JPH05268960A

JPH05268960A - 動物細胞固定化用担体及びそれを用いる細胞培養方法

Info

Publication number: JPH05268960A
Application number: JP4148507A
Authority: JP
Inventors: Noritoshi Kimura; 文紀木村; Shinjiro Mitsuda; 伸二郎満田; Yoshiaki Matsuda; 義章松田
Original assignee: Japan Vilene Co Ltd; Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Japan Vilene Co Ltd; Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1991-05-17
Filing date: 1992-05-15
Publication date: 1993-10-19
Anticipated expiration: 2016-10-15
Also published as: JP3219305B2

Abstract

(57)【要約】【目的】ＰＢＳや生理食塩水の存在下で実施するオー
トクレーブ滅菌処理によって劣化しない動物細胞固定化
用担体及びその担体を用いる細胞培養方法を提供する。【構成】動物細胞接着材料（例えば、絹フィブロイ
ン、骨粉、ゼラチン、コラーゲンおよび／または２価陽
イオン）をキトサンとの混合物の形で、多孔質基材の全
表面上に担持させた。【効果】３次元的な多孔質体内に動物細胞接着材料が
分散して付着しているので、動物細胞の付着効率が良
く、付着容量も大きい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、動物細胞固定化用担体
及びそれを用いる細胞培養方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】動物細胞等を培養して、医薬上有用な生
理活性物質を大量に生産することが行われている。培養
に用いる動物細胞には、血球系細胞やガン化細胞のよう
に浮遊して存在する浮遊細胞（付着非依存性細胞：ａｎ
ｃｈｏｒａｇｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌ）
と、適当な担体に接着して存在する付着依存性細胞（ａ
ｎｃｈｏｒａｇｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌ）と
がある。生理活性物質の効率的な生産には浮遊細胞を使
用する方が有利なので、付着依存性細胞を用いる場合に
も、その中から浮遊状態で増殖することのできる変異株
を選択する技術がある。しかしながら、この技術を全て
の付着依存性細胞に利用することはできないので、付着
依存性細胞を接着させることのできる適当な担体が必要
となる。

【０００３】一方、遺伝子組換え技術によって細胞や微
生物を改良し、生理活性物質を大量生産する技術が実用
化されている。これらの生理活性物質においては、例え
ば、ワクチンや抗生物質などの糖側鎖をもつタンパク質
が、微生物産生物質からは得られないのに対し、動物細
胞産生物質からは得られるように、微生物産生物質より
も動物細胞産生物質の方が有用な生理活性物質を得やす
いと考えられるので、動物細胞を用いる場合が多くなる
ものと予想されている。ところが、遺伝子組換えを行っ
た動物細胞は接着能力が低下する傾向があるので、この
点からも細胞接着性に優れた材料の開発が望まれてい
る。

【０００４】付着依存性細胞の固定化用担体としては、
セルロース、キトサン又はシラン等の多孔質ビーズを基
材として用いるマイクロキャリアが従来から知られてお
り、体積当たりの比表面積が大きいので、特に工業的規
模の培養に適しているものとされてきた。しかしなが
ら、この担体は製法が複雑で高価であるだけでなく、個
々のビーズに細胞を接着させることが必ずしも容易では
ない。更に、培養槽内での攪拌によって生じる剪断力に
より、細胞が損傷を受けるので、取扱に注意が必要であ
った。

【０００５】また、各種の基材にコラーゲンをコーティ
ングして調製した固定化用担体も公知であるが、動物細
胞を固定化する前に行うオートクレーブ滅菌処理の際
に、コラーゲン層が流れ落ちたり、コラーゲン自体が変
性してしまうため、接着性が低下するという欠点があっ
た。オートクレーブ滅菌処理以外の滅菌処理も知られて
いるが、それらは特殊な装置を必要としたり、危険を伴
うものであるので、一般的に利用できるものではなかっ
た。

