）中で２８°Ｃで２４時間培養した 。培養物試料７５−を、２０°Ｃで５分間８０００　ｒｐｍで遠心分離した。

上清を捨て、更に試料７５−を加え、再度遠心分離し、再度上清を捨てた。遠心 管に残っているキビ穀粒を食塩水（９，２９−／−１；３）５　ｍＺで繰り返し 洗浄した。最後に、得られたキビ穀粒を食塩水【５０−に分散させ懸濁液を得た 。

得られた食塩水懸濁液３０−を６０−容注射器から前記のＬｅｏｎａｒｄジャー の各々に注入した。

化学薬剤との比較のために、蒸留水５００−に殺菌剤３５チメタラキシル（商標 名：　ＡＰＲＯＮ）　２８５．５５’を溶解した溶液の試料３０−を、対照とし て働（Ｌｅｏｎａｒｄジャー中に注入した。

病原菌を感染させていない（ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ　）キビ穀粒／土壌混合物の 試料を使用して、病原菌未感染の対照を調製した。

次いで種子を播いて栽培室中で１５〜１７，０００ルツクスの照明下で２０±２ °Ｃで生育させた。化学薬剤を用いた対照と比較した苗の発現率（ｐｅｒｃｅｎ ｔ　ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ）を基準として評点評価した。

０Ｃで１０日間生育させ分生胞子を形成させた。形成させた分生胞子を採取し、 【−当り１０’〜１０８個の分生胞子濃度の範囲とした。この保存株（ｓｔａｃ ｋ）から５−をボトル中の小麦の種子」００−に加え、次いでこのボトルを１０ °Ｃで１夜、回転させた。

感染させた種子の試料を、供試菌と５ｉｌｖｅｒ　５ａｎｄの混合物中に６０分 間浸して播種する前に種子【粒当り約１０６個の細胞の被膜を施した。第２の試 料を化学的対照として殺菌剤ベノミル（ｂｅｎｏｍｙｌ）　（１１００ｐｐ　） を用いて処理した。

・　種子１００粒を、深さ２αの育苗器（ｓｅｅｄｌｉｎｇ　ｔｒａｙ）中の泥 炭（ｐｅａｔ　）を基礎とする堆肥中に播いた。この堆肥に試験開始時に水をや り、２０°Ｃで２週間置き、播種後５日目に再度、水をやった。種子の発芽を促 進するだめの堆肥への最初の給水の後に、堆肥を乾燥させたままにして病害の発 現を促進させた。

苗を元画と病害発現のために監視した。病害の症状は０（病害の症状なし）〜４ （病害が甚大）の尺度で評価した。

結果 ７０００個の土壌細菌分離株を前記の試験により選別した。これらの試験の結果 を以下の第１表に要約した。

表の欄中の数値はＯ（抗菌効果がない）〜３（認められる病害の症状がない）の 尺度に基づくものである。

また、表中には典型的な効果のない菌株すなわら５３／８７　と呼ぶ菌株の比較 例を含めた。

１次スクリーニングと２次スクリーニングで最も有望性を示した菌株を、エント ウとサトウダイコンの゛立枯れ”病に対する生物学的防除剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｌｃｏｎｔｒｏｌ　）として圃場試・使用に選択した。

添付図面の第１図に、エントウの立枯れに対して菌株ＮＣｌＢ４Ｏ１８６を用い て得られた結果を示す。この試験は英国で行なった。この菌株を用いて得られた 防除価は殺菌剤メタラキンル（商標名：　ＡＰ）ＣＯＮ　）を用いて化学的処理 することによって得られた防除価の約８０％であった。菌株ＮＣｌＢ４Ｏ１８７ はこの試験では効果があまりなかった。

第２図と第３図には、菌株ＮＣｌＢ４Ｏ１８６とＮＣｌＢ４Ｏ１９０を使用した サトウダイコンに関する圃場試験の結果を示す。これらの試験はベルギー国で行 なった。６個所の圃場を選択した。３個所の圃場（ｉｌ！ｌ場１，３及び６）で は３月にサトウダイコンを播種し、残りの３個所の圃場では５月に播種した。第 ２図には播種後３週間目に行なった最初の集計の結果を示し、第３図には播種後 ６〜８週間後の結果を示す。

