JPH0549280B2 - - Google Patents

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JPH0549280B2
JPH0549280B2 JP59020194A JP2019484A JPH0549280B2 JP H0549280 B2 JPH0549280 B2 JP H0549280B2 JP 59020194 A JP59020194 A JP 59020194A JP 2019484 A JP2019484 A JP 2019484A JP H0549280 B2 JPH0549280 B2 JP H0549280B2
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alkyl
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Yukio Katsumata
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q2337/10—Anilides

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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は新規な酵素活性測定法、測定のために
便利な組成物に関する。 本発明において酵素活性測定の対象となる酵素
はロイシンアミノトランスペプチダーゼ（以下、
LAPという）及びγ−グルタミルトランスペプ
チダーゼ（以下γ−GTPという）を意味する。 従来これらの酵素活性の測定法としてロイシン
又はグルタミン酸に発色性化合物もしくは他の化
合物と反応させることによつて発色しうる化合物
を結合させ、これを基質として酵素含有試料と反
応させて生成する発色化合物を直接定量するか、
生成化合物と上記他の化合物とを反応させて生成
する色素を定量する方法が知られている。 発色性化合物としてｐ−ニトロアニリド、β−
ナフチルアミド、４−ヒドロキシ−３−カルボキ
シアニリド、ｐ−ヒドロキシアニリド、４−（Ｎ，
Ｎ−ジアルキルアミノ）−３−カルボキシアニリ
ド、４−（Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ）アニリド
等が使用されている。 しかるにこれらの化合物の溶解度はせいぜい
6.5mg／mlで酵素反応の律速は基質の溶解速度に
支配される。又これらの基質を用いて生成する色
素を定量にするには紫外部での吸収による方法で
定量するため試料中の他の成分による影響が大き
く、又は強アルカリ下という危険な条件での反応
が必要となり、又生成色素の分子吸光係数が小さ
いため感度が悪く、酵素の反応時間を長くとらね
ばならず、結果として精度が悪くなる。 かかる欠点の少ない基質について検討の結果、
ｐ−アミノアニリド系化合物のパラ位のアミノ基
にスルホノ基を有するアルキル基もしくはヒドロ
キシアルキル基が結合した化合物は、溶解性、色
素へ導いたときの色素の安定性がよく、分子吸光
係数が大きいので可視部の検出が可能である等の
優れた性質を有することが見い出された。 本発明によれば新規な基質は一般式（） 〔式中Ｚは（CH3）2CHCH2CH（NH2）−（以下Z1
と略す）又は（NH2）（COOH）CH・CH2・
CH2−（以下Z2と略す）を示し、R1は水素、アル
キル又は置換アルキルを示し、R2はアルキレン
基又はヒドロキシアルキレン基を示し、R3、R4
は同一もしくは異なつてよく水素、ハロゲン、ニ
トロ、ヒドロキシル、スルホ、カルボキシル、ア
ルキル、シアノ、メトキシカルボニル又はアルコ
キシを示す）で表されるロイシン誘導体もしくは
グルタミン酸誘導体又はそれらの塩を包含する。 上記R1〜R4においてアルキルはメチル、エチ
ル、プロピル、ブチル、ペンチル等の炭素数１〜
５のアルキルを包含し、ハロゲンは塩素原子、臭
素原子、沃素原子を包含し、アルコキシにおける
アルキル部分は前記アルキルと同じ意義を有し、
アルキレン基は炭素数１〜５のアルキレン例えば
メチレン、エチレン、テトラメチレン、ペンタメ
チレンを包含し、ヒドロキシアルキレンにおける
アルキレンは前記アルキレンと同意義を有し、置
換アルキルにおける置換基はスルホ、ヒドロキシ
アリール、ニトロ、カレボシル、ハロゲン例えば
塩素原子、臭素原子等を包含する。 本発明の基質を用いて試料中のLAPあるいは
γ−GTP活性を精度よく求めることができる。
即ち、化合物（）は試料中のLAP活性もしく
はγ−GTP活性に比例して分解され下記化合物