【０００６】本発明者等は、前記の従来技術の欠点を解
消する１手段として、親水性繊維を主体とする構成繊維
が親水性樹脂によって結合されている不織布であって、
動物細胞接着材料が前記親水性樹脂との混合物の形で含
まれていることを特徴とする、動物細胞固定化用不織布
を提供し、付着依存性細胞を容易に接着させることがで
き、安価で、取扱が容易で、更に簡易なオートクレーブ
滅菌処理が可能な動物細胞固定化用担体を開示した（特
願平３−２０４７０号明細書）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、前記
の手段とは別の観点から従来技術の欠点を解消する手段
を提供するものである。即ち、不織布だけでなく、広く
一般に多孔質基材に応用することができ、しかも、リン
酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）を加えた状態で簡易なオート
クレーブ滅菌処理が可能な動物細胞固定化用担体を提供
することにある。更に、本発明の目的はその担体を用い
る細胞培養方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】前記の目的は、本発明に
より、動物細胞接着材料がキトサンとの混合物の形で、
多孔質基材の全表面上に、連続的に又は不連続的に分散
して含まれていることを特徴とする、動物細胞固定化用
担体によって達成することができる。

【０００９】また、本発明は、動物細胞接着材料がキト
サンとの混合物の形で、多孔質基材の全表面上に、連続
的に又は不連続的に分散して含まれている動物細胞固定
化用担体に細胞を接着させたのち、細胞培養を行い、細
胞を増殖させることを特徴とする、細胞培養方法にも関
する。

【００１０】更に、本発明は、動物細胞接着材料をキト
サン酸性水溶液に加えて被覆液を調製し、その被覆液を
多孔質基材に与えてから乾燥し、この乾燥させた多孔質
基材をアルカリで処理して前記キトサンを不溶性にする
ことを特徴とする、動物細胞固定化用担体の製造方法に
も関する。

【００１１】本発明で基材として用いる多孔質体は、特
に制限されるものではないが、親水性の有機多孔質体が
好ましく、例えば、繊維加工体（例えば、不織布又は３
次元的な織編物）及び発泡体を挙げることができる。本
発明で基材として用いる発泡体は、特に制限されるもの
ではないが、親水性有機発泡体、例えば、セルロース発
泡体又はポリウレタン発泡体を挙げることができる。

【００１２】本発明で基材として用いる繊維加工体は、
親水性繊維を主体とする。即ち、構成繊維中に親水性繊
維が５０％以上含まれている不織布又は織編物を用い
る。親水性繊維としては、特に制限されるものではない
が、例えば、再生セルロース繊維、ポリアミド繊維、タ
ンパク質含有繊維又は天然繊維（例えば、木綿、麻、絹
又は羊毛）を挙げることができる。更に、疎水性繊維
（例えば、ポリエチレン繊維、ポリプロピレン繊維、ア
クリル繊維又はウレタン繊維）から、任意の親水性付与
処理（例えば、紫外線照射又はプラズマ処理）によって
親水性に変性させたものも含まれる。この親水性付与処
理は任意の段階、即ち、不織布又は織編物の形成前の繊
維や樹脂の段階で実施しても、又は不織布又は織編物の
形成後に実施してもよい。

【００１３】不織布又は織編物を構成する親水性繊維の
太さも特に制限されるものではないが、３〜１００デニ
ールの太いもの、特に１０〜１００デニールのものを用
いるのが好ましい。動物細胞は一般に１０〜２０μｍ程
度の大きさであり、浮遊状態では球状であるが、担体に
付着すると偏平化する。従って、繊維径が大きいと、細
胞が繊維を取り巻いて偏平化することができるので好ま
しい。繊維径が３デニール未満だと、繊維間の隙間が小
さくなってしまい、細胞が不織布又は織編物内部に入り
込めなくなり、細胞の増殖効率が低下するだけでなく、
不織布又は織編物内部への培養液の栄養成分や溶存酸素
などの供給が困難になるので好ましくない。逆に、繊維
径が１００デニールを越えると、不織布又は織編物全体
の表面積が減少して細胞の付着効率が低下し、更に、不
織布又は織編物としての加工性も悪化するので好ましく
ない。

