JPH05279376A - ＩＦＮ―γ誘導活性物質 - Google Patents
ＩＦＮ―γ誘導活性物質Info
- Publication number
- JPH05279376A JPH05279376A JP3222423A JP22242391A JPH05279376A JP H05279376 A JPH05279376 A JP H05279376A JP 3222423 A JP3222423 A JP 3222423A JP 22242391 A JP22242391 A JP 22242391A JP H05279376 A JPH05279376 A JP H05279376A
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- substance
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】（１）分子量が７０キロダルトンであり（２）
モノクロナール抗体ＴＳ―２との反応性及びＩＦＮ―γ
の誘起能が、 ５６℃、３０分間の熱処理、 Ｐｒｏｎａｓｅ ０．２ｍｇ／ｍｌ、３７℃、１時間
処理、 Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ０．５ ＩＵ／ｍｌ、
３７℃、２時間処理、及び ０．１５Ｍ ＮａＣｌ―アンモニア（ＰＨ１１）処理
では失活せず、且つ 過ヨウ素酸５０ｍＭ、４℃、２時間処理、及び ０．２Ｍグリシン―ＨＣｌ（ＰＨ２．５）処理で失活
するＩＦＮ―γ誘導活性物質。 【効果】 ＩＦＮ―γ誘導活性を有しin vivo において
抗腫瘍効果が認められる。
モノクロナール抗体ＴＳ―２との反応性及びＩＦＮ―γ
の誘起能が、 ５６℃、３０分間の熱処理、 Ｐｒｏｎａｓｅ ０．２ｍｇ／ｍｌ、３７℃、１時間
処理、 Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ０．５ ＩＵ／ｍｌ、
３７℃、２時間処理、及び ０．１５Ｍ ＮａＣｌ―アンモニア（ＰＨ１１）処理
では失活せず、且つ 過ヨウ素酸５０ｍＭ、４℃、２時間処理、及び ０．２Ｍグリシン―ＨＣｌ（ＰＨ２．５）処理で失活
するＩＦＮ―γ誘導活性物質。 【効果】 ＩＦＮ―γ誘導活性を有しin vivo において
抗腫瘍効果が認められる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、溶血連鎖状球菌製剤
（以下溶連菌製剤という）ＯＫ―４３２より得られるイ
ンターフェロン―γ誘導活性を有する新規な物質及びそ
の製法に関する。
（以下溶連菌製剤という）ＯＫ―４３２より得られるイ
ンターフェロン―γ誘導活性を有する新規な物質及びそ
の製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】溶連菌製剤であるＯＫ―４３２は、イン
ターフェロン（以下ＩＦＮと略記する）やインターロイ
キン２などのサイトカイン産生能を有し、且つ抗腫瘍効
果を有することが知られている。本発明者らは先にこの
ＯＫ―４３２に対するモノクロナール抗体であるＴＳ―
１抗体の取得に成功し、これを用いてＯＫ―４３２の組
織移行の解析研究を行い、ＩＦＮがＯＫ―４３２により
誘導、活性化されたマクロファージやＮＫ細胞に発現さ
れることを報告した（J.Biol.Response Mod., Vol.7,No
2.p212〜228.(1988)）。
ターフェロン（以下ＩＦＮと略記する）やインターロイ
キン２などのサイトカイン産生能を有し、且つ抗腫瘍効
果を有することが知られている。本発明者らは先にこの
ＯＫ―４３２に対するモノクロナール抗体であるＴＳ―
１抗体の取得に成功し、これを用いてＯＫ―４３２の組
織移行の解析研究を行い、ＩＦＮがＯＫ―４３２により
誘導、活性化されたマクロファージやＮＫ細胞に発現さ
れることを報告した（J.Biol.Response Mod., Vol.7,No
2.p212〜228.(1988)）。
【０００３】しかしながら、該ＴＳ―１抗体ではＩＦＮ
誘導性が菌体物であるＯＫ―４３２のどのような分画に
存在するかをつきとめることができなかった。そこで、
本発明者らはＯＫ―４３２に対するモノクロナール抗体
について研究をさらに行った結果、ＯＫ―４３２対する
新規なモノクロナール抗体であるＴＳ―２抗体の取得に
成功し、この抗体がＯＫ―４３２に対するモノクロナー
ル抗体であって、ＩｇＭのクラス、サブクラスを示し、
ＯＫ―４３２の菌体表面の糖鎖抗原を認識し、且つＯＫ
―４３２のＩＦＮ―γ誘導能を有する分画と反応する抗
体であることを確認し、先に特許出願した（特願平２―
３１１４４１号）。
誘導性が菌体物であるＯＫ―４３２のどのような分画に
存在するかをつきとめることができなかった。そこで、