景するに、これらの結果はＰｙｔｈｉｕｍ　ｕｌｔｉｍｕｍ病原菌によってもた らされたエントウの立枯れ病は、菌株ＮＣｌＢ４Ｏ１８６の施用により、殺菌剤 メタラキンルを用いた化学的処理によって得られたレベルと同等のレベルで低減 されたことを示している。サトウダイコンについての結果は、６個所の圃場全て において未処理対照と比べて、菌株ＮＣｌＢ４Ｏ１８６及びＮＣｌＢ４Ｏ１９０ の施用によって向上した苗の確立（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ）を示す。３個 所の圃場では、前記２つの菌株の存在下の苗の確立は殺菌剤メタラキシルを用い て得られた結果と同等であ１９９０年中、微生物ＮＣｌＢ４Ｏ１８６及びＮＣｌ Ｂ４Ｏ１９０の圃場試験をＰｙｔｈｉｕｍ　ａｐｐ病を抑制する能力について行 った。この試験は米国、ベルギー国及び仏国で行なった。

その結果を以下に報告する。この試験のために、上記微生物は欧州（ベルギー国 、仏国）での研究にｔま種子を浸し、次後に砂の中で乾燥して施用し、ＵＳＡで の研究にはゴム／堆肥製剤として施用した。別の試１噛を、立枯れ病が風土病で ある世界の別の地域で、例えばマレンア国で野菜で行なった。本発明者らは、試 験が未だ完了しておらないという地山から世界中で行なっている試験の結果を簡 単に示すことができず、しかも認められるように農業の手順には季節的制約があ るという理由から試験を加速進行させることができないが、本発明の試験実施者 からの最初の結果報告は好ましいものであり、このような次第で、少なくとも前 記の特定の微生物は商業的な生物学的防除剤として大きな可能性を示す。また、 本明細書中に記載した別の微生物についての試験は、人間と環境の両方に対する 有効性と安全性についての標準的方法に従って実験室及び栽培室中で継続してい る。現在所有している結果によれば、より早く認められしかも本明細書中に報告 したような可能性が確認される。

菌株ＮＣｌＢ４Ｏ１，８６及びＮＣｌＢ４Ｏ１９０は、ベルギー国及び仏国の９ 個所の試験場での試験においてサトウダイコンの立枯れに対して試験を行につた 。早春の播種中は、気候が非常に暖かで乾燥しており、これはサトウダイコ／の 立枯れ病の発現には若干の問題をもたらした。

試験用の鉢の各々には全部で種子２００粒を播いた。今日迄に９個所の試験結果 が得られている。

１９９０年のベルギー国及び仏国における試験供試作物：サトウダイコン 化学防除剤：殺菌剤タチカレン／ＴＭＴＤ＊＝５チの確率でのし５Ｄ １９９０年の仏国における試験 供試作物、エントウ 化学的防除剤：下記に示すもの 植物の番号（嵐）は、処理後２２日目の５　ｍの長さの細長いものとして出た植 物の平均数をいう。

各表中の第２欄には播種後２２日目の種子２００粒から発現した植物の数を示す 。

表中の植物の発現数の後のアルファベット文字は統計学的有意差を示す。共通の アルファベット文字を有する記載事項（ｅｎｔｒｙ）同志の間には５チの確率で は有意差はない。

防除処理 病原菌を何ら加えずに通常の屋外土壌中で試験を行試験処理 １９９０年のカリフォルニル（米国）での試験供試作物　エントウ １９９０年のミンンソピー州（米国）での試験供試作物；トウモロコシ 供試病原菌：　ＦｕＢａｒｌｕｍ菌　（１）　Ｉｆ）５’／　ｌ　＊ｉ並びで使 用（ＩＩ）　３０　Ｐ／　ｌ　ｍ並びで使用植物の発現は播種後１５日後のチで 示した。

５ＥＥＤＬＩＮＧＳρＥＲＲＯＷ Ｆ　ＩＧ　、　２ＦＩＥＬＤ　ＴＲＩＡＬＳ手続補正書岨発） 特許庁長官殿　平成４年５月１９日 １、事件の表示　ＰＣＴ／ＧＢ　９０１０１５９８２、発明の名称　抗菌性の微 生物 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　イギリス国、ロンドン、ニス、ダブリュ、１．ビー。

３・ジエイ・エフ、ミルバンク、インペリアル・ケミカル・ハウス（番地その他 表示なし）名　称　インペリアル・ケミカル・インダストリーズ・ピーエルシー ４、代理人 〒１０５住　所　東京都港区西新橋１丁目１番１５号物産ビル別館　！　（３５ ９１）０２６１（２）請求の範囲の翻訳文 より浄書したもの 国際調査報告 −１−、い、１＾−６゜Ｉ＋い、、ＰＣＴ／Ｇｌミ１９０１０１５９８Ｓ＾　４ １２１７

