JPH05336961A

JPH05336961A - 株化した哺乳動物細胞による物質の生産方法

Info

Publication number: JPH05336961A
Application number: JP4174707A
Authority: JP
Inventors: Hidetaka Shimoizu; 英貴下伊豆; Nobuyuki Eto; 伸幸江藤
Original assignee: Tabai Espec Co Ltd
Current assignee: Espec Corp
Priority date: 1992-06-08
Filing date: 1992-06-08
Publication date: 1993-12-21

Abstract

(57)【要約】【構成】あらかじめウィルスに感染させることにより、
所望の物質を発現する哺乳動物細胞を株化し、該株化し
た哺乳動物細胞を少なくとも細胞およびウィルスに対し
て透過性を有しないが栄養物、増殖因子、ガス等に対し
ては透過性を有する多孔性ポリマー膜で仕切られた細胞
培養器内の細胞生育空間に挿入し、該多孔性ポリマー膜
を介して栄養物、増殖因子、ガス等を供給して、該株化
した哺乳動物細胞の培養を行なうことを特徴とする、株
化した哺乳動物細胞による物質の生産方法。【効果】株化細胞と共に混入したウィルスが細胞培養器
外部に拡散されて生産設備の汚染および人間への感染を
起こす恐れのない、また、細胞が細胞培養器内でコンタ
ミネーションを起こす恐れのない細胞培養による物質の
生産が可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、予め哺乳動物細胞をウ
ィルスに感染させて株化することにより得られる株化細
胞を培養増殖し、該培養物中に所望の物質を発現させて
該物質を回収することよりなる物質の生産方法に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術・発明が解決しようとする課題】哺乳動物
細胞には、ウィルスの感染により細胞が株化して増殖し
続ける性質があることが従来より知られている。従っ
て、生体内で微量に生産される酵素、生理活性物質等の
所望の物質を大量生産する方法の１つとして、所望の物
質を発現する性質を有する哺乳動物細胞を予めウィルス
に感染させた後、株化することにより得られた株化細胞
の培養増殖を行い、該培養物中に所望の物質を発現させ
て該物質を回収する方法が知られている。

【０００３】即ち、所望の物質を発現する性質を既に有
する細胞を用いる場合は、例えばＢ細胞（Ｂリンパ
球）、マクロファージ等のヒト由来細胞や、ＶＥＲＯ、
ＣＶ−１等のサル由来細胞等をＳＶ４０（シミアンウィ
ルス）、ＥＢウィルス（エプスタイン・バーウィル
ス）、アデノウィルス１２型等のウィルスに感染させて
得られた細胞を株化させ、細胞培養の際に通常用いられ
るペトリディッシュ（シャーレ）、Ｔ型フラスコ、スピ
ナーフラスコ、ローラーボトルまたはタンク型培養器等
の細胞培養器内で株化した細胞を培養することにより、
該感染細胞の増殖が行われている。

【０００４】ところでこのように、細胞を培養して生育
し増殖させるためには、水分、無機塩、アミノ酸、グル
コースおよびビタミン等の栄養物、増殖因子および酸素
や二酸化炭素等のガスを供給すると共に、培養中の細胞
より排出されたガスや老廃物の除去を適宜行うことが必
要となる。この際、栄養物およびガスの供給にあたって
は、培養細胞に対するコンタミネーションの防止、すな
わち培養細胞とは異なる他の細胞やウィルス、細菌、マ
イコプラズマ等の微生物が細胞培養器中に侵入すること
を培養目的である株化細胞の培養を制御する点から防止
する必要がある。

【０００５】また、株化細胞の細胞培養器内への挿入に
おいて、感染に用いたウィルスは株化細胞と共に細胞培
養器内に混入する。従って、培養中の株化細胞より排出
されたガスや老廃物の除去にあたっては、培養中の株化
細胞やウィルスがガスや老廃物と共に細胞培養器外に排
出され外部に拡散することにより生産設備および実験室
がウィルスにより汚染されることを防止する必要があ
る。特に生産設備のウィルスによる汚染は、環境汚染の
問題ひいては生産機能の破壊にかかわることから、非常
に大きな問題となっている。ＳＶ４０やＥＢウィルス等
は、哺乳動物の細胞に感染し、癌化させる性質を有して
おり、培養にかかわる作業を行う人間への影響を特に注
意しなければならない。また、これらのウィルスが拡散
した場合、生産現場における人間への感染および外部の
人間への感染の可能性が考えられ、社会問題となり得
る。

