JPH05317044A - スタフィロキナーゼの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 血栓溶解作用を有するスタフィロキナーゼの
遺伝子組み換え技術を用いた生産方法の改良に関する。 【構成】 スタフィロキナーゼ産生遺伝子を組み込んだ
大腸菌を培養するにあたり、培地成分に０．２％量以上
の糖由来炭素源を含有せしめることにより、スタフィロ
キナーゼを培養液中に蓄積させ、培養液中から、スタフ
ィロキナーゼを採取するスタフィロキナーゼの生産方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血栓溶解作用を有する
スタフィロキナーゼの遺伝子組み換え技術を用いた生産
方法の改良に関する。

【０００２】

【背景技術】スタフィロキナーゼ（以下ＳＡＫと略記す
る）は、スタフィロコッカス・アウレウス（以下Ｓ・ア
ウレウスと記す）が産生する繊維素溶解酵素であって、
血中のプラスミノーゲンをプラスミンに変える機能を有
するが、このプラスミンがフィブリンに作用してこれを
溶解するので、ＳＡＫは、血栓溶解作用を有する物質と
して、血液凝固防止剤、血栓治療剤などのいわゆる線溶
剤として用いられ、医療上、極めて有用な物質として知
られている。

【０００３】ＳＡＫの生産方法としては、Ｓ・アウレウ
スの溶原ファージ由来のＳＡＫ産生遺伝子を大腸菌や枯
草菌に組み込み、ＳＡＫを産生させるという遺伝子組み
換え技術を用いた生産方法が知られている（特開昭５８
−６７１８１号公報および特開昭５９−１３５８８８号
公報参照）。

【０００４】例えば、大腸菌による遺伝子組み換え方法
（特開昭５８−６７１８１号）を用いたＳＡＫの生産方
法においては、ＳＡＫ産生大腸菌をペプトン・イースト
エキスを主とした培地を用いて好気的に培養し、増殖の
停止が認められた後に集菌し、該菌体のペリプラズム画
分に蓄積したＳＡＫを抽出し、この抽出液をイオン交換
クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマ
トグラフィー等で精製し、純度の高いＳＡＫを得てい
る。

【０００５】このような従来法においては、菌体自体か
らＳＡＫを抽出しているため、細胞破壊、浸透圧ショッ
クなどの複雑な処理工程が必要であり、しかもこの間、
Ｐ１微生物である組み換え大腸菌が自然界に飛散しない
ように、厳重な製造管理を行うことが必要であり、ま
た、菌体中の成分が精製ＳＡＫに混入しないように、多
段階にわたる精密な精製処理を行う必要がある。

【０００６】また、このような従来法においては、ＳＡ
Ｋが、菌体培養液中には低濃度でしか存在しないので、
菌体培養液からＳＡＫを抽出するには、効率が悪く現実
的に実施する方法としては種々の欠点が存在する。

【０００７】

【発明の開示】本発明者は、ＳＡＫの生産方法につき、
種々検討を行った結果、前述のＳＡＫ産生大腸菌の培養
時の培養条件を改良することにより、その培養時にＳＡ
Ｋが、培養液中に高濃度で蓄積されることを見出し、そ
の結果、該培養液について簡単な抽出操作を行うことに
より高純度のＳＡＫが得られることを見出した。本発明
はかかる知見に基づいてなされたものである。

【０００８】すなわち、本発明により、Ｓ・アウレウス
の溶原ファージＤＮＡを切断して得たスタフィロキナー
ゼ産生遺伝情報を担うＤＮＡを組み込んだベクターを導
入して得られたスタフィロキナーゼ産生大腸菌の培養に
よりスタフィロキナーゼを生産する方法において、培地
成分に０．２％量以上の糖由来炭素源を含有せしめるこ
とによりスタフィロキナーゼを培養液中に蓄積させ、該
培養液中からスタフィロキナーゼを採取することを特徴
とするスタフィロキナーゼの生産方法が提供される。