【００１４】本発明においては、不織布としてニードル
パンチ処理をしたものを用いるのが好ましい。ニードル
パンチ処理により、構成繊維が相互に３次元的に絡み合
うので、細胞が不織布内部に入り込んだ状態で固定化さ
れ易くなり、増殖効率が向上する。また、本発明におい
て用いる織編物は、３次元的な織構造又は編構造を有す
る厚みのある織編物が望ましい。なお、本発明で使用す
る不織布又は織編物の繊維密度は０．０２〜０．１ｇ／
cm³、好ましくは０．０３〜０．０７ｇ／cm³の範囲に
あることが望ましい。繊維密度が０．０２ｇ／cm³より
も小さいと不織布又は織編物の形状の保持性がなく、取
扱強度が不足し、一方、０．１ｇ／cm³よりも大きいと
充分な空隙を不織布又は織編物内に形成することができ
ないので細胞が不織布内部へ入り込めず、細胞数が減少
するだけでなく、培養液も充分に行き渡らなくなり、目
的とする生理活性物質の収量が減少する。

【００１５】本発明では、不織布のバインダーとして通
常用いられている樹脂を用いることができるが、特に、
動物細胞との付着性を阻害しないために親水性であるこ
とが望ましく、更に、動物細胞を付着した不織布を培養
液中で使用するので、水不溶性であることが好ましい。
また、ＰＢＳを加えた状態でオートクレーブ処理を行う
ことができるように、耐熱水性を有する樹脂を用いるの
が好ましく、例えば、ポリウレタンは、繊維接着性や水
との濡れ性が高く、良好な耐熱水性を有するので良い。
特に好ましいポリウレタンは、ポリエステル型ポリウレ
タン等であって、フィルムに成形した際の１００％モジ
ュラスが２０kg/cm ²以上の強度を有するものである。

【００１６】本発明において多孔質担体として用いる不
織布は、通常の不織布製造方法、例えば、親水性繊維か
ら主になるウエブにバインダー樹脂を含浸させ、含浸ウ
エブを乾燥させることによって調製することができる。

【００１７】本発明で用いる動物細胞接着材料は、絹フ
ィブロイン、骨粉、ゼラチン、コラーゲン及び二価陽イ
オン生成性塩（特には、二価陽イオン生成性無機塩）か
らなる群から選ばれる。これらの動物細胞接着材料は、
キトサンとの混合物の形で多孔質基材の全表面上に担持
される。ここで、「多孔質基材の全表面上」とは、多孔
質基材の外形を形成する表面だけでなく、多孔質基材内
部の表面をも含む。これらの全表面上に前記混合物が、
不連続的に分散して担持されるか、又は連続的に担持さ
れる。

【００１８】キトサンは、キチン（β−ポリ−Ｎ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミン）を濃アルカリ溶液と加熱する
か又はカリウム融解してから、脱アセチル化して得るこ
とのできる生成物（β−ポリ−Ｄ−グルコサミン）であ
る。本発明では、任意のキトサンを用いることができる
が、特には、脱アセチル化度が７５％以上で、０．６重
量％Ｌ−乳酸水溶液に０．５重量％の量で溶解した場合
に、溶液粘度が３００〜５０００センチポイズになるも
のが、膜強度の大きな膜を形成することができるので良
い。

【００１９】絹フィブロインは、オートクレーブ処理程
度の加熱により絹II型配列を取って安定な構造を有する
ポリペプチドとなる。ポリペプチドは、本来的に生体適
合性が高く、しかも、絹フィブロインは、加熱により安
定化するので、本発明の動物細胞接着材料として好まし
い。

【００２０】骨粉は、ヒドロキシアパタイトからなる多
孔体であり、孔の中にはコラーゲンが存在している。従
って、生体適合性が高く、細胞付着性も優れている。ま
た、比重が大きいので、本発明の動物細胞固定化用担体
全体の比重を調整するために用いることもできる。

【００２１】ゼラチンは、コラーゲンが熱変性を受けた
ものであり、細胞付着性に優れている。ゼラチンをそれ
単独で多孔質基材上に単にコーティングしただけでは、
オートクレーブ処理により流れ落ちてしまうが、本発明
ではゼラチンをキトサンとの混合物の形で構成繊維に含
ませてあり、ゼラチンが多孔質基材に強固に付着してい
るので、オートクレーブ処理により流れ落ちてしまうこ
とがなく、本発明の動物細胞接着材料として用いること
ができる。