【０００６】従来、前記の問題を解決するための対策と
しては、細胞培養器の開閉部分や隙間にエアーフィルタ
ー、メンブレン等を取りつけることによって、これを介
して栄養物およびガスを供給し、またガスや老廃物の除
去を行なっていた。しかしながら、エアーフィルター、
メンブレンの孔の大きさに比して、通常、所望の物質を
発現させる目的で、哺乳動物細胞を感染させて株化させ
る手法に用いるウィルスは非常に微細であり、その構造
・性質上エアーフィルター、メンブレンの孔を通過し得
るものであったため、生産設備のウィルスによる汚染の
恐れの問題が常に指摘されており、この問題の解決が当
業界で要請されていたものの未だ有効な解決手段は見出
されていないのが実情である。また、タンク型培養装置
等においては、培養液の流通する部分にウィルス不透過
性の多孔性ポリマー（再生セルロース等）を付設するこ
とにより、ウィルスが装置外部に排出されるのを防ぐ方
法が用いられていることはあるが、当該装置には、同時
に前述のエアーフィルター等を付設して圧力逃しやガス
排除を行なっている場合が多く、ウィルスの封じ込めを
するには至ってないと考えられる。また、それらを付設
することによる装置の拡大、空間の占拠、工数の増大の
発生は否めない。

【０００７】従って、本発明の目的は、細胞培養器内の
株化細胞やウィルスが培養器外部に拡散することによる
生産設備の汚染の心配がなく、また培養空間への外部か
らの微生物等によるコンタミネーションを防止できるよ
うにウィルス感染により株化された哺乳動物細胞を培養
し、所望の物質を回収することよりなる物質の生産方法
を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の課
題を解決するために鋭意検討した。その結果、細胞培養
器内に細胞およびウィルスに対して透過性を有しない大
きさの細孔を有する多孔性ポリマー膜を備えることによ
って、生産設備がウィルスにより汚染されることおよび
人間への感染を有効に防止できる細胞培養の方法を見い
だし、本発明を完成するに至った。

【０００９】即ち、本発明の要旨は、あらかじめウィル
スに感染させることにより、所望の物質を発現する哺乳
動物細胞を株化し、該株化した哺乳動物細胞を少なくと
も細胞およびウィルスに対して透過性を有しないが栄養
物、増殖因子、ガス等に対しては透過性を有する多孔性
ポリマー膜で仕切られた細胞培養器内の細胞生育空間に
挿入し、該多孔性ポリマー膜を介して栄養物、増殖因
子、ガス等を供給して、該株化した哺乳動物細胞の培養
を行なうことを特徴とする、株化した哺乳動物細胞によ
る物質の生産方法に関する。

【００１０】本発明で用いられるウィルスの種類は、こ
れを感染させる細胞の種類にあわせて適宜選択し得るも
のであって、特に限定されるものではないが、感染後の
細胞が容易に株化し、株化細胞の増殖作用を高めるもの
が望ましい。本発明で用いられる哺乳動物細胞として
は、ウィルスに感染した後、得られる株化細胞の培養に
よる増殖が容易なものであれば特に限定されるものでは
ない。また、特にウィルスの感染により細胞が株化され
ることにより、細胞自体が有する所望の物質を発現する
性質が強化されるものが好ましい。例えばＢ細胞（Ｂリ
ンパ球）等のヒト由来の細胞、腎細胞（ＶＥＲＯ細胞、
ＣＶ−１細胞）等のサル由来の細胞等が挙げられる。

【００１１】本発明において哺乳動物細胞をウィルスに
感染させる方法については特に制限はなく、リン酸カル
シウム法のように通常の方法が用いられる。感染後の細
胞は、通常３〜５×１０⁵細胞／ｍｌで、血清含有培地
を用い、その密度を保つように３７℃、ｐＨ６．８付近
にて継代、培地交換を繰り返し、２０〜５０日間程度培
養することによって株化する。その後、選択培地の利用
やプラークハイブリダイゼーション等の方法で株化され
た細胞のみを抽出して、本発明の方法に用いる株化した
哺乳動物細胞（以下、単に株化細胞と記載する）とする
ことができる。

【００１２】本発明において株化細胞の培養には、従来
より使用されている通常の細胞培養器内に本発明におけ
る多孔性ポリマー膜を設けて行うことができ、細胞培養
器の種類・形状等に何ら限定されるものではない。即
ち、例えば、従来の透析膜、限外濾過膜、精密濾過膜等
の膜を用いることが可能な細胞培養器や培養袋、または
ホローファイバー等の膜型リアクターであって、栄養物
およびガス等の供給のための開閉可能な開口部を持つ容
器を本発明における細胞培養器用の容器として用いるこ
とができる。本発明においては、これらの容器内に前記
の透析膜、限外濾過膜、精密濾過膜等の膜の代わりに、
本発明における多孔性ポリマーの膜を用いて使用するこ
とができる。

