JPH05244875A - 活性の高いラクテニン画分の回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 (1) 脱脂乳を硫酸化多糖類に接触させ、(2)
吸着画分を塩溶液で溶出させてラクトフェリン及びラク
トパーオキシダーゼを含有する画分を回収し、(3) 非吸
着画分を酸またはレンネットで凝固させ、ホエー画分を
得、このホエー画分を塩析処理して免疫グロブリン含有
画分を回収し、(4) この回収されたラクトフェリン及び
ラクトパーオキシダーゼ含有画分と免疫グロブリン含有
画分とを合わせ、(5) これを脱塩および低分子画分除去
することよりなるラクテニン画分の回収方法 【効果】 免疫グロブリン、ラクトフェリン、ラクトパ
ーオキシダーゼの３者を生理活性な状態で含有するので
抗菌作用が高く、食品、医薬品、飼料添加物として有用
である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、乳中に含有される抗菌
性画分であるラクテニン画分を回収する方法に関する。
本発明の方法で得ることのできるラクテニン画分は食
品、医薬品、飼料等広範な利用が可能である。

【０００２】

【従来の技術】牛乳または乳清によってストレプトコッ
カス パイロゲネシス(Streptococcuspyrogenesis）の
生育が阻害されることが知られており、この阻害物質に
対しラクテニンと命名された( 祐川金次郎著, 乳タンパ
ク質,118頁, 酪農技術普及学会刊, 1971年) 。しかし乳
中に存在する抗菌性物質は、単一のものではなく、現在
は牛乳中の抗菌性物質として、ラクトフェリン、免疫グ
ロブリン、リゾチーム、ラクトパーオキシダーゼ(LPO)
などが確認されている。なかでも免疫グロブリン、ラク
トフェリン、LPO は乳中の含有量も多く、相互作用を有
している。これらの牛乳より得られた抗菌性物質を含有
する画分をラクテニン画分と呼んでいる。

【０００３】従来、免疫グロブリン、ラクトフェリン、
LPO をそれぞれ回収する方法が提案されている。例え
ば、特開昭58-28233号公報には吸着担体にラクトフェリ
ンを結合させたのち酸性溶液により溶出させる方法が開
示されている。特開昭61-246198 号公報にはアルギン酸
やカラギーナンゲルを用いてラクトフェリンとLPO を精
製する方法が開示されている。特開平1-86839 号公報に
はカルボキシル基またはスルフォン基を導入したデキス
トランで被覆したシリカ粒子を用い、塩濃度勾配によっ
てLPO とラクトフェリンを溶出する方法が開示されてい
る。特表平3-502921号公報にはラクトフェリンとLPO
を、乳清を原料として強陽イオン交換体に吸着させたの
ち、異なる濃度の塩溶液で連続して溶出して回収する方
法が開示されている。これらの方法はそれぞれラクトフ
ェリンの回収方法としては優れているものの、さらに免
疫グロブリン及び LPOをあわせて回収する方法ではな
い。

【０００４】なお、上記特開昭61-246198 号公報ラクト
フェリンとLPO が得られることが記載されているが、免
疫グロブリンの回収ができることは開示されていない。
また、特開平3-218318号公報にはロタウイルス感染症治
療剤の製法として牛初乳のホエーを分子量10万の限外濾
過処理を行い、ついで凍結乾燥処理を行い、免疫グロブ
リンとラクトフェリンに富む粉末を得る方法が開示され
ている。この方法で得られた粉末は免疫グロブリンが65
％、ラクトフェリン5.7 ％を含んでいる。しかしLPO を
どれくらい含有しているか記載されていない。