（）が生成する。次いで酸化剤もしくは酸化酵
素の存在下に化合物（）と発色化合物とを反応
させることによつて色素が生成する。色素の生成
により呈色した反応液を比色定量することにより
試料中の酸素活性が求められる。 化合物（） 化合物（）＋発色化合物酸化剤又は酸化酵素 ―――――――――→ 色素 また上記化合物（）をジアゾ化してジアゾニ
ウム塩に導びき、これを適当なカツプリング剤と
反応させてアゾ色素に導き反応液の呈色の変化を
測量することによつて酵素活性を求めることがで
きる。 さらに化合物（）とケイ皮アルデヒドとを反
応させることによつて直接アゾ色素に導き反応液
の呈色の変化を測定することによつても酵素活性
を求めることができる。 化合物（）は下記の方法によつて合成でき
る。 〔又はCl−R2−SO3H〕
（）脱保護 ―――→ （） Z′はＺにおけるアミノ基がアミノ基の保護基で
及び／又はカルボキシル基がカルボキシル基の保
護基で保護された基を示し、保護基としては例え
ばペンジルオキシカルボニル基、第三ブトキシカ
ルボニル基（BOC）、アセチル等のアシル基等の
アミノ保護基、ベンジル基等のカルボキシル保護
基が用いられる。 化合物（）の具体例としてはＮ−BOC−Ｌ
−ロイシン、Ｎ−BOC−Ｌ−グルタミン酸−α
−ベンジルエステル等があげられる。 化合物（）としてはフエニレンジアミン或い
は目的物の置換基のR3、R4に応じた置換基を有
するフエニレンジアミン類が用いられる。 縮合剤としては例えばDCCが用いられる。 反応はジオキサン等有機溶媒中室温〜60℃で数
時間反応させる。反応混合物をそのままもしくは
化合物（）を単離し、これをクロロホルム等の
有機溶媒に溶解し、化合物（）を加えて常温〜
60℃で15〜30時間反応させる。 化合物（）としては目的物の置換基R2に相
当する化合物が用いられ後述の参考例２に例示さ
れる。 反応後化合物（）を分離し次いでアミノ基及
び／又はカルボキシル基の保護基をそれ自体公知
の手段で除去し目的物を得る。 発色化合物としてはアミン類例えばＮ，Ｎ−ジ
エチル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−ヒド
ロキシエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ
−（３−メチルフエニル）−N′−アセチルエチレ
ンジアミン（EMAE）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−
メチルフエニル）−N′−サクシニルエチレンジア
ミン（EMSE）、Ｎ，Ｎ−ビス（３−スルホプロ
ピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイ
ジン（TOOS）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイ
ジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−シアノエチル）−ｍ
−トルイジン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−ｍ−トルイジン等のトルイジン類
や、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−
３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５
−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−
スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−
エチル−Ｎ−（２−シアノエチル）−アニリン、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルア
ニリン等のアニリン誘導体が用いられ、又フエノ
ール類例えばフエノール、α−ナフトール、β−
ナフトール、o″−又はｐ−ブロムフエノール、
o″−又はｍ−アニソール、２，６−キシレノー
ル、３，５−キシレノール、２，５−キシレノー
ル、２，３−キシレノール、ｏ又はｍ−クレゾー
ル等が用いられる。 これらのカツプリング剤は通常0.01〜５mg／ml
の濃度で用いられるが、溶解しにくいものについ
ては適宜、界面活性剤、例えばTritonX−100や
Brij−35、Brij−80を0.01〜２％の濃度で用いて
溶解させることができる。 酸化剤としては、メタ過ヨウ素酸ナトリウム
（又はカリウム）、過酸化水素、過マンガン酸カリ
