JPH0542256B2

JPH0542256B2 -

Info

Publication number: JPH0542256B2
Application number: JP60123884A
Authority: JP
Inventors: Tooru Nakajima; Masahiro Sato
Original assignee: Asahi Kogaku Kogyo Co Ltd
Current assignee: Pentax Corp
Priority date: 1985-06-07
Filing date: 1985-06-07
Publication date: 1993-06-28
Also published as: JPS61282072A

Description

【発明の詳細な説明】「技術分野」本発明は、バイオインダストリー分野で発達し
つつある動植物細胞や細菌などの有用細胞種の大
量培養のための培養基支持体として、ハイドロキ
シ・カルシウム・アパタイトと多糖体との複合体
を利用する技術に関する。

「従来技術およびその問題点」従来、各種細胞の培養基としては、寒天培地が
その大半を占めていた。寒天培地は、寒天ゲルの
持つミセル構造、形態保持能、無毒性、そして豊
富な水酸基による蛋白質、糖質、塩類、必須アミ
ノ酸類など培養に必要な成分の吸着能など、理想
的な培地の支持構造体となつている。

しかしながら、寒天培地による細胞培養は、主
としてその表面部分で行なわれ、いわば二次元培
養基であるため、試験培養には適しているが、大
量生産を必要とする生産培養には適していなかつ
た。すなわち、通常の細胞種は、その本性として
コンタクト・インヒビツシヨンなる現象を有し、
培地の面が増殖細胞でカバーされつくしたとき、
分裂増殖を止める。そのため、二次元培養基によ
る細胞生産量は、その面積に支配されてしまい、
大量生産には限度がある。

このため、大量生産を目的とするバイオインダ
ストリーの分野では、三次元構造を有する培養基
支持体に細胞を吸着保持させ、培養液を流通させ
て培養させることにより、空間利用効率を高める
ようにした、いわゆるバイオリアクターが開発さ
れ、利用され始めている。このような三次元構造
を有する培養基支持体としては、細胞を安定して
吸着保持できること、細胞の吸着保持面積が大き
いこと、培養した細胞の分離・取得が容易である
ことが必要とされる。

「発明の目的」本発明の目的は、培養空間を二次元から三次元
に拡大し、細胞を安定して吸着保持でき、細胞の
吸着保持面積が大きく、培養した細胞の分離・取
得が容易であり、しかも培養細胞の分裂、増殖を
促進することができるようにした細胞培養基支持
体、細胞培養装置および細胞培養方法を提供する
ことにある。

「発明の構成」本発明による細胞培養基支持体は、グルコマン
ナンゲルの分子架橋により相互に連通して構成さ
れた多孔構造体中に、全体の乾燥重量100重量％
に対して10〜90重量％のハイドロキシ・カルシウ
ム・アパタイトの微粉末が分散されてなることを
特徴とする。

また、本発明による細胞培養装置は、上記の細
胞培養基支持体と、この細胞培養基支持体中に培
養液を流通させる機構とを備えていることを特徴
とする。

さらに、本発明による細胞培養方法は、上記の
細胞培養基支持体に細胞を吸着保持させ、この細
胞培養基支持体中に培養液を流通させつつ前記細
胞の分裂増殖を行なうことを特徴とする。

このように、本発明は、細胞培養基支持体とし
て、グルコマンナンゲルと、ハイドロキシ・カル
シウム・アパタイトとの複合体を利用することに
着眼してなれたものである。

グルコマンナンゲルは、こんにやく芋から得ら
れる多糖類の一種で、これにアルカリ水を添加し
て混練するとゲル状になる。アルカリとしては、
水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、アンモニ
アなどが使用できる。本発明では、グルコマンナ
ンにあらかじめハイドロキシ・カルシウム・アパ
タイト微粉末を混合した後、アルカリ水を添加し
てゲル化してもよく、あるいはグルコマンナンに
水を加えて糊状とし、これにハイドロキシ・カル
シウム・アパタイト微粉末を添加混合した後、ア
ルカリを添加してゲル状としてもよい。得られた
グルコマンナンゲルは、水等に浸漬して脱アルカ
リを行なう。そして、このグルコマンナンゲルを
凍結乾燥すると、不可逆的に水に膨潤はするが、
不溶性の多孔体構造の支持体としての機能を有す
るようになる。この場合、グルコマンナンゲル
は、内部に多数のミクロポアーを有し、これらの
ミクロポアーがトンネルを介して連通し、三次元
網目構造をなしている。一方、ハイドロキシ・カ
ルシウム・アパタイトの微粉末は、グルコマンナ
ンゲルの組織で囲まれた部分（スケルトン）にも
分布するが、含有量の増大と共にミクロポアーの
内面にその表面を部分的に直接露出させた状態の
ものが多くなる。このように、ハイドロキシ・カ
ルシウム・アパタイトの微粉末がミクロポアーの
内面に露出すると、細胞に対してより好ましい吸
着点となる。