【０００５】ラクテニン画分の抗菌性にはLPO の活性が
重要であることは広く知られている。特開平3-193708号
公報にはラクトフェリンがLPO の抗菌活性を増強するこ
とが開示されている。さらにZina Moldoveanu らは免疫
グロブリンとLPO 、ラクトフェリンが抗菌活性を示すた
めに、相互に作用しあっていることを報告している〔An
n.N.Y.Acad.Sci.,409,848-850,(1983)〕。LPO はさらに
消化管内のチオシアン酸や過酸化水素と反応することに
より、強い抗菌活性を示すことが知られており、ラクテ
ニン活性を維持するためには必須な成分である。しかし
これまでに、免疫グロブリン、ラクトフェリン及びLPO
３成分の活性を保持したラクテニン画分は得られていな
い。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明はラクテニン画
分の回収方法について検討を進めた結果、従来報告され
ていたラクテニン画分と異なり、免疫グロブリン、ラク
トフェリン及びLPO をそれぞれが生物学的に活性な状態
で含まれているラクテニン画分を回収する方法を見出し
た。乳中のラクトフェリンとLPO は類似の精製方法を用
いて回収できるが、免疫グロブリン画分はこの2 成分と
は異なった挙動を示すため、それぞれ別々に回収されて
いた。本発明者らはラクテニン画分の研究を進める過程
において、これらの3 成分を簡単な操作により、同一原
料から容易に、しかも活性を保持したまま回収する方法
をみいだした。従って本発明は、免疫グロブリン、ラク
トフェリン及びLPO が活性な形で多量に含有するラクテ
ニン画分を回収する方法を提供することを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、次の工程〜
よりなる、免疫グロブリン、ラクトフェリン及びLPO
がそれぞれ活性な状態で含まれているラクテニン画分を
回収する方法である。 工程 脱脂乳を硫酸化多糖体に接触させ、ついで吸着
画分を塩溶液により溶出させ、ラクトフェリン及びラク
トパーオキシダーゼを含有する画分を回収する工程、 工程 前記工程の非吸着画分を酸またはレンネット
で凝固させ、ホエー画分を得て、このホエー画分を塩析
処理し、免疫グロブリン含有画分を回収する工程、 工程 工程及び工程で回収された画分をあわせ、
脱塩および低分子画分を除去する工程。

【０００８】本発明においては、哺乳動物の分娩後早期
の乳、特に、免疫グロブリン、ラクトフェリン及びLPO
を高濃度に含有する原料として初乳を用いることが望ま
しい。免疫グロブリン、ラクトフェリン、LPO を高濃度
に含有する乳としては、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジなど
分娩後１〜７日以内、特に好ましくは、分娩後１〜５日
以内の初乳がラクテニン画分の含量も高いため適してい
る。しかし、本発明では、これら以外の哺乳動物の初乳
あるいは通常の泌乳期の乳であっても原料として使用可
能である。

【０００９】本発明では、まずこれらの乳を脱脂処理
後、ラクトフェリン及びLPO を選択的に吸着する作用を
有する硫酸化多糖体と接触させ、ラクトフェリン及びLP
O を硫酸化多糖体に吸着させる。硫酸化多糖体としては
スルフォン化アルギネート、スルフォン化セルロース、
スルフォン化デキストラン、スルフォン化キトサンなど
を例示できるが、本発明においてはスルフォン化キトサ
ンが吸着効率の面からみて特に好ましい。スルフォン化
キトサンはスルフォン化キトパールの名称で富士紡績か
ら市販されており容易に入手可能である。スルフォン化
キトパールに導入されたスルフォン基の量は、担体1ml
当たり10〜50μeqに調整されたものが本発明では好まし
い。特に好ましくは担体1ml 当たり27〜40μeqに調整さ
れたものである。担体ゲルは、脱脂乳容量の約0.5 〜5
％を用いて吸着操作を行う。吸着操作は、バッチ処理や
担体を充填したカラムに脱脂初乳を通液する方法など種
々の方法を採用できるが、特開平3-109400号公報に開示
された回転型カラムを用いた循環法により吸着操作を行
うことが吸着効率も高く好ましい。

【００１０】担体はその後イオン強度0.2 以下、pH5 以
下の水溶液もしくは緩衝液を用いて洗浄し、担体の間に
つまった不純物を洗浄する。洗浄後、担体をイオン強度
0.5以上、pH 5以上、好ましくはイオン強度0.7 〜2.0
でpH6 〜8 の水溶液または緩衝液で吸着画分の溶出を行
う。このような緩衝液には、炭酸水素ナトリウム緩衝液
等が用いられる。

