JPH05500659A - アミノアルギニンの分離および身体内の酸化窒素生成を遮断するための用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アミノアルギニンの分離および身体内の酸化窒素生成を遮断するための用途 本発明は、少くとも一部分はアメリカ予防衛生研究所認可番号ＤＫ３７１１６の 下で政府の援助によりなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する ものである。

技術分野 本発明は生物学的酸化窒素生成の新規な阻害剤に指向される。

発明の背景 数１０年間ニトログリセリンは心臓血管病の処置における血管拡張剤としてヒト に投与されてきた。最近そのように投与されるニトログリセリンが医薬的に活性 な代謝物である酸化窒素に身体内で変換されることが示された。さらに極く最近 酸化窒素は内皮由来の弛緩因子（ＥＤＲＦ類）の重要成分である正常な代謝物と してアルギニンから生成されることが示された。ＥＤＲ，Ｆ類は現在血流および 血管抵抗の調節に関与することについて集中的に研究されている。上記の研究に 付随して、探索が身体内の酸化窒素を遮断する化合物について行われた。この作 用を得るのに用いるために発見された化合物はＮｏ−メチル−Ｌ−アルギニンで ある［バルマー、アル、エム。

シュウ、ネーチャー（ロンドン）、第３３３巻、６６４−６６６頁、１９８８年 ］。モルモットおよびウサギへのＮ６−メチル−し−アルギニンの投与は血圧を 増大することが示された（アイサカ、ケイウ、バイオケミカル・アンド・バイオ フィジイク・リサーチ・コミュニケーション、第１６０巻、２号、８８１−８８ ６頁、１９８９年４月２８日、ニース、ディ、デイウ、プロシーディンゲス・オ ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー、第８６巻 、３３７５−３３７８頁、１９８９年５月）。

血管内皮以外に、マクロファージはまた、それらの細胞死滅および／または細胞 増殖抑制機能の成分である酸化窒素を身体内で生成することが示された（イエン ガー、アルク、プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ ・サイエンス・ニーニスニー、第８４巻、６３７３−６３７３頁、１９８７年９ 月）。

発明の概要 生理学的に活性なＮ’−アミノアルギニン（その中で用語Ｎ６はグアニジノ窒素 での置換を示す）およびその医薬的に許容可能な酸付加塩が身体内の酸化窒素合 成のすぐれた阻害剤を構成することが本発明で発見された。用語［生理学的に活 性なＮ６−アミノアルギニンコは本明細書でＮＧ−アミノ−Ｌ−アルギニンおよ びＮ６−アミノ−Ｄ、Ｌ−アルギニンからなる群より選ばれたＮ’−アミノアル ギニンを意味するのに用いられる。Ｄ、Ｌ−化合物において、Ｎ６−アミノ−し −アルギニン部分のみが生理学的に活性である。

Ｎ６−アミノ−Ｌ−アルギニンはペプチドの化学的合成に用いられるＮ６−ニト ロ−し−アルギニンの還元性脱保護における副産物として記録された。しかし、 上記のものまたは医薬的に純粋な形でのＮｏ−アミノ−Ｄ、Ｌ−アルギニンの製 造および分離についての記録は知られていない。ここに記載した本発明は上記の 製造および分離を意図している。

すなわち、新規であると考えられる本発明の組成物は、医薬的に純粋な生理学的 に活性なＮ６−アミノアルギニンまたはその医薬的に許容可能な酸付加塩である 。用語「医薬的に純粋な」は９９９＋％純度（水を除いた成分での）意味するた めに本明細書で用いられる。

生理学的に活性なＮ６−アミノアルギニンの製造および分離のためのここに記載 した本発明の方法は：　（ａ）　Ｎ　’−二トローＬ−アルキニンまたはＮｃ− ニトロ−Ｄ、Ｌ−アルギニンを還元して生理学的に活性なＮｏ−アミノアルギニ ンおよびアルギニンの混合物を生成すること：（ｂ）アルギナーゼにより上記の 混合物を処理してその中のアルギニンをオルニチンに変換し生理学的に活性なＮ Ｇ−アミノアルギニンおよびオルニチンの混合物を生成すること、（Ｃ）段階（ ｂ）により生成される混合物から医薬的に純粋で生理学的に活性なＮＧ−アミノ アルキニンを分離することの段階を含む。