【００２２】更に、コラーゲンは、動物細胞固定化用担
体において接着材料として従来から使用されているが、
従来はコラーゲンをそれ単独で多孔質基材上に単にコー
ティングしただけであったので、オートクレーブ処理に
より流れ落ちてしまった。しかしながら、本発明ではコ
ラーゲンをキトサンとの混合物の形で多孔質基材に含ま
せてあり、コラーゲンが多孔質基材に強固に付着してい
るので、オートクレーブ処理により流れ落ちてしまうこ
とがなく、本発明の動物細胞接着材料として用いること
ができる。

【００２３】二価陽イオン生成性塩（特には、二価陽イ
オン生成性無機塩）とは、水中で陰イオンを放出してそ
れ自体が二価陽イオンとなるものであり、例えば、アル
カリ土類金属（例えば、カルシウム又はマグネシウム）
の炭酸塩、塩酸塩、硫酸塩又はリン酸塩を挙げることが
できる。多孔質基材の表面に二価陽イオンが存在する
と、表面が（−）に帯電している細胞が付着し易くな
る。特に、炭酸カルシウムを使用すると、培養液を中性
に保つ作用も有するので好ましい。

【００２４】本発明においては、前記の動物細胞接着材
料を１種類単独で、あるいは２種類以上を組み合わせて
用いることができる。特に、絹フィブロイン及び／又は
ゼラチンを用いると、オートクレーブ処理にも安定であ
り、動物細胞の付着性も良好なので好ましい。

【００２５】本発明の動物細胞固定化用担体の調製は、
キトサンの０．１〜１０％酸性水溶液、好ましくは、有
機酸（例えば、置換又は非置換の脂肪族カルボン酸、例
えば、酢酸、プロピオン酸、乳酸、安息香酸又はグルタ
ミン酸）水溶液に前記の動物細胞接着材料を加えて被覆
液を生産し、この被覆液を前記多孔質基材に与え（例え
ば、コーティング、噴霧、浸漬又は含浸し）た後、乾燥
してキトサンを析出させ、アルカリ（例えば、アルカリ
金属水酸化物希水溶液）を加えてアルカリ処理してキト
サンを不溶化させることによって行うことができる。こ
うして、キトサン水溶液中に存在した動物細胞接着材料
が、３次元的な多孔質基材の全表面上に不溶性キトサン
によって強固に付着される。

【００２６】キトサン酸性水溶液におけるキトサンの濃
度が０．１％より低いと、本発明が目的とする効果が充
分に得られず、１０％を越えるとキトサン溶液が高粘稠
性となり加工が困難な上、充分に溶解できなくなるので
好ましくない。基材上のキトサンの担持量は特に限定さ
れるものではないが、好ましくは０．５〜５０ｇ／
ｍ²、より好ましくは５〜３０ｇ／ｍ²である。担持量
が０．５ｇ／ｍ²未満であると動物細胞接着材料を担体
上に安定に保持するのが困難になり、担持量が５０ｇ／
ｍ²を越えると基材の穴が詰まるので好ましくない。ま
た、前記の動物細胞接着材料とキトサンとの混合物の担
持量は特に限定されるものではないが、絹フィブロイ
ン、コラーゲン又はゼラチンの場合には１〜１００ｇ／
ｍ²の範囲であるのが好ましい。１ｇ／ｍ²未満である
と動物細胞の接着が不充分になるので好ましくなく、１
００ｇ／ｍ²を越えると担持量の増加に伴う動物細胞数
の増加が認められなくなる。骨粉又は二価陽イオン生成
性塩とキトサンとの混合物の担持量は、１０〜２００ｇ
／ｍ²の範囲であるのが好ましい。１０ｇ／ｍ²未満で
あると動物細胞の接着が不充分になるので好ましくな
く、２００ｇ／ｍ²を越えると多孔質基材内に安定して
担持しておくことが困難になり、しかも、担持量の増加
に伴う動物細胞付着量の増加が認められなくなるので好
ましくない。

【００２７】本発明の担体は、ＰＢＳあるいは生理食塩
水の存在下にオートクレーブ処理を行うことができる。
本発明の担体は、比較的大きな塊のまま用いても、比較
的小さな小片に裁断してから用いてもよい。

【００２８】本発明の担体に固定化することのできる動
物細胞は、特に限定されるものではないが、例えば、Ｂ
ＨＫ、Ｌ９２９、ＣＨＯなどの遺伝子組換の宿主として
用いられる細胞や、ＩＭＲ−９０細胞のような正常細胞
を挙げることができる。