そこで、細胞含有液を上記培養基支持体中に流
通させると、細胞含有液は、グルコマンナンゲル
中のミクロポアーおよびトンネルを通つて内部に
浸透し、ミクロポアー内面に露出したハイドロキ
シ・カルシウム・アパタイトに吸着される。この
状態で、培養液を培養基支持体中に流通させる
と、細胞は培養基支持体中に吸着保持された状態
で分裂、増殖する。このようにして、三次元的な
空間における細胞培養が行なわれ、生産効率を高
めることができる。なお、増殖した細胞は、遠心
分離などの手段によつて容易に分離取得すること
ができる。

本発明の培養基支持体は、グルコマンナンゲル
と、ハイドロキシ・カルシウム・アパタイトとの
複合体からなるのであるが、ハイドロキシ・カル
シウム・アパタイトは、哺乳動物の骨成分であつ
て、生体親和性の極めて高い活性生体材料である
ため、特に付着性細胞種に関しては、優れた吸着
能を有し、グルコマンナンゲルのミクロポアー表
面への細胞滞留性を良好とする。また、ハイドロ
キシ・カルシウム・アパタイト分子中のＣサイト
やＰサイトなどによる活性化作用により、細胞増
殖促進効果も有する。

本発明の培養基支持体において、グルコマンナ
ンゲル中へのハイドロキシ・カルシウム・アパタ
イト微粉末の配合量は、全体の乾燥重量100重量
％に対してハイドロキシ・カルシウム・アパタイ
ト微粉末10〜90重量％とされる。ハイドロキシ・
カルシウム・アパタイト微粉末の配合量が上記範
囲よりも少ない場合には、好ましい吸着点の露呈
が少なすぎ、所望の培養効果が得られないという
問題が生じ、上記範囲よりも多い場合には、支持
体としての構造上の強度が低下し、実用に供し難
くなるという問題が生じる。

本発明の培養基支持体において、ミクロポアー
のサイズや、単位体積当りのポアーの密度は、グ
ルコマンナンゲルとハイドロキシ・カルシウム・
アパタイトとの複合体の製造条件によつて、自由
に制御することができる。そして、ミクロポアー
のサイズ、単位体積当りのポアーの密度、ミクロ
ポアーを連通させるトンネルの状態などは、目的
とする増殖細胞の大きさ、マイクロコロニーの性
質や形態、細胞の増殖に見合つた栄養補給や老排
物の排除の速度など、培養条件によつて適宜選択
する。この場合、細胞の生育、増殖に対する好ま
しい条件は、細胞種によつて異なるので、実験事
実の積み上げにより、それぞれ決められなければ
ならない。なお、一般的条件として、平均的ミク
ロポアーのサイズは数μｍから数千μｍ程度、ミ
クロポアーの密度は平均50％（具体的範囲は10〜
90％）程度が好ましい。

なお、本発明の培養基支持体において、ミクロ
ポアーの表面を化学修飾することによつて、細胞
種によつては、その吸着、滞留性を増大させ、ま
たは逆に離脱させやすくすることが可能である。
さらに、培養基支持体のゲルとしては、グルコマ
ンナンの他の多糖類、例えば寒天、アルギン酸、
ペクチン、セルロースなどを混入してなるゲルを
用いてもよい。なお、上記のような生物由来の多
糖類のみでなく、細胞種によつては石油化学的合
成物質を利用することもできる。しかし、これら
全ての素材は、細胞に対する毒性、あるいは抗原
性を有してはならない。

本発明は、リンパ球、マクロフアージ等の生体
細胞、大腸菌等の細菌など、各種の細胞培養に適
用することができる。

「発明の実施例」第１図には、本発明による細胞培養基支持体の
具体例が示されている。図において、グルコマン
ナンゲル１は、多数のミクロポアー２と、これら
のミクロポアー２を連通させるトンネル３とから
なる三次元網目構造をなしている。そして、ハイ
ドロキシ・カルシウム・アパタイトの微粉末４は
グルコマンナンゲル１中に包埋されて支持され、
その表面が部分的にミクロポアー２の内面に露出
している。したがつて、細胞含有液や培養液は、
ミクロポアー２およびトンネル３を通つて、三次
元網目構造の内部をすみずみまで流通することが
できる。そして、細胞は、ミクロポアー２の内面
に露出したハイドロキシ・カルシウム・アパタイ
ト微粉末４の表面に吸着されて滞留する。

この細胞培養基支持体の製造例を挙げると、グ
ルコマンナンを水に溶かしてグルコマンナン５％
のペーストを作り、ハイドロキシ・カルシウム・
アパタイトとグルコマンナンとの重量比が５：１
となるようにハイドロキシ・カルシウム・アパタ
イト微粉末を入れて混練し均一化する。これに水
酸化カルシウムを約10重量％加えて架橋反応を起
こさせ、ゲル化させる。ゲル化終了後、水中に浸
漬して脱アルカリを行ない、凍結乾燥する。な
お、使用時には、再び水で膨潤させた後、絞つて
ミセル構造を再現すると、引張り強度3.97Kgｆ／
cm²の培養基支持体となる。