【００１３】本発明でいう多孔性ポリマー膜とは、栄養
物、増殖因子およびガス等に対しては透過性を有する
が、本発明で用いられる株化細胞および該細胞の感染に
用いたウィルス（以下、単にウィルスと記載する）に対
しては透過性を有しない大きさの細孔を有する膜であれ
ば特に制限はなく、ウィルスの大きさにより適宜選択さ
れる。即ち、これらのウィルスは通常２０ｎｍ程度から
数１００ｎｍ程度の大きさであるため、これらの大きさ
を考慮して多孔性ポリマーの孔の大きさを適宜選択すれ
ばよい。例えば、ウィルスの大きさが２０ｎｍより少し
大きい程度であれば、２０ｎｍ程度の孔を有する多孔性
ポリマーを使用することができ、この程度の孔径があれ
ば栄養物、増殖因子およびガス等を多孔性ポリマー膜に
接液させて透過させるのに支障はないため問題なく使用
することができる。このような多孔性ポリマーとして、
例えばポリサルホン、キュプロファン、セルロースアセ
テート等が挙げられる。膜の厚さは通常５μｍ〜２００
μｍ程度で好ましくは２０μｍ程度である。なお、前記
多孔性ポリマー膜は単層であっても、また複数に積層し
たものであってもよい。

【００１４】本発明における多孔性ポリマー膜は、通
常、細胞生育空間と該空間に隣接する栄養物・増殖因子
・ガス通過空間を仕切る部分に設けられ、栄養物・増殖
因子・ガス通過空間から細胞生育空間へは栄養物、増殖
因子およびガスを該多孔性ポリマー膜に接液させ、この
膜を介して供給することができるが、細胞生育空間から
栄養物・増殖因子・ガス通過空間へは培養中に株化細胞
および株化細胞と共に混入したウィルスが拡散すること
ができないようこれを防止するという役割を有してい
る。また、細胞生育空間において培養中の株化細胞より
排出されるガスや老廃物は、多孔性ポリマー膜を通過し
て細胞生育空間から栄養物・増殖因子・ガス通過空間に
排出させるという役割をも有している。

【００１５】本発明でいう細胞生育空間とは、株化細胞
を培養するための空間をいい、少なくとも細胞およびウ
ィルスに対して透過性を有しない部材により形成された
空間であって、該部材の一部が栄養物、増殖因子および
ガス等に対しては透過性を有する前記の多孔性ポリマー
の膜よりなるものをいう。また、栄養物・増殖因子・ガ
ス通過空間とは、栄養物、増殖因子およびガス等を該多
孔性ポリマー膜を介して細胞生育空間内に供給するため
の空間をいい、多孔性ポリマー膜を介して細胞生育空間
に隣接して設けられる空間をいう。なお、本発明で供給
されるガスは、通常、液状の栄養物中に溶解した状態で
用いられる。

【００１６】次に、本発明の生産方法における株化細胞
の培養に用いる細胞培養器の代表例について、図面を用
いて説明する。図１は本発明で用いる細胞培養器を配設
した培養装置の概略構成図である。株化細胞の培養に必
要な栄養物、増殖因子およびガスは栄養物・増殖因子・
ガス供給部から細胞培養器内に必要に応じて供給され
る。培養中の株化細胞より排出された老廃物および不要
なガスは、細胞培養器外に排出される。培養する株化細
胞は、細胞供給部より細胞培養器に供給される。