段階（Ｃ）の分離は、クロマトグラフィによるかまたはフラビアン酸塩としての Ｎｃ−アミノアルギニンの結晶化によって簡単に行われる。

上記の阻害を必要とする対象における酸化窒素合成の阻害用の本明細書での方法 は、上記の対象に酸化窒素合成を阻害する量の生理学的に活性なＮ６−アミノア ルギニンまたはその医薬的に許容可能な酸付加塩を投与することを含む。用語「 対象」はアルギニンからの酸化窒素生成が起るような、ヒトを含んでいる全ての 哺乳動物を意味するのに本明細書で用いられる。この方法は予防および治療の用 途を意図している。

酸化窒素の生合成、代謝または生理学的役割を解明するかまたは制御するための 、分離した器官、無傷の細胞、細胞ホモジェネートおよび組織ホモシエネートに よる研究を含めたイン　ビトロの研究におけるアルギニンからの酸化窒素生成の 遮断のための本発明の方法は、酸化窒素生成を阻害するのに充分な濃度で上記の 器官、細胞、またはホモンエネートを含んでいる培地に生理学的に活性なＮ’− アミノアルギニンまたはその医薬的に許容可能な酸付加塩を添加することを含む 。

詳細な説明 先に示したように、本発明の組成物は医薬的に純粋で生理学的に活性なＮｃ−ア ミノアルギニンまたはその医薬的に許容可能な酸付加塩が構成する。

遊離塩基形のＮ６−アミノ−Ｌ−アルギニンは下記構造式を有しＨ２ Ｈ２ Ｈ２ 暖 Ｈ Ｃ＝ＮＨ ■ Ｈ Ｈ２ 遊離塩基形のＮ６−アミノ−Ｄ、Ｌ−アルギニンは５０％ＮＧ−アミノーＬ−ア ルキニンおよび下記構造式を有している５０％ＮＣ−アミノ−Ｄ−アルギニンか ら成っでいる。

「 Ｈ２ Ｈ２ ■ Ｈ２ Ｈ 「 Ｃ＝ＮＨ Ｈ Ｈ２ 医薬的に許容可能な酸付加塩は最初に高いｐｋａをもつ窒素で生成され、たとえ ば塩酸、硫酸、酢酸、グルコン酸、リン酸、コハク酸、マレイン酸およびクエン 酸付加塩を包含する。それらは当業界では周知の方法により生成される。

次に医薬的に純粋で生理学的に活性なＮＧ−アミノアルギニンを製造し、分離す ることを述べる。Ｎ６−ニトロアルギニン出発物質は、Ｎｏ−アミノ−Ｌ−アル ギニンの製造の場合Ｎ６−ニトロ−Ｌ−アルギニンであり、Ｎ６−アミノ−Ｄ、 Ｌ−アルギニンの製造の場合Ｎ６−ニトロ−Ｄ、Ｌ−アルギニンである。Ｎｏ− ニトロ−Ｌ−アルギニンは既に市販されている。Ｎ′″−二トローＤ、Ｌ−アル ギニンはり、Ｌ−原料から出発する点を除いてＮ６−ニトロ−Ｌ−アルギニンと 同じ方法で製造される。ＮＧ−二トローＬ−アルギニンが出発物質である場合、 段階（ａ）の生成物はＮ６−アミノ−Ｌ−アルギニンおよびＬ−アルギニンの混 合物である。Ｎｏ−ニトロアルギニンの還元は適当な還元触媒（たとえば、木炭 上のＰｔ１木炭上のＰｔ○、Ｐｄおよび還元方法に周知の他の物）の存在下で過 剰の水素カスによる溶液中の反応により容易に行われる。適当な溶媒は水性酸、 たとえば１５％水性酢酸である。還元反応は室温で容易に行われるが、たとえば ０°Ｃ−１００°Ｃまたはより高い範囲内にある温度が用いられ得る。加減反応 は４０ポンド／平方インチの圧力で容易に進むが、１−２０００ポンド／平方イ ンチの範囲内にある圧力で行われ得る。