【０００９】さらに詳しく言えば、本発明は、従来のＳ
ＡＫ生産大腸菌によるＳＡＫ生産方法において、ＳＡＫ
産生大腸菌を培養する際のペプトン、イーストを主とす
る培地に、更に、グルコース等の糖由来炭素源を含有せ
しめた培地を用いて、ＳＡＫ産生大腸菌の培養を行うこ
とを特徴とするものであり、その結果、菌体濃度を数倍
から１０倍に高め、それに比例して培養液中にＳＡＫを
多量に蓄積させ、その培養液中からＳＡＫを採取すると
いうものである。

【００１０】本発明のＳＡＫ生産方法につき、以下に、
更に詳細に説明する。

【００１１】本発明方法で使用するＳＡＫ産生大腸菌
は、後記の実施例に記載されているとおりの寄託株がそ
の一例であるが、これに限定されるものでない。すなわ
ち、ＳＡＫ産生遺伝子の入手源としては、ＳＡＫ産生遺
伝子を保持しているＳ・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の溶原ファージであれ
ば、とくに制限はなく、前記の引用公報中に開示されて
いるファージもその１例として利用することができる。

【００１２】このファージ由来のＳＡＫ産生遺伝子の採
取方法、採取した遺伝子断片の中間処理、および、導入
する大腸菌菌株の選択、用いるベクターの選択等につい
ても格別に特定はされない。通常、遺伝子組み換えの分
野で用いられている技術は、いずれも適用することがで
きる。

【００１３】本発明方法において使用するＳＡＫ産生大
腸菌は、例えば下記〜の工程により得られる。 ＤＮＡ供与体であるＳ・アウレウスの溶原ファージＤ
ＮＡを制限酵素で切断する。 ＳＡＫ産生遺伝情報を有するＤＮＡ断片をとり出す。
（この工程は省略することもできる） ベクターＤＮＡを制限酵素によって開裂させる。 ベクターＤＮＡの開裂部位に又はで得たＤＮＡ断
片を組み込ませる。 この組み換え体ＤＮＡを宿主大腸菌に導入する。 によりＳＡＫ産生能を有することとなった大腸菌
を選択分離する。

【００１４】上記のＤＮＡ供与体としての溶原ファージ
はＳＡＫ生産能を有するＳ・アウレウス溶原株から分離
された溶原ファージで、かつ、そのファージが溶原変換
能を有するファージであれば、すべて使用可能である。
その例としては４２Ｄ、Ｌ４２Ｅ、７７（文献：Ｍａｓ
ｏｎ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ Ａｌｌｅｎ，Ｗ．Ｅ．（１９７
５）Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２１，１１１３
〜１１１６）、Ｐφ１，Ｐφ２，Ｔφ−４２Ｄ，Ｐφ−
４０６（文献：Ｋｏｎｄｏ，Ｉ．ａｎｄ Ｆｕｊｉｓ
ｅ，Ｋ．（１９７７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１
８，２６６〜２７２）、Ｒφ１９，ＳφＣ（文献：近藤
勇ら（１９８０）東京慈恵会医科大学雑誌９５，１２０
３〜１２０６）などがある。溶原ファージＤＮＡの調製
に使用される手段は、常用の手段である。すなわち、溶
原ファージをその宿主菌であるＳ・アウレウスに感染さ
せ、この感染菌を培養する（この方法は例えば文献：Ｂ
ｌａｉｒ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．
Ｅ．Ｏ．（１９６１）Ｂｕｌｌ．Ｗ．Ｈ．Ｏ．２４，７
７１〜７８４に記載されている）。これによってファー
ジは培地中に出てくる（菌は溶菌する）ので、このファ
ージを適当な方法（例えば塩化セシウム平衡密度勾配遠
心法，文献：Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ，Ｅ．Ｄ．ａｎｄＴｙ
ｒｏｎｅ，Ｓ．（１９６４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
８８，１７３７〜１７４２）で集め、このファージから
さらに公知の方法（例えばフュノール抽出法など）によ
りファージＤＮＡを抽出することができる。