【００１７】本発明の生産方法における株化細胞の培養
に用いられる細胞培養器内の構造は、例えば図２の断面
側面概略図（図３はそのＡ−Ａ線断面概略図）に示され
るものを挙げることができる。即ち、多孔性ポリマー膜
としてホローファイバーを用いたホローファイバーカー
トリッジを充填した細胞培養器であり、株化細胞は開閉
自在な開口部２７、２８から細胞生育空間２１に挿入さ
れる。栄養物・増殖因子・ガス通過空間２４はホローフ
ァイバー２３を介して細胞生育空間２１と隣接してお
り、開閉自在な開口部２５より栄養物、増殖因子および
ガスが供給される。即ち開口部２５は図１で示した栄養
物・増殖因子・ガス供給部と連結しており、必要に応じ
て栄養物・増殖因子・ガス等が栄養物・増殖因子・ガス
供給部から細胞培養器内の栄養物・増殖因子・ガス通過
空間２４に供給される。この例では、細胞生育空間２１
は一部をホローファイバー２３により、他は細胞培養器
の外壁２２およびホローファイバーカートリッジの端部
２９により囲まれている。細胞培養器の外壁２２は、特
に制限はないが、通常ポリカーボネート等の材質よりな
り、細胞およびウィルスに対して透過性を有しないもの
である。また、細胞培養器の外壁２２の材質を例えば、
ウィルスや栄養物は通過できないが、酸素や二酸化炭素
等のガスの通過が可能な程度の細孔をもつ、有機・無機
ポリマー等を用いることにより、ガスのみを細胞培養器
の容器内外に通過できるようにしてもよい。また、前記
のホローファイバーカートリッジの端部２９は通常エポ
キシ樹脂、ウレタン樹脂等の材質により形成されてお
り、同様にウィルスおよび細胞に対して透過性を有しな
いものである。従って、細胞生育空間２１は、挿入され
た株化細胞が培養中に細胞生育空間２１より外部に排出
する恐れのない空間である。

【００１８】本発明の生産方法における株化細胞の培養
に用いる細胞培養器としては、多孔性ポリマーの膜とし
て前記のようなホローファイバーを用いる代わりに、多
孔性の平膜を用いてもよい。図４および図５にその例と
して平膜を用いた細胞培養器の断面側面概略図を示す。
即ち、図４は、細胞培養器の上段に細胞生育空間４５を
設け、平膜４７を介して下段に栄養物・増殖因子・ガス
通過空間４８を設けた例である。この場合、株化細胞は
開閉自在な開口部４１または４２より細胞生育空間４５
内に挿入され、栄養物、増殖因子およびガスは開閉自在
な開口部４３または４４より栄養物・増殖因子・ガス通
過空間４８へ供給される。図５は、細胞培養器の中間部
分に細胞生育空間５９を設け、平膜５８を介して上段と
下段に栄養物・増殖因子・ガス通過空間５７、６０を設
けた例である。株化細胞は図４の場合と同様に開口部５
３または５４より挿入され、栄養物、増殖因子およびガ
スは開口部５１または５２、開口部５５または５６より
供給される。このように本発明において多孔性ポリマー
の膜を配設するには種々の態様が可能であり、特にこれ
らに限定されるものではない。

【００１９】このような細胞培養器を用いた本発明の生
産方法について、図２を用いて以下に説明する。まず前
記のような常法によりウィルスに感染させて株化細胞を
得る。この株化細胞を細胞供給部に供給し、さらに細胞
供給部に連結した前記開口部２７または２８より細胞培
養器中の細胞生育空間２１内に株化細胞を挿入する。挿
入後は開口部は閉じられ、株化細胞および株化細胞と共
に混入したウィルスの外部への排出が防止される。な
お、前記細胞培養器は、通常用いられる培養装置の回路
内に予め接続される。このような培養装置としては、例
えば、栄養物タンクやガス交換器等よりなる栄養物・増
殖因子・ガス供給部、送液ポンプ（または循環ポン
プ）、送液チューブ、ｐＨセンサー、ＤＯセンサー、お
よび老廃物の回収用タンク等を有する回路などを使用す
ることができる。培養装置を稼働させて、栄養物・増殖
因子・ガス供給部に連結した細胞培養器の前記開口部２
５より栄養物・増殖因子・ガス通過空間２４に栄養物、
増殖因子およびガスが供給され、多孔性ポリマーの膜
（この例ではホローファイバー２３）を介して栄養物、
増殖因子およびガス等が細胞生育空間内の株化細胞に供
給され、これにより株化細胞の培養増殖が行われる。栄
養物・増殖因子・ガス通過空間への栄養物、増殖因子お
よびガスの供給、および細胞生育空間から栄養物・増殖
因子・ガス通過空間への不要なガスおよび老廃物の排出
・除去等は、通常の細胞培養の場合と同様に細胞培養器
と連結した送液チューブ等を通じて行うことができ、培
養装置内のｐＨセンサー、ＤＯセンサー等により培養状
態を管理しながら株化細胞の培養増殖が行われる。

【００２０】前記の培養により得られる増殖後の株化細
胞は、所望の物質を発現するので、例えばクロマトグラ
フィー、電気泳動等の通常の方法を用いることにより、
所望の物質を容易に回収することができる。