段階（ｂ）において、Ｌ−アルギニンはＬ−オルニチンに変換されるか、または り、Ｌ−アルギニンはり、Ｌ−オルニチンに変換される。

段階（ｂ）のため、段階（ａ）の触媒は、たとえば濾過することにより除去され 、溶媒は、たとえば減圧でロータリー蒸発により除去される。

生成する残留物は水に溶解され、わずかにアルカリｐＨ，たとえば塩基たとえば ＮａＯＨの添加による８−１０の範囲内にあるｐＨに調節される。アルギナーゼ （市販品を容易に入手できる）が次に、たとえば０．５−５ｍｇ／Ｎ’−ニトロ アルギニン出発物質ｇの範囲内にある濃度で添加される。反応は、たとえば２０ °Ｃ−４０°Ｃで８−１２時間、好ましくは３７℃で一晩中の培養により行われ る。反応の終了時にアルギナーゼはたとえば熱変性および遠心分離または濾過に より除去され、生成した生成物は段階（ｃ）に付される。

段階（ｃ）のクロマトグラフィ分離は強酸性陽イオン交換樹脂（たとえば、水素 またはナトリウムの形でのダウエックス５０）および適度から強い塩基性溶液、 たとえば水と希釈した水酸化アンモニウムとの間に形成される勾配による溶出に より容易に行われる。画分は集められ、高速液体クロマトグラフィ（以下ＨＰＬ Ｃ）により分析される。適当な画分はプールされ、たとえばロータリー蒸発によ り分離したオルニチン−およびアルギニン−を欠（生成物である。

フラビアン酸塩としてのＮ６−アミノアルギニンの結晶化を含んでいる段階（Ｃ ）の実施態様に転すると、これは、ｐＨが約３．８であるまで、フラヒアン酸（ たとえば、６−１０ｇｍ５／　１００＋ｎｌ）の水溶液を添加すること、たとえ ば２−１０℃に冷却することおよび、たとえば濾過により生成される黄色沈澱物 を集めることにより行われる。沈澱物は好ましくＮａＯＨおよびＨＣｌにより連 続的にｐＨを上げ下げすることにより再晶出され、医薬的に純粋でＮＧ−アミノ アルギニンの溶液は、再晶出したフラビアン酸塩から、強塩基陰イオン交換樹脂 （たとえば、ダウエックス５０）の懸濁物と共に上記の塩を撹拌して、フラビア ン酸を結合しＮ６−アミノアルギニンを放出することにより製造される。それに 結合したフラビアン酸をもつ樹脂は、たとえば濾過することにより分離される。

医薬的に純粋で生理学的に活性なＮｏ−アミノアルギニン生成物は蒸発すること または他の方法で濾液を乾燥することにより固体として回収される。

次に、上記の阻害を必要とする対象に酸化窒素合成を阻害する量の生理学的に活 性なＮｏ−アミノアルギニンまたはその酸付加塩を投与することを含む発明のイ ン　ビボの方法に転する。

対象の１群は病理学的に低血圧をもつものを含む。

この群の中の１組は自然発症的低血圧症をもつものである。

この群の中の他の組は薬剤由来の低血圧症をもつものである。この場合に、本発 明の方法に従った併用は、そうでなければ許容不可能な副作用をもつ薬剤の用途 を可能にする。

さらにこの群の中の他の組はショック（毒物ショック症候群を包含している）で 損害をこうむるものである。

エキスプレス・メイル・メソッドにより１９８９年９月１３日にファイルした“ インヒビジョン・オブ・システミック・ハイポテンンヨン・プロデユースト・パ イ・バイオロジック・レスポンス・モデファイアズと題するロバート・シー・キ ルホルン、ステイーブン・ニス・グロス、オウエン・ダブリュー・グリフイスお よびロバート・レヴイの出願を引用する。キルホルンらの出願は全身性低血圧症 を阻害することに本明細書で請求したものを含めた化合物の用途を包含する。

対象の他の群は、酸化窒素生成の低い調節が有用である免疫障害をもつもの、た とえば自己免疫障害のもの、または移植の目的のための治療的免疫抑制のものを 含む。

次に投与用量に転じると、これは目的とする効果および個々の対象の敏感性によ り異なる。たとえば、血圧を上昇させるには、血圧を効果的に上昇させる量が投 与される。一般に、１０マイクログラム／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは １　１０ｍｇ／ｋｇの用量範囲が有用である。Ｎ６−アミノ−Ｄ、Ｌ−アルキニ ンについては、用量はＮ６−アミノ−Ｌ−アルギニンについての倍である。