細胞培養基支持体の他の製造例を挙げると、グ
ルコマンナンを水に溶かしてグルコマンナン５重
量％のペーストを作り、ハイドロキシ・カルシウ
ム・アパタイトとグルコマンナンとの重量比が
２：１となるようにハイドロキシ・カルシウム・
アパタイト微粉末を入れて混練し均一化する。こ
れに水酸化ナトリウムの0.1規定溶液を20容量％
加えて架橋反応させ、ゲル化させる。ゲル化終了
後、水で脱アルカリを行ない、凍結乾燥する。な
お、使用時には、上記製造例と同様に水で膨潤さ
せることにより、引張り強度5.21Kgｆ／cm²の培養
基支持体となる。

第２図には、上記細胞培養基支持体を利用した
本発明の細胞培養装置の具体例が示されている。
培養液入口１１を有する容器蓋体１２と、培養液
出口１４を有する容器本体１３とからなる容器内
に、上記培養基支持体１７が保持されている。な
お、培養基支持体１７は、多孔質セラミツクスあ
るいはガラスウールなどからなる保持体１５，１
６を介して、容器内に保持されている。

この培養装置を用いた本発明の培養方法は、次
のようにして行なう。まず、培養液などに分散さ
れた細胞含有液を培養液入口１１から流入し、保
持体１５を通して培養液支持体１７中に浸透させ
る。細胞含有液は、培養基支持体１７中のミクロ
ポアー２およびトンネル３を通つて浸透し、ミク
ロポアー２の内面に露出したハイドロキシ・カル
シウム・アパタイト微粉末４に吸着され、滞留す
る。細胞が必要個数吸着された後、約１時間程度
インキユベーシヨンを行ない、細胞の活性化を促
し吸着を確実にする。そして、計量された定温の
培養液を培養液入口１１から流入し、培養基支持
体１７に流通させ、培養液出口１４から流出させ
る。この場合、培養液は、還流させることがより
好ましい。こうして、細胞を培養基支持体１７に
支持させた状態で培養液を供給し、三次元空間に
おける培養を行なう。細胞が充分に分裂、増殖し
た時点で培養基支持体１７を取出して遠心分離
し、増殖細胞を分離取得する。勿論、これらの操
作は全て無菌的に行なわなければならない。な
お、培養液の供給は間欠的に行なつてもよい。

細胞培養基支持体１７の全体的な形状は、直方
体状、円板状、球状、その他不規則形状などいか
ようにもすることができる。また、細胞培養基支
持体１７は、一体構造でもよく、不規則な小ブロ
ツクの集合体構造でもよい。さらに、細胞培養基
支持体１７を保持する容器は、ガラス、セラミツ
クス、プラスチツクスなど種々の材質の容器が使
用できる。

「発明の効果」以上説明したように、本発明によれば、グルコ
マンナソゲルとハイドロキシ・カルシウム・アパ
タイトとの複合体からなる細胞培養基支持体を用
いるので、細胞を表面積の大きい三次元網目構造
体中に吸着保持することができる。そして、培養
液を流通させることにより、細胞を三次元空間で
効率的に増殖させることができる。その場合、ハ
イドロキシ・カルシウム・アパタイトの有する活
性作用により、細胞の増殖を良好にする効果も得
られる。また、細胞増殖後は、遠心分離などの簡
単な手段によつて細胞を容易に分離取得すること
ができる。なお、本発明は、インビトロにおける
細胞培養に適しているが、生物の体内空間を利用
するいわゆるインビボの細胞培養にも利用するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による細胞培養基支持体の具体
例を示す断面図、第２図は本発明による細胞培養
装置の具体例を示す断面図である。図中、１はグルコマンナンゲル、２はミクロポ
アー、３はトンネル、４はハイドロキシ・カルシ
ウム・アパタイトの微粉末、１１は培養液入口、
１２は容器蓋体、１３は容器本体、１４は培養液
出口、１７は細胞培養基支持体である。

Claims

【特許請求の範囲】１グルコマンナンゲルの分子架橋により相互に
連通して構成された多孔構造体中に、全体の乾燥
重量100重量％に対して10〜90重量％のハイドロ
キシ・カルシウム・アパタイトの微粉末が分散さ
れてなることを特徴とする細胞培養基支持体。２グルコマンナンゲルの分子架橋により相互に
連通して構成された多孔構造体中に、全体の乾燥
重量100重量％に対して10〜90重量％のハイドロ
キシ・カルシウム・アパタイトの微粉末が分散さ
れてなる細胞培養基支持体と、この細胞培養基支
持体中に細胞液を流通させる機構とを備えている
ことを特徴とする細胞培養装置。３グルコマンナンゲルの分子架橋により相互に
連通して構成された多孔構造体中に、全体の乾燥
重量100重量％に対して10〜90重量％のハイドロ
キシ・カルシウム・アパタイトの微粉末が分散さ
れてなる細胞培養基支持体に細胞を吸着保持さ
せ、この細胞培養基支持体中に培養液を流通させ
つつ前記細胞の分裂増殖を行なうことを特徴とす
る細胞培養方法。