JP2003116519A

JP2003116519A - 人工組織用材料

Info

Publication number: JP2003116519A
Application number: JP2001318503A
Authority: JP
Inventors: Yasuhiko Tabata; 泰彦田畑; Shinichiro Morita; 真一郎森田; Yoshitake Takahashi; 佳丈高橋
Original assignee: Gunze Ltd
Current assignee: Gunze Ltd
Priority date: 2001-10-16
Filing date: 2001-10-16
Publication date: 2003-04-22
Anticipated expiration: 2021-10-16
Also published as: JP4102557B2

Abstract

(57)【要約】【課題】均一に分布した細胞及び足場材料を含む人工
組織用材料の提供。【解決手段】細胞が沈降しない条件下において、細胞
懸濁液と足場材料とを接触させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞が沈降しない
条件下において、細胞懸濁液と足場材料とを接触させる
ことによって得ることができる、均一に分布した細胞及
び足場材料を含む人工組織用材料に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年の細胞工学技術の進展によって、数
々の動物細胞の培養が可能となり、またそれらの細胞か
ら組織・器官を再構築するという試みが行われつつあ
る。このような試みにおいて、最も重要なことは、播種
した細胞が増殖分化して３次元的な生体組織様構造物を
構築するために、足場材料内に細胞を高密度かつ均一に
分布させ、保持することである。

【０００３】足場材料として、種々の高分子が開発され
ているが、細胞を高分子に均一に、高密度に、高い生存
率を有して播種し培養することは困難であった。Kimら
は、ポリグリコール酸からなる生体分解性のマトリック
スを用いた平滑筋細胞の播種及び培養方法について報告
している。これは、５０mlチューブ内で、細胞及びポリ
グリコール酸マトリックス（幅５mm×長さ５mm×高さ２
mm）を含む培養液０．３mlを、１００rpmで攪拌しなが
ら２０時間培養する播種方法である（Biotechnol. and
Bioeng., 57, 48-54, 1998）。しかし、この方法による
人工組織用材料には、人工組織用材料の上層と下層又は
外層と内層との間の細胞密度の分布に、偏りがあるとい
う問題点があった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、細胞が沈降しない条件下において、細胞懸濁液
と足場材料とを接触させることによって得ることができ
る、均一に分布した細胞及び足場材料を含む人工組織用
材料を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、人工組織
用材料の播種・培養に関する上記の問題点を解決するた
めに鋭意検討した結果、添加する細胞を分散させた培養
液（細胞懸濁液）の容量と細胞の足場材料の容量（体
積）との比、及び培養条件の組合わせを選択することに
よって、細胞とその足場材料を含む人工組織用材料内部
の細胞分布が均一であり、かつ高い細胞の生存率及び生
理活性を有している細胞を含む人工組織用材料の開発に
成功し、本発明を完成した。

【０００６】したがって、本発明は、細胞が沈降しない
条件下において、細胞懸濁液と足場材料とを接触させる
ことによって得ることができる、均一に分布した細胞及
び足場材料を含む人工組織用材料に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の足場材料は、例えば、ポ
リ乳酸、ポリグリコール酸、ポリε−カプロラクトン、
乳酸とグリコール酸との共重合体、グリコール酸とε−
カプロラクトンとの共重合体、ポリクエン酸、ポリリン
ゴ酸、ポリ−α−シアノアクリレート、ポリ−β−ヒド
ロキシ酪酸、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテト
ラメチレンオキサレート、ポリオルソエステル、ポリオ
ルソカーボネート、ポリエチレンカーボネート、ポリプ
ロピレンカーボネート、ポリ−γ−ベンジル−L−グル
タメート、ポリ−γ−メチル−L−グルタメート、ポリ
−L−アラニンなどの合成高分子、デンプン、アルギン
酸、ヒアルロン酸、キチン、ペクチン酸及びその誘導体
などの多糖、あるいはゼラチン、コラーゲン（コラーゲ
ンのタイプ及びその抽出法はいずれでもよい）、アルブ
ミン、フィブリンなどのタンパク質など種々の高分子及
びその混合物あるいは化学反応によって作製した複合物
などを挙げることができる。本発明の高分子は、好まし
くは、酸、アルカリなどによる単純加水分解あるいは酵
素による加水分解によって生体内で分解吸収されるとい
う、生体吸収性の性質を有し、適当な処理をすることに
よって多孔質状となっており、そして所望の形態に成型
してあるものである。また、本発明の足場材料は、不織
布状、スポンジ状、編物、織物等の任意の形状に成形す
ることができる。