【００２９】固定化は、従来の動物細胞固定化用担体と
同様に行うことができ、例えば、本発明の動物細胞固定
化用担体を充填したカラムに動物細胞懸濁液を流すか、
あるいは本発明の動物細胞固定化用担体を動物細胞懸濁
液に浸漬すればよい。

【００３０】本発明の動物細胞固定化用担体は、浮遊型
の培養装置又は充填型の培養装置において、培養される
動物細胞の担体として使用することができる。浮遊型の
培養装置の場合には、例えば、本発明による動物細胞固
定化用担体を５mm程度の立方体状や直径６mm程度の円柱
状に裁断し、これを動物細胞懸濁液に浸漬させると動物
細胞が固定化される。動物細胞が固定化された担体を攪
拌又は流動しながら浮遊状態で培養を行う。一方、充填
型の培養装置の場合には、例えば、本発明による動物細
胞固定化用担体をシート状のままで培養槽に充填し、こ
れに動物細胞懸濁液を通液させると動物細胞が固定化さ
れる。動物細胞を固定化した後、培養液を培養槽に通液
及び循環させて動物細胞を培養する。いずれの場合も、
培養された動物細胞から目的とする生理活性物質が分泌
されるので、これを分離、精製することができる。ま
た、増殖された細胞は、担体上に付着して成育する。

【００３１】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。

【００３２】実施例１レーヨン繊維ウェブ１７０ｇ／ｍ²（平均繊維径＝１５
デニール：平均繊維長＝７６mm）にニードルパンチ処理
（針密度２００本／cm²）を施してニードルパンチフェ
ルトを得た。ポリウレタンエマルジョン（固形分３５
％）（メルシー５８９：東洋ポリマー）２０重量部とエ
ポキシ系架橋剤（ＡＤ−Ｃ−６５：東洋ポリマー）０．
５重量部とを含み、蒸留水で全体を１００重量部とした
バインダー液を用い、ステンレススチールマングルによ
り、スリット幅０．７mmで絞り、前記のニードルパンチ
フェルトに均一に含浸させた後、１５０℃で架橋乾燥さ
せた（バインダー量＝２５ｇ／ｍ²）。次に、キトサン
１％溶液〔キトサン（脱アセチル化率＝８５〜９５％；
和光純薬工業（株））１ｇを、蒸留水９８．４ｇ及びＬ
−乳酸（和光純薬工業（株））０．６ｇで、５８℃にて
溶液化して調製〕７０重量部、３％フィブロイン水溶液
２０重量部及び８％ゼラチン水溶液１０重量部からなる
被覆液を用い、ステンレススチールマングルにより、ス
リット幅０．８mmで絞り、前記のウレタン含浸ニードル
パンチフェルトに均一に含浸させた。１５０℃で乾燥さ
せた後、４％ＮａＯＨ水溶液で処理してキトサンを不溶
化し、水洗してからもう一度１５０℃で乾燥させて担体
を得た（目付＝２７０ｇ／ｍ²；厚み＝３．０mm）。

【００３３】実施例２（絹フィブロイン）前記実施例１に記載の操作を繰り返したが、但し、被覆
液として、キトサン１％溶液７０重量部と３％フィブロ
イン水溶液３０重量部とからなる液を用いて担体（目付
＝２６５ｇ／ｍ²；厚み＝３．２mm）を得た。

【００３４】実施例３（骨粉）前記実施例１に記載の操作を繰り返したが、但し、被覆
液として、８％ゼラチン水溶液１０重量部の代わりに、
骨粉５重量部と蒸留水５重量部とを含有するものを用い
て担体（目付＝３１７ｇ／ｍ²；厚み＝２．６mm）を得
た。

【００３５】実施例４（コラーゲン）前記実施例１に記載の操作を繰り返したが、但し、被覆
液として、８％ゼラチン水溶液１０重量部の代わりに、
コラーゲン粉末２重量部と蒸留水８重量部とを含有する
ものを用いて担体（目付＝２４５ｇ／ｍ²；厚み＝３．
１mm）を得た。