本発明者らはＯＫ―４３２に対するモノクロナール抗体
について研究をさらに行った結果、ＯＫ―４３２対する
新規なモノクロナール抗体であるＴＳ―２抗体の取得に
成功し、この抗体がＯＫ―４３２に対するモノクロナー
ル抗体であって、ＩｇＭのクラス、サブクラスを示し、
ＯＫ―４３２の菌体表面の糖鎖抗原を認識し、且つＯＫ
―４３２のＩＦＮ―γ誘導能を有する分画と反応する抗
体であることを確認し、先に特許出願した（特願平２―
３１１４４１号）。
【０００４】
【発明が解決しょうとする課題】本発明は、上記のＴＳ
―２モノクロナール抗体を用いて、溶連菌製剤ＯＫ―４
３２よりＩＦＮ―γ誘導活性を有する新規な物質を取得
し、その諸特性を明らかにすることにより抗腫瘍剤とし
て期待しうる新規物質を提供することを課題とするもの
である。
―２モノクロナール抗体を用いて、溶連菌製剤ＯＫ―４
３２よりＩＦＮ―γ誘導活性を有する新規な物質を取得
し、その諸特性を明らかにすることにより抗腫瘍剤とし
て期待しうる新規物質を提供することを課題とするもの
である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、先の発明
で得たＴＳ―２モノクロナール抗体をリガンドとしたア
フイニティークロマトグラフィーを作製し、これを用い
てＯＫ―４３２よりMorrisonの方法でブタノール抽出し
た糖脂質標品から該ＴＳ―２が認識する抗原を精製し、
さらにSephacryl Ｓ―３００カラムで分画を行い、その
各画分の糖脂質濃度、ＩＦＮ力価、ＮＫ活性、ＬＡＫ活
性を調べることにより本発明に到達した。
で得たＴＳ―２モノクロナール抗体をリガンドとしたア
フイニティークロマトグラフィーを作製し、これを用い
てＯＫ―４３２よりMorrisonの方法でブタノール抽出し
た糖脂質標品から該ＴＳ―２が認識する抗原を精製し、
さらにSephacryl Ｓ―３００カラムで分画を行い、その
各画分の糖脂質濃度、ＩＦＮ力価、ＮＫ活性、ＬＡＫ活
性を調べることにより本発明に到達した。
【０００６】すなわち、本発明は （１）分子量が７０キロダルトンであり （２）モノクロナール抗体ＴＳ―２との反応性及びＩＦ
Ｎ―γの誘起能が ５６℃、３０分間の熱処理、 Ｐｒｏｎａｓｅ ０．２ｍｇ／ｍｌ、３７℃、１時間
処理、 Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ０．５ ＩＵ／ｍｌ、
３７℃、２時間処理、及び ０．１５Ｍ ＮａＣｌ―アンモニア（ＰＨ１１）処理
では失活せず、且つ 過ヨウ素酸５０ｍＭ、４℃、２時間処理、及び ０．２Ｍグリシン―ＨＣｌ（ＰＨ２．５）処理で失活
するＩＦＮ―γ誘導活性物質、及びこれを得るための溶
連菌製剤ＯＫ―４３２よりモリソンの方法でブタノール
抽出した糖脂質標品から、該ＯＫ―４３２に対するモノ
クロナール抗体であるＴＳ―２をリガンドとするアフイ
ニテイクロマトグラフィーを用いて、該ＴＳ―２が認識
する抗原物質を分離・精製し、次いで得られたその精製
標品をSephacryl Ｓ―３００カラムにより２５画分に分
画し、その画分８に相当する物質を取得することを特徴
とする請求項１記載のＩＦＮ―γ誘導活性物質の製造方
法を提供するものである。
Ｎ―γの誘起能が ５６℃、３０分間の熱処理、 Ｐｒｏｎａｓｅ ０．２ｍｇ／ｍｌ、３７℃、１時間
処理、 Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ０．５ ＩＵ／ｍｌ、
３７℃、２時間処理、及び ０．１５Ｍ ＮａＣｌ―アンモニア（ＰＨ１１）処理
では失活せず、且つ 過ヨウ素酸５０ｍＭ、４℃、２時間処理、及び ０．２Ｍグリシン―ＨＣｌ（ＰＨ２．５）処理で失活
するＩＦＮ―γ誘導活性物質、及びこれを得るための溶
連菌製剤ＯＫ―４３２よりモリソンの方法でブタノール
抽出した糖脂質標品から、該ＯＫ―４３２に対するモノ
クロナール抗体であるＴＳ―２をリガンドとするアフイ
ニテイクロマトグラフィーを用いて、該ＴＳ―２が認識
する抗原物質を分離・精製し、次いで得られたその精製
標品をSephacryl Ｓ―３００カラムにより２５画分に分
画し、その画分８に相当する物質を取得することを特徴
とする請求項１記載のＩＦＮ―γ誘導活性物質の製造方
法を提供するものである。
【０００７】以下本発明を詳細に説明する。本発明のＩ
ＦＮ―γ誘導活性物質を得るには、まず、ＯＫ―４３２
より先の出願（特願平２―３１１４４１号）で確認され
ているＩＦＮ産生、ＮＫ及びＬＡＫ活性誘導能を有する
糖脂質標品（以下これをＯＫ―ＰＳという）を抽出して
くる必要がある。この抽出は実施例で詳述するようにMo
rrisonの方法〔THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY.