【００１５】溶原ファージＤＮＡの制限酵素による切断
は次のようにして行う。

【００１６】ファージＤＮＡに適当な制限酵素を加え、
適当な反応条件で反応を行うことによって、ファージＤ
ＮＡは加えられた制限酵素によって種々の断片に切断さ
れる。

【００１７】このファージＤＮＡの切断に使用しうる制
限酵素は、１）ファージＤＮＡを切断しうるものであ
り、かつ２）ＳＡＫ生産に関する遣伝情報を担うＤＮＡ
部分を切断しないものでなければならない。これに適す
る制限酵素としては、ＨｉｎｄＩＩＩ，Ｐｓｔ Ｉ，Ａ
ｃｃ Ｉ，Ａｖａ ＩＩ，ＥｃｏＲ Ｉ，Ｈｐａ Ｉ，
Ｈｐａ ＩＩ，Ｈｉｎｄ ＩＩ，Ｓｓｔ Ｉ，Ｃｌａ
Ｉ，ＢｓｔＥ ＩＩ，Ｓｓｔ ＩＩ，Ｘｈｏ Ｉ，Ｂｃ
ｌ Ｉ，Ｂｇｌ ＩＩ，Ｐｖｕ ＩＩ，Ｘｏｒ ＩＩ，
Ｋｐｎ Ｉ，Ｓｍａ Ｉ，Ｘｂａ Ｉなどがある。

【００１８】次に、ファージＤＮＡを制限酵素で切断し
たＤＮＡ断片群の中からＳＡＫ産生情報を含むＤＮＡ断
片を各種の公知の方法（例えばアガロースゲル電気泳動
法など）により分離する。このためには、ファージＤＮ
Ａの断片群のうち、どの断片がＳＡＫ産生情報を有して
いるかを前もって判定しておかなければならない。この
判定方法については後述する。上記のＤＮＡ断片の分離
操作は場合により省略することもできる。

【００１９】一方、ベクターＤＮＡの開裂は、ベクター
ＤＮＡに適当な制限酵素を加え、適当な反応条件下で反
応を行うことによりベクターＤＮＡを開裂させることが
できる。

【００２０】ベクターＤＮＡとしては公知のものが使用
できる。それには例えばＣｏｌＥ１，ｐＭＢ９，ｐＳＣ
１０１，ｐ１５Ａおよびその誘導体（例えばｐＢＲ３２
２，ｐＡＣＹＣ１８４など）やスファージ由来のシャロ
ンベクターなどがある。

【００２１】次に、ベクターＤＮＡの開裂部位に上述の
ＤＮＡ断片を組み込ませるが、その手段自体は、常法に
よるものであり、使用したファージＤＮＡの種類、ベク
ターＤＮＡの種類および制限酵素の種類に応じて適当な
反応条件が選択される。なお、ベクターの複製能を損な
わない限り、上記のファージＤＮＡ断片を挿入する方向
及び部位は問わない。

【００２２】次いで組み換え体ＤＮＡを宿主大腸菌に導
入させるが、宿主大腸菌としては大腸菌に特異な制限・
修飾系のうち制限能を欠損した大腸菌株はすべて使用可
能である。また、いったん修飾をうけたＳＡＫ産生遺伝
情報を担うＤＮＡを組み込んだプラスミドは制限能を有
する大腸菌株に対しても使用することができる。宿主大
腸菌は、用いたベクターの種類によって限定される場合
がある。使用した大腸菌原株のうちのｒ（−）_Ｋとは制
限能を欠損した株を、またｍ（−）_Ｋとは修飾能をもた
ない株を示す。

【００２３】導入の手段、自体は公知の方法（例えばＣ
ａｍｅｒｏｎらの方法：文献 Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｊ．
Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７２，３４１６〜３４２
０）を用いることができる。