【００３６】実施例５（塩）前記実施例１に記載の操作を繰り返したが、但し、被覆
液として、８％ゼラチン水溶液１０重量部の代わりに、
炭酸カルシウム１０重量部を含有するものを用いて担体
（目付＝２３０ｇ／ｍ²；厚み＝２．２mm）を得た。

【００３７】比較例１前記実施例１に記載の操作により、ウレタン含浸ニード
ルパンチフェルトを調製した。次に、完全ケン化タイプ
ポリビニルアルコール（ＰＶＡ−１１７Ｈ：クラレ）１
０％水溶液６９．５重量部、１，３−ジメチル尿素０．
５重量部、３％フィブロイン水溶液２０重量部及び８％
ゼラチン水溶液１０重量部からなる被覆液を用い、前記
実施例１に記載の操作により、担体（目付＝２５０ｇ／
ｍ²；厚み＝２．８mm）を得た。

【００３８】比較例２前記実施例１に記載の操作により、ウレタン含浸ニード
ルパンチフェルトを調製した。次に、ポリウレタンエマ
ルジョン（固形分３５％）（メルシー５８９：東洋ポリ
マー）２０重量部、エポキシ系架橋剤（ＡＤ−Ｃ−６
５：東洋ポリマー）０．５重量部、完全ケン化タイプポ
リビニルアルコール（ＰＶＡ−１１７Ｈ：クラレ）１０
％水溶液３０重量部、１，３−ジメチル尿素０．５重量
部、３％フィブロイン水溶液２０重量部及び８％ゼラチ
ン水溶液１０重量部からなる被覆液を用い、前記実施例
１に記載の操作により、担体（目付＝２８０ｇ／ｍ²；
厚み＝２．８mm）を得た。

【００３９】比較例３前記実施例１に記載の操作を繰り返すが、但し、バイン
ダー液として、比較例２に記載の被覆液を用い、このバ
インダー液（被覆液）含浸ニードルパンチフェルト（目
付＝２５０ｇ／ｍ²；厚み＝２．８mm）をそのまま下記
の担体評価に使用した。

【００４０】試験例（担体評価法）前記実施例１〜実施例５及び比較例１〜比較例３で調製
した各担体について、オートクレーブ処理特性、細胞担
持能力及び培養効果を以下の方法で評価した。

【００４１】試験例１：オートクレーブ処理特性不織布を裁断（６mm×６mm）して２０個のサンプルを用
意し、１００mlトールビーカに入れ、蒸留水４０mlを加
えてからアルミニウムホイルで密封し、１２１℃で１５
分間オートクレーブ処理した。蒸留水の白濁の程度を目
視によって評価した。次に、前記ビーカに棒状テフロン
被覆攪拌棒（直径＝８mm；長さ＝３０mm）を入れ、マグ
ネチックスターラで２００ｒｐｍで２４時間攪拌した。
不織布の繊維のほつれの程度を観察した。これらの結果
を表１に示す。

【００４２】

【表１】

【００４３】試験例２：細胞担持能力各不織布サンプル（１５mm×１５mm）を遠心管に入れ、
これらの各遠心管に各々ＰＢＳ液１０mlを加えた後、温
度１２１℃で２０分間滅菌し、増殖培地（ＤＭＥＭに１
０％ウシ血清と１０％トリプトースホスフェートブロス
を添加）１０mlを加えＰＢＳ液と置換した。この操作を
２回繰り返した。各被検不織布を１２穴プレート（コー
ニング社製）に移し、ＢＨＫ細胞懸濁液（１×１０⁵個
／ml）約２mlを添加した。続いて、３７℃のフラン器に
て５％の二酸化炭素を含む空気中で約４時間静置した。
次に、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉ
ｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ：ＧＩＢＣＯ）培地
に、１０％牛血清と１０％トリプトースホスフェートブ
ロスとを添加した培地を入れ、３日間培養した。各不織
布を顕微鏡（２００倍）で観察することにより動物細胞
の付着性を評価した後、被検不織布をトリプシン処理す
ることによって動物細胞を剥がし、細胞数を血球計算盤
で計測した。実施例１の不織布サンプルでは４．２×１
０⁶cells/cm³、比較例１の不織布サンプルでは０．０
４×１０⁶cells ／cm³、比較例２の不織布サンプルで
は０．０６×１０⁶cells ／cm³であった。