VOL.250.No8.P2911-2919(1975)〕に準じてブタノール抽
出により行われる。
ＦＮ―γ誘導活性物質を得るには、まず、ＯＫ―４３２
より先の出願（特願平２―３１１４４１号）で確認され
ているＩＦＮ産生、ＮＫ及びＬＡＫ活性誘導能を有する
糖脂質標品（以下これをＯＫ―ＰＳという）を抽出して
くる必要がある。この抽出は実施例で詳述するようにMo
rrisonの方法〔THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY.
VOL.250.No8.P2911-2919(1975)〕に準じてブタノール抽
出により行われる。
【０００８】次に、ＯＫ―ＰＳをさらに精製して本発明
の目的物質に近づけるためには、ＴＳ―２モノクロナー
ル抗体をリガンドとしたアフイニティクロマトグラフィ
ーが用いられる。このアフイニティクロマトグラフィー
を作製するためのＴＳ―２モノクロナール抗体は、本発
明者が先に発明し、特願平２―３１１４４１号として特
許出願されているものが用いられる。即ち、モノクロナ
ール抗体ＴＳ―２は溶連菌製剤ＯＫ―４３２に対するモ
ノクロナール抗体であって、ＩｇＭのクラス、サブクラ
スを示し、ＯＫ―４３２の菌体表面の糖鎖抗原を認識
し、且つＯＫ―４３２のγ―インターフェロン誘導能を
有する分画と反応することを特徴とする。
の目的物質に近づけるためには、ＴＳ―２モノクロナー
ル抗体をリガンドとしたアフイニティクロマトグラフィ
ーが用いられる。このアフイニティクロマトグラフィー
を作製するためのＴＳ―２モノクロナール抗体は、本発
明者が先に発明し、特願平２―３１１４４１号として特
許出願されているものが用いられる。即ち、モノクロナ
ール抗体ＴＳ―２は溶連菌製剤ＯＫ―４３２に対するモ
ノクロナール抗体であって、ＩｇＭのクラス、サブクラ
スを示し、ＯＫ―４３２の菌体表面の糖鎖抗原を認識
し、且つＯＫ―４３２のγ―インターフェロン誘導能を
有する分画と反応することを特徴とする。
【０００９】その取得方法は上記出願の明細書に詳述さ
れているのでそれを用いればよいが、一応その概要を説
明しておくと、腹腔内にＯＫ―４３２を投与免疫したマ
ウスより摘出した脾細胞とマウス由来ミエローマ細胞を
細胞融合し、形成したハイブリドーマからＯＫ―４３２
に対する抗体産生能を有するハイブリドーマをスクリー
ニングした後、クローニングを行って得たハイブリドー
マクローンを培養し、培養液上清から目的抗体を精製す
るか又は該ハイブリドーマクローンをマウス腹腔内に投
与し、その腹水より、目的抗体を精製する方法である。
なお、上記のハイブリドーマクローンは微工研に微工研
菌寄第１１８４６号（ＦＥＲＭ Ｐ―１１８４６）とし
て寄託されている。
れているのでそれを用いればよいが、一応その概要を説
明しておくと、腹腔内にＯＫ―４３２を投与免疫したマ
ウスより摘出した脾細胞とマウス由来ミエローマ細胞を
細胞融合し、形成したハイブリドーマからＯＫ―４３２
に対する抗体産生能を有するハイブリドーマをスクリー
ニングした後、クローニングを行って得たハイブリドー
マクローンを培養し、培養液上清から目的抗体を精製す
るか又は該ハイブリドーマクローンをマウス腹腔内に投
与し、その腹水より、目的抗体を精製する方法である。
なお、上記のハイブリドーマクローンは微工研に微工研
菌寄第１１８４６号（ＦＥＲＭ Ｐ―１１８４６）とし
て寄託されている。
【００１０】このようにして得られたＴＳ―２をリガン
ドとするアフイニティクロマトグラフィーを用いて、Ｏ
Ｋ―ＰＳからＴＳ―２が認識する抗原物質を分離・精製
すると、精製標品（以下これをＯＫ―ＰＡＳという）が
得られる。
ドとするアフイニティクロマトグラフィーを用いて、Ｏ
Ｋ―ＰＳからＴＳ―２が認識する抗原物質を分離・精製
すると、精製標品（以下これをＯＫ―ＰＡＳという）が
得られる。
【００１１】次いでそのＯＫ―ＰＡＳをSephacryl Ｓ―
３００カラムを用いて分画し、各画分について糖脂質濃
度、ＩＦＮ力価、ＮＫ及びＬＡＫ活性の測定を行う。そ
の結果、図１に示すように目的とするＩＦＮ―γ誘導活
性物質が存在する画分は８画分であることが確認され
た。よって該８画分から本発明の目的物質を取得するこ
とができる。
３００カラムを用いて分画し、各画分について糖脂質濃
度、ＩＦＮ力価、ＮＫ及びＬＡＫ活性の測定を行う。そ