【００２４】前述のの工程を行った場合においても、
溶原ファージのＳＡＫ産生遺伝情報を担うＤＮＡ断片を
組み込まない場合があり、また、の工程を省略した場
合には、組み込まない場合の他にＳＡＫ産生能に関する
ものでないＤＮＡ断片を組み込む場合がある。そのため
にＳＡＫ産生能を有することとなった大腸菌を選択分離
することが必要である。この大腸菌の選択分離には、Ｓ
・アウレウスについて用いられている公知の方法（例え
ば文献：Ｋｏｎｄｏ，Ｉ ａｎｄ Ｆｕｊｉｓｅ，Ｋ．
（１９７７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１８，２６６
〜２７２）を使用することができる。すなわち、この方
法により、加熱血漿寒天培地を作成し、その上に試験菌
をスポットし、一定期間培養することによりフィブリン
分解能をみる。フィブリン分解能を有するものは集落の
周辺をとかして、透明なゾーンができるので、この菌だ
けをとり出すことができる。かくしてＳＡＫ産生能を有
する大腸菌が分離されるが、ＳＡＫ産生能を有する大腸
菌からのＳＡＫ産生遺伝情報を担うＤＮＡの解析は次の
如くして行う。すなわち、ＳＡＫ産生能を有する大腸菌
から組換え体プラスミドまたは組換え体ファージを取り
出し、ファージＤＮＡの切断およびベクターＤＮＡの開
裂に用いた制限酵素でこの組換え体プラスミドまたは組
換え体ファージを切断する。この切断されたＤＮＡ断片
の分子量（すなわちＤＮＡとしての長さ）を公知方法
（例えば、アガロースゲル電気泳動など）によって測定
することによってＳＡＫ産生遺伝情報を担うＤＮＡ断片
のファージＤＮＡ上での位置を知ることができる。

【００２５】本発明の方法において特徴的である培養培
地の組成成分は、糖由来の炭素源が０．２％量以上の割
合で含有せしめられていることが必要であるが、その基
本となる培地としては、通常、大腸菌の増殖に用いられ
るものは、いずれも使用可能であり、格別に特定されな
い。例としては、Ｌ−ブロス培地、肉エキスブイヨン培
地などの基本培地をあげることができる。

【００２６】糖由来炭素源としては、例えば、単糖類、
２糖類、糖アルコール類が利用可能なものとしてあげら
れ、とくに限定はされないが、グルコース、マルトー
ス、蔗糖、乳糖、グリセリン、ソルビトールなどはその
好適な例としてあげられる。

【００２７】その添加量は、０．２％未満の量では、本
発明の効果を達成することができずまた一方、余り多量
に使用すると、浸透圧が高くなりすぎ、かえって、増殖
を阻害するという問題が生じる可能性があるので、０．
２〜５％が好適な範囲であり、好ましくは、０．５〜２
％の範囲で含有せしめる。本発明の効果をさらに増大せ
しめるためには、培養の過程において、菌体による資化
により減少する糖由来炭素源を、培養基中に適宜、添加
することにより、その炭素源の濃度を維持する方法をと
ることができる。

【００２８】この培養にあたり、窒素源としては、一般
的に用いられるペプトン、硫酸アンモニウム、カザミノ
酸、硝酸アンモニウムなどが利用可能であり、さらに、
従来知られている大腸菌培養に好影響を与える各種添加
物としてのイーストエキス、肉エキス、ビタミン類、無
機塩等を本発明の効果に影響を及ぼさない限りの範囲で
使用することができる。

【００２９】ＳＡＫ産生大腸菌の培養は、好気的条件下
で行われる。菌の増殖状態を適時チェックし、十分な菌
数となった時点で、培養操作を停止する。

【００３０】ついで、この培養液から生成したＳＡＫを
抽出するがその方法としては、まず、遠心分離、濾過等
の手段により、培養液中の菌体を除去し、培養濾液を得
る。この培養濾液は、他の培地成分が低濃度でしかも低
分子であるため、限外濾過膜で濃縮することにより容易
に、ペプチド成分や糖成分を除去でき、濃縮されたＳＡ
Ｋ溶液を収得することができる。それをさらに慣用の方
法により、イオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過、
さらにエンドトキシン除去のためのアフィニティークロ
マトグラフィー処理等を行って精製する。かくして高純
度のＳＡＫを得ることができる。