ウム（又はナトリウム）、重クロム酸カリウム
（又はナトリウム）、メタバナジン酸ナトリウム
（又はカリウム）、ペンタシアノ鉄錯塩、等の無機
物の他、過酢酸などの過酸化物あるいは過酸化水
素−パ−オキシダーゼ（HRP）、セルロプラスミ
ン、ラツカーゼ（EC.1.10.3.2）等の酸化酵素が使
用できる。無機類は通常0.01〜10mg／mlの濃度
で、酵素類は0.1単位〜100単位／mlで用いられ
る。 又、ジアゾ化する試薬としては、通常の亜硝酸
塩（カリウム、ナトリウム、アンモニウム等）が
良く、ジアゾカツプリングさせる相手としてはフ
エノール、３，５−キシレノール等前記フエノー
ル類が使用できる。濃度は亜硝酸塩は0.1〜100
mg／ml、フエノール類は0.01〜100mg／mlで用い
られる。 又ケイ皮アルデヒドとしては、ｐ−（Ｎ，Ｎ−
ジメチルアミノ）ケイ皮アルデヒド、ｐ−（Ｎ，
Ｎ−ジメチルアミノ）ケイ皮アルデヒド等が0.01
〜100mg／mlの範囲で好適に用いられる。 本発明の基質及びその溶解度、生成色素の極大
波長、感度、安定性が第１、２表に示される。
【表】
【表】 感度は、１ｍＭの各遊離化合物50μを反応液３
mlに入れ、37℃で５分間反応、発色させた時の
λnaxに於ける吸光度を対照の５−アミノサリチル
酸の場合の吸光度（ただしこの場合は強アルカリ
中でメタ過ヨウ素酸により、２，６−キシレノ−
ルとカツプリングさせた）と比較し、５−アミノ
サリチル酸の場合を100として表わした。 前記反応液とは0.1Mリン酸緩衝液100mlに
EMSE50mg、ラツカーゼ100Uを溶解した液を意
味する。 以上述べたように、本発明方法によれば用いる
基質の水に対する溶解性が非常に優れているため
界面活性剤、有機溶媒等の溶解補助剤を特に必要
とせず、試薬の調製や操作が簡便で取扱い易く、
基質を十分に含む系に於いてγ−GTPやLAP活
性を国際単位で測定することができる。又血清成
分の影響を受けない560nｍ以上の高波長にλmax
を持つ、高感度で安定な色素を生成しうるため、
正確性、精密度のよい結果を得ることができるの
も大きな特徴である。 以下に本発明の態様を実施例によつて説明す
る。 実施例 １ 100ml中に実施例４で得られる化合物３ｇ、
EMSE50mg、硝酸マグネシウム100mg、Bicine（同
仁化学製ドータイトBicine）800mgラツカーゼ100
単位を含有する反応液（PH：7.3）３mlを分光光
度計用セル（１cm厚さ）に入れ10分間37℃で予備
加温する。この液に検体血清0.05mlを添加し、す
ばやく撹拌して分光光度計にセツトし、745nｍ
に於て吸光度の変化速度を測定する。１分間の変
化量を△Ｅとした時次式により検体中のLAP活
性は計算される。 LAP（IU／Ｌ）＝△Ｅ×3.05×1000／7.2×0.05＝△Ｅ×
847 又同時に同じ検体を (イ) Ｌ−ロイシル−３−カルボキシ−４−ヒドロ
キシアニリドを基質に使い酸化剤としてメタ過
ヨウ素酸ナトリウム・カツプリング相手にｐ−
キシレノールを用いるキツトを使つて波長
635nｍで測定する。 (ロ) Ｌ−ロイシル−ｐ−ニトロアニリドを基質に
使い、ｐ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ケイ皮ア
ルデヒドとカツプリングさせるキツトを用い波
長565nｍで測定する。 (ハ) Ｌ−ロイシル−ｐ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミ
ノ）アニリドを基質に使いメタ過ヨウ素酸を酸
化剤として、１−ナフトール−２−スルホン酸
とカツプリングさせるキツトを用い波長675n
ｍで測定する。 同量の血清を用いて１分間当りの吸光度の変
化量を測定し、次表に結果を示す。
【表】
【表】 本法の基質を用いた場合感度の点で非常に優れ
ており、(イ)の方法により約2.7倍、(ロ)より約3.5
倍、(ハ)より約６倍の吸光度変化が観測され、この
点についても、酵素に対する親和性、色素の感度
共すぐれていることを証明している。 実施例 ２ 実施例１において酸酵素を抜いた反応液を別途
作成して、反応液とする。反応液３mlを２本の試
験管にとり、37℃で10分間予備加温する。検体血
清0.05ml（もう一方に蒸留水0.05ml）を加えすば
やく撹拌して正確に37℃で10分間加温をつづけ
る、10分後ただちに (A) α−ナフトールのメタノール溶液（10mg／
ml）を0.03mlとメタ過ヨウ素酸ナトリウムを50
mg／ml含有する１規定NaOH溶液0.1mlを加え、
37℃で10分間加温し600nｍで検体と蒸留水の