の結果、図１に示すように目的とするＩＦＮ―γ誘導活
性物質が存在する画分は８画分であることが確認され
た。よって該８画分から本発明の目的物質を取得するこ
とができる。
【００１２】この画分８にある本発明のＩＦＮ―γ誘導
活性物質は、図１に示すようにＩＦＮ―γ誘導活性を有
し、図２で明らかなように in vivoで抗腫瘍効果が認め
られる物質である。又、本発明物質の分子量はゲルろ過
法〔免疫実験操作法１０（日本免疫学会編）3119〜3142
頁1981年〕により測定したところ、７０キロダルトン
（ｋｄ）であることが判明した。さらに、本発明の物理
化学的性質を調べたところ表１の結果が得られた。
活性物質は、図１に示すようにＩＦＮ―γ誘導活性を有
し、図２で明らかなように in vivoで抗腫瘍効果が認め
られる物質である。又、本発明物質の分子量はゲルろ過
法〔免疫実験操作法１０（日本免疫学会編）3119〜3142
頁1981年〕により測定したところ、７０キロダルトン
（ｋｄ）であることが判明した。さらに、本発明の物理
化学的性質を調べたところ表１の結果が得られた。
【００１３】
【表１】
【００１４】
【実施例】以下実施例で本発明を説明する。なお、実施
例で用いた測定法は次に示す通りの方法で行なった。
例で用いた測定法は次に示す通りの方法で行なった。
【００１５】（１）糖脂質定量 Bitter等の方法［Anal.Biochem. ４.P330(1962) ］に準
じた硫酸カルバゾール反応によるウロン酸定量法により
行った。
じた硫酸カルバゾール反応によるウロン酸定量法により
行った。
【００１６】（２）ＩＦＮ力価 ＩＦＮ活性の測定はヒト羊膜由来細胞〔Fogh, Lund, Pr
oc. Soc.Exp.Biol. Med., 94. p532〜537 (1957)；ＦＬ
細胞〕と水庖性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を用いたプラ
ーク減少法で行った。ＩＦＮの型分類は、抗ヒトＩＦＮ
―α抗体（LeeBiomolecular Research Inc.）、抗ヒト
ＩＦＮ―β抗体（Lce Biomolecular Research Inc.）、
抗ヒトＩＦＮ―γ抗体（ENDOGEN ）を用いた中和試験に
より行った。すなわち、中和活性で５００Ｕ／ｍｌに調
整した抗ヒトＩＦＮ―α抗体と抗ヒトＩＦＮ―β抗体の
混合抗体或いは抗ヒトＩＦＮ―γ抗体２００μｌを段階
希釈したＩＦＮ標品である培養上清８００μｌに加え、
４℃、２４時間反応させた。この後、残存するＩＦＮ力
価を測定した。
oc. Soc.Exp.Biol. Med., 94. p532〜537 (1957)；ＦＬ
細胞〕と水庖性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を用いたプラ
ーク減少法で行った。ＩＦＮの型分類は、抗ヒトＩＦＮ
―α抗体（LeeBiomolecular Research Inc.）、抗ヒト
ＩＦＮ―β抗体（Lce Biomolecular Research Inc.）、
抗ヒトＩＦＮ―γ抗体（ENDOGEN ）を用いた中和試験に
より行った。すなわち、中和活性で５００Ｕ／ｍｌに調
整した抗ヒトＩＦＮ―α抗体と抗ヒトＩＦＮ―β抗体の
混合抗体或いは抗ヒトＩＦＮ―γ抗体２００μｌを段階
希釈したＩＦＮ標品である培養上清８００μｌに加え、
４℃、２４時間反応させた。この後、残存するＩＦＮ力
価を測定した。
【００１７】（３）ＮＫ、ＬＡＫ活性 ＮＫ、ＬＡＫ活性の測定は、標的細胞としてＮＫ活性測
定にはヒト赤芽球性白血病細胞［Blood,45,p32(1975) ;
Ｋ―５６２細胞］を、ＬＡＫ活性測定にはヒトバーキッ
トリンパ腫由来細胞〔Cancer Res. 28. p1300 〜1310(1
968);Daudi細胞〕を用いた51Ｃｒ遊出法で行った。すな
わち、標的細胞１０6 個を１００μＣｉＮａ2 Ｃｒ51Ｏ
4 で３７℃、90分間反応させて放射線標識をした後、９
６穴マイクロタイタープレート中に１穴当り１０4 個／
１００μｌの割合で植込んだ。ＲＰＭＩ １６４０培養
液で調製したヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をエフェク
ター細胞として、２×１０5 個／１００μｌの割合で加