【０００８】本発明に用いる不織布は、公知の方法によ
って調製することができる。例えば、短い繊維の層（ウ
ェブ）を多数の針のついたニードルパンチ機に通し繊維
を機械的に絡み合わせてフェルト状にするニードルパン
チ法、繊維になる前の溶けた原料樹脂を多数のノズルか
ら同時に吹き出して細い糸を作りながらその連続した多
数の糸をあらゆる方向にクモの巣状に配置し均一な厚さ
のウェブを作り、自然に又は機械的に糸同士をくっつけ
るメルトブロー法である。

【０００９】本発明に用いる不織布を構成する繊維の直
径は、好ましくは、１〜５０μm、より好ましくは、５
〜２０μmであり、空隙率は、好ましくは、７０〜１０
０％未満、より好ましくは、８５〜１００％未満、最も
好ましくは、９０〜１００％未満である。その形態とし
ては、ディスク状、フィルム状、棒状、粒子状、および
ペースト状、チューブ状などがあるが、これらに限定さ
れない。

【００１０】本発明に用いるスポンジは、公知の方法に
よって調製することができる。例えば、重量平均分子量
が１〜５０万を有する高分子又は共重合体の溶液を所望
の型枠に入れ、凍結後、真空凍結乾燥することによって
得ることができる。この際、サイズの異なる水溶性固
体、例えば、食塩、デンプンなどを混合して、凍結乾燥
体を得た後、水中にてそれらの水溶性固体を抽出するこ
とによって、また、凍結温度や高分子溶液濃度を変化さ
せることによって、所望の孔サイズを有する多孔質体を
得ることも可能である。この作製されたスポンジを適当
な形にカットすることによって成型することも可能であ
る。

【００１１】本発明に用いることができる多孔体セラミ
ックスは、多孔性であること及びその空隙が連通孔構造
を有しており、生体毒性が少なく、生体親和性であるこ
とが好ましい。空隙のサイズ（気孔径）、連通孔（連通
部径）のサイズは１０μm以上であることが好ましい。
例えば、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）、あるいはＦ
若しくはＭｇなどが混合されたＨＡ誘導体及び傾斜材
料、炭酸アパタイト、トリリン酸カルシウム（ＴＣ
Ｐ）、炭酸カルシウム（サンゴからの天然物も含む）な
どを用いることができる。また、金属材料としては、す
でに生体内で用いられているステンレススチール、チタ
ン、種々の合金などからなる多孔質体も足場材料となり
得る。例えば、チタンなどからなるスポンジ、メッシュ
構造を有する３次元多孔質体などが好ましい。気孔径及
び連通部径は、１０μm以上であること、メッシュの場
合には、繊維径は１〜５００μmが好ましい。また、そ
の空隙率は、６０〜１００％である。さらに、高分子、
セラミックス、金属などの2種類以上からなる混合物あ
るいは化学反応によって作製された複合体を用いて、上
述の３次元多孔体を作製して用いることもできる。ま
た、高分子、セラミックス、金属のいずれの足場材料に
対しても、その材料表面を細胞の接着、増殖、分化など
を促進するための物質によって修飾した後に、本発明の
目的に用いることができる。多孔質体を作製した後に、
修飾を行ってもよいし、また、修飾を行ったものを用い
て多孔質体を作製してもよい。修飾方法としては、種々
の足場材料に物質をコーティングなどの物理固定、化学
固定又は材料内への物理的、化学的混合法などの公知の
方法を用いることができる。修飾物質としては、コラー
ゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、
ラミニン、種々のムコ多糖類などの細胞接着性を有する
物質、細胞増殖因子、分化因子、サイトカイン、ケモカ
インなどの生理活性物質、及びそれらの誘導体、並びに
それらの細胞接着（細胞接着物質）、増殖、分化などの
作用を有する天然ペプチド、合成ペプチドなどが挙げら
れる。これらの物質は、単独又は２種類以上の混合物と
して、この目的に用いることができる。