場合の吸光度差を測定する。 (B) ｐ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ケイ皮アル
デヒドの10mg／mlのエタノール溶液と0.4N−
HC溶液を１mlずつ加え37℃で10分間加温
し、570nｍで検体と蒸留水の場合の吸光度差
を測定する。 (C) 1N−HCを0.5mlと亜硝酸ナトリウム１
mg／mlを0.5ml入れ、37℃で10分間放置し、そ
の後３，５−キシレノール１mg／ml（エタノー
ル溶液）を0.1mlを加え650nｍで検体蒸留水と
の吸光度差を測定する。 以上(A)(B)(C)の結果は次表の通りである。
【表】
【表】 な感度で測定できる。
実施例 ３ 実施例１の反応液中の基質濃度を１ｍmo1／
ml、３ｍmo1／ml、５ｍmo1／ml、10ｍmo1／
ml、20ｍmo1／ml、30ｍmo1／ml、40ｍmo1／
ml、50ｍmo1／ml、60ｍmo1／ml、70ｍmo1／
ml、80ｍmo1／mlと変化させて、血清１について
吸光度の変化量を測定し、第１図の結果を得る。 10〜20ｍmo1／mlでは基質濃度によつてかなり
変化量が変化するが、60〜70ｍmo1／mlではほと
んど変化がない。 この様に基質量は多い程良いが本基質の様に溶
解性がよいものでなければVmaxに近い速度を得
ることはできない。 実施例 ４ 第３表に表した化合物No.１、３、５、７、９を
それぞれ500mg及びグリシルグリシン500mgを
0.1Mリン酸緩衝液100ml（PH＝7.7）に溶解する。
この液をそれぞれＡ−１、Ａ−３、Ａ−５、Ａ−
７、Ａ−９とする。一方３−｛Ｎ−（ｍ−トリル）
−Ｎ−エチル｝アミノ−２−ヒドロキシプロパン
スルホン酸50mgを100mlのリン酸緩衝液に溶解し
たものをＢとし、1N−HC中にメタ過ヨウ素酸
ナトリウム（NaIO4）を50mg／ml含有する液をＣ
とする。 Ａ−１、Ａ−３、Ａ−５、Ａ−７、Ａ−９各々
２mlを３本ずつ計15本の試験管に入れ、37℃で予
備加熱する。これに(イ)血清検体、(ロ)標準血清、(ハ)
水を20μｇ別々に加え撹拌後、正確に５分間加温
する。ちようど５分後にすべての試験管にＢを１
ml、Ｃを１ml同時に加え、撹拌後、10分間呈色反
応を起こさせる。これを分光光度計で第２表に示
す波長で吸光度を測定し、標準血清は別途ヤトロ
ン社製、γ−GTP測定用キツト（イヤトロセツ
トγ−GTP）で測定し、235ｍＵ／mlであつた。 血清検体中のγ−GTP活性は (イ)の吸光度−(ハ)の吸光度 ―――――――――――――→ (ロ)の吸光度−(ハ)の吸光度×235（ｍＵ／ml） から計算されたそれぞれ231、228、236、240、
242ｍＵ／mlとなつた。 参考例 １ Ｌ−ロイシル−ｐ−｛Ｎ，Ｎ−ビス（スルホプ
ロピル）アミノ｝アニリド臭化水素酸塩の製造 Ｎ−BOC−Ｌ−ロイシン（以下BLLという）
2.49ｇにジオキサン100mlを加えて溶解し、これ
にDCC4.12ｇ、ｐ−フエニレンジアミン（以下
PPDという）2.16ｇを入れ室温で４時間反応させ
る。沈殿を濾過し、濾液を減圧濃縮乾固する。メ
タノール／水＝80／20（vo1／vo1）で再溶解し、
ダイヤイオンHP−20（三菱化成(株)製）でカラム
クロマトグラフイーを行う（溶出剤はメタノー
ル／水＝80／20）。溶出液からメタノールを減圧
下除去すればＮ−BOC−Ｌ−ロイシン−ｐ−ア
ミノアニリドを濾別する（収量1.25ｇ）。 Ｎ−BOC−Ｌ−ロイシン−ｐ−アミノアニリ
ド１ｇをクロロホルム50mlに溶解し、トリエチル
アミン２ml、１，３−プロパンサルトン５ｇを加
え50℃で一昼夜反応させる。さらにエチルエーテ
ル50mlを入れると、液が２相に分離する。下層を
分離し、これに酢酸５ml、25％臭化水素−酢酸溶
液20mlを入れ、室温で１時間内放置する。次いで
エチルエーテル50mlを入れるとBOC基が除去さ
れ、Ｌ−ロイシン−ｐ−｛Ｎ，Ｎ−ビス（スルホ
プロピル）アミノ｝アニリド・HBrが沈殿する。
ガラスフイルターで濾過した後、これをメタノー
ル50mlに溶解し、6N−NaOHで中和し、生じる
NaClを濾過後、エチルエーテルを入れて再沈殿
させ、濾別して目的物0.63ｇを得る。
【表】 参考例 ２ 参考例１においてBLLの代りにＮ−BOC−Ｌ
−グルタミン酸−α−ベンジルエステル（BLGB
という）を、又はPPDの代りにクロル−PPD
（CLPPDという）、スルホーPPD（SPPD）、Ｎ−
メチル−PPD（NMPPD）、Ｎ−エチル−PPD
（NEPPD）、シアノ−PPD（CYPPD）、メチル−
PPD（MPPD）、メトキシカルボニル−PPD
（MCPPD）、２−メチル−５−メトキシ−PPD