え、３７℃で４時間培養した。
定にはヒト赤芽球性白血病細胞［Blood,45,p32(1975) ;
Ｋ―５６２細胞］を、ＬＡＫ活性測定にはヒトバーキッ
トリンパ腫由来細胞〔Cancer Res. 28. p1300 〜1310(1
968);Daudi細胞〕を用いた51Ｃｒ遊出法で行った。すな
わち、標的細胞１０6 個を１００μＣｉＮａ2 Ｃｒ51Ｏ
4 で３７℃、90分間反応させて放射線標識をした後、９
６穴マイクロタイタープレート中に１穴当り１０4 個／
１００μｌの割合で植込んだ。ＲＰＭＩ １６４０培養
液で調製したヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をエフェク
ター細胞として、２×１０5 個／１００μｌの割合で加
え、３７℃で４時間培養した。
【００１８】ＮＫ、ＬＡＫ活性は％障害能で表わし、下
記の公式より算出した。 ％障害能＝（各標品のカウント−バックグランドのカウ
ント／全体のカウント−バックグランドのカウント）×
１００
記の公式より算出した。 ％障害能＝（各標品のカウント−バックグランドのカウ
ント／全体のカウント−バックグランドのカウント）×
１００
【００１９】実施例１ （ＯＫ―４３２の糖脂質分画
（ＯＫ―ＰＳ）の抽出） ＯＫ―４３２の糖脂質分画の抽出法はMorrisonの方法
〔 THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 250,No
8, P2911〜2919(1975)〕に準じて行った。すなわち、生
理食塩水５ｍｌに溶解したＯＫ―４３２ ５０ＫＥに１
―ブタノール５ｍｌを加え混和した。この後３５，００
０×ｇで２０分間遠心し、水溶液層を採取した。この抽
出溶液にプロナーゼ２０μｇ／ｍｌで加え、３７℃で２
４時間反応した。３５，０００×ｇで２０分間遠心した
後上清を採取した。この抽出標品をリン酸緩衝溶液〔Ｐ
ＢＳ（−）〕にて透析し、糖脂質標品（ＯＫ―ＰＳ）と
した。
（ＯＫ―ＰＳ）の抽出） ＯＫ―４３２の糖脂質分画の抽出法はMorrisonの方法
〔 THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 250,No
8, P2911〜2919(1975)〕に準じて行った。すなわち、生
理食塩水５ｍｌに溶解したＯＫ―４３２ ５０ＫＥに１
―ブタノール５ｍｌを加え混和した。この後３５，００
０×ｇで２０分間遠心し、水溶液層を採取した。この抽
出溶液にプロナーゼ２０μｇ／ｍｌで加え、３７℃で２
４時間反応した。３５，０００×ｇで２０分間遠心した
後上清を採取した。この抽出標品をリン酸緩衝溶液〔Ｐ
ＢＳ（−）〕にて透析し、糖脂質標品（ＯＫ―ＰＳ）と
した。
【００２０】実施例２ （モノクロナール抗体ＴＳ―２
の調製） 雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（６週齢）の腹腔内にＯＫ―４３
２（中外製薬製）の５クリニカルユニット（ＫＥ）を投
与し免疫した。１週間後に、さらに腹腔内にＯＫ―４３
２の５ＫＥを追加免疫し、この最終免疫３日後に該マウ
スより無菌的に脾蔵を摘出し、脾細胞を調製した。この
脾細胞とＢａｌｂ／ｃ由来ミエローマ細胞であるＮＳ-
１細胞をKohlerとMilsteinの方法〔Eur.J.Immunol ６.
P511-519(1976)〕に従い、ポリエチレングリコール４，
０００（和光純薬製）を用い、無血清ＲＰＭ１ 1640 培
地中で細胞融合を行った。その結果２８８個のハイブリ
ドーマ上清が得られた。このハイブリドーマ培養上清を
用いてＥＬＩＳＡの検索を行った結果、ＯＫ―４３２に
対する抗体を産生する４個のハイブリドーマが得られ
た。
の調製） 雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（６週齢）の腹腔内にＯＫ―４３
２（中外製薬製）の５クリニカルユニット（ＫＥ）を投
与し免疫した。１週間後に、さらに腹腔内にＯＫ―４３
２の５ＫＥを追加免疫し、この最終免疫３日後に該マウ
スより無菌的に脾蔵を摘出し、脾細胞を調製した。この
脾細胞とＢａｌｂ／ｃ由来ミエローマ細胞であるＮＳ-
１細胞をKohlerとMilsteinの方法〔Eur.J.Immunol ６.