【００２１】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定
されるものではない。実施例Ｂリンパ芽球細胞の培養によるイムノグロブリン（Ｉｇ
Ｇ）の生産まず、３７．０℃、ｐＨ６．５〜６．６の条件で、ヒト
由来のＢリンパ球細胞を、ＥＢウィルスに感染させた。
３〜５日毎に培地交換、細胞の継代を行なったのち、得
られた細胞のうち、株化細胞であるＢリンパ芽球細胞
（イムノグロブリン産生細胞）数は６．５３×１０⁶個
細胞であった。図１〜図３の概略構成図に示される、多
孔性ポリマーの膜としてホローファイバーを用いた細胞
培養器を配設した培養装置を用いて、前記培養装置の滅
菌および洗浄を行った後、細胞培養器の開口部２７およ
び開口部２８より、前記株化細胞を、ｐＨ約７の条件に
て細胞培養器内の細胞生育空間に播種し、同開口部より
ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）培地
を添加し、培養装置を稼働させて前記細胞の培養を開始
した。酸素センサーおよびｐＨセンサーにより、回路内
の酸素の消費量およびｐＨ値を指標として前記細胞の培
養を行なった。約５００時間後に培養を終了し、イムノ
グロブリン（ＩｇＧ）の発現を調べた。なお、培養終了
後の最終細胞数は５．０×１０⁹個細胞であり、うち生
細胞は３．０×１０⁹個細胞であった。細胞密度は１．
２×１０⁸個生細胞／ｍｌであり、高密度に増殖したこ
とが示された。培養期間中は酸素消費速度、細胞の増殖
（観察）およびｐＨの値を指標として細胞培養器の開口
部２５より水分、無機塩、アミノ酸、グルコースおよび
ビタミン等よりなる栄養物、増殖因子およびガスを細胞
培養器中の栄養物・増殖因子・ガス通過空間に供給し
た。

【００２２】培養終了後に、細胞生育空間内の培養液お
よび細胞をとりだして、イムノグロブリン（ＩｇＧ）の
発現を非変性条件で電気泳動を行なって確認したとこ
ろ、培養上清中にイムノグロブリン（ＩｇＧ）のバンド
が確認された。また、免疫沈降法により当該ＩｇＧ抗体
は抗ＩｇＧ抗体との沈降反応を示した。次に、ＩｇＧの
活性量を免疫酵素測定法により測定した。この結果よ
り、本発明の方法がＢリンパ芽球細胞における高密度培
養手法の一つとして有用であり、哺乳動物細胞による物
質生産に利用できることが判明した。なお、株化細胞と
共に混入したＥＢウィルスの細胞培養器外への排出によ
る汚染は認められなかった。

【００２３】

【発明の効果】本発明により、株化細胞と共に混入した
ウィルスが細胞培養器外部に拡散されて生産設備の汚染
および人間への感染を起こす恐れのない、また、細胞が
細胞培養器内でコンタミネーションを起こす恐れのない
細胞培養が可能となり、目的とする物質の生産を安全か
つ有効に行うことが可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明で用いる細胞培養器を配設した培養装置
の概略構成図である。

【図２】本発明で用いる細胞培養器の１例を示す断面側
面概略図である。

【図３】図２に示される本発明で用いる細胞培養器のＡ
−Ａ線断面概略図である。

【図４】本発明で用いる細胞培養器の１例を示す断面側
面概略図である。

【図５】本発明で用いる細胞培養器の１例を示す断面側
面概略図である。

【符号の説明】

２１細胞生育空間２２外壁２３ホローファイバー２４栄養物・増殖因子・ガス通過空間２９ホローファイバーカートリッジの端部４５細胞生育空間４６外壁４７平膜４８栄養物・増殖因子・ガス通過空間５７栄養物・増殖因子・ガス通過空間５８平膜５９細胞生育空間６０栄養物・増殖因子・ガス通過空間６１外壁

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:92）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】あらかじめウィルスに感染させることに
より、所望の物質を発現する哺乳動物細胞を株化し、該
株化した哺乳動物細胞を少なくとも細胞およびウィルス
に対して透過性を有しないが栄養物、増殖因子、ガス等
に対しては透過性を有する多孔性ポリマー膜で仕切られ
た細胞培養器内の細胞生育空間に挿入し、該多孔性ポリ
マー膜を介して栄養物、増殖因子、ガス等を供給して、
該株化した哺乳動物細胞の培養を行なうことを特徴とす
る、株化した哺乳動物細胞による物質の生産方法。
【請求項２】ウィルスが所望の物質を発現する遺伝子
を有し、株化細胞が前記遺伝子を発現するものである請
求項１記載の生産方法。
【請求項３】多孔性ポリマー膜がホローファイバーで
ある請求項１または２記載の生産方法。