（MOMPPD）を用いスルホン化剤としてプロパ
ンサルトン（PS）、２−クロルエタンスルホン酸
（CESA）、１，４−ブタンサルトン（BS）、３−
クロル−２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸
（CHPSA）を用いて反応させ第５表の化合物を
得る。
【表】
【表】 【図面の簡単な説明】
第１図は本発明方法において用いる基質濃度を
変化（横軸）させたときの吸光度の変化（縦軸）
を示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式（） 〔式中R1は水素、アルキル又は置換アルキルを
    示し、R2はアルキレン又はヒドロキシアルキレ
    ンを示し、R3、R4は水素、アルキル、ハロゲン、
    ニトロ、ヒドロキシル、スルホ、カルボキシル、
    シアノ、メトキシカルボニル又はアルコキシを示
    し、Ｚは（CH3）2CH−CH2−CH（NH2）−又は
    −CH2−CH2−CH（NH2）COOHを示す〕で表
    わされる化合物もしくはその塩〔以下化合物
    （）という〕にロイシンアミノトランスペプチ
    ダーゼ（以下LAPという）又はγ−グルタミル
    トランスペプチダーゼ（以下γ−GTPという）
    を作用させて生成する化合物を色素に導き、色素
    の生成速度を測定することを特徴とする酵素活性
    の測定法。 ２ 化合物（）とLAP又はγ−GTPとの反応
    生成物と発色化合物とを酸化剤もしくは酸化酵素
    の存在下に反応させて色素を生成させることを特
    徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 化合物（）とLAP又はγ−GTPとの反応
    生成物を必要に応じてジアゾ化し、次いでカツプ
    リング剤と反応させてアゾ色素を生成させること
    を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ (イ)化合物（）及び(ロ)(1)発色化合物、及び酸
    化剤もしくは酸化酵素又は(2)ジアゾ化剤及びカツ
    プリング剤からなるLAPもしくはγ−GTP定量
    用組成物。
JP59020194A 1984-02-07 1984-02-07 酵素活性測定法 Granted JPS60164499A (ja)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
JP59020194A JPS60164499A (ja) 1984-02-07 1984-02-07 酵素活性測定法
DE8585300801T DE3586999T2 (de) 1984-02-07 1985-02-06 Verfahren zur bestimmung von leucinaminopeptidase (lap).
EP85300801A EP0152274B1 (en) 1984-02-07 1985-02-06 Method for the determination of leucine aminopeptidase (lap)
US07/248,347 US4877727A (en) 1984-02-07 1988-09-20 Substrate for determining leucine aminopeptidase or gamma-glutamyltranspeptase activity

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP59020194A JPS60164499A (ja) 1984-02-07 1984-02-07 酵素活性測定法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS60164499A JPS60164499A (ja) 1985-08-27
JPH0549280B2 true JPH0549280B2 (ja) 1993-07-23

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ID=12020363

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP59020194A Granted JPS60164499A (ja) 1984-02-07 1984-02-07 酵素活性測定法

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