【００３１】本発明の方法によれば、菌体の処理工程が
省略されるので、菌体由来の爽雑物質の混入の可能性も
少なく、高生産性で高純度のＳＡＫの生産が可能であ
る。

【００３２】以下に、実施例を掲げ、本発明を更に具体
的に説明する。

【００３３】

【実施例】本例においては、ＳＡＫ産生大腸菌株とし
て、エシュリヒア・コリＫ１２ Ｃ６００（ｐＳＡＫ−
ＨＰ２）（ＡＴＣＣ ３９１７９号）を使用した。

【００３４】この菌株は、特開昭５８−６７１８１号公
報の実施例２に準拠して製造されたものである。すなわ
ち、ＳＡＫ産生ＤＮＡとしてＳφＣを用い、制限酵素と
してＨｉｎｄ ＩＩＩを用いて４．９ｋｂのＤＮＡ断片
を分離し、更にＰｓｔＩで処理して得られるＤＮＡ断片
（約２．５ｋｂ）を、プラスミドｐＢＲ３２２に組み込
み、大腸菌Ｋ１２Ｃ６００株に形質転換することにより
ＳＡＫ産生用大腸菌；エシュリヒア・コリＫ１２Ｃ６０
０（ｐＳＡＫ−ＨＰ２）（ＡＴＣＣ ３９１７９号）か
ら得られる。

【００３５】培地は、各例ともにＬ−ブロス液体培地
（組成；ポリペプトン１％、イーストエキス１％、Ｎａ
Ｃｌ ０．５％、ｐＨ７．０） を基本組成とし、これ
に、糖由来炭素源としてグルコース、蔗糖、乳糖をそれ
ぞれ０．５％あるいは２％の量で添加した。また、糖由
来炭素源を添加しない基本組成のみの培地を対象群とし
て用い、本発明の比較対象とした。これらの培地に、Ｓ
ＡＫ産生大腸菌を接種し、３７℃で撹拌下通気培養を行
う。培養３時間後に、ＳＡＫ誘導のために、ＩＰＴＧ
０．５ｍＭを添加した。

【００３６】ＯＤ_６６０で菌数の増殖状態をチエック
し、菌数濃度が定常状態に達したら、培養を停止する。
遠心分離により、菌体を除去し、得られる培養上清につ
いて、フィブリンプレート法を用いてＳＡＫの産生量の
定量を行った。

【００３７】次表（表１）に記載されたとおりの各条件
による培養によるＳＡＫの定量結果を表１に示す。な
お、ＳＡＫ量は、培地１ｍｌ当たりの単位数で表されて
いる。

【００３８】

【表１】

【００３９】培地上清から得られたＳＡＫは、電気泳動
及び高速液体クロマトグラフィーで同定し、ＳＡＫの標
準品と同一であることを確認した。

【００４０】本発明の生産方法によれば、ＳＡＫ産生大
腸菌を使ってＳＡＫを生産する方法において、培地成分
に０．２％量以上の糖由来炭素源を含有せしめて、該Ｓ
ＡＫ産生大腸菌を培養することにより、従来法の数倍以
上のＳＡＫを培養液中に蓄積させることが可能となり、
該培養液中からＳＡＫを抽出するというだけの簡便な操
作でＳＡＫを製造することが可能となる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 スタフィロコッカス・アウレウスの溶原
   ファージＤＮＡを切断して得たスタフィロキナーゼ産生
   遺伝情報を担うＤＮＡを組み込んだベクターを導入して
   得られたスタフィロキナーゼ産生大腸菌の培養によりス
   タフィロキナーゼを生産する方法において、培地成分に
   ０．２％量以上の糖由来炭素源を含有せしめることによ
   りスタフィロキナーゼを培養液中に蓄積させ、該培養液
   中からスタフィロキナーゼを採取することを特徴とする
   スタフィロキナーゼの生産方法。
2. 【請求項２】 上記の糖由来炭素源がグルコースである
   請求項１に記載のスタフィロキナーゼの生産方法。