投与は、たとえば経口または非経口経路により容易に行われる。

生理学的に活性なＮ６−アミノアルギニンは代表的な充填剤、香料等と併用して 容易に投与される。

以下本明細書でのイン　ビトロの方法に転する。代表的な媒質は心臓かん流媒質 、組織培養媒質、細胞または組織のホモシェネートまたは精製蛋白質と共に用い られる培養媒質を包含する。処置する器官は代表的に血管、肺臓または腎臓であ る。無傷の細胞は血管内皮細胞またはマクロファーンを包含する。ホモンエネー トは、たとえば心臓、血管、神経または他の組織および細胞からのものであり得 る。生理学的に活性なＮｃ−アミノアルギニンまたはその塩は１＋モル−３００ ミリモルの範囲内にある濃度で媒質に添加される。

以下本発明を実施例により説明する。

実施例工 ４．３８（２０ｍｍｏｌ）Ｎ’−二ｈｏ−Ｌ−アルキニン（シグマ　ケミカルズ ）を酸化白金０．１ｇ＋ｎと１５％水性酢酸２５ｍ１に溶解した。反応を４０ポ ンド／平方インチＨ２圧および室温で約６０時間行った。

触媒をアルゴン下で濾過により除去し、濾液を減圧下でロータリー蒸発して油状 物にした。分析は５５％Ｎ６−アミノ−Ｌ−アルギニンおよび４５％Ｌ−アルギ ニンを示した。溶液をＮａＯＨでｐ）（９゜５に調節し、アルギナーゼ５ｍｇ（ １０５０国際里位）を添加した。生成する溶液を一晩中３７°Ｃてインキュベ− １−した。この処理の後、溶液はＮ６−アミノ−Ｌ−アルギニンおよびＬ−オル ニチンを含んでいたが、Ｌ−アルキニンを含まなかった。５−１０分間１００° Ｃに溶液を加熱することによりアルギナーゼを変性し、濾過により除去した。フ ラビアン酸水溶液（１００ｍＪ中に６．２８ｇｍ）をｐＨが約３゜８で、沈澱が 生成しはじめるまで添加した。溶液を一晩中４０℃に冷却して、生成物の沈澱を 完了し、沈澱物を濾過により集めた（約３．０ｇｍ）。固体を１．ＭＮａＯＨの 滴下により熱水（１，００ｍのに再溶解した。ｐＨ３，８へのＨＣＡ溶液の添加 はＮｏ−アミノ−し−アルギニンーフラビアン酸塩の結晶の形成を起した。４時 間４℃での溶液の冷却後、黄色の結晶を濾過により集め、逐次無水アルコールお よびエチルエーテルで洗浄した。生成物（２，４ｇｍ）は、純度の高いＮ６−ア ミノ−し−アルギニンーフラヒアン酸塩（ＣＩ６Ｈ２＋Ｎ７０ＩＯ８に対する計 算値Ｃ＝３８．２％；Ｈ＝４．２％；Ｎ＝１９．５％。実験値：Ｃ＝３８．４％ ：Ｈ＝４．２％；Ｎ＝１９．５％）であった。モノフラビアン酸塩を１００℃で 水１００ｍＡに懸濁し、ダウエックス１（ＯＨつ（強塩基イオン交換樹脂）ＩＱ ｇｍを添加した。５時間１００°Ｃで撹拌後、上澄液は透明となり、全ての黄色 のフラビアン酸はタウエックス１樹脂に結合した。樹脂を濾過により除去し、澄 明な濾液を減圧でロータリー蒸発により油状物に濃縮した。油状物をエタノール ５Ｑｍｌに溶解し、エタノールを減圧で蒸発した。エタノールの添加および除去 を再三くり返し、次いでエチルエーテル５ＱｍＪを同様に添加し、除去した。固 体状残留物を１２時間Ｐ２Ｏ５で高真空下で乾燥した。収量は純粋な（９９，９ 十％純度）Ｎ６−アミノ−Ｌ−アルキニン（出発Ｎ６−ニトロ−Ｌ−アルギニン を基にした３５％の収率）１．２ｍｇであった。