P511-519(1976)〕に従い、ポリエチレングリコール４，
０００（和光純薬製）を用い、無血清ＲＰＭ１ 1640 培
地中で細胞融合を行った。その結果２８８個のハイブリ
ドーマ上清が得られた。このハイブリドーマ培養上清を
用いてＥＬＩＳＡの検索を行った結果、ＯＫ―４３２に
対する抗体を産生する４個のハイブリドーマが得られ
た。
【００２１】このスクリーニングされた４個のハイブリ
ドーマに対し、限界希釈法によるクローニングを２〜３
回行い、ＯＫ―４３２に対する抗体を産生し、且つ安定
な増殖を示すハイブリドーマクローンを得た。該ハイブ
リドーマはＴＳ―２と命名され、工業技術院微生物工業
技術研究所に受託番号、微工研菌寄第１１８４６号（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ―１１８４６）として寄託されている。この
ＴＳ―２ハイブリドーマを培養し、モノクロナール抗体
ＴＳ―２産生せしめた。産生したＴＳ―２抗体の精製は
ハイブリドーマ培養上清或いはハイブリドーマをＢａｌ
ｂ／ｃマウス腹腔内に投与した腹水より、２０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ―ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いたSephacry
l Ｓ―３００（Pharmacia)カラムクロマトグラフィーで
行った。
ドーマに対し、限界希釈法によるクローニングを２〜３
回行い、ＯＫ―４３２に対する抗体を産生し、且つ安定
な増殖を示すハイブリドーマクローンを得た。該ハイブ
リドーマはＴＳ―２と命名され、工業技術院微生物工業
技術研究所に受託番号、微工研菌寄第１１８４６号（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ―１１８４６）として寄託されている。この
ＴＳ―２ハイブリドーマを培養し、モノクロナール抗体
ＴＳ―２産生せしめた。産生したＴＳ―２抗体の精製は
ハイブリドーマ培養上清或いはハイブリドーマをＢａｌ
ｂ／ｃマウス腹腔内に投与した腹水より、２０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ―ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いたSephacry
l Ｓ―３００（Pharmacia)カラムクロマトグラフィーで
行った。
【００２２】実施例３ （ＴＳ―２が認識する抗原物質
の分離・精製） 実施例２で調製したＴＳ―２モノクロナール抗体を０．
１Ｍ ＮＡＨＣＯ3 緩衝液で希釈する。そのＴＳ―２溶
液とＣＮＢｒ―activated Sepharose ４Ｂ（Pharmacia
）をＴＳ―２ １ｍｇ／ｍｌ・ゲルに調整されるよう
に室温で２時間撹拌しながら反応させたものをカラムに
充填しＴＳ―２モノクロナール抗体をリガンドとするア
フィニティカラムを調製した。
の分離・精製） 実施例２で調製したＴＳ―２モノクロナール抗体を０．
１Ｍ ＮＡＨＣＯ3 緩衝液で希釈する。そのＴＳ―２溶
液とＣＮＢｒ―activated Sepharose ４Ｂ（Pharmacia
）をＴＳ―２ １ｍｇ／ｍｌ・ゲルに調整されるよう
に室温で２時間撹拌しながら反応させたものをカラムに
充填しＴＳ―２モノクロナール抗体をリガンドとするア
フィニティカラムを調製した。
【００２３】このアフィニティカラムに実施例１で得た
ＯＫ―ＰＳ溶液（５００Ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌを添加し、
室温で２時間反応させた後、溶出液（０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ―アンモニア ＰＨ１１）を加えて、ＴＳ―２抗体
と結合していた抗原を溶出し、抗原物質の分離・精製標
品（以下ＯＫ―ＰＳＡという）を得た。なお抽出したＯ
Ｋ―ＰＳＡは直ちにＰＢＳ（−）で透析し、安定な条件
に戻した。
ＯＫ―ＰＳ溶液（５００Ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌを添加し、
室温で２時間反応させた後、溶出液（０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ―アンモニア ＰＨ１１）を加えて、ＴＳ―２抗体
と結合していた抗原を溶出し、抗原物質の分離・精製標
品（以下ＯＫ―ＰＳＡという）を得た。なお抽出したＯ
Ｋ―ＰＳＡは直ちにＰＢＳ（−）で透析し、安定な条件
に戻した。
【００２４】実施例４ （ＯＫ―ＰＳＡ分画にする目的
物質取得） 実施例３で得たＯＫ―ＰＳＡをSephacryl Ｓ―３００カ
ラムクロストグラフィー（Pharmacia ）により２５画分
（１画分当り３ｍｌ）に分画した。即ち、この精製標品
をＰＢＳ（ｐＨ７．２）中でSephacryl Ｓ―３００カラ
ム（１６ｍｍ×３６０ｍｍ／Pharmacia 社製）にかけ、
溶出を行い、３ｍｌ／画分ずつ分画し２５画分とした。
これらの画分について夫々の糖脂質定量、ＩＦＮ力価、
ＮＫ活性、ＬＡＫ活性の測定を行った。結果を図１に示
す。図１から明らかになるように画分８において糖脂質
のピークとＩＦＮ力価及びＮＫ，ＬＡＫ活性のピークと
が一致しており、この画分８にＩＦＮ―γ誘導活性物質
が存在することが確認された。
物質取得） 実施例３で得たＯＫ―ＰＳＡをSephacryl Ｓ―３００カ
ラムクロストグラフィー（Pharmacia ）により２５画分