【００１２】本発明に用いる細胞としては、培養するこ
とができる正常細胞、癌細胞、胚性及び成体（組織）幹
細胞、造血系幹細胞などの細胞であれば、あらゆる種類
の細胞を用いることができる。

【００１３】本発明に用いる培養液は、組織培養で従来
用いられている動物細胞用の培養液例えば、ｍｅｄｉｕ
ｍ１９９、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ある
いは幹細胞の培養に調製された培地及び細胞の分化培地
などを用いることができる。細胞懸濁液は、かかる培養
液に細胞を加えて調製する。

【００１４】本発明に用いる培養容器は、あらゆる細胞
培養のために通常に用いられる培養容器を用いることが
できる。例えば、試験管、びん、フラスコ、シャーレの
形態であることができる。素材は、プラスチック又はガ
ラスであることができ、プラスチック製品の場合には、
表面処理をしてあるかどうかを問わない。

【００１５】本発明において振盪培養とは、細胞懸濁液
中での細胞の均一性を保持したまま培養することをい
う。振盪方法は、細胞懸濁液中の細胞の均一性を保持す
ることができるものであれば何でもよく、往復、回転、
八の字等であることができ、振盪は、振盪培養器によっ
て容器の外部から与えることができる。また、培養液を
機械的に攪拌しながら培養するスピンナーフラスコ（sp
inner flask）、フラスコ自体を回転させるタイプの培
養器、回転容器（rotary vessel）・微小重力培養器、
培地流動型の培養器（perfused culture system）など
を用いることもできる。

【００１６】本発明の人工組織用材料の調製方法として
は、細胞懸濁液の流動が生じ得る条件下、すなわち、人
工組織用材料の容量当たりの細胞懸濁液量が、１を超え
ること、好ましくは、１を超えて５０以下、より好まし
くは、１を超えて２０以下、最も好ましくは、１を超え
て１０以下である条件下において、振盪培養することに
よって調製することができる。

【００１７】細胞懸濁液における細胞密度は、細胞懸濁
液の中での細胞の偏りのない均質流動が生じ得る条件、
すなわち、１０¹〜１０⁹細胞／ml、好ましくは、１０⁵
〜１０⁸細胞／mlである。

【００１８】培養は、細胞の生存率を低下させることな
く、細胞の高分子への接着が促進され、そして細胞密度
の分布が均一となる条件、すなわち、３７℃、５％ＣＯ
₂雰囲気下にて、６〜１２時間、振盪回転数２５０rpm以
上、好ましくは２５０〜３００rpmで行う。培養期間中
において、培養液交換は不要である。

【００１９】本発明の人工組織用材料は、より長期間、
より高機能な人工組織を開発するために用いることがで
きる。

【００２０】

【実施例】以下、実施例をあげて本発明について説明す
るが、本発明は以下の実施例に限定されるものではな
い。

【００２１】実施例１：細胞接着試験異なる培養容器に、あらかじめ培養液で馴化したＰＥＴ
不織布（直径６mm、厚さ３mm、空隙率９４％）を置き、
次いで、５０μl又は２００μlの骨髄から採取した未分
化間葉系幹細胞（以下、断りがない限り本細胞種を用い
た。）懸濁液（細胞数：１０⁵、１０⁶又は１０⁷細胞）
を加え、静置培養又は振盪培養（Bellco社製回転式振盪
機、３００rpm）条件下で培養した。用いた培養条件を
下記に示す。培養容器培養液量培養条件細胞懸濁液量／（μl）人工組織用材料容量ａ９６穴マイクロプレート５０静置培養０．５９ｂ９６穴マイクロプレート５０振盪培養０．５９ｃ９６穴マイクロプレート２００静置培養２．３５ｄ９６穴マイクロプレート２００振盪培養２．３５ｅ５０mlチューブ２００静置培養２．３５ｆ５０mlチューブ２００振盪培養２．３５