実施例■ Ｎ６−ニトロ−■７−アルキニン（４，３８ｇｍ）を実施例■に記載のようにＬ −アルギニンおよびＮｏ−アミノ−し−アルギニンの混合物に還元し、アルギナ ーゼで処置した。アルギナーゼを欠く溶液を乾固するまで蒸発し、乾燥した残留 物を水１０ｍｆｆに溶解し、生成する溶液をダウエックス５０（Ｈ”）樹脂のカ ラム（２，５Ｘ　４５ｃｍ）に適用した。樹脂を水（５００ｍｎ）により、次い て水１リットルと２Ｍ水酸化アンモニウム１リツトルとの間に形成した直線状勾 配により洗浄した。２５ｒｎｌの画分を集め、オルニチンおよび／またはＮｏ− アミノ−し−アルキニンのそれらの含量について分析した。純粋なＮ０−アミノ ーＬ−アルギニンを含有している画分をプールし、減圧で乾固するまでロータリ ー蒸発した。半結晶性残留物をＰ２Ｏ５で真空上乾燥した。乾燥後、白色の固体 （１，５ｇｍ）は９９．９十％純度のＮｏ−アミノ−し−アルギニンであった。

実施例■ 体重５００ｇｍの雄のハートレイ系モルモットをベントパルビタールナトリウム で麻酔にかけ（５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）、気管カニユーレを挿入する。左頚動脈 をカニユーレ挿入し、生理学的圧力変換器に連結する。血圧の追跡をフィシオグ ラフで表す。６搏拡張期の血圧を止理食塩水、Ｎ６−メチル−Ｌ−アルギニン（ ０，１，１または１０ｒｎｇ／ｋｇ体重）またはＮ６−アミノ−Ｌ−アルギニン （０，１，１または１０ｍｇ／ｋｇ体重）の静脈投与によりモニターする。別個 のモルモットを各々の化合物に対して」いる。薬剤投与５分後、１ｍｇ／ｋｇお よび１０ｍｇ／ｋｇＮ’−メチルーＬ−アルギニンが、それぞれ血圧１０および ２５ｍｍＨｇを増大したのに対して生理食塩水および０．１＋ｎｇ／ｋｇＮ６− メチルーＬ−アルキニンは血圧に影響を及ぼさない（アイサカ、ケイウ、前に引 用した８８２頁）。０．１．１および１０ｍｇ／ｋｇ　Ｎ’−アミノ−Ｌ−アル ギニンの投与５分後、６搏拡張期の血圧は、それぞれ１０．２０および４０ｍｍ Ｈｇ増大する。

実施例■ 血管の弛緩をモルモットの大動脈または肺動脈から取った分離した輪を用いて好 便に研究する。上記の輪へのアセチルコリンの添加はＬ−アルギニンから酸化窒 素の合成を引き起し、生成した酸化窒素は脈管輪の血管緊張力を制御している平 滑筋細胞の弛緩を引き起す。酸化窒素生成の阻害はアセチルコリンの弛緩作用を 減退する。

このイン　ビトロ系は過度の血管の弛緩により化学的に誘発した低血圧症を研究 するのに好適なモデルである。

モルモットの大動脈および肺動脈の輪のアセチルコリン仲介弛緩に及ぼすＮ６− アミノ−し−アルギニンの影響をサクマ、アイウ、プロシーディンゲス・オブ・ ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー第８５巻、８６ ６４−８６６７頁（１９８８年）に記載した方法により記載通り測定した。アセ チルコリンの用量は１０−８−１０−５Ｍの範囲である。Ｎ’−アミノ−Ｌ−ア ルギニンを０．３マイクロモル、１０マイクロモルおよび３０マイクロモルの用 量で添加した。Ｎｃ−アミノ−Ｌ−アルギニンの無い場合、１０−８．１０−７ ．１０−６および１０−５Ｍの用量でのアセチルコリンは、それぞれ約１０％、 ２３％、４３％および５８％の弛緩を引き起した。３マイクロモルのＮｏ−アミ ノ−し−アルギニンが有る場合での同じ実験は０％、０％、５％および１９％の 弛緩を得た。Ｎ６−アミノ−Ｌ−アルキニンの濃度を１０マイクロモルまたは３ ０マイクロモルに増大した場合、１０−’Ｍアセチルコリンにより誘発した弛緩 の範囲は１％未満で、１０−５Ｍアセチルコリンにより起った範囲は１０％未満 であった。それより低用量のアセチルコリンは１０マイクロモルまたは３０マイ クロモルＮ’−アミノーＬ−アルギニンのある場合に弛緩を起さなかった。結果 は、アセチルコリン支配の血管の弛緩が大部分Ｌ−アルキニンからの酸化窒素生 成によるもので　ＮＧ−アミノ−し−アルギニンによって阻害されることを示す 。上記の研究がイン　ビポの低血圧症に対する好適なモデルであるから、結果は また酸化窒素仲介血管の弛緩による低血圧を上昇させることについてのＮ６−ア ミノ−し−アルギニンのイン　ビボの有用性を示す。