【００４４】試験例３：本発明担体と公知担体との細胞
担持能力の比較公知担体として、多孔質セルロ−スからなるマイクロキ
ャリア（旭化成（株）製）、セルロ−ス発泡体（酒伊エ
ンジニアリング（株）製：商品名＝Cellsnow）６種及び
多孔質シランからなるマイクロキャリア（SCHOTT社製）
を用意した。

【００４５】実施例１で調製した担体を直径６mmの大き
さに裁断した小片５個、多孔質セルロ−ス製マイクロキ
ャリア０．２ｇ、セルロ−ス発泡体０．２ｇ、そして多
孔質シラン製マイクロキャリア１ｇを各々遠心管に入れ
た。この各遠心管に各々ＰＢＳ液１０mlを加えた後、温
度１２１℃で２０分間滅菌し、増殖培地（ＤＭＥＭに１
０％ウシ血清と１０％トリプトースホスフェートブロス
を添加）１０mlを加えＰＢＳ液と置換した。この操作を
２回繰り返した。

【００４６】次いで、ＢＨＫ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１
０）、ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、Ｌ−９２
９細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１）を、各々の担体１cm³当
たりに５×１０⁵cells になるように接種し、５％炭酸
ガスインキュベーターで培養した。２４時間後、全量が
８mlとなるように前記と同じ増殖培地を加えた。培養５
日目にＰＢＳ液で担体を洗浄した後、トリプシン処理に
より細胞数を計測して単位体積当たりの細胞数を求め
た。結果を図１に示す。図１において、ａ〜ｉは以下の
担体を意味する。ａ：本発明の担体（実施例１の不織布）ｂ：セルロース発泡体（酒伊エンジニアリング（株）：
Cellsnow CX-N ）ｃ：セルロース発泡体（酒伊エンジニアリング（株）：
Cellsnow CX-K ）ｄ：セルロース発泡体（酒伊エンジニアリング（株）：
Cellsnow EX-C ）ｅ：セルロース発泡体（酒伊エンジニアリング（株）：
Cellsnow EX-T ）ｆ：セルロース発泡体（酒伊エンジニアリング（株）：
Cellsnow EX-P ）ｇ：セルロース発泡体（酒伊エンジニアリング（株）：
Cellsnow EX-G ）ｈ：多孔質セルロース製マイクロキャリア（旭化成
（株）製：EX-K) ｉ：多孔質シラン製マイクロキャリア（ＳＣＨＯＴＴ社
製）

【００４７】図１に示すように、ＢＨＫ細胞では、実施
例１の担体で６．１×１０⁶cells／cm³であるのに対
して、公知担体で０．５〜３．６×１０⁶cells/cm³で
あり、ＣＨＯ細胞では、実施例１の担体で４．７×１０
⁶cells ／cm³であるのに対して、公知担体で０．２〜
１．７×１０⁶cellｓ／cm³であり、Ｌ−９２９細胞で
は、実施例１の担体で３．５×１０⁶cells ／cm³であ
るのに対して、公知担体で０．６〜１．８×１０⁶cell
s ／cm³であった。

【００４８】なお、顕微鏡（２００倍）により細胞の付
着状態を観察したところ、実施例１の担体では表面だけ
でなく、内部にも細胞が増殖していたが、セルロ−ス発
泡体は付着量が少なく、多孔質セルロ−ス製マイクロキ
ャリア及び多孔質シラン製マイクロキャリアでは付着量
が少ないだけでなく、孔部の直径と細胞の大きさとが同
程度であるために、孔内部には細胞が付着している様子
も観察されなかった。

【００４９】試験例４：充填層型リアクターによる培養充填層型培養装置を用いて、接着性動物細胞の培養実験
を実施した。図２は、この試験で使用した装置を模式的
に示す説明図である。

【００５０】実施例１で調製した動物細胞用固定化担体
を直径６mmの大きさに裁断し、充填槽１に裁断担体約９
５０個を充填した。濃度３０×１０⁴cells ／mlのＢＨ
Ｋ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１０）のＰＢＳ懸濁液９０ml
を、充填槽１の上部より供給して、ＢＨＫ細胞を担体に
接種した後、担体へ安定に付着させるために４時間ほど
静置培養した。