【００２２】培養は、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で６時
間行った。

【００２３】接着細胞数の定量は、ＤＮＡアッセイ法を
用いた。細胞培養後、細胞が接着した不織布をＣａ²⁺Ｍ
ｇ²⁺不含リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ−）で３回洗浄し、
−３０℃で１晩凍結させた。次に、凍結サンプルに０．
２mg/mlラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）／０．５mg/
mlプロテナーゼＫクエン酸３ナトリウム溶液の１mlを加
え、５５℃で１２時間緩やかに攪拌しながら細胞成分を
消化した。消化した細胞懸濁液１００μl、１μg/mlの
ヘキスト３３２５８溶液５００μl、及び０．２mg/mlＳ
ＤＳ溶液４００μlを混合し、混合液の蛍光強度を測定
した（励起波長３５５nm、蛍光波長４６０nm）。

【００２４】表１に示すように、ａ〜ｃでは、不織布断
面の細胞分布が上層に偏っているのに対し、ｄ〜ｆで
は、不織布断面の細胞分布が各層で均一であった。ま
た、ａ，ｃ，ｅに対してｂ、ｄ、ｆでは、不織布全体の
接着細胞数の増加が認められた。したがって、振盪培養
を行うことによって細胞を高密度かつ均一に不織布に接
着させることできることが分かった。これは、振盪によ
って細胞懸濁液の均一性が保持されているためと思われ
た。

【００２５】実施例２：細胞分布試験上記、ａ〜ｆの６種類の培養条件のそれぞれについて、
培養後、細胞接着不織布をヘマトキシンエオジン染色
し、不織布断面の上層、中層、下層について、接着細胞
数を測定し、中層について走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）
による観察を行った（図１）。

【００２６】ａ〜ｆいずれのサンプルにおいても接着細
胞数は、静置培養よりも振盪培養で多くなっていた。特
に、培養液量の多いｄ及びｆに関しては接着細胞数の向
上割合が大きく、振盪培養における培養液の流動が必要
条件であることが示唆された。ｃ及びｄとｅ及びｆとの
接着細胞数に差が認められないことから、不織布の大き
さと培養容器の大きさが同じである必要がないことも明
らかとなった。すなわち、不織布容量に対する培養液量
が多ければ、振盪による細胞懸濁液の流動により、細胞
懸濁液と不織布との接触機会が増加し、不織布の大きさ
及び形には制限されずに、組織再生に必要とされる希望
形状の足場材料に対して多くの細胞を効率よく接着させ
ることができることが明らかとなった（図２）。

【００２７】

【表１】

【００２８】実施例３：細胞代謝活性測定静置培養と振盪培養における細胞の代謝活性を測定する
ために、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を測定した。Ｌ
ＤＨ活性は、細胞障害の増加に伴って高くなることが知
られている。

【００２９】細胞接着試験と同様に、ａ〜ｆの６種類の
条件について、静置培養及び振盪培養を適用した。培養
時間は、それぞれ６及び２４時間とした。

【００３０】ＬＨＤ活性の測定は、ＬＤＨ−ＵＶテスト
ワコー（和光純薬）を用いて行った。ＬＤＨ基質緩衝液
（ＮＡＤＨ／５０mmol/mlリン酸緩衝液＋０．６２mmol/
lピルビン酸リチウム）２mlに培養器中の培養液５０μl
（（ａ）の場合には、培養液量を２００μlに調整した
もの）を加え、軽く混和した。この混合液の波長３４０
nmにおける、０分後及び２分後の吸光度を測定し、吸光
度の減少量からＬＤＨ活性の量を算出した。

【００３１】ＬＤＨ活性は、６時間培養では、いずれの
培養条件においても有意差は認められないが、２４時間
培養時には、静置培養で高いのに対して振盪培養では低
かった（図３）。したがって、振盪培養では静置培養に
比べて細胞障害が抑制されており、振盪培養は、細胞の
不織布への接着効率の向上、細胞分布の均一化のみなら
ず、細胞障害を低減させることが明らかとなった。