（１画分当り３ｍｌ）に分画した。即ち、この精製標品
をＰＢＳ（ｐＨ７．２）中でSephacryl Ｓ―３００カラ
ム（１６ｍｍ×３６０ｍｍ／Pharmacia 社製）にかけ、
溶出を行い、３ｍｌ／画分ずつ分画し２５画分とした。
これらの画分について夫々の糖脂質定量、ＩＦＮ力価、
ＮＫ活性、ＬＡＫ活性の測定を行った。結果を図１に示
す。図１から明らかになるように画分８において糖脂質
のピークとＩＦＮ力価及びＮＫ，ＬＡＫ活性のピークと
が一致しており、この画分８にＩＦＮ―γ誘導活性物質
が存在することが確認された。
【００２５】そこで、この画分８を常法に従い目的とす
るＩＦＮ―γ誘導活性物質を分取した。この物質の分子
量をゲル口過法（文献前出）に準じ、且つ、分子量マー
カーとしてレンチナン（ Lentinan,味の素製）１００キ
ロダルトン及びシゾフィラン（ＳＰＧ、科研製薬製）４
５キロダルトンを用いて測定したところ、７０キロダル
トンという特果が得られた。さらにその物理化学的性質
を調べたところ前記の表１に示す結果が得られた。
るＩＦＮ―γ誘導活性物質を分取した。この物質の分子
量をゲル口過法（文献前出）に準じ、且つ、分子量マー
カーとしてレンチナン（ Lentinan,味の素製）１００キ
ロダルトン及びシゾフィラン（ＳＰＧ、科研製薬製）４
５キロダルトンを用いて測定したところ、７０キロダル
トンという特果が得られた。さらにその物理化学的性質
を調べたところ前記の表１に示す結果が得られた。
【００２６】実施例５ （抗腫瘍効果） ６週令、雌のＢａｌｂ／ｃヌードマウス腹腔内に２×１
０7 個のヒト唾液腺癌細胞（ＨＳＧ細胞）を移植後、該
マウスを５匹づつ次の２群に分けた。 （１）本発明物質投与群：本発明のＩＦＮ―γ誘導活性
物質１００μｇを移植翌日より隔日で５日間腹腔内投与
した。 （２）対照群：生理食塩水０．２ｍｌを移植翌日より隔
日で５日間腹腔内投与した。
０7 個のヒト唾液腺癌細胞（ＨＳＧ細胞）を移植後、該
マウスを５匹づつ次の２群に分けた。 （１）本発明物質投与群：本発明のＩＦＮ―γ誘導活性
物質１００μｇを移植翌日より隔日で５日間腹腔内投与
した。 （２）対照群：生理食塩水０．２ｍｌを移植翌日より隔
日で５日間腹腔内投与した。
【００２７】上記（１）及び（２）群の各マウスの生存
日数を調べた結果を生存率とＨＳＧ細胞移植日よりの経
過日数の関係にして図２に示す。図２より本発明物質投
与群には生存日数の延長が認められ、本発明物質に抗腫
瘍効果があることがわかる。
日数を調べた結果を生存率とＨＳＧ細胞移植日よりの経
過日数の関係にして図２に示す。図２より本発明物質投
与群には生存日数の延長が認められ、本発明物質に抗腫
瘍効果があることがわかる。
【００２８】
【発明の効果】本発明のＩＦＮ―γ誘導活性物質は、溶
連菌製剤ＯＫ―４３２よりモノクロナール抗体ＴＳ―２
を用いて分離・精製された新規な物質であって、ＩＦＮ
―γ誘導活性を有し、in vivo において抗腫瘍効果が認
められるという効果を有する。
連菌製剤ＯＫ―４３２よりモノクロナール抗体ＴＳ―２
を用いて分離・精製された新規な物質であって、ＩＦＮ
―γ誘導活性を有し、in vivo において抗腫瘍効果が認
められるという効果を有する。
【図１】ＯＫ―ＰＳＡをSephacryl Ｓ―３００カラムで
分画した各画分の糖脂質濃度、ＩＦＮ力価、ＮＫ活性及
びＬＡＫ活性を示す図である。
分画した各画分の糖脂質濃度、ＩＦＮ力価、ＮＫ活性及
びＬＡＫ活性を示す図である。
【図２】本発明物質と対照例の各群の生存率と経過日数
の関係を示す図である。
の関係を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 8931−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 8413−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ
Claims (4)
- 【請求項１】（１）分子量が７０キロダルトンであり、 （２）モノクロナール抗体ＴＳ‐２との反応性及びＩＦ
Ｎ―γの誘起能が ５６℃、３０分間の熱処理、 Ｐｒｏｎａｓｅ ０．２ｍｇ／ｍｌ、３７℃、１時間
処理、 Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ０．５ ＩＵ／ｍｌ、
３７℃、２時間処理、及び ０．１５Ｍ ＮａＣｌ―アンモニア（ＰＨ１１）処理
では失活せず、且つ 過ヨウ素酸５０ｍＭ、４℃、２時間処理、及び ０．２Ｍグリシン―ＨＣｌ（ＰＨ２．５）処理で失活
するＩＦＮ―γ誘導活性物質。 - 【請求項２】 溶連菌製剤ＯＫ―４３２よりモリソンの
方法でブタノール抽出した糖脂質標品から、該ＯＫ―４
３２に対するモノクロナール抗体であるＴＳ―２をリガ
ンドとするアフイニテイクロマトグラフィーを用いて、
該ＴＳ―２が認識する抗原物質を分離・精製し、次いで
得られたその精製標品をSephacryl Ｓ―３００カラムに
より２５画分に分画し、その画分８に相当する物質を取
得することを特徴とする請求項１記載のＩＦＮ―γ誘導
活性物質の製造方法。 - 【請求項３】 モノクロナール抗体ＴＳ―２が溶連菌製
剤ＯＫ―４３２に対するモノクロナール抗体であって、
ＩｇＭのクラス、サブクラスを示し、ＯＫ―４３２の菌
体表面の糖鎖抗原を認識し、且つＯＫ―４３２のγ―イ
ンターフェロン誘導能を有する分画と反応することを特
徴とするＴＳ―２モノクロナール抗体である請求項２記
載のＩＦＮ―γ誘導活性物質の製造方法。 - 【請求項４】 ＴＳ―２モノクロナール抗体をＴＳ―２