【００５１】続いて、灌流培養を行った。培養では、グ
ルコースを含む新鮮な培養液（ＤＭＥＭに１０％ウシ血
清と１０％トリプトースホスフェートブロスを添加）を
培地貯槽２からポンプ１０によって循環槽３に連続的に
送り、循環槽３でスターラ４により生産物を含む培養液
と攪拌混合する。この混合培養液は酸素電極５を介して
ポンプ１１により充填層１に送られ、充填層１で担体に
固定化されたＢＨＫ細胞と接触する。こうして、ＢＨＫ
細胞は増殖すると共に物質生産を行う。この生産物を含
む培養液は循環槽３に戻され、循環槽３でスターラ４に
より新鮮な培養液と攪拌混合され、循環槽３からポンプ
１２によって回収槽６に連続的に回収される。すなわ
ち、この装置では連続的に新鮮な培養液を供給しなが
ら、連続的に生産物を回収することができる。なお、循
環槽３には培養液に溶存させるために電磁弁７から酸素
が供給される。この電磁弁７と酸素電極５とは適当な手
段（図示せず）によって連結されており、酸素電極５で
読取った酸素濃度に応じて酸素供給量を制御している。

【００５２】図３は、充填層１内での空塔速度、循環槽
３から回収槽６への培養液の回収量、及び循環槽３内の
培養液中のグルコース濃度と動物細胞の老廃物である乳
酸の濃度の経時変化を示すものである。培養開始から４
日目までは回分培養を行い、５日目から１２日目までの
８日間では繰り返し回分生産を行い、そして１３日目か
ら３３日目までの２１日間で連続灌流培養を行った。５
日目からの生産期間における回収液量は、循環槽３内の
培養液中のグルコース濃度が約１．５mg／mlになるよう
に、新鮮な培地の供給量を調整した。すなわち、循環槽
３内の培養液中のグルコース濃度が約１．５mg／mlにな
るように、図３に示す速度で新鮮な培養液を培地貯槽２
から循環槽３内へ供給し、同時に同量の培養液を回収槽
６に回収した。

【００５３】この連続灌流培養の間、グルコース濃度、
乳酸濃度、及び培養液の回収量は安定しており、細胞の
はく離も少なく、細胞が長期間安定に活性を維持した状
態で担体に固定化されていることを示している。なお、
この方法では動物細胞の固定化担体への接種方法も簡便
で確実であった。

【００５４】

【発明の効果】本発明の動物細胞固定化用担体において
は、動物細胞に対して良好な接着性を有する動物細胞接
着材料が、不溶化キトサンとの混合物の形で多孔質基材
の全表面上に強固に付着した状態で含まれているので、
培地水溶液の存在下でオートクレーブ滅菌処理を行って
も流れ落ちることがなく、熱変性も起こしにくい。

【００５５】更に、３次元的な多孔質体内に動物細胞接
着材料が分散して付着しているので、動物細胞の付着効
率が良く、動物細胞の付着容量も大きい。このため、低
濃度の動物細胞懸濁液から効率よく動物細胞を付着させ
ることができ、しかも多量の動物細胞を保持しながら培
養することができる。また、本発明の動物細胞固定化用
担体は、親水性材料から構成されているので、動物細胞
との適合性が良好である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による担体及び公知担体の細胞担持能力
を比較した結果を示すグラフである。

【図２】充填層型リアクターの構造を模式的に示す説明
図である。

【図３】連続灌流培養の結果を示すグラフである。

【符号の説明】

１充填層２培地貯槽３循環槽４マグネチックスターラ５酸素電極６回収槽７電磁弁１０，１１，１２ポンプ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】動物細胞接着材料がキトサンとの混合物
の形で、多孔質基材の全表面上に、連続的に又は不連続
的に分散して含まれていることを特徴とする、動物細胞
固定化用担体。
【請求項２】動物細胞接着材料がキトサンとの混合物
の形で、多孔質基材の全表面上に、連続的に又は不連続
的に分散して含まれている動物細胞固定化用担体に細胞
を接着させたのち、細胞培養を行い、細胞を増殖させる
ことを特徴とする、細胞培養方法。