【００１１】一方、硫酸化多糖と接触させた後の非吸着
画分は、酸もしくはレンネット処理により、カゼイン画
分を凝固させ、濾過もしくは遠心分離してホエー画分を
回収する。酸処理は、乳酸、塩酸等の酸を用いpH4.6 に
調整することにより、またレンネット処理は酵素力価10
万U/g 程度のレンネットを非吸着画分に添加することに
より行われる。このような処理によってカゼイン画分を
凝固沈澱させ、ホエー画分を採取する。ホエー画分から
は塩析により免疫グロブリンを含む画分を分離する。免
疫グロブリンは約40％飽和硫安で沈殿することが知られ
ており、この方法により回収することができる。沈殿画
分を濾過により回収し、再度水に溶解し、不溶解物質を
濾過により除いた後、上記の硫酸化多糖体吸着画分とあ
わせる。

【００１２】この画分はラクトフェリン、LPO 及び免疫
グロブリンの他溶出に用いた塩、塩析に使用した硫安が
高濃度に含有されているため脱塩処理を行う。脱塩処理
としては、透析、イオン交換、分子篩による脱塩などの
方法を用いることが出来る。特に、本発明においては、
50KD以下の分子量画分を限外濾過膜により除去する工程
を採用することにより、脱塩、濃縮及びラクテニン画分
の精製を同時に行うことができる。この限外濾過は電気
伝導度あるいは硫酸イオン濃度を指標とすることによ
り、脱塩効果を判定できる。電気伝導度 400μS/cmおよ
び硫酸イオン濃度0.29％( 全固形分当たり) 以下となっ
た段階で限外濾過を終了させる。

【００１３】以上の操作により、免疫グロブリン、ラク
トフェリン及びLPO を含有するラクテニン画分を容易に
回収することができる。この画分は乾燥処理により粉末
化することができる。しかしラクテニン活性の失活をふ
せぐためには可能な限り低温条件での乾燥、例えば凍結
乾燥等の処理を行うことが望ましい。

【００１４】以下に本発明を実施例によりさらに詳細に
説明する。

【実施例１】ウシ初乳からのラクテニン画分の回収 工程 分娩後1 〜5 日経過のウシより搾乳し集めた初
乳を遠心分離により脱脂乳とした。この脱脂初乳100kg
(14℃に冷却) を、スルフォン基導入量38.9μeq/ml ・
ゲルのスルフォン化キトパールSU-3（富士紡績製) を88
2ml 充填した内容積1474mlの回転型吸着装置（東京理化
製) に通液した。通液速度は25kg/ 時間として通液し
た。回転型反応装置の回転数は30rpm に調整した。

【００１５】工程 次いで30〜35℃の温湯40l を工程
と同様に通液し、洗浄を行った。洗浄は280nm の吸光
度を測定し、吸光度が光路長1cm のセルを用いて測定し
た場合、0.01以下になることを確認し、洗浄を終了させ
た。

【００１６】工程 洗浄後0.7M食塩水(0.5mMの炭酸水
素ナトリウム NaHCO₃ , pH7.0 に溶解して調製する) 約
67.5l を工程と同様な条件で通液し、溶出を行った。
溶出は280nm の吸光度を測定し、吸光度が光路長1cm の
セルを用いて測定した場合、0.015 〜0.020 になること
を確認した。溶出液66.5kgを回収した。この回収液の電
気伝導度は26.5mS/cm であった。

【００１７】工程 工程で通液終了した脱脂初乳溶
液104.5kg を回収し、この溶液にレンネットを約 0.006
％濃度になるように添加し、30℃で30分間ゆるやかに攪
拌しながら酵素反応を行わせ、カード形成させた。凝固
したカードを濾過により除き、ホエー画分を回収した。

【００１８】工程 ホエー溶液に硫安を加え、硫安40
％飽和になるように調整し、10℃の冷蔵庫に一昼夜放置
し、塩析を行った。翌日、0.5 μm の濾過板をセットし
濾過助剤としてセライト(Celite-535) 750ｇを用いて濾
過層を形成させたフィルタープレスを用いて濾過を行っ
た。沈殿画分6.3kg を回収した。

【００１９】工程 この沈殿画分に47l の水を加え、
２時間緩やかに攪拌しながら蛋白画分を溶解させ、つい
で 0.2μm の濾過板をセットしたフルタープレスを用い
て濾過を行い、濾過助剤として添加したセライトを除去
し、あわせて除菌をおこなった。濾過液として44.5kgを
回収した。