微工研菌寄第１１８４６号のハイブリドーマクローンを
用いて得ることを特徴とする請求項３記載のＩＦＮ―γ
誘導活性物質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22242391A JP3230531B2 (ja) | 1991-08-08 | 1991-08-08 | ＩＦＮ―γ誘導活性物質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22242391A JP3230531B2 (ja) | 1991-08-08 | 1991-08-08 | ＩＦＮ―γ誘導活性物質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05279376A true JPH05279376A (ja) | 1993-10-26 |
| JP3230531B2 JP3230531B2 (ja) | 2001-11-19 |
Family
ID=16782164
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22242391A Expired - Lifetime JP3230531B2 (ja) | 1991-08-08 | 1991-08-08 | ＩＦＮ―γ誘導活性物質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3230531B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0692536A3 (en) * | 1994-07-14 | 1997-03-26 | Hayashibara Biochem Lab | Protein that induces interferon gamma production and monoclonal antibodies against it |
| EP0712931A3 (en) * | 1994-11-15 | 1997-03-26 | Hayashibara Biochem Lab | Interferon-gamma inducing polypeptide monoclonal antibody, and composition for interferon-gamma linked diseases |
-
1991
- 1991-08-08 JP JP22242391A patent/JP3230531B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0692536A3 (en) * | 1994-07-14 | 1997-03-26 | Hayashibara Biochem Lab | Protein that induces interferon gamma production and monoclonal antibodies against it |
| US5914253A (en) * | 1994-07-14 | 1999-06-22 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Recombinant production of murine interferon--γ (IFN-γ) inducing factor (IGIF, IL-18) |
| US6274709B1 (en) | 1994-07-14 | 2001-08-14 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Interferon-gamma (IFN-γ) inducing factor (IGIF, IL-18) and peptide fragment thereof |
| US6277598B1 (en) | 1994-07-14 | 2001-08-21 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | DNA molecule encoding interferon-gamma (IFN-λ) inducing factor (IGIF, IL-18) and DNA fragment thereof |
| EP0712931A3 (en) * | 1994-11-15 | 1997-03-26 | Hayashibara Biochem Lab | Interferon-gamma inducing polypeptide monoclonal antibody, and composition for interferon-gamma linked diseases |
| EP0962531A3 (en) * | 1994-11-15 | 1999-12-15 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Interferon-gamma production inducing isolated polypeptide fragment and an isolated DNA fragment encoding said polypeptide |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3230531B2 (ja) | 2001-11-19 |
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