【００３２】実施例４：培養容器の形状の細胞分布への
影響振盪培養を行う際の、培養容器の形状による細胞分布へ
の影響を調べるために、種々の形状の培養容器を用いて
細胞接着試験を行った。

【００３３】培養容器として、台形底５０mlチューブ、
２４穴マイクロプレート及び丸底チューブ（φ１２mm×
長さ７５mm）を用いた。それぞれの容器の底にあらかじ
め培養液で馴化させたＰＥＴ不織布（直径６mm、厚さ３
mm、空隙率９４％）を置き、その不織布に間葉系幹細胞
（１×１０⁷個）をマイクロピペットを用いて加えた。
培養液量は、台形底５０mlチューブでは２００μl、２
４穴マイクロプレート及び丸底チューブでは５００μl
とした。これらを静置培養又は振盪培養（Bellco社製回
転式振盪機、３００rpm）条件下で６時間培養（３７
℃、５％ＣＯ₂）した。培養終了後、細胞接着不織布の
断面「中層」のＳＥＭ観察を行った。

【００３４】３種類の培養容器ともに、静置培養では細
胞接着数が少ないが、振盪培養では細胞接着数が多く、
不織布断面のどの層においても高密度に細胞が接着した
（図４）。この結果より、培養容器の形状にかかわら
ず、細胞は不織布に均一に付着することが明らかとなっ
た。

【００３５】実施例５細胞分布に対する空隙率の影響細胞分布に対する空隙率の影響を調べるために、種々の
空隙率を有する不織布を作製し、この不織布に対する細
胞接着試験を実施した。ＰＥＴ不織布に加温（１５０
℃）圧縮を行うことによって、種々の空隙率（９３．５
〜８０．７％）を有する不織布を作製した。これらのＰ
ＥＴ不織布（直径６mm、厚さ３mm、空隙率９４％）を培
養液で馴化させ、５０ml遠心管の底に置き、その不織布
に間葉系幹細胞（１×１０⁷個）をマイクロピペットを
用いて加えた。培養液量は、５００μlとした。これら
を静置培養又は振盪培養（Bellco社製回転式振盪機、３
００rpm）条件下で６時間培養（３７℃、５％ＣＯ₂）し
た。培養終了後、細胞接着不織布の断面「中層」のＳＥ
Ｍ観察を行った。

【００３６】図５に示すように、より空隙率の低い不織
布ほど接着細胞密度は高かったが、４種類の空隙率の異
なる不織布の細胞分布は均一であった。また、広範囲の
空隙率において振盪培養が有効であることが示唆され
た。

【００３７】実施例６細胞懸濁液の均一性を保持する
ために必要な振盪条件の検討実施例２の結果より、不織布内で均一な細胞分布を達成
するためには、細胞を不織布に付着させるための培養期
間中に細胞懸濁液の均一性を保持することが重要である
ことが示された。そこで、細胞懸濁液の均一性を保持す
るために必要な振盪条件の検討を行った。下記の条件下：培養容器：１２／７５チューブ、２４穴マイクロプレー
ト、９６穴マイクロプレート及び５０mlチューブ、播種細胞数：１×１０⁶個及び１×１０⁷個、振盪回転数：１００及び３００rpm、振盪時間：０．５、１、３及び６時間で振盪培養を行い、上層から経時的に細胞懸濁液を採取
し、その５７０nmにおける吸光度を測定し懸濁液の濁り
の変化を評価した。コントロール値（０時間）の値に対
する割合（％Ｃ：percent of control）を算出した。

【００３８】振盪回転数が３００rpmにおいては、１２
／７５チューブ、２４穴マイクロプレート、９６穴マイ
クロプレート及び５０mlチューブなどのいずれの培養容
器、播種細胞数、振盪時間においても吸光度に変化は認
められず、細胞懸濁液が均一であることが証明された。
それに対して、１００rpmにおいては、培養容器の種類
又は播種細胞数にかかわらず、振盪培養３０分後には、
上層部から採取された細胞懸濁液の吸光度は測定限界ま
で減少し、上層部には細胞が存在しないこと、すなわ
ち、細胞が底部に沈降し、細胞懸濁液が不均一であるこ
とが証明された。したがって、細胞懸濁液の細胞の分散
均一性を保持するためには、２５０〜３００rpmの振盪
回転数における振盪培養が必要であることが明らかとな
った（図６、図７）。