同じ研究において、血管輪弛緩の同程度の阻害を起すのにＮＯ−アミノ−し−ア ルギニンの上にした用量よりも５−１０倍高い濃度のＮ６−メチル−Ｌ−アルギ ニンが必要であった。

等モル量のＮｏ−ニトロ−Ｄ、Ｌ−アルギニンを実施例Ｉまたは■におけるＮ’ −ニトロ−Ｌ−アルギニンに置換する場合、純粋なＮｏ−アミノ−Ｄ、Ｌ−アル ギニンを得る。

実施例■および■において、Ｎ′−アミノ−Ｄ、Ｌ−アルギニンを用量または濃 度を２倍にしてＮ’−アミノ−Ｌ−アルギニンに置換する場合、実質的に６搏拡 張期の血圧増大の同等の結果および血管輪の弛緩の阻害を得る。

本発明の具体例の多くの変形は当業者に明らかである。すなわち、本発明の実施 態様は請求範囲により定義される。

国際調査報告

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）医薬的に純粋で生理学的に活性なＮＧ−アミノアルギニンまたはその医薬 的に許容可能な酸付加塩。
2. （２）遊離塩基形のＮＧ−アミノ−Ｌ−アルギニンである、請求項１記載の化合 物。
3. （３）生理学的に活性なＮＧ−アミノアルギニンの製造方法であって、（ａ）Ｎ Ｇ−ニトロ−Ｌ−アルギニンまたはＮＧ−ニトロ−Ｄ，Ｌ−アルギニンを還元し て生理学的に活性なＮＧ−アミノアルギニンおよびアルギニンの混合物を生成す ること；（ｂ）アルギナーゼで上記の混合物を処理してその中のアルギニンをオ ルニチンに変換し、それにより生理学的に活性なＮＧ−アミノアルギニンおよび オルニチンの混合物を生成すること；（ｃ）段階（ｂ）により生成される混合物 から医薬的に純粋で生理学的に活性なＮＧ−アミノアルギニンを分離することの 段階を含んでいる上記の方法。
4. （４）出発物質がＮＧ−ニトロ−Ｌ−アルギニンであり、生理学的に活性なＮＧ −アミノアルギニンかＮＧ−アミノ−Ｌ−アルギニンであり、アルギニンがＬ− アルギニンであり、オルニチンがＬ−オルニチンである、請求項３記載の方法。
5. （５）段階（ｃ）において、分離がクロマトグラフィ的に行われる、請求項４記 載の方法。
6. （６）段階（ｃ）が、段階（ｃ）より生成される混合物を過剰のフラビアン酸で 処理して本質的に純粋なＮＧ−アミノ−Ｌ−アルギニン　フラビアン酸塩結晶を 形成することおよび上記結晶から医薬的にＮＧ−アミノ−Ｌ−アルギニンを分離 することを含む、請求項４記載の方法。
7. （７）阻害を必要とする対象中の酸化窒素合成を阻害する方法であって、上記の 対象に、酸化窒素合成阻害量の生理学的に活性なＮＧ−アミノアルギニンまたは その医薬的に許容可能な酸付加塩を投与することを含んでいる方法。
8. （８）酸化窒素の生合成、代謝、生理学的役割を解明するかまたは制御する方法 であって、分離した器官、無傷の細胞、細胞ホモジェネートまたは組織ホモジェ ネートを含んでいる媒質に酸化窒素生成を阻害するのに充分な濃度の生理学的に 活性なＮＧ−アミノアルギニンまたはその医薬的に活性な酸付加塩を添加するこ とを含んでいる方法。