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．潜在的な抗菌剤の阻止効果を２回の試験で試験し即らピチウム（Ｐｙｔｈｉ ｕｍ ｓｐｐ）の菌糸体が蔓延した殺菌済み土壌中で病害の発生を阻止する第１ の試験と、立枯れ病の複合菌の存在下に該複合菌からの病害を受け易い生長中の 植物で病害の発生を再び阻止する第２の試験とで試験し、対照と比較して第１と 第２との両方の試験で潜在的な阻止効果を与える抗菌剤を同定し、該抗菌剤を更 なる別の試験にかけることからなる、潜在的な抗菌剤を選別する方法。
2. ２．立枯れ病の複合菌による感染を受け易い植物はテンサイである特許請求の範 囲１記載の方法。
3. ３．潜在的な抗菌剤は微生物である特許請求の範囲１又は２に記載の方法。
4. ４．微生物は根集落性の微生物である特許請求の範囲記載の方法。
5. ５．密閉性の容器内に湿った無菌の砂の１層を装入し、その上に湿った状態の土 壌試料を配置し、土壌試料中に興味の対象となる病害を受け易い植物の種子をま き、容器を密閉し、病害を発生させ易い環境条件下に容器を配置し、種子を発芽 させ且つその根を土壌層から砂層中に伸長させ、両層を縦方向に通して管容器を 切開し、砂層のみから根を採取し、且つ採取した根から微生物を単離することか らなる方法により、根集落性の微生物を土壌試料から単離する特許請求の範囲４ 記載の方法。
6. ６．第１と第２の試験との両方で病害の阻止を示す薬剤は、１回又はそれ以上の 追加の試験で次の感染；（ａ）１２〜１５℃の温度でアフアノミセスコクリオイ デス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）によるテンサイの感 染；　 （ｂ）１２〜１５℃の温度でピチウムウルチマム（Ｐｙｔｈｉ−ｕｍ　ｕｌｔｉ ｍｕｍ）によるエンドウの感染；（ｃ）２４〜２７℃の温度でピチウムウルチマ ム（Ｐｙｔｈｉ−ｕｍ　ｕｌｔｉｍｕｍ）によるエンドウの感染；（ｄ）２４〜 ２７０Ｃの温度でリゾクトニアソラニ（Ｒｈｉｚｏ−ｃｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎ ｉ）によるエンドウの感染；（ｅ）１８〜２１℃の温度でフーザリウムクルモラ ム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｃｕｌｍｏｒｕｍ）による小麦の感染：（ｆ）２０〜２ ４℃の温度でフイトフトラメガスペルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｍｅｇａ ｓｐｅｒｍａ）による大豆の感染；（ｇ）２０〜２４℃の温度でフーザリウムモ ニリホルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）による馬鈴薯スライ スの感染； （ｈ）２０〜２４℃の温度でフーザリウムサムブシナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓ ａｍｂｕｓｉｎｕｍ）による馬鈴薯スライスの感染；及び （ｉ）１５〜１９℃の温度でホーマ（Ｐｈｏｍａ　ｓｐｐ．）によるテンサイの 感染 から選んだ菌による感染を阻止するため更に選別する特許請求の範囲１〜５の何 れかに記載の方法。
7. ７．特許請求の範囲１〜６の何れかに記載された選別試験により示される如く匹 敵しうる化学薬剤と同じ又はそれより良い菌感染阻止率を示す抗菌剤。
8. ８．螢光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の微生物を含 有してなり、その培養物がブタペスト条約により受理番号第４０１８６号として 英国のナシヨナルコレクシヨンオプインダストリアルアンドマリーンバクテリア リミテッド（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｉ −ａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　Ｌｉｍｉｔｅｄ）に１９８ ９年９月１日に寄託されている抗菌剤。
9. ９．螢光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の微生物を含 有してなり、その培養物がブタペスト条約により受理番号第４０１８７号として 英国のナシヨナルコレクシヨンオブインダストリアルアンドマリーンバクテリア リミテッドに１９８９年９月１日に寄託されている抗菌剤。
10. １０．螢光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の微生物を含 有してなり、その培養物がブタペスト条約により受理番号第４０１８８号として 英国のナシヨナルコレクシヨンオブインダストリアルアンドマリーンバクテリア リミテッドに１９８９年９月１日に寄託されている抗菌剤。
11. １１．螢光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｅｎｓ）の微生物 を含有してなり、その培養物がブタペスト条約により受理番号第４０１９０号と して英国のナシヨナルコレクシヨンオブインダストリアルアンドマリーンバクテ リアリミテッドに１９８９年９月１日に寄託されている抗菌剤。
12. １２．農業用途に許容できる担体組成物と混合して特許請求の範囲７〜１１の何 れがに記載の抗菌剤を活性成分として含有する抗菌性の農薬組成物。
13. １３．特許請求の範囲７〜１１の何れかに記載の抗菌剤を有効投与量で植物、播 種前の植物の種子又は植物が生長中であるか又は生長させようとしている生育培 地に施用することからなる、植物上の菌による侵食作用を阻止する方法。