【００２０】工程 工程と工程で得られた溶液を
合わせ、50KDのUF膜をセットした限外濾過装置を用いて
限外濾過濃縮を行った。濃縮液の電気伝導度及び硫酸イ
オン濃度を測定し、電気伝導度 400μS/cm、硫酸イオン
濃度0.29％（全固形分当たり) になった時点で濃縮操作
を終了し、ラクテニン画分を回収した。ついでこの画分
を凍結乾燥処理を行い、ラクテニン画分の乾燥粉末350
g を得た。

【００２１】

【実施例２】ウシ通常乳からのラクテニン画分の回収 分娩後10日以上経過し、通常に搾乳しているウシより集
めた牛乳 100kgを遠心分離により脱脂乳とした。以下操
作は実施例１の工程〜と同様に操作を行い、ラクテ
ニン画分を含む液30kgを得た。この濾過液を工程とし
て工程及び工程で得た溶液を合わせ、50KDのUF膜を
セットした限外濾過装置を用いて限外濾過濃縮を行っ
た。濃縮液の電気伝導度及び硫酸イオン濃度を測定し、
電気伝導度 400μS/cm、硫酸イオン濃度0.29％（全固形
分当たり) になった時点で濃縮操作を終了し、ラクテニ
ン画分を回収した。ついでこの画分を凍結乾燥処理を行
い、乾燥粉末250 g を得た。

【００２２】

【実施例３】ラクテニン画分中の活性成分の分析 実施例１及び実施例２で得たラクテニン含有画分粉末中
の免疫グロブリン、ラクトフェリン及びLPO 含量の測定
を行った。 免疫グロブリン含量 IgG含量として定量を行った。抗ウシIgG 抗体（ヤギ）
を用いたサンドイッチEIA 法により測定を行った。 ラクトフェリン含量 抗ウシラクトフェリン血清（ウサギ) を用いたサンドイ
ッチEIA 法により測定を行った。 LPO 含量 LPO活性を指標としてLPO 含量を測定した。回収したラ
クテニン画分中の活性成分は表 1の通りであった。

【００２３】

【表１】

【００２４】

【比較例】特開平3-218318号公報にはウシ初乳ホエーを
脱脂、レンネット処理、限外濾過処理、濃縮により蛋白
質含有量が75％を超える粉末の調製方法が開示されてい
る。この粉末には免疫グロブリン、ラクトフェリン、LP
O が豊富に含有されていることが記載されている。この
公報に開示された方法に従い実施例1 に示した初乳100k
g を処理し、500gの粉末を得た。この粉末を実施例２と
同様に活性成分の分析をおこなった。免疫グロブリン2
3.5％、ラクトフェリン1.43％が含有されていたがLPO
は検出されなかった。

【００２５】

【発明の効果】本発明の実施により活性の高いラクテニ
ン画分を容易に回収することが可能となる。また本発明
操作は、吸着溶出、塩析、限外濾過の簡便な３工
程からなり、大量処理も可能であり、生産コストの低減
も可能である。さらに従来の方法では回収することが困
難であった、免疫グロブリン、ラクトフェリン及びラク
トパーオキシダーゼの３成分を含有する画分として回収
できるため、より活性の高いラクテニン画分を得ること
が可能となる。

フロントページの続き (72)発明者 天谷 三枝子 北海道恵庭市恵み野西６丁目14−11 (72)発明者 阿彦 健吉 北海道札幌市中央区宮の森一条９丁目４− 22

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 工程 脱脂乳を硫酸化多糖体に接触さ
   せ、ついで吸着画分を塩溶液により溶出させ、ラクトフ
   ェリン、ラクトパーオキシダーゼを含有する画分を回収
   する工程、 工程 前記工程の非吸着画分を酸またはレンネット
   を用いて凝固させ、ホエー画分を得て、このホエー画分
   を塩析処理し、免疫グロブリン含有画分を回収する工
   程、 工程 工程及び工程で回収された画分をあわせ、
   脱塩および低分子画分を除去する工程からなる、活性な
   免疫グロブリン、ラクトフェリン及びラクトパーオキシ
   ダーゼを含有するラクテニン画分の回収方法。
2. 【請求項２】 工程の脱塩および低分子画分の除去工
   程が、50KD以上の限外濾過膜を用いて行うことを特徴と
   する請求項1 記載の回収方法。
3. 【請求項３】 硫酸化多糖体としてスルフォン化キトサ
   ンを用いる請求項１記載の回収方法。