【００３９】実施例７異なる細胞種における細胞懸濁
液の均一性を保持するために必要な振盪条件の検討異なる細胞種（異なる直径）における細胞懸濁液の均一
性を保持するために必要な振盪条件を検討した。下記の条件下：細胞種：赤血球（直径８μm）、肝細胞（直径２０μm）培養容器：１２／７５チューブ播種細胞数：１×１０⁶個振盪回転数：１００、１５０、２００、２５０、３００
及び３５０rpm 振盪時間：０．５、１、３及び６時間で振盪培養を行い、上層から経時的に細胞懸濁液を採取
し、その５７０nmにおける吸光度を測定し懸濁液の濁り
の変化を評価した。コントロール値（０時間）の値に対
する割合（％Ｃ）を算出した。

【００４０】赤血球では、２００rpm以下の振盪回転数
で濁度が緩やかに減少し、２５０rpmを超える振盪回転
数で細胞懸濁液の均一性が保持された。それに対して、
より直径の大きい肝細胞では、２５０rpm以下の振盪回
転数で濁度の急速な減少が認めれた。赤血球や間葉系幹
細胞とは異なり、細胞懸濁液の均一性が保持されたのは
振盪回転数が３００rpm以上の場合のみであった。した
がって、本発明の方法において、振盪回転数が２５０rp
mであれば、直径の異なる細胞種においても細胞懸濁液
の均一性が保持されることが明らかとなった（図８）。

【００４１】

【発明の効果】再生医学を目指した生体組織様構造物を
構築するために必要とされる足場材料への細胞播種の際
に、細胞が沈降しない条件下で細胞懸濁液と足場材料と
を接着させ、足場内に均一にしかも高密度で細胞が分
布、またその生存率も高い人工組織材料を提供すること
ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】細胞接着不織布のＳＥＭ観察。ａ：９６穴マイ
クロプレート、５０μl、静置培養；ｂ：９６穴マイク
ロプレート、５０μl、振盪培養；ｃ：９６穴マイクロ
プレート、２００μl、静置培養；ｄ：９６穴マイクロ
プレート、２００μl、振盪培養；ｅ：５０mlチュー
ブ、２００μl、静置培養；ｆ：５０mlチューブ、２０
０μl、振盪培養。

【図２】異なる培養条件による接着細胞数。

【図３】細胞代謝活性測定。

【図４】培養基材による細胞分布効果（不織布断面中層
のＳＥＭ観察）。

【図５】細胞分布に対する空隙率の影響。

【図６】異なる振盪条件による細胞懸濁液の均一性への
影響。

【図７】異なる振盪速度による細胞懸濁液の均一性への
影響。

【図８】異なる細胞種による細胞懸濁液の均一性への影
響。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者森田真一郎京都府綾部市井倉新町石風呂１番地グンゼ株式会社内 (72)発明者高橋佳丈京都府綾部市井倉新町石風呂１番地グンゼ株式会社内Ｆターム(参考） 4B029 AA02 BB11 CC02 CC10 DF06 4C081 AC16 BA12 CD34 DA16 DB06

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞が沈降しない条件下において、細胞
懸濁液と足場材料とを接触させることによって得ること
ができる、均一に分布した細胞及び足場材料を含む人工
組織用材料。
【請求項２】細胞が沈降しない手段として振盪を用い
ることを特徴とする請求項１記載の材料。
【請求項３】細胞が沈降しない条件が、１）人工組織用材料の容量当たりの細胞懸濁液量が、１
を超えること、及び２）２５０rpmを超える回転数で振盪しながら細胞懸濁
液と足場材料とを接触させることである、請求項１記載の材料。
【請求項４】足場材料が、高分子、セラミックス、金
属及びその複合体からなる群より選択される、請求項１
〜３いずれか１項記載の人工組織用材料。
【請求項５】足場材料が、不織布、織物、メッシュ、
スポンジ、編物又は多孔質体の形状である、請求項１〜
４いずれか１項記載の